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UNIVERSIDADE CEUMA
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO, PESQUISA E EXTENSÃO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA PARASITÁRIA
SÃO LUIS
2013
JÉSSICA FRANCISCA FERNANDES DE OLIVEIRA
Avaliação do potencial terapêutico de
micropartículas biodegradáveis
contendo Punica granatum (Romã) em
modelo de asma murina
JÉSSICA FRANCISCA FERNANDES DE OLIVEIRA
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL TERAPÊUTICO DE MICROPARTÍCULAS
BIODEGRADÁVEIS CONTENDO PUNICA GRANATUM (ROMÃ) EM MODELO DE
ASMA MURINA
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Biologia Parasitária como parte
dos requisitos para a obtenção do título de
Mestre em Biologia Parasitária.
Orientador: Prof. Dr. – Roberto Nicolete
Co-orientador: Prof. Dr. – Marcos Augusto
Grigolin Grisotto
SÃO LUÍS
2013
Oliveira, Jéssica Francisca Fernandes de.
Avaliação do potencial terapêutico de micropartículas
biodegradáveis contendo Punica granatum (romã) em modelo de
asma murina. / Jéssica Francisca Fernandes de Oliveira. São Luís:
UNICEUMA, 2013.
109 p.
Dissertação (Mestrado) – Biologia Parasitária. Universidade do
CEUMA, 2013.
O48a
Jéssica Francisca Fernandes de Oliveira
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL TERAPÊUTICO DE MICROPARTÍCULAS
BIODEGRADÁVEIS CONTENDO PUNICA GRANATUM (ROMÃ) EM MODELO DE
ASMA MURINA
A Comissão julgadora da Defesa do Trabalho Final de Mestrado
em Biologia Parasitária, em sessão pública realizada no dia / / ,
considerou o(a) candidato(a)
( ) APROVADA ( ) REPROVADA
1) Examinador __________________________________
2) Examinador ___________________________________
3) Examinador ___________________________________
4) Presidente (Orientador)__________________________________
iv
Dedico este trabalho aos meus amados
pais, Gilson e Ceiça, pelo amor,
dedicação e zelo.
As minhas irmãs, Vanessa, Aline e
Estefânia, por serem minha alegria e
minhas companheiras.
Ao meu orientador, Prof. Dr. Roberto
Nicolete, pela confiança.
v
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus, minha verdadeira fonte de sabedoria, alegria e paz; por
estar sempre comigo, guiando cada passo meu; pela fé e força que me dá para lutar e
enfrentar todos os obstáculos e por suprir todas as minhas necessidades.
Aos meus pais, Gilson e Ceiça, por me ensinarem a viver com dignidade e caráter, pelo
esforço que sempre fizeram para que eu pudesse chegar aqui, por desejarem sempre o
melhor a mim, pelo grande apoio, me estimulando nos momentos mais difíceis; pela
compreensão ao serem privados muitas vezes da minha companhia e atenção, e pelo
recíproco imensurável amor que vocês têm por mim.
Às minhas irmãs Vanessa, Aline e Estefânia, por serem motivos de muita alegria na minha
vida. Obrigada pelo amor, pela atenção e pela companhia de vocês, que tornam meus dias
melhores. Amo muito vocês!
Agradeço em especial ao meu orientador, Prof. Dr. Roberto Nicolete, pelas chances
oferecidas, desde a iniciação científica durante a graduação, e agora a realização do
mestrado. A você minha gratidão, pelo desafio lançado em me orientar à distância, e acima
de tudo pela confiança depositada em mim, a qual me deu coragem para ousar, pois
sabendo que dificuldades poderiam surgir acreditou que eu seria capaz de superar cada
uma e vencer. A sua confiança foi condição imprescindível para a realização deste trabalho.
Muito obrigada pelo grande estímulo e incentivo à pesquisa, pela permanente
disponibilidade, que mesmo longe se fez presente em todos os momentos que precisei
durante esses anos de pesquisa, pela dedicação, paciência, e aprendizado científico
transmitido. Serei sempre grata.
Ao meu co-orientador, Prof. Dr. Marcos Grisotto, pela acessibilidade e pelo tempo que se
dispôs a me ajudar gentilmente na elaboração desta dissertação. Muito obrigada por ter
proporcionado discussões e sugestões que serviram para crescimento, aprendizado e
incentivo à pesquisa.
Às professoras Dra. Elizabeth Soares Fernandes e Luciana Salles Branco, componentes da
banca examinadora de qualificação, pela disponibilidade, pela atenção e colaboração ao
meu trabalho, pelas sugestões e críticas construtivas que me ajudaram na conclusão desta
dissertação
Aos demais professores que fazem parte do corpo docente do Programa de Pós-graduação
em Biologia Parasitária, Dr. Valério Monteiro, Dra. Cristina de Andrade Monteiro, Dr. Lídio
Gonçalves, Dra. Patrícia Figueiredo, Dra. Priscila Sabbadini, Dra. Maria Rosa Quaresma e
vi
Dr. Silvio Monteiro, pelo saber científico transmitido, despertando em mim a busca contínua
desse saber, fazendo-me reconhecer ainda mais, que somos eternos aprendizes.
Aos meus colegas que conviveram comigo no laboratório durante a iniciação científica e
início do mestrado, Maycon, Thayanne, Cássia, Danilo, Michellyne, Silvelene e Juliana,
pelos momentos de alegria que me proporcionaram durante o período que ficaram no
laboratório; e em especial agradeço à minha amiga Wend Jéssica, aos poucos nos
tornamos mais que amigas, quase irmãs... Obrigada por dividir comigo as angústias e
alegrias do dia-a-dia no laboratório, foram momentos maravilhosos, pudemos juntas crescer
e amadurecer cientificamente com os ensinamentos do nosso “pai científico”, prof. Roberto,
que nos deu a oportunidade de sermos as pioneiras da iniciação científica do laboratório de
Imunologia do Ceuma e através disso buscamos sempre fazer o melhor. Obrigada por tudo
Wend!
À prof. Larissa Nicolete que me acompanhou nos “bastidores”, durante todo o período da
pesquisa, pelo exemplo de inteligência e humildade, e por estar torcendo pelo meu futuro
profissional.
Àos meus colegas da “turma IV”, Cláudia, Carol, Márcia, Kátia, Lisiane e Toni (in memorian),
pela convivência, cada um deixou um pouco de si e me ensinaram algo novo durante essa
jornada do mestrado, em especial quero agradecer à Fernanda, à Iven e à Fran, que se
tornaram grandes amigas. Obrigada pelo carinho de vocês, pelos agradáveis momentos de
alegrias, tristezas, brincadeiras que compartilhamos juntas, e por fazerem da rotina do
laboratório uma forma mais prazerosa de desenvolver e crescer cientificamente. Estou na
torcida pelo sucesso de vocês!
À minha irmã-amiga, Sanielle Abrantes, pelas sábias palavras que muitas vezes usou para
me animar, por toda a força e companheirismo. Obrigada my friend!
À minha amiga Flávia Duarte pelo incentivo na realização do meu mestrado, pelo apoio que
sempre me deu, e por diversos momentos de alegria, com muitos risos e gargalhadas, que
fizeram muita diferença (positiva) na minha adaptação em São Luis.
Às minhas amigas de sempre, Tainá e Tâmara, que hoje mesmo longe sempre nos
preocupamos uma com a outra. Agradeço pelo cuidado, carinho e por sempre estarem ao
meu lado me apoiando e torcendo por mim.
Aos funcionários e ao meu colega Diego Garreto do Instituto Florence de Ensino pela
colaboração e ajuda nos experimentos realizados.
vii
Ao Prof. Dr. Fernando Batista da Costa pelo auxílio e colaboração da Faculdade de Ciências
Farmacêuticas de Ribeirão Preto – USP na realização da caracterização fitoquímica dos
extratos.
À Prof. Dra. Flávia Nascimento pela colaboração e por ter me apresentado as suas alunas
Mayara Cristina e Thiare Silva, que me receberam, me deram todo apoio e me ajudaram
gentilmente nos experimentos realizados no LIF (Laboratório de Imunofisiologia) da UFMA.
À Universidade Ceuma, pela oportunidade na realização do mestrado em Biologia
Parasitária.
Aos funcionários, Ana Cléia (Laboratório de histologia - CEUMA) pelo apoio técnico na
confecção das lâminas histológicas; Orlando (Laboratório de Análises Clínicas – CEUMA)
pelo apoio técnico nas dosagens bioquímicas dos experimentos; Valdir (Biotério – CEUMA),
pela paciência e auxílio no cuidado dos animais e nos experimentos realizados e a todos os
técnicos da sala de preparo que me auxiliaram de alguma forma ao longo desses anos.
Aos meus colegas Nadide, Enzo, Andréia, Dália e Camila, pela admiração e por terem me
proporcionado bons momentos de convívio no laboratório, à Monique Santos e Ronildson
Lima pela paciência, disponibilidade e auxílio nos momentos que precisei em especial para
tirar as fotos das lâminas histológicas.
A secretaria de Pós-graduação, em especial à Nancy Leal e à Erymonica Pereira pela
disponibilidade, simpatia e gentiliza com que me atenderam sempre que precisei durante o
mestrado.
À FAPEMA pelo apoio financeiro.
O meu profundo e sincero agradecimento a todos que contribuíram direta ou indiretamente
para a concretização desta dissertação.
Ninguém vence sozinho.
Muitíssimo Obrigada!
viii
“Mas os que esperam no Senhor renovam
as suas forças, sobem com asas como
águias, correm e não se cansam,
caminham e não se fatigam” Isaías 40:31.
ix
RESUMO
O tratamento da asma é ainda hoje um grande desafio devido à diversidade de
mecanismos e moléculas envolvidas na fisiopatologia da doença. Portanto, há uma
clara e evidente necessidade de se buscar novos compostos potencialmente
medicinais, principalmente aqueles derivados de plantas. Nesse contexto, destaca-
se a Punica granatum (L.), conhecida como romã. Dentre as opções para tratamento
das doenças que atingem o sistema respiratório, especialmente a asma, os sistemas
de liberação modificada de fármacos para aplicação intranasal representam uma
importante abordagem terapêutica in situ para o tratamento da inflamação. O
presente estudo teve como objetivo avaliar o efeito terapêutico de micropartículas
biodegradáveis constituídas pelo ácido poli-lático co-glicólico (PLGA) contendo
extrato de romã encapsulado em modelo de asma murina induzida por ovalbumina.
O extrato foi preparado a partir das folhas da P. granatum e caracterizado
qualitativamente por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). Micropartículas
foram preparadas com e sem o extrato e analisadas quanto aos seus diâmetro e
Potencial Zeta. Além disso, foram realizados ensaios para avaliação do
recrutamento leucocitário para a cavidade broncoalveolar e parênquima pulmonar de
camundongos sensibilizados e desafiados com ovalbumina e tratados com as
micropartículas. Foram quantificados proteínas, nitritos e citocinas presentes nos
exsudatos dos lavados broncoalveolares. Os resultados demonstraram que o
tratamento foi capaz de reduzir o recrutamento leucocitário, principalmente
eosinófilos, para a cavidade broncoalveolar e parênquima pulmonar dos
camundongos desafiados com ovalbumina. Os níveis das citocinas IL-1β e IL-5
também foram reduzidos, bem como a produção de muco nos pulmões. Os
resultados obtidos neste estudo demonstram pela primeira vez que o extrato
hidroalcoólico das folhas de P. granatum apresenta atividade anti-asma significativa
e quando encapsulado em micropartículas biodegradáveis potencializa o efeito
terapêutico. Esta abordagem pode ser uma alternativa complementar para a entrega
de bioativos aos pulmões, visando ao tratamento de doenças inflamatórias/alérgicas.
Palavras chave: Micropartículas, Poli (ácido láctico co-glicólico), Punica granatum,
Inflamação, Asma.
x
ABSTRACT
The treatment of asthma is still a major challenge due to the diversity of
mechanisms and molecules involved in the pathophysiology of the disease.
Therefore, there is a clear and obvious need to seek new potential medicinal
compounds, especially those derived from plants. In this context, stands out Punica
granatum (L.), known as pomegranate. Among the options for treatment of diseases
affecting the respiratory system, especially asthma, drug-delivering systems for
intranasal application represent an important in situ therapeutic approach for the
treatment of inflammation. The present study aimed to evaluate the therapeutic effect
of biodegradable microparticles formed by poly lactic-co-glycolic acid (PLGA)
containing encapsulated pomegranate extract in a murine model of asthma induced
by ovalbumin. The extract was prepared from the leaves of P. granatum and
qualitatively characterized by high performance liquid chromatography (HPLC).
Microparticles were prepared with and without the extract and analyzed for their
diameter and Zeta Potential. In addition, tests were performed to evaluate the
leukocyte recruitment into the bronchoalveolar lavage (BAL) and pulmonary
parenchyma from mice sensitized, challenged with ovalbumin and treated with the
microparticles. Proteins, cytokines and nitrites present in the BAL exudates were
quantified. The results show that the treatment was able to reduce leukocyte
recruitment, particularly eosinophils, in BAL and lung tissue obtained from mice
challenged with ovalbumin. The levels of the cytokines IL-1β and IL-5 were also
reduced, as well as the mucus production in the lungs. The results from this study
demonstrate for the first time that the ethanol extract from the leaves of P. granatum
shows significant anti-asthma activity and also its use as encapsulated biodegradable
microparticles enhances the therapeutic effect. This approach can be an additional
alternative to delivery bioactives to the lungs for the treatment of inflammatory/allergic
conditions.
Keywords: Microparticles, Poly (lactic-co-glycolic acid), Punica granatum,
Inflammation, Asthma
xii
SUMÁRIO
RESUMO.................................................................................................................... ix
ABSTRACT ................................................................................................................. x
LISTA DE FIGURAS ................................................................................................ xiv
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS .................................................................... xv
1. INTRODUÇÃO 1
1.1. A asma no contexto do Sistema Imunológico 1
1.2. Terapia para a asma e a Punica granatum (romã) 6
1.3. Sistemas de liberação de drogas e o potencial terapêutico na asma 10
2. OBJETIVOS 12
3. METODOLOGIA 13
3.1. Obtenção do extrato hidroalcoólico das folhas de P. granatum (Romã) 13
3.2. Análise fitoquímica qualitativa 13
3.3. Preparo de micropartículas de PLGA 14
3.4. Preparo das micropartículas de PLGA contendo o extrato de P.
granatum
14
3.5. Caracterização in vitro das micropartículas 15
3.6. Animais utilizados no estudo
3.7. Esquema de imunização e desafio antigênico dos camundongos
3.8. Tratamento dos camundongos com as micropartículas de PLGA
contendo o extrato hidroalcoólico de P. granatum
3.9. Obtenção e contagem total e diferencial das células do lavado
broncoalveolar (LBA)
3.10. Determinação de proteínas totais no LBA dos camundongos
3.11. Determinação da produção de óxido nítrico (NO)
3.12. Determinação de citocinas no LBA
3.13. Análise histológica
3.14. Análise estatística
15
15
16
16
17
17
18
18
19
xiii
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 20
4.1. Análise fitoquímica do extrato de Punica granatum 20
4.2. Obtenção das micropartículas
4.3. Caracterização das micropartículas
22
23
4.3.1. Análise da distribuição dos diâmetros médios das partículas 23
4.3.2. Determinação do potencial zeta
4.4. Micropartículas contendo extrato de romã inibem o recrutamento
leucocitário, principalmente de eosinófilos, para o LBA
4.5. Micropartículas contendo extrato de romã não alteram o
extravasamento de proteínas para o LBA
4.6. Micropartículas contendo extrato de romã não alteram a produção de
derivados do óxido nítrico no LBA
4.7. Micropartículas contendo extrato de romã diminuem a produção das
citocinas IL-1β e IL-5 no LBA
4.8. Micropartículas contendo extrato de romã inibem o recrutamento
leucocitário e a produção de muco no tecido pulmonar
25
27
29
30
31
33
5. DISCUSSÃO 35
6. CONCLUSÕES
7. REFERÊNCIAS
40
41
Anexo
Apêndice
55
58
xiv
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Resposta característica de reação de hipersensibilidade tipo I 2
Figura 2: A. Fruto da Romãzeira; B. Fruto aberto da Romã; C. Sementes e fruto
da Romã; D. Flor e folhas da Romãzeira.
8
Figura 3: Análise do extrato das folhas da romã por cromatografia líquida de alta
eficiência (CLAE)
21
Figura 4: Distribuição dos diâmetros médios das micropartículas 24
Figura 5: Potencial Zeta 26
Figura 6: Efeito do tratamento com micropartículas sobre o número de leucócitos
totais em modelo de asma murina
28
Figura 7: Extravasamento proteico para o lavado broncoalveolar (LBA) de
camundongos.
29
Figura 8: Efeito do tratamento com preparações farmacêuticas sobre a produção
de óxido nítrico.
30
Figura 9: Efeitos do tratamento com as micropartículas sobre a produção de IL-
1β e IL-5.
Figura 10. Histologia dos pulmões
32
34
xv
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AcOH – Ácido acético
CLAE - Cromatografia líquida de alta eficiência
D.O - Densidade ótica
ELISA – do inglês “Enzyme-linked Immunosorbent Assay”
FcεRI - Receptores de membrana de alta afinidade para a porção Fc
FDA - Agência Reguladora de Drogas e Alimentos (do inglês “Food and Drug
Administration”)
HUVEC - Células endoteliais da veia de cordão umbilical humano
ICAM - Molécula de Adesão Intercelular
Ig - Imunoglobulina
IL - Interleucina
LBA - Lavado broncoalveolar
MeCN – Metanol-Acetonitrila
MeOH - Metanol
MHC - Complexo Principal de Histocompatibilidade
MIP-1α – Proteína inflamatória de macrófagos-1 alfa
NF-кB - Fator de transcrição nuclear-кB
NO - Óxido nítrico
Nos - Óxido nítrico sintase
OMS - Organização Mundial de Saúde
OVA - Ovalbumina
PBS - Tampão Fosfato Salina
PLGA - Ácido poli-lático-co-glicólico
PTFE - Politetrafluoretileno
xvi
PVA – Álcool polivinílico
RANTES – Regulada na ativação, expressa e secretada por células T normais,
também conhecida como CCL5
Th – Linfócitos T auxiliares
TNF - Fator de necrose tumoral
VLA – Antígenos muito tardios (do inglês, “Very Late Antigens”)
VCAM – Molécula de adesão vascular
1
1. INTRODUÇÃO
1.1 A asma no contexto do Sistema Imunológico
A asma é uma doença inflamatória crônica complexa, a qual afeta as vias
aéreas inferiores. A exposição a estímulos irritantes como endotoxinas bacterianas,
alérgenos, predisposição genética e fatores ambientais são os principais fatores de
risco para o desenvolvimento desta doença e está associada à hipersensibilidade
das vias aéreas, hiperreatividade brônquica e limitação do fluxo aéreo (BARNES,
2003; CORRÊA, MELO, COSTA, 2008). De acordo com a Organização Mundial de
Saúde (OMS) estima-se que 300 milhões de pessoas sofrem de asma em todo o
mundo e que o número de óbitos anuais chega a até 250 mil (WHO, 2012).
A asma pode ser dividida em asma intrínseca e extrínseca, sendo que na asma
intrínseca o indivíduo apresenta histórico negativo de alergia e os sintomas típicos
nesse fenótipo da doença são provenientes de estímulos como o ar frio, exercício
físico, estresse emocional, infecções pulmonares e drogas. A asma extrínseca é
caracterizada por uma reação de hipersensibilidade do tipo 1, denominada asma
alérgica, e representa a maior parte dos casos de asma, na qual há uma resposta
imune direcionada aos alérgenos ambientais presentes na poeira, pólen,
determinados alimentos, pelos de animais, dentre outros (HUMBERT et al.; 1999).
A maior parte dos alérgenos são antígenos de natureza proteica, relativamente
pequenos e muito solúveis. Esses alérgenos ao entrarem em contato com a mucosa
pulmonar se difundem através do epitélio e são capturados por células dendríticas
que migram para os linfonodos e apresentam peptídeos presentes nos alérgenos
complexados às moléculas de MHC (do inglês, Major Histocompatibility Complex)
classe II aos linfócitos T CD4+ naive (Th0) específicos, os quais devido ao
microambiente se diferenciam em linfócitos T CD4+ do padrão Th2. A reação
inflamatória é essencialmente dependente dos linfócitos T CD4+ que secretam
preferencialmente citocinas tipo 2 como IL-4, IL-5 e IL-13. (CORRIGAN e KAY, 1992;
ROBINSON et al., 1992; YSSEL e GROUX, 2000; FIREMAN, 2003), sendo estas as
principais responsáveis pelo desenvolvimento do quadro asmático (MUCIDA, et al.,
2003). Como resultado desse processo inflamatório crônico, o tecido pulmonar pode
sofrer uma profunda mudança estrutural e funcional denominada “remodelamento”
2
pulmonar (BLUMENTHAL et al., 1995). Os linfócitos Th2 ativados migram para
determinadas zonas nos linfonodos ricas em linfócitos B e induzem a ativação dos
linfócitos B alérgeno-específicos. A secreção de citocinas, derivadas dos linfócitos
Th2, como a IL-4 (COFFMAN e CARTY, 1986; MINTY et al., 1993) leva à mudança
de isotipo dos linfócitos B e consequentemente, estes passam a secretar anticorpos
IgE específicos para o alérgeno (LARCHE, ROBINSON, KAY; 2003). A IgE
produzida liga-se aos receptores de membrana de alta afinidade para a porção Fc
da Imunoglobulina E (FcεRI) que são expressos em basófilos e mastócitos, e após o
subsequente contato com o mesmo alérgeno, ocorre a ligação cruzada destes à IgE
específicas ligadas aos receptores na superfície celular de mastócitos e basófilos
(GOULD e SUTTON, 2008; BISCHOFF, 2007).
Figura 1. Resposta característica de reação de hipersensibilidade tipo I. (Fonte: adaptado de
HOLGATE, 1999).
Esta ligação é seguida pela ativação de vias secretórias nestas células, as
quais liberam mediadores inflamatórios, por exemplo, histamina, leucotrienos e
prostaglandinas que caracterizam a fase imediata da doença e causam aumento da
permeabilidade vascular e intensa broncoconstrição (SANTING et al., 1994;
3
SCHUILING et al., 1999). Juntamente com outras moléculas como as quimiocinas e
citocinas produzidas nesta fase, ocorre a persistência da inflamação e
desenvolvimento de uma segunda fase, denominada fase tardia, que se inicia 2 ou 3
horas após a exposição ao alérgeno e pode se estender por mais de 24 horas
(BOOIJ-NOORD, 1972; HERXHEIMER, 1952).
Com o início da fase tardia, um microambiente inflamatório é formado pelas
citocinas (IL-4, IL-5, IL-13) (SANDERSON, 1988; CLUTTERBUCK, 1988),
quimiocinas (eotaxina, RANTES, MIP-1α e outras), moléculas de adesão e seus
receptores (VLA-1, VLA-4, ICAM-1, VCAM-1) (ANWAR et al., 1994; WALSH et al.,
1996), que contribuem para a infiltração de leucócitos para o tecido e causam o
dano no tecido pulmonar. A migração de células inflamatórias (eosinófilos,
macrófagos e linfócitos) para o tecido pulmonar é o evento que perpetua na asma e
caracteriza a fase tardia, sendo o grande influxo e a ativação de eosinófilos nas vias
aéreas os principais responsáveis pela cronicidade da doença (AALBERS et al.,
1993; METZGER et al., 1986). O acúmulo de células para o local da inflamação
ocorre a partir do contato e da rolagem de leucócitos circulantes sobre as células
endoteliais (KELLY et al., 2007). Estas etapas são necessárias para a aderência dos
leucócitos ao endotélio e extravasamento plasmático para a área afetada (LUSTER
et al., 2005). O controle destes eventos é multimediado e envolve uma complexa
interação das membranas dos leucócitos com as células endoteliais (KELLY et al.,
2007; ZIMMERMAN et al., 1996). As moléculas de adesão celular (CAMs) são
glicoproteínas expressas na superfície das células, as quais medeiam o contato
entre duas células ou entre células e a matriz extracelular. No contexto da asma, o
aumento de eosinófilos e linfócitos na mucosa das vias aéreas se dá paralelamente
ao aumento na expressão de moléculas de adesão específicas em células
endoteliais, como por exemplo, a selectina-E, ICAM-1 e VCAM-1 (BOCHNER, 2004).
A elevada expressão de moléculas de adesão celular, como a VCAM-1 e a ICAM-1
nas células do endotélio vascular são fundamentais para o desencadeamento da
inflamação pulmonar (BAZAN-SOCHA et al., 2005).
No contexto das citocinas envolvidas na resposta inflamatória, a IL-1β participa
centralmente em respostas imunes locais e sistêmicas e atua como um mediador
fundamental no processo inflamatório. Há evidências de que a desregulação na
síntese e a liberação prolongada de IL-1β podem contribuir para a patogênese de
doenças inflamatórias crônicas, como a doença inflamatória intestinal, psoríase,
4
artrite reumatoide e asma (DINARELLO, 1998). Esta citocina atua na fase inicial do
processo inflamatório e exerce múltiplas ações em células endoteliais, incluindo a
indução da síntese de moléculas de adesão, bem como a liberação de diversos
mediadores inflamatórios. Sua presença na asma ocasiona a permanência do
quadro inflamatório e contínuo recrutamento de células para o pulmão. (WHELAN et
al., 2004). Dentre outras citocinas envolvidas na asma, a IL-5 destaca-se, pois
participa da fase tardia da doença, a qual é responsável pela proliferação, acúmulo e
migração de eosinófilos a partir da medula óssea para o sangue. (FACCIOLI et al.,
1996; ROGERIO et al., 2003). Durante a resposta inflamatória alérgica, os produtos
liberados pelos eosinófilos contribuem diretamente para o dano tecidual,
desenvolvimento de hiperreatividade brônquica e também no remodelamento
pulmonar (HUMBLES et al., 2004; WARDLAW et al.,1988).
Outro mediador envolvido em diversos processos biológicos como
vasodilatação e broncodilatação, é o óxido nítrico (NO), o qual também participa da
regulação nos processos inflamatórios. Estudos indicam que o NO desempenha um
papel na regulação da função das vias aéreas, tanto em indivíduos saudáveis
quanto asmáticos (BARNES e LIEW, 1995, SALEH et al., 1998, RICCIARDOLO,
2003). NO exalado pode ser gerado enzimaticamente por três isoformas distintas de
NO sintase (NOS1, NOS2, NOS3), expressas por diferentes tipos de células
presentes no tecido pulmonar normal ou inflamado, tais como células epiteliais
brônquicas das vias respiratórias, células neuronais, macrófagos, neutrófilos,
eosinófilos, mastócitos, e as células endoteliais e do músculo liso. As isoformas
NOS1 e NOS3 são expressas constitutivamente e produzem baixos níveis de NO,
enquanto que a isoforma NOS2 é induzida por produtos bacterianos e/ou citocinas
pró-inflamatórias (MEURS et al., 2003). Assim, em pacientes asmáticos ou em
outras doenças inflamatórias pulmonares, o NO exalado parece derivar da NOS2
expressa das células epiteliais brônquicas ou células inflamatórias (KHARITONOV et
al., 1994, BARNES, 1995; GUO et al., 2000, VAN DER VLIET et al., 2000; YATES,
2001).
Desde o início da década de 1990, modelos experimentais em camundongos
foram estabelecidos para o estudo dos aspectos específicos da asma, permitindo
realizar estudos em animais isogênicos com o sistema imunológico e respiratório
intactos. Modelos animais representam o único método disponível para estudar
alguns processos in vivo da doença, já que aspectos éticos não permitem realizar
5
alguns procedimentos invasivos em seres humanos (GUALDI, 2010). Como a
investigação nesta área continua a se expandir, as vantagens e as limitações de
cada modelo devem ser definidas e compreendidas, para que os achados à partir
destes modelos possam ser interpretados no contexto da doença humana, e assim,
novas drogas possam ser desenvolvidas. Apesar de haver diversas diferenças entre
a asma animal e a asma humana, modelos animais têm sido, e continuam a ser,
vitais para a compreensão dos mecanismos envolvidos no desenvolvimento e
progressão da asma (ZOSKY e SLY, 2007). Modelos de asma alérgica em
camundongos têm sido amplamente utilizados com o propósito de elucidar
mecanismos da doença e avaliar a eficácia de novos fármacos como teste pré-
clínico, já que são mais fáceis de manusear e têm, ainda, a vantagem do baixo custo
e a existência de linhagens transgênicas, quando comparados a animais de maior
porte (GUALDI, 2010). Assim como na doença humana, camundongos
desenvolvem, após exposição por via inalatória de antígeno específico com o qual
foram previamente sensibilizados, uma fase imediata dependente da degranulação
de mastócitos mediada por IgE ligada a receptores FcεRI presentes na membrana
dessas células e, posteriormente, apresentam infiltrado celular com predominância
de eosinófilos e linfócitos T. Na maioria dos modelos atuais, os camundongos são
sensibilizados por injeção intraperitoneal de ovalbumina, frequentemente em
conjunto com um adjuvante, como o hidróxido de alumínio. A sensibilização por si só
induz a produção de IgE-ovalbumina específica. Após a exposição secundária à
ovalbumina pela via intranasal, os animais sensibilizados desenvolvem
hiperresponsividade das vias aéreas e recrutamento de eosinófilos para as vias
respiratórias. (KIPS et al, 2003).
Diante deste cenário, como a asma é caracterizada por uma inflamação crônica
e é de aspecto multifatorial, diferentes células efetoras e diversos fatores
desencadeadores estão envolvidos na doença. Assim sendo, fenótipos presentes na
maioria das manifestações de asma foram escolhidos para servirem de objeto de
estudo no modelo animal escolhido: recrutamento celular, extravasamento vascular,
produção de óxido nítrico (NO), produção de citocinas inflamatórias e perfil alérgico
(IL-1β e IL-5), produção de muco e infiltração celular no tecido pulmonar.
6
1.2 Terapia para a asma e a Punica granatum (romã)
O tratamento da asma é ainda hoje um grande desafio devido à diversidade de
mecanismos e moléculas envolvidas na fisiopatologia da doença. Atualmente,
existem duas principais categorias de fármacos utilizados no tratamento da asma, os
agonistas β2-adrenérgicos e corticosteróides (broncodilatadores e anti-
inflamatórios). A inalação desses fármacos é o tratamento mais comum para a
asma, entretanto, a frequente administração desse tipo de medicamento está
associada com muitos efeitos colaterais locais e sistêmicos, tais como tosse,
náuseas, supressão da suprarrenal, interferência na produção hormonal e
osteoporose (WANNMACHER, 2006; BARNES, 2004, 2006). Portanto, há uma
necessidade evidente de se buscar novos compostos potencialmente medicinais,
principalmente aqueles derivados de origem natural, como as plantas, visando ao
alcance de novos alvos terapêuticos. Estes novos compostos devem apresentar
relevante atividade na terapia da asma e menos efeitos colaterais quando
comparados com os corticóides, amplamente utilizados no controle dessa doença.
Como fonte destes compostos, as plantas medicinais têm sido amplamente
utilizadas para obtenção de moléculas bioativas para serem exploradas
terapeuticamente.
Com relação à terapia para a asma envolvendo o uso de plantas, estas vêm
sendo descritas para o alívio dos sintomas provocados pela doença desde os
primórdios da humanidade. Há mais de 5.000 anos o chá da espécie Ephedra sínica
já era utilizado na medicina tradicional chinesa como estimulante e antiasmático,
através do efeito broncodilatador atribuído aos alcalóides presentes na espécie, os
quais possuíam afinidade por receptores β adrenérgicos. Porém, o fato de não
serem seletivos para os receptores β da musculatura brônquica, ocasionavam
efeitos cardiovasculares indesejáveis. Assim, fármacos seletivos foram sintetizados
a fim de evitar os efeitos colaterais no sistema cardiovascular (SCHANEBERG et al.,
2003). Os agonistas de receptores β-adrenérgicos são substâncias de maior uso
clínico no combate a broncoconstrição causada pela crise asmática. Apesar da
ampla utilização e de aliviarem parte dos sintomas da asma, os broncodilatadores
desempenham sua função de forma desejada em associação com substâncias anti-
inflamatórias, sendo esta a terapia mais eficiente para o tratamento da asma, visto
7
que o controle da inflamação crônica é necessário para diminuição das crises
asmáticas (CORRÊA, MELO, COSTA, 2008).
No Brasil, estudos com plantas medicinais são de grande importância, visto
que são utilizadas em várias áreas da saúde como forma alternativa de tratamento.
Além disso, nosso país apresenta uma rica biodiversidade, devendo-se considerar o
custo mais baixo destas formas terapêuticas em relação aos medicamentos
industrializados (DUARTE et al, 2004). A utilização de plantas como medicamento,
provavelmente é muito antiga e está relacionada com a evolução humana. A
preocupação com a cura das doenças ao longo da história da humanidade, sempre
se fez presente e o homem busca na natureza recursos que melhorem suas
condições de vida para aumentar suas chances de sobrevivência, através da
melhoria de sua saúde (BRASIL, 2006). O uso de plantas medicinais é significativo.
Dados da Organização Mundial de Saúde mostram que aproximadamente 85% da
população mundial utilizaram alguma planta medicinal na busca de alívio de alguma
sintomatologia dolorosa ou desagradável (OLIVEIRA et al., 2006). O uso de terapias
chamadas “alternativas ou complementares” e “caseiras” tem crescido nos últimos
anos, apesar da constante introdução de novas e efetivas drogas no mercado.
Produtos naturais de origem vegetal representam um grande potencial farmacológico
contra a asma, uma vez que podem fornecer moléculas diversas com mecanismos
específicos para o tratamento e controle dessa doença. A busca por terapias mais
eficientes e específicas para o processo asmático com menos efeitos colaterais
mostra que a busca nos produtos naturais é promissora e possui um papel
importante para o descobrimento de novas terapias (CORRÊA, MELO, COSTA,
2008).
Metabólitos secundários de plantas possuem uma larga distribuição, bem como
diversas atividades biológicas. Essas substâncias pertencem a diferentes classes
químicas, o que aumenta a probabilidade de descoberta de novos agentes
terapêuticos no combate da asma (ROGERIO, NUNES, FACCIOLI, 2010).
A Punica granatum (L.), conhecida popularmente como romãzeira é um arbusto
lenhoso, ramificado, cultivada nas regiões tropicais e subtropicais do mundo. Seu
fruto, comestível, é de odor agradável (LORENZI; SOUZA, 2001). Possui folhas
pequenas, rijas, brilhantes e membranáceas; flores vermelho-alaranjadas dispostas
nas extremidades dos ramos, originando frutos esféricos, com muitas sementes em
camadas, as quais se acham envolvidas em arilo polposo (FERREIRA, 2004).
8
Tradicionalmente a P. granatum pertence à família Punicaceae, porém análises
filogenéticas moleculares incluíram o gênero Punica na família Lythraceae (HUANG
e SHI, 2002).
Figura 2. A. Fruto da Romãzeira; B. Fruto aberto da Romã; C. Sementes e fruto da Romã; D. Flor e
folhas da Romãzeira.
Extratos de todas as partes da P. granatum são caracterizados por
apresentarem em sua composição compostos fenólicos, incluindo flavonóides
(antocianinas, catequinas e outros complexos flavonóides) e taninos hidrolisáveis
(punicalina, pedunculagina, punicalagina, ácido gálico e elágico), sendo estas as
principais moléculas responsáveis pelas diversas propriedades terapêuticas desta
planta (ISMAIL et al., 2012; WANG et al., 2013). Extratos do fruto, cascas e raízes
da P. granatum são descritos na literatura por apresentarem atividades
antimicrobianas (CHOI et al., 2011; HOFLING et al., 2010; SILVA et al., 2008;
VASCONCELOS et al., 2006), antihelmínticas (FERNANDES et al., 2005),
antiparasitárias (LUIZE et al., 2005; DELL'AGLI et al., 2010; VALDÉS et al., 2010)
anti-inflamatórias e antineoplásicas (JUNG et al., 2006; NAGATA et al., 2007; KHAN
et al., 2007; HONG et al., 2008; SHUKLA et al., 2008; RETTIG et al., 2008;
RASHEED et al., 2010; ADAMS et al., 2010; KHAN et al., 2010; KOYAMA et al.,
2010).
Werkman e colaboradores (2008), através de uma análise da literatura sobre
as aplicações terapêuticas da romã, concluíram que entre as várias propriedades
que a planta possui, destacam-se as propriedades antimicrobiana e anti-inflamatória.
Além disso, seus princípios ativos preencheriam as recomendações da OMS quanto
ao uso de fontes naturais de baixo custo para tratamento de doenças.
Flavonóides extraídos do suco fermentado e do óleo da romã apresentam
atividade inibitória das enzimas ciclooxigenase e lipooxigenase. A ciclooxigenase,
enzima chave na conversão do ácido araquidônico a prostaglandinas (importantes
9
mediadores inflamatórios), é inibida em 37% e a lipooxigenase, que catalisa a
conversão do ácido araquidônico em leucotrienos (também importantes mediadores
inflamatórios) é inibida em 75% (SCHUBERT, LANSKI, NEEMAN, 1999).
Um estudo utilizando modelo de inflamação pulmonar induzida por LPS em
camundongos mostrou que o tratamento com o extrato aquoso das cascas da romã
atenua a inflamação pulmonar, e este efeito é atribuído à inibição da atividade da
enzima mieloperoxidase neutrofílica, redução da quantidade de proteínas no LBA,
bem como redução do número de células recrutadas (BACHOUAL et al., 2011).
Poucos estudos são descritos em relação às propriedades terapêuticas das
folhas da romã, embora estas apresentem constituintes semelhantes aos
encontrados nas outras partes da planta e sejam ricas em taninos presentes
exclusivamente nas folhas (BALWANI et al., 2011). As folhas de romã têm atraído
muita atenção devido à sua ampla gama de bioativos. Foi relatado que extratos das
folhas da romã inibem o desenvolvimento de obesidade e hiperlipidemia em ratos
com obesidade induzidos por dieta rica em gordura e estes efeitos são parcialmente
mediados através da inibição da atividade da lipase pancreática (LEI et al., 2007). A
atividade antiparasitária das folhas de romã também foi descrita contra Giardia
lamblia (EL-SHENNAWY et al., 2010). Sugere-se que os compostos fenólicos
contidos predominantemente nas folhas da romã contribuam para os benefícios à
saúde (LAN et al., 2009).
Um estudo recente descreveu pela primeira vez a caracterização e purificação
de um novo composto extraído das folhas da P. granatum, o qual foi testado e
apresentou efeito inibitório sobre a expressão de moléculas de adesão celular em
células endoteliais da veia de cordão umbilical humano (HUVEC) induzida por TNF-α
e mostrou ainda o bloqueio da ativação e translocação do fator de transcrição
nuclear-кB (NF-кB), sugerindo, portanto um potente composto a ser empregado em
desordens inflamatórias que envolvem o recrutamento e migração celular para o
espaço intersticial (BALWANI et al., 2011).
Atualmente, muitos trabalhos científicos vêm estudando as propriedades
medicinais da romãzeira. No entanto, existem poucos estudos etnobotânicos,
toxicológicos e farmacológicos desenvolvidos até o momento, na tentativa de
elucidar os mecanismos de ação e efeitos dos constituintes químicos derivados da
romã. Diante das diversas atividades biológicas descritas e dos diversos metabólitos
10
secundários, os quais constituem a planta, é conferida a esta; potencial atividade
contra o processo inflamatório/alérgico desenvolvido na asma.
1.3 Sistemas de liberação de drogas e o potencial terapêutico na asma
Torna-se cada vez mais evidente que somente o desenvolvimento de novos
fármacos não é suficiente para atender as necessidades terapêuticas. As limitações
relacionadas ao uso de substâncias ativas, como o alcance de concentrações
plasmáticas insuficientes, elevado metabolismo, rápida eliminação pelos fluidos
corporais, distribuição inadequada, elevada toxicidade, baixa solubilidade aquosa
(reduzindo a absorção intestinal ou dificultando a preparação de formas
farmacêuticas líquidas), entre outras, têm restringido a introdução de novos
medicamentos no mercado farmacêutico mundial (MEHNERT; MÄDER, 2001).
Neste contexto, há um corrente e notável crescimento das áreas de pesquisa
envolvidas na investigação de novos sistemas destinados à administração de
medicamentos, frequentemente descritos como sistemas de liberação controlada ou
modificada de drogas. Estas áreas representam um desenvolvimento relativamente
novo e, quanto às nossas necessidades em saúde humana, podem melhorar a
eficácia e a segurança na administração dos ativos.
O uso de sistemas nano e microestruturados tem se tornado uma estratégia
interessante no que diz respeito à alteração das características biofarmacêuticas das
drogas, além de oferecer inúmeras vantagens quando comparados aos sistemas
tradicionais, permitindo uma liberação prolongada através da membrana do
carreador, o aumento da biodisponibilidade dos fármacos no sítio de ação, redução
de dose e melhora da posologia sem comprometimento da eficácia terapêutica, além
da capacidade de vetorização ativa ou passiva de fármacos a tecidos e células alvos
(BLASI et al., 2009; PANDEY e AHMAD, 2011; VRIGNAUD et al., 2011).
Nano e micropartículas poliméricas, formadas a partir de polímeros
biodegradáveis vêm sendo pesquisadas com o objetivo de melhorar a terapia de
diversas doenças (PANDEY e AHMAD, 2011). Dentre esses polímeros, o ácido poli-
lático-co-glicólico (PLGA) tem sido extensamente empregado por ser biocompatível,
biodegradável, apresentar uma boa resistência mecânica e ser bastante versátil na
preparação de carreadores, encapsulando diferentes tipos de substâncias, desde
fármacos até proteínas e peptídeos. A degradação desta matriz polimérica ocorre
11
por hidrólise não enzimática em fluidos corporais, sendo que os produtos de sua
degradação, os ácidos lático e glicólico, são compostos metabolizados pela via do
Ciclo de Krebs e biotransformados pelas próprias células em água e gás carbônico.
Por apresentar estas características é aprovado pela “Food and Drug Administration”
(FDA) para uso em sistemas de liberação de drogas humano e animal (BARROW,
2004; FREDENBERG et al., 2011).
Ungaro e colaboradores (2009) avaliaram a potencial liberação pulmonar da
insulina a partir de micropartículas porosas de PLGA/ β-ciclodextrina em ratos.
Ainda, avaliaram o perfil de deposição in vivo e a atividade hipoglicêmica. Os autores
ressaltam a viabilidade do uso deste sistema microestruturado, evidenciando que
este foi capaz de alcançar os alvéolos, onde a insulina foi liberada, rapidamente
absorvida e, de forma bioativa, capaz de reduzir os níveis de glicose em doses muito
baixas.
O sistema de liberação controlada é uma modalidade atrativa para o tratamento
de várias desordens pulmonares, entre elas, a asma. Para esta doença, a liberação
sustentada do fármaco no pulmão é altamente desejável a fim de reduzir a
frequência de administração, aprimorar as concentrações efetivas do composto no
sítio da patologia, bem como reduzir de efeitos adversos, elevando a aceitabilidade e
a adesão do paciente ao tratamento (YANG et al., 2009). OH e colaboradores
(2010), a fim de avaliar a eficiência terapêutica de micropartículas de PLGA,
encapsularam o corticoide inalatório Budesonida e o utilizaram no tratamento de
asma em modelo experimental murino induzido por ovalbumina. As micropartículas
apresentaram diâmetros entre 8,2 e 9,2 µm e os resultados demonstraram que estas
reduziram significativamente o número de células inflamatórias, como os macrófagos
e eosinófilos no LBA, bem como a hiperresponsividade brônquica e a infiltração de
células inflamatórias observadas na análise histológica dos pulmões.
Tendo em vista a necessidade pela busca de novos compostos que
apresentem relevante eficiência no tratamento da asma, tanto na composição da
medicação quanto na forma farmacêutica sob a qual os compostos utilizados são
apresentados, micropartículas constituídas pelo ácido poli-lático co-glicólico (PLGA),
contendo extrato da romã mostram-se promissoras para serem utilizadas no
tratamento da asma, conforme resultados obtidos neste estudo.
12
13
2. OBJETIVOS
2.1 Geral
Avaliar o efeito do tratamento com micropartículas biodegradáveis contendo
extrato da Punica granatum (romã) encapsulado ou não em modelo experimental de
asma.
2.2 Específicos
Caracterizar qualitativamente o extrato hidroalcoólico da Punica granatum
(romã);
Preparar e caracterizar micropartículas de PLGA contendo ou não o extrato
de romã encapsulado;
Avaliar o recrutamento celular para o lavado broncoalveolar de camundongos
sensibilizados com de ovalbumina e tratados com as preparações;
Avaliar a produção de proteínas totais e nitritos no lavado broncoalveolar dos
camundongos;
Avaliar o efeito dos tratamentos sobre a produção das citocinas IL-1β e IL-5
no lavado broncoalveolar;
Analisar o infiltrado celular e produção de muco no tecido pulmonar dos
camundongos tratados com as preparações.
14
3. METODOLOGIA
3.1. Obtenção do extrato hidroalcoólico das folhas de P. granatum (romã)
As folhas da planta Punica granatum L. foram coletadas no Herbário Ático
Seabra, localizado na Universidade Federal do Maranhão, em São Luís-MA, Brasil.
A planta utilizada está depositada no acervo do Herbário universitário e catalogada
sob o voucher 01002. O extrato hidroalcoólico da espécie P. granatum foi obtido por
maceração de 20 gramas das folhas frescas da planta previamente lavadas e
trituradas em um recipiente fechado contendo 200 mL de solução hidroalcoólica
(etanol 70%, v/v), a temperatura ambiente. Essa solução foi mantida durante 8 dias
em vidro âmbar, sob o abrigo da luz e com agitações ocasionais. Após, procedeu-se
à filtração do líquido extrativo, que, em seguida, foi levado ao rotaevaporador, à
temperatura de 60-70°C em banho termostatizado, para evaporação do solvente
(CORRÊA, 1999). O extrato apresentou um rendimento de 10,35% e o mesmo foi
acondicionado e mantido sob refrigeração para posteriores ensaios.
3.2 Análise fitoquímica qualitativa
As análises foram realizadas por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)
em fase reversa. O equipamento utilizado foi um cromatógrafo líquido Shimadzu
(Japão) SCL 10 Avp acoplado a detector UV-DAD Shimadzu SPD-M10 Avp e um
injetor automático. O gradiente de eluição consistiu de uma fase móvel binária
composta de H2O (0,5% AcOH) e MeCN em um gradiente linear de 0 a 50 % de
MeCN em 30 min, e de 50 a 100 % de MeCN nos tempos de 30 a 35 min, mantendo
a 100 % de MeCN por mais 5 min para a limpeza da coluna. Foram utilizadas duas
colunas monolíticas acopladas (Onix C18, 200 x 300 mm, Phenomenex) protegidas
por uma pré-coluna equivalente. As amostras foram analisadas pela dissolução de
100 µL do extrato (100 mg/mL) em 500 µL de uma solução de MeOH:H2O (1:1 v/v),
seguida de posterior filtração em filtros PTFE (0,45 µm). O volume injetado foi de
10µL. Foram realizadas corridas entre 250 e 380 nm.
15
Este experimento foi feito em colaboração com o Prof. Dr. Fernando Batista da
Costa, da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto - USP.
3.3 Preparo das micropartículas de PLGA
O sistema polimérico foi obtido pelo “método da emulsão e evaporação do
solvente” (NIWA et al., 1993; NICOLETE et al., 2007). A fase orgânica foi constituída
pelo polímero PLGA (Resomer RG 505, Alemanha) (100 mg), em proporções
equivalentes entre o ácido láctico e glicólico (50:50 m/m), dissolvidos no solvente
diclorometano (5 mL) (J.T. Baker/Mallinckrodt, Phillipsburg, NJ, USA). Esta fase foi
vertida numa fase aquosa contendo tensoativo (PVA 3% m/v, 40 mL) (Mowiols 40–
88, Sigma-Aldrich). Em seguida as fases foram homogeneizadas a 600 rpm, em um
agitador mecânico vertical (mini-Q 235, Quimis, Brasil). A evaporação do solvente foi
realizada mediante agitação a temperatura ambiente (4 horas). As partículas
passaram pelo processo de lavagem com água destilada estéril (3x), centrifugadas
(1.000 x g, 5 min) e liofilizadas.
3.4 Preparo das micropartículas de PLGA contendo o extrato de P. granatum
O sistema microencapsulado foi obtido pelo método da emulsão e evaporação
do solvente, conforme descrito acima. A fase orgânica foi composta pelo extrato de
romã (100 mg/mL) e o polímero PLGA (Resomer RG 505) (100 mg), dissolvidos no
solvente diclorometano (5 mL) (J.T. Baker/Mallinckrodt, Phillipsburg, NJ, USA). Foi
realizada homogeneização das fases a 900 rpm (mini-Q 235, Quimis, Brasil) por 3
minutos. Ao final desse processo, obteve-se uma emulsão do tipo água-óleo (a/o).
Esta fase foi vertida lentamente sobre uma solução de PVA 3% (40 mL) para
formação da emulsão múltipla (a/o/a), deixando-se em agitação (600 rpm) por 4
horas para a evaporação do solvente (diclorometano), e consequentemente
obtenção das partículas. Estas passaram pelo processo de lavagem com água
destilada estéril (3x), centrifugadas (1.000 x g, 5 min) e liofilizadas.
16
3.5 Caracterização in vitro das micropartículas
As partículas foram reconstituídas em água destilada para análise a
temperatura ambiente. Os diâmetros das partículas foram caracterizados por
difratometria a laser utilizando um analisador de tamanho de partícula (LS 13 320
Laser Diffraction Particle Size Analyzer, Beckman Coulter, EUA) e a análise do
Potencial Zeta das partículas foi feito utilizando um Nano Zeta Sizer (Malvern
Instruments, Inglaterra).
Estas análises foram feitas no laboratório de Análise de Sistemas Micro e
Nanoestruturados da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto –
USP.
3.6 Animais utilizados no estudo
Foram utilizados camundongos adultos fêmeas pertencentes à linhagem
BALB/c, pesando entre 20-25g. Os animais foram provenientes da Suprilab –
Biotério e Suprimentos Ltda. (Cachoeirinha-BA) e mantidos sob condições de
experimentação no biotério do Instituto Florence de Ensino Superior, com livre
acesso a água e alimento. Esta pesquisa foi submetida e aprovada pelo Comitê de
Ética e Experimentação Animal da Universidade Estadual do Maranhão (Protocolo
CEEA/UEMA no 022/2011), (Anexo A). Os animais foram divididos em 6 grupos
(n=6/grupo). O grupo controle negativo recebeu apenas solução salina durante as
etapas de imunização e tratamento e o grupo controle positivo foi sensibilizado com
solução de ovalbumina (OVA), porém não recebeu tratamento. Os demais grupos
foram sensibilizados e tratados com Dexametasona ou com as preparações de
micropartículas.
17
3.7 Esquema de sensibilização e desafio antigênico dos camundongos
Os camundongos foram sensibilizados nos dias 0 e 7 por injeção
intraperitoneal de 75 µg de OVA (Sigma Aldrich) e 2,6 mg de hidróxido de alumínio
em 0,2 mL de salina. Nos dias 14 e 21 foram desafiados com solução de OVA (50
µg OVA/50µL de salina estéril), por via intranasal (25 µL por narina), com o auxílio
de uma micropipeta. Este modelo é amplamente utilizado e bem caracterizado, com
características semelhantes às de asma alérgica humana (WAGER et al., 2004). O
grupo controle recebeu durante as sensibilizações e desafios apenas solução salina
estéril.
3.8 Tratamento dos camundongos com as micropartículas de PLGA contendo
extrato hidroalcoólico de P. granatum
Os camundongos previamente sensibilizados foram tratados diariamente a
partir do dia 18 até o dia 21 com as micropartículas contendo extrato hidroalcoólico
de P. granatum encapsulado (10 mg/mL, 25 µL por narina), ou com extrato de romã
não encapsulado (20 mg/Kg, 25 µL por narina) por instilação intranasal. Para
comparação com a terapia clássica, um grupo de camundongos foi tratado com
injeções intraperitoneais de Dexametasona (Decadron®, Aché) (0,4 mg/Kg, 200 µL).
A fim de avaliar a eficácia do extrato encapsulado, outro grupo foi tratado com as
micropartículas controle (10 mg/mL, 25 µL por narina), sem o extrato. Os
camundongos foram mortos 24 horas após o segundo desafio antigênico para a
realização dos estudos (ROGERIO et al., 2007).
3.9 Obtenção e contagem total e diferencial das células do lavado
broncoalveolar (LBA)
As células do LBA foram coletadas através da inserção de um cateter
acoplado a uma seringa contendo 0,5 mL de PBS na traqueia do animal previamente
exposta. Esse procedimento foi repetido 3x com o mesmo volume para obtenção da
18
suspensão celular. O exsudato foi coletado individualmente de cada animal e
acondicionado separadamente em tubos plásticos, mantidos sob refrigeração. A
contagem do número total de células presentes nos lavados foi feita imediatamente
utilizando a câmara de Neubauer, com auxílio de microscópio óptico de campo claro
(objetiva de 40x). As contagens diferenciais das células foram feitas em esfregaços
preparados em citocentrífuga, e submetidas à coloração panótica (Instant-Prov,
Newprov, Pinhais, Brasil). Macrófagos, linfócitos, eosinófilos e neutrófilos foram
identificados segundo coloração e características morfológicas específicas de cada
célula, com auxílio de microscópio óptico de campo claro. A objetiva de 100x foi
empregada para a análise diferencial de leucócitos das lâminas na microscopia, com
auxílio de óleo de imersão.
Este ensaio foi feito em colaboração com a Prof. Dra. Flávia Raquel
Fernandes do Nascimento no laboratório de Imunofisiologia da Universidade Federal
do Maranhão (LIF-UFMA).
3.10 Determinação de proteínas totais no LBA dos camundongos
A quantificação de proteínas totais no sobrenadante do LBA foi realizada com
base no método de Biureto, utilizando o Kit de ensaio para Proteínas Totais da
Labtest® Diagnóstica SA (Lagoa Santa, MG, BRA), de acordo com o protocolo do
fabricante, utilizando como padrão solução de albumina 4,0 g/dL contendo azida
sódica 14,6 mmol/L. As absorbâncias do teste foram determinadas em
espectrofotômetro automatizado em 545 nm.
3.11 Determinação da produção de óxido nítrico (NO)
A quantificação dos derivados do óxido nítrico foi feita através da dosagem de
nitritos no LBA, pela reação de Griess. Os sobrenadantes (100 µL) foram incubados
com volumes iguais do reagente de Griess (1% sulfanilamina, 0,1% N-(1-naphtyl)-
ethylendiamina, 2,5% H3PO4) a temperatura ambiente por 10 min. A absorbância foi
medida em espectrofotômetro semi-automático a 540 nm e as concentrações
19
calculadas através de uma curva padrão de nitrito de sódio (NaNO2) (NICOLETE et
al., 2009).
3.12 Determinação de citocinas no LBA
Empregando o método de ELISA, foi feita a quantificação das citocinas IL-1β
e IL-5 (R & D Systems, MN, e PharMingen, San Diego, CA). Os anticorpos de
captura foram diluídos em tampão carbonato (100 µL/poço), na concentração
indicada pelo fabricante, e após incubação das placas durante uma noite a 4C, as
mesmas foram lavadas 3x (tampão de lavagem). Após as sucessivas lavagens e
secagem da placa, foram adicionados 300 µL/poço do tampão de bloqueio, seguido
de incubação à temperatura ambiente no mínimo por 1 h. Após o bloqueio, os poços
foram novamente lavados 3x com o tampão de lavagem, e então adicionados 100 L
das amostras para a quantificação das citocinas. Depois de repetido o procedimento
de lavagem da placa, foi adicionado 100µL/poço dos anticorpos de detecção
biotinilados, na concentração indicada pelo fabricante por 2 hs. Após a incubação foi
repetido novo ciclo de lavagem, e em seguida foi feita a amplificação da reação pela
adição de 100 µL/poço de estreptoavidina/biotina com incubação por 1 h a
temperatura ambiente. Em seguida, foram adicionados 100L/poço da solução de
substrato e as placas foram incubadas por 30 minutos à temperatura ambiente. A
reação foi bloqueada pela adição de 50µL/poço de H2SO4 1M. A densidade ótica
(D.O.) foi avaliada em leitor de microplacas com filtro de 450 nm (Metertech Inc.,
modelo 960). Os ensaios foram feitos em duplicata e a concentração de citocinas
calculada a partir da curva padrão.
3.13 Análise histológica
Os pulmões dos camundongos foram fixados em solução de formalina a 10%,
inclusos em parafina, cortados em seções (5 µm) e corados com hematoxilina
eosina (HE) para avaliação do infiltrado celular e com ácido periódico de Schiff para
análise da produção de muco pelas células do glicocálix (“globet”).
20
3.14 Análise estatística
Os dados foram expressos como média ± desvio padrão. A comparação entre
os grupos foi feita através do teste de análise da variância (ANOVA) e pós-teste pelo
método de Tukey-Kramer pelo software estatístico GraphPad Prisma 5.0, aceitando
o nível de significância inferior a 5% (P < 0,05).
21
4. RESULTADOS
4.1 Análise fitoquímica do extrato de Punica granatum
A presença de algumas classes de metabólitos foi inferida através de seus
espectros de absorção no UV, baseando-se em informações da literatura sobre o
perfil fitoquímico da romã (FISCHER et al., 2011; GIL et al., 2000, LANSKY et al.,
2007). A análise do extrato das folhas de P. granatum por CLAE revelou picos entre
0 e 25 minutos, a maioria deles bem visualizada a 325 nm. Os baixos tempos de
retenção indicam a predominância de substâncias mais polares, enquanto a
visualização em 325 nm indica a presença, principalmente, de compostos fenólicos
(Figura 3). Espectros de absorção no UV dos picos 1, 2 e 3 sugerem a presença de
catequinas (flavan-3-ols, banda II em 270-280 nm). Dessa classe de substâncias
foram descritas para a romã a catequina, epicatequina e 3-galato de
epicagalocatequina (LANSKY et al., 2007). Os picos 11 e 12 sugerem a presença de
flavonóis (banda I em 250-270 nm, banda II em 350 -380 nm). Dessa classe de
substâncias foram descritas para a romã a quercetina e o kampferol (LANSKY et al.,
2007).
22
Figura 3. Análise do extrato das folhas da romã por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)
em fase reversa. Foram utilizadas duas colunas monolíticas acopladas (Onix C18, 200 x 300 mm,
Phenomenex) protegidas por uma pré-coluna equivalente; a fase móvel foi composta de H2O (0.5%
AcOH) e MeCN; e a leitura foi feita a 325nm.
O espectro de absorção no UV de muitos dos picos observados na Figura 3
parecem sugerir a presença de taninos hidrolisáveis derivados provavelmente dos
ácidos gálico e elágico. Os picos 4, 6 e 7 são prováveis derivados do ácido gálico
(UV máx do ácido gálico = 269 nm, derivados = banda II em torno de 260 nm e
banda I em 360 - 380 nm). Muitos são os taninos hidrolisáveis descritos para a romã.
Como exemplos podem ser citados a punicalina, punicalagina, corilagina,
casuarinina e a pedunculagina, entre outros (FISCHER et al., 2011; GIL et al., 2000,
LANSKY et al., 2007).
Os demais picos não puderam ter suas classes inferidas simplesmente a
partir de seus espectros de absorção no UV.
23
4.2. Obtenção das Micropartículas
O método pelo qual as micropartículas foram produzidas envolveu a
emulsificação entre a fase orgânica composta pelo solvente orgânico e polímero e a
fase aquosa que continha o extrato da planta e tensoativo. A partir da obtenção das
micropartículas foi determinado o rendimento das mesmas, de acordo com a
fórmula:
R (%) = (Mf/Mi) x 100
R (rendimento das micropartículas), Mf (massa final das micropartículas), Mi (massa
inicial da amostra em g)
De acordo com o cálculo, as micropartículas sem o extrato encapsulado
(controle) apresentaram rendimento de 74,7% e as micropartículas com o extrato
encapsulado 97,9%.
Os valores obtidos mostram que o método para encapsulação do extrato
utilizado neste trabalho apresentou boa eficiência. Foi observado que a adição do
extrato aumentou o rendimento das partículas com relação ao rendimento obtido
para as micropartículas controle. Essa característica sugere que o extrato da romã
adicionado na formulação foi encapsulado ou adsorvido à parede externa do
polímero, já que a quantidade de polímero e as condições experimentais foram
mantidas no preparo das duas formulações (micropartículas controle e
micropartículas contendo o extrato encapsulado).
24
4.3. Caracterização das micropartículas
4.3.1 Análise da distribuição dos diâmetros médios das partículas
Após a liofilização das micropartículas obtidas através do método de
evaporação-extração do solvente, foi realizada a caracterização in vitro das mesmas,
através da análise da distribuição dos seus diâmetros médios, sendo reconstituídas
em água bi-destilada, a 25°C. O método utilizado para essas análises foi a
difratometria a laser.
Os sistemas de partículas sem a incorporação do extrato (Fig. 4A) e as
partículas contendo extrato de romã (Fig. 4B) apresentaram, respectivamente,
valores de diâmetro médio de 7,22 e 7,31 µm. Esses resultados revelaram que 50%
das micropartículas contendo ou não o extrato encapsulado apresentaram diâmetros
próximos daqueles possíveis de serem utilizados para a via de administração
intranasal nos animais, uma vez que a análise dos diâmetros por distribuição segue
a curva de Gauss.
25
(A)
(B)
Figura 4. Distribuição dos diâmetros médios das micropartículas controle (A) ou contendo o extrato
hidroalcoólico de romã (B). As partículas foram reconstituídas em água bi-destilada e analisadas a
temperatura ambiente.
26
4.3.2 Determinação do Potencial Zeta
O valor do Potencial Zeta é um parâmetro muito importante a ser analisado nas
partículas, principalmente quando a finalidade destas é a aplicação biomédica, pois
a fagocitose das micropartículas poliméricas pelos macrófagos é favorecida pelo
aumento do valor absoluto dessa medida (LI, TIAN, 1997).
O Potencial Zeta das micropartículas não funcionalizadas (sem a incorporação
do extrato) foi de -0,70 mV. As micropartículas funcionalizadas (contendo extrato de
romã) apresentaram valor de -1,37 mV. A Figura 5 mostra os perfis dos dois
sistemas microparticulados. De acordo com estes resultados, ambas formulações
exibem um valor de Potencial Zeta negativo. O valor encontrado para as
micropartículas sem a encapsulação do extrato (Fig. 5A) é significativamente menor
em valor absoluto do que o das micropartículas contendo o extrato (Fig. 5B).
27
(A)
(B)
Figura 5. (A) Potencial zeta com valor de -0,70mV para micropartículas sem a incorporação do
extrato de romã, e (B) Potencial zeta com valor de -1,37 mV para micropartículas contendo o extrato
de romã. As partículas foram reconstituídas em água bi-destilada e analisadas a temperatura
ambiente.
28
4.4 Micropartículas contendo extrato de romã inibem o recrutamento
leucocitário, principalmente de eosinófilos, para o LBA
A eficácia terapêutica das micropartículas foi avaliada utilizando modelo de
asma murina. A asma foi induzida através de sensibilizações e desafios com solução
de ovalbumina e os animais foram divididos em grupos os quais receberam os
tratamentos com as micropartículas contendo ou não o extrato de romã,
Dexametasona, ou o extrato não encapsulado. O grupo controle recebeu apenas
solução salina nas sensibilizações e desafios. A característica marcante na asma é o
aumento de células inflamatórias como macrófagos, eosinófilos, neutrófilos e
linfócitos. Portanto, foi feita a contagem total e diferencial das células inflamatórias
obtidas a partir do LBA dos pulmões dos animais para avaliação do efeito dos
tratamentos utilizados (Fig. 6).
O número total de células inflamatórias do grupo de animais com asma (OVA)
foi 30,8 x 104 céls/mL, estatisticamente mais elevado que o grupo controle (animais
não asmáticos) (Fig. 6A). Esse número foi significativamente reduzido quando
comparado aos grupos tratados com as micropartículas contendo o extrato de romã
encapsulado (16,9 x 104 céls/mL), ou com a Dexametasona (19,0 x 104 céls/mL) ou
com o extrato de Romã não encapsulado (14,6 x 104 céls/mL). O grupo que recebeu
as micropartículas controle, ao contrário dos outros grupos de tratamento, mostrou
um aumento estatisticamente significativo no número de células recrutadas (38.06 x
104 céls/mL). Em relação aos tipos celulares, o número de eosinófilos (Fig. 6E),
principais células envolvidas no processo inflamatório crônico da asma, foi
significativamente reduzido no grupo de animais tratados com as micropartículas de
romã (1,24 x 104 céls/mL) quando comparado ao grupo asmático (OVA, 4,7 x 104
céls/mL). Os animais que receberam as micropartículas controle ou a Dexametasona
como tratamentos também apresentaram contagens baixas dessas células.
Entretanto, os animais tratados com o extrato de romã não encapsulado não
mostraram redução significativa comparados ao grupo OVA. Em relação aos
neutrófilos, o grupo de animais que recebeu as micropartículas controle
apresentaram um aumento estatisticamente significativo (13,22 x 104 céls/mL)
comparado aos grupos salina (0,13 x 104 céls/mL), OVA (0,21 x 104 céls/mL) e
Dexametasona (0,60 x 104 céls/mL). Foi observada também a redução desse
29
número de células na presença do extrato encapsulado, ou seja, os animais tratados
com as micropartículas contendo o extrato encapsulado apresentaram redução
significativa de neutrófilos (1,01 x 104 céls/mL) comparados com o grupo que
recebeu as micropartículas controle.
Figura 6. Efeito dos tratamentos com as preparações sobre o número de leucócitos totais em modelo
de asma murina. Amostras do LBA de camundongos (n=6) foram coletadas e após 24h do último
desafio com OVA foi realizada contagem total das células em câmera de Neubauer (A). Contagem de
Macrófagos (B), Linfócitos (C), Neutrófilos (D) e Eosinófilos (E) foram realizadas em esfregaços
preparados em citocentrífuga e coradas com corante panótico. Os dados são mostrados como sendo
média +/- DP. * p<0,05, ** p<0,01 *** p<0,001, comparados com controle negativo (salina); ##
p<0,01, e ### p<0.001 comparados com o grupo Ova, & p<0,05, &&& p<0,001 comparados com o
grupo Dexametasona, $ p<0,05 e $$$ p<0,001 comparados ao grupo micropartículas controle.
30
4.5 Micropartículas contendo extrato de romã não alteram o extravasamento de
proteínas para o LBA
O início do processo inflamatório é caracterizado por eventos vasculares que
ocorrem imediatamente após o estímulo inflamatório, o que provoca vasodilatação
seguido de maior permeabilidade vascular e consequente passagem de moléculas
para o tecido inflamado. Para avaliar se os tratamentos utilizados no modelo de
asma apresentaram efeitos sobre o extravazamento de proteínas para o tecido
pulmonar, a quantificação de proteínas totais foi avaliada no LBA dos animais (Fig.
7). Nenhuma redução significativa nos níveis de proteínas foi obtida pelos
tratamentos com as micropartículas ou com o extrato não encapsulado.
Figura 7. Extravasamento proteico para o lavado broncoalveolar (LBA) de camundongos. Os animais
foram divididos em grupos: Salina, Ova, Dexametasona, Micropartículas controle, Micropartículas
romã e romã (extrato não encapsulado). Os dados são mostrados como sendo média +/- DP.
31
4.6 Micropartículas contendo extrato de romã não alteram a produção de
derivados do óxido nítrico no LBA
Com o objetivo de avaliar se o tratamento com as preparações contendo o
extrato de romã foi capaz de alterar a produção de NO pelos leucócitos,
principalmente macrófagos, foram quantificados os níveis de nitritos produzidos no
LBA dos camundongos. Os resultados deste estudo demonstram que, exceto o
aumento observado para o grupo tratado com o extrato de romã não encapsulado,
não houve diferença na produção de NO entre os outros grupos avaliados.
Figura 8. Efeito do tratamento com preparações farmacêuticas sobre a produção de óxido nítrico.
Amostras do LBA de camundongos foram coletadas 24h após o último desafio com OVA e
quantificada a produção de óxido nítrico através de seus derivados pelo método de Griess. Os dados
são mostrados como sendo média +/- DP. * p<0.05, comparado com controle (salina); # p<0,05,
comparado com o grupo Ova.
32
4.7 Micropartículas contendo extrato de romã diminuem a produção das
citocinas IL-1β e IL-5 no LBA
A quantificação das citocinas IL-1β e IL-5 no LBA dos animais foi determinada
por ELISA (Fig. 9). Os resultados mostram que no grupo de animais asmáticos
(OVA) houve aumento significativo nos níveis de IL-1β em comparação com o grupo
controle (Salina) e este aumento foi significativamente atenuado por todos os
tratamentos (Fig. 9A). Os grupos tratados com Dexametasona e com as
micropartículas contendo o extrato apresentaram níveis semelhantes ao grupo
controle (Salina). Os tratamentos com as micropartículas controle (sem extrato) e
extrato não encapsulado (romã) também apresentaram redução significativa em
comparação com o grupo controle. Quanto aos níveis de IL-5 (Fig. 9B), o tratamento
com as micropartículas contendo o extrato de romã foi capaz de reduzir
significativamente os níveis desta citocina, em comparação ao grupo OVA. Os outros
tratamentos também apresentaram bons níveis de redução. O grupo tratado com o
extrato de romã não encapsulado (romã) apresentou níveis muito baixos de IL-5, não
detectados no ensaio.
33
Figura 9. Efeitos do tratamento com as preparações sobre a produção de IL- 1β e IL-5. A
quantificação foi feita no sobrenadante do LBA dos animais. * p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001
comparados ao grupo controle (salina). # p<0,05; ## p<0,01; ###p<0,001 comparados ao grupo Ova.
& p<0,05 comparado ao grupo Dexametasona e $$ p<0,01 comparado ao grupo Microp. Controle.
34
4.8. Micropartículas contendo extrato de romã inibem o recrutamento
leucocitário e a produção de muco no tecido pulmonar
Para investigar os efeitos do extrato de romã encapsulado ou não em
alterações patológicas do tecido pulmonar no modelo de asma murina, os tecidos
dos pulmões foram corados com hematoxilina e eosina (HE) e com ácido periódico
de Schiff (PAS) (Fig. 10). Os animais asmáticos (OVA), mostraram aumento
leucocitário nos tecidos peribrônquicos (Fig. 10B) e hipersecreção de muco pelas
células caliciformes nos brônquios (representados pelas setas brancas), comparado
com os tecidos pulmonares do grupo controle (Salina) (Fig. 10A). Os animais que
receberam Dexametasona (Fig. 10C) também mostraram menor infiltração de
leucócitos no tecido pulmonar em relação ao grupo OVA. O extrato de romã
encapsulado quando entregue ao microambiente pulmonar, especialmente quando
comparado com micropartículas controle, inibiu de forma evidente as alterações
patológicas (Fig. 10E). Além disso, o extrato não encapsulado também diminuiu
alterações histológicas no parênquima pulmonar durante o processo asmático,
porém não foi capaz de reduzir na mesma intensidade a quantidade de muco
produzida pelas células do glicocálix (Fig. 10F).
35
Figura 10. Secções representativas dos pulmões dos grupos: salina (A), Ova (B), Dexametasona (C),
micropartículas controle (D), micropartículas contendo extrato de romã (E) e extrato de romã não
encapsulado (F). A infiltração de células inflamatórias nos tecidos pulmonares foi avaliada pela
coloração hematoxilina eosina (coluna da esquerda). A hipersecreção de muco nos tecidos dos
pulmões foi mostrada usando coloração pelo ácido periódico de Schiff (coluna da direita). As setas
brancas mostram infiltração de leucócitos e áreas de hipersecreção de muco. Aumento de 100x.
36
5. DISCUSSÃO
Micro ou nanopartículas poliméricas tem sido utilizadas frequentemente como
veículo de drogas terapêuticas para o pulmão devido as várias vantagens
apresentadas por esses sistemas, incluindo a liberação controlada de fármacos
encapsulados e a fácil administração de forma minimamente invasiva (OH et al.,
2011).
Os resultados obtidos neste estudo demonstram num primeiro momento, que
as micropartículas biodegradáveis produzidas a partir do polímero PLGA pelo
método da emulsão múltipla e evaporação do solvente, sem qualquer bioativo ou
com o extrato da P. granatum encapsulado apresentaram um diâmetro médio dentro
da faixa de tamanhos utilizados para a via de administração intranasal nos animais
(5 a 9 μm), bem como mostraram eficiente entrega do extrato encapsulado no
microambiente pulmonar. Num estudo realizado por Oh e colaboradores (2011),
micropartículas de PLGA com corticosteroide inalatório encapsulado e com diâmetro
semelhante ao das partículas utilizadas no nosso estudo foram capazes de reduzir
significativamente o número de células inflamatórias no LBA de camundongos com
asma induzida por ovalbumina, bem como a hiperresponsividade brônquica e a
infiltração de células inflamatórias observada nos pulmões. Estes resultados, apesar
de terem sido conduzidos com corticosteroide se assemelham aos nossos, utilizando
o sistema de polímero biodegradável para entrega do extrato de romã como
abordagem promissora para o tratamento da asma, em especial com base nos
resultados obtidos comparando a eficácia deste sistema com a atividade do extrato
não encapsulado.
A migração de células inflamatórias, principalmente os eosinófilos para o
tecido pulmonar é o evento que perpetua na asma, e caracteriza a fase tardia e a
cronicidade da doença. Foi demonstrado neste estudo que o tratamento com as
micropartículas contendo o extrato de P. granatum encapsulado diminuiu
significativamente o número de células recrutadas para o LBA dos animais em
comparação com o grupo de animais asmáticos e não-tratados (OVA). O mesmo foi
observado nos grupos tratados com o extrato não encapsulado ou Dexametasona.
Este fato pode estar relacionado com a diminuição da expressão de moléculas de
adesão endotelial. O tráfego de leucócitos entre a corrente sanguínea e o espaço
37
extravascular é controlado pelo endotélio vascular. A cascata de sequenciais
interações dos leucócitos com células de adesão endotelial que envolve uma
variedade de moléculas de adesão celular (CAMs) presentes nos leucócitos e nas
células endoteliais medeiam a migração de leucócitos do sangue para os locais de
inflamação ou lesão extravascular (COOK-MILLS e DEEM, 2005 ). Neste contexto,
um estudo com o extrato etanólico preparado a partir das folhas da P. granatum
avaliou a sua capacidade de inibir ICAM-1 (molécula de adesão intercelular-1
célula), VCAM-1 (molécula de adesão celular vascular 1) e a expressão de selectina-
E em células endoteliais de veia umbilical humana (HUVEC) induzidas por TNF-α.
Os resultados mostraram que o extrato inibe significativamente a expressão de
ICAM-1 (55%), VCAM-1 (57%) e selectina-E (51%) em HUVEC. Além disso, foi
demonstrada a capacidade do extrato etanólico inibir a aderência de neutrófilos ao
endotélio (56%) (BALWANI et al., 2011). Neste contexto, e relacionando estes
resultados ao nosso estudo, podemos sugerir que os números decrescentes de
leucócitos totais presentes no LBA e também no parênquima pulmonar dos animais
observados no nosso estudo pode estar relacionado com a ação inibitória do extrato
liberado pelas partículas nos pulmões após a instilação intranasal. Em contraste, o
grupo de animais que recebeu o tratamento com micropartículas sem qualquer
molécula encapsulada mostrou aumento no número de células recrutadas para o
LBA e também na infiltração de células inflamatórias no tecido do pulmão. Este
achado pode ser devido ao fato das micropartículas, por si só constituírem um
estímulo inflamatório, após o processo de captura pelas células fagocíticas. Este
processo leva à translocação do NF-kB para o núcleo da célula e estimula
acentuadamente a produção de citocinas inflamatórias, incluindo a IL-1β (NICOLETE
et al., 2011). Isto foi evidenciado no nosso estudo pelo aumento significativo no
número de neutrófilos recrutados para o LBA do grupo de animais que receberam o
tratamento com as micropartículas controle.
Nossos resultados mostram que a redução de células inflamatórias no grupo
de animais tratados com as micropartículas contendo o extrato de romã encapsulado
é devida à atividade do extrato liberado no tecido pulmonar, indicando que existe
uma boa taxa de degradação das partículas e que o sistema de liberação controlada
do extrato pode modular a resposta inflamatória/alérgica desenvolvida no quadro de
asma.
38
A análise do extrato de P. granatum usando CLAE mostrou um perfil
fitoquímico semelhante aos dados descritos na literatura para esta planta, que
descrevem, principalmente, a presença de taninos hidrolisáveis (punicalina,
punicalagina, corilagina, casuarinina e pedunculagina) e flavonóides (quercetina e
kampferol), catequinas (catequina, epicatequina e 3-galato epicagalocatequina)
(LANSKY e NEWMAN, 2007). Uma variedade de moléculas presentes nesta planta
implica em muitas diferentes atividades biológicas, bem como em uma variedade de
mecanismos de ação. Neste contexto, a análise do Potencial Zeta foi realizada para
verificar se a encapsulação do extrato etanólico da romã iria alterar a carga negativa
do polímero utilizado para produzir as micropartículas. Os resultados mostraram que
as micropartículas contendo o extrato apresentaram um valor de Potencial Zeta mais
negativo em relação às micropartículas controle (-1,37 vs. -0,70 mV). Este resultado
sugere que alguns grupamentos de moléculas (metabólitos secundários) presentes
no extrato etanólico podem ter fornecido íons para a superfície do polímero e este
fato pode estar envolvido com a captura mais eficiente das partículas que contém o
extrato pelas células fagocíticas no pulmão.
Quanto às citocinas envolvidas no processo inflamatório, a IL-1β é uma das
que atuam no início do processo inflamatório e executa várias ações sobre as
células endoteliais, incluindo a síntese de moléculas de adesão, a indução da
liberação de vários mediadores inflamatórios, tais como as prostaglandinas,
prostaciclinas e tromboxanos. A presença desta citocina na asma provoca a
persistência da inflamação e contínuo recrutamento de células inflamatórias para os
pulmões (WHELAN et al., 2004). Os resultados mostram que todos os grupos de
animais tratados apresentaram níveis reduzidos de IL-1β. Em relação a IL-5, esta é
a principal citocina envolvida na fase tardia da asma, que é responsável pela
proliferação, migração e acúmulo de eosinófilos a partir de medula óssea para o
sangue (FACCIOLI et al., 1996; ROGÉRIO et al., 2003). O tratamento com as
micropartículas contendo o extrato de romã mostrou redução significativa na
produção de IL-5 em comparação com animais asmáticos e não tratados (grupo
OVA), bem como aqueles tratados com Dexametasona. Os níveis detectados foram
bem inferiores a todos os outros grupos, especialmente em comparação com os
animais que receberam as micropartículas controle. Curiosamente, o grupo tratado
com o extrato de romã não encapsulado apresentou níveis muito baixos de IL-5, não
39
detectados no ensaio. Estes resultados estão de acordo com o observado para as
baixas contagens de células, especialmente eosinófilos, recuperados a partir do LBA
dos animais que receberam a instilação do extrato microencapsulado. Este fato
sugere que estas micropartículas foram capazes de modular a resposta imune
envolvida na asma, provavelmente, através da regulação do eixo Th1/Th2, bem
como de proteger o extrato de rápido metabolismo, prolongando assim o seu efeito
local no tecido pulmonar.
Além da redução na quantidade de leucócitos totais recrutados para o LBA foi
também observado que o extrato encapsulado quando entregue ao microambiente
pulmonar, especialmente quando comparado ao grupo que recebeu as
micropartículas controle, inibiu significativamente as alterações patológicas, ou seja,
inibiu o infiltrado de leucócitos nos tecidos peribrônquicos bem como a
hipersecreção de muco pelas células caliciformes nos brônquios. Além disso, o
extrato não encapsulado também diminuiu alterações histológicas no parênquima
pulmonar durante o processo asmático, porém a hipersecreção de muco
permaneceu inalterada. Tal fato sugere que o extrato na forma de solução promoveu
sua ação biológica de forma imediata após a aplicação intranasal, diferentemente do
extrato microencapsulado, o qual foi liberado de forma gradativa e pôde ter exercido
sua atividade por um período de tempo maior, preservando os metabólitos
secundários da romã no interior da rede polimérica.
O extravasamento de proteínas no tecido do pulmão é um evento que
aparece no início do estabelecimento da inflamação. Os resultados obtidos nesse
estudo não mostraram diferença significativa entre os tratamentos. Uma vez que o
modelo de asma utilizado constitui uma condição crônica, o extravasamento pode ter
ocorrido em fases anteriores, e não pôde ser avaliado de forma comparativa entre os
grupos de animais tratados.
Embora existam diversos estudos biológicos que envolvam o papel do óxido
nítrico na asma, ainda há dúvidas quanto a sua ação, nesta patologia. Por exemplo,
não se sabe ao certo se o aumento da produção de NO é primeiramente benéfico
por sua ação broncodilatadora (HOGMAN et al., 1993) ou se há exacerbação na
produção por ação pró-inflamatória tóxica, perpetuando e amplificando a inflamação
devido ao aumento do extravasamento de plasma das vênulas pós-capilares.
Evidências indicam que doenças inflamatórias do trato respiratório são comumente
40
associadas com elevada produção de NO (SALEH et al.; 1998; RICCIARDOLO,
2003).
Os resultados obtidos neste estudo quanto ao ensaio para detecção de nitritos,
como medida indireta da produção de NO, mostraram que, à exceção do aumento
apresentado pelo grupo de animais que recebeu o extrato de romã não
encapsulado, não houve diferença significativa na produção deste mediador pelos
leucócitos dos animais tratados com as micropartículas quando comparados aos
animais asmáticos não tratados. Tal fato sugere que a liberação imediata do extrato
nos pulmões na forma de solução fez com que a ação farmacológica sobre os
leucócitos para a produção de NO fosse mais intensa e menos controlada, como
observado nos grupos que receberam as micropartículas contendo o extrato
encapsulado.
Quando comparada com as administrações convencionais de medicamentos
(soluções, suspensões, emulsões, etc), nas quais a concentração de fármaco no
sangue ou em outro local apresenta um pico e, em seguida, diminui, os sistemas de
liberação controlada oferecem a grande vantagem de manter uma concentração de
droga constante/sustentada na faixa terapêutica durante um período prolongado,
utilizando doses únicas ou reduzidas. Do ponto de vista clínico, o controle da
concentração terapêutica é importante, pois, aumenta a eficácia terapêutica e reduz
a potencial toxicidade que poderia ser alcançada com extratos em bruto em forma de
solução. (AHMAD et al., 2011)
Tomados em conjunto, nossos resultados mostram que o tratamento de asma
com o extrato de romã microencapsulado reduz a expressão de marcadores-chave
envolvidos na inflamação pulmonar alérgica em modelo murino. É importante
ressaltar que, embora não tenham sido avaliadas outras citocinas, incluindo IL-4, IL-
13, IL-8, ou outros mediadores inflamatórios (LAMPINEN et al., 2004), os
metabólitos secundários presentes e preservados nas micropartículas
desempenharam um importante papel na inibição do recrutamento principalmente de
eosinófilos, sugerindo que este tipo celular pode também ser modulado pelo extrato
liberado nos pulmões.
Este estudo demonstra pela primeira vez que o extrato etanólico das folhas de
P. granatum apresenta atividade biológica significativa em modelo murino de asma e
mais importante, nesta investigação, o possível mecanismo de redução do
41
recrutamento celular para o LBA, principalmente de eosinófilos, bem como da
produção das interleucinas (IL-1β e IL-5) foi proposto por meio da liberação
prolongada do extrato através da encapsulação do mesmo em micropartículas
biodegradáveis. Tal abordagem evidencia que houve supressão dos mecanismos
que induzem a exacerbação na resposta Th2, embora a quantidade de extrato
encapsulado e liberado das partículas não tenha sido mensurada neste estudo.
Diante deste cenário, os resultados aqui apresentados mostram que o extrato
encapsulado em micropartículas biodegradáveis tem maior potencial terapêutico
para ser empregado em doenças inflamatórias/alérgicas do trato respiratório que a
forma em solução do extrato.
42
6. CONCLUSÕES
- A análise fitoquímica do extrato de P. granatum confirmou a presença de
grupamentos de moléculas (metabólitos secundários) responsáveis por atividades
biológicas da planta;
- O método utilizado neste trabalho para encapsulação do extrato
hidroalcoólico da romã foi eficaz, atendendo ao objetivo proposto, o qual permitiu a
produção de micropartículas biodegradáveis com características físico-químicas
adequadas à liberação do extrato no microambiente pulmonar;
- As micropartículas contendo o extrato encapsulado apresentaram-se
capazes de modular a resposta imunológica no modelo estudado; quando
administradas nos animais asmáticos foram capazes de reduzir o recrutamento
celular para o LBA, bem como os níveis de citocinas envolvidas na doença;
- Nenhuma redução significativa nos níveis de proteínas foi obtida pelos
tratamentos com as micropartículas ou com o extrato não encapsulado no modelo
utilizado no estudo;
- Com exceção do grupo tratado com o extrato de romã não encapsulado, não
houve diferença na produção de NO entre os grupos avaliados;
- O extrato de romã encapsulado quando entregue ao microambiente pulmonar,
especialmente quando comparado com micropartículas controle, inibiu
significativamente alterações patológicas, fato que mostra um efeito supressor sobre
a inflamação das vias aéreas. Além disso, o extrato não encapsulado também
diminuiu alterações histológicas no parênquima pulmonar durante o processo
asmático; porém a produção de muco manteve-se evidente;
- Tomados em conjunto, os resultados deste estudo indicam que a abordagem
utilizada com sistemas de liberação modificada de drogas pode ser uma alternativa
complementar na entrega de bioativos aos pulmões para aplicação terapêutica em
doenças inflamatórias/alérgicas, especialmente a asma.
43
7. REFERÊNCIAS
AALBERS, R., KAUFFMAN, H.F., VRUGT, B., SMITH, M., KOETER, G. H., TIMENS
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Immunol. v.121(1):10-8, 2000.
ZIMMERMAN, G. A.; MCLNTYRE, M. M.; PRESCOTT, S. M. Adhesion and signaling
in vascular cell-cell interactions. J. Clin. Invest., v.98:1699-1702, 1996.
ZOSKY, G. R., SLY, P. D. Animal models of asthma. Clinical & Experimental
Allergy, v.37:973–988, 2007.
56
ANEXO
57
ANEXO A – PARECER DE APROVAÇÃO DA COMISSÃO DE
ÉTICA E EXPERIMENTAÇÃO ANIMAL DA UNIVERSIDADE
ESTADUAL DO MARANHÃO (CEEA/UEMA)
Projeto: Avaliação do potencial terapêutico de preparações farmacêuticas contendo
Punica granatum (ROMÃ) em modelo de asma murina.
58
59
APÊNDICE
60
Therapeutic potential of biodegradable microparticles containing Punica
granatum L. (Pomegranate) in murine model of asthma
Jéssica F. F. de Oliveiraa, Diego V. Garretob, Mayara C. P. da Silvac, Thiare S.
Fortesc, Flávia R. F. Nascimentoc, Fernando B. Da Costad, Marcos A. G. Grisottoa,
Roberto Nicoletea,e *
aPró-Reitoria de Pós-Graduação, Pesquisa e Extensão, Universidade CEUMA
(UNICEUMA), Rua Josué Montello, 1, 65075-120, São Luís, Maranhão, Brazil.
bInstituto Florence de Ensino, Rua Rio Branco, 216, São Luís, Maranhão, Brazil.
cDepartment of Pathology, Laboratory of Immunophysiology, Biological and Health
Sciences Center, Federal University of Maranhão (UFMA), 65085-580 São Luís,
Maranhão, Brazil.
dDepartamento de Ciências Farmacêuticas, Faculdade de Ciências Farmacêuticas
de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Av. do Café s/n, 14040-903, Ribeirão
Preto, São Paulo, Brazil.
eFundação Oswaldo Cruz – Fiocruz Rondônia, Rua da Beira 7671, 76812-245, Porto
Velho, Rondônia, Brazil.
*Corresponding author: Roberto Nicolete, Fundação Oswaldo Cruz – Fiocruz
Rondônia, Rua da Beira 7671, 76812-245, Porto Velho, Rondônia, Brazil, Tel: +55
69 3219-6010; Fax: +55 69 3219-6000; E-mail: [email protected]
61
Abstract
Asthma is a chronic inflammatory disease, which with a high number of deaths
and high socio-economic status, is a global public health problem. Since traditional
treatments present numerous side effects, there is a clear need to seek novel
compounds potentially medicinal, especially those derived from plants. In this
context, stands out Punica granatum L., known as Pomegranate. The crude extracts
have been used to treat diarrhea, dysentery, and dental plaque with several
important active molecules, such as polyphenols, antioxidants and other flavonoids.
Among the options for treatment of diseases affecting the respiratory system,
especially asthma, drug delivering systems for intranasal application represent an
important therapeutic approach at the site of inflammation. The present study aimed
to evaluate the therapeutic effect of biodegradable microparticles formed by poly
lactic-co-glycolic acid (PLGA) containing encapsulated pomegranate extract on
murine model of asthma. The extract was acquired from the leaves of P. granatum
and characterized qualitatively by HPLC. A w/o/w emulsion solvent extraction–
evaporation method was chosen to prepare the microparticles containing
Pomegranate encapsulated extract (MP). We determined their diameters and zeta
potential. OVA-sensitized BALB/c mice were used as asthma model and treated with
the preparations. MP were able to inhibit leukocytes’ recruitment to bronchoalveolar
fluid, especially, eosinophils, decreasing nitrites and cytokines (IL-1β and IL-5) levels
and also mucus production in the lungs. This approach can be used as an
alternative/supplementary therapy for managing inflammatory processes, especially
those with pulmonary complications.
Keywords: Microparticles, Poly (lactic-co-glycolic acid), Punica granatum L.,
Inflammation, Asthma
62
1. Introduction
Asthma is chronic lung disease that involves many inflammatory cells and
proteins. The complex inflammatory disorder that characterizes asthma is associated
with eosinophilic inflammation, airway hyperresponsiveness and hypersecretion of
mucus by goblet cells (Barnes, 2003; Tattersfield et al., 2002). Inhaled corticosteroids
are effective in treating chronic asthma, but the adverse side effects displayed by
these substances severely limit their long-term use (Barnes, 2004). The extracts of
numerous plants are reported as potent therapeutic materials in various diseases,
including inflammatory processes such as asthma (Yang et al., 2008; Yuk et al.,
2007; Clardy and Walsh, 2004; Koehn and Carter, 2005; Rogerio et al., 2008;
Verpoorte, 1999). Experimental models to screen the pharmacologic activities of
plant extracts well as isolated compounds (secondary metabolites) have been used
with success in the course of a continued search for bioactive natural products
derived from plants (Rogerio et al., 2010).
Punica granatum L., known as Pomegranate, is a common fruit cultivated in
tropical and subtropical regions of the world (Jurenka, 2008). Pomegranate juice is a
naturally rich source of polyphenols and other antioxidants including punicalagin,
ellagic acid, gallotannins, anthocyanins (cyanidin, delphinidin and pelargonidin
glycosides) and also flavonoids (quercetin, kaempferol and luteolin glycosides)
(Fischer et al., 2011). These components suggest a wide range of clinical
applications for the treatment and prevention of several diseases where chronic
inflammation is believed to play an essential etiologic role (Lansky and Newman,
2007). The extract has been used to treat diarrhea, dysentery, and dental plaque
(Lansky et al., 2004). A study using the classical experimental model of ovalbumin-
63
induced asthma performed with the plant (Lafoensia pacari), which belongs to the
same family as the Pomegranate showed that treatments made with the plant extract
and ellagic acid (secondary metabolite) were able to interfere with the development
and establishment of airway allergic inflammation, inhibiting leukocyte recruitment to
the pulmonary parenchyma and also cytokines’ production (Rogerio et al., 2008). The
described anti-inflammatory components of Pomegranate extract, i.e., punicalagin,
punicalin, strictinin A and granatin B significantly reduced production of nitric oxide
and PGE2 by inhibiting the expression of proinflammatory proteins (Lee et al., 2008;
Romier et al., 2008). In this context, we can speculate that some metabolites from
Pomegranate, such as ellagic acid cited above, can contribute to the potential activity
against allergic and inflammatory processes present in the asthma.
The use of polymeric microparticles as a pulmonary delivery vehicle for
therapeutic drugs have been frequent due to their many advantages, including the
controlled release of encapsulated drugs and easy administration in a minimally
invasive manner (Nicolete et al., 2007; Nicolete et al., 2008; Sung et al., 2007; Oh et
al., 2011). When compared to conventional drug administration, the controlled
release systems offer the great advantage of maintaining a sustained/constant drug
concentration in the therapeutic range for a prolonged period (Pilcer and Amighi,
2010).
64
2. Materials and methods
2.1. Materials
Poly (D,L-lactide-co-glycolide) (PLGA) with a co-monomer ratio of 50:50
(lactic/glycolic acid) and molecular weight of 78 kDa was obtained from Boehringer
Ingelheim (Ingelheim, Germany). Poly (vinyl-alcohol) (Mowiols 40–88) was obtained
from Aldrich Chemicals (Wankee, WI, USA). Methylene dichloride was purchased
from Merck (Dietikon, Switzerland). Chicken ovalbumin (OVA) was obtained from
Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA); dexamethasone was from Aché
pharmaceutical laboratories S.A (Guarulhos, SP, Brazil); Griess` reagent was from
Sigma Aldrich Brasil Ltda. (São Paulo, SP, Brazil).
2.2. Preparation of the Pomegranate extract
The fresh leaves of the plant were collected in Herbarium of the Universidade
Federal do Maranhão, São Luis (Brazil). Punica granatum L. (Pomegranate) is
deposited in the collection of the University Herbarium and cataloged under 01002
voucher. The hydroalcoholic extract was obtained by maceration 20 g of plant leaves
previously washed and crushed in a closed container containing 200 mL water-
alcohol solution (70% ethanol, v/v) at room temperature. Ethanol as solvent was
chosen based on the results obtained by Bekir et al. (2013). The solution was
maintained for 8 days in amber glass under the dark and with occasional agitation.
Thereafter, we proceeded to filtration extractive liquid, which then was
rotaevaporated at a temperature of 60-70 °C in thermostatic bath.
65
2.3. Analysis of the extract by High Performance Liquid Chromatography
(HPLC)
The analysis was conducted by high performance liquid chromatography
(HPLC) on reverse phase. The equipment used was a Shimadzu liquid
chromatography (Japan) 10 SCL Avp coupled to UV-DAD detector Shimadzu SPD-
M10Avp and an automatic gun. The gradient elution consisted of a binary mobile
phase composed of H2O (0.5% AcOH) and MeCN in a linear gradient of 0 to 50% of
MeCN in 30 min and 50 to 100% of MeCN in 30 min to 35 min while maintaining at
100% of MeCN for 5 min to clean the column. Two monolithic columns coupled
(Onyx C18, 200 x 300 mm, Phenomenex) protected by a precolumn equivalent were
used for the analyses. The sample was analyzed by dissolving 100 µL of the extract
(100 mg/mL) in 500 µL of a solution of MeOH: H2O (1:1 v/v), followed by subsequent
filtration on PTFE filter (0.45 mm). The injected volume was 10 µL.
The presence of some classes of metabolites was inferred from their UV
absorption spectrums, based on literature information about phytochemical profile of
Pomegranate (Fischer et al., 2011; Gil et al., 2000, Lansky and Newman, 2007) and
also its general structures of the important phenolic compounds described (Ismail et
al., 2012).
2.4. Microparticles’ preparation
The microparticles containing the extract of encapsulated Pomegranate (MP)
were prepared using the double emulsion/solvent evaporation method, as previously
66
described (Nicolete et al., 2008) with some modifications. Briefly, 200 µL of the
extract (100 mg/mL) were added to dichloromethane solvent (5 mL) (JT Baker/
Mallinckrodt, Phillipsburg, NJ, USA) containing 100 mg of PLGA polymer (Resomer
RG 505, Germany) to produce a primary water-in-oil emulsion. Subsequently, this
organic phase was stirred mechanically (mini-Q 235, Quimis, Brazil) at 1000 rpm for
3 min and mixed with 40 mL (3% w/v) of an external aqueous phase (polyvinyl
alcohol (PVA), Sigma Chemical Co.) to form a stable water-in-oil in-water emulsion.
This was then placed under a magnetic stirring condition for 4 h to evaporate the
solvent. Finally, microparticles formed were washed three times with doubly distilled
water, centrifuged and then freeze-dried until further use. The control microparticles
(MC) were prepared under the same conditions but without the addition of
Pomegranate extract (PGE).
2.5. Microparticles’ characterization
The particles were reconstituted in distilled water for analysis at room
temperature. Particle diameters were characterized using a particle size analyzer (LS
13 320 Laser Diffraction Particle Size Analyzer; Beckman Coulter, USA). Zeta
potential analysis of the particles was performed using a Nano Zeta Sizer (Malvern
instruments, England).
2.6. Animals
Female BALB/c mice weighing between 20- 25 g (4-6 week old) were used for
the induction of asthma. Mice were obtained from Suprilab - Biotery and Supplies
67
Ltda. (Cachoeirinha-BA) and were maintained in the laboratory of the Instituto
Florence de Ensino, São Luís, Brazil, under standard laboratory conditions. All the
protocols used in this study were approved by the Ethics Committee of Animal
Experimentation of the Universidade Estadual do Maranhão, Brazil (Protocol
CEEA/UEMA no 022/2011).
2.7. Murine model of asthma
The mice were divided into six groups (n=6), and the allergic lung inflammation
was induced in five groups. To induce asthma, each mouse was sensitized with 75
μg ovalbumin and 2 mg Aluminum Hydroxide dissolved in 200 μL of saline on days 0
and 7, followed by two intranasal challenges (on post-sensitization days 14 and 21)
with 50 μg of ovalbumin in 50 μL (25 μl per nostril) of saline delivered with the aid of
a micropipette. This model is widely used and well characterized with similar features
to those in human allergic asthma (Wager et al., 2004). The control group received
only saline without OVA and drug treatment.
2.8. Treatments
Groups of the asthma-induced mice were treated daily from days 18 to 21 with
microparticles containing Pomegranate encapsulated extract (MP, 10 mg/mL, 25 μl
per nostril) or with non-encapsulated pomegranate extract (PGE, 20 mg/Kg, 25 μl per
nostril) by intranasal instillation. For comparison with classical therapy, mice in one
group were treated with i.p. injection of dexamethasone (Dex, 0.4 mg/Kg, 0.2 mL). In
order to evaluate the efficiency of the encapsulated extract, another group was
68
treated with control microparticles (MC, 10 mg/mL, 25 μL per nostril), without the
extract. Animals were killed at 24 h after the second ovalbumin challenge.
2.9. Collection of bronchoalveolar lavage (BAL)
To collect BAL, a polyethylene cannula was introduced into the trachea and
PBS was instilled in three aliquots (0.5 mL) in a total of 1.5 ml. The lavage was
recovered and placed on ice. Total cell counts were immediately carried out using a
Neubauer Chamber. Differential cell counts were performed in light microscopy,
according to standard morphologic criteria, by counting, in a blinded fashion, 100
cells in cytospin preparations stained with Rosenfeld's stain. Following centrifugation
(400 xg, 5 min, 4°C), supernatants of the BAL were collected and stored at -70°C for
subsequent measurement of cytokines and nitrites.
2.10 Cytokines’ assessment
IL-1β and IL-5 were determined by enzyme-linked immunosorbent assay
(ELISA) using commercial assay kit (BD OptEIA™, BD Biosciences, San Diego, CA)
according to the manufacturer`s protocol. The optical density (O.D) of samples was
determined at 450 nm in a microplate reader and cytokine concentrations calculated
from the standard curve.
69
2.11 Proteins and NO assessment
A quantification of total proteins in the BAL supernatants was performed based
on the Biuret method using the standard Total Proteins Assay Kit from Labtest
Diagnostica SA (Lagoa Santa, MG, BRA) according to the manufacturer`s protocol.
Albumin solution (4.0 g/dL) and sodium azide (14.6 mmol/L) were using as a
standard. The absorbance of the test was determined in automated
spectrophotometer at 545 nm.
The production of nitric oxide (NO) by the cells in BAL was indirectly determined
as nitrites by Griess reaction. The supernatants (100 uL) were incubated with equal
volume of Griess reagent (1% sulfanilamine, 0.1% N-(1-naphtyl)-ethylendiamine,
2.5% H3PO4) at room temperature for 15 min. The absorbance was measured by
spectrophotometer at 540 nm and the concentrations were calculated from a sodium
nitrite standard curve. The data are presented as micromoles of NO2- (nitrite) (mean
± S.E.M).
2.12 Histological analysis
Lungs were fixed in 10% neutral formalin, paraffinized, cut into sections (5
μm), and stained with hematoxylin and eosin for examining cell infiltration and with
periodic acid-Schiff stain for measuring mucus production.
2.13 Statistical analysis
70
Data were expressed as a mean ± S.E.M. Multiple comparisons were
performed by one-way ANOVA followed by Turkey post-test using a computer
program GraphPad Prism version 5.0. Values of P < 0.05 were considered
statistically significant.
3. Results
3.1. HPLC profile of Pomegranate extract (PGE)
The presence of some classes of metabolites in the extract was inferred
through their absorption spectra in the UV, based on information in the literature
about the phytochemical profile of Pomegranate (Fischer et al., 2011; Gil et al., 2000,
Lansky and Newman, 2007). The analysis of the extract of the leaves of P. granatum
by HPLC showed peaks between 0 and 25 min, most of them well visualized at 325
nm. The lower retention times indicate a predominance of polar compounds, mainly
of phenolic compounds (Fig. 1). UV absorption spectra of peaks 1, 2 and 3 suggest
the presence of catechin (flavan-3-ols, band II at 270-280 nm). This class of
substance has been described for the Pomegranate catechin, and epicatechin
epicagalocatechin 3-gallate (Lansky and Newman, 2007). The peaks 11 and 12
suggest the presence of flavonols (I band at 250-270 nm band II at 350-380 nm).
This class of substance was described for Pomegranate quercetin and kampferol
(Lansky and Newman, 2007). The UV absorption spectrum of many peaks observed
suggest the presence of hydrolysable tannins probably derived from gallic and ellagic
acid. The peaks 4, 6 and 7 are probable gallic acid derivatives (gallic acid UV max =
71
269 nm, = derivatives II band around 260 nm to I band at 360-380 nm) (Fischer et al.,
2011; Gil et al., 2000, Lansky and Newman, 2007).
3.2. Size and zeta potential
Lyophilized particles were dispersed in distilled water and submitted to analysis
of size distribution. For control microparticles (MC), the average diameter was 7,22
μm (Fig. 2A) and for microparticles containing encapsulated extract (MP) was 7,31
μm (Fig. 2B). The average zeta potential was −0.70 and −1.37 mV, for MC and MP,
respectively.
3.3. MP selectively reduce eosinophils’ recruitment to BAL
The therapeutic efficacy of the microparticles was assessed using murine model
of asthma. Asthma was induced by sensitization and challenged with ovalbumin
solution and the animals were divided into groups that received treatment with
microparticles containing (MP) or not encapsulated Pomegranate extract (MC),
dexamethasone (Dex) or non-encapsulated extract (PGE). The control group
received only saline in sensitizations and challenges steps. The striking feature of
asthma is the increase of inflammatory cells, such as macrophages, eosinophils,
neutrophils and lymphocytes. Therefore, the total and differential cell counts were
performed from the BAL of animals to evaluate the effects of the treatments (Fig. 3).
The total number of inflammatory cells in mice with asthma (OVA) was 30.8 x 104
cells/mL, which was substantially higher than that of control (no asthma-induced
mice) (Fig. 3A). This number was significantly reduced compared to the treatment
72
with microparticles containing Pomegranate extract (MP, 16.9 x 104 cells/mL), to
those treated with dexamethasone (Dex, 19.0 x 104 cells/mL) and to Pomegranate
non-encapsulated extract (PGE, 14.6 x 104 cells/mL). The group that received control
microparticles (MC), unlike other treatment groups, showed a statistically significant
increase in cell-recruited numbers. In relation to the cell types, the number of
eosinophils (Fig. 3E), the “hall marker” cells involved in the inflammatory process of
asthma, was substantially decreased in mice treated with MP (1.24 x 104 cells/mL)
when compared to the asthma-induced mice (OVA, 4.7 x 104 cells/mL). Animals that
received MC and Dex treatments also showed low cell counts. Interestingly, mice
treated with PGE did not show significant reduction compared to OVA group. The
other cell types (macrophages, lymphocytes and neutrophils) did not present any
unexpected recruitment that could be described comparing the groups treated.
3.4 MP reduce inflammatory/allergic cytokines’ production in the BAL
Quantification of IL-1β and IL-5 cytokines from the BAL of animals was
determined by ELISA (Fig. 4). The results show that the asthma-induced group
(OVA) had a significant increase in IL-1β levels compared to the control group and
this increase was significantly attenuated by all treatments (Fig. 4A). The groups
treated with Dexamethasone (Dex) and microparticles containing the extract (MP)
showed similar levels to the control group (saline), demonstrating relevant anti-
inflammatory effect, especially comparing MP treatment to that with Dex, a classical
therapeutic. The treatments with MC and PGE also showed significant decrease
compared to the control group. Regarding IL-5 levels (Fig. 6B), treatment with MP
showed a statistically significant reduction compared to OVA group. The other
73
treatments also showed good reduction levels. The group treated with Pomegranate
non-encapsulated extract (PGE) showed very low levels of IL-5, undetectable in the
assay (data not shown).
3.5 Microparticles do not reduce neither protein extravasation nor nitrites
levels in the BAL
The onset of the inflammatory process is characterized by vascular events that
happen right after the inflammatory stimulus, which causes vasodilation followed by
increased vascular permeability and consequent leakage of molecules to the
inflamed tissue. To assess whether the treatments used in asthma model showed
effects on protein leakage into the lung tissue quantification of total protein was
assessed in BAL of the animals (Fig. 5A). No significant reduction on protein levels
was achieved for the treatments with microparticles or with non-encapsulated extract
(PGE).
In addition to this investigation, we also evaluated the presence of nitric oxide
derivatives (nitrites) in BAL of the animals (Fig. 5B). The results of this study
demonstrated that, except for PGE treatment, there is no difference in nitrites’
production among the groups evaluated.
3.6. MP reduce airway inflammation in lung tissue with clearance of mucus
hypersecretion
To investigate the effects of the pomegranate extract encapsulated or not on
the pathological changes of the lung tissue in an asthmatic murine model, the lung
74
tissues were stained with hematoxylin and eosin (HE) and periodic acid-Schiff
staining (PAS) (Fig. 6). The asthma-induced mice (OVA) showed increased
leukocytosis in the peribronchial tissues (Fig. 6B) and mucus hypersecretion by
goblet cells into the bronchi (represented by white arrows), compared with control
lung tissues (Fig. 6A). Animals that received Dex (Fig. 6C) also displayed lower
leukocytes’ infiltration in the lung tissue compared to OVA group. The Pomegranate
encapsulated extract when delivered to pulmonary microenvironment, especially
when compared to control microparticles, significantly inhibited pathological changes,
showing a suppressive effect on airway inflammation (Fig. 6E). Moreover, the non-
encapsulated extract also decreased histological alteration in the pulmonary
parenchyma during asthmatic process (Fig. 6F).
4. Discussion
Biodegradable micro/nanoparticles have been frequently used as a vehicle for
therapeutic drugs to the lung due to the various advantages offered by these
systems, including the controlled release of encapsulated drugs and simple
administration of minimally invasive manner (Oh et al., 2011). In this study, we
demonstrated that the biodegradable microparticles produced from PLGA polymer by
the method of double emulsion and solvent evaporation without any bioactive or with
P. granatum encapsulated extract had an average diameter within the range of sizes
used for intranasal route of administration in animals as well as efficiency in the
delivery of encapsulated compound to the lungs (Nicolete et al., 2009). Porous PLGA
microparticles with inhaled encapsulated corticosteroids and with similar diameter of
the particles used in our study were able to reduce significantly the number of
75
inflammatory cells in BAL of asthma-induced mice, as well as bronchial
hyperresponsiveness and inflammatory cell infiltration observed in the lungs (Oh et
al., 2011). This corroborates our findings using biodegradable polymeric system to
deliver Pomegranate extract as promising approach in the treatment of asthma,
especially based on the results comparing its efficiency with non-encapsulated
extract.
The inflammatory cells migration into the lung tissue is the event that
perpetuates in asthma, and characterizes the late stage and chronicity of the
disease. We demonstrated that the microparticles containing P. granatum extract
significantly decreased the number of cells in BAL compared to the group of
asthmatic and non-treated animals (OVA). The same phenomenon was observed in
groups treated with the non-encapsulated extract or Dexamethasone. This fact may
be related to the expression of endothelial adhesion molecules. The trafficking of
leukocytes between the bloodstream and the extravascular space is controlled by the
vascular endothelium. A cascade of sequential leukocyte-endothelial cell adhesive
interactions that involves a variety of cell adhesion molecules (CAMs) present on
leukocytes and endothelial cells mediate the migration of leukocytes from the blood
to sites of inflammation or injury extravascular (Cook-Mills and Deem, 2005). In this
context, a study with crude ethanolic extract prepared from freshly collected leaves of
P. granatum assessed its ability to inhibit TNF-α-induced ICAM-1 (intercellular cell
adhesion molecule-1), VCAM-1 (vascular cell adhesion molecule-1) and E-selectin
expression on human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). The results showed
that the extract significantly inhibited the expression of ICAM-1 (55%), VCAM-1
(57%) and E-selectin (51%) on HUVECs. Also, it was screened the ability of
ethanolic extract to inhibit the adhesion of neutrophils to the endothelium (56%)
76
(Balwani et al., 2011). In this regard and bringing those results to our study, we can
suggest that the decreasing numbers of total leukocytes present in the BAL and also
in the pulmonary parenchyma of animals observed in our study may be related to the
inhibitory action of the extract released by the particles into the lungs after intranasal
instillation. In contrast, the group of animals that received treatment with
microparticles without any encapsulated molecule showed an increase in cell
numbers recruited to BAL, also reflected by cell infiltration in lung tissue. This finding
might be due to the fact that microparticles per se constitute an inflammatory stimulus
after the uptake process by phagocytic cells. This process leads to the translocation
of the nuclear transcription factor NF-kB to the cell nucleus and markedly stimulates
the production of inflammatory cytokines, including IL-1β (Nicolete et al., 2011). This
was evidenced here in our study by the significant increase in the number of
neutrophils recruited to BAL from the group of animals that received control
microparticles.
Our results show that the reduction of inflammatory cells in the group of animals
treated with microparticles containing Pomegranate extract is due to the activity of
the extract released to lung tissue, indicating that there is good degradability rate of
the particles and that the controlled release system of the extract can modulate the
immune response developed in the asthma condition.
The analysis of the extract of P. granatum using HPLC showed phytochemical
profile similarly to data described in the literature for this plant, which mainly describe
the presence of hydrolysable tannins (punicalin, punicalagin, corilagin, casuarinin
and pedunculagin) and flavonols (quercetin and kampferol), catechins (catechin,
epicatechin and 3-gallate epicagalocatechin) (Lansky and Newman, 2007). A variety
of molecules present in this plant implies in many different biological activities, as well
77
as a variety of mechanisms of action. In this context, the analysis of zeta potential
was evaluated to verify whether the encapsulation of the ethanolic Pomegranate
extract would modify the negative charge of the polymer used to produce the
microparticles. The results showed that microparticles containing the extract present
lower zeta potential value compared to control microparticles (−1.37 mV vs. −0.70
mV). This finding suggests that some molecules present in the ethanolic extract could
provide ions to the polymer surface.
Regarding cytokines involved in the inflammatory process, IL-1β is one of them
that acts in the beginning of inflammatory process and performs multiple actions on
endothelial cells, including the synthesis of adhesion molecules, induction of the
release of various inflammatory mediators such as prostaglandins, prostacyclins and
thromboxanes. The presence of this cytokine in asthma causes the persistence of the
inflammatory and continuous cell recruitment to the lungs (Whelan et al., 2004). The
results show that all groups of animals treated reduced the amount of IL-1β. In
relation to IL-5, this is the primary cytokine involved in the late phase of asthma,
which is responsible for the proliferation, migration and accumulation of eosinophils
from bone marrow into the blood (Faccioli et al., 1996; Rogerio et al., 2003). The
treatment with microparticles containing Pomegranate extract showed a statistically
significant reduction in IL-5 compared to asthmatic non-treated animals and also to
those treated with dexamethasone. The levels detected were great lower than all
other groups, especially compared to animals that received control microparticles.
Interestingly, the group treated with non-encapsulated Pomegranate extract showed
very low levels of IL-5, undetectable in the assay (data not shown). These results are
in agreement with the low cell counts, especially eosinophils, recovered from the BAL
of animals that received instilled microencapsulated extract. This fact suggests that
78
these microparticles were able to modulate the immune response involved in asthma,
probably by regulating the Th1/Th2 axis, as well as protecting the extract of rapid
metabolism, thus prolonging its local effect in the lung tissue.
The protein leakage into the lung tissue is an event, which appears in the
beginning of setting of inflammation. The results achieved here did not show any
significant difference between the treatments. Since the asthma model is a chronic
condition, the extravasation might be occurred at earlier stages and could not be
differently assessed in the treated group of animals.
Evidence indicates that inflammatory diseases of the respiratory tract are
commonly associated with high production of NO (Ricciardolo, 2003; Saleh et al.,
1998). Our results from the assay to detect nitrites showed that no significant
difference in NO production by leukocytes was detected with administration of the
preparations.
When compared to conventional drug administrations (solutions, suspensions,
emulsions, etc.), where the drug concentration in the bloodstream or another site
presents a peak and then declines, the controlled release systems offer the great
advantage of maintaining a constant/sustained drug concentration in the therapeutic
range for a prolonged period, using single or reduced doses. From a clinical
perspective, therapeutic concentration control is important because it increases the
therapeutic efficacy and also reduces the potential toxicity that could be achieved
with crude extracts in solution forms.
Taken together, our results show that the treatment of asthma-induced mice
with microencapsulated Pomegranate extract reduces the expression of the key
markers involved in lung allergic inflammation. Importantly, although we did not
examine other cytokines, including IL-4, IL-13, IL-8, or other inflammatory mediators
79
(Lampinen et al., 2004), the secondary metabolites present and preserved into
microparticles play an important role in inhibiting eosinophil recruitment, suggesting
that this cell type may also be modulated by the extract released into the lungs.
In conclusion, in this study we demonstrated for the first time that the ethanolic
extract from the leaves of P. granatum presents significant biological activity in a
murine model of asthma and more important, this extract encapsulated in
biodegradable microparticles has greater potential therapeutic effect than the extract
in solution form. This approach can be alternatively/complementary delivered to the
lungs, regarding the treatment of inflammatory/allergic diseases.
Acknowledgements
This study was supported by Fundação de Amparo à Pesquisa e ao
Desenvolvimento Científico e Tecnológico do Maranhão (FAPEMA) and
Universidade Ceuma, São Luis, Maranhão. We would like to thank the technician
Ana Cleia Pestana from the Universidade Ceuma for the assistance in the
histological sections.
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86
Figure Legends
Fig. 1. HPLC chromatograms of crude extract obtained from P. granatum leaves.
Fig. 2. Distribution of average diameters of (A) control microparticles and (B)
microparticles containing Pomegranate extract.
Fig. 3. Effect of the treatments with the preparations on murine model of asthma.
Groups of BALB/c mice were treated from days 18 to 21 with dexamethasone (Dex),
microparticles without encapsulated extract (MC), microparticles containing
Pomegranate extract (MP) or non-encapsulated Pomegranate extract (PGE). BAL
samples of mice were collected 24 h after the last OVA challenge and leukocytes’
count was performed in a Neubauer chamber (A). Macrophages (B), lymphocytes
(C), neutrophils (D) and eosinophils (E) counts were performed in cytospin
preparations stained with Rosenfeld's stain. Data are shown as mean ± SD.
*P<0.05, **P<0.01 and ***P<0.001 compared with negative control (saline); ##
P<0.01 and ###P<0.001 compared with the Ova group; & P<0.05 and &&&
P<0.001, compared with dexamethasone; $$$P<0.001, compared to control
microparticles group (MC).
Fig. 4. Effects of the treatments with the preparations on the production of IL-1β and
IL-5 cytokines. Quantification levels were performed in the supernatant of BAL. *P
<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 compared to negative control group (saline); #P<0.05,
##P<0.01, ###P<0.001 compared to Ova group; & P<0.05 compared to
dexamethasone group. $P<0.05, compared to control microparticles group (MC).
87
Fig. 5. (A) Protein leakage and (B) nitrites’ production in the BAL of animals 24 h
after the last challenge with OVA. Samples were collected from the groups: saline,
Ova, dexamethasone (Dex), control microparticles (MC), microparticles containing
Pomegranate extract (MP) and non-encapsulated Pomegranate extract (PGE). Data
are shown as mean ± SD. *P <0.05 compared with negative control (saline), #p <0.05
compared with the Ova group.
Fig. 6. Representative lung sections from the groups: saline (A), Ova (B),
dexamethasone (C), control microparticles (D), microparticles containing
Pomegranate extract (E) and non-encapsulated Pomegranate extract (F). The cell
infiltration in the lung tissues was confirmed by hematoxlyin an eosin staining (left
column). The mucus hypersecretion in the lung tissues was shown using periodic
acid-Schiff staining (right column). White arrows show leukocytes’ infiltration and
mucus hypersecretion areas. Magnification 100x.
88
Figure 1
(nm)
89
Figure 2
90
Figure 3
91
Figure 4
92
Figure 5
A
B
93
Figure 6