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Jaqueline Silvério Zancanari
Produção de Xilitol:
Revisão das pesquisas relacionadas à sua
produção nos últimos anos e principais
aplicações
Lorena 2012
JAQUELINE SILVÉRIO ZANCANARI
Produção de xilitol:
Revisão das pesquisas relacionadas à sua
produção nos últimos anos e principais
aplicações
Lorena 2012
Monografia apresentada junto ao curso de Engenharia Bioquímica da Escola de Engenharia de Lorena- EEL- USP,como requisito para aprovação na disciplina Trabalho de Conclusão de Curso. Orientador: Prof. Dr. Sílvio Silvério da Silva.
AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE
TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA
FINS DE ESTUDO DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
JAQUELINE SILVÉRIO ZANCANARI
Produção de xilitol:
Revisão das pesquisas relacionadas à sua
produção nos últimos anos e principais
aplicações
Lorena, 28 de Maio de 2012
Monografia apresentada junto ao curso de Engenharia Bioquímica da Escola de Engenharia de Lorena- EEL- USP,como requisito para aprovação na disciplina Trabalho de Conclusão de Curso. Orientador: Prof. Dr. Sílvio Silvério da Silva.
AGRADECIMENTOS
Agradeço à minha família pelo apoio e amor incondicionais que me fizeram chegar
onde estou.
Ao professor Dr. Sílvio Silvério da Silva pela disponibilidade e orientação durante a
realização do trabalho.
À Bruna Caroline por toda a ajuda e tempo disponibilizado para a melhoria do
trabalho.
RESUMO
O presente trabalho teve por objetivo a realização de uma revisão bibliográfica a
respeito da produção de xilitol, destacando-se algumas pesquisas realizadas nos
últimos anos, no tocante a obtenção do produto por via biotecnológica. A obtenção
por via química atualmente utilizada em escala industrial também foi explorada, e
constatou-se apresentar vantagens quanto ao tempo de processo, uma vez que a
bioconversão da xilose em xilitol correspondeu, nos trabalhos analisados, a um
tempo mínimo de cerca de 30 horas, o que torna a via biotecnológica aparentemente
menos eficiente quando comparada com a via química. No entanto, vantagens
adicionais são apresentadas pela via biotecnológica, como os maiores rendimentos
da mesma e uma menor complexidade do processo. Este trabalho também teve por
objetivo destacar as principais aplicações atuais do xilitol na indústria. Com base em
uma revisão bibliográfica de alguns estudos sobre a obtenção biotecnológica do
xilitol, foi possível identificar os principais tipos de micro-organismos utilizados nesta
via, destacando-se as leveduras do gênero Candida sp., e o principal setor industrial
onde é utilizado este produto, o alimentício.Constatou-se também que as matérias-
primas utilizadas na obtenção do xilitol são de uma grande variedade, constituindo-
se de fontes de açúcares fermentescíveis de origem lignocelulósica, tais como
bagaço de cana-de-açúcar, palha de arroz, malte de cerveja, entre outros. Neste
trabalho pode-se concluir que o xilitol é de grande importância para as indústrias de
alimentos e médica, e que muitos estudos vêm sendo realizados no sentido de se
fornecer uma alternativa ao processo de obtenção por via química, como é o caso
da obtenção por via biotecnológica.
PALAVRAS-CHAVE: xilitol, via bioquímica, via química, xilose, Candida sp.,
alimentos, materiais lignocelulósicos.
ABSTRACT
The current work had as objective the accomplishment of a literature review about
the xylitol production, emphasizing some of the researches made in the last years,
related to the obtainment of the product by biotechnological pathway. The obtainment
by the chemical pathway used currently in industrial scale was also explored, and it
was observed that it has advantages when considering the process time, once the
bioconversion of xylose to xylitol corresponded, in the reviewed works, to a minimum
time of about 30 hours, which becomes the biotechnological pathway apparently less
efficient when compared to the chemical pathway. However, additional advantages
are shown by the biotechnological pathway, such as its higher yields and lower
complexity. This work had also the objective to point out the main current applications
of xylitol in industries. Based on the literature review of some of the publications
about the biotechnological obtainment of xylitol, it was possible to identify the main
microorganisms types used in this pathway, highlighting the yeasts of Candida sp.
genus, and the main industrial sector where this product is used, the food sector. It
was also observed that the raw materials used in the xylitol attainment are of a wide
variety, constituting of fermentable sugar sources from lignocellulosic materials, such
as sugar cane bagasse, rice straw, brewing malt, among others. In this study, it was
possible to conclude that xylitol has a great importance for medical and food
industries, and that a lot of studies have been made in order to provide an alternative
to the obtainment process by the chemical pathway, which is the case of the
biotechnological pathway process.
KEY WORDS: xylitol, biochemical pathway, chemical pathway, xylose, Candida sp.,
foods, lignocellulosic materials.
SUMÁRIO
1 Introdução........................................................................................................... 07 2 Revisão bibliográfica........................................................................................... 07 2.1 Xilitol: Estrutura e Propriedades Físico-Químicas......................................... 07 2. 2 Principais aplicações do xilitol...................................................................... 08 2.2.1 Uso como adoçante: indústria de alimentos.............................................. 10 2.2.2 Prevenção contra cáries............................................................................ 11 2.2.3 Aplicações médicas................................................................................... 11 2.3 Vias de obtenção do xilitol e matérias-primas.............................................. 13 2.3.1 Via química de obtenção........................................................................... 15 2.3.2 Via biotecnológica de obtenção................................................................. 16 2.4 Revisão: pesquisas sobre a produção biotecnológica do xilitol.................... 20 2.4.1 Efeito da disponibilidade de oxigênio no meio........................................... 20 2.4.2 Efeito da concentração inicial de substrato no meio.................................. 22 2.4.3 Efeito da presença de compostos inibidores............................................. 24 2.4.4 Obtenção de xilitol pelo metabolismo de bactérias.................................... 26 3 Considerações finais .......................................................................................... 28 4 Referências bibliográficas .................................................................................. 29
7
1 INTRODUÇÃO
O xilitol é um poliálcool natural, muito utilizado nas indústrias de alimento e
farmacêutica em substituição a sacarose, por possuir poder adoçante semelhante,
somando-se a vantagens, tais como: possuir propriedades anticariogênicas e
possibilidade de ingestão por diabéticos, pois seu metabolismo, ao contrário da
sacarose, não necessita da atividade da insulina. Seu uso na área médica vem
apresentando destaque, sendo que alguns estudos têm comprovado sua eficácia na
prevenção de doenças infecciosas, como a otite média aguda, e também na
prevenção à osteoporose. Pode ser usado também como estabilizante de proteínas,
e como matéria-prima para a produção de compostos poliméricos (DA SILVA et al.,
1993/94).
Em escala industrial, o xilitol é obtido por meio de um processo químico, que
compreende a hidrogenação catalítica da D-xilose a altas temperaturas e pressões,
na presença de um catalisador de níquel. Este processo, além de complexo envolve
um alto custo, por isso têm sido desenvolvidas algumas técnicas de obtenção do
xilitol por vias biotecnológicas, a partir do metabolismo de alguns micro-organismos
(SARROUH, B.F, 2009).
Buscou-se nesse trabalho fazer uma revisão dos principais usos do xilitol na
indústria, bem como de alguns estudos envolvendo sua produção pela via
biotecnológica nos últimos anos, destacando-se alguns dos parâmetros que
influenciam no metabolismo dos micro-organismos utilizados na bioconversão do
substrato em xilitol, e consequentemente, no rendimento do processo.
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Xilitol: Estrutura e Propriedades Físico-Químicas
O xilitol é um poliálcool encontrado naturalmente em pequenas quantidades
em algumas frutas e vegetais, além de ser um intermediário no metabolismo de
carboidratos em animais e micro-organismos (DA SILVA et al., 1993/94). Sua fórmula
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estrutural e algumas de suas propriedades físico-químicas podem ser observadas na
Tabela 1.
Tabela 1. Estrutura e propriedades físico-químicas do xilitol
Xilitol
Propriedades físico-químicas
Valor / Característica
Fórmula empírica C5H12O5
Peso molecular 152,15 g/mol Calor de solução 34,8 cal/g (endotérmico)
Estabilidade Estável a 120 °C
Aparência Pó branco e cristalino
Sabor Doce Odor Inodoro
Poder adoçante Semelhante ao da sacarose Valor calórico 2,4 kcal/g
Solubilidade (30°C) 68 g/100g solução Ponto de fusão 92-96 °C
Ponto de ebulição 216 °C pH (solução 5%) 5-7
Higroscopicidade Em elevada umidade relativa, é mais higroscópico que a sacarose e menos que o sorbitol.
Fonte: Adaptado de da Silva et al., 1993/94.
Algumas propriedades físico-químicas, tais como poder adoçante, calor de
solução e sabor adocicado, são responsáveis pelo emprego crescente do xilitol em
alguns segmentos industriais, como as indústrias de alimentos e de fármacos.
2. 2 Principais aplicações do xilitol
Atualmente, há um interesse crescente na obtenção do xilitol devido à sua
grande aplicabilidade no segmento industrial, principalmente por seu poder adoçante
e anticariogênico. É também comumente utilizado na área médica, pois se trata de
um composto atóxico, reconhecido pela FDA (“Food and Drug Administration”) como
um composto GRAS (“Generally Regarded as Safe”), sendo seu uso seguro para
humanos (MUSSATO; ROBERTO, 2002).
Pode ainda ser utilizado como agente estabilizante de proteínas extraídas de
membranas naturais, ajudando a evitar a desativação proteica quando em altas
9
concentrações no meio, e como matéria-prima para a produção de hidróxipropilxilitol,
cujas propriedades mecânicas permitem a fabricação de espumas absorvedoras de
impacto (XILITOL, O ADOÇANTE DO FUTURO, 2010).
A produção de xilitol na China, que é o maior produtor mundial do composto, é
de aproximadamente 35 mil toneladas por ano, e há previsões de um aumento de
2,7% ao ano da produção de polióis no país (ANNIES, 2009).
A figura 1 ilustra alguns exemplos de produtos que utilizam o xilitol em sua
fabricação.
Figura 1. Produtos que contêm xilitol em sua composição: gomas de mascar, pastilhas,
produtos destinados à animais e adoçantes.
Fonte: Adaptado de www.maio.odo.br, 2009; Saúde, 2010.
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2.2.1 Uso como adoçante: indústria de alimentos
Na indústria alimentícia, as propriedades do xilitol têm sido exploradas por se
tratar de um bom agente estabilizante e adoçante.
A vantagem de ser utilizado como estabilizante está no fato de não se tratar
de um carboidrato, logo, não participa de reações de escurecimento não enzimático,
as chamadas reações de “Maillard”, nas quais ocorre a combinação de açúcares
redutores com aminoácidos livres de proteínas, com a formação de compostos de
coloração escura. Dessa forma, as indesejadas reações de escurecimento são
evitadas e a integridade dos alimentos é mantida (JAEGER; JANOSITZ; KNORR,
2010).
Uma das características dos poliálcoois é seu sabor adocicado, tornando-os
atrativos para serem empregados como adoçante. Além disso, seu calor de solução
endotérmico faz com que proporcionem um efeito refrescante ao serem ingeridos,
tornando-os componentes indispensáveis em produtos como gomas de mascar,
pastilhas, entre outros. Uma vantagem adicional do uso do xilitol como adoçante em
alimentos é que sua absorção pelo organismo não é intermediada pela insulina, e o
composto não causa o aumento da concentração de glicose no sangue, o que
possibilita seu consumo por pessoas portadoras de diabetes tipo I ou II (MUSSATO;
ROBERTO, 2002).
Segundo estudos promovidos por Ylikahri (1979), citado por Mussato e
Roberto (2002), a glicose liberada no metabolismo do xilitol é armazenada no fígado
na forma de glicogênio e é lentamente liberada no sangue, não causando bruscas
alterações em sua concentração. Nestes mesmos estudos, foi constatado que uma
quantidade de 60 g de xilitol na alimentação diária de pacientes portadores de
diabetes não causava aumentos significativos na concentração de glicose no
sangue.
A ingestão de xilitol, dentro das quantidades recomendadas, não causa
efeitos colaterais, mas se ingerido em grandes quantidades, pode provocar um em
efeito laxativo, que cessa com a suspensão do seu consumo (ALMEIDA, 2007).
11
2.2.2 Prevenção contra cáries
Propriedades anticariogênicas e cariostáticas tornam o xilitol atrativo em
formulações destinadas à higiene bucal e gomas de mascar (LEE; CHOI; KIM, 2011;
MUSSATO; ROBERTO, 2002).
A cárie dental ocorre devido à ação de bactérias presentes na placa dentária,
em especial bactérias do gênero Streptococcus. Os açúcares remanescentes de
alimentos são metabolizados por essas bactérias, com a formação de ácidos, como
o ácido láctico, responsáveis pela diminuição do pH e consequente degradação do
esmalte dental, ocasionando uma perda de íons cálcio e fosfato, caracterizando um
processo conhecido como desmineralização (BRASIL MEDICINA, 2001). As
bactérias desse gênero não são capazes de metabolizar o xilitol, e seu crescimento
torna-se limitado em sua presença. Além disso, o xilitol estimula a produção de
saliva, que possui efeito tamponante sobre a região bucal, equilibrando assim, o pH
da mesma, evitando a desmineralização (PEREIRA et al., 2007).
De acordo com estudos realizados por Isokangas et al. (2000), o consumo de
gomas de mascar contendo xilitol por crianças de até 10 anos reduziu em mais de
50% a incidência de cáries, e estudos realizados por Gaban et al. (2008),
demonstraram que para se obter um efeito significativo, a quantidade de xilitol a ser
ingerida deveria ser de 5 a 10 g por dia, e que quantidades superiores não
apresentavam efeitos adicionais de proteção contra as cáries.
2.2.3 Aplicações médicas
Alguns estudos recentes têm demonstrado possíveis aplicações do xilitol
também na área médica. Almeida (2007) e Pereira et al. (2007) constataram que na
mucosa nasal o xilitol inibe a ação de bactérias do gênero Staphylococcus
(coagulase negativa), responsáveis por algumas infecções hospitalares. Brown et al.
(2004) submeteram coelhos à lavagens nasais com o xilitol e demonstraram que seu
uso como spray nasal ajuda a diminuir crises de rinite e de rinossinusite.
12
Tapiainen (2004) e Almeida (2007) realizaram alguns testes in vitro e
demonstraram uma redução no crescimento de Streptococcus pneumoniae,
principais responsáveis por doenças como a meningite e a pneumonia em indivíduos
adultos e o principal causador da otite média aguda, infecção no ouvido muito
comum em crianças. A redução observada foi de 35-72% em concentrações de 1-
5% de xilitol no meio de cultivo.
Estudos in vivo de Almeida (2007) envolvendo o xilitol demonstraram uma
significativa redução na incidência da otite média em crianças, e Uhari et al. (1996)
relataram que embora não se conheça a dose exata requerida para combater a
doença, uma dose de 8,4 g de xilitol por dia reduziam em 40% sua incidência.
O mecanismo responsável pela inibição do Streptococcus pneumoniae pelo
xilitol foi sugerido por Kontiokari et al. (1995), citado por Almeida (2007). Segundo
ele, o xilitol pode seguir duas vias após ser transportado para dentro da célula. Na
primeira via, o composto compõe um “ciclo fútil”, onde é exteriorizado e interiorizado
pela célula, com gasto de energia e nenhum rendimento energético. Na segunda via,
ele é fosforilado à xilitol-5-fosfato, que não é metabolizado pela célula, devido à
ausência de enzimas específicas, com um consequente acúmulo do produto no
espaço intracelular, tornando-se tóxico e inibindo o crescimento da bactéria.
Outra aplicação do xilitol na área médica é sua ação na prevenção da
osteoporose, doença caracterizada pela diminuição da densidade óssea, causada
pela deficiência na deposição de cálcio nos ossos, e consequente enfraquecimento
dos mesmos (FARIAS, 2003).
Testes realizados por Matilla et al. (1998) com animais demonstraram que o
xilitol estimula a absorção de cálcio pelo organismo, e facilita sua passagem do
sangue para o tecido ósseo, proporcionando um aumento da deposição destes íons.
Uma possível explicação para esse efeito de maior absorção do cálcio em presença
de xilitol seria o aumento da relação NADH/NAD+ que ocorre durante o seu
metabolismo. A maior quantidade de NADH culmina em uma maior taxa de
transporte de íons Ca2+ através da membrana celular, intensificando a calcificação
da estrutura óssea. Estudos realizados com ratos confirmaram que a suplementação
contínua com xilitol na dieta dos animais conduzia a melhores propriedades
biomecânicas, tanto em relação à estrutura quanto à resistência dos ossos.
13
2.3 Vias de obtenção do xilitol e matérias-primas
As principais formas de obtenção do xilitol são as vias química e
biotecnológica (ou bioquímica), sendo que, industrialmente, a mais utilizada é a via
química. O processo químico de produção, no entanto, se mostra um tanto
dispendioso e apresenta baixos rendimentos em função da complexidade das
etapas de recuperação do produto, enquanto a via biotecnológica, caracterizada
pelo uso de micro-organismos em processos fermentativos, apresenta maiores
rendimentos (65-85%, dependendo da matéria-prima) e trata-se de um processo
menos complexo, mostrando-se uma boa alternativa ao processo químico (BIER et
al., 2007).
Nos estudos revisados, observou-se que o tempo de bioconversão da xilose
em xilitol foi relativamente alto, chegando a atingir, em um deles, 830 horas. Com
isso, pode-se afirmar que, aparentemente, a obtenção do xilitol por via bioquímica é
menos viável em termos de eficiência, quando comparado com a obtenção por via
química, na qual a hidrogenação catalítica da xilose leva de 3-5 horas, dependendo
das temperaturas e pressões utilizadas (PEREIRA et al., 2009).
As matérias-primas utilizadas nessas vias de produção consistem em uma
gama de diferentes materiais lignocelulósicos, tais como cascas de madeiras ricas
em xilana, farelo de arroz, cascas de amêndoas, hidrolisados de bagaço de cana-de-
açúcar, entre outros (DA SILVA et al., 1993/94; RAO et al., 2005).
Os materiais lignocelulósicos são de origem de fibras vegetais, e compostos
por lignina, celulose e hemicelulose, principalmente, destacados na figura 2. Estas
fibras são compostas por microfibrilas de celulose, que são mantidas coesas pela
presença da lignina e da hemicelulose, sendo esta a porção que interessa ao
processo de obtenção do xilitol (SILVA et al., 2009).
As hemiceluloses (ou polioses) são polímeros de monossacarídeos que estão
associados à celulose na parede vegetal e o segundo polissacarídeo mais
abundante na natureza. Podem ser classificadas em hexosanas e pentosanas,
polímeros formados por açúcares de 6 e 5 carbonos, respectivamente. Um exemplo
14
Figura 2. Localização e disposição das microfibrilas de celulose e das hemiceluloses na
parece celular vegetal.
Fonte: Sobiologia, 2012.
de pentosanas são as moléculas de xilanas, utilizadas como fonte de xilose para a
produção do xilitol (SAHA, 2003). Alguns dos materiais lignocelulósicos mais
comumente utilizadas no processo de obtenção do xilitol e seus respectivos teores
de hemicelulose estão listados na tabela 2.
A figura 3 representa um fluxograma do processo de obtenção do xilitol, tanto
pela via química quanto pela via bioquímica, destacando as principais etapas
envolvidas em ambas.
.
Tabela 2. Materiais lignocelulósicos utilizados na produção do xilitol.
Material Lignocelulósico Hemicelulose (%) Referência
Farelo de cevada 32,70 Cruz et al., 2000
Sabugo de milho 34,70 Cruz et al., 2000
Folhas de milho 34,50 Cruz et al., 2000
Eucalyptus globulus 17,10 Cruz et al., 2000
Bagaço de cana 26,42 Neureiter et al., 2002
Palha de arroz 22,00 Mussato; Roberto, 2002.
Palha de trigo 31,83 Cândido; Canilha, Silva, 2002
Casca de aveia 28,63 Felipe et al., 2003
Eucalyptus grandis 15,67 Canettieri; Silva; Carvalho Jr,
2003
Palha de sorgo 44,00 Herrera et al., 2004
Fonte: Adaptado de Tamanini e Hauley, 2004.
15
Figura 3. Esquema para as duas vias de obtenção do xilitol – vias química e bioquímica.
Fonte: Adaptado de Mussato e Roberto (2002).
2.3.1 Via química de obtenção
A via química de obtenção do xilitol consiste na hidrogenação catalítica da D-
xilose, que é obtida da hidrólise das xilanas, um polímero de xilose, encontradas em
abundância na parede celular de tecidos vegetais (DA SILVA et al., 1993/94; SILVA et
al., 2009).
As xilanas são formadas por moléculas de xilose unidas por ligações
glicosídicas do tipo β (1→4) (PEIXOTO, 2005), e a hidrólise ácida ou alcalina de
materiais com altos teores deste composto é a primeira etapa da obtenção química
do xilitol. Sua função é a de promover a clivagem das ligações das cadeias de
xilana, liberando a xilose no meio. É uma etapa de fundamental importância, pois os
16
rendimentos ao final do processo dependem diretamente da pureza da solução
inicial de xilose (DA SILVA et al., 1993/94; BRASIL MEDICINA, 2010).
Após essa etapa, segue-se a purificação do hidrolisado de xilana, a fim de se
obter a xilose pura, uma vez que a presença de impurezas remanescentes da
hidrólise (como a lignina) pode interferir na catálise e na hidrogenação posteriores,
além de diminuir o rendimento do processo. Para essa purificação, são necessárias
diversas operações cromatográficas, de troca iônica e de descoloração, que tornam
essa etapa complexa e contribuem para o aumento do custo do processo. A xilose
pura é posteriormente hidrogenada na presença de um catalisador de níquel em
reatores sob alta pressão (31-40 atm) e temperatura (100-130°C), por um intervalo
de 3-5 horas (DA SILVA et al., 1993/94, PEREIRA et al., 2009).
A solução de xilitol obtida é purificada a fim de eliminar os subprodutos e
resíduos de catalisador da reação e obter uma solução de maior pureza. Essa é a
etapa mais crítica e dispendiosa do processo, pois requer uma elevada eficiência
para assegurar uma maior concentração de xilitol na solução final. A última etapa da
produção consiste na cristalização do xilitol obtido. (MICHEL, 2007).
De acordo com Heikkilä et al. (1992), citado por Mussato e Roberto (2002), a
produção do xilitol à partir de xilose tem um custo cerca de 10 vezes superior,
quando comparado à produção de sacarose ou sorbitol.
2.3.2 Via biotecnológica de obtenção
Devido aos altos custos e baixos rendimentos do processo de obtenção do
xilitol por via química, vários estudos vêm sendo conduzidos, nos quais se busca a
obtenção do produto pela via biotecnológica, da qual participam enzimas de
determinados micro-organismos capazes de metabolizar a xilose, gerando um
acúmulo do xilitol no meio (DA SILVA et al., 1993/94).
Os micro-organismos mais utilizados para a produção biotecnológica do xilitol
são as leveduras do gênero Candida e Debaromyces e bactérias do gênero
Corynebacterium e Enterobacter (NÁHLÍK et al., 2000).
Na figura 4 observa-se a rota metabólica da xilose em células de leveduras. A
xilose é reduzida a xilitol por meio da reação catalisada pela enzima xilose redutase
17
(XR), com o requerimento de um NADPH como cofator. O xilitol formado é
convertido à xilulose, pela enzima xilitol desidrogenase (XDH), na presença de
NAD+. A xilulose é então fosforilada e incorporada à via das pentoses-fosfato, que
opera juntamente com a glicólise e onde o NADPH necessário à ação da xilose
redutase é regenerado (BARRADAS et al., 2010; NÁHLÍK et al., 2000).
.
Figura 4. Mecanismo de síntese biológica do xilitol pelo metabolismo de leveduras.
O NAD+ necessário à ação da xilitol desidrogenase é obtido da cadeia
respiratória nas mitocôndrias, sendo a secreção do xilitol resultante de uma
deficiência da regeneração deste cofator, o que causa a diminuição da atividade da
xilitol desidrogenase, gerando um acúmulo do xilitol no meio, uma vez que a baixa
atividade da enzima não permite sua conversão à xilulose. O acúmulo do xilitol
depende, portanto, não só da atividade das enzimas envolvidas em seu
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metabolismo, mas também da capacidade das células de repor o NADPH enquanto
mantém a concentração de NAD+ em um valor mínimo (BARRADAS et al., 2010).
A obtenção do xilitol pela via biotecnológica apresenta uma etapa adicional,
denominada destoxificação. Em decorrência da hidrólise dos materiais
lignocelulósicos usados como fontes de açúcares, ocorre a formação de alguns
compostos que podem ser tóxicos para as células.
Estes compostos tóxicos devem ser removidos na etapa de destoxificação da
solução antes da adição das células do micro-organismo a ser utilizado, para que
seu metabolismo não seja inibido. De acordo com Palmqvist e Hanh-Hägerdal
(2000), citados por Villarreal et al.(2005), os compostos inibidores da ação dos
micro-organismos podem ser oriundos da hidrólise ou estar presentes na própria
matéria-prima.
Esses compostos são classificados nos principais grupos: subprodutos
derivados do açúcar (furfurais e hidróximetilfurfurais), ácidos alifáticos (ácido acético
e ácido levulínico), produtos de degradação da lignina, que incluem uma variedade
de compostos aromáticos e poliaromáticos com diferentes substituintes, e
substâncias inibidoras derivadas de metais presentes em compostos de madeiras,
no solo e nos próprios equipamentos utilizados para promover a hidrólise
(VILLARREAL et al., 2006).
Devido à necessidade de remover esses compostos inibidores, muitos
métodos de destoxificação têm sido estudados. Métodos físicos, como evaporação a
vácuo, e químicos, como extração por solventes, adsorção com carvão ativo ou
resinas de troca iônica e alterações de pH têm sido amplamente explorados
(PARAJO; DOMÍNGUEZ; DOMÍNGUEZ, 1996). Uma alternativa aos métodos físicos
e químicos é o método de destoxificação biológica, que utiliza organismos como
bactérias, leveduras e fungos filamentosos, e/ou enzimas. Micro-organismos como
leveduras, fungos e bactérias podem, naturalmente, metabolizar compostos
inibidores, sendo cada tipo de micro-organismo capaz de metabolizar um
determinado composto específico (PARAWIRA; TEKERE, 2010).
Okuda et al. (2008), realizaram estudos utilizando a bactéria Ureibacillus
thermosphaericus para a destoxificação de hidrolisados lignocelulósicos de resíduos
de madeira, constatando que a bactéria é capaz de metabolizar o 5-
hidróximetilfurfural e furfurais. Já Yu et al. (2011) constataram em suas pesquisas
que o fungo Aspergillus nidulans se mostrou capaz de diminuir não só a
19
concentração dos furfurais e hidróximetilfurfurais, mas também dos ácidos fórmico e
acético.
A escolha da técnica e a maneira como ela será utilizada dependerá,
portanto, do tipo de composto tóxico a ser removido, que, por sua vez, depende do
tipo de material utilizado como fonte de açúcares para o processo de produção do
xilitol e do tipo de tratamento ao qual o material é submetido (VILLARREAL et al.,
2006).
A obtenção do xilitol por via biotecnológica não envolve necessariamente as
células de micro-organismos, embora essa seja a forma mais comum. Uma técnica
alternativa é a utilização das enzimas envolvidas na bioconversão produzidas por
esses micro-organismos, processo conhecido como conversão biocatalítica. Nesse
processo, cujo esquema é representado na figura 5, a xilose redutase é obtida pela
lise das células de leveduras por meio de técnicas de ultrassom, e em seguida
levada a um reator de membranas contendo um caldo rico em xilose. O xilitol é
formado pela ação da enzima sob o substrato e se acumula no meio, sendo em
seguida recuperado e cristalizado (CORREIO BRAZILIENSE, 2010).
Figura 5. Produção biocatalítica do xilitol em uma pesquisa realizada pelo Laboratório de
Biocatálise Enzimática da Universidade de São Paulo (Labe/USP) (2010).
Fonte: Adaptado de Correio Braziliense, 2010.
20
2.4 Revisão: pesquisas sobre a produção biotecnológica do xilitol
Nos últimos anos, os estudos envolvendo a obtenção do xilitol por
mecanismos biotecnológicos vêm se tornando muito comuns. Isso se deve à
necessidade de novas opções para o processo de obtenção química, que ofereçam
maiores rendimentos e sejam industrialmente aplicáveis. Alguns destes estudos
realizados nos últimos anos serão destacados nesse trabalho.
Muitos dos trabalhos realizados nos últimos anos estão relacionados com os
parâmetros envolvidos no processo de obtenção do xilitol pelo metabolismo dos
micro-organismos, e destacam a influência de tais parâmetros no meio de
fermentação. Alguns desses parâmetros são: concentração inicial de substrato
(xilose), aeração do meio e presença de compostos inibidores (SARROU, 2009),
serão destacados a seguir.
2.4.1 Efeito da disponibilidade de oxigênio no meio
A obtenção do xilitol depende de uma baixa atividade da xilitol desidrogenase
(XDH), enzima que faz parte do metabolismo da xilulose nas células de alguns
micro-organismos. Essa baixa atividade é obtida por uma disponibilidade reduzida
do cofator NAD+, que é regenerado na cadeia respiratória nas mitocôndrias, sendo o
funcionamento desta intimamente ligado à disponibilidade de oxigênio no meio de
cultivo (BARRADAS et al., 2010).
Em 1999, Ikeuchi et al. analisaram o efeito da disponibilidade de oxigênio
para as células por meio da variação do coeficiente de transferência de oxigênio
(kla) durante o processo fermentativo, sendo conhecido que, quanto maior o valor de
kla, maior a transferência de oxigênio para as células. Utilizaram uma cepa
identificada como Candida sp. 559 – 9, e os valores de kla utilizados foram 1,7, 5,2 e
7,7 h-1.
Os resultados foram obtidos em 120 horas de fermentação, e demonstraram
que o menor valor de kla (1,7 h-1) promoveu a menor concentração celular no meio
(5,8 g/L) e, consequentemente um baixo acúmulo do xilitol (8,8 g/L) pela baixa
21
disponibilidade de células. Já para o maior valor de kla (7,7 h-1) a concentração de
xilitol foi relativamente alta, igual a 153,2 g/L, porém, não correspondeu ao maior
valor obtido, pois com uma maior quantidade de células, o xilitol é metabolizado e
destinado à manutenção celular, o que explica por que o maior valor de
concentração de xilitol (173,0 g/L) foi obtido com o valor intermediário de kla, igual a
5,2 h-1.
Nakano et al. (2000) comprovaram também a importância de se manter uma
condição microaeróbia controlada durante a fase de produção do xilitol pela levedura
Candida magnoliae, utilizando um sistema de lógica difusa para controlar a
concentração de oxigênio dissolvido no meio controlando-se sua aeração. A xilose
foi consumida durante todo o período com uma produção celular mínima, e o xilitol
se acumulou em grande quantidade ao final do processo, que durou 830 horas,
atingindo concentrações de até 356 g/L, o que corresponde a um fator de conversão
de 0,75 (YP/S = 0,75 g/g).
Em 2004, Sampaio et al. realizaram uma pesquisa também analisando a
relação entre o oxigênio e a produção de xilitol utilizando a levedura Debaryomyces
hansenii. O parâmetro analisado foi a velocidade de consumo específica de oxigênio
pelas células (qo2), e foi constatado que sob condições estritamente limitadas de
oxigênio (qo2 = 12 mmolO2 C-molDM−1 h−1) a produção de xilitol foi praticamente nula.
Já para um meio altamente aerado (qO2 ≥ 55.0 mmolO2 C-molDM−1 h−1), o rendimento
de produção de xilitol variou entre 0,41–0,52 g/g, e o maior rendimento obtido
ocorreu sob condições microaeradas (qO2 = 26.8 mmolO2C-molDM−1 h−1), quando a
concentração do xilitol atingiu 76,6 g/L, correspondendo à um rendimento de 0,73
g/g em 112 horas de metabolismo da xilose.
Em estudos mais recentes, Barradas et al. (2010) analisaram o efeito da
aeração do meio durante a fase de produção do xilitol utilizando a levedura Candida
parapsilosis, e variando-se a aeração do meio.Os valores de aeração utilizados
foram: 0, 0,1, 0,15, 0,2 e 0,5 vvm, e a fermentação foi conduzida por cerca de 80
horas. Os resultados obtidos confirmaram o que havia sido apontado por estudos
posteriores. Quando a aeração era nula, a levedura se mostrou incapaz de assimilar
a xilose, resultando na não formação do xilitol. Á medida que a aeração foi
aumentada, a produção do xilitol se iniciou, chegando a atingir um rendimento de
0,65 g/g quando o meio estava sob aeração de 0,1 vvm. Sob condições totalmente
22
aeradas, foi observado um aumento do crescimento celular e consequente
diminuição da concentração de xilitol no meio.
Um estudo também recente foi promovido por Zhang et al. (2012), no qual foi
analisado o efeito da aeração,com a utilização de uma nova cepa de levedura
isolada dos solos de Cingapura, denominada Candida athensensis,e hidrolisado de
resíduos horticulturais como matéria-prima. Os resíduos foram submetidos a um
fracionamento por solventes orgânicos para a obtenção do hidrolisado, que foi em
seguida destoxificado pela passagem por um filtro de carvão ativado. O efeito da
aeração durante a fermentação foi avaliado variando-se a velocidade de agitação
entre 100 e 250 rpm. O menor rendimento obtido foi correspondente à maior
velocidade de agitação, 0,61 g/g, quando foi observado também o maior valor de
concentração celular, de 21,25 g/L. Já o maior rendimento, igual a 0,77 g/g, foi
observado sob a agitação de 100 rpm, sendo que, para essa velocidade de agitação,
a concentração celular no meio foi a menor observada, de 12,47 g/L. Detectou-se
que as agitações mais intensas favoreceram o crescimento celular, enquanto valores
inferiores favoreceram o acúmulo de xilitol, o que comprova a importância das
condições microaeróbias do meio para bons rendimentos do processo.
2.4.2 Efeito da concentração inicial de substrato no meio
Outro importante parâmetro na obtenção do xilitol pela via biotecnológica é a
concentração inicial de substrato (xilose) utilizado no processo. É conhecido que a
concentração inicial de substrato está diretamente relacionada com o crescimento
celular e, consequentemente, com a quantidade de biomassa. Sabe-se também que
o metabolismo destinado ao crescimento celular não favorece o acúmulo do xilitol,
mas sim seu consumo com a formação de compostos intermediários, destinados à
via das pentoses-fosfato. Com base nisso, é presumível que a concentração inicial
de xilose influencie na obtenção do xilitol (BARRADAS et al., 2010; NÁHLÍK et al.,
2000).
No estudo realizado por Ikeuchi et al (1999), foi promovida a análise desse
parâmetro por meio da variação da concentração inicial da xilose de 50 à 300 g/L.
23
Foi observado que, para a menor concentração de xilose (50 g/L), a
concentração de xilitol obtida foi de 27,9 g/L, o que corresponde à um rendimento de
0,56 g/g. A concentração de xilitol aumentou de acordo com o aumento da
concentração de xilose, sendo que, para o maior valor dessa concentração (300
g/L), a quantidade de xilitol foi também a maior obtida no experimento, 210,3 g/L,
correspondente a um rendimento de 0,70 g/g.
O efeito da concentração inicial de xilose também foi destacado no estudo de
Nakano et al. (2000), o qual comprovou que maiores rendimentos podem ser obtidos
prolongando-se a fase de produção do xilitol por meio da complementação com
xilose á medida que esta era consumida pelas células. Foi feita por quatro vezes a
adição de xilose ao meio quando sua concentração chegava á zero, e assim a
concentração de xilitol no meio chegou a 356 g/L (YP/S = 0,75 g/g) após a última
adição de xilose. Constataram também que os maiores rendimentos com Candida
magnoliae foram obtidos com concentrações de xilose entre 100 e 172 g/L, o que
indica que esse micro-organismo tolera altas pressões osmóticas e concentrações
de açúcar. Foi também observada uma alta atividade da levedura mesmo em altas
concentrações de xilitol (muito superiores a 200 g/L), contrariando estudos feitos por
Silva e Afschar (1994), que observaram uma inibição pelo xilitol de leveduras quando
sua concentração chegava à cerca de 200g/L.
Rangaswamy (2003) estudou também o efeito da concentração inicial de
xilose em células de Corynebacterium sp. variando as concentrações iniciais de
xilose, cujos valores foram 20 g/L, 75 g/L e 100 g/lL. A maior concentração de xilitol
(42,7 g/L) foi obtida com a concentração inicial intermediária de xilose (75 g/L), o que
corresponde à um rendimento de 0,57 g/g.
Mussato e Roberto (2008) realizaram estudos com Candida guilliermondii,
para estabelecer a concentração inicial ótima de xilose e de suplementos no meio de
cultivo, tendo como matéria-prima o hidrolisado de bagaço de malte de cerveja. Os
experimentos envolveram testes com diferentes concentrações de xilose, 55, 75 e
95 g/L, com ou sem suplementação do meio com outros nutrientes (sulfato de
amônio,cloreto de cálcio e extrato de farelo de arroz). Os resultados obtidos
mostraram um efeito negativo da xilose, ou seja, os valores obtidos para os
parâmetros analisados (conversão de substrato em células - YX/S, rendimento de
produto por massa celular - YP/X e a produtividade volumétrica de xilitol - QP)
aumentavam à medida que se diminuía a concentração de xilose. Esse
24
comportamento, no entanto, não foi linear, e o valor ideal encontrado para a
concentração inicial da xilose foi de 70 g/L. Foi constatado também que os valores
obtidos para os parâmetros analisados foram superiores quando obtidos dos meios
não suplementados. Sob tais condições, os valores obtidos para os parâmetros
foram de: Yx/S = 0,78 g/g, YP/X = 5,81 g/g e QP = 0,58 g/L.h. Foi concluído que a
concentração inicial ideal de xilose no meio, bem como sua suplementação
dependem do tipo de micro-organismo utilizado e das condições de cultivo.
Os estudos recentes de Zhang et al. (2012) também analisaram o efeito da
concentração inicial de xilose. Seu efeito no meio fermentativo foi estudado através
da variação da concentração de xilose entre 100 e 300 g/L. Os autores constataram
que o rendimento de conversão à xilitol foi diretamente proporcional ao aumento da
concentração de xilose, até a concentração inicial de 250 g/L, quando o rendimento
chegou a atingir 0,82 g/g em 192 horas. A partir dessa concentração de xilose, se
iniciou uma queda do rendimento, caracterizando-se uma inibição pelo substrato da
Candida athensensis.
2.4.3 Efeito da presença de compostos inibidores
Como já citado anteriormente, a presença de compostos inibidores oriundos
da hidrólise da matéria-prima pode influenciar no processo, afetando o metabolismo
celular, em especial a atividade das enzimas xilose redutase e xilitol desidrogenase,
diminuindo a concentração de xilitol acumulado no meio (VILLARREAL et al., 2006;
ALVES et al., 2002).
Carvalheiro et al. (2005) realizaram estudos com Debaromyces hansenii,
utilizando grãos usados em cervejarias. O hidrolisado foi submetido a técnicas de
destoxificação, como ajuste de pH para 5,5, calagem, adsorção em carvão ativado e
em resinas catiônicas e aniônicas a diferentes valores de pH.
A maior produtividade observada no experimento ocorreu após a
destoxificação do hidrolisado por adsorção em carvão ativado, sendo esse valor
igual a 0,33 g/L.h. Para o caso da não destoxificação do hidrolisado, a produtividade
obtida foi de 0,29 g/L.h.
25
Rao et al. (2005) realizaram um estudo da obtenção do xilitol à partir de
hidrolisados de fibra de milho e bagaço de cana-de-açúcar utilizando a levedura
Candida tropicalis. Os rendimentos obtidos foram relativamente baixos, o que foi
justificado pela presença de compostos inibidores nos hidrolisados. Para efeito
comparativo, realizaram dois experimentos: no primeiro as células foram cultivadas
nos hidrolisados da fibra de milho e de bagaço de cana-de-açúcar e no segundo, em
meios sintéticos, cuja composição imitava a dos hidrolisados, mas sem a presença
de compostos inibidores. Foram utilizados três meios sintéticos, com diferentes
proporções de xilose, glicose, manose, galactose, L-arabinose, extrato de levedura,
peptona e solução salina. Os hidrolisados foram submetidos à neutralização, com o
uso de Ca(OH)2 e tratados com carvão ativado e resinas de troca iônica.
A produção de xilitol apresentou maiores rendimentos quando a fermentação
foi realizada nos três meios sintéticos (0,63 g/g, 0,68 g/g e 0,72 g/g), confirmando
que baixos rendimentos são obtidos quando há a presença de compostos inibitórios
no meio.
Villarreal et al. (2006) pesquisaram o efeito dos inibidores resultantes da
hidrólise da hemicelulose de eucalipto, utilizando Candida guilliermondii e alguns
métodos de destoxificação, como tratamentos com carvão ativado e resinas
catiônicas e aniônicas. Para checar a eficácia dos tratamentos, as células de
Candida guilliermondii foram submetidas aos hidrolisados.
Para o hidrolisado que não foi destoxificado, o consumo de xilose e formação
de xilitol foram ínfimos (6% de xilose consumida, com a formação de 1,2 g/L de
xilitol). Já o maior rendimento obtido para a produção do xilitol, igual a 0,65 g/g, foi
oriundo do hidrolisado tratado com as resinas de troca iônica, responsáveis pela
remoção de inibidores como ácido acético e compostos fenólicos, após 72 horas de
fermentação.
Kelly et al. (2008) estudaram os efeitos individuais e combinados de furfurais,
vanilina e seringaldeído no metabolismo de Candida guilliermondii. Constatou-se
que a uma concentração de 1g/L, a vanilina foi o inibidor mais severo, seguida do
seringaldeído e que o furfural não causava severas inibições. Seringaldeído e
furfural, à uma concentração de 2 g/L, causaram uma diminuição no crescimento
celular nas primeiras 30 horas de cultivo, e a vanilina com a mesma concentração,
resultou no não crescimento celular durante 42 horas de cultivo. Já o efeito múltiplo
dos inibidores se mostrou menos severo que o efeito individual, e dependente
26
também da concentração de cada composto. Foi observado que a presença dos
inibidores resultava em aumentos da fase lag (fase de adaptação) das células. Na
presença dos furfurais, a duração desta fase variou entre 0 – 15 horas, e na
presença de seringaldeído e vanilina, a duração era de 2 e 5 horas,
respectivamente.
O efeito sinergístico dos inibidores promoveu uma diminuição no acúmulo do
xilitol, sendo que em concentrações de 1 g/L de cada inibidor, a produção de xilitol
correspondia a 85% da produção observada em um controle, que não possuía
inibidores, e o furfural em concentrações de 2 e 3 g/L resultava em uma produção de
cerca de 43% da produção observada no controle.
Estudos a respeito do assunto também foram realizados por da Silva et al
(2011), que abordaram o tratamento do hidrolisado de bagaço de cana-de-açúcar
antes e depois de uma concentração do mesmo. Foi utilizada a levedura Candida
guilliermondii.
O tratamento do hidrolisado consistiu em alterações de pH (inicialmente o
valor foi ajustado para 7,0 com a adição de CaO e posteriormente diminuído a 5,5
com H3PO4) e em seguida adicionou-se carvão ativado em pó. Os sólidos
precipitados após essas etapas foram removidos e o líquido concentrado a vácuo.
Foi observado que, em linhas gerais, o hidrolisado que sofreu tratamento
antes da concentração a vácuo (H1) apresentava maior concentração de compostos
inibidores (furfurais, hidróximetilfurfurais e fenóis) do que o hidrolisado tratado após
a concentração (H2), demonstrando que a carga de inibidores varia de acordo com o
tratamento ao qual o hidrolisado é submetido. O maior valor para o rendimento de
produção de xilitol (0,77 g/g) foi obtido do hidrolisado H2, o que corresponde a uma
diferença de cerca de 48% a mais do que foi obtido com o hidrolisado H1,
provavelmente pela maior quantidade de inibidores presente neste hidrolisado.
2.4.4 Obtenção de xilitol pelo metabolismo de bactérias
Embora a maior parte da produção por via biotecnológica do xilitol seja
realizada por leveduras, estudos utilizando bactérias também foram conduzidos,
como o realizado por Sakakibara et al. (2008), que empregaram uma cepa
27
geneticamente modificada de Escherichia coli, para produção de xilitol a partir de L-
arabinose, obtendo altos rendimentos. Essa capacidade de conversão foi criada
introduzindo-se uma nova via metabólica nas células, denominada “via ATX”,
esquematizada na Figura 6.
As enzimas empregadas nesta via são normalmente produzidas pelo micro-
organismo Ambrosiozyma monospora, cujo DNA foi clonado, e o plasmídeo obtido
inserido em uma cepa selvagem de E. coli, originando a cepa ZUC99 (pATX210).
Uma vez que as células de E. coli não utilizam o xilitol como fonte de carbono, este
composto não é metabolizado após sua formação e se acumula no meio.
Existem três enzimas chave na via ATX: L-arabinose isomerase, responsável
pela conversão de L-arabinose em L-ribulose, a D-psicose 3-epimerase, que
converte a L-ribulose em L-xilulose e a L-xilulose redutase, que reduz a L-xilulose à
xilitol.
O resultado obtido foi um rendimento de 0,95 g/g de conversão da L-
arabinose consumida em xilitol num tempo de 30 horas, comprovando que células
geneticamente modificadas de E. coli também podem ser uma opção para a
obtenção do xilitol por via bioquímica.
Figura 6. Via ATX para a conversão de L-arabinose em xilitol.
Fonte: Adaptado de Sakakibara et al. (2008).
28
Além de Sakakibara et al. (2008), outros pesquisadores utilizaram cepas de
bactérias para promover a obtenção do xilitol pro via biotecnológica. Suzuki et al.
(2002) utilizaram cepas pertencentes aos gêneros Acetobacter e Gluconobacter, que
se mostraram boas produtoras de xilitol à partir de L-arabinose. Dentre essas cepas,
Gluconobacter oxydans produziu 29,2 g/L de xilitol á partir de 52,4 g/L de L-
arabinose, o que corresponde a um rendimento de 0,56 g/g.
Rangaswamy e Agblevor (2002) estudaram também a possibilidade de se
utilizar algumas cepas de bactérias anaeróbias facultativas para a obtenção do
xilitol, Serratia, Cellulomonas e Corynebacterium. Dentre elas, Corynebacterium sp.
demonstrou ser também uma boa produtora de xilitol.
3 CONSIDERAÇÕES FINAIS
Com base na retrospectiva dos estudos realizados nos últimos anos, pode-se
concluir que o setor alimentício é o que mais utiliza o xilitol, devido a sua capacidade
adoçante, embora o composto também seja empregado no setor da saúde, para
prevenção de doenças e cáries.
Ainda com base na revisão de algumas pesquisas realizadas nos últimos
anos, pode-se afirmar que o micro-organismo mais comumente utilizado em estudos
para a produção biotecnológica do xilitol são os da espécie Candida sp, e que a
utilização de bactérias é também possível no processo de obtenção bioquímica do
xilitol. Porém, o uso de alguns delas, tais como E. coli, requer técnicas de
engenharia genética, uma vez que as cepas selvagens não produzem as enzimas
necessárias para o metabolismo do xilitol.
Conclui-se também que muitos tipos de matéria-prima podem ser utilizados,
como hidrolisados de bagaço de cana-de-açúcar, resquícios de cascas de malte,
palha de arroz e fibras de milho, pois possuem açúcares fermentescíveis na
composição de sua parede celular. As matérias-primas utilizadas como fonte de
açúcar variam de acordo com sua disponibilidade e sazonalidade, e é comum optar
por aquelas que estão disponíveis em grandes quantidades, a fim de evitar o
acúmulo de resíduos agroindustriais. No Brasil, por exemplo, é comum utilizar o
bagaço de cana-de-açúcar, produzido em grandes quantidades pela indústria
sucroalcooleira. Já em Cingapura, os resíduos horticulturais são obtidos em grande
29
quantidade e não possuem outra destinação além da incineração e disposição em
aterros, o que causa impactos ambientais. Seu uso como matéria-prima é uma
alternativa para amenizar tais impactos.
Os rendimentos obtidos para a conversão da xilose em xilitol variam de
acordo com o tipo de micro-organismo e principalmente, com alguns parâmetros
relacionados com o processo fermentativo, tais como aeração, concentração inicial
de xilose e presença de substâncias inibidoras do metabolismo celular.
Apesar de o xilitol ser amplamente produzido por métodos químicos, a via
biotecnológica é uma opção que pode ser viável para a indústria no futuro. No
entanto, os longos tempos necessários para a bioconversão da xilose são um
inconveniente do processo e devem ser melhorados.
Sugere-se para trabalhos futuros, pesquisas que busquem oferecer
alternativas para esse problema, buscando bons rendimentos de formação do xilitol.
Com uma maior eficiência do processo nesse tocante, a viabilidade da obtenção do
xilitol por vias bioquímicas se tornará mais evidente.
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