IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE FUNGOS

HIPERPARASITAS DE Asperisporium caricae

JANIELI MAGANHA SILVA VIVAS

UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY RIBEIRO – UENF

CAMPOS DOS GOYTACAZES – RJ

FEVEREIRO – 2014.

IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE FUNGOS HIPERPARASITAS DE Asperisporium caricae

JANIELI MAGANHA SILVA VIVAS

Dissertação apresentada ao Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, como parte das exigências para obtenção do título de Mestre em Produção Vegetal.

Orientador: Prof. Silvaldo Felipe da Silveira.

CAMPOS DOS GOYTACAZES – RJ FEVEREIRO – 2014.

IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE FUNGOS

HIPERPARASITAS DE Asperisporium caricae

JANIELI MAGANHA SILVA VIVAS

Dissertação apresentada ao Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, como parte das exigências para obtenção do título de Mestre em Produção Vegetal.

Aprovada em 11 de fevereiro de 2014. Comissão Examinadora: ________________________________________________________________

Prof. Olinto Liparini Pereira (D.Sc., Fitopatologia) – UFV

________________________________________________________________ Vicente Mussi Dias (D.Sc., Produção Vegetal) – UENF

________________________________________________________________ Ricardo Moreira de Souza (Ph.D., Plant Pathology) – UENF

________________________________________________________________ Prof. Silvaldo Felipe da Silveira (D.Sc., Fitopatologia) – UENF

Orientador

ii

AGRADECIMENTOS

A Deus, por sua presença forte e constante em minha vida;

A todos os meus familiares, em especial, aos meus pais Maria Rita Maganha

Silva e Ely Ferreira Silva pelo apoio, pela oração constante e por torcerem sempre

por minha felicidade e realização. À minha irmã Juliete Maganha Silva, que

sempre esteve ao meu lado como uma verdadeira companheira inseparável;

Ao meu esposo Marcelo Vivas, pelo companheirismo, comprometimento e

incentivo;

Ao meu orientador, Professor Silvaldo Felipe da Silveira, pela oportunidade, pela

confiança e por todos os ensinamentos, além do grande incentivo;

Ao professor Olinto Liparini Pereira, por ceder seu laboratório para condução das

análises filogenéticas, além da colaboração no processo de elaboração e

execução dos trabalhos;

Ao Pós-doutorando Danilo Batista Pinho, pelo auxílio ímpar na condução das

análises filogenéticas, além das conversas e dos conselhos para melhoria do

trabalho;

iii

A Vicente Mussi Dias e Ricardo Moreira de Souza, pela participação na banca e

colaboração para a melhoria do trabalho;

Aos Colegas de Laboratório, pela amizade e convivência;

A FAPERJ, pela concessão da bolsa de mestrado;

A Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro e ao Centro de

Ciências e Tecnologia em Agropecuária, pela oportunidade de realização do

curso.

iv

SUMÁRIO

RESUMO ....................................................................................................... vi

ABSTRACT ................................................................................................... viii

1. INTRODUÇÃO .......................................................................................... 01

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ..................................................................... 04

2.1. Cultura do mamoeiro .............................................................................. 05

2.2. Pinta-preta do mamoeiro ........................................................................ 05

2.3. Medidas de controle da pinta-preta ........................................................ 07

2.4. Controle biológico ................................................................................... 09

3. MATERIAL E MÉTODOS .......................................................................... 14

3.1. Obtenção de isolados e isolamento monospórico................................... 14

3.2. Caracterização cultural, morfológica e identificação dos isolados ......... 16

3.3. Crescimento micelial dos hiperparasitas e esporulação em diferentes temperaturas...................................................................................................

17

3.4. Antibiose in vitro: compostos voláteis e não voláteis que possam inibir a germinação de esporos de A. caricae......................................................... 18

3.5. Microscopia ótica da interação entre A. caricae e isolados hiperparasitas ................................................................................................ 19

3.6. Hiperparasitismo in vivo sob condições de telado................................... 19

v

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................ 21

4.1. Caracterização cultural e morfológica e identificação ............................ 21

4.2. Crescimento micelial dos hiperparasitas e esporulação em diferentes temperaturas ..................................................................................................

35

4.3. Antibiose in vitro: Compostos voláteis e não voláteis que possam inibir a germinação de esporos de A. caricae ........................................................ 41

4.4. Microscopia ótica da interação entre A. caricae e isolados hiperparasitas ................................................................................................ 46

4.5. Hiperparasitismo in vivo sob condições de telado .................................. 48

5. CONCLUSÃO GERAL .............................................................................. 54

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................... 56

vi

RESUMO

VIVAS, Janieli Maganha Silva M. Sc., Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro. Fevereiro de 2014. Identificação e caracterização de fungos hiperparasitas de Asperisporium caricae. Orientador: Prof. Silvaldo Felipe da Silveira.

A pinta-preta do mamoeiro causada pelo fungo Asperisporium caricae,

apresenta expressiva importância, pois é uma doença que provoca danos no

desenvolvimento da planta pela redução de área foliar fotossintética e pelas

lesões nos frutos, tornando-os inadequados à comercialização. A cultura do

mamoeiro é hoje dependente da pulverização de fungicidas, principal medida de

controle da pinta-preta. Há, portanto, necessidade de se buscar controle

alternativo sustentável, como o controle biológico. Diferentes autores relataram

fungos hiperparasitas colonizando sinais de A. caricae, entretanto, alguns relatos

são pouco sustentados cientificamente e a maioria deles compreende trabalhos,

que não comprovam o micoparasitismo, tampouco avaliaram o potencial dos

fungos hiperparasitas no biocontrole de A. caricae. No presente trabalho

objetivou-se: obter, identificar e caracterizar diferentes isolados hiperparasitas;

conduzir testes in vitro para avaliar o efeito de metabólitos voláteis e não voláteis

que possam inibir a germinação de esporos, analisar a interação entre o patógeno

A. caricae e fungos hiperparasitas; e, avaliar in vivo o potencial dos diferentes

isolados obtidos quanto à capacidade de colonizar lesões de A. caricae. Foram

obtidos 24 isolados de fungos a partir de sinais do patógeno de amostras de

folhas oriundas de diferentes regiões do Brasil, sendo: 10 isolados pertencentes

vii

ao gênero Hansfordia (destes um isolado de Pseudocercospora no quiabeiro, um

isolado de Cladosporium em jiloeiro e oito isolados a partir de A. caricae em

mamoeiro); 11 isolados pertencentes ao gênero Acremonium (destes um de

Pseudocercospora em quiabeiro e 10 isolados de A. caricae em mamoeiro); dois

pertencentes ao gênero Lecanicillium (obtidos de ferrugem do café) e um

pertencente ao gênero Simplicillium (obtido de ferrugem no Jasmim-manga). Em

sua maioria, os isolados de fungos hiperparasitas apresentaram maior

crescimento micelial e esporulação em temperaturas amenas, entre 20 e 25 °C.

Em estudo de antibiose in vitro, não se constatou, nos isolados testados, ação de

composto volátil sobre a germinação de conídio de A. caricae. Por outro lado, há

evidências de antibiose por compostos não voláteis. Os isolados I-608, I-616, I-

600, I-611, I-612, I-604, I-623 e I-617 foram os que mais reduziram a germinação

conidial de A. caricae nos testes de antibiose por difusão em meio de ágar.

Evidências de micoparasitismo direto a tubos germinativos de A. caricae foram

observadas para os isolados pertencentes aos gêneros Lecanicillium,

Simplicillium e Acremonium (à exceção dos isolados I-609 e I-621 de

Acremonium), e compreenderam colonização associada e penetração das hifas

hiperparasitas no tubo germinativo do patógeno. Já os isolados de Hansfordia

diferiram na frequência e na intensidade de colonizar externamente o tubo

germinativo A. caricae, mas não se observou invasão. Em casa de vegetação, os

isolados de I-614, I-608, I-611, I-615 (isolados de Hansfordia) apresentaram

maiores médias de incidência de lesões de pinta-preta hiperparasitadas. Conclui-

se haver potencial da implementação do biocontrole da pinta-preta do mamoeiro,

pela aplicação de fungos hiperparasitas, como medida complementar de controle,

visando à redução do inóculo do patógeno, em um contexto de manejo integrado

ou agricultura orgânica.

viii

ABSTRACT

VIVAS, Janieli Maganha Silva M. Sc., Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro. February, 2014. Identification and characterization of fungal hyperparasites Asperisporium caricae. Advisor: Prof. Silvaldo Felipe da Silveira.

The black spot of papaya caused by the fungus Asperisporium caricae has

a significant importance as it is a disease that damages the development of the

plant by reducing photosynthetic leaf area and lesions on fruit, making them

unsuitable for marketing. The papaya crop is now dependent on the spraying of

fungicides, the main measure to control black spot. There is therefore need to

seek sustainable alternative approaches, such as biological control. Different

authors reported hiperparasites fungi colonizing A. caricae signals, however, some

reports are poorly supported scientifically and mostly comprises works that do not

prove mycoparasitism nor assessed the potential of hiperparasites fungi in

biocontrol of A. caricae. In the present study we aimed to: obtain, identify and

characterize different isolates hiperparasites; lead in vitro to evaluate the effect of

volatile and non-volatile metabolites that inhibit spore germination, analyze the

interaction between pathogen and A. caricae hiperparasites fungi; and evaluate in

vivo the potential of different isolates for their ability to colonize lesions of A.

caricae . We obtained 24 isolates of fungi from signs of the pathogen from leaf

samples from different regions of Brazil, with 10 isolates belonging to the genre

Hansfordia (these Pseudocercospora an isolate of okra in one isolate of

Cladosporium in S. gilo eight isolated from A. caricae on papaya); 11 isolates

ix

belonging to the genus Acremonium (one of these Pseudocercospora to okra and

10 isolates of A. caricae on papaya); two belonging to the genus Lecanicillium

(obtained from coffee rust) and one belonging to the genus Simplicillium (got rust

in Jasmine manga). Most of the isolates showed higher hiperparasites fungi

mycelial growth and sporulation in mild temperatures, between 20 and 25 ° C. In a

study of in vitro antibiosis not found in isolates tested volatile compound action on

the germination of conidia of A. caricae. Moreover, there is evidence for antibiosis

non-volatile compounds. The I- 608 , I- 616 , I- 600 , I- 611 , I- 612 , I- 604 , I- 623

and I- 617 isolates were most reduced conidial germination of A. caricae in

antibiosis tests for diffusion through agar. Direct evidence of mycoparasitism the

germ tubes of A. caricae were observed for isolates belonging to the genera

Lecanicillium, Simplicillium and Acremonium (except the isolated I- 609 and I- 621

Acremonium), and comprised associated colonization and penetration of hyphae

in hiperparasites germ tube of the pathogen. The isolates from Hansfordia differ in

the frequency and intensity of colonizing the germ tube externally A. caricae but no

invasion was observed. In the greenhouse, isolates from I-614, I- 608, I-611, I-615

(isolates Hansfordia) showed higher incidence of early blight lesions

hiperparasited . It follows the implementation of biocontrol potential of early blight

of papaya by applying hiperparasites fungi as an additional control measure aimed

at reducing pathogen inoculum, in a context of integrated or organic farming

management there.

1

1. INTRODUÇÃO

O mamoeiro (Carica papaya L.) é uma das fruteiras tropicais de maior

importância no Brasil. O Brasil é o segundo maior produtor e o terceiro maior

exportador da fruta. O mamão é a sétima fruta “in natura” mais exportada no País,

sendo cultivado em cerca de 30mil hectares, que estão concentrados nos estados

do Espírito Santo, Bahia, Ceará e Rio Grande do Norte (AGRIANUAL, 2011).

A cultura do mamoeiro é vulnerável ao ataque de inúmeros fitopatógenos.

Dentre estes, o fungo Asperisporium caricae (Speg.) Maubl., agente causal da

pinta-preta. A pinta-preta é uma das doenças mais comuns na maioria das

regiões tropicais e subtropicais onde se cultiva o mamoeiro, tais como: África,

Austrália e Oceania, sul e sudeste da Ásia (ex: Índia) e nas Américas Central e do

Sul (Liberato et al., 2007). A doença apresenta expressiva importância

econômica, pois provoca danos ao desenvolvimento da planta, pois reduz a

superfície fotossintética da folha, devido ao grande número de lesões necróticas e

de coloração escura. Nos frutos, embora os sintomas sejam superficiais, as

lesões os tornam inadequados à comercialização, predispondo-os a podridões na

pós-colheita (Rezende & Martins, 2005).

Devido à frequência com que ocorre e os danos que causa, a pinta-preta

exige muitas aplicações de fungicidas para o seu controle. Porém, o controle

exclusivamente químico repercute negativamente nas exportações. Ademais, o

uso intensivo de agrotóxicos oferece riscos de contaminação ambiental (solo e

água), de alimentos e dos animais, dos agricultores e dos consumidores. Além

2

disso, patógenos, pragas e plantas invasoras desenvolvem comumente

resistência aos agroquímicos, bem como há o surgimento de doenças

iatrogênicas, decorrentes de desequilíbrios fisiológicos e no sistema radicular.

Também, o uso de fungicidas ocasiona a eliminação de organismos benéficos e a

redução da biodiversidade da micobiota do solo, dentre outros efeitos indesejados

(Bettiol & Morandi, 2009).

Atualmente o interesse por métodos alternativos de controle está alterando

o cenário agrícola, para favorecer a conservação e o uso sustentável dos

recursos biológicos. Políticas internacionais demandam fortemente alternativas

para os agrotóxicos. Dentre as alternativas ao uso de fungicidas químicos

convencionais na agricultura, o controle biológico é amplamente discutido. O

controle biológico consiste na redução da soma de inóculo ou das atividades

determinantes da doença (crescimento, infectividade, virulência, agressividade e

outras qualidades do patógeno, ou processos que determinam infecção,

desenvolvimento de sintomas e reprodução) provocada por um patógeno, pelo

uso de um ou mais organismos antagônicos, que não o homem (Cook & Baker,

1983).

O controle biológico tem sido apontado como um método promissor para

minimizar o uso de agrotóxicos e promover a proteção das culturas, pois se

baseia em procedimentos ambientalmente corretos que podem fazer parte de um

sistema de controle integrado de doenças (Grigoletti Junior et al., 2000; Slininger

et al., 2003). Dentre os fungos empregados no controle de doenças de plantas,

espécies de Trichoderma encontram-se entre as mais estudadas e utilizadas

mundialmente (Benítez et al., 2004). Estudos de controle biológico utilizando

fungos também têm sido feitos com os gêneros Dicyma (considerados por muitos

como sinônimo de Hansfordia) (Mitchell et al. 1987, Warwick, 2007), Acremonium

(Warwick, 2001, 2007), Penicillium (De Cal et al. 1990; Larena et al., 1996;

Moreira et al., 2008), Clonostachys (Valdebenito-Sanhueza et al., 1997; Morandi

et al., 2003; Nobre et al., 2005, Morandi et al., 2007; Silvera-Pérez et al., 2010) e

Gliocladium (Tarantino et al., 2007), dentre outros.

Diferentes autores encontraram fungos colonizando lesões da pinta-preta

do mamoeiro, Rhinotrichum glossypinum (Charles, 1940), Sclerospora sp. e

Verticillium sp. (Adikaram & Wijepala, 1995); Cephalosporium (Silva et al., 1999);

Dicyma sp. e Acremonium sp. (Vivas et al. 2011). Estes relatos reforçam a

3

hipótese de que a pinta-preta pode ser controlada biologicamente. Entretanto,

alguns destes relatos são pouco sustentados cientificamente e a maioria

compreende trabalhos incontínuos, publicados em resumos ou anais de

congresso. Além disso, há possibilidade de um mesmo fungo ter sido classificado

diferentemente por mais de um autor, justificando a tentativa de identificar em

nível de espécies os fungos de lesões de pinta-preta do mamoeiro. Sendo assim,

embora os fungos tenham sido relatados parasitando lesões de pinta-preta, não

há nenhum trabalho que comprove o parasitismo, tampouco que avalie o seu

potencial para biocontrole de A. caricae. Desta forma, o trabalho visa buscar

alternativas para se controlar o fungo A. caricae, patógeno que vem se

constituindo em um dos principais problemas para a cultura do mamoeiro no

Brasil.\Os objetivos desse trabalho foram: i) obter em cultura pura isolados de

fungos hiperparasitas de A. caricae a partir de lesões de pinta-preta do mamoeiro

e em outros patossistemas; ii) identificar e caracterizar os diferentes isolados

obtidos; iii) conduzir testes in vitro para avaliar a presença de metabólitos voláteis

e não voláteis que possam inibir a germinação de esporos de A. caricae; iv)

avaliar a influência da temperatura sobre o crescimento micelial e a esporulação

dos isolados obtidos; e, v) avaliar in vivo o potencial dos diferentes isolados

quanto à capacidade de colonizar lesões em folhas de mamoeiro ocasionada por

A. caricae, sob condições controladas, bem como selecionar isolados

hiperparasitas mais promissores.

4

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1. Cultura do mamoeiro

O mamoeiro (Carica papaya L.), espécie pertencente à Classe

Equisetepsida, Ordem das Brasscales, Família Caricaceae é uma das fruteiras

mais comuns em quase todos os países da América Tropical. Há relatos de que

este foi descoberto pelos espanhóis na região compreendida entre o sul do

México e o norte da Nicarágua (Serrano & Cattaneo, 2010). Após a descoberta, o

mamoeiro foi amplamente distribuído em várias regiões tropicais e subtropicais,

estendendo-se a 32° de latitude norte e sul, com possível introdução no Brasil em

1587 (Serrano & Cattaneo, 2010). A cultura desenvolve-se de maneira satisfatória

em locais com temperatura média anual de 25ºC, com limites entre 21ºC e 33ºC,

e precipitação pluviométrica de 1.500 mm anual bem distribuída.

A fruta é fonte importante de papaína, enzima proteolítica de ação

semelhante à da pepsina e tripsina, empregada para os mais variados usos na

indústria têxtil, farmacêutica, de alimentos e de cosméticos. Das folhas, dos frutos

e das sementes é extraído também um alcaloide denominado carpaína, utilizado

como ativador cardíaco. Além disso, o mamão é boa fonte de cálcio e excelente

fonte de pró-vitamina A e de ácido ascórbico (vitamina C), sendo o teor deste

último aumentado com a maturação do fruto (Trindade, 2000).

Segundo a FAO (2011), a produção mundial de mamão representa 10% da

produção mundial de frutas tropicais, girando em torno de 8 milhões de

toneladas/ano, das quais 39% são produzidas na América Latina e no Caribe. O

mamão é a sétima fruta “in natura” mais exportada no país, sendo cultivado em

5

cerca de 30 mil hectares, que estão concentrados nos estados do Espírito Santo,

Bahia, Ceará e Rio Grande do Norte. Atualmente, o Brasil é o segundo maior

produtor mundial, ficando atrás somente da Índia, e o terceiro maior exportador da

fruta (AGRIANUAL, 2011). No entanto, o potencial brasileiro de exportação do

mamão é muito grande, visto que as variedades produzidas no país são

compatíveis com a demanda do mercado externo (Cruz, 2008).

Um dos problemas relacionados à pequena capacidade de exportação do

mamão brasileiro é a falta de certificação que ateste a qualidade das frutas e a

forma pouco sustentável como elas foram produzidas. Exigências dessa natureza

têm sido feitas pelo Mercado Comum Europeu, principal comprador do mamão

brasileiro, bem como pelo mercado norte-americano (Cruz, 2008).

2.2. Pinta-preta do mamoeiro

A cultura do mamoeiro foi relatada como hospedeira de

aproximadamente 171 diferentes espécies de fungos (Nishijima & Zhu, 2004).

Dentre esses, o fungo Asperisporium caricae (Speg.) Maubl, agente causal da

pinta-preta, constitui-se a doença fúngica de expressiva importância econômica,

pela depreciação do aspecto comercial da fruta e pela exigência de muitas

aplicações de fungicidas para o seu controle (Santos Filho et al., 2007; Nishijima

et al., 1994). O fungo pode incidir sobre folhas e frutos de Carica papaya,

raramente em Carica chilensis (= Vasconcellea chilensis) (Caricaceae) (Ellis &

Holliday 1972 Crous & Braun, 2003).Santos & Barreto (2003) relataram perdas de

30% na comercialização de frutos de mamão em São Paulo. Segundo Liberato &

Zambolim (2002), plantas muito afetadas podem perder de 50 a 60% de suas

folhas em um período de dois a três meses, e a incidência da doença em frutos

pode atingir quase 100%.

A primeira descrição da pinta-preta no Brasil foi realizada por Maublanc

(1913), no Estado do Rio de Janeiro. Ela se tornou uma das doenças mais

comumente observadas tanto em pomares comerciais quanto em plantios

domésticos. O patógeno encontra-se disseminado na maioria das regiões

tropicais e subtropicais do globo incluindo a Argentina, Austrália, Ilhas Bermudas,

Colômbia, Cuba, El Salvador, Flórida, Índia, Jamaica, Japão, Quênia, México,

Peru, Porto Rico, Ilhas Salmão, África do Sul, Sri Lanka, Tanzânia, Venezuela e

6

Zimbábue (Liberato et al., 2007). Os mesmos autores relataram a ocorrência de

pinta-preta nos E.U.A. e Canadá.

O primeiro nome dado ao fungo, agente causal da pinta-preta, foi dado por

Spegazzini com Cercospora caricae Speg. em 1886. Ao longo dos anos foram

ocorrendo mudanças na nomenclatura como, Epiclinium cumminsii Massee, 1898,

Scolecotrichum caricae Ellis & Everh., 1892, Fusicladium caricae (Speg.) Sacc.,

1902, Pucciniopsis caricae Earle, 1902, até esse fungo ser nomeado

Asperisporium caricae (Speg.) Maubl., em 1913, sendo esse nome aceito

atualmente (Sivanesan, 1990).

A. caricae é considerado um fungo biotrófico, baseado na dificuldade de

seu cultivo e esporulação in vitro. Quanto à posição taxonômica A. caricae

pertence ao Reino Fungi, ao Filo Ascomycota, à Classe Dothideomycetes, à

Subclasse Dothideomycetidae, à Ordem Capnodiales, à Família

Mycosphaerellaceae (INDEX FUNGORUM, 2014). No entanto, alguns aspectos

taxonômicos do gênero Asperisporium são controversos, tais como a

comprovação de Mycosphaerella caricae Syd. & P.Syd como teleomorfo. Estudos

recentes mostram que A. caricae não é anamorfo de M. caricae, tratando-se de

espécies distintas (Silva, 2010).

Asperisporium caricae é um hifomiceto que produz conídios uni ou

bicelulares escuros, em esporodóquios formados por conidióforos curtos, escuros

e densamente agrupados. Lesões secas, sem esporos assumem coloração cinza

e parda, principalmente na face adaxial das folhas, circundadas por estreito halo

amarelo (Ellis, 1971). O fungo apresenta estroma subepidérmico com 60 x 200

µm de diâmetro e 60-80 µm de altura, produzindo conidióforos fasciculados,

eretos e septados com 40-45 µm de comprimento. Os conídios são piriformes ou

oblongos com dimensões de 10-24 x 8-10 µm (Kimati et al, 1997).

A infecção dá-se, comumente, na face inferior das folhas mais velhas,

servindo de fonte de inóculo para o fruto, daí a importância de controlar a doença

primeiramente nelas. Segundo Stevens (1939), o período de incubação da

doença é de oito a dez dias e o período latente de 18 a 21 dias. A doença é mais

severa em períodos chuvosos e em regiões com alta umidade relativa (Adikaram

& Wijepala, 1995; Elder et al., 2000). Nas folhas o fungo desenvolve frutificações

pulverulentas que formam manchas pequenas, geralmente menores do que 4 mm

de diâmetro, circulares, ligeiramente angulosas, de coloração escura.

7

Correspondente à lesão, na face superior, formam-se lesões semelhantes de

coloração pardo-clara envolvidas por uma pequena depressão e um halo amarelo

(Luna, 1986).

Nos frutos os primeiros sintomas são verificados quando estes ainda estão

verdes, na forma de manchas circulares semelhantes às lesões das folhas. O

tamanho das manchas acompanha o desenvolvimento dos frutos, tornado-se

então pretas, salientes, ásperas ao tato e limitando-se à camada superficial da

casca (Liberato et al., 2007). Estas lesões não atingem a polpa do fruto, são

restritas apenas à casca, onde causam um endurecimento na parte afetada,

porém desvalorizam o produto para o comércio, além de reduzir a sobrevida pós-

colheita, a presença de apenas algumas lesões inviabiliza a exportação do fruto.

Devido à grande frequência com que a doença é encontrada no campo

sugere-se que o fungo não tenha problemas de sobrevivência, provavelmente

porque o mamoeiro apresenta folhas suscetíveis durante todo o ano, além de os

conídios poderem ser disseminados pelo vento em longas distâncias. Respingos

de chuva e água de orvalho também contribuem para a disseminação (Rezende &

Martins, 2005). Para a doença as condições favoráveis ao desenvolvimento de

epidemias são de temperatura variando de 25 ºC a 30 ºC e umidade relativa

variando de 80 a 100 % (Suzuki et al., 2007).

2.3. Medidas de controle da pinta-preta

Pela alta frequência com que normalmente ocorre e pelos danos que pode

ocasionar ao mamoeiro, particularmente diminuindo o valor comercial dos frutos,

a pinta-preta constitui um dos mais sérios problemas da cultura (Chiacchio, 1985;

Nishijima et al., 1994; Oliveira & Santos, 2000). Assim, há necessidade de

estudos que visem à adoção de estratégias alternativas para o controle desta

doença.

No sistema de cultivo atual, a pulverização de fungicidas convencionais é

necessária para se garantir a produção do mamoeiro, com reflexos negativos para

a saúde humana, o ambiente e a comercialização. Todavia, o mamoeiro é uma

planta muito sensível a produtos químicos, especialmente fungicidas triazóis em

formulações oleosas, os mais utilizados no combate às doenças foliares causadas

por fungos na agricultura (Liberato, 1999). Somado a isso, o mercado

8

internacional, cada vez mais exigente, estabelece níveis de tolerância de resíduos

de agrotóxico mínimos, com base em métodos analíticos modernos, de alta

capacidade de detecção, similares àqueles utilizados nos exames “antidoping” do

esporte. A recusa de cargas de frutas por presença de resíduos de agrotóxicos é

altamente prejudicial à comercialização, não somente pela perda econômica, mas

principalmente pelo marketing negativo à exportação de frutas tropicais

brasileiras.

Devido aos problemas acarretados pelos agrotóxicos no mamoeiro, há

necessidade da adoção de estratégias alternativas para o controle da pinta-preta

que tenham por finalidade oferecer alternativas para diminuir a dependência dos

agrotóxicos e contribuir para as práticas de agricultura que sejam mais adequadas

às novas exigências de qualidade.

Pesquisas recentes apontam para um cenário de controle alternativo aos

fungicidas por meio de aplicação de indutores de resistência e, ou ativadores de

plantas (Dantas et al 2004, Nascimento et al 2008). Outro produto muito utilizado

na agricultura orgânica é a calda bordalesa, um fungicida protetor à base de cobre

(Paulus et al., 2000), entretanto, tal produto possui certo grau de toxicidade, tanto

para a planta quanto para o ambiente, uma vez que, em excesso, tende acumular

no solo desequilibrando o ambiente através da lixiviação.

O melhoramento genético pela seleção de genótipos resistentes constitui

outra medida alternativa. Esta metodologia baseia-se em uma medida sustentável

de controle da pinta-preta, sendo uma tecnologia de fácil adoção por parte dos

agricultores e sem impactos ao meio ambiente e à saúde humana. Mas, não há

relatos de cultivares que sejam imunes/resistentes a esta doença (Santos &

Barreto, 2003; Dianese et al., 2007; Vivas, 2009, 2012, Vivas et al. 2012).

Outra medida de controle alternativa aos fungicidas é o controle biológico.

No entanto, no que tange ao controle da pinta-preta do mamoeiro, não existem

praticamente pesquisas completas.

9

2.4. Controle biológico

O controle biológico de pragas pode ser definido como a regulação natural

do número de indivíduo de uma população de uma espécie-praga através da ação

de outra população, esta ação pode ser algum mecanismo de antagonismo como;

antibiose, competição, parasitismo, hipovirulência, predação e indução de defesa

do hospedeiro. Tais indivíduos são genericamente conhecidos como agentes de

controle biológico e agem de forma a reduzir a soma de inóculo ou das atividades

determinantes da doença (crescimento, infectividade, virulência, agressividade e

outras qualidades do patógeno ou processos que determinam infecção,

desenvolvimento de sintomas e reprodução) provocada por um patógeno,

realizada por um ou mais organismos que não o homem (Cook & Baker, 1983;

Bettiol, 1991).

Inicialmente o controle biológico foi aplicado para controlar insetos, ácaros,

e ervas daninhas. Com o passar do tempo, seu emprego se tornou mais amplo e

outros invertebrados, patógenos de plantas e mesmo alguns vertebrados

passaram a ser considerados alvos (Parra et al., 2002). Em 1932, o fungo

Trichoderma lignorum (Tode) Harz [Trichoderma viride (Pers)] foi observado

parasitando fungos fitopatogênicos. Este foi o primeiro relato do uso de fungo

como agente de biocontrole de fungos patogênicos, induzindo o início das

pesquisas do uso de micoparasitas para esta finalidade (Adams, 1990).

No Brasil, embora o uso do controle biológico não seja uma prática

generalizada entre os agricultores, há avanços significativos para algumas

culturas. Um exemplo de sucesso consiste no uso de espécies de Trichoderma

Pers., no controle de Fusarium Link, Pythium Nees, Rhizoctonia D.,

Macrophomina Petr, Sclerotinia Fuckel, Sclerotium Tode., Botrytis P. Micheli e

Moniliophthora H.C. Evans, Stalpers, Samson & Benny, nas culturas do feijão, da

soja, do algodão, do fumo, do morango, do tomate, da cebola, do alho, das

plantas ornamentais e do cacau (Bettiol & Morandi, 2009).

Dado à sua ampla gama de hospedeiro, o gênero Trichoderma foi testado

através de pareamento de cultura, produção de metabólitos fixos e produção de

metabólitos voláteis por Almeida (2009), em culturas de Colletotrichum spp.

Cercospora musae e A. caricae, a fim de viabilizar o seu controle biológico. Em

ensaios conduzidos em laboratório, verificou-se que os isolados de T. viride

10

mostraram ampla potencialidade para antagonizar os fungos fitopatógenos

testados. Porém, os resultados obtidos para o fungo A. caricae são questionáveis,

uma vez que o tempo de condução do experimento (7 a 15 dias em BDA), não é

suficientes para o crescimento do fungo A. caricae o que inviabiliza a competição

entre o antagonista e o patógeno. Segundo Oliveira (2005), o fungo A. caricae é

cultivado com dificuldade em meio de cultura artificial no laboratório e, nesta

condição, possui crescimento muito lento com o diâmetro das colônias em dois

meses atingindo apenas 2 mm. À exceção de Almeida (2009), para a cultura do

mamoeiro não há estudos de biocontrole de doenças, o que existem são relatos

de fungo supostamente hiperparasitando lesões de A. caricae: Rhinotrichum

glossypinum (Speg.) Speg (Charles, 1940), Sclerospora J. Schrat. e Verticillium

Nees. (Adikaram & Wijepala, 1995); Cephalosporium Corda (Silva et al., 1999);

Dicyma Boulanger e Acremonium Link. (Vivas et al., 2011).

Dos fungos referidos acima, R. gossypinum foi apenas mencionado como

parasita Charles (1940), em sua revisão o autor não apresenta detalhes da

descrição do fungo encontrado. Quanto aos gêneros Sclerospora e Verticillium

Adikaram & Wijepala (1995) relataram pela primeira vez a ocorrência de pinta-

preta em mamoeiro no Sri Lanka, onde encontraram dois fungos crescendo nas

lesões com A. caricae, os identificando morfologicamente. Segundo os autores, o

papel destes dois fungos não ficou esclarecido, mas sugere alguma forma de

hiperparasitismo.

Lesões de pinta-preta do mamoeiro colonizadas por Cephalosporium sp

foram relatadas em um plantio experimental no município de Seropédica (RJ) por

Silva et al. (1999). Os autores observaram entrelaçamento de hifas do agente

causal da pinta-preta. Também foi feita pulverização de conídios do hiperparasita

sobre lesões de pinta-preta em plantas de mamoeiro e os resultados apontaram

que 60 a 70% das lesões foram colonizadas pelo fungo, aos 15 e 30 dias após a

inoculação. Os resultados observados pelos autores apontam que,

aparentemente, o fungo A. caricae estava sendo controlado, visto que nas lesões

colonizadas não se observou esporulação do patógeno. Entretanto, este trabalho

restringiu-se apenas ao resumo, não tendo continuidade dos trabalhos e tão

pouco maiores detalhes da metodologia utilizada.

Recentemente, Vivas et al. (2011) observaram a ocorrência de folhas de

mamoeiro com lesões de pinta-preta com sinais do fungo hiperparasita (lesões

11

esbranquiçadas). Os autores analisaram as estruturas reprodutivas dos fungos, e

indicaram a presença dos gêneros Dicyma e Acremonium. Espécies dos gêneros

mencionados acima, já estão sendo utilizadas na tentativa de se controlar

doenças em outros patossistemas. Sudo (1989) demonstrou a viabilidade de se

controlar biologicamente doenças da parte aérea em coqueiro, como as lixas-

pequena e grande (Camarotella acrocomiae (Mont.) K.D. Hyde & P.F. Cannon

(syn. = Phyllachora torrendiella (Bat.) Subileau, Renard & Dennet; Sphaerodothis

acrocomiae (Mont.) Arx & E. Müll )) com Acremonium alternatum Link e

Acremonium persicinum (Nicot) N. Gams. Esses antagonistas foram multiplicados

e pulverizados nos talhões de coqueiro afetados pela lixa, cujas plantas estavam

no início da frutificação, época mais prejudicial da doença, e quando o

Acremonium não estava presente. De modo geral obteve-se uma eficiência

superior a 65% com apenas uma aplicação anual dos antagonistas. Os

hiperparasitas foram isolados diretamente dos estromas dos patógenos, sendo,

portanto, um exemplo da viabilidade do método de controle biológico.

Warwick (2001), na tentativa de viabilizar o biocontrole da lixa do coqueiro

através de diferentes formas de aplicação de A. persicinum, concluiu que a

melhor época de aplicação foi nos meses chuvosos, no período da tarde, onde

houve colonização efetiva dos estromas pelo hiperparasita. Warwick (2007),

avaliando os índices de parasitismo de lixa-grande e pequena do coqueiro pelos

fungos hiperparasitas: Acremonium cavaraeanum (Jasevali) W. Gams e

Hansfordia pulvinata (Berk & M.A. Curtis) S.Hugles (Syn. Dicyma pulvinata (Berk

& M.A. Curtis) Arx) observou em laboratório que A. cavaraeanum colonizou todas

as cavidades estromáticas dos fitopatógenos. Por outro lado, o fungo D. pulvinata

não parasitou as partes internas dos estromas, crescendo apenas na superfície

externa do mesmo. O autor relatou em condição de campo um controle parcial

das doenças avaliadas.

Além do gênero Acremonium, espécies pertencentes ao gênero Dicyma

(=Hansfordia) também são relatadas com potencial para o biocontrole. Tal

espécie foi relatada pela primeira vez como um hiperparasita em Isariopsis indica

K.R.G.Nair e em espécies de Cercospora Fresen, na Ìndia (Rathaiah & Pavgi,

1971; Krishna & Singh, 1979). Nos Estados Unidos e na França, D. pulvinata tem

sido alvo de pesquisas para controle da mancha-preta (Mycosphaerella berkeleyi

W.A. Jenkins (syn. Cercosporidium personatum Berk. & M. A. Curtis) Deighton) do

12

amendoim (Arachis hipogea L.) e da cladosporiose – (Passalora fulva (Cooke)

U.Braun & Crous (Syn. Cladosporium fulvum Cooke) do tomateiro (Lycopersicon

esculentum Mill.) (Peresse & Le Picard, 1980; Tirilly et al., 1983; Mitchell et al.,

1987). Tirilly et al. (1983) isolaram um metabólico antifúngico (13-

desoxyphomenome) a partir de culturas líquidas de D. pulvinata obtida a partir de

lesões de C. fulvum em tomate. Watanabe et al. (2003), relataram esse fungo no

Japão, colonizando corpos de frutificações de Aphyllophorales (Basidiomata).

Alderman et al. (2010) relataram D. pulvinata parasitando estroma de Epichloe

typhina (Pers.) Tul. & C. Tul em orchardgrass (Dactylis glomerata L), nos Estados

Unidos. Neste último caso para a avaliação da eficácia de D. pulvinata como

agente de controle biológico de E. typhina, foram conduzidos ensaios em

condições de estufa e de campo. Em ambos os ensaios os efeitos foram

significativos, D. pulvinata reduziu o desenvolvimento de peritécios de E. typhina .

No entanto, em condições de campo os melhores resultados surgiram quando o

inóculo foi aplicado no momento em que os estromas de E. typhina começaram a

surgir, durante a tarde, entre meados de abril e início de maio, quando as

condições de umidade são altas.

Outro exemplo no Brasil é o biocontrole do mal das folhas da seringueira

[(Microcyclus ulei (Henn.) Arx] pela aplicação do hiperparasita D. pulvinata. Este

fungo tem sido apontado como promissor, pois coloniza e destrói as lesões

estromáticas do patógeno e, consequentemente, reduz o desfolhamento das

plantas e a taxa de inóculo em reinfecções (Junqueira & Gasparotto, 1991). No

Brasil, além das avaliações realizadas por Junqueira & Gasparotto (1991),

Rodrigues (2002) conduziu experimentos relativos ao cultivo do fungo em

laboratório, enquanto na Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia são

estudados aspectos fisiológicos, morfológicos, moleculares e de patogenicidade,

no intuito de selecionar isolados de D. pulvinata com potencial para o

desenvolvimento de biofungicida (Tavares et al., 2004). Delmadi et al. (2009)

concluíram que em campo, as aplicações com as diferentes concentrações de

fungo, tiveram um efeito de controle semelhante à aplicação de fungicida à base

de benomyl.

Portanto, há possibilidade de se utilizar esta técnica na cultura do

mamoeiro, uma vez que já existem trabalhos relatando a ocorrência de fungos

supostamente parasitando lesões de A. caricae (Charles, 1940; Adikaram &

13

Wijepala, 1995; Silva et al., 1999; Vivas et al., 2011). Entretanto, não há trabalho

que comprove o parasitismo, tampouco que avalie o potencial de biocontrole de

A. caricae por hiperparasitas. Ademais, acredita-se que a classificação de alguns

destes fungos possa ser controversa, o que carece de estudos taxonômicos

aprofundados.

14

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1. Obtenção de isolados e cultura monospórica

Para coleta e isolamento de fungos potenciais hiperparasitas, folhas de

mamoeiro com lesões de pinta-preta e com sinais do patógeno colonizadas por

hiperparasitas foram coletadas em diferentes localidades. Concomitantemente,

coletaram-se folhas de quiabeiro e jiloeiro que apresentavam sinais de

hiperparasitismo semelhantes aos observados na pinta-preta do mamoeiro, bem

como folhas de cafeeiro e Jasmim-manga com ferrugem hiperparasitada, para fins

de comparação (Tabela 1).

Os materiais coletados foram conduzidos ao laboratório para o preparo de

lâminas das estruturas reprodutivas e pré-identificação dos gêneros fúngicos

presentes, por Microscopia Ótica (MO). Constatada a presença de fungos

hiperparasitas, procedeu-se ao isolamento direto, pela transferência de

propágulos para meio batata-dextrose-ágar (BDA), em placas de Petri, seguindo-

se a incubação a 25±ºC, sob regime de 12 h de fotoperíodo.

15

Tabela 1. Relação dos isolados de fungos potenciais hiperparasitas, local, data da

coleta e substrato (patógeno) de origem.

Código Planta

hospedeira Patógeno Local da coleta

Data da

coleta

A-598

Carica papaya L. Asperisporium caricae Alegre – ES 04/06/2012

S-599

Plumeria rubra L. Coleosporium plumeriae Campos dos Goytacazes - RJ

19/06/2012

H-600

C. papaya A. caricae Alegre – ES 27/06/2012

A-601

C. papaya A. caricae Alegre – ES 23/05/2012

A-602

C. papaya. A. caricae Mimoso do Sul – ES

02/07/2012

A-603

C. papaya A. caricae Linhares - ES 29/12/2012

A-604

C. papaya A. caricae Mimoso do Sul – ES

18/11/2012

H-605

C. papaya A. caricae Pesqueiro - SP 29/12/2012

H-608

C. papaya A. caricae Mimoso do Sul – ES

04/06/2012

A-609

C. papaya A. caricae Campos dos Goytacazes - RJ

12/06/2012

H-610

Solanum gilo Raddi

Cladosporium sp. Mimoso do Sul – ES

12/06/2012

H-611

C. papaya. A. caricae Colatina - ES 26/09/2012

H-612

C. papaya A. caricae Alegre – ES 29/06/2012

H-613

C. papaya A. caricae Campos dos Goytacazes - RJ

23/05/2012

H-614

C. papaya A. caricae Mimoso do Sul – ES

02/07/2012

H-615

C. papaya A. caricae Cachoeiras de Macacu – RJ

18/11/2012

A-616

C. papaya A. caricae Alegre – ES 27/06/2012

A-617

C. papaya A. caricae Cachoeiras de Macacu – RJ

21/11/2012

A-618

C. papaya A. caricae Mimoso do Sul – ES

29/06/2012

A-619

C. papaya. A. caricae Mimoso do Sul – ES

26/09/2012

L-620

Coffea arabica L. Hemileia vastatrix Mimoso do Sul – ES

30/06/2012

A-621

Abelmoschus esculentus L.

Pseudocercospora abelmoschi

Campos dos Goytacazes - RJ

12/06/2012

L-622

C arabica H. vastatrix Alegre – ES 03/07/2012

H-623

A esculentus P. abelmoschi Campos dos Goytacazes - RJ

12/06/2012

Código dos isolados representado pela letra inicial A=Acremonium, H=Hansfordia, S=Simplicillium e L= lecanlicillium

16

As culturas puras obtidas foram submetidas a isolamentos monospóricos

com o intuito de se garantir a pureza genética para fins de identificação. Neste

procedimento esporos diluídos em gota de água estéril foram espalhados em

meio de ágar 2%, sob lâmina, com alça de Drigalsky, seguindo-se de incubação

em câmara úmida, a 25ºC, fotoperíodo de 12 h. Sob microscópio óptico, esporos

recém-germinados foram transferidos para meio BDA em placas de Petri. As

culturas foram mantidas em tubos com BDA a 10ºC (Dhingra & Sinclair, 1995),

bem como utilizaram outros métodos de conservação em água (Castellani, 1939)

e óleo mineral (Sherf, 1943).

3.2. Caracterização cultural, morfológica e identificação dos isolados

Observaram-se dois gêneros fúngicos em A. caricae: Hansfordia e

Acremonium. Para caracterização de fungos do gênero Acremonium o meio

padrão utilizado foi o meio de malte (MEA) e o meio de BDA para avaliação do

crescimento micelial após 10 d de incubação. Para os isolados de Hansfordia

utilizou-se apenas BDA.

Das culturas dos isolados com 10 d de incubação em BDA a 25ºC,

fotoperíodo de 12 h, foram observados: o aspecto visual da colônia, a coloração

de frente e verso da colônia, o aspecto do micélio e a forma da margem das

colônias.

Para a visualização das estruturas fúngicas, efetuaram-se microculturas em

meio de BDA sobre lâmina de microscopia. Sobre a cultura colocou-se lamínula e

incubou-se em câmara úmida. Após 48 h o fungo se desenvolveu na parte inferior

da lamínula, as quais foram analisadas diretamente sob o microscópio ótico.

A partir de preparações em lâminas em ácido lático, com corante azul-de-

algodão, foram efetuadas 30 medições micrométricas das estruturas reprodutivas

(corpos de frutificação, conidióforos, conídios e demais estruturas), sob aumentos

variados de 100 a 1000X, ao microscópio Nikon E-400, munido de ocular

micrométrica e câmera integrada a microcomputador. Para identificação em nível

de gênero, recorreram-se às referências da área de Micologia e Taxonomia de

fungos (Ellis, 1971; Barnett & Hunter, 1972; Carmichael et al., 1980; Ellis, 1980;

17

Sutton, 1980; Ainsworth et al., 1973; Dennis, 1978; Hawksworth et. al., 1995;

Seifert et al., 2011).

O isolado de ferrugem do jasmim manga, S-599, e os isolados de ferrugem

do cafeeiro, L-620 e L-622, não foram caracterizados em cultura e identificados

em nível de espécie, por não serem encontrados infectando naturalmente

pústulas de pinta-preta em mamoeiro, fugindo ao escopo deste trabalho. Mas,

foram incluídos nos testes de antibiose e hiperparasitismo, para se avaliar a

especificidade ao hospedeiro dos fungos hiperparasitas.

3.3. Crescimento micelial dos hiperparasitas e avaliação da esporulação em

diferentes temperaturas

Foi retirado com o auxílio de um furador discos de 7 mm da borda da

colônia de culturas puras dos isolados em BDA, com 5 d de incubação,

fotoperíodo de 12 h. Os discos foram depositados no centro de placas de Petri

contendo meio de BDA e em seguida, incubados em B.O.D. sob regime de luz de

12 h de fotoperíodo, a diferentes temperaturas (15, 20, 23, 25, 27 e 30 ºC). O

ensaio foi instalado em blocos casualizados com quatro repetições (placas) para

cada isolado.

Avaliou-se após 10 d de incubação o crescimento radial das colônias,

medindo-se o diâmetro médio das colônias em dois sentidos ortogonais. Avaliou-

se também a produção de conídios em discos de 7 mm de diâmetros nas

diferentes temperaturas. Para tal, com o auxílio de um furador, disco de 7 mm de

diâmetro foram retirados da região mediana das colônias e mergulhados em 1ml

de água com uma gota solução Tween a 20%. Após agitação por 1 min em

agitador de tubos, retirou-se com pipeta a suspensão e procedeu-se a contagem

em câmara de Neubauer.

Os dados de crescimento micelial e esporulação nas diferentes temperaturas

foram submetidos à análise de variância, com delineamento em blocos

casualizados, sob arranjo fatorial (6 temperaturas x 10 isolados). As variáveis

significativas pelo teste F da análise de variância foram submetidas à análise de

regressão linear. Para determinar a temperatura ótima ou o ponto de máximo

18

crescimento micelal e esporulação, foi realizada a derivada de primeira ordem da

equação de segundo grau ajustada por regressão (método dos quadrados

mínimos).

3.4. Antibiose in vitro: Avaliação de compostos voláteis e não voláteis que

possam inibir a germinação de esporos de A. caricae

Devido à dificuldade de se cultivar A. caricae em meio de cultura, por este

patógeno apresentar crescimento micelial muito lento (Oliveira, 2005), os testes in

vitro foram realizados avaliando-se a germinação do conídio de A. caricae.

Para avaliar a ação de componentes voláteis, sobre a cultura de cada

hiperparasita com 10 d de crescimento em meio de BDA, à temperatura de 25 ºC

e fotoperíodo de 12 h, foi colocado um suporte (fragmentos de ágar), acima deste

foram postas lâminas de vidro contendo disco de ágar de 7 mm, sendo

posteriormente adicionada uma suspensão de 104 conídios.ml-1 de A. caricae

sobre os discos. A placa de Petri de cada hiperparasita foi vedada

hermeticamente com parafilme e conduzida até a B.O.D. onde permaneceu até o

momento da avaliação.

Para o estudo da antibiose por compostos não-voláteis, os isolados foram

cultivados sobre papel celofane esterilizado sobreposto ao meio de BDA em placa

de Petri. Após10 d de crescimento, à temperatura de 25 0C e fotoperíodo de 12 h,

o papel celofane foi retirado da superfície do meio e descartado juntamente com a

cultura do antagonista. Disco de 7 mm do meio de BDA, retirado da cultura, na

qual cresceu o hiperparasita foi depositado sobre uma lâmina de microscopia,

sendo posteriormente adicionada uma suspensão de 104 conídios.ml-1 de A.

caricae. As lâminas foram colocadas em placa de Petri e vedadas com parafilme

e incubadas em B.O.D., onde permaneceram até avaliação.

Os ensaios descritos acima foram repetidos uma vez. Tanto para o teste de

componente volátil quanto para o não volátil foi utilizado o delineamento em

blocos casualizados, com 26 tratamentos (24 isolados + 1 controle +1 controle

negativo) e 4 repetições. Como controle, utilizou-se placas sem crescimento de

fungo. Como controle negativo, utilizou-se pré-cultivo do fungo Cladosporium sp,

19

que é considerado um fungo de crescimento rápido, com a finalidade de saber se

há efeito de componente volátil ou se houve efeito de acúmulo de gás carbônico,

procedente da respiração micelial, impedindo a germinação de A.caricae.

Após 24 h de incubação, à temperatura de 25 ºC e fotoperíodo de 12 h, sob

microscópio ótico no aumento de 20x, foram contados em três campos de

visualização, os conídios germinados e não germinados. Estes foram comparados

com a testemunha (meio de BDA sem cultura prévia do antagonista) e com

testemunha negativa. Os dados de germinação dos conídios de A. caricae na

presença de componentes voláteis e não-volátil foram submetidos a análises de

variância, com arranjo em fatorial. Quando constatado efeito significativo foram

conduzidos teste de comparações de média (Scott-knott a 0,05 de probabilidade)

utilizando-se o programa Genes (Cruz, 2013).

3.5. Microscopia ótica da interação entre A. caricae e isolados hiperparasitas

A fim de se verificar o parasitismo direto e a interação entre os fungos

(hiperparasitas x A.caricae) foi realizado um ensaio de co-cultivo em microcultura

(meio de ágar-água em lâminas de microscopia). Após a solidificação do meio,

suspensões de 104 conídios.ml-1 do hiperparasita e de A. caricae foram

depositadas sobre meio de Ágar água em lâminas, seguindo-se a incubação em

câmara úmida, em placas de Petri, à temperatura de 25 ºC, durante 24, 48 e 72 h,

sob fotoperíodo de 12 h.

Analisou-se ao microscópio a ocorrência de crescimento direcionado e

associado das hifas, a penetração do tubo germinativo pelas hifas dos

hiperparasitas, bem como as alterações nos padrões de crescimento do

patógeno, na presença e ausência dos prováveis isolados hiperparasitas.

3.6. Hiperparasitismo in vivo sob condições de telado

Os fungos hiperparasitas foram inoculados em folhas de mudas de

mamoeiro apresentando sintomas de pinta-preta e sinais de A. caricae, sob

condições de telado. Para isso, mudas de mamoeiro cv. Golden, suscetíveis à

20

pinta-preta (Vivas et al., 2012), com seis meses após transplantio foram

pulverizadas adaxialmente com suspensão de 105 conídios.ml-1 dos fungos

hiperparasitas.

Instalaram-se dois experimentos, o primeiro em julho e o segundo em

novembro de 2013, delineados em blocos casualizados, com 25 tratamentos (24

hiperparasitas e testemunha – aspersão com água) e três repetições. A parcela

experimental constituiu-se de uma planta por vaso, previamente inoculada com o

patógeno, pela atomização adaxial de folhas com 105 esporos por mL, seguindo-

se de incubação em viveiro telado com irrigação por aspersão (mist) intermitente

diurna.

Para avaliações, considerou-se apenas 10 cm da extremidade apical

(nervura central) de cada quinta folha do ápice para a base. Foram avaliados: (i) o

tempo médio em dias para aparecerem à colonização das estruturas de A. caricae

pelos hiperparasitas (lesões hiperparasitadas e recobertas por esporulação

branca, sinais dos fungos aplicados); (ii) a incidência (%) de lesões brancas,

hiperparasitadas, avaliadas aos 15 dias após inoculação. Os dados foram

submetidos à análise de variância, com arranjo em fatorial. Quando constatado

efeito significativo, conduziram-se teste de comparação de médias visando

selecionar os isolados mais promissores quanto à capacidade de colonizar lesões

de pinta-preta. Todas as análises foram realizadas utilizando o programa Genes

(Cruz, 2013).

21

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1. Caracterização cultural, morfológica e identificação dos isolados

Os isolados estudados no presente trabalho foram classificados e

encontram-se descritos em três grupos, conforme gêneros identificados e tipos de

patossistemas. Os isolados obtidos de mamoeiro e quiabeiro, foram classificados

em dois gêneros hifomicetos, segundo características morfológicas dos

conidióforos e conídios, a saber Hansfordia e Acremonium. Os isolados de jiloeiro,

foram identificados no gênero Hansfordia. Os isolados obtidos de ferrugens, nas

plantas de Jasmim-Manga e Cafeeiro, foram classificados em dois gêneros, já

conhecidos hiperparasitas em ferrugens: Lecanicillium e Simplicilium.

Isolados de H. pulvinata

O primeiro grupo, formado pelos isolados H-610, H-623, H-600, H-614, H-

612, H-613, H-608, H-611, H-615 e H-605, apresentou crescimento lento em meio

de BDA, atingindo em média 14 mm de diâmetro em 10 dias. Em média os

isolados produziram colônias efusas, de aspecto aveludado e coloração que

variou de cinza-claro a cinza-escuro, tornando-se mais escuras com o passar do

tempo (Figura 1D). Além disso, os isolados apresentam micélio superficial,

septado e ramificado. Conidióforos lisos, mais escuros na base, eretos,

22

ramificados no terço superior, terminados em células conidiogênicas com

ramificações verticiladas, poliblásticas e denticuladas no ápice (Figura 1E e F).

Conídios globosos, lisos, solitários, subialinos, unicelulares e com cicatriz basal

(Figura 1C).

Figura 1 Fungo Hansfordia pulvinata, hiperparasita de A. caricae. (A) sinais de

hiperparasitismo sobre lesões de pinta-preta em folhas de mamoeiro; (B) lesão

hiperparasitada em lupa; (C) Estrutura reprodutiva em microcultura; (D) colônia do

fungo em meio de BDA; (E) conidióforo, (F) dentículo da célula conidiogênica e

(G) conídios do fungo.

23

Os dados morfométricos obtidos para os isolados permitiram enquadrá-los

como sendo H. pulvinata (Berk & M.A. Curtis) S.Hugles (syn. Dicyma pulvinata

(Berk & M.A. Curtis) Arx), e como confirmado por outros autores (Watanabe et

al.,2003; Tavares et al., 2004; Alderman et al., 2010; Park et al., 2010) (Tabela

02). Segundo Deigthon (1972), a variação de tamanho do conídio pode ser

atribuída a variações comumente observadas na espécie, em função da origem

dos isolados e das condições de cultivo.

O fungo Dicyma pulvinata é considerado por muitos autores como

sinônimo de Hansfordia pulvinata. Contudo, alguns autores consideram estas

duas espécies distintas. De acordo com as diferenças apontadas entre estes dois

fungos por Seifert, et al (2011), os isolados obtidos neste estudo pertencem a H.

pulvinata. A espécie hiperparasita, mitospórica, H. pulvinata é considerada

cosmopolita e saprofítica, sendo relatada sobre muitos fungos dematiáceos

principalmente cercosporioides, tais como Cercospora (Hawksworth, 1981), mas

também Passalora fulva em tomate (Lycopersicon esculentum Mill.) (Peresse &

Le Picard, 1980), e P. personata sobre folha de amendoim (Arachis hipogea L.)

(Mitchell et al., 1986, 1987).

Este hiperparasita já foi relatado sobre Microcyclus ulei em diferentes áreas

de cultivo de seringueira do Brasil, tais como Acre, Amazonas, Bahia, Mato

Grosso, Pará e Rondônia (Mello et al , 2003) e em São Paulo (Furtado & Sridhar,

2004). O fungo também já foi encontrado sobre lixa do coqueiro (Phyllachora

torrendiella) no Sergipe (Warwick, 2007). No entanto, é a primeira vez que esta

espécie é isolada em diferentes regiões dos estados do Rio de Janeiro e Espírito

Santo hiperparasitando pinta-preta no mamoeiro, e nos demais patossistemas

estudados, tais como Cladosporium sp. no jiloeiro e Pseudocercospora

abelmoschi em quiabeiro.

24

Tabela 2. Medidas morfométricas das estruturas reprodutivas de isolados de

Hansfordia pulvinata obtidas de diferentes regiões e patossitemas e medidas

típicas fornecidas por diferentes autores.

Isolado Conidióforo

N=30

Célula Conidiogênica

N=30

Conídio

N=30

Comp.

(µm)

Larg.Base

(µm)

Comp

(µm).

Larg.

(µm)

Diâm.

(µm)

H-610 88,5-324,5 2,0-4,5 9,0-15,0 1,0-3,0 2,5-5,5

H-623 75,5-289,0 3,0-4,5 8,5-16,5 1,5-2,0 3,0-5,0

H-600 102,0-282,0 2,0-4,0 9,5-16,5 1,0-2,5 3,0-5,0

H-614 115,0-236,0 2,0-3,5 9,0-13,0 1,5-2,0 3,0-5,0

H-612 104,0-352,5 2,0-4,0 7,5-16,5 1,5-3,5 3,5-5,5

H-613 112,0-288,0 2,5-4,0 8,0-18,5 1,0-2,5 3,0-5,0

H-608 96,0-261,0 2,0-4,0 8,5-17,1 1,0-2,5 3,0-5,0

H-611 144,5-276,0 2,5-4,5 6,0-14,5 1,5-3,0 3,5-5,5

H-615 110,5-339,0 3,0-5,0 9,5-14,5 1,5-3,0 3,0-5,5

H-605 85,5-351,0 3,0-4,0 7,5-17,0 2,0-3,5 3,5-5,0

W1 200 1,2-3,0 8,0-18,0 1,6-2,0 2,8-6,0

A2 -------- 3-5 ----- ----- 5-7

P3 500 2-4 7-15 2-3.5 4-6

W1, A2 e P3 corresponde, respectivamente às descrições de Watanabe et al.

(2003), Alderman, (2009) e Park et al. (2010).

25

Isolados de Acremonium spp.

Os isolados A-598, A-609, A-604, A-601, A-619, A-618, A-616, A-603, A-

602, A-621 e A-617 foram classificados em Acremonium. Para estes isolados

observou-se maior variação nas características culturais e morfológicas (Tabela 3

e Figuras 2, 3 e 4). Considerando que houve grande variabilidade entre a

morfologia dos isolados, estes serão descritos em grupos separados. Como

características comuns a todos, incluem-se: colônias efusas e com a idade

liberando exsudatos; micélio superficial, hifas septadas, ramificadas,

plectonematogênicas; esporulação abundante. Células conidiogênicas em

monofiálide, lateral ou terminal, ereta, simples, acicular, hialina e lisa; conídios

unicelulares (ameroconidia), hialinos, produzidos em cadeia no vértice de cada

monofiálide (Figura 2).

O gênero Acremonium aparentemente é uma das espécies que incluem

algumas das estruturas mais simples de hifomicetos. Em meio de cultura seu

crescimento geralmente é lento. Possui conídios geralmente pequenos, hialinos

ou pouco pigmentados, de parede fina e lisa, forma esférica ou cilíndrica,

unicelulares e agregadas em falsas cabeças viscosas ou formando cadeias. Com

certa frequência um mesmo isolado pode apresentar falsas cabeças e cadeias

conidiais em cultura. Algumas espécies formam clamidósporos e outras não

produzem clamidósporos (Gams 1971, 1975; Domsch et al., 2007; Perdomo et al

2011).

Cerca de 100 espécies já foram descritas no gênero Acremonium, e

segundo Kirk et al.(2001) estão geograficamente difundidas e registradas em todo

o mundo, em vários substratos. Estudos moleculares têm demonstrado que

Acremonium é polifilético, com espécies pertencendo a diferentes ordens de

Sordariomycetes. Muitas espécies, incluindo a espécie tipo A. alternatum Link: Fr

pertencem à Hypocreales. Outras pertencem à Sordariales e um pequeno grupo à

Família Plectosphaerellaceae, em Glomerellales (Glenn et al., 1996; Zare et al.,

2007; Perdomo et al., 2011; Summerbell et al., 2011).

26

Tabela 3. Medidas morfométricas das estruturas reprodutivas de isolados de

Acremonium spp obtidas de diferentes regiões e patossitemas.

Isolado Fiálide

N=30

Conídio

N=30

Clamidósporo

N=30

Comp.

(µm)

L. base

(µm)

Comp.

(µm)

Larg.

(µm)

Comp.

(µm)

Larg.

(µm)

A-601 16,0-32,0 1,5-2,5 3,0-4,0 1,5-2,0 4,0-9,0 3,0-7,5

A-598 18,0-40,0 1,5-3,0 2,5-4,0 1,5-2,0 3,0-9,0 2,5-6,5

A-621 14,0-48,0 2,0-3,0 3,0-5,0 1,5-2,0 NO* NO

A-602 15,0-25,0 1,5-2,0 2,0-4,0 1,5-2,5 4,5-10,0 4,0-9,0

A-617 19,0-35,5 1,0-2,5 2,5-4,0 1,5-2,0 3,0-6,5 2,5-5,5

A-616 17,0-42,0 1,5-2,0 2,5-4,5 1,5-2,0 3,0-7,5 2,5-7,0

A-604 15,5-34,0 1,5-2,5 3,0-5,0 1,5-2,0 3,0-6,0 2,5-4,0

A-603 17,0-31,0 1,5-2,5 2,5-4,0 1,5-2,0 4,0-7,0 3,0-6,5

A-619 19,5-34,0 2,0-2,5 3,0-5,0 1,5-2,0 3,5-10,5 3,0-9,0

A-618 17,0-38,0 2,0-2,5 3,0-5,0 1,5-2,0 3,0-8,5 2,5–6,0

A-609 18,0-30,0 1,5-2,5 3,0-5,0 1,0-2,0 NO NO

*NO = Não observado

27

Figura 02. Fungo Acremonium spp, hiperparasita de A. caricae. (A) sinais do

hiperparasita sobre lesões de pinta-preta em folhas de mamoeiro; (B) lesão

hiperparasitada em lupa; (C) Estrutura reprodutiva em microcultura; (D) Conídios

produzidos em cadeia; (E) micélio plectonematogênico.

28

Considerando as médias de crescimento micelial, observa-se que os

isolados A-609 e A-621 possuem o crescimento mais rápido, crescendo em média

29 e 31 mm em meio BDA, e 25 e 28 mm em MEA, após 10 dias à temperatura

de 25 ºC (Figura 03 A e B). Estes apresentam micélio aéreo, coloração da colônia

de verso laranja e reverso laranja mais intenso em ambos os meios, conídios

cilíndricos e ausência de clamidósporo (Figura 3 C e D, Tabela 3).

Figura 03. Isolado do fungo Acremonium sp A-609 hiperparasita de A. caricae. (A)

Característica da Frente e (B) do verso de colônia em meio de BDA; (C)

conidióforo; (D) conídios.

29

Os isolados A-601, A-602 e A-603 formaram um subgrupo à parte, com

diferenças na coloração da colônia, o isolado A-601 apresenta coloração cinza-

clara, o A-602 cinza-escuro e o A-603 bege na frente e no verso das colônias.

(figura A – F) Este subgrupo, a uma temperatura de 250C e após 10 d, em meio

BDA crescem de 11 a 18 mm e em meio de MEA cresceram de 6 a 8 mm. Estes

apresentam aspecto da colônia rugoso, micélio com crescimento superficial, o

conídio com formato obovoide, produzem clamidósporo de formato irregular

(Tabela 3, Figura 4 G, H e I).

Por último o subgrupo formado pelos isolados A-598, A-604, A-616, A-617,

A-618 e A-619 cresceram de 10 a 17 mm em BDA e de 4 a 8 mm em MEA,

possuem coloração da colônia branca na frente e no verso de aspecto rugoso a

floculoso. (Figura 5 A e B). Conídios cilíndricos. Produzem clamidósporos de

formato irregular (Figura 5 C,D e E, Tabela 3).

30

Figura 04. Variação morfocultural de isolados de Acremonium sp hiperparasitas

de A. caricae (A) Frente e (B) verso da colônia do Isolado A-601, (C) frente e (D)

verso da colônia do Isolado A-602, (E)Frente e (F) verso da colônia do Isolado A-

603 em meio de BDA; (G) conídio; (H) conidióforo e (I) Clamidósporo isolado A-

603.

31

Figura 05. Isolados A-618 do fungo Acremonium sp, hiperparasita de A.caricae.

(A) Frente e (B) verso da colônia em meio de BDA; (C) conidióforo; (D ) conídio,

(E) clamidósporo

32

Observa-se uma grande diversidade entre os isolados de Acremonium

obtidos neste estudo, o que sugere a existência de mais de uma espécie

envolvida no hiperparasitismo de lesões de pinta-preta no mamoeiro. Delgado

(2011) realizou um levantamento sobre fungos relatados na Nicarágua, onde faz

referência a Gonzáles (1985), relatando a ocorrência do gênero Acremonium

como hiperparasita de pinta-preta no mamoeiro, porém nenhuma informação foi

referida em nível de espécie.

Aventa-se, neste trabalho, a possibilidade de ocorrência de diferentes

espécies relacionadas ao patossistema A. caricae x C. papaya. Todavia, a

identificação de isolados de Acremonium em nível de espécie é muito complicada

devido às poucas características para diferenciar as espécies e o tamanho

diminuto das estruturas fúngicas, neste sentido para uma correta identificação faz-

se necessário recorrer a análises filogenéticas, envolvendo o sequenciamento de

genes conservados tais como LSU, actina e RNA polimerase (Grafenhan et al.,

2011; Giraldo et al., 2012).

Os isolados A-609 e A-621(Figura 03), por não produzirem clamidósporo, e

pelas características culturais e morfológicas, aproximam-se de Acremonium

cavaraeanum (Jasevoli) W. Gams, espécie relatada hiperparasitando lixa-grande

do coqueiro, no Brasil (Warwick, 2001) A. cavaraeanum cresce de 32-33 mm em

meio MEA após 10 d. Suas colônias são de aspecto aveludado, coloração de

verso branco e reverso rosa-violácea; comprimento da fialide; conídios em longas

cadeias, hialinos ou pálidos castanho-amarelados, fusiformes a elipsoides,

ausência de clamidósporos. Ainda as características, dos isolados A-609 e A-

621sobrepõem a outra espécie distinta, Acremonium implicatum J.C. Gilman &

E.V. Abbott W. Gams.

Summerbel (2011) em seu trabalho sobre filogenia de Acremonium e afins,

relata que a espécie descrita como Acremonium implicatum, micoparasita de

Puccinia graminis, não apresentava cultura viável que permitisse sua

identificação. O autor relata ainda a possibilidade de A. implicatum ser Fusidium

terricola JH Mill., Giddens & A. A. Foster. A cultura de F. terricola apresenta

coloração que a princípio é branca, depois bege meio rosado; conidióforo simples,

estreitado em direção à ponta, hifas aéreas, ereto ou procumbentes, fialide 10-33

x 2-3 µm; conídios em cadeias flexuosas muito longas, fusiforme medindo 3-6 x 1-

33

1,5 µm com extremidades agudas, hialino. Não sendo relatada presença ou

ausência de clamidósporo.

Já os isolados A-601, A-602 e A-603 (Figura 04) apresentam

características semelhantes à espécie Acremonium sordidulum Gams, W. 1975.

Acremonium sordidulum micoparasita de Colletotrichum dematium, em meio de

cultura possui coloração branca, tornando-se cinza-esverdeada e aspecto flocoso;

conídio em longas cadeias, fusiforme com extremidade municiosamente truncar

ou periforme com uma extremidade superior ligeiramente arredondada e mais

apiculada na base com largura maior no terço superior, hialino ou levemente

pigmentado. No entanto, esta espécie não possui clamidósporo, o que a difere

dos isolados apresentados acima.

Os isolados A-598, A-604, A-616, A-617, A-618 e A-619 (Figura 05)

apresentam-se semelhantes à Acremonium acutatum Gams, W. Acremonium

acutatum foi encontrado hiperparasitando Cercospora atromarginalis em Solanum

nigrum. Suas colônias são de coloração branca para rosa pálido, aspecto flocoso,

granuloso no centro; conídios medindo em longas cadeias; possuem

clamidósporos. A. acutatum, porém, possui conídios mais ou menos simétricos,

diferentemente dos isolados A-598, A-604, A-616, A-617, A-618 e A-619, os quais

apresentam conídios simétricos.

Estas espécies citadas acima são apenas exemplos que apresentam

semelhanças com os isolados caracterizados neste estudo. Conforme já

comentado, a identificação dos isolados inclusos no presente estudo em nível de

espécies requer o uso de análise filogenética ampla, baseada em marcadores

moleculares, havendo, inclusive a possibilidade de alguns dos grupos de isolados

caracterizados no presente estudo, pertencerem à nova espécie.

Isolados hiperparasitas de Ferrugens

O isolado S-599 apresentou características morfológicas de acordo com as

descritas por Zare & Gams, (2001) para o gênero Simplicillium. Este gênero

possui aspecto cotonoso e coloração que varia do creme ao branco. Fiálides

exclusivamente solitárias, longas e estreitas, surgindo a partir de pares opostos.

Conídios produzidos em pequenas cabeças globosas no ápice das fiálides

34

encontram-se envoltos por uma massa gelatinosa. Os conídios são pequenos,

variáveis na forma podendo ser subglobosos, ovais ou elipsoidais para

subcilíndricos.

O gênero Simplicillium. já foi descrito sobre várias espécies de Pucciniales,

incluindo dentre as plantas hospedeiras cultivadas, o café e a soja (Zare & Gams,

2001 Ward, 2011). Em Plumeria rubra L. popularmente conhecido como Jasmim

manga, é o primeiro relato deste gênero hiperparasitando a Coleosporium

plumariae Pat. Estudos adicionais, para correta identificação em nível de espécie

do isolado de Simplicilium S-599 deverão ser conduzidos, envolvendo

caracterização morfológica e molecular.

Já os isolados L-620 e L-622 apresentaram características morfológicas

semelhantes às descritas por Zare & Gams (2001) para o gênero Lecalicillium.

Este gênero possui aspecto cotonoso e coloração branca-amarelada tênue. O

micélio origina o conidióforo que se caracteriza por apresentar fiálides

pontiagudas, com uma disposição verticiliada. Quanto aos conídios são

produzidos individualmente e agregam nas cabeças ,são elipsoidais para

cilíndricos com extremidades arredondadas, encontram-se envoltos por uma

massa gelatinosa na extremidade da fiálide.

O gênero Lecanicillium já é amplamente conhecido como hiperparasita de

várias ferrugens e, no Brasil, e no mundo a relação foi bastante estudada por

Vandermeer, (2009) Jackson (2012) sobre Hemileia vastatrix Berk. & Broome,

agente causal da ferrugem do cafeeiro. Porém, para confirmação em nível de

espécie, estudos adicionais deverão ser conduzidos, estudos morfológicos e

moleculares.

Zare & Gams (2001), revisando o gênero Lecanicillium e Simplicillium em

um amplo estudo filogenético e morfológico classificaram as espécies em

Cordyciptaceae, a qual inclui fungos micoparasitas e entomopatogênicos..

Segundo estes mesmos autores, estes fungos são um dos agentes mais efetivos

e possuem potencial de utilização no controle biológico, apresentando uma ampla

gama de hospedeiros. São um importante patógeno de homópteros (Grajek, 1994

e Jackson, 2012), além de causar doenças em alguns ácaros e hiperparasitar

fungos patógenos de plantas tais como aqueles causadores de várias ferrugens

(Verhaar & Hijwegen, 1993; Castaldi & Nicoli, 1993, ward, 2011).

35

4.2. Crescimento micelial dos hiperparasitas e avaliação da esporulação em

diferentes temperaturas

As diferenças observadas nos resultados de estudos de hiperparasitismo in

vivo conduzidos em telado, em função da época do ano, sugeriram que os fungos

hiperparasitas diferem entre si quanto às exigências térmicas e, baseando-se

nisto, foram conduzidos ensaios em laboratório, para se determinar o ótimo de

temperatura para crescimento micelial em meio de cultura. Esse é um dado

relevante, tanto para produção de inóculo, quanto para se inferir sobre as

condições ambientais e indicação dos períodos de aplicação dos fungos para fins

de controle biológico.

Observou-se que os isolados de Hansfordia sp. apresentam preferência por

temperaturas amenas, variando de 19 a 22 ºC, tanto para crescimento micelial,

quanto para esporulação. Todos os isolados desta espécie apresentaram

comportamento semelhante em termos de desenvolvimento e esporulação.

Independente do patossistema de origem, local e época de coleta (Tabela 1) não

houve variação na resposta dos isolados nas diferentes temperaturas para

crescimento micelial (Figura 6), confirmando possível similaridade fisiológica dos

diferentes isolados de Hansfordia pulvinata.

A temperatura ótima para o maior crescimento micelial dos diferentes

isolados variou de 21 °C a 22 °C. Todos os isolados apresentaram crescimento

micelial nas temperaturas entre 15 e 27 ºC. Porém, a 30 ºC somente os isolados

H-610, H-613, H-623, H-608, H-611 e H-615 apresentaram crescimento mínimo

em BDA, embora este não ultrapassasse 3,5 mm (Figura 6).

Para os isolados de Acremonium spp., a temperatura ótima para

crescimento micelial variou de 20°C a 25°C. Para a grande maioria dos isolados

(A-618, A-602, A-598, A-604, A-601, A-619, A-616, A-603 e A-617) a temperatura

ótima para crescimento micelial ficou entre 20 e 22 °C (Figura 07). Já para os

isolados A-609 e A-621, a temperatura ótima de crescimento micelial foi de 25 °C.

Nesta temperatura, o crescimento máximo previsto para os dois últimos isolados

foi de 29,5 mm (Figura 7).

36

H-6

10

H-6

13

H-6

23

H

-608

H-6

00

H-6

11

H-6

14

H-6

05

H-6

12

H-6

15

Figura 06. Curvas de crescimento micelial, dos isolados de Hansfordia pulvinata em função da temperatura aos 10 d de incubação, em meio de BDA

37

A-5

98

A-6

16

A-6

09

A-6

19

A-6

18

A-6

01

A-6

02

A-6

21

A-6

03

A-6

04

A-6

17

Figura 07. Curvas de crescimento micelial, dos isolados de Acremonium spp em função da temperatura aos 10 d de incubação, em meio de BDA.

38

Para esporulação também houve interação significativa entre isolados e

temperatura. Os isolados H-608 e H-611, obtidos de lesões de pinta-preta (Tabela

1), apresentaram a temperatura ótima para esporulação de 19°C. Já para os

isolados I-623 (obtido de P. abelmoschi) e H-600, H-612, H-613 e H-605 (obtidos

de lesões de pinta-preta), a temperatura ótima para a esporulação ficou em torno

de 20°C. Enquanto os isolados H-610 e H-614, obtidos respectivamente de

Cladoporium/tomateiro e A. caricae/mamoeiro, apresentaram ótimo de

esporulação a 21°C. O isolado I-615, obtido de pinta-preta do mamoeiro,

esporulou mais em torno de 22°C (Figura 8).

Os isolados A-609 e A-621 não tiveram a produção de conídios afetada

mesmo nas maiores temperaturas (Figura 9). Para estes isolados, não foi possível

propor um modelo que descrevesse a relação entre temperatura e esporulação.

Os isolados A-601 e A-602, também não tiveram a esporulação fortemente

afetada pela temperatura (Figura 9). Entretanto, ao se analisar o crescimento

micelial destes isolados, observou-se que a temperatura entre a faixa de 25 a 30

0C apresentou menor crescimento (Figura 07). Aventa-se, portanto, a

possibilidade da temperatura influenciar pouco a conidiogênese, sendo que a

produção de conídios, mais dependente da massa micelial preexistente, uma vez

que os esporos foram obtidos do centro de colônias aos 10 d, tendo estas,

crescido mais ou menos, em função da temperatura. Possivelmente, ao se avaliar

a quantidade de esporos produzidos por placa, ao invés de se amostrar discos de

culturas já crescidas, o resultado seria diferente. Assim, a temperatura final

influenciaria pouco a conidiogênese, estando esta na dependência direta da

biomassa micelial preexistente (Sales-Campos & Andrade, 2010).

Para os demais isolados observou-se que a temperatura ótima para

esporulação variou de 20 a 22 oC. A temperatura de 20 oC foi a que mais

favoreceu a esporulação dos isolados A-598, A-618 e A-617, enquanto que para

A-616 a temperatura ótima foi de 21oC e para os isolados A-604 e A-603 esta foi

de 22oC (Figura 09).

39

H-6

10

H-6

13

H-6

23

H

-608

H-6

00

H-6

11

H-6

14

H-6

05

H-6

12

H-6

15

Figura 08. Curvas de produção de conídios dos isolados de Hansfordia pulvinata. em função da temperatura aos 10 d de incubação em meio de BDA.

40

A-5

98

A-6

16

A-6

09

A-6

19

A-6

18

A-6

01

A-6

02

A-6

21

A-6

03

A-6

04

A-6

17

Figura 09. Curvas de produção de conídios dos isolados de Acremonium spp. em função da temperatura aos 10 d de incubação em meio de BDA.

41

Os resultados acima evidenciam que a faixa de temperatura ótima para

crescimento micelial e esporulação, para a grande maioria dos isolados

estudados de H. pulvinata e Acremonium spp, foi em temperaturas amenas,

variando entre 20 e 22 oC. A única exceção foi para os isolados A-609 e A-621 de

Acremonium, que apresentaram ótimo crescimento e esporulação a 25oC. De todo

modo, em todos os casos, os ótimos de temperatura foram inferiores a 25 oC,

tanto para crescimento micelial quanto para esporulação, sugerindo que as

condições de verão, com temperaturas médias superiores a 25 oC, não sejam

propícias a aplicação dos hiperparasitas. No entanto, estudos em nível de campo

são necessários para corroborar o observado no presente estudo. Ademais, tem-

se observado que no verão as epidemias de pinta-preta são menos severas.

Embora Suzuki et al. (2008) tenham relatado que a doença ocorre o ano todo até

mesmo à temperatura de 30 oC. Porém, na região sul do espírito Santo e norte do

Rio de janeiro, observa-se uma redução na epidemia de pinta-preta nas

condições de temperaturas elevadas, o que sugere novos estudos nestas

condições.

4.3. Antibiose in vitro: Avaliação de componentes voláteis e não voláteis que

possam inibir a germinação de esporos de A. caricae

Observou-se que não houve diferença estatística entre as médias de

germinação conidial em nenhum dos dois ensaios conduzidos para avaliar a

presença de componentes voláteis (Tabela 4). Portanto, nenhum dos 24 isolados

testados apresentou evidências de produção de compostos voláteis que possam

ter efeito de antibiose sobre a germinação conidial de A. caricae. Observou-se,

contudo, diferenças nas médias de germinação conidial entre os ensaios, o que

pode estar associado às condições ambientais e épocas de coleta dos conídios

de A. caricae.

42

Tabela 4. Médias da porcentagem de germinação de conídios de Asperisporium

caricae em ensaio de produção de compostos voláteis de 24 isolados de fungos

hiperparasitas.

Isolado

% Germinação

Primeiro Ensaio Segundo Ensaio

A-598 29,11 A 40,77 A

H- 608 28,04 A 46,54 A

A-616 32,90 A 44,71 A

A-609 30,98 A 38,97 A

A-619 32,25 A 39,99 A

A-618 29,39 A 42,93 A

S-599 34,76 A 42,69 A

H-600 32,17 A 48,55 A

A-601 24,41 A 39,45 A

H-610 32,51 A 43,23 A

H-611 29,18 A 39,63 A

A-602 30,54 A 40,97 A

H-612 27,30 A 41,91 A

A-603 19,55 A 47,15 A

L-620 24,00 A 45,96 A

H-613 30,36 A 42,57 A

A-604 28,83 A 37,83 A

A-621 25,06 A 40,35 A

H-614 24,80 A 42,00 A

H-623 31,19 A 45,84 A

L-622 25,96 A 47,35 A

A-617 30,40 A 36,54 A

H-605 37,39 A 43,85 A

H-615 36,25 A 39,73 A

Controle negativo (cladosporium sp) 28,85 A 44,06 A

Controle sem fungo 31,47 A 33,49 A

Média 29,52 42,19

CV (%) 24,19 13,90

*Médias seguidas de mesma letra não diferem entre si pelo teste Scott-Knott

(0,05).

43

Por outro lado, verificou-se efeito de antibiose para alguns hiperparasitas,

para componentes não-voláteis, reduzindo a germinação de A. caricae. Nos dois

ensaios repetidos no tempo, observou-se que os isolados H-608, A-616, H-600,

H-611, H-612, A-604, H-623 e A-617 foram os que mais inibiram a germinação

conidial de A. caricae (Tabela 5). Destes, A-616, A-604, e A-617 pertencem a

Acremonium sp., obtidos de lesões de pinta-preta do mamoeiro. Os demais

isolados são de Hansfordia pulvinata. Isolados desta espécie e gênero já foram

relatados em outros patossistemas apresentando antibiose e componentes

antifúngicos. Tirilly et al. (1983) investigando o mecanismo de hiperparasitismo de

H. pulvinata sobre Cladosporium fulvum Cook em folhas de tomateiro

comprovaram in vitro a presença de um composto sesquiterpene, (13-

desoxyphomenome), com ação fungistática.

O gênero Acremonium também produz importantes metabólitos

secundários ativos. Estas substâncias são muito importantes, por apresentarem,

dentre outras atividades biológicas relevantes, ação bactericida, fitotóxica e

anticancerígena (Assante et al., 2005). Entretanto, o uso do gênero Acremonium

como agente de controle biológico deve ser encarado com cautela, uma vez que

há relatos de espécie deste gênero como agentes patogénicos oportunistas em

pessoas imunocomprometidas, assim como doentes com HIV, no caso de

leucemia, após trauma ou queimaduras, transplante de órgãos e outras cirurgias

(Weisenborn 2010). Todavia, a taxonomia destas espécies, inclusive as

micoparasitas de fungos fitopatogênicos, é controversa e merece um amplo

estudo. Ainda, faltam estudos contundentes demonstrando a eficiência de

biocontrole de doenças de parte aérea em plantas por espécies de Acremonium.

No Brasil, por exemplo, existem poucos trabalhos relatando eficiência técnica da

aplicação de Acremonium spp. no biocontrole de doenças em plantas, a exemplo,

na cultura do coqueiro, no controle da lixa-grande e lixa-pequena (Warwick, 2001

e 2007, Sudo, 1989). Mas, até o momento, não há registro de produto formulado à

base de hiperparasitas pertencentes à Acremonium spp.

O teste de componente não volátil conduzido neste experimento demonstra

que um dos modos de ação exercido pelo antagonista é a antibiose - interação

entre organismos, na qual um ou mais metabólitos produzidos pelo antagonista

têm efeito negativo sobre o fitopatógeno, resultando na inibição do crescimento

e/ou germinação (Bettiol, 1991). No entanto, pode-se mencionar que um fungo

44

pode apresentar mais de um mecanismo de ação antagônica, como no caso de

Trichoderma, um fungo que é um agente de controle biológico que pode agir pela

competição por espaço e nutrientes, modificação das condições ambientais,

produção de antibióticos e inativação das enzimas do patógeno, ou mediante o

micoparasitismo direto (Benitez et al, 2004) e, ainda, indução de resistência na

planta hospedeira (Harman et al 2004). Estudos adicionais deverão comprovar

outras formas de ação de fungos micoparasitas em lesões foliares da pinta-preta

do mamoeiro.

45

Tabela 5. Médias da porcentagem de germinação de conídios de A. caricae

submetidos à ação de componentes não voláteis de 24 isolados hiperparasitas da

pinta-preta no mamoeiro.

Isolado

(% germinação)

Primeiro Ensaio Segundo Ensaio

A-598 22.16 C 34.06 C

H- 608 2.21 F 3.94 G

A-616 0.18 F 0.05 G

A-609 8.99 E 10.15 F

A-619 17.67 D 26.01 D

A-618 25.53 C 38.16 B

S-599 28.37 C 39.11 B

H-600 0.00 F 0.00 G

A-601 19.09 D 30.07 D

H-610 9.78 E 20.72 E

H-611 11.16 E 10.13 F

A-602 20.07 D 41.18 B

H-612 2.11 F 2.90 G

A-603 6.20 E 21.72 E

L-620 27.75 C 34.64 C

H-613 22.82 C 13.30 F

A-604 10.01 E 15.81 F

A-621 25.87 C 20.28 E

H-614 16.80 D 19.16 E

H-623 2.30 F 1.53 G

L-622 25.89 C 32.06 C

A-617 0.00 F 0.00 G

H-605 11.56 E 9.92 F

H-615 23.57 C 14.05 F

Controle negativo (cladosporium sp) 43.02 A 49.23 A

Controle sem fungo 34.15 B 40.83 B

Média 16,05 20,35

CV (%) 23,82 19,74

*Médias seguidas de mesma letra não diferem entre si pelo teste Scott-Knott

(0,05).

46

4.4. Microscopia ótica da interação entre A. caricae e isolados hiperparasitas

Após 24 h de incubação, em meio de ágar, ambos, fitopatógeno (A.

caricae) e hiperparasitas, apresentaram germinação satisfatória. Inicialmente, os

antagonistas não apresentaram aparentemente crescimento de hifas direcionado

aos conídios de A. caricae. Porém, após 48 h, observou-se entrelaçamento das

hifas do hiperparasitas ao redor dos tubos germinativos dos conídios de A.

caricae. Às 72 h, os isolados obtidos de ferrugens, de Lecanicillium (L-620 e L-

622), e de Simplicillium (S-599) e Acremonium sp (à exceção dos isolados A-609

e A-621) penetraram nas paredes do tubo germinativo dos conídios do patógeno

(Figura 10 A, B e D).

Observaram-se sinais de degradação de parede celular e os conídios

invadidos entraram em colapso. Já os isolados de Hansfordia diferiram na

frequência e mais claramente diferiram quanto à intensidade de entrelaçar os

conídios de A. caricae, mas, para estes isolados não se observou invasão das

hifas nos conídios e nos tubos germinativos do patógeno (Figura 10 C). O

observado para Hansfordia no presente estudo está em acordo com o relatado

por Peresse & Le Picard (1980). Estes últimos autores observaram que H

pulvinata entrelaça suas hifas nos conídios de seus hospedeiros, matando-os.

Tirilly et al. (1991) afirmam que em continuidade ao processo de micoparasitismo

direto, há também ação de metabólito fungistático sesquiterpeno,

deoxyphomenone (Tirilly et al., 1991).

Lecanicillium e Simplicillium pertencem à mesma família, Cordyciptaceae,

são micoparasitas e entomopatogênicos. Simplicillium lanosoniveum é um

hiperparasita e pode ser encontrado em lavouras de soja, onde são utilizados

como micofungicidas sobre urédias de Phakopsora pachyrhizi (Ward, 2011). O

fungo Lecanicillium (sin. Verticillium lecanii) tem sido estudado com agente de

controle biológico da ferrugem do cafeeiro (Shaw, 1988; Carrion, 2002). A ação

entomopatogênica e micoparasítica de Lecanicillium lecanii foi confirmada por

Jackson et al. (2012), em estudo com Hemileia vastatrix, o qual observaram o

papel regulatório desse antagonista na ocorrência da doença.

Para ocorrência de micoparasitismo direto, a primeira barreira a ser

quebrada no hospedeiro é a parede celular fúngica, que é constituída

primariamente por quitina, proteínas e outros compostos. O envolvimento de

47

enzimas hidrolíticas com capacidade de degradar a parede do fungo hospedeiro

deve ser uma das primeiras características requeridas para o micoparasitismo

(Chet, & Inbar, 1994; Lima et al., 2000). Sendo assim, pode existir uma correlação

entre o potencial antagônico e a secreção enzimática pelo antagonista, refletindo

na eficiência de biocontrole. Todavia, nos estudos de microscopia ótica, a lise da

parede não é facilmente visualizada, devido à extensa colonização pelo fungo

hiperparasita, impedir a resolução da parede celular do fungo sob ataque (Figura

10). O que se observou, nos casos de hiperparasitismo acentuado, para isolados

de Acremonium, Lecanicillium e Simplicillium foi uma extensa colonização ao

redor dos esporos e tubos germinativos pelas hifas dos hiperparasitas.

Figura 10. Entrelaçamentos das hifas dos hiperparasitas ao redor de

conídios e tubos germinativos de A. caricae, sob microscópio óptico, após 72

h de incubação: (A) Simplicillium sp. (isolado S-599); (B) Acremonium sp.

(isolado A-616); (C) Hansfordia sp. (isolado H-613); (D) Lecanlicillium sp.

(isolado L-620)

48

Neste ensaio não foi observada interação dos isolados de Acremonium A-609 e

A-621 com conídios do A. caricae. Vale ressaltar que estes isolados obtidos de A.

caricae e Pseudocercospora, foram alguns dos que mais se diferenciaram

morfologicamente dos demais isolados de Acremonium. Para Lorito (1998), o

micoparasitismo parece ser o mecanismo mais eficiente de antagonismo no

controle biológico natural, pois, os hiperparasitas, por viverem às custas do

patógeno, estão sujeitos às mesmas variações ambientais e dependem das

mesmas condições do organismo parasitado. No entanto, outros mecanismos

podem estar envolvidos na ação destes isolados sobre A. caricae, conforme já

comentado. Ademais, as condições de cultivo in vitro utilizadas na condução

deste ensaio, podem ter influenciado a interação destes hiperparasitas com o

fungo-teste utilizado. Novos estudos, utilizando técnicas de microscopia eletrônica

de varredura, deverão ser conduzidos a fim de elucidar o envolvimento destes

isolados no hiperparasitismo de A. caricae.

4.5. Hiperparasitismo in vivo em condições de telado

Com relação às avaliações in vivo da inoculação de hiperparasitas sobre

folhas de mamoeiro infectadas por A. caricae, houve efeito significativo de todas

as fontes de variação testadas: isolado, período de inoculação e interação entre

estes dois fatores.

Observou-se que, por ocasião da primeira avaliação (julho de 2013), o

número de lesões foliares de pinta-preta foi menor que o observado na segunda

avaliação (novembro de 2013). Parte desta diferença pode ser explicada pelo fato

da umidade do ar, bem com a duração diária de molhamento foliar no segundo

período, terem sido superiores que as do primeiro período de avaliação. No

primeiro período de avaliação, as temperaturas no interior do telado variaram de

17 a 32 ºC, com umidade de 57 a 78%; enquanto que no segundo período, a

temperatura variou de 20 a 30 ºC e a umidade de 64 a 98%. Ademais, antes da

aplicação dos hiperparasitas, as plantas estavam sob as mesmas condições de

incubação, em telado coberto e sob sombrite. Assim, as condições ambientais

afetaram tanto a manifestação dos sintomas da doença, quanto a eficiência dos

hiperparasitas inoculados. Todavia, ao se analisar as médias do número de

49

lesões de pinta-preta (com ou sem sinais de hiperparasitismo), nas duas épocas

de inoculação, não houve diferença entre tratamentos, ou seja, em ambas as

épocas de avaliação os isolados hiperparasitas (tratamentos) foram aplicados em

plantas com quantidades equivalentes de lesões de pinta-preta nas folhas (Tabela

6). O segundo ensaio foi o mais favorável, tanto para o patógeno (A. caricae)

quanto para os hiperparasitas, uma vez que houve maior quantidade de lesões

produzidas pelo patógeno e hiperparasitadas (Tabela 7). Ao analisar as condições

ambientais ocorridas nesta época, observa-se que a temperatura variou de 20 a

30º.C e umidade de 64 a 98%, o que favoreceu tanto o patógeno quanto o

hiperparasita. Tais resultados corroboram observações de campo obtidas por

Suzuki et al. (2007), os quais afirmam que para a pinta-preta as condições

favoráveis ao desenvolvimento de epidemias no campo envolvem temperaturas

variando de 25 ºC a 30 ºC e umidade relativa mais elevada, variando de 80 % a

100 %, no Norte do Estado do Espírito santo, Brasil.

Considerando a incidência de lesões de pinta-preta hiperparasitadas,

observou-se, no primeiro ensaio, que os isolados A-619, A-616, A-602, H-610, H-

623, H-600, H-614, H-612, H-613, H-608, H-611, H-605 e H-615 apresentaram

médias mais elevadas de incidência de lesões de pinta-preta hiperparasitadas. No

segundo ensaio, os isolados A-609, A-603, A-602, S-599, H-623, H-614, H-612,

H-613, H-608, H-611, H-605 e H-615 apresentaram as maiores médias de

incidência de lesões hiperparasitadas. Foi possível assim, identificar isolados

potencialmente promissores para o controle biológico da pinta-preta, notadamente

os isolados de H. pulvinata (H-614, H-608, H-611 e H-615), os quais se

destacaram nas duas épocas de inoculação (Tabela 6). Estes isolados foram

obtidos em diferentes regiões do estado do Rio de Janeiro e Espírito Santo. Há,

portanto, possibilidade de variabilidade entre os mesmos em função de outras

épocas do ano, não avaliadas neste estudo, haja vista, que as condições

climáticas de cada região de origem dos hiperparasitas são bastante distintas.

Quanto aos isolados de Acremonium ssp., embora estes não se

destacaram como os isolados de H. pulvinata, apresentaram potencial de

biocontrole. Alguns isolados de Acremonium spp. produzem clamidósporos, o que

lhes oferece maior vantagem adaptativa e competitiva no ambiente, o que pode

viabilizar sua manutenção e multiplicação massal para fins comerciais, bem como

sua sobrevivência sob condições de campo, a exemplo de outros fungos agentes

50

de biocontrole já consagrados. Dentre espécies fúngicas de sucesso no

biocontrole e capazes de produzir clamidósporos, pode-se citar Lewia

chlamidosporiformans B.S. Vieira & R.W. Barreto, utilizado como micoherbicida

em Euphorbia heterophylla (Vieira e Barreto, 2010); Pochonia chlamydosporia

(Goddard) Zare & Gams utilizadas em programas de controle biológico do

nematoide das galhas, Meloidogyne javanica (Dallemole-Giaretta et al, 2008,

2012) e Trichoderma spp. ,que são utilizadas na promoção de crescimento

vegetal e no controle de diversos fitopatógenos principalmente do solo

(Melo,1998) dentre outros.

Quanto ao número de dias decorridos entre a inoculação e o aparecimento

de sinais de hiperparasitismo, não foi possível conduzir análise estatística, pois

houve isolados que não manifestaram sinais de hiperparasitimos na ocasião em

que se procederam as avaliações. De forma geral, observou-se que na primeira

inoculação, os sinais apareceram entre 8 e 11 d após a inoculação (d.a.i.),

enquanto que na segunda estes apareceram no intervalo de 6 a 9 d. (Tabela 7).

No Brasil, Hansfordia pulvinata (=Dicyma pulvinata) já foi relatada na lixa-

grande e pequena do coqueiro por Warnick (2007). A mesma autora avaliou os

índices de parasitismo pelos fungos, relatando um controle parcial da doença.

Mas, o estudo de maior abrangência sobre H. pulvinata foi como hiperparasita em

lesões do mal-das-folhas da seringueira, causada por Microcyclus ulei. Diversos

trabalhos foram conduzidos comprovando o potencial de H. pulvinata

(=D. pulvinata) no biocontrole de M. ulei, por meio do hiperparasitismo (Junqueira

et al., 1989; Junqueira & Gasparotto, 1991; Rodrigues, 2002; Tavares et al.,

2004). Segundo Junqueira & Gasparotto (1991), D. pulvinata coloniza as lesões

estromáticas, destruindo as estruturas sexuais do patógeno, reduzindo o

desfolhamento das plantas e a taxa de inóculo em reinfecções. Além disso, o

gênero tem despertado interesse, também, no isolamento de novos compostos

terapêuticos para usos medicinais (Vázquez et al., 2003).

51

Tabela 6. Médias do número de lesões da pinta-preta, causadas por

Asperisporium caricae, em folhas de mamoeiro, e incidência de lesões com sinais

de hiperparasitismo, em duas épocas de inoculação (Julho e Novembro de 2013),

em viveiro telado, sob sombrite.

ISOLADOS

Número total de lesões de pinta-preta

Incidência de lesões de pinta-preta hiperparasitada (%)

Primeira Inoculação

Segunda Inoculação

Primeira Inoculação

Segunda Inoculação

A-598 15 A* 89 A 0,00 C 31,69 C

A-609 17 A 57 A 0,00 C 42,59 B

A-604 29 A 103 A 0,00 C 12,07 D

A-601 14 A 80 A 0,00 C 22,07 C

A-619 74 A 81 A 60,18 A 31,90 C

A-618 24 A 86 A 0,00 C 9,64 D

A-616 45 A 118 A 36,37 B 17,77 D

A-603 22 A 95 A 0,00 C 51,22 B

A-602 34 A 88 A 35,21 B 51,91 B

A-621 18 A 87 A 0,00 C 19,07 D

S-599 31 A 115 A 0,00 C 45,84 B

L-622 25 A 82 A 0,00 C 9,52 D

L-620 20 A 99 A 0,00 C 11,17 D

A-617 17 A 101 A 0,00 C 17,26 D

H-610 25 A 74 A 32,28 B 31,50 C

H-623 53 A 90 A 62,55 A 46,59 B

H-600 52 A 114 A 56,01 A 11,93 D

H-614 19 A 120 A 54,09 A 60,39 A

H-612 43 A 110 A 51,61 A 49,22 B

H-613 37 A 110 A 50,68 A 67,52 A

H-608 51 A 155 A 53,66 A 43,42 B

H-611 55 A 58 A 60,28 A 75,46 A

H-605 23 A 149 A 41,82 B 36,24 B

H-615 66 A 88 A 49,76 A 70,25 A

TEST. 47 A 122 A 0,00 C 0,00 D

MÉDIA 34,24 98,84 27,78 34,65

*Médias seguidas de mesma letra não diferem entre si pelo teste Scott-Knott

(0,05).

52

Tabela 7. Número de dias decorridos da inoculação de isolados de fungos

hiperparasitas em lesões da pinta-preta do mamoeiro, causadas por

Asperisporium caricae, até o aparecimento dos sinais de hiperparasitismo, em

duas épocas de aplicação (julho e novembro de 2013), sob condições de telado

sob sombrite.

ISOLADOS Dias para aparecer sinais de hiperparasitas

Época 1 Época 2

A-598 Ns 8

A-609 Ns 8

A-604 Ns 9

A-601 Ns 7

A-619 11 7

A-618 Ns 7

A-616 11 6

A-603 Ns 7

A-602 10 7

A-621 Ns 7

S-599 Ns 6

L-622 Ns 8

L-620 Ns 8

A-617 Ns 9

H-610 8 6

H-623 9 6

H-600 8 6

H-614 8 6

H-612 8 6

H-613 8 6

H-608 8 6

H-611 8 6

H-605 8 6

H-615 8 6

TEST. Ns Ns

ns – não apresentou sinais de hiperparasitismo.

53

Analogamente, o gênero Acremonium apresenta potencial para uso na

agricultura. Diferentes trabalhos relatam o potencial de biocontrole de doenças e

pragas em plantas de Acremonium spp. endófitas (Poling, et al., 2008). Segundo

Azevedo et al. (2000), este gênero pode ser utilizado no controle de insetos

nocivos. Koga et al. (1997) estudaram o efeito em Festuca arundinacea e Lolium

perenne, associada à Acremonium sp. endofítico. Estes autores conseguiram,

transmitir via semente, a capacidade de controlar larvas da praga Parapediasia

teterrella. O fungo Acremonium implicatum foi considerado potente protetor em

Brachiaria spp. e aumentou a resistência de gramíneas tropicais contra ataques

de insetos e patógenos (Kelemu et al., 2002). Acremonium zeae tem sido

caracterizada como espécie endófitica que confere proteção em milho contra

outros fungos e exibe atividade antifúngica (Wicklow, et al., 2005; Poling, 2008).

Trabalhos demonstram o micoparasitismo de A. strictum em Botrytis cinerea

(Choi,et al 2008) e A. furcatum em Aspergillus spp.( Srivastava et al 1981).

No Brasil, o potencial dos fungos hiperparasitas A. alternatum e A.

persicinum como hiperparasitas tem sido avaliado para o controle da lixa-pequena

como da lixa-grande (Kimati et al, 1997, Sudo 1989) Warwick (2001) avaliou a

colonização de estromas de Sphaerodothis acrocomiae, agente causal da lixa-

grande no coqueiro por A. persicinum e concluiu que a concentração de 107

conídios por ml foi a que proporcionou maior colonização no ensaio de campo e a

aplicação de hiperparasitas com melhores resultados foi na estação chuvosa e

quando realizada no período da tarde.

Para Lumsden & Locke, (1989) não basta apenas que o antagonista seja

um potente agente de controle em condições de laboratório. É preciso também

conhecer os fatores ecológicos que podem afetar a permanência e o desempenho

dos antagonistas, para se adotar práticas de manejo adequadas visando

favorecer o controle biológico da doença no ambiente. Com base nisso, estudos

adicionais, sob condições de campo, deverão avaliar não somente a ação dos

hiperparasitas sobre a doença e sua presença nas lesões de pinta-preta, mas

como também deverão determinar as condições que propiciam ao

hiperparasitismo e aumentam a eficiência do controle da pinta-preta do mamoeiro.

Ademais, formulações e formas de aplicação dos agentes de biocontrole carecem

de estudo visando à aplicação na cultura do mamoeiro e em diversas outras

culturas no mundo.

54

5. CONCLUSÃO GERAL

Pelas análises morfométricas e culturais observou-se a ocorrência de ao

menos dois gêneros hiperparasitas de lesões da pinta-preta do mamoeiro,

causadas por Asperisporium caricae: Hansfordia pulvinata, que apresentou menor

variação entre os isolados avaliados e Acremonium ssp, que apresentou maior

variabilidade entre os isolados. Há indícios de ocorrência de mais de uma espécie

de Acremonium associada ao hiperparasitismo de lesões de A. caricae.

A variabilidade dentre os isolados de fungos hiperparasitas estudados

também foi percebida quando se estimou a temperatura ótima para o crescimento

micelial e a esporulação. Observou-se para os isolados de Hansfordia pulvinata,

que temperaturas amenas (em torno de 21 °C) favorecem tanto o crescimento

micelial quanto a esporulação. Para o Acremonium spp., o ótimo de crescimento

micelial varia entre 20 °C e 25 °C. Para os isolados de Acremonium sp., A-609 e

A-621, a temperatura ótima para crescimento micelial foi de 25 ºC e, para os

demais isolados deste gênero, esta foi de 20 ºC a 22 ºC.

Não se constatou entre os isolados estudados, evidência de produção de

compostos voláteis, com ação inibidora da germinação de conídios de

Asperisporium caricae, nas condições experimentais utilizadas. Por outro lado, há

evidências de antibiose por compostos não voláteis. Os isolados H-608, A-616,

H-600, H-611, H-612, A-604, H-623 e A-617 foram os que mais reduziram a

germinação de conídios de A. caricae.

55

Observou-se que os isolados de Lecanicillium, Simplicillium e Acremonium

spp (à exceção dos isolados A-609 e A-621 de Acremonium) entrelaçam suas

hifas e invadem o tubo germinativo de A. caricae. Já os isolados de Hansfordia

pulvinata diferiam quanto à capacidade de entrelaçar hifas nos conídios e tubos

germinativos de A caricae e estes não foram capazes de invadir as hifas e o tubo

germinativo do patógeno, nas condições experimentais.

No teste de aplicação dos hiperparasitas em lesões de pinta-preta do

mamoeiro em mudas sob condições de telado sob sombrite, observou-se que

todos os isolados testados dos quatro gêneros Hansfordia, Acremonium,

Lecanicillium e Simplicillium, foram capazes de hiperparasitar lesões de pinta-

preta, com destaque para os isolados H-614,H-608, H-611, H-615, pertencentes a

Hansfordia pulvinata, os quais foram os mais eficientes. Portanto, há possibilidade

de se utilizar estes isolados no controle biológico da pinta-preta na cultura do

mamoeiro. No entanto, deve-se atentar para o efeito das condições ambientais

afetando o hipeparasitismo, notadamente a temperatura, uma vez que há

evidência de que esta possa atrasar ou mesmo impedir a colonização de lesões

de pinta-preta pelo fungo antagonista.

56

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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