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PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM TECNOLOGIAS EM SAÚDE JACQUELINE DE AZERÊDO SILVA AVALIAÇÃO DO REPARO DE DEFEITO ÓSSEO NÃO CRÍTICO COM A UTILIZAÇÃO DE HIDROXIAPATITA DOPADA OU NÃO COM MAGNÉSIO DISSERTAÇÃO DE MESTRADO Salvador 2014

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Page 1: JACQUELINE DE AZERÊDO SILVA AVALIAÇÃO DO REPARO … DE... · de Bioengenharia Tecidual e Biomateriais do Instituto de Ciências da Saúde da Universidade Federal da Bahia, necessários

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM TECNOLOGIAS EM SAÚDE

JACQUELINE DE AZERÊDO SILVA

AVALIAÇÃO DO REPARO DE DEFEITO ÓSSEO NÃO CRÍTICO COM A UTILIZAÇÃO DE HIDROXIAPATITA DOPADA OU NÃO

COM MAGNÉSIO

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO

Salvador

2014

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AVALIAÇÃO DO REPARO DE DEFEITO ÓSSEO NÃO CRÍTICO COM A UTILIZAÇÃO DE HIDROXIAPATITA DOPADA OU NÃO

COM MAGNÉSIO

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Tecnologias em Saúde da Escola Bahiana de Medicina e Saúde Pública para obtenção do título de Mestre em Tecnologias em Saúde

Autor: Jacqueline de Azerêdo Silva

Orientador: Prof. Dr. Fúlvio Borges Miguel

Co-orientador: Prof. Dr. Maurício Andrade Barreto

Salvador

2014

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Ficha Catalográfica elaborada pela

Biblioteca Central da EBMSP

S586 Silva, Jacqueline de Azerêdo

Avaliação do reparo de defeito ósseo não crítico com a utilização de

hidroxiapatita dopada ou não com magnésio. Jacqueline de Azerêdo Silva. –

Salvador. 2014.

71f. il.

Dissertação (Mestrado) apresentada à Escola Bahiana de Medicina e Saúde

Pública. Programa de Pós-Graduação em Tecnologias em Saúde.

Orientador: Prof. Dr. Fúlvio Borges Miguel

Co-orientador: Prof. Dr. Maurício Andrade Barreto

Inclui bibliografia

1.Regeneração óssea. 2.Biomateriais. 3.Hidroxiapatita. 4.Magnésio I. Título.

CDU: 616.71

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FOLHA DE APROVAÇÃO

Nome: SILVA, Jacqueline de Azerêdo Título: Avaliação do reparo de defeito ósseo não crítico com a utilização de hidroxiapatita dopada ou não com magnésio.

Dissertação apresentada à Escola Bahiana de Medicina e Saúde Pública para obtenção do título de Mestre em Medicina e Saúde Humana.

Data da defesa: 21 de agosto de 2014

Banca Examinadora

Prof. Dr. Atson Carlos de Souza Fernandes Doutor em Ciências Morfológicas, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP) Universidade do Estado da Bahia (UNEB) Escola Bahiana de Medicina e Saúde Pública (EBMSP) Profª. Drª. Isabela Cerqueira Barreto Doutora em Processos Interativos dos Órgãos e Sistemas, Universidade Federal da Bahia (UFBA) Universidade Federal da Bahia (UFBA) Profª. Drª. Livia Souza Pugliese Doutora em Ciências, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP) Universidade do Estado da Bahia (UNEB) Escola Bahiana de Medicina e Saúde Pública (EBMSP)

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Dedico este trabalho

Aos meus pais, Edgar e Heloísa, pelas lições de persistência, honestidade e amor,

importantes para a formação de meu caráter. À minha irmã Soraia e ao meu marido

Newton, por me estimular a nunca desistir dos meus sonhos. E aos meus queridos

filhos, Caroline e Luís Felipe, meus incentivadores, pela compreensão do tempo

dedicado a este trabalho.

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AGRADECIMENTOS

A Deus, por sempre iluminar meu caminho e me acolher nos momentos mais difíceis,

fortalecendo minha fé e esperança para superar os obstáculos.

Agradeço aos animais que contribuíram com sua vida em prol da Ciência.

Aos meus pais, Edgar e Heloísa, pela iniciação da fé e esperança, que apesar de

todos os absurdos a que assistimos nos dias atuais e achar que não tem jeito,

devemos acreditar em um mundo melhor.

A minha irmã Soraia, meu apoio em todos os momentos.

Ao meu marido Newton, pelo incentivo.

Aos meus queridos filhos, Caroline e Luís Felipe, pela paciência e incentivo.

Ao professor Fúlvio Borges Miguel, sempre disposto a auxiliar, grande apoio para

realização e conclusão deste trabalho. Um incentivador, amigo e admirável, que Deus

colocou no meu caminho. Muito obrigada!

A professora Isabela Cerqueira Barreto, que disponibilizou seu tempo para auxiliar na

execução deste trabalho. Muito obrigada!

Ao professor Maurício Barreto que também disponibilizou seu tempo para auxiliar na

cirurgia experimental. Obrigada!

A professora Carla Daltro, que disponibilizou seu tempo para auxiliar na bioestatística

deste trabalho. Obrigada!

Ao professor Marcos Almeida, Coordenador do Mestrado em Tecnologias em Saúde.

Muito obrigada pela oportunidade e apoio!

Ao pesquisador Alexandre M. Rossi e à química Silvia R. Albuquerque Santos do

Centro Brasileiro de Pesquisas Físicas (CBPF), pela concessão do biomaterial

utilizado neste estudo.

À professora Fabiana Paim Rosa, pela concessão dos equipamentos do Laboratório

de Bioengenharia Tecidual e Biomateriais do Instituto de Ciências da Saúde da

Universidade Federal da Bahia, necessários à captura das imagens histológicas e

análise histomorfométrica.

Ao professor Aryon de Almeida Barbosa Júnior, pela concessão do Instituto de

Patologia Geral e Cutânea – IPAC, para o processamento histológico dos espécimes.

Ao mestrando George Gonçalves e às doutorandas Iorrana Ribeiro e Renata Almeida,

pela grandiosa ajuda, o que foi muito importante para a conclusão deste trabalho.

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Ao Biotério da UEFS, especialmente ao médico veterinário Orestes da Paixão e ao

técnico em biotério Florisvaldo da Costa Brandão Júnior, pela grande ajuda durante a

realização dos experimentos.

A técnica de laboratório Cristina dos Santos Vasconcelos Mota, pela dedicação no

processamento histológico dos espécimes.

À Conceito Auditoria, pelo apoio financeiro a esta pesquisa.

Ao Centro de Medicina Hiperbárica, pelo fornecimento de alguns materiais para

execução da cirurgia experimental.

A todos que de alguma forma contribuíram para mais esta conquista.

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“É justamente a possibilidade de realizar um sonho que torna a vida interessante”

Paulo Coelho

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RESUMO

A hidroxiapatita sintética é um biomaterial que tem sido amplamente pesquisado, devido à sua semelhança com componentes da fase mineral do tecido ósseo, excelente biocompatibilidade e osteocondutividade. Durante o preparo destas cerâmicas, pode-se fazer substituições iônicas que melhorem sua eficiência biológica, mimetizando a apatita biológica, com vistas a contribuir com a osteogênese. Um dos íons utilizados nesse processo é o magnésio, mineral essencial à formação e homeostasia do tecido ósseo. Diante disto, o objetivo deste estudo foi avaliar, in vivo, o reparo de defeito ósseo não crítico, em calvária de rato, após a implantação de microesferas de hidroxiapatita dopada, ou não, com magnésio. Para tanto, utilizou-se 24 ratos machos, distribuídos aleatoriamente para compor três grupos experimentais, com quatro animais em cada grupo e ponto biológico –15 e 45 dias de pós-operatório: GHAMg – defeito preenchido com microesferas de hidroxiapatita dopadas magnésio; GHA – defeito preenchido com microesferas de hidroxiapatita sem magnésio; GC – grupo controle, defeito sem biomaterial de preenchimento. Na análise histológica observou-se, no GI, neoformação óssea além da borda, que evoluiu gradativamente com o ponto biológico, e reação inflamatória crônica granulomatosa mais evidente neste grupo, em ambos os pontos biológicos, quando comparado ao GHA. No GHA a neoformação também ocorreu de forma centrípeta a partir da borda, e uma inflamação crônica granulomatosa associada às microesferas foi observada. No GC, houve neoformação óssea, porém limitada às bordas do defeito, com formação de tecido conjuntivo fibroso na área remanescente do defeito nos dois pontos biológicos. Diante destes resultados, conclui-se que os biomateriais estudados foram biocompatíveis e osteocondutores, contudo a hidroxiapatita dopada com magnésio não favoreceu maior regeneração óssea. Palavras-Chave: regeneração óssea, biomateriais, hidroxiapatita, magnésio.

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ABSTRACT

The synthetic hydroxyapatite is a biomaterial that has been widely researched due to its similarity to components of the mineral phase of bone, excellent biocompatibility and osteoconductivity. During the preparation of these ceramics can be made ionic substitutions that improve the biological efficiency, mimicking the biological apatite, aiming to contribute to osteogenesis. One of the ions used in this process is magnesium, essential mineral in the formation and homeostasis of bone tissue. Hence, the aim of this study was to evaluate in vivo repair bone noncritical defects in rat calvaria, after implantation of hydroxyapatite microspheres doped or not with magnesium. For this, we used 24 male rats were randomly divided to form three groups with four animals in each group and biological point – 15 and 45 days postoperatively: GHAMg – defect filled with hydroxyapatite microspheres doped magnesium; GHA – defect filled with hydroxyapatite microspheres without magnesium; GC – group control, biomaterial filling defect without. In histological analysis was observed in GI, bone formation over the border, which gradually evolved with the biological point and was more pronounced chronic granulomatous inflammatory reaction in this group, both biological points compared to GHA. In GHA neoformation also occurred in a centripetal way from the border, and a chronic granulomatous inflammation associated with the microspheres was observed. In GC, there was bone formation, but limited to the borders of the defect, with the formation of fibrous connective tissue in the remaining area of the defect in two biological points. Considering these results, it is concluded that the biomaterials were studied biocompatible and osteoconductive, however hydroxyapatite doped with magnesium did not favor increased bone regeneration. Keywords: bone regeneration, biomaterials, hydroxyapatite, magnesium.

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LISTA DE FIGURA

Figura 1 - Tipo de biomateriais. (A) Biomaterial metálico, placas em titânio

para reconstrução facial; (B) Biomaterial polimérico, polietileno para

implante de queixo e (C) Biomaterial cerâmico, cimento de HA, para

preenchimento ósseo ............................................................................... 23

Figura 2 - Classificação dos materiais de acordo com sua origem e interação

com o meio fisiológico. ............................................................................. 25

Figura 3 - Unidade de cristal de HA. Ca: cálcio; Na: sódio; Mg: magnésio; Sr:

estrôncio; OH: hidróxido; Cl: cloreto; F: flúor; PO4 e HPO4: fosfato;

CO3: carbonato. ........................................................................................ 29

Figura 4 - Mecanismos envolvidos na relação entre deficiência de Mg e o

aparecimento da osteoporose. PTH: paratormônio; vit D: vitamina D. ..... 31

Figura 5 - Sequência cirúrgica para a confecção do defeito ósseo. (A) Tricotomia

da região da calvária. (B) Exposição do tecido ósseo. (C) Demarcação

do defeito ósseo na porção mediana da calvária. (D) Defeito ósseo

não crítico confeccionado. ........................................................................ 36

Figura 6 - Desenho esquemático do defeito não crítico em calvária de rato.

(a) Linha de referência para o corte transversal dos espécimes;

(b) área seccional do defeito após corte transversal. ............................... 37

Figura 7– GHAMg 15d. Preenchimento do defeito ósseo com as microesferas

(M) de HAMg em única camada. Na região próxima às bordas ósseas

(Bo) notam-se áreas de mineralização (*) associadas às microesferas

(M). Na região central do defeito observa-se um tecido conjuntivo

(Tc) com aspecto denso. Veia central (Vc). HE. Barra 300 µm. ............... 39

Figura 8– GHAMg 15d. Neoformação óssea (*) associada à borda óssea (Bo)

e ao biomaterial, de permeio às microesferas (M). Tecido conjuntivo

(Tc) circundando as microesferas ao longo do defeito. Veia central

(Vc). PIFG. Barra 300 µm. ........................................................................ 40

Figura 9 – GHAMg 15d. Deposição de matriz osteóide (*) associada à borda

óssea (Bo) e às microesferas (M) de HAMg. Microesferas preenchendo

o defeito e circundadas por tecido conjuntivo (Tc). PIFG. Barra 200 µm. 40

Figura 10– GHAMg 15d. Mineralização (*) ao redor e de permeio às microesferas

(M) deHAMg. Na região superior, onde não houve mineralização,

nota-se a presença de tecido conjuntivo (Tc) com aspecto denso.

HE. Barra 200 µm. .................................................................................... 41

Figura 11 – GHAMg 15d. Presença de tecido conjuntivo fibroso circundado as

microesferas (M) de HAMg. Reação inflamatória crônica (Ri)

granulomatosa moderada com células gigantes multinucleadas ( )

associadas ao biomaterial. HE. Barra 100 µm. ........................................ 41

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Figura 12 – GHAMg 15d. Estroma com tecido conjuntivo fibroso (Tc) e presença

de células gigantes multinucleadas ( ) circundando a microesfera

(M) de HAMg. HE. Barra 50 µm. .............................................................. 42

Figura 13 – GHAMg 45d. Presença de matriz osteóide (*) associada às bordas

ósseas (Bo) e ao longo do defeito em associação às microesferas (M)

que ocuparam toda a extensão do defeito ósseo. Presença de tecido

conjuntivo (Tc) na região central. HE. Barra 300 µm. ............................... 43

Figura 14 – GHAMg 45d. Mineralização (*) próxima às bordas ósseas e

circunjacente às microesferas (M) de HAMg. Tecido conjuntivo fibroso

(Tc) na região central do defeito circundando o biomaterial. HE. Barra

300 µm. .................................................................................................... 43

Figura 15 – GHAMg 45d. Tecido mineralizado em organização (*) circunjacente à

microesfera (M) de HAMg. Nota-se a presença de osteócitos ( ) e

tecido conjuntivo (Tc). HE. Barra 50 µm. .................................................. 44

Figura 16 – GHAMg 45d. Presença de tecido conjuntivo (Tc), rico em vasos

sanguíneos ( ) de permeio às microesferas (M) de HAMg.

Preenchimento do defeito com múltiplas camadas de biomaterial. HE.

Barra 200 µm. ........................................................................................... 44

Figura 17 – GHA 15d. Microesferas (M) de HA preenchendo toda a extensão do

defeito. Mineralização (*) próxima às bordas ósseas (Bo) e ao longo do

defeito em associação com as microesferas (M). Presença de tecido

conjuntivo (Tc) na região central. HE. Barra 300 µm. ............................... 45

Figura 18– GHA 15d. Mineralização (*) nas proximidades da borda óssea (Bo) e

circunjacente às microesferas (M) de HA. HE. Barra 200 µm. ................. 46

Figura 19 – GHA 15d. Presença de matriz osteóide neoformada (*) nas

proximidades da borda óssea (Bo) e circundando as microesferas (M)

de HA presentes nesta região. Deposição de tecido conjuntivo ( )

dentro da microesfera. PIFG. Barra 200 µm. ............................................ 46

Figura 20 – GHA 15d. Tecido conjuntivo (Tc) organizado na região superior do

defeito. Nota-se aspecto heterogêneo das microesferas de HA, algumas

têm aspecto mais denso (Md) outras mostram-se porosas (Mp). HE.

Barra 200 µm. ........................................................................................... 47

Figura 21 – GHA 15d. Presença de tecido conjuntivo circundando a microesfera

(M) de HA, associado à reação inflamatória crônica granulomatosa

(RI), com presença de células gigantes multinucleadas ( ). HE.

Barra 50 µm. ............................................................................................. 47

Figura 22 – GHA 45d. Presença de mineralização em, praticamente, toda

extensão do defeito circunjacente às microesferas (M) de HA. O

biomaterial preencheu todo o defeito e se organizou em múltiplas

camadas. HE. Barra 300 µm. ................................................................... 48

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Figura 23 – GHA 45d. Presença de matriz osteóide (*) associada à borda óssea

(Bo) e circundando a microesfera (M) de HA próxima a esta região.

PIFG. Barra 200 µm. ................................................................................ 49

Figura 24 - GHA 45d. Mineralização (*), com áreas já em organização,

circundando a microesfera (M) de HA. Presença de osteócitos. HE.

Barra 100 µm. ........................................................................................... 49

Figura 25 - GHA 45d. Presença de tecido conjuntivo (Tc), rico em vasos

sanguíneos ( ) de permeio as microesferas (M) de HA.

Preenchimento do defeito com múltiplas camadas de biomaterial.

HE. Barra 200 µm. .................................................................................... 50

Figura 26 – GHA 45d. Septos de tecido conjuntivo ( ) ao redor das

microesferas (M) de HA e também no interior de algumas

microesferas. PIFG. Barra 200 µm. .......................................................... 50

Figura 27 - GHA 45d. Presença de tecido conjuntivo (Tc) circundando as

microesferas (M) de HA, com presença de vasos sanguíneos (*) e

células gigantes multinucleadas ( ). HE. Barra 100 µm. ....................... 51

Figura 28 – GC 15d. Mineralização (*) restrita às bordas ósseas (Bo) e área

residual preenchida por tecido conjuntivo (Tc) em toda sua extensão.

Veia central (Vc). HE. Barra 300 µm. ....................................................... 52

Figura 29 – GC 15d. Mineralização (*) associada a borda óssea (Bo) com tecido

conjuntivo (Tc) em toda a área residual do defeito. HE. Barra 200 µm. ... 52

Figura 30 – GC 15d. Presença de tecido conjuntivo associado a uma reação

inflamatória crônica (Ri), infiltrado inflamatório monomorfonuclear.

Nota-se a presença de células fusiformes ( ) e vasos sanguíneos

(*). HE. Barra 50 µm. ................................................................................ 53

Figura 31 – GC 45d. Defeito ósseo preenchido por tecido mineralizado (*),

com a presença de uma pequena área de tecido conjuntivo (Tc) na

região central. Borda óssea (Bo). HE. Barra 300 µm. .............................. 54

Figura 32 – GC 45d. Presença de tecido conjuntivo fibroso (Tc) na região

central do defeito. Matriz osteóide (*). PIFG. Barra 100 µm. .................... 54

Figura 33 - Mensuração da extensão linear do defeito ósseo dos grupos

experimentais, nos pontos biológicos de 15 e 45 dias. ............................ 55

Figura 34 - Análise da razão de matriz osteóide neoformada na área seccional

total do defeito dos grupos experimentais, nos pontos biológicos de

15 e 45 dias. ............................................................................................. 56

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Número de animais de acordo com o grupo experimental e ponto

biológico. .................................................................................................. 35

Tabela 2 - Média (desvio-padrão) da extensão linear do defeito ósseo dos grupos

experimentais, nos pontos biológicos de 15 e 45 dias. ............................ 55

Tabela 3 - Média (± desvio-padrão) da área de matriz osteóide neoformada dos

grupos experimentais, nos pontos biológicos de 15 e 45 dias. ................ 56

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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

® Marca registrada

°C Graus Celsius

µm Micrômetro

Al Alumínio

AMM Área de matriz mineralizada do defeito

AT Área total do defeito

Bo Borda óssea

BSP Sialoproteína óssea

Ca Cálcio

CBPF/RJ Centro Brasileiro de Pesquisas Físicas/Rio de Janeiro

CEUA Comitê de Ética em Pesquisas no Uso de Animais

EBMSP Escola Bahiana de Medicina e Saúde Pública

EL Extensão linear do defeito

GHAMg Grupo defeito ósseo preenchido com hidroxiapatita dopada com magnésio

GHA Grupo defeito ósseo preenchido com hidroxiapatita

GC Grupo controle

HA Hidroxiapatita

HAMg Hidroxiapatita dopada com magnésio

HE Hematoxilina-eosina

ICS Instituto de Ciências da Saúde

LBTB Laboratório de Bioengenharia Tecidual e Biomateriais

M Microesferas

Md Microesferas densas

MEC Matriz Extracelular

Mg Magnésio

mL Mililitro

Mm Milímetros

Mo Matriz osteóide

Mp Microesferas porosas

nº. Número

OC Osteocalcina

ON Osteonectina

OP Osteopontina

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PIFG Picrossíriusred

PMMA Polimetilmetacrilato de metila

Ri Reação inflamatória crônica

Sr Estrôncio

Tc Tecido conjuntivo

Tcf Tecido conjuntivo frouxo

TCP Tricálcio fosfato

UEFS Universidade Estadual de Feira de Santana

UFBA Universidade Federal da Bahia

Vc Veia central

VM Vesículas da matriz

Zn Zinco

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SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 17

2 REVISÃO DE LITERATURA ................................................................................. 19

2.1 Tecido Ósseo ..................................................................................................... 19

2.1.1 Reparo Ósseo .................................................................................................. 21

2.2 Biomateriais ....................................................................................................... 22

2.2.1 Biomateriais substitutos ósseos ....................................................................... 24

2.2.2 Hidroxiapatita ................................................................................................... 28

2.2.3 Magnésio .......................................................................................................... 30

3 OBJETIVOS ........................................................................................................... 32

3.1 Objetivo Geral .................................................................................................... 32

3.2 Objetivos Específicos ....................................................................................... 32

4 METODOLOGIA .................................................................................................... 33

4.1 Biomateriais ....................................................................................................... 33

4.1.1 Processamento das microesferas .................................................................... 33

4.1.1.1 Preparação dos pós de HA ........................................................................... 33

4.1.1.2 Preparação das microesferas ........................................................................ 34

4.2 Etapa experimental ........................................................................................... 34

4.2.1 Amostra ............................................................................................................ 34

4.2.2 Técnica Cirúrgica ............................................................................................. 35

4.3 Etapa laboratorial .............................................................................................. 37

4.3.1 Processamento histológico ............................................................................... 37

4.4 Análise morfométrica ........................................................................................ 38

5 RESULTADOS ....................................................................................................... 39

5.1 Análise histomorfológica .................................................................................. 39

5.2.1 Extensão linear do defeito ósseo ..................................................................... 55

5.2.2 Área de matriz osteóide neoformada ............................................................... 56

6 DISCUSSÃO .......................................................................................................... 57

7 CONCLUSÕES ...................................................................................................... 61

REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 62

ANEXO ..................................................................................................................... 71

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17

1 INTRODUÇÃO

A Bioengenharia Tecidual Óssea é uma área emergente, interdisciplinar e

multiprofissional, que tem ganhado destaque, nos últimos anos, devido aos avanços

técnico-científicos e às demandas biomédicas e socioeconômicas. Nesta área os

princípios das ciências biológicas e das engenharias são utilizados para o

desenvolvimento ou aperfeiçoamento de biomateriais ou técnicas regenerativas que

melhorem ou restaurem a função tecidual comprometida1,2,3. Estes biomateriais

podem ser produzidos a partir de substratos metálicos; poliméricos, naturais ou

sintéticos; cerâmicos; ou uma mistura de dois ou mais tipos, denominados

compósitos4.

Os biomateriais devem apresentar propriedades físico-químicas e biológicas,

bem como morfologia, compatíveis com os tecidos vivos para atuarem como

arcabouços tridimensionais que favoreçam a regeneração tecidual ou para

substituírem de forma adequada os tecidos danificados ou perdidos5, 4. Dentre uma

grande variedade de materiais, as cerâmicas representam um grupo que tem sido

amplamente utilizado nas técnicas regenerativas ósseas e dentárias3, como nos casos

de pseudoartrose e perda óssea em alvéolos dentários. Dentre elas, aquelas à base

de fosfato de cálcio (Ca), principalmente a hidroxiapatita (HA) tem se destacado devido

à similaridade com componentes da fase mineral do tecido ósseo, por favorecer a

interação entre o tecido e o biomaterial, por sua boa biocompatibilidade, excelente

osteocondutividade6,7, ausência de toxicidade, local ou sistêmica6, 7 e por servir de

arcabouço tridimensional para os eventos celulares ocorridos durante a regeneração

tecidual, como a angiogênese e a neoformação óssea.

Aperfeiçoar as propriedades da HA é uma perspectiva promissora para a área

biomédica, uma vez que contribui para modificar e/ou melhorar a resposta tecidual a

este biomaterial. Como exemplo, têm-se as substituições isomórficas que mantêm a

estrutura hexagonal da HA7-9. Neste caso, o Ca da HA pode ser substituído por

metais como zinco (Zn), estrôncio (Sr) e magnésio (Mg)7,9. Estas substituições

modificam as propriedades físico-químicas deste biomaterial e podem interferir na

resposta tecidual ao mesmo.

O Mg é um íon interessante para ser utilizado nestas substituições, pois este

mineral tem grande importância nas fases iniciais da osteogênese, na qual está

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intimamente associado ao mecanismo de mineralização e atua sobre as células

ósseas, ao estimular a proliferação de osteoblastos10-12. Sua deficiência pode causar

danos à rigidez óssea e, consequentemente, aumentar os riscos a osteoporose13,12.

Aproximadamente de 53% do Mg distribuído pelo corpo humano está depositado no

tecido ósseo11,12.

Uma vez instituídas estas incorporações na HA sintética, faz-se necessária a

realização de novos estudos para avaliar seu comportamento in vivo, quando em

contato com os fluidos corpóreos, visto que estas substituições alteram a

cristalinidade, a solubilidade, os parâmetros de rede, estabilidade térmica e

reatividade superficial14,9, a bioatividade, a biocompatibilidade10 e as propriedades de

adsorção da estrutura da HA15.

Diante do exposto, fica evidente a necessidade de realizar estudos

experimentais, in vitro e in vivo, capazes de elucidar as interferências das novas

características físico-químicas da HA dopada com Mg no reparo tecidual. Assim, este

estudo teve como objetivo avaliar, in vivo, a biocompatibilidade e o potencial

osteogênico de microesferas de HA dopadas ou não com Mg, produzidas com

tecnologia nacional, em defeito ósseo não crítico na calvária de rato.

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19

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Tecido Ósseo

O tecido ósseo é um tipo de tecido conjuntivo especializado, metabolicamente

ativo, rico em matriz extracelular (MEC) e diferentes tipos celulares: osteoblastos,

osteócitos e osteoclastos. Estas células estão imersas em uma MEC mineralizada,

composta pelas fases orgânica e inorgânica, que associadas proporcionam

resistência e resiliência, dureza a este tecido16.

A arquitetura macroscópica deste tecido divide-se em cortical ou compacto e

esponjoso ou trabecular17,18. O primeiro é denso, encontra-se na região mais

periférica do tecido ósseo e resiste melhor ao estresse mecânico, quando comparado

ao esponjoso. Este último é trabeculado, pois apresenta espaços intercomunicantes

que abrigam a medula óssea e não suporta forças mecânicas excessivas18-20.

As superfícies ósseas, internas e externas, são revestidas, respectivamente,

pelo endósteo e periósteo, membranas que apresentam grande importância para a

integridade do tecido ósseo18. O periósteo é constituído de duas camadas uma

externa, rica em vasos sanguíneos e nervos, fibroblastos e fibras de colágeno, com

núcleos intensamente corados, esparsos em meio à MEC17,19. A outra camada,

interna, denominada “cambium”19, é composta de dois tipos celulares: I) células

fusiformes com núcleos alongados, da linhagem osteogênica e II) células

arredondadas e caracterizadas pela grande quantidade de citoplasma basofílico, em

contato direto com a superfície do osso; são os osteoblastos. Esta membrana

encontra-se ausente nas superfícies articulares. Já o endósteo é composto por uma

única camada achatada de osteoblastos quiescentes20.

Os três tipos celulares presentes no tecido ósseo, osteoblastos, osteócitos e

osteoclastos são responsáveis, respectivamente, pela síntese, manutenção e

reabsorção da MEC20. Os osteoblastos originam-se de células mesenquimais

indiferenciadas e apresentam-se como células cubóides, mononucleadas,

polarizadas, com núcleo esférico e citoplasma basófilo. Estas células são

responsáveis pela síntese da matriz orgânica do tecido ósseo, bem como pela sua

mineralização18. Quando são encontradas na superfície óssea com o aspecto

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ligeiramente alongado formando uma camada contínua, são denominadas de células

de revestimento ósseo18,21,20. Os osteoblastos que ficam aprisionados na matriz

óssea mineralizada tornam-se osteócitos20,21, células que mantêm e preservam a

MEC deste tecido17. Estas células são fundamentais para a remodelação óssea,

uma vez que possuem receptores para hormônios como, por exemplo, da tireóide

e da paratireoide, estrogênios, glicocorticóides, insulina, vitamina D (1,25

Dihidroxivitamina D3)18.

Os osteoclastos são formados a partir de células do sistema monocítico-

fagocitário, que se fusionam e originam as células multinucleadas22,23. Caracterizam-

se bioquimicamente por apresentar diferentes tipos de enzimas: fosfatase ácida

resistente ao tartarato, adenosina ácida trifosfatadavanadato sensitiva,

isosimaanidrase carbônica II, entre outras, sendo responsáveis pela reabsorção

óssea, dentro das denominadas lacunas de Howship18.

Recentes avanços levaram a descoberta do sistema chave de regulação

molecular para a remodelação óssea, mecanismos moleculares e as proteínas

envolvidas no processo de reabsorção óssea. Atualmente, compreende-se que este

processo é controlado por um sistema composto por três proteínas: o receptor

ativador do fator nuclear kappa-beta (RANK), o ligante do receptor ativador do fator

nuclear kappa-beta (RANKL) e a osteoprotegerina (OPG)24. A estimulação,

diferenciação e ativação de osteoclastos é estimulado quando o RANKL se liga ao

seu receptor RANK. Esse efeito estimulante é inibido por seu antagonista (OPG), que

impede a ligação do RANKL com o receptor RANK, inibindo a reabsorção óssea, ou

seja, inibe a ativação e diferenciação dos osteoclastos. O sistema RANK também

contribui para a reabsorção óssea induzindo a expressão de uma proteinase

(catepsina K), que é produzida por osteoclastos ativados e está envolvida com a

solubilização da matriz óssea22. Osteoporose pós-menopausa, artrite reumatóide,

doença periodontal, tumores ósseos benignos e malignos, metástases ósseas,

doença de Paget e hipercalcemia maligna, são algumas das patologias relacionadas

com as anormalidades nesse sistema25. A deficiência de OPG resulta em

osteoporose, pela maior reabsorção óssea26.

A MEC do tecido ósseo é constituída por componentes orgânico e inorgânico.

O componente orgânico corresponde a 1/3 do tecido ósseo e é também denominado

de matriz orgânica. Esta matriz dá forma ao osso e garante sua resistência tênsil. Os

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outros 2/3 formam a matriz inorgânica composta por sais minerais de fosfato de

cálcio, carbonatos, sódio, flúor, citrato e magnésio14,17. As porções, orgânica e

inorgânica, da matriz interagem para fornecer propriedades mecânicas de

elasticidade, resistência e dureza, características do tecido ósseo20.

A matriz orgânica é composta principalmente por colágeno tipo I, cerca de

90%18,27. Entretanto, proteoglicanas e glicoproteínas adesivas, proteínas não

colagênicas, como osteopontina (OP), sialoproteína óssea (BSP), osteonectina (ON)

e osteocalcina (OC), também fazem parte desta matriz18,20,28. Estas proteínas

auxiliam na formação da matriz tridimensional deste tecido e na interação célula-

célula, célula-matriz29, células-fatores de crescimento e deposição de sais minerais.

A parte inorgânica da MEC do tecido ósseo é constituída, principalmente, por

fosfato de cálcio, organizado como cristais de HA – apatita biológica18,30. Ademais,

podem também ser encontrados, em menor quantidade, bicarbonato, sódio,

potássio, citrato, Mg, carbonato, lactato, fluoreto, Zn, bário e Sr18,26,31. O Mg é o

quarto cation mais abundante no corpo humano e cerca de 53% é encontrado

naturalmente no osso, principalmente, no cortical32. Este micronutriente é

depositado, em sua maioria, na superfície dos cristais de HA33.

2.1.1 Reparo Ósseo

Durante o reparo ósseo, eventos como inflamação, fibroplastia e remodelação,

que ocorrem durante a cicatrização normal de feridas em tecidos moles, também

ocorrem. Após uma fratura ou lesão óssea, ocorre ruptura vascular, que ativa a

cascata de coagulação, seguida da formação de hematoma19,34. As extremidades

ósseas no local de fratura, privadas de seu suprimento sanguíneo, tornam-se

necróticas e são reabsorvidas pelos osteoclastos17. O comprometimento do

suprimento sanguíneo também priva os osteócitos de nutrientes essenciais, os quais,

consequentemente, morrem.

Mediadores inflamatórios liberados pelas plaquetas fazem com que os vasos

sanguíneos dilatem-se e exsudem plasma, levando à formação de edema17. Neste

momento, as células inflamatórias, incluindo leucócitos polimorfonucleares, seguidos

por macrófagos e linfócitos, migram para a região. À medida que a resposta

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inflamatória regride, o tecido necrótico e o exsudato são reabsorvidos, e os

osteoblastos aparecem e começam a produzir nova matriz osteóide17,35.

À medida que o reparo progride, o pH gradualmente retorna a neutro e a seguir

fica alcalino; assim a atividade da fosfatase alcalina é otimizada e promove a

mineralização do calo da fratura17. Este evento leva à proliferação das células do

periósteo e à formação do calo ósseo na área lesionada, com consequente

neoformação óssea, constituída, inicialmente, por osso imaturo, gradualmente

substituído por osso lamelar20. Ao mesmo tempo, há neoformação vascular, a partir

de vasos sanguíneos já existentes. E, finalmente, ocorre a remodelação tecidual e

redução do tecido neoformado para o tamanho ósseo inicial36, 37.

Devido a este potencial regenerativo, semelhante ao da osteogênese

embriológica34, defeitos ósseos pequenos reparam-se por regeneração e sem a

formação de cicatriz fibrosa19. Em contrapartida, situações em que a morfologia e

dimensão do defeito são extensas e críticas ao reparo, o mecanismo regenerativo

torna-se limitado, e dessa forma há deposição de tecido conjuntivo, formando cicatriz

fibrosa38-40. Esta condição pode comprometer tanto a estética quanto a função do

tecido38,41.

2.2 Biomateriais

Define-se como biomaterial (Figura 1) qualquer substância ou combinação de

substâncias, natural ou não, que não sejam drogas ou fármacos, utilizados em

aplicações biomédicas e que interagem com sistemas biológicos, que tratam,

aumentam ou substituem quaisquer tecidos, órgãos ou funções do corpo42,43.

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Figura 1 - Tipo de biomateriais. (A) Biomaterial metálico, placas em titânio para reconstrução facial; (B) Biomaterial polimérico, polietileno para implante de queixo e (C) Biomaterial cerâmico, cimento de HA, para preenchimento ósseo.

Fonte: Adaptado de MAIA, et al (2010)115.

A primeira geração de biomateriais data do início do século XX até a década de

197044. Esta foi baseada na procura de materiais denominados inertes. Teoricamente

estes biomateriais não estimulariam nenhuma resposta tecidual, nem inflamatória, nem

infecciosa no local da implantação43. Vários tipos de materiais foram testados e

utilizados, como, por exemplo, as cerâmicas (alumina totalmente densa e zircônia); os

metais nobres (platina, liga cromo-cobalto e titânio); os polímeros (silicone,

politetrafluoretileno/teflon e polimetilmetacrilato de metila/PMMA), dentre outros43.

A segunda geração de biomateriais surgiu na década de 70, onde o foco era

o conceito de biocompatibilidade – comportamento celular após contato do

biomaterial com o tecido ao qual foi implantado – e a biodegradabilidade – fenômeno

em que o material é degradado ou solubilizado em fluidos tissulares, desaparecendo

do sítio de implantação45,43. Deste modo, surgiu novo questionamento referente à

forte relação entre a biocompatibilidade-bioinerticidade, dando origem a uma classe

de biomateriais: os denominados bioativos43. A bioatividade pode ser definida como

sendo a capacidade de um material estimular a ligação interfacial entre tecidos vivos

e o material, sem a formação de cápsula fibrosa que separa o biomaterial do tecido43.

A terceira geração inclui os materiais capazes de estimular respostas celulares

específicas no nível molecular46. Nesta geração os conceitos de bioatividade e

A B

C

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biodegradabilidade se combinam em um determinado material44. Recentemente, o

conceito de materiais bioinertes foi abandonado, devido às evidências de que todo

material provoca algum tipo de resposta no organismo43.

Essas três gerações são interpretadas de forma conceitual e não cronológica,

visto que cada uma delas representa uma evolução nas propriedades dos materiais

envolvidos, de acordo com as necessidades e exigências que surgiam44.

2.2.1 Biomateriais substitutos ósseos

Os pesquisadores da Bioengenharia Tecidual Óssea buscam restabelecer a

estrutura e funcionalidade do tecido ósseo perdido47. Para isto, enxertos ósseos

podem ser utilizados, os quais são classificados de acordo com sua natureza e

origem em quatro grandes famílias (Figura 2)48,49: Autógenos – obtidos de áreas

doadoras do próprio indivíduo; Homógenos – provenientes de doadores da mesma

espécie; Xenógenos – provenientes de doadores de espécie diferente do receptor; e

Aloplásticos ou biomateriais – têm origem sintética e podem ser confeccionados em

laboratórios a partir de materiais metálicos, cerâmicos e/ou poliméricos, naturais ou

sintéticos48,49.

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Figura 2 - Classificação dos materiais de acordo com sua origem e interação com o meio fisiológico.

Fonte: OLSSON, et al. (2008)50.

Quanto ao comportamento biológico, a classificação dos biomateriais é

baseada na resposta do tecido hospedeiro43,49,50.

Bioinertes - aqueles que não provocam reação de corpo estranho no

organismo, encontrando-se em ligação direta ao tecido receptor.

Exemplos: cerâmicas e polímeros.

Biotoleráveis - são moderadamente aceitos pelo tecido receptor,

geralmente envolvidos por cápsula fibrosa. Exemplos: metais e

polímeros.

Bioativos - existe a formação de uma ligação direta aos tecidos vivos,

pois geralmente tem na sua composição íons de cálcio ou fósforo que

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vão estabelecer uma ponte química com o osso envolvente, sem a

formação de cápsula fibrosa que separa o biomaterial do tecido

Exemplos: cerâmicas (hidroxiapatita).

Biodegradáveis/Reabsorvíveis - são lentamente degradáveis

desaparecendo do sítio de implantação. Exemplos: cerâmicas (fosfato

tricálcico) e alguns polímeros.

Tendo em vista os problemas relacionados com a obtenção de quantidade

ideal de enxerto, morbidade do sítio doador, no caso de enxertos autógenos, e com

a antigenicidade, em relação aos homógenos e xenógenos, uma grande variedade

de biomateriais vem sendo desenvolvidos nos últimos anos (Figura 2)51-53.

Atualmente, para a utilização como substitutos do tecido ósseo, existem

diversos biomateriais que variam não somente em relação à sua origem e

composição química (metálicos, cerâmicos, poliméricos e compósitos)54,49, mas

também quanto à sua ação mecânica e configuração espacial (arcabouços

tridimensionais, pós, grânulos, microesferas, hidrogéis, entre outros)54.

Os biomateriais cerâmicos têm sido utilizados desde 1892, com o emprego do

gesso de Paris (sulfato de Ca), como um cimento para fixação de fraturas e

preenchimento de defeitos ósseos55. Entre as cerâmicas mais estudadas, aquelas à

base de fosfato de Ca (HA, fosfato tricálcio, carbonato de cálcio,vidros bioativos e

vitrocerâmicas sintéticas) vêm sendo amplamente utilizadas na recuperação e

substituição óssea, uma vez que possuem características de superfície bioativa49,

43,51. Existem várias fases de fosfatos de Ca: bruxita [CaH(PO4)2H2O], fosfato

tricálcico (TCP) [Ca3(PO4)2] e a HA[Ca10(PO4)6(OH)2], sendo esta muito similar à fase

inorgânica do tecido ósseo humano49,56.

Devido à biocompatibilidade, bioatividade e características de osteocondução,

os biomateriais cerâmicos como a HA e TCP têm recebido grande atenção como

materiais de preenchimento, espaçadores e substitutos para os enxertos ósseos43,57-60.

Principal desvantagem do TCP quando comparado a HA é sua rápida reabsorção56.

Dentre as cerâmicas utilizadas, a HA sintética demonstra propriedade

osteocondutora61,62, similaridade com o componente inorgânico do tecido ósseo e

biocompatibilidade. Assim, tem sido indicada em alguns casos de reparo periodontal,

levantamento de seio maxilar63 e em preenchimento de alvéolos dentários64. Esta

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cerâmica pode ser produzida em diferentes formas (pó, partículas, pastilhas, blocos ou

microesferas), tamanho, textura, grau de porosidade (macro ou microporoso), grau de

cristalinidade (cristalino ou amorfo) e solubilidade (absorvíveis ou não absorvíveis)51-53.

Estas cerâmicas podem ser produzidas por uma série complexa e demorada

de reações de síntese utilizando, principalmente, carbonato de cálcio e ácido

fosfórico65. Ao final dessas reações de síntese, obtêm-se as cerâmicas na forma de

um pó, isto é, constituídas por um aglomerado de partículas em simples justaposição,

mantidas juntas por ligações muito fracas. Nessas condições, as cerâmicas

apresentam quase nenhuma propriedade mecânica, e essa forma é utilizada para a

preparação de amostras, chamadas de “verdes”, que posteriormente são submetidas

ao processo de sinterização65.

As cerâmicas “verdes” podem ser preparadas de diferentes maneiras, em

geral, exercendo-se uma carga sobre uma quantidade de pó a fim de se obter uma

amostra compactada. As técnicas mais comumente utilizadas para isso são: pressão

uniaxial, vazamento em moldes (onde não se utiliza carga), pressão uniaxial em altas

temperaturas e pressão isostática em altas temperaturas. Nessas duas últimas, a

preparação de amostras e sinterização são efetuadas ao mesmo tempo65.

A sinterização é o tratamento térmico que é dado às amostras de cerâmica

“verde”. Nesse processo ocorre a progressiva transição daquele estado de

aglomeração, partículas em simples justaposição, para uma unidade na qual as

partículas fundem-se umas com as outras. Durante esse processo, ocorrem várias

modificações nas cerâmicas, tais como: diminuição da área de superfície, diminuição

do volume da amostra, aumento da fase cristalina e aumento das propriedades

mecânicas. A diminuição do volume da amostra se dá como consequência da

densificação da cerâmica durante a sinterização, a qual, por sua vez, determina o

nível de porosidade65.

As cerâmicas devem possibilitar a adesão, proliferação e diferenciação das

células que em sua direção migrarem; ser porosas para possibilitar a formação e

crescimento vascular de permeio aos seus poros ou no interstício observado entre

suas esferas ou partículas; ter biodegradação controlada para permanecer no local

implantado por um período necessário e assim estimular reações químicas e

biológicas favoráveis à sua função; e desencadear reação tecidual mínima28, 66-68. O

tamanho dos poros da cerâmica é inversamente proporcional ao aumento de

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temperatura de sinterização. Assim, quanto mais elevada a temperatura, menor

número de poros43,60-70. Entretanto, sua capacidade de resistência à compressão até

uma temperatura de 1.525 ºC possui relação direta com essa temperatura69.

As principais limitações do uso de fosfatos de cálcio em biomateriais são as

suas propriedades mecânicas, uma vez que são frágeis e apresentarem baixa

resistência à fadiga71,72. As cerâmicas porosas apresentam esta característica mais

acentuada. Entretanto, acredita-se que uma porosidade superior a 100 µm de

diâmetro favorece vascularização adequada, colonização de células ósseas e

difusão de nutrientes71.

2.2.2 Hidroxiapatita

A HA [Ca10(PO4)6(OH)2] é um fosfato de cálcio hidratado e o principal

constituinte inorgânico do osso, cerca de 95%43. O termo “hidroxi” corresponde ao

grupo hidroxila e “apatita” é um nome do mineral. A HA biológica é composta por íons

em concentrações diversas, tais como cálcio, magnésio, sódio, flúor e outros43.

Quanto à distribuição do magnésio no corpo humano, cerca de 99% do total

encontra-se nos ossos, músculos e tecidos moles. No caso de alterações agudas na

concentração plasmática de magnésio, ocorrerá a permutação deste íon a partir do

tecido ósseo. Em geral, um terço de magnésio esquelético é permutável, servindo

como um reservatório para manter níveis fisiológicos de magnésio extracelular. Os

níveis de concentração de magnésio intracelular variam de 5 a 20 mmol/L; sendo 1-

5% ionizado, o restante encontra-se ligado às proteínas, moléculas carregadas

negativamente e trifosfato de adenosina (ATP). A concentração de magnésio

extracelular corresponde a 1% de total de magnésio no corpo, que se encontra

principalmente no soro e células vermelhas do sangue33.

O magnésio é depositado na superfície da HA como parte integrante dos

cristais (Figura 3) e sua liberação segue à reabsorção óssea33. Em menor quantidade

também é depositado na camada ao redor do cristal, tornando-se um reservatório de

Mg permutável, útil para manter as concentrações extracelulares fisiológicas durante

alterações agudas deste micronutriente no sangue33.

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Figura 3 - Unidade do cristal de HA. Ca: cálcio; Na: sódio; Mg: magnésio; Sr: estrôncio; OH: hidróxido; Cl: cloreto; F: flúor; PO4 e HPO4: fosfato; CO3: carbonato.

Fonte: JAHNEN-DECHENT; KETTELER (2012)33.

Devido às suas características físico-químicas e microestrutural similares

àquelas da matriz inorgânica do tecido ósseo, a HA tem destaque tanto nas

pesquisas científicas quanto nas aplicações clínicas30. De um modo geral, HA

sintéticas são biocompatíveis; osteocondutoras, já que favorecem o crescimento

ósseo em direção a suas partículas; e bioativas, por estabelecer união direta com o

tecido ósseo do sítio de implantação, possibilitando assim a migração e proliferação

de fibroblastos e osteoblastos em associação à sua estrutura6,43,60,73,74.

A partir de reações em sistemas aquosos, por precipitação ou hidrólise,

reações hidrotermais ou reações em estado sólido, pode-se obter a HA. Quando

preparada pelos métodos de precipitação ou hidrólise, a apatita obtida é geralmente

deficiente em Ca (razão molar Ca/P é menor que o valor estequiométrico 1,67 para

HA) e baixa cristalinidade43. Caso a reação de precipitação seja realizada em pH

muito básico, o precipitado conterá carbonato, que fará razão molar Ca/P maior que

valor estequiométrico43.

A HA pode ser sintetizada com relativa facilidade em laboratório, com

diferenças nas características físico-químicas, formas de apresentação e

formatos9,73. Quando produzidas no formato de microesferas, estas cerâmicas

tornam-se promissoras para a regeneração óssea, visto que possibilitam a secreção

e difusão de fatores de crescimento e nutrientes; migração e proliferação de células

fusiformes e osteoprogenitoras; síntese de MEC; neovascularização e reparo

tecidual de permeio às microesferas77-79.

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A implantação destas biocerâmicas pode ser feita por meio de técnicas

cirúrgicas minimamente invasivas, dando celeridade à recuperação do paciente com

menor tempo de internamento e, consequentemente, menor risco de infecções

secundárias80. Todavia, vale ressaltar que, devido a sua baixa resistência mecânica,

a utilização destas cerâmicas pode ser limitada em alguns casos, especialmente

quando o defeito ósseo a ser reparado está em regiões anatômicas que estão sob

constante tensão49,78,81,82.

Pesquisadores têm considerado a habilidade de efetuar substituições

isomórficas na HA, sem perder seu arranjo estrutural hexagonal7-9 e têm permutado

íons de cálcio por zinco, estrôncio, flúor, Mg7,9 entre outros, com objetivo de melhorar

suas propriedades físico-químicas e osteogênicas.

2.2.3 Magnésio

O Mg é um micronutriente essencial ao metabolismo corporal e com grande

relevância para as funções celulares11. Em seres humanos, é o quarto cátion mais

abundante e o segundo no meio intracelular11,83. Do total de Mg corpóreo, cerca de 53%

é encontrado no tecido ósseo, 27% nos compartimentos intracelulares do músculo e

19% nos tecidos moles. O 1% restante é encontrado no soro e nos eritrócitos11,83.

O íon Mg é necessário para a síntese de ATP11,12,84, de ácidos nucléicos e de

proteínas; participa de reações mitocondriais11,12,85 e atua como cofator em mais de

300 reações enzimáticas, influenciando indiretamente o metabolismo mineral11,83,84.

Além disso, este íon está intimamente associado ao mecanismo de mineralização,

uma vez que interfere na cinética da nucleação de apatita biológica durante a

osteogênese, e pode reduzir sua cristalinidade10,12. Portanto, não é surpreendente que

as alterações na homeostase do Mg impacte sobre as funções de células e tecidos11.

O Mg é muito abundante durante as fases iniciais da osteogênese, quando

estimula a proliferação dos osteoblastos, devido a sua influencia sobre a mitose

destas células13. E a sua depleção causa fragilidade e perda óssea, e,

consequentemente, risco de osteoporose (Figura 4)11-13.

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Figura 4 - Mecanismos envolvidos na relação entre deficiência de Mg e o aparecimento da

osteoporose. PTH: paratormônio; vit D: vitamina D.

Fonte: Adaptado de CASTIGLIONI, et al. (2013)11.

Na resposta imunoinflamatória, o estudo de86 demonstrou que, na deficiência

de Mg, há um aumento no número de leucócitos polimorfonucleares circulantes,

havendo um aumento na atividade fagocítica e uma maior produção de espécies

reativas de oxigênio responsáveis pela maior destruição tecidual. Nesse mesmo

estudo foi observado ainda que a maior concentração extracelular deste íon inibe a

formação de radicais livres.

A incorporação de metais em biomateriais para substituição óssea é uma

abordagem atrativa para modificar as propriedades mecânicas e biológicas destes

materiais87. Dada a relevância biológica do magnésio, muitas equipes de pesquisa têm

trabalhado na síntese de HA e fosfatos de cálcio contendo baixos níveis de Mg, para

melhorar a sua bioatividade13. Deste modo, a incorporação de Mg na estrutura da HA é

de grande interesse a fim de tentar elucidar o papel do Mg no tecido ósseo. De acordo

com a literatura, a substituição de cálcio pelo magnésio em HA é limitado. Isto está

relacionado com a grande diferença de tamanho entre íons de magnésio e íons de

cálcio, o que leva a fortes deformações da estrutura HA e reduz a sua cristalinidade13.

A adição de Mg à estrutura hexagonal da HA, por meio da substituição parcial

dos íons de Ca por Mg, favorece a diminuição da cristalinidade da HA e,

consequentemente, aumenta a dissolução desta cerâmica10. A substituição do Ca pelo

Mg tem despertado grande interesse científico e clínico, uma vez que as cerâmicas

dopadas mostraram-se, in vitro, biocompatíveis e não apresentaram toxicidade26,89,

tornando esses novos biomateriais promissores para a regeneração óssea90.

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32

3 OBJETIVOS

3.1 Objetivo Geral

Avaliar, in vivo, a resposta tecidual após a implantação de microesferas de HA

dopadas ou não com Mg, em defeito ósseo não crítico, na calvária de rato.

3.2 Objetivos Específicos

Descrever, por meio da análise histomorfométrica, o comportamento biológico

das microesferas de HA dopada, ou não, com Mg, após 15 e 45 dias de pós-

operatório.

Caracterizar o reparo ósseo por microscopia óptica após a implantação das

microesferas supracitadas, nos mesmos períodos de análises.

Identificar se o Mg incrementou a capacidade osteogênica da HA.

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33

4 METODOLOGIA

Esta pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética no Uso de Animais (CEUA),

Escola Bahiana de Medicina e Saúde Pública (EBMSP) (Protocolo nº02/2013 CEUA-

EBMSP) (Anexo A) e foi desenvolvida de acordo com as Normas de Ética em

Pesquisa com Animais, bem como os Princípios de Biossegurança. Os animais foram

cedidos e mantidos no Biotério Central da Universidade Estadual de Feira de

Santana (UEFS-BA), onde os procedimentos cirúrgicos foram desenvolvidos.

4.1 Biomateriais

Os biomateriais utilizados neste estudo foram desenvolvidos, preparados e

fornecidos por pesquisadores do Centro Brasileiro de Pesquisas Físicas (CBPF), sob

supervisão do pesquisador Alexandre Malta Rossi.

4.1.1 Processamento das microesferas

4.1.1.1 Preparação dos pós de HA

Para a síntese da HA, utilizaram-se soluções de nitrato de Ca e nitrato de Mg

(teores molares de 1%), e fosfato dibásico de amônio. Primeiramente, preparou-se

uma solução de nitrato de Ca [Ca(NO3)2.4H2O] e nitrato de Mg (Mg(NO3)2.6H2O) com

concentração total de cátions de 0,2M ou 0,20 moles/1000mL. Com auxílio de uma

bomba peristáltica com fluxo de 4,5 mL/min, gotejou-se esta mistura sobre uma

solução de fosfato dibásico de amônio, (NH4)2HPO4 com concentração 0,20M ou 0,12

moles/600mL, mantendo-se o pH 9,0 com hidróxido de amônio concentrado

(NH4OH), temperatura de 90ºC e agitação mecânica de 240rpm. Esta mistura

permaneceu em digestão por três horas nas mesmas condições, sendo então filtrada

em funil de Buckner e ressuspensa em água MilliQ a 90ºC, por três vezes, até obter

pH 7,0 na água de lavagem. O sólido obtido foi seco por liofilização por 24 horas.

Finalmente, o material obtido foi macerado e peneirado em peneira menor que 74µm.

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4.1.1.2 Preparação das microesferas

Os pós de HA substituída com 1% molar de magnésio (HAMg), menores que

74 µm, foram misturados a uma solução de alginato de sódio 1% v/v até a formação

de pasta cerâmica. Por extrusão, com o auxílio de uma seringa com agulha (0,55 x

20mm), a pasta cerâmica foi, então, gotejada em uma solução de cloreto de Ca

(CaCl2) 0,15M, onde imediatamente foram formadas as microesferas. Estas ficaram

em solução de cloreto de Ca durante 24h e, após este período, foram lavadas com

água MilliQ e secas por liofilização. As microesferas obtidas foram peneiradas

utilizando-se peneiras com abertura na faixa de 425 a 600µm de diâmetro.

Após esta etapa as microesferas foram sinterizadas em forno mufla durante

27h, sob rampa crescente de aquecimento (17h até atingir 550ºC; 550ºC por 2h; 6h

até atingir 1100ºC e 1100ºC por 2h). A temperatura de 1100ºC corresponde ao

processo de sinterização.

4.2 Etapa experimental

4.2.1 Amostra

Foram utilizados 24 ratos machos (Rattus norvegicus) albinos, da linhagem

Wistar, com peso corporal entre 350g e 400g e idade aproximada de 3 a 4 meses,

fornecidos pelo Biotério Central da UEFS.

Os animais foram distribuídos aleatoriamente para a composição de três

grupos experimentais, com quatro animais em cada, avaliados nos ponto biológicos

de 15 e 45 dias de pós-operatório: Grupo HAMg (GHAMg) – defeito ósseo não crítico

preenchido com microesferas de HA dopadas com Mg; Grupo HA (GHA) – defeito

ósseo não crítico preenchido com microesferas de HA preparadas pela mesma rota,

porém sem Mg; Grupo Controle (GC) – defeito ósseo não crítico sem biomaterial de

preenchimento (Tabela 1).

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Tabela 1 – Número de animais de acordo com o grupo experimental e ponto biológico.

Ponto Biológico

Grupo experimental 15 dias 45 dias Total

GHAMg 4 4 8

GHA 4 4 8

GC 4 4 8

TOTAL 12 12 24

Durante todo o experimento os animais receberam ração sólida (Nuvital®) e

água ad libitum; foram mantidos em caixas plásticas forradas com maravalha de

pinus, autoclavada e trocada diariamente, conforme grupo e ponto biológico. Na

etiqueta de identificação ainda constava a massa corporal do animal, data da cirurgia

e do sacrifício, e nome do pesquisador.

4.2.2 Técnica Cirúrgica

Esta etapa somente foi iniciada após aprovação do projeto de pesquisa pelo

CEUA-EBMSP. Estes procedimentos cirúrgicos foram realizados no Biotério Central

da UEFS, onde os animais foram mantidos durante todo o período experimental.

Previamente à realização do procedimento cirúrgico, os animais foram

submetidos à analgesia e sedação com injeção intramuscular de cloridrato de

quetamina 2% na proporção de 0,1 mL/100g de massa corporal e cloridrato de xilazina

a 2% na proporção de 0,04 mL/100g de massa corporal. Em seguida, os animais foram

tricotomizados na região da calvária, posicionados em decúbito ventral e submetidos

à antissepsia com álcool iodado do campo operatório (Figura 5A).

A técnica cirúrgica empregada na confecção do defeito foi a mesma descrita

na literatura39, contudo, vale ressaltar que o defeito confeccionado no nosso estudo

foi de 5 mm. Nesta técnica, o acesso cirúrgico à porção mediana da calvária foi obtido

com uma incisão cutânea semilunar com aproximadamente 3cm de extensão,

mediante a utilização de lâmina de bisturi nº15, seguida da exposição do periósteo e

sua remoção, para exposição do tecido ósseo (Figura 5B).

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Posteriormente, o defeito ósseo circular não crítico transfixado com,

aproximadamente, 5,0 mm de diâmetro foi confeccionado75,76,91 na porção mediana

da calvária a partir do vértice da sutura craniana posterior (Figura 5C e 5D). Para

isto, foi utilizada uma fresa trefina (Dentoflex®) com 5mm de diâmetro, montada em

contra ângulo (Driller®) com redução de 16:1, acoplado em motor para implante

(Driller®), a 1500rpm, sob irrigação constante com solução fisiológica. Por fim, os

biomateriais utilizados foram implantados no defeito ósseo, exceto para o grupo

controle, no qual não houve implantação de biomaterial. Em seguida, o retalho foi

reposicionado e suturado com pontos interrompidos com fio de seda 4.0 (Ethicon®,

Johnson & Johnson).

Figura 5 - Sequência cirúrgica para a confecção do defeito ósseo. (A) Tricotomia da região da calvária.

(B) Exposição do tecido ósseo. (C) Demarcação do defeito ósseo na porção mediana da

calvária. (D) Defeito ósseo não crítico confeccionado.

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4.3 Etapa laboratorial

4.3.1 Processamento histológico

Após 15 e 45 dias de pós-operatório, os animais foram submetidos a eutanásia,

mediante aprofundamento anestésico com dose letal de cloridrato de quetamina.

Posteriormente, removeu-se a porção superior da calvária, e os tecidos moles foram

descartados e o espécime fixado em formaldeído a 4% durante sete dias.

Após este período as calvárias foram reduzidas com disco de carborundum

(nº. 409) acoplado a um mandril e a um motor elétrico rotativo (Dremel®). Durante

esta etapa o defeito foi cortado ao meio (Figura 6), os espécimes descalcificados em

ácido nítrico (5%) por duas horas e incluídos em parafina. Os cortes obtidos, com

5µm de espessura, foram corados em hematoxilina-eosina (HE) e picrossírius red

(PIFG) e, posteriormente, examinados por microscopia de luz comum (Leica®

DM1000) para análise histomorfométrica. O processamento histológico foi realizado

no Instituto de Patologia Geral e Cutânea – IPAC.

Figura 6 - Desenho esquemático do defeito não crítico em calvária de rato. (a) Linha de referência

para o corte transversal dos espécimes; (b) área seccional do defeito após corte transversal.

Fonte: Adaptado de Rolim (2010)92.

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4.4 Análise morfométrica

Na avaliação morfométrica, mensurou-se os seguintes parâmetros: extensão

linear do defeito (EL), área de matriz mineralizada do defeito (AMM), nos 03 grupos

da pesquisa, com pontos biológicos de 15 e 45 dias, calculando-se a média, o desvio

padrão e o valor de p (ANOVA). Para tanto, utilizou-se o Sistema de Análise de

Processamento de Imagens QWin 3.1 (Leica®), a partir da análise de imagens

obtidas pela câmera digital (Leica® DFC 310 FX) acopladas ao microscópio de luz

comum (Leica® DM1000). Esta etapa foi realizada no Laboratório de Bioengenharia

Tecidual e Biomateriais (LBTB) do Instituto de Ciências da Saúde (ICS) da

Universidade Federal da Bahia (UFBA).

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5 RESULTADOS

5.1 Análise histomorfológica

GHAMg

Aos 15 dias, observou-se que o biomaterial preencheu toda a extensão e

espessura do defeito (Figura 7). As microesferas caracterizaram-se por um aspecto

mais denso. Notou-se que a neoformação óssea foi observada além das bordas

ósseas do defeito, em direção centrípeta do defeito (Figuras 8 e 9). Distante das

bordas, esta neoformação foi observada de permeio às microesferas, por vezes,

circundando-as (Figura 10). Limitando esta neoformação de matriz osteóide,

observam-se osteoblastos e osteócitos englobados pela mesma. Nos locais onde não

houve formação de matriz osteóide, notou-se a presença de tecido conjuntivo rico em

vasos sanguíneos, no qual foi possível evidenciar um infiltrado inflamatório

mononuclear e células gigantes multinucleadas, caracterizando inflamação crônica

granulomatosa moderada, principalmente próximo às microesferas (Figuras 11 e 12).

Figura 7– GHAMg 15d. Preenchimento do defeito ósseo com as microesferas (M) de HAMg em única

camada. Na região próxima às bordas ósseas (Bo) notam-se áreas de mineralização (*)

associadas às microesferas (M). Na região central do defeito observa-se um tecido conjuntivo

(Tc) com aspecto denso. Veia central (Vc). HE. Barra 300 µm.

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Figura 8– GHAMg 15d. Neoformação óssea (*) associada à borda óssea (Bo) e ao biomaterial, de

permeio às microesferas (M). Tecido conjuntivo (Tc) circundando as microesferas ao longo

do defeito. Veia central (Vc). PIFG. Barra 300 µm.

Figura 9 – GHAMg 15d. Deposição de matriz osteóide (*) associada à borda óssea (Bo) e às

microesferas (M) de HAMg. Microesferas preenchendo o defeito e circundadas por tecido

conjuntivo (Tc). PIFG. Barra 200 µm.

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Figura 10– GHAMg 15d. Mineralização (*) ao redor e de permeio às microesferas (M) deHAMg. Na

região superior, onde não houve mineralização, nota-se a presença de tecido conjuntivo

(Tc) com aspecto denso. HE. Barra 200 µm.

Figura 11 – GHAMg 15d. Presença de tecido conjuntivo fibroso circundado as microesferas (M) de

HAMg. Reação inflamatória crônica (Ri) granulomatosa moderada com células gigantes

multinucleadas ( ) associadas ao biomaterial. HE. Barra 100 µm.

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Figura 12 – GHAMg 15d. Estroma com tecido conjuntivo fibroso (Tc) e presença de células gigantes

multinucleadas ( ) circundando a microesfera (M) de HAMg. HE. Barra 50 µm.

No ponto biológico de 45 dias, a neoformação óssea estendeu-se de maneira

centrípeta e confluente, de ambas as bordas, em direção à área central, com quase

união completa no centro do defeito (Figuras 13 e 14). Esta, na maioria das vezes,

preencheu 2/3 da extensão do defeito ósseo em permeio às microesferas. Pode-se

observar que as microesferas que estavam próximas às bordas foram circundadas por

este tecido mineralizado neoformado, com presença de osteócitos (Figura 15). Nas

áreas onde não houve formação de tecido mineralizado, identificou-se um tecido

conjuntivo mais denso em relação ao período anterior. Neste, foi possível observar

células fusiformes e capilares sanguíneos (Figura 16).

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Figura 13 – GHAMg 45d. Presença de matriz osteóide (*) associada às bordas ósseas (Bo) e ao longo

do defeito em associação às microesferas (M) que ocuparam toda a extensão do defeito

ósseo. Presença de tecido conjuntivo (Tc) na região central. HE. Barra 300 µm.

Figura 14 – GHAMg 45d. Mineralização (*) próxima às bordas ósseas e circunjacente às microesferas

(M) de HAMg. Tecido conjuntivo fibroso (Tc) na região central do defeito circundando o

biomaterial. HE. Barra 300 µm.

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Figura 15 – GHAMg 45d. Tecido mineralizado em organização (*) circunjacente à microesfera (M) de

HAMg. Nota-se a presença de osteócitos ( ) e tecido conjuntivo (Tc). HE. Barra 50 µm.

Figura 16 – GHAMg 45d. Presença de tecido conjuntivo (Tc), rico em vasos sanguíneos ( ) de

permeio às microesferas (M) de HAMg. Preenchimento do defeito com múltiplas camadas

de biomaterial. HE. Barra 200 µm.

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GHA

Aos 15 dias, observou-se a presença de matriz osteóide associada às bordas

ósseas, bem como circundando as microesferas que ocupavam toda a extensão e

espessura do defeito, organizadas em uma única camada de material (Figuras 17,

18 e 19). Observou-se a presença de osteócitos e osteoblastos associados a esta

neoformação. Pode-se observar que houve deslocamento de algumas microesferas.

Notou-se que as microesferas se apresentavam num aspecto não uniforme, pois ora

havia a presença de tecido conjuntivo em seu interior, ora não (Figura 20). Na região

central do defeito, houve formação de tecido conjuntivo frouxo, contendo infiltrado

inflamatório mononuclear e células gigantes multinucleadas, o que caracteriza uma

inflamação crônica granulomatosa discreta, mais notória ao redor das microesferas

mais densas. Notou-se também neovascularização em toda a extensão do defeito

(Figura 21).

Figura 17 – GHA 15d. Microesferas (M) de HA preenchendo toda a extensão do defeito.

Mineralização (*) próxima às bordas ósseas (Bo) e ao longo do defeito em associação

com as microesferas (M). Presença de tecido conjuntivo (Tc) na região central. HE. Barra

300 µm.

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Figura 18– GHA 15d. Mineralização (*) nas proximidades da borda óssea (Bo) e circunjacente às

microesferas (M) de HA. HE. Barra 200 µm.

Figura 19 – GHA 15d. Presença de matriz osteóide neoformada (*) nas proximidades da borda óssea

(Bo) e circundando as microesferas (M) de HA presentes nesta região. Deposição de

tecido conjuntivo ( ) dentro da microesfera. PIFG. Barra 200 µm.

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Figura 20 – GHA 15d. Tecido conjuntivo (Tc) organizado na região superior do defeito. Nota-se

aspecto heterogêneo das microesferas de HA, algumas têm aspecto mais denso (Md)

outras mostram-se porosas (Mp). HE. Barra 200 µm.

Figura 21 – GHA 15d. Presença de tecido conjuntivo circundando a microesfera (M) de HA, associado

à reação inflamatória crônica granulomatosa (RI), com presença de células gigantes

multinucleadas ( ). HE. Barra 50 µm.

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Aos 45 dias, observou-se que a deposição de matriz osteóide nas regiões de

borda foi mais evidente que aos 15 dias, preenchendo, em média, 4/5 do defeito em

direção centrípeta (Figura 22). O biomaterial se organizou, na maioria das vezes, em

multicamadas (Figura 22). As microesferas que se encontravam próximas às bordas

ósseas foram englobadas pela matriz osteóide neoformada, com presença de

osteócitos e osteoblastos, nesta região (Figuras 23 e 24). Notou-se, circunjacente às

microesferas, a presença de vasos sanguíneos e discreto infiltrado inflamatório

mononuclear com células gigantes, características da inflamação crônica

granulomatosa (Figuras 25, 26 e 27).

Figura 22 – GHA 45d. Presença de mineralização em, praticamente, toda extensão do defeito

circunjacente às microesferas (M) de HA. O biomaterial preencheu todo o defeito e se

organizou em múltiplas camadas. HE. Barra 300 µm.

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Figura 23 – GHA 45d. Presença de matriz osteóide (*) associada à borda óssea (Bo) e circundando a

microesfera (M) de HA próxima a esta região. PIFG. Barra 200 µm.

Figura 24 - GHA 45d. Mineralização (*), com áreas já em organização, circundando a microesfera (M)

de HA. Presença de osteócitos. HE. Barra 100 µm.

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Figura 25 - GHA 45d. Presença de tecido conjuntivo (Tc), rico em vasos sanguíneos ( ) de permeio

as microesferas (M) de HA. Preenchimento do defeito com múltiplas camadas de

biomaterial. HE. Barra 200 µm.

Figura 26 – GHA 45d. Septos de tecido conjuntivo ( ) ao redor das microesferas (M) de HA e

também no interior de algumas microesferas. PIFG. Barra 200 µm.

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Figura 27 - GHA 45d. Presença de tecido conjuntivo (Tc) circundando as microesferas (M) de HA,

com presença de vasos sanguíneos (*) e células gigantes multinucleadas ( ). HE. Barra

100 µm.

GC

Aos 15 dias, observou-se limitada neoformação óssea restrita às bordas ósseas,

com presença de osteoblastos ativos e osteócitos, e na área residual do defeito notou-

se tecido conjuntivo frouxo, com espessura reduzida quando comparado com a borda

(Figura 28 e 29), rico em células fusiformes e vasos sanguíneos (Figura 30). Observou-

se também inflamação crônica discreta (Figura 30).

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Figura 28 - – GC 15d. Mineralização (*) restrita às bordas ósseas (Bo) e área residual preenchida por

tecido conjuntivo (Tc) em toda sua extensão. Veia central (Vc). HE. Barra 300 µm.

Figura 29– GC 15d. Mineralização (*) associada a borda óssea (Bo) com tecido conjuntivo (Tc) em

toda a área residual do defeito. HE. Barra 200 µm.

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Figura 30 – GC 15d. Presença de tecido conjuntivo associado a uma reação inflamatória crônica (Ri),

infiltrado inflamatório monomorfonuclear. Nota-se a presença de células fusiformes ( ) e

vasos sanguíneos (*). HE. Barra 50 µm.

Aos 45 dias, notou-se que a neoformação óssea estendeu-se além da borda

em direção centrípeta ao defeito, e mais evidente do que aos 15 dias (Figura 31). A

inflamação crônica discreta com escassas células inflamatórias mononucleares.

Notou-se também a presença de vasos sanguíneos e células fusiformes de permeio

ao tecido conjuntivo formado nas regiões onde não houve mineralização, na região

central, o que equivale provavelmente à região de sutura na tábua óssea da calvária

(Figura 32).

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Figura 31 – GC 45d. Defeito ósseo preenchido por tecido mineralizado (*), com a presença de uma

pequena área de tecido conjuntivo (Tc) na região central. Borda óssea (Bo). HE. Barra 300

µm.

Figura 32 – GC 45d. Presença de tecido conjuntivo fibroso (Tc) na região central do defeito. Matriz

osteóide (*). PIFG. Barra 100 µm.

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5.2 ANÁLISE MORFOMÉTRICA

5.2.1 Extensão linear do defeito ósseo

Em relação à extensão linear do defeito não se observou diferenças

estatisticamente significantes entre os grupos estudados, em nenhum dos pontos

biológicos (Tabela 2 3), mostrando que o defeito permaneceu com uma dimensão

aproximada de 5mm.

Tabela 2 - Média (desvio-padrão) da extensão linear do defeito ósseo dos grupos experimentais, nos

pontos biológicos de 15 e 45 dias.

Grupo Período

GHAMg GHA GC Valor de p Comparação GHAMg com

GHA

Comparação com GC

15 dias 3,43 ± 2,38 5,27 ± 0,19 5,02 ± 0,17

p=0,18 NS p=0,20 NS GI: p=0,28 NS

GII: p=0,97 NS

45 dias 4,65 ± 0,62 5,00 ± 0,86 5,07 ± 0,19

p=0,60 NS p=0,71 NS GI: p=0,61 NS GII: p=0,98 NS

NS: não significante; S: significante.

Figura 33 - Mensuração da extensão linear do defeito ósseo dos grupos experimentais, nos pontos

biológicos de 15 e 45 dias.

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5.2.2 Área de matriz osteóide neoformada

Aos 15 dias não se observou diferenças significativas quanto à área de matriz

osteóide neoformada. Contudo, no ponto biológico de 45 dias, pode-se observar

significância estatística quanto o total desta, comparando os grupos GHAMg e GHA

com GC, tendo GC maior média de matriz osteóide neoformada (Tabela 3).

Tabela 3 - Média (± desvio-padrão) da área de matriz osteóide neoformada dos grupos experimentais,

nos pontos biológicos de 15 e 45 dias.

Grupo Período

GHAMg GHA GC Valor de p Comparação GHAMg com

GHA

Comparação com GC

15 dias 0,25 ± 0,29

0,12 ± 0,07

0,20 ± 0,38

p=0,58 NS p=0,55 NS GHAMg:p=0,89 NS

GHA: p=0,82 NS

45 dias 0,20 ± 0,13

0,25 ± 0,11

0,61 ± 0,21

p=0,01 S p=0,92 NS GHAMg: p=0,01 S

GHA: p=0,02 S

NS: não significante; S: significante.

Figura 34 - Análise da razão de matriz osteóide neoformada na área seccional total do defeito dos

grupos experimentais, nos pontos biológicos de 15 e 45 dias.

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6 DISCUSSÃO

No âmbito da Bioengenharia Tecidual Óssea a HA tem destaque entre as

cerâmicas à base de fosfato de cálcio devido à sua similaridade com componentes da

fase mineral do tecido ósseo, boa biocompatibilidade, osteocondutividade, e, também,

por sua bioatividade, que favorece a interação entre o tecido ósseo e o biomaterial93.

Estas características puderam ser observadas no nosso estudo, uma vez que quando

implantadas, as microesferas de HA dopadas ou não com Mg, mostraram-se

biocompatíveis, osteocondutores e bioativas.

A propriedade de osteocondução dos biomateriais possibilita que estes

funcionem como arcabouços e favoreçam a adesão, a migração e a proliferação de

células mesenquimais, a angiogênese e a formação de um novo tecido ósseo94. Para

tanto, é importante que os biomateriais permaneçam no sítio de implantação durante

o reparo, pois o deslocamento dos mesmos limita a execução de sua funcionalidade.

Nos grupos, onde houve a implantação dos biomateriais, as microesferas se

organizaram em camadas, e, consequentemente formaram um arcabouço para

deposição de um novo tecido mineralizado de permeio às microesferas, nos dois

grupos e em ambos pontos biológicos. Esta neoformação iniciou nas bordas,

provavelmente, estimulada por fatores inflamatórios, angiogênicos, de crescimento e

de diferenciação celulares liberados nesta região devido à ruptura vascular decorrente

do procedimento cirúrgico e, também, pela presença do periósteo na região adjacente

ao defeito75,95.

Biomateriais à base de fosfato de cálcio são amplamente utilizados na prática

clínica, médica e odontológica. Assim, atualmente, existem diferentes pesquisadores

utilizando fosfatos de cálcio, em diferentes formulações, especialmente, substituídos

por diferentes íons, a fim de melhorar propriedades físico-químicas do material. Entre

os diferentes cátions utilizados nestas substituições, o Mg é de especial importância,

por ser o quarto cátion mais abundante no corpo, segundo no meio intracelular e o

mais abundante em cartilagem e tecido ósseo durante as fases iniciais da

osteogênese12.

A adição de Mg à estrutura hexagonal da HA, por meio da substituição dos íons

de Ca por Mg, favorece a diminuição da cristalinidade da HA e consequentemente

aumento no grau de dissolução desta cerâmica10. Assim, a HA dopada com Mg (GHAMg)

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desencadeou uma reação inflamatória mais evidente, com aparente maior grau de

degradação das microesferas, aos 15 e 45 dias, quando comparada com as microesferas

de HA sem o metal (GHA). Diferentemente, os resultados encontrados por96, ao

avaliarem grânulos de HA dopados com Mg, mostraram que a degradação dos grânulos

dopados com o metal foi semelhante aquela observada nos grânulos de HA

estequiométrica. Contudo, os grânulos utilizados neste estudo não foram sinterizados. Já

as microesferas avaliadas em nosso estudo foram sinterizadas à 1100°C.

A biodegradação da HA – fator que interfere na reação tecidual ao biomaterial

– pode ocorrer pela combinação dos seguintes processos: (1) físico-abrasivo – fratura,

desintegração; (2) químico – dissolução, aumento de Ca e P localmente na superfície;

e (3) biológico – redução do pH causado pela atividade celular e fagocítica, resultando

no aumento da taxa de biodegradação devido à dissolução do cálcio e fósforo97.

Fatores que tendem a aumentar a taxa de biodegradação incluem aumento da

porosidade, redução do tamanho do cristal, aumento no número de cristais imperfeitos

e tamanho do biomaterial97. No estudo de Kalita e Bhatt (2007)98 foi avaliado as

características físico-químicas de HA dopada ou não com magnésio e zinco, in vitro,

os autores observaram que a HA dopada com Mg obteve a maior taxa de degradação

quando comparada a HA pura e com zinco. Nosso estudo, in vivo, corrobora com

estes achados, uma vez que as microesferas de HAMg apresentavam maior

degradação quando comparada a HA sem o metal.

Somado a isto, este íon está intimamente associado ao mecanismo de

mineralização10, principalmente na fase inicial de osteogênese, uma vez que aumenta a

cinética de nucleação da HA, retardando sua cristalização, e pode interferir em mudanças

qualitativas da matriz óssea10. Isto pode ser notado aos 15 dias no GHAMg onde pode-

se observar uma neoformação óssea superior GHA, 25% e 12% da área total,

respectivamente. Porém, este padrão não se repetiu aos 45 dias, tendo o GHA (25% da

AT) uma neoformação óssea próxima ao GHAMg (20% da AT). Em ambos os casos

estas diferenças não foram significativas (p=0,55 – 15 dias e p=0,92 – 45 dias).

No GHA, aos 15 dias, notou-se que as microesferas apresentavam-se com

aspecto não uniforme, pois ora havia a presença de tecido conjuntivo em seu interior,

ora não. Isto mostra uma heterogeneidade na estrutura das microesferas que pode

estar relacionada ao processo de sinterização, que resultou em microesferas com

cristais mais coesos em determinadas regiões e menos coesos em outras. Em regiões

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onde houve menor fragmentação do biomaterial, provavelmente devido à sinterização

mais efetiva, houve maior formação de tecido ósseo ao redor destas partículas,

principalmente próxima às margens ósseas. No GHAMg as microesferas

caracterizaram-se por um aspecto mais denso sendo observada neoformação óssea

além das bordas ósseas do defeito, e distante das bordas, esta neoformação foi

observada de permeio às microesferas, por vezes, circundando-as. Este aspecto mais

denso das microesferas dopadas com Mg pode estar associado ao fato da adição de

Mg favorecer a sinterização mais uniforme99 e também aumentar as propriedades

mecânicas do biomaterial, sem alterar a segurança biológica e biocompatibilidade do

composto inicial99.

A confecção de um defeito na região da calvária culmina com rompimento

vascular que promove o extravasamento sanguíneo, liberação de citocinas

inflamatórias, formação de coágulo, inflamação aguda e inflamação crônica35. Esta

reação, quando associada ao biomaterial, e a depender de suas características físico-

químicas, tem maior ou menor intensidade e finda com uma regeneração óssea,

reação de corpo estranho ou fibrose. Nos três grupos experimentais deste estudo,

observou-se uma inflamação crônica. Nos grupos GHAMg e GHA, esta inflamação foi

do tipo crônica granulomatosa, o que, segundo35, é inerente à implantação dos

biomateriais nos tecidos vivos. Este tipo de resposta inflamatória crônica também foi

encontrado por Barreto (2006)100, Cardoso e colaboradores (2006)101, Miguel e

colaboradores (2006)39, Barreto (2008)102, Paula (2008)103, Rolim (2010)92, Barreto

(2011)104, Miguel e colaboradores (2013)40 e Ribeiro (2013)105 que também avaliaram

biomateriais para regeneração óssea, em calvária de rato. Vale ressaltar que nestes

estudos o defeito ósseo foi de 8mm e no nosso o defeito foi de 5mm, o que não tem

correlação com o surgimento de inflamação crônica granulomatosa. Além disso, nosso

estudo corrobora com o de Barreto (2011)104, que avaliou o potencial osteogênico de

microesferas de HA e também observou, aos 15 dias, uma reação inflamatória mais

acentuada associada às microesferas mais fragmentadas.

Outro fator fundamental à regeneração óssea é a neovascularização37. No

nosso estudo observou-se neoformação vascular em toda a extensão do defeito nos

três grupos, em todos os períodos estudados, sendo mais acentuada no GHAMg e

GHA. Este aspecto é de fundamental importância para o reparo ósseo, uma vez que

fornece nutrientes, oxigênio e fatores de crescimento necessários à diferenciação e

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maturação de células mesenquimais indiferenciadas, bem como células da linhagem

osteoblástica, em osteoblastos5.

No GC (controle) a neoformação limitou-se, aos 15 dias, à região das bordas,

com 20% da AT preenchida por matriz osteóide neoformada. Já aos 45 dias, esta

neoformação evoluiu em direção centrípeta, e ocupou 61% da área total do defeito.

Nossos resultados contrapõem os resultados obtidos por Develioglu, Saraydin e Kartal

(2009)106, Frota e colaboradores (2010)107 e Zong e colaboradores (2010)108, já que

estes estudos concluíram que defeito ósseos com 5mm em calvária podem ser

considerados críticos, por apresentarem reparo finalizado por fibrose e neoformação

óssea restrita as bordas, no controle e, também, nos grupos com a implantação de

biomateriais. Desta forma, fica evidente que não há consenso entre os autores sobre

o exato diâmetro para o defeito ósseo ser considerado como crítico – defeito que não

regenera ao longo da vida do animal109. Alguns autores utilizaram defeitos com

dimensão de 4mm110; de 5mm76,91,111,112; de 6mm113; e de 8mm41,114,30,40. O que se

torna evidente é que defeitos ósseos com dimensões de 4, 5 e 6 mm, em que a área

residual remanescente é pequena, pode apresentar regeneração óssea completa,

apenas com a utilização de biomateriais osteocondutores.

Estimular a regeneração óssea é um desafio constante para os profissionais da

área de saúde e pesquisadores da área de Bioengenharia Tecidual Óssea.

Atualmente a tendência é desenvolver e utilizar biomateriais biomiméticos que

acelerem e/ou favoreçam a regeneração do defeito ósseo, diminuindo o risco pós-

operatório4.

A biocompatibilidade e o potencial osteocondutor dos biomateriais estudados

evidenciados neste estudo demonstram seu potencial para futuras aplicações clínicas,

principalmente em perdas ósseas menores. Contudo, estudos em defeitos críticos

devem ser realizados para melhor caracterizar o potencial osteogênico da HA dopada

com Mg.

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7 CONCLUSÕES

Os biomateriais foram biocompatíveis, osteocondutores;

O grupo controle apresentou neoformação óssea evidente, compatível com

a capacidade regenerativa do tecido ósseo, sem, contudo, regenerar-se de modo

completo, no período observado;

Os grupos HAMg e HA restituíram a altura óssea em comparação ao grupo

controle;

O Mg não favoreceu maior regeneração óssea;

Os biomateriais avaliados neste estudo são interessantes para aplicações

clínicas onde a permanência do biomaterial faz-se necessário, como material de

preenchimento ósseo.

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100 Barreto EC. Avaliação in vivo do reparo de defeito ósseo com biomaterial do tipo microesferas cerâmicas. [Dissertação]. Salvador: Faculdade de Odontologia, Universidade Federal da Bahia; 2006.

101 Cardoso AK, Barbosa Ade A Jr, Miguel FB, Marcantonio E Jr, Farina M, Soares GD, Rosa FP. Histomorphometric analysis of tissue responses to bioactive glass implants in critical defects in rat calvaria. Cells Tissues Organs. 2006;184(3-4):128-37.

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103 Paula FL. Avaliação in vivo de um compósito de hidroxiapatita e alginato no reparo ósseo. [Dissertação] Rio de Janeiro: Universidade Federal do Rio de Janeiro; 2008.

104 Barreto IC. Utilização de ranelato de estrôncio associado a biometrias para regeneração óssea. [Tese]. Salvador: Instituto de Ciências da Saúde, Universidade Federal da Bahia. 2011.

105 Ribeiro IIA. Estudo da implantação in vivo de biomateriais compósitos de fosfato de cálcio e polímero. [Dissertação]. Salvador, 2013. Instituto de Ciências de Saúde, Universidade Federal da Bahia; 2013.

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107 Frota R, Da Silva-Júnior VA, Teixeira M, Sobral AP, Emanuel-Dias-de Oliveira e Silva, Da Silveira MM, Aragão-Neto AC. Histological evaluation of bone repair using β-tricalcium phosphate. Med Oral Patol Oral Cir Bucal. 2011 Mar 1;16(2):e190-4.

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109 Schmitz JP, Hollinger JO. The critical size defect as an experimental model for craniomandibulofacial nonunions. Clin Orthop Relat Res. 1986 Apr;(205):299-308.

110 Cowan CM, Shi YY, Aalami OO, Chou YF, Mari C, Thomas R, Quarto N, Contag CH, Wu B, Longaker MT. Adipose-derived adult stromal cells heal critical-size mouse calvarial defects. Nat Biotechnol. 2004 May;22(5):560-7.

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111 Florczyk SJ, Leung M, Li Z, Huang JI, Hopper RA, Zhang M. Evaluation of three-dimensional porous chitosan-alginate scaffolds in rat calvarial defects for bone regeneration applications. J Biomed Mater Res A. 2013 Oct;101(10):2974-83.

112 Fernández T, Olave G, Valencia CH, Arce S, Quinn JM, Thouas GA, Chen QZ. Effects of calcium phosphate/chitosan composite on bone healing in rats: calcium phosphate induces osteon formation. Tissue Eng Part A. 2014 Jul;20(13-14):1948-60.

113 Pryor ME, Polimeni G, Koo KT, Hartman MJ, Gross H, April M, Safadi FF, Wikesjö UM. Analysis of rat calvaria defects implanted with a platelet-rich plasma preparation: histologic and histometric observations. J Clin Periodontol. 2005 Sep;32(9):966-72.

114 Marins LV, Cestari TM, Sottovia AD, Granjeiro JM, Taga R. Radiographic and histological study of perennial bone defect repair in rat calvaria after treatment with blocks of porous bovine organic graft material. J Appl Oral Sci. 2004 Mar;12(1):62-9.

115 Maia M, Klein ES, Monje TV, Pagliosa C. Reconstrução da estrutura facial por biomateriais: revisão de literatura. Rev. Bras. Cir. Plást. 2010 Sep;25(3):566-572.

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ANEXO

PARECER DO COMITÊ DE ÉTICA