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1

UNIVERSIDADE CEUMA – UNICEUMA

GERÊNCIA DE PÓS-GRADUAÇÃO, PESQUISA E EXTENSÃO

MESTRADO EM BIOLOGIA PARASITÁRIA

ISRAEL VIEGAS MOREIRA

Detecção de atividade antimicrobiana de microrganismos isolados

de solos do Maranhão

São Luís - MA

Outubro / 2015

2




Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

graduação em Biologia Parasitária da

Universidade CEUMA, como requisito para a

obtenção do título de Mestre em Biologia

Parasitária.

Orientado: Israel Viegas Moreira

Orientador: Prof. Dr. Valério Monteiro Neto

Co-orientadora, Profª. Dra. Maria Rosa

Quaresma Bomfim

São Luís - MA

Outubro / 2015

3

Moreira, Israel Viegas.


de solos do Maranhão/ Israel Viegas Moreira. São Luís:

UNICEUMA, 2015.

75 p.: il. color.

Dissertação (Mestrado) – Programa de pós-graduação em

Biologia Parasitária. Universidade CEUMA, 2015.

1. Bioprospecção. 2. Microrganismos. 3. Atividade antimicrobiana. I.

Monteiro Neto, Valério (Orientador). II. Título.

CDU: 579.67:631.4 (812.1)

CDU: 579.67:631.4 (812.1)

M835d

4




A Comissão julgadora da Defesa do Trabalho Final de Mestrado em

Biologia Parasitária, em sessão pública realizada no dia / / , considerou

o(a) candidato(a)

( ) APROVADA ( ) REPROVADA

1) Examinador ________________________________________

2) Examinador _________________________________________

3) Examinador _________________________________________

4) Presidente (Orientador)_________________________________

5

“Eu guardei muitas coisas em minhas mãos, e perdi todas. Mas todas que coloquei nas

mãos de Deus, essas eu ainda possuo” (Marthin Luther King)

6

Aos meus pais, João Furtado e Severina Viegas, pelo ensino, dedicação e amor.

7

A minha esposa Joama Gusmão, pela dedicação, incentivo, paciência e seu amor.

8

Agradecimentos

Agradeço a Deus pelo seu amor, graça e misericórdia, por ser o criador de

todas as coisas, inclusive de bactérias e fungos, e sustentador da vida. Agradeço

por ter escutado minha oração quando clamei por resultados.

À minha família, que tem imenso amor por mim.

Ao Prof. Dra. Valério Monteiro Neto, pela orientação, disposição,

conhecimento e competência. Obrigado pela convivência agradável e confiança no

desenvolvimento deste trabalho.

Agradeço sem medida à minha co-orientadora, Profª. Dra. Maria Rosa

Quaresma Bomfim pela paciência, confiança, conhecimento e dedicação. Obrigado

pela convivência amável.

À Profª Cristina Monteiro, pela participação neste trabalho.

Agradeço à Márcia Barros, pela sua Importante contribuição laboratorial.

Ao Prof Stelito pelo seu companheirismo, coleta de amostras e conversas

incentivadoras.

Agradeço à Profª Andrea Pires, da Universidade Federal do Maranhão, pela

apoio.

À Monique do Carmo pelo conhecimento transmitido, ajuda técnica e atos de

gentileza.

À Margareth Penha, por todos os atos de ajuda, empenho e palavras

incentivadoras.

À todos os professores do Mestrado em Biologia Parasitária pelos

conhecimentos adquiridos.

Aos meus irmãos Júnior e Geovane pelo incentivo e amor dispensado.

Aos meus sobrinhos Alayne e Higor pela contribuição de coleta de amostras.

À Dário Gusmão, Marcos Antônio, Diná Elda, Rilton Filho e Rilton Neto pelas

numerosas coletas.

Aos colegas, alunos do mestrado, pelos momentos agradáveis e de

aprendizagem vividos.

À FAPEMA, pelo auxílio financeiro.

Por fim, agradeço àquelas pessoas que contribuíram direta ou indiretamente

na realização desta pesquisa.

9

RESUMO

A detecção de antibióticos produzidos por microrganismos do solo tem proporcionado a maior parte do arsenal disponível para o combate das doenças infecciosas no mundo. O crescente aumento de microrganismos multidroga-resistentes (MDR) e a falta de opções terapêuticas têm levado a busca de novos antibióticos, principalmente de microrganismo do solo. Portanto, o objetivo deste estudo foi investigar a presença de microrganismos produtores de substâncias com atividade antimicrobiana em solos oriundos de diferentes ecossistemas do Estado do Maranhão. As amostras de solo foram coletadas no período de julho de 2011 a abril de 2013 em dezenove cidades do norte e do leste do Estado do Maranhão que compreenderam solos de restinga, cerrado, campo e mata de transição. Os isolamentos dos microrganismos foram realizados por diluições das amostras e inoculação em ágar cobre, ágar Sabouraud-dextrose e ágar amido-caseína. Os isolados foram submetidos a triagem inicial da atividade antimicrobiana com as linhagens de referência Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Escherichia coli (ATCC 25922) e Candida albicans (ATCC 18804), utilizando o método de ágar difusão e também contra isolados clínicos MDR, incluindo-se: Enterococcus faecalis, E. coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas. aeruginosa, S. aureus e C. albicans. Posteriormente, os isolados com atividade antimicrobiana foram identificados por sequenciamento de região do rDNA da subunidade 16S, no caso de bactérias, e das regiões ITS1 e ITS4, para os fungos. Foram isolados 599 microrganismos, destes 95 (15,9%) apresentaram atividade antimicrobiana contra pelo menos um dos microrganismos ATCC avaliados. Entre os isolados, 79 (83,2%) bactérias e 16 (16,8%) eram fungos. Um total de 60 (63,2%) isolados apresentou atividade inibitória do crescimento contra uma única cepa padrão, enquanto que 35 (36,8%) apresentaram atividade antimicrobiana contra duas ou três das cepas padrão empregadas (S. aureus ATCC 25923, E. coli ATCC 25922 e C. albicans ATCC 18804). Quanto à atividade antimicrobiana contra bactérias MDR e fungo de origem clínica, 43 (58,9%) isolados do solo apresentaram atividade contra uma única cepa, enquanto que 18 (24,7%) inibiram duas das cepas empregadas no ensaio, incluindo C. albicans, E. faecalis e/ou S. aureus. Doze isolados (16,4%) apresentaram atividade contra três a sete microrganismos, simultaneamente. A maior frequência de isolados com atividade inibitória do crescimento específica foi observada em 36 (49,3%) isolados do solo contra C. albicans, seguida da atividade contra S. aureus MDR evidenciada em seis (8,2%) microrganismos. A análise de identificação genotípica dos isolados avaliados neste estudo evidenciou 40 bactérias, 39 actinomicetos e 16 fungos, os quais apresentaram a seguinte distribuição de gêneros entre as bactérias: Kitasatospora, Streptomyces, Bacillus, Burkholderia, Paenibacillus e Pseudomonas. Quanto aos fungos filamentosos foram identificados três gêneros: Aspergillus, Penicillium, e Trichoderma. Em suma, foi demonstrado que o solo do Estado do Maranhão contém microrganismos com ação antimicrobiana, principalmente bactérias, com maior frequência de atividade inibitória contra fungos, além da ação contra bactérias Gram-positivas, Gram-negativas ou ambas. Alguns podem representar microrganismos ainda não conhecidos ou caracterizados, considerando as suas características fenotípicas e moleculares.

Palavras chave: Bioprospecção, microrganismos, atividade antimicrobiana.

http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi#alnHdr_631251236


10

ABSTRACT

Detection of antibiotics produced by soil micro-organisms has provided most of the available

arsenal to combat infectious diseases in the world. The increasing number of multidrug-

resistant organisms (MDR) and the lack of therapeutic options have led to the search for new

antibiotics, especially from soil microorganisms. Therefore, the aim of this study was to

investigate the presence of microorganisms that produce substances with antimicrobial

activity in soils from different ecosystems in the state of Maranhão. Soil samples were

collected from July 2011 to April 2013 in nineteen cities in the north and east of the

Maranhão State who understood sandbank land, savanna, fields and transition forest. The

isolation of microorganisms was carried out by plating tenfold dilutions of samples onto

copper agar, Sabouraud dextrose agar, and starch-casein agar. Microbial isolates were

subjected to initial screening of antimicrobial activity with the reference strains of

Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Escherichia coli (ATCC 25922) and Candida albicans

(ATCC 18804) using the agar diffusion method and also against MDR isolates, including:

Enterococcus faecalis, E. coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas. aeruginosa, S. aureus

and C. albicans. Subsequently, the antimicrobial isolates were identified by sequencing rDNA

region of the 16S subunit, in the case of bacteria, and the ITS1 and ITS4 regions for fungi. Of

599 isolated microorganisms, 95 (15.9%) showed antimicrobial activity against at least one of

the evaluated ATCC microorganisms. Of these isolates, 79 (83.2%) were bacteria and 16

(16.8%) were fungi. A total of 60 (63.2%) isolates showed growth inhibitory activity against a

single reference strain, whereas 35 (36.8%) showed antimicrobial activity against two or

three of standard strains used (S. aureus ATCC 25923, E. coli ATCC 25922 and C. albicans

ATCC 18804). Regarding antimicrobial activity against MDR bacteria and fungi of clinical

origin, 43 (58.9%) isolates showed activity against a single strain, while 18 (24.7%) inhibited

two of the strains used in the assay, including C. albicans, E. faecalis and/or S. aureus.

Twelve isolates (16.4%) showed activity against three to seven microorganisms,

simultaneously. The higher frequency of isolates with specific growth inhibitory activity was

observed in 36 (49.3%) isolates from soil against C. albicans, followed by the activity against

MDR S. aureus evidenced in six (8.2%) microorganisms. Genotypic identification analysis of

the isolates in this study showed 40 bacteria, 39 actinomycetes and 16 fungi, which showed

the following distribution of genders among bacteria: Kitasatospora, Streptomyces, Bacillus,

Burkholderia, Paenibacillus and Pseudomonas. Regarding filamentous fungi, three genera

were identified: Aspergillus, Penicillium, and Trichoderma. In sum, it was demonstrated that

soil samples of Maranhão contains microorganisms with antimicrobial activity, mainly

bacteria, most commonly inhibitory activity against fungi, and also action against Gram-

positive bacteria, Gram-negative or both microorganisms. Some may represent

microorganisms not known yet or characterized, considering their phenotypic and molecular

characteristics.

Keywords: Bioprospecting, microorganisms, antimicrobial activity

11

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Marcos históricos dos antibióticos.................................................... 19

Figura 2 Mortes atribuídas à resistência antimicrobiana por ano até 2050

21

Figura 3 Ecossistemas do estado do Maranhão............................................ 26

Figura 4 Municípios onde foram coletas amostras de solos.........................

28

Figura 5 Esquema de isolamento de microrganismos do solo e fragmento de meio de cultura após crescimento dos isolado...........................

30

Figura 6 Esquema da atividade antimicrobiana de isolado do solo contra

bactérias ATCC................................................................................

31

Figura 7 Esquema da atividade antimicrobiana de isolado do solo contra microrganismos de isolados clínicos................................................

32

Figura 8 Pesquisa da atividade antimicrobiana em isolados do solo pelo método de difusão em ágar..............................................................

32

Figura 9 Esquema do teste de atividade enzimática dos isolados do solo antes e após ebulição......................................................................

34

Figura 10 Esquema da atividade antimicrobiana de isolado do solo contra microrganismos ATCC com fragmentos após ebulição...................

34

Figura 11 Teste de produção de protease de isolado do solo em Ágar Mueller Hinton adicionado de “Skim Milk”........................................

35

Figura 12 Teste de produção de lípase dos isolados do solo em Ágar Mueller Hinton com 1% de Tween-80..............................................

36

Figura 13 Teste de produção de fosfatase alcalina de isolado do solo em ágar de Sperber...............................................................................

36

Figura 14 Demonstração do perfil de crescimento de isolados microbianos recuperados de amostras de solo avaliadas neste estudo..............

40

Figura 15 Pesquisa da atividade antimicrobiana em isolados do solo pelo método de difusão em ágar..............................................................

43

Figura 16 Perfis de amplificação pela Reação em Cadeia pela Polimerase de alguns isolados do solo com os diferentes iniciadores utilizados no presente estudo...........................................................

48

Figura 17 Árvore filogenética dos isolados de Actinomicetos isoladas de diferentes tipos de solos do Estado do Maranhão...........................

54

12

Figura 18 Árvore filogenética obtida com sequencias dos isolados

identificados com o par de iniciadores universais 8F e 1492R e sequencias de bactérias existentes no Genbank.............................

55

Figura 19 Árvore filogenética mostrando o grupamento das sequencias dos fungos isolados a partir de amostras de solo do Estado do Maranhão.........................................................................................

56

13

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Alguns microrganismos e seus metabólitos secundários de importância industrial.......................................................................

24

Tabela 2 Número de amostras de solo e isolados microbianos testados oriundos de diferentes cidades do Maranhão .................................

42

Tabela 3 Espectro da atividade antimicrobiana dos isolados do solo testado inicialmente contra microrganismos ATCC......................................

43

Tabela 4 Atividade antimicrobiana de isolados de solo contra microrganismos ATCC por microrganismos identificados................

44

Tabela 5 Espectro da atividade antimicrobiana dos microrganismos isolados do solo contra isolados clínicos ........................................

45

Tabela 6 Atividade antimicrobiana de isolados de solo contra isolados clínicos.............................................................................................

46

Tabela 7 Avaliação da atividade enzimática dos isolados do solo em relação à atividade antimicrobiana antes e após ebulição...............

47

Tabela 8 Diversidade e frequência de microrganismos do solo identificados por sequenciamento com iniciadores desenhados para Actinobactérias, Universais para a região 16S do rDNA de bactérias e para região ITS de fungos.............................................

50

Tabela 9 Análise de similaridade genética das sequências dos isolados do solo das diferentes cidades em relação às sequências do Genbank...........................................................................................

51

14

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

ATCC American Type Culture Collection

BTT Benedict

dATP Desoxiadenosina trifosfatado

dCTP Desoxicitidina trifosfatado

dGTP Desoxiguanosina trifosfatado

DNA Ácido desoxiribonucléico (do inglês, DeoxyriboNucleic Acid)

dTTP Desoxitimidina trifosfatado

EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético (do inglês, Ethylenediaminetetraacetic acid)

Kb Kilobase

MDR Multidroga-resistentes

PBS Solução salina tamponada com fosfato (do inglês, phosphate-buffered saline)

PCR Reação em cadeia pela polimerase (do inglês, Polymerase Chain Reaction)

TBE Tris-Borato-EDTA

TE Tris-EDTA

UFC Unidades Formadoras de Colônias

UV Ultravioleta

15

LISTA DE SÍMBOLOS

ºC Grau Celsius

µg Micrograma

µL Microlitro

µM Micromolar

mg Miligrama

MgCl2 Cloreto de magnésio

mL Mililitros

mM Milimolar

mV Milivolt

pmol Picomol

V Volts

16

SUMÁRIO

RESUMO ABSTRACT LISTA DE FIGURAS LISTA DE TABELAS LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS LISTA DE SÍMBOLOS 1 INTRODUÇÃO........................................................................................... 15 2 REVISÃO DE LITERATURA..................................................................... 17 2.1 Produtos naturais....................................................................................... 17 2.2 Marcos históricos dos antibióticos............................................................. 18 2.3 Novos antibióticos...................................................................................... 20 2.4 Resistência microbiana.............................................................................. 20 2.5 Bactérias produtores de antimicrobianos................................................... 22 2.6 Fungos produtores de antimicrobianos...................................................... 23 3 Justificativa................................................................................................. 25 4 OBJETIVOS............................................................................................... 27 4.1 Objetivo Geral............................................................................................ 27 4.2 Objetivos Específicos................................................................................. 27 5 MATERIAL E MÉTODOS.......................................................................... 28 5.1 Coleta e processamento das amostras de solo ........................................ 28 5.2 Isolamento e identificação de microrganismos produtores de antibióticos

presentes no solo ...................................................................................... 29

5.3 Atividade Antimicrobiana............................................................................ 30 5.4 Testes de atividade enzimática.................................................................. 33 5.4.1 Pesquisa de atividade de proteases.......................................................... 35 5.4.2 Pesquisa de atividade de lipases............................................................... 35 5.4.3 Pesquisa de atividade de fosfatase alcalina.............................................. 36 6 Caracterização molecular dos isolados .................................................... 37 6.1 Extração de DNA....................................................................................... 37 6.2 Amplificação e análise dos amplicons....................................................... 37 6.3 Identificação genotípica dos isolados pelo sequenciamento do

fragmento amplificado de DNA.................................................................. 39

7 RESULTADOS........................................................................................... 40 7.1 Isolados de solo com atividade antimicrobiano de diferentes cidades do

Maranhão...................................................................................................

38

7.2 Atividade antimicrobiana de isolados contra cepas de referência............. 41 7.3 Atividade antimicrobiana dos isolados do solo contra amostras clínicas... 44 7.4 Avaliação da atividade enzimática de proteases, lipases e fosfatase

alcalina e atividade antimicrobiana após ebulição.....................................

46

7.5 Identificação molecular dos isolados do solo ............................................ 47 7.6 Análise de similaridade genética das sequências dos isolados em

relação às sequências do Genbank........................................................... 48

08 DISCUSSÃO.............................................................................................. 57 09 CONCLUSÕES.......................................................................................... 65 10 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.......................................................... 66

15

1 INTRODUÇÃO

Na natureza encontra-se um número gigantesco de produtos naturais que

beneficiam o ser humano, entre esses estão os compostos químicos com finalidade

para a saúde. Uma grande parte deles é produzida por microrganismos pertencentes

ao solo (BÉRDY, 2005).

A indústria internacional farmacêutica ao longo da história tem explorado

produtos naturais e entre eles os antibióticos, os quais são produzidos por diversos

gêneros de microrganismos (HARVEY, 2008).

A detecção de microrganismos do solo que produz algum tipo de metabólito

com atividade biológica e a industrialização destes produtos metabólicos

proporcionaram a maior parte do arsenal antimicrobiano atual, para o combate das

doenças infecciosas. A corrida por novos antimicrobianos nos últimos anos foi

gerada pelo crescente aumento de agentes infecciosos resistentes a vários

antimicrobianos (RICE, 2008).

Algumas bactérias multirresistentes têm sido alvo de preocupação na saúde

pública como: Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Staphylococos

aureus, espécies de Enterococcus e de Enterobactéria. Os fungos também têm

causado preocupação pela ocorrência de linhagens multidroga-resistentes como

Candida albicans e espécies Aspergillus (PIDOT, 2014). Esse cenário e a falta de

novos antimicrobianos tem ocasionado novos investimentos direcionados às

pesquisas com solo, inclusive com apoio das ferramentas da biologia molecular

(BUSTI et al., 2006a).

Alguns gêneros de bactérias e fungos têm se destacado como produtores de

antibióticos. Entre as bactérias o gênero Bacillus, as cianobactérias, espécies de

Pseudomonas e actinomicetos, especialmente do gênero Streptomycetes, são

fontes de compostos com inúmeras atividades biológicas. Estes compostos têm

aplicação na antibioticoterapia, agentes anticancerígenos e outros compostos

farmacêuticos (BIBB, 2005; PIDOT, 2014).

Os antibióticos sintetizados por fungos possuem um percentual menor

comparado às bactérias, porém, não menos importante no combate e controle de

doenças infecciosas. Podem ser citados alguns importantes gêneros como

Aspergillus, Cephalosporium e Penicillium, (YU; KELLER, 2005).

16

O Estado do Maranhão possui uma variedade de ecossistemas, incluindo

manguezais, cerrados, restingas, florestas e campos, os quais apresentam uma

biodiversidade de microrganismos com potencial de produção de novos compostos

químicos com atividade antimicrobiana.

17

2 REVISÃO DA LITERATURA

2.1 Produtos naturais

As bactérias e fungos estão presentes em todos os ambientes naturais. No

solo, esses microrganismos possuem papel importante nos ciclos do carbono,

nitrogênio e enxofre e são os principais agentes na decomposição de matéria

orgânica e exercendo influência na fertilidade do solo (POTTER; MEYER, 1990).

Os microrganismos tem a capacidade de inibir outros microrganismos,

através da produção de metabólitos secundários, objetivando manter a

sobrevivência de suas espécies no seu habitat e, algumas vezes, pela competição

de recurso entre os microrganismos (OSBURNE et al., 2000).

O metabolismo primário é composto por atividades metabólicas associadas

ao crescimento celular, representadas principalmente por enzimas, ácidos orgânicos

e etanol, Enquanto a síntese de metabólitos secundários ocorre no fim ou durante a

fase estacionaria, podendo acontecer por via ribossomal ou não-ribossomal. Esses

metabólitos não são essenciais a vida, portanto, não participam do crescimento

celular (KLEINKAUF; VON DOHREN, 1996).

A produção de metabólitos secundários é de grande interesse para a

comunidade cientifica, devido às suas propriedades farmacêuticas, como os

antibióticos, mas também são importantes pelos seus produtos tóxicas (YU;

KELLER, 2005). Entre os metabólitos secundários gerados por microrganismos com

atividade antimicrobiana estão por exemplo, os policetídeos (PK) não ribossômicos,

produzidos pelas enzimas policetídeo sintases (PKS) e peptídeos sintetase não-

ribossomal (NRPS) (WENZEL; MULLER, 2005). Eles são produzidos naturalmente

por inúmeras espécies de microrganismos, principalmente por fungos e bactérias, e

podem apresentar várias atividades farmacológicas como: antibióticas, antitumorais,

antifúngicas, agentes imunossupressores, antivirais (YADAV; GOKHALE;

MOHANTY, 2003). Como exemplo de antimicrobiano policetídeos podemos citar o

macrolídeo (eritromicina), a ansamicina (rimamicina) e o poliene (anfotericina )

(STAUNTON; WEISSMAN, 2001).

18

2.2 Marcos históricos dos antibióticos

Em 1877, Pasteur e seu auxiliar Jules Joubert foram os primeiros a mostrar

interesse em produtos microbianos como agentes terapêuticos. A partir das suas

observações sobre a capacidade do bacilo do antraz inibir a multiplicação de outros

microrganismos (TAVARES, 2006).

No entanto, Jean Paul Vuillemin foi quem primeiro utilizou o termo antibiose,

para drogas antibacterianas, e expressar que são “contra vida” (FOSTER; RAOULT,

1974) o que foi descrito, em 1877, por Louis Pasteur e Robert Koch (LANDSBERG,

1949). Em 1909, um composto sintético de arsênio chamado Salvarsan, foi

introduzido para tratar pela primeira vez a sífilis (LLOYD et al., 2005).

Posteriormente, Domagk, em 1932, descobriu que um pigmento de cor

vermelha, usado como corante denominado de protosil, possuía atividade

antibacteriana, neste momento descobria-se as sulfas. Esse evento foi o início para

o surgimento de várias outras sulfas que foram produzidas até 1942, como

sulfadiazina, sulfatiazol, sulfaguanidina e sulfamerazina (DOMAGK, 1935).

Em 1942, o termo antibiótico foi usado por Waksman (1947) como

substância elaborada por seres vivos com a capacidade tóxica seletiva usada em

pequenas quantidades sobre os microrganismos. Posteriormente, em 1943, esses

pesquisadores descobriram a estreptomicina, a partir da cultura de Streptomyces

griseus, o que revolucionou o tratamento das infecções por bacilos Gram-negativos

e também por Mycobacterium tuberculosis (WOODRUFF, 2014).

Contudo, a maioria dos antibióticos foi descoberta no período entre 1940 e

1960, designado a “era de ouro” dos antibióticos (BALTZ, 2008; AMINOV, 2010). Na

realidade, esse período foi iniciado com a descoberta da penicilina por Alexander

Fleming, em 1929, quando observou-se que colônias de Staphylococcus aureus,

semeadas em placa de Petri, haviam sido mortas por um composto produzido por

um fungo contaminante, o Penicillium notatum (FLEMING, 1929). Anos depois esse

composto foi isolado e denominado de penicilina, muito usado durante a segunda

guerra mundial (DEMAIN; SANCHEZ, 2009).

O uso clínico da penicilina, em 1940, impulsionou a busca e descobertas de

inúmeros antibióticos, principalmente a partir de culturas de actinomicetos e de

fungos do solo), proporcionando a identificação das tetraciclinas, cefalosporinas,

aminoglocosídeos, macrolídeos, cloranfenicol, glicopeptídeos e rifamicinas, os quais

19

formam a base atual do arsenal terapêutico contra vários agentes infecciosos (2005;

BÉRDY, 2005; PELÁEZ, 2006; OVERBYE; BARRETT, FERNANDES, 2006).

Segui-se a descoberta da neomicina, em 1948, por Lechevalier e Waksman,

um aminoglicosídeo produzido pelo Streptomyces fradiae. Posteriormente, em 1953,

a candicidina, um composto produzido pelo Streptomyces griseus utilizado como

produto antifúngico tópico (DEMAIN, 2006).

Figura 1. Marcos históricos dos antibióticos.

Fonte: Modificado de Wright, Nat. Rev. Microbiol., 2007.

20

2.3 Novos antibióticos

A Associação Americana Food and Drug Administration (US-FDA) aprovou

os dois antibióticos resultantes das modificações da tetraciclina a tigeciclina, primeira

glicilciclina, tendo suas vantagens em termos de espectro, potência e propriedades

farmacocinéticas (COATES et al., 2002). Nos últimos 30 anos, somente a

dalfopristina, daptomicina, platensimicina e linezolida foram inseridos na classe de

novos antibióticos, de forma que a última é considerada uma droga totalmente

sintética (OVERBYE; BARRETT, 2005; COATES et al.,2002; WANG et al., 2006).

Além de antibióticos, muitos metabólitos secundários extraídos de

microrganismos são utilizados como: agentes antitumorais, imunossupressores,

hipocolesterolêmico, inibidores enzimáticos, anti-enxaqueca e antiparasitário

(DEMAIN; FANG, 1999).

Com a descoberta das sulfonamidas e da penicilina os infectologistas da

época imaginaram que a problemática das infecções bacterianas tinha terminado.

No entanto, na década de 30, surgiram alguns casos de infecção por Streptococcus

pyogenes que não respondiam ao uso de sulfas. Posteriormente, na década de 40,

foram isolados S. aureus apresentando resistência às penicilinas (LEVY;

MARSHALL, 2004; PIDOT et al., 2014).

2.4 Resistência microbiana

Estudos mostram que a forma como os antibióticos têm sido utilizados na

medicina, na agricultura e na pecuária tem promovido uma rápida disseminação de

microrganismos resistentes (CHAIT; VETSIGIAN; KISHONY, 2012). O uso abusivo e

de forma indiscriminada, tem sido o principal fator para a emergência de

microrganismos resistentes aos antibióticos (DOERN; TILLOTSON, 2002). O

aumento e a disseminação da resistência aos antibióticos tem se constituído um

grande desafio para a ciência e a medicina principalmente. Segundo a American

Academy of Microbiology (2003), a resistência aos agentes antimicrobianos é uma

consequência natural, inevitável e irreversível do microrganismo, pela seleção frente

à exposição continuada aos antimicrobianos.

Um grande número de bactérias, principalmente as que circulam no

ambiente hospitalar tem demonstrado resistência a múltiplas drogas (MDR, multidrug

21

resistance) o que gera grandes desafios no tratamento. Como exemplo de bactérias

nosocomiais podem ser citadas as mais comumente encontradas, tais como:

Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, A. baumannii, S. aureus,

Enterococcus spp. e várias espécies de Enterobactérias (BOUCHER; TALBOT;

BRADLEY, 2009; LEWIS, 2013; PIDOT, 2014). Relato recente demonstrou a

ocorrência de linhagens multidroga-resistentes de Mycobacterium tuberculosis,

Candida albicans e Aspergillus spp. O crescente aumento da resistência bacteriana,

associado ao investimento reduzido na pesquisa de novos antibióticos poderá tornar

sem eficácia a terapêutica de muitas doenças infecciosas bacterianas, levando a

humanidade de volta a era pré-antibiótica podendo chegar a inúmeras mortes por

ano, mostrado na Figura 2 (NEILL, J. O., 2014; PIDOT et al., 2014; OVERBYE;

BARRETT, 2005).

Figura 2. Mortes atribuídas à resistência antimicrobiana por ano até 2050.

Fonte: Neill, J. O. (2014)

22

2.5 Bactérias produtoras de antimicrobianos

Historicamente, os produtos naturais têm um papel importante na síntese de

muitos antibióticos (NEWMAN, CRAGG; 2007). Como fonte destes produtos,

encontram-se os microrganismos do solo, especialmente os actinomicetos, pois têm

sido a fonte de vários antibióticos, tais como estreptomicina, gentamicina,

cloranfenicol, actinomicina, eritromicina e vancomicina, para citar somente alguns

(CLARDY; 2005).

Os actinomicetos são bactérias produtoras de antibióticos e de outros

compostos bioativos. Eles compreendem um grande grupo de bactérias Gram-

positivas, geralmente filamentosas e esporuladas, com elevado conteúdo de guanina

e citosina no seu material genético, sendo o seu ácido desoxirribonucleico (DNA)

constituído de 57 a 75%, dessas bases (BHATTACHARJEE; BANERJEE; JOSHI,

2012). Possuem em torno de 2.500 espécies, as quais estão distribuídas em 238

gêneros, 37 famílias e nove subordens conhecidas (MÜLLER; WINK, 2014). Elas

têm fornecido cerca de dois terços dos antibióticos conhecidos e continuam a ser a

maior fonte de recursos para descoberta de novos compostos (BÉRDY, 1989). A

ordem Actynomycetales compreende mais de 80 gêneros, como: Micromonospora,

Nocardia e Saccharopolyspora que produzem aminoglicosídeos; Micromonospora e

Saccharopolyspora que sintetizam macrolídeos; Amycolatopsis mediterranei que

produzem ansamicinas (rifamicina); Amycolatopsis orientalis (vancomicina) e

Actinoplanes teichomyceticus (teicoplanina) (EMBLEY, 1994; VARA et al., 2002)

podendo haver outros ainda não conhecidos. A maioria dos metabólitos bioativos

com atividade antibiótica foi isolada de espécies de Streptomyces, um dos gêneros

pertencentes a essa ordem (STACKEBRANDT; RAINEY; WARD-RAINEY, 1997).

Em ambientes naturais como água, plantas, sedimentos e, principalmente,

solo, é possível a detecção de uma quantidade elevada de actinomicetos e outras

bactérias produtoras de substâncias com atividade antibiótica. Estima-se que cerca

de 10% dos isolados bacterianos, em determinadas condições de cultura, têm sido

testadas e menos de 1% do total de produtos naturais tem sido identificado,

podendo significar que uma grande quantidade de metabólitos poderá ser

descoberta e estudada (FISCHBACH; WALSH, 2009; WATVE; TICKOO; JOG,

2001).

O gênero Streptomyces foi proposto por Waksman e Henrici (1943). Muitas

espécies pertencentes a este gênero têm contribuído pela sua capacidade de

23

produção de inúmeros produtos naturais e elevada importância comercial, incluindo

os antibióticos. As espécies pertencentes ao gênero de Streptomyces contem

aproximadamente 649 espécies e 38 subespécies (LEE et al., 2014).

Além dos actinomicetos, outros gêneros bacterianos, tais como:

Myxobacteria, Cyanobacteria, algumas espécies do gênero Pseudomonas e os

Bacillus têm participado como importantes fontes de metabólitos secundários

aplicados na antibioticoterapia (YILMAZ; SORAN; BEYATLI, 2006; MÜLLER; WINK,

2014).

2.6 Fungos produtores de antimicrobianos

Além das bactérias, os fungos constituem outro importante grupo de

microrganismos produtores de substâncias com atividade antimicrobiana. Eles são

classificados como eucariontes e heterotróficos. Eles estão distribuídos em

diferentes locais como solo, água, parasitas de plantas, peixes, insetos e animais

(FEOFILOVA, 2001).

A produção de metabólitos secundários por fungos é um processo complexo

e, em muitos casos, desconhecido, pois leva em consideração o desenvolvimento

morfológico. Tais compostos têm muitas aplicações para a indústria farmacêutica,

incluindo-se a de antibióticos (YU; KELLER, 2005). Entre os inúmeros metabólitos

secundários produzidos pelos fungos, algumas são tóxicas, como as micotoxinas,

que tem poder carcinogênico elevado e são produzidos principalmente pelos fungos

filamentosos Penicillium, Aspergillus e Fusarium, outras são atóxicas, como a

griseofulvina produzida pelo fungo Penicillium griseofulvum que é utilizada no

tratamento de micoses da pele, cabelos e unhas (GUPTA; SAUDER; SHEAR, 1994).

Os antibióticos produzidos pelo Penicillium chrysogenum (Penicillium

notatum) e outras espécies de Penicilium são usados pela indústria farmacêutica na

produção de antibióticos betalactâmicos realizando modificações do anel

betalactâmicos formando penicilinas semissintéticas, como amoxicilina, ampicilina,

oxacilina, meticilina, carbenicilina, ticarcilina e piperacilina (ROLINSON; GEDDES,

2007).

O fungo Cephalosporium acremonium, produz a cefalosporina C e dela são

sintetizados vários representantes desta importante classe de antibióticos (DEMAIN;

ZHANG, 1998). As Cefalosporinas podem ser classificadas por gerações como

24

exemplo podemos citar as de primeira geração: cefalotina, cefadroxil, cefazolina,

cefalexiana; segunda geração: cefuroxima, cefaclor, cefoxitina; terceira geração:

ceftriaxona, cefotaxima, ceftazidima; quarta geração: cefpiroma, cefepime

(ROLINSON; GEDDES, 2007).

Além de compostos antibacterianos, várias metabólitos secundários também

possuem atividade antifúngica, incluindo-se polienos (anfotericina B), azóis

(cetoconazol, itraconazol, fluconazol e voriconazol) e flucitosina, entre outros

(DENNING, 2003). Mais recentemente, uma nova classe de antifúngico tem sido

proposta, a equinocadina, a qual possui como representantes a anidulafungina,

caspafungina e a micafungina (KOFLA; RUHNKE, 2011; CHEN et al.,2013).

Outros importantes metabólitos secundários e o seu respectivo

microrganismo produtor estão mostrados na Tabela 1 (BARRIOS-GONZALEZ;

TOMASINI, 2003).

Tabela 01. Alguns microrganismos e seus metabólitos secundários de importância

industrial.

Atividade Exemplo Microrganismo produtor

Antibacteriana Cefalosporina Acremonium chrysogenum

Cefamicina Streptomyces glavuligerus

Cloranfenicol Streptomyces venezuelae

Eritromicina Saccharopolyspora erythraea

Kanamicina Streptomyces hanamyceticus

Tetraciclina Streptomyces aureofaciens

Penicilina Penicillium chrysogenum

Rifamicina Amycolatopsis mediterranei

Esptinomicina Streptomyces spectablis

Estreptomicina Streptomyces griseus

Antifúngica Anfotericina Streptomyces nodosus

Ácido aspergillico Aspergillus flavus

Aureofacina Streptomyces aureofaciens

Candicidina Streptomyces griseus

Griseofulvina Penicillium griseofulvum

Nistatina Streptomyces nourse

Oligomicina Streptomyces diastachromogenes

Fonte: Adaptado de (BARRIOS-GONZALEZ; TOMASINI , 2003).

25

3. Justificativa

O crescente aumento da resistência microbiana tem gerado uma crise na

saúde pública mundial. A Organização Mundial de Saúde prevê uma catástrofe

devido a esse fenômeno e aponta para a necessidade de grandes investimentos e a

rápida produção de novos antimicrobianos, com o objetivo de contornar a resistência

microbiana (COOPER; SHLAES, 2011).

No entanto, o que tem ocorrido é uma diminuição de indústrias que

desenvolvem projetos visando a descoberta de novos antimicrobianos. Entre 1993 e

2012 existiam mais de vinte grandes indústrias envolvidas nessa área, enquanto que

em 2013 foram relacionados somente quatro grandes indústrias farmacêuticas

investindo em novos antimicrobianos (SHLAES et al., 2013). Este desinteresse da

indústria é justificado pelos grandes investimentos econômicos na descoberta de

novas drogas antimicrobiana e também pelos testes clínicos exigidos pelos órgãos

fiscalizadores de saúde, isso faz com que as indústrias invistam em outros

medicamentos mais lucrativos (PENESYAN; GILLINGS; PAULSEN, 2015).

Atualmente existem poucos antibióticos realmente novos, encontrando-se

apenas variações de classes já conhecidas. Isso conduz a grandes investimentos

para a modificação das moléculas e antibióticos já existentes. Outro problema é que

há uma maior predisposição para a adaptação bacteriana, com seleção de mutantes

resistentes, uma vez que a base da estrutura primaria de vários antibióticos tem sido

empregada há décadas (FERNANDES, 2006).

Ressalta-se a importância de mais estudos que propiciem a descoberta de

novas espécies de microrganismos, bem como a produção de novos metabólitos

que possam ser utilizados como antimicrobianos. Neste contexto, o Estado do

Maranhão possui vários ecossistemas, ainda não estudados em termos de

microbiota produtora de antimicrobianos. Esses ecossistemas incluem manguezais,

cerrados, restingas, florestas, campos, entre outros (Figura 3). Desta forma, há a

possibilidade de detecção de novas espécies de microrganismos produtores de

novas moléculas com atividade antibiótica.

26

Figura 3. Ecossistemas do estado do Maranhão.

Fonte: MARTINS; GALILEO; MARIA HELENA, 2009.

27

4. OBJETIVOS

4.1 Objetivo Geral

Investigar a presença de microrganismos produtores de substâncias com

atividade antimicrobiana em solos oriundos de diferentes ecossistemas do Estado do

Maranhão.

4.2 Objetivos Específicos

Avaliar a atividade antimicrobiana dos microrganismos isolados do solo e seu

antagonismo contra bactérias Gram-positivas, Gram-negativas e fungos,

incluindo-se microrganismos de referência (ATCC) e isolados clínicos;

Identificar os microrganismos isolados do solo pelo sequenciamento do gene

rDNA da subunidade 16S para bactérias e de sequências das regiões ITS de

DNA para os fungos;

Verificar se há relação entre atividade antimicrobiana e a produção das

enzimas fosfatase alcalina, lipases e proteases.

28

5 MATERIAL E MÉTODOS

5.1 Coleta e processamento das amostras de solo

As amostras de solo foram coletadas entre julho de 2011 a abril de 2013 em

dezenove cidades do norte e do leste do Estado do Maranhão. As áreas de coletas

compreenderam municípios com vegetações de restinga, cerrado, campo e mata de

transição. As amostras de solo foram coletadas em locais sem influência antrópica,

até uma profundidade de 10 cm. Os 3 cm da camada superior foram descartados.

As amostras foram misturadas e transportadas em sacos plásticos tipo Zip ao

laboratório, dentro de 4h após a coleta, em recipientes isotérmicos. As amostras

foram submetidas a tamis estéril (2 mm) e processadas no Laboratório de Biologia

Parasitária e no Laboratório de Biologia Molecular do UNICEUMA. As amostras de

solos foram armazenadas a 4ºC, mostrado na Figura 4.

Figura 4: Municípios onde foram coletas amostras de solos.

Fonte: google earth

29

5.2 Isolamento e identificação de microrganismos produtores de antibióticos

presentes no solo

Para o isolamento dos microrganismos um grama de cada amostra de solo

foi suspendido em 9 mL de salina tamponada estéril (Sigma aldrich) e

homogeneizado em agitador de tubos do tipo vortex. As amostras de solo foram

submetidas a diluições seriadas decimais até 10-5 e inoculação em meios de cultura.

Em seguida, alíquotas de 100 µL das diferentes diluições foram inoculadas na

superfície de placas de Petri contendo ágar Cobre (CASIDA et al., 1987), ágar

Sabouraud-dextrose (Difco, EUA) com cloranfenicol e ágar amido-caseína,

espalhando o inoculo com alça de Drigalski. Antes da inoculação em ágar amido-

caseína, as diluições foram previamente submetidas a aquecimento a 60C por 6

minutos, para facilitar o isolamento de Actinomicetos (BHATTACHARJEE;

BANERJEE; JOSHI, 2012). Todas as placas foram incubadas a 28°C em estufa de

B.O.D de 2 a 5 dias (Figura 5). As bactérias isoladas foram estocadas em caldo BHI

com 20% de glicerol e conservadas na temperatura de -20°C. Os fungos foram

armazenados em tubos com água estéril e em tubos com ágar Sabouraud-dextrose

inclinado, os quais foram mantidos ao abrigo da luz. Os isolados foram submetidos à

pesquisa de atividade antimicrobiana. As amostras formadoras de halo de inibição

foram submetidas a testes enzimáticos e identificadas por meio de aspectos

morfotintoriais. Posteriormente, foram feitos os ensaios moleculares de amplificação

e sequenciamento genômico, da região 16S do DNA ribossomal (rDNA), no caso de

bactérias, e das regiões ITS1 e ITS4, para os fungos.

30

Figura 5. Esquema de isolamento de microrganismos do solo e fragmento de meio

de cultura após crescimento dos isolado.

Fonte: O autor (2015).

5.3 Atividade Antimicrobiana

A triagem inicial da atividade antimicrobiana dos isolados microbianos foi

realizada com as cepas de referência de Staphylococcus aureus (ATCC 25923),

Escherichia coli (ATCC 25922) e Candida albicans (ATCC 18804). Suspensões

padronizadas de cada microrganismo foram feitas em solução salina estéril de

acordo com o tubo No. 0,5 da escala de MacFarland (1,8 x 108 UFC/mL). Elas foram

semeadas com auxílio de swab estéril em placas contendo ágar Mueller-Hinton

(para bactérias) ou ágar Sabouraud (para fungos) (BUSTI et al., 2006b). A

determinação da atividade antimicrobiana foi realizada com os isolados microbianos

cultivados em ágar de Benedict (BTT) a 28°C por dez dias. Fragmentos cilíndricos

de diâmetro de 9 mm do meio foram obtidos e depositados sob a superfície do ágar

Mueller-Hinton (para bactérias) ou ágar Sabouraud (para fungos). Os testes foram

considerados positivos quando houve a formação de halo de inibição do crescimento

em torno dos fragmentos (Figura 6). Um fragmento de ágar BTT sem crescimento

microbiano foi empregado como controle negativo dos testes. Após os ensaios de

atividade antimicrobiana com os microrganismos padrão (ATCC), aqueles que

31

demonstraram atividade foram selecionados para os testes de antagonismo com os

seguintes isolados clínicos bacterianos MDR da coleção de culturas do Laboratório

de Microbiologia da Universidade CEUMA: S. aureus IJF1 (Benzilpenicilina,

Clindamicina, Eritromicina, Linezolida, oxacilina), E. faecalis IJF4 (ciprofloxacina,

clindamicina, eritromicina, estreptomicina, gentamicina, moxifloxacina e

norfloxacina), K. pneumoniae CNM7 (Amoxicilina + Clavulanato, Cefuroxima,

Cefalotina, Ceftazidima, ciprofloxacina e Sulfametoxazol + Trimetoprim), P.

aeruginosa IJF3 (amicacina, amoxicilina/ácido clavulânico, ampicilina, cafalotina,

cefepime, ceftriaxona, cefuroxima, ciprofloxacina, gentamicina, meropenem,

nitrofurantoína, norfloxacina, piperacina/tazobactam, trimetroprim/sulfametoxazol e

ácido nalidíxico) e E. coli IJF2 (ampiilina, cefalotina, ciprofloxacina, norfloxacina,

trimetroprim/sulfametoxazol e ácido nalidíxico). Além desses isolados bacterianos,

foi analisado um isolado clínico de C. albicans SV85 da coleção de cultura do

Laboratório de Micologia, gentilmente cedidos pela Profa. Dra. Cristina de Andrade

Monteiro (Figura 7).

Figura 6. Esquema da atividade antimicrobiana de isolado do solo contra bactérias

ATCC.

Fonte: O

autor (2015).

32

Figura 7. Esquema da atividade antimicrobiana de isolado do solo contra

microrganismos de isolados clínicos.


Figura 8 Pesquisa da atividade antimicrobiana em isolados do solo pelo método de

difusão em ágar.

Fonte: O autor (2015). Legenda: Em A: Microrganismo do solo com atividade antimicrobiana

caracterizada pela formação de halo de inibição de crescimento ao redor de fragmentos de

crescimento em B microrganismo sem atividade inibitória (à direita).

A B

33

5.4 Testes de atividade enzimática

Com a finalidade de descartar a possibilidade da atividade antimicrobiana

ser devido a ação enzimática foi desenvolvido um método in house para avaliação

enzimática de Protease em agar “Skim Milk”, fosfatase alcalina com agar BHI com

1% de tween-80 e lípase em agar de Sperber. Para tal, uma alçada de cada cultivo

oriundo do caldo BHI com glicerol, foi semeado em placa com ágar BTT, incubado a

28°C e após 10 dias uma colônia de cada isolado foi repicada com auxílio de agulha

de platina para os devidos meios teste. Os resultados com atividade de protease e

fosfatase alcalina formaram uma zona clara em torno da colônia e da lípase

formação de turbidez. Em seguida o Agar BTT com crescimento de cada isolado foi

cortado em fragmentos e realizados teste sem ebulição e com ebulição. Para

realização dos testes sem ebulição fragmentos dos isolados foram adicionados

sobre a superfície de cada meio de cultura teste e estes testes apresentaram os

mesmos resultados aos das colônias repicadas. Para os testes enzimático com

ebulição fragmentos do agar BTT com crescimento dos isolados foram colocados em

frasco plástico cilíndrico, estéril, de capacidade 1,5 mL e com tampa. Estes foram

colocados no Banho-Maria a 100°C durante 10 minutos. Em seguida foram

invertidos sobre bancada de superfície plana, para solidificação do meio de cultura.

Depois eles foram abertos e realizado um corte transversal no agar utilizando um

bisturi estéril, formando um fragmento cilíndrico de 5 mm de diâmetro por 4 mm de

altura (Figura 9). Como controle para os testes enzimáticos, utilizou-se fragmentos

do meio que não foram fervidos. Os fragmentos foram transferidos com auxílio de

agulha de platina em forma de “L”, previamente flambada e esfriada, para os

respectivos meios de cultura de testes enzimáticos, conforme descrito abaixo, bem

como para os testes de atividade antimicrobiana com ATCC (Figura 10).

34

Figura 9. Esquema do teste de atividade enzimática dos isolados do solo antes e

após ebulição.


Figura 10. Esquema da atividade antimicrobiana de isolado do solo contra

microrganismos ATCC com fragmentos após ebulição.


35

5.4.1 Pesquisa de atividade de proteases

A atividade proteolítica foi considerada positiva quando houve a formação de

uma zona clara ao redor do inóculo por picada e fragmento, dos microrganismos

previamente cultivados em ágar BTT a 28°C/10 dias, realizados em placas de Ágar

Mueller Hinton (HIMEDIA), adicionado de 10% de “Skim Milk” (HIMEDIA), mostrado

na Figura 11 (JAGGE; BAHNER; WARREN, 1983).

Figura 11. Teste de produção de protease de isolado do solo em Ágar Mueller

Hinton adicionado de “Skim Milk”.

Fonte: O autor (2015). Legenda: Em A: teste de protease positiva com a formação de uma

zona clara em torno do fragmento testado, em B: teste de protease negativa sem a zona clara em

torno do fragmento.

5.4.2 Pesquisa de atividade lipases

Para a atividade lipolítica dos microrganismos isolados com atividade

antimicrobiana (formação de halo de inibição) foi utilizado o método descrito por

Edberg, Gallo e Kontnick (1996). Os microrganismos, previamente cultivados em

ágar BTT a 28ºC/ 10 dias, foram semeados por picada e com fragmentos de ágar,

do mesmo modo ao descrito no item 4.4 sem ebulição, da atividade antimicrobiana,

em placas com ágar BHI com 1% de Tween-80. As placas foram incubadas à

temperatura ambiente e avaliadas durante três dias. Os resultados foram

considerados positivos quando houve a formação de um halo turvo ao redor da

picada e do fragmento com crescimento em ágar BTT (Figura 12).

A B

36

Figura 12. Teste de produção de lípase dos isolados do solo em Ágar Mueller

Hinton com 1% de Tween-80.

Fonte: O autor (2015). Legenda: Em A: Teste lipofílico positivo caracterizado por aspecto turvo em torno do

fragmento, em B: teste negativo sem o aspecto turvo em torno do fragmento.

5.4.3 Pesquisa de atividade de fosfatase alcalina

Para a pesquisa de atividade de fosfatase alcalina foi utilizado o ágar de

Sperber em placa (SARIKHANI et al, 2010). Os microrganismos foram previamente

cultivados em ágar BTT a 28ºC por 10 dias, foram semeados por picada e com

fragmentos com crescimento em ágar BTT. A presença de atividade de fosfatase

alcalina foi considerada positiva quando foi observada a formação de cor azul, bem

como pela presença de um halo formado em torno da colônia e ou do fragmento de

ágar do microrganismo após 24 e 48 h (Figura 13).

Figura 13. Teste de produção de fosfatase alcalina de isolado do solo em ágar de

Sperber.

Fonte: O autor (2015). Legenda: Em A: teste de fosfatase alcalina positiva com a formação de uma

zona clara em torno do fragmento testado, em B: teste de protease negativa sem a zona clara em

torno do fragmento.

A B

A B

37

6 Caracterização molecular dos isolados

6.1 Extração de DNA

Para a obtenção do DNA molde dos isolados a ser utilizado nas reações de

amplificação pela Reação em Cadeia da Polimerase, uma alçada dos isolados que

apresentaram algum tipo de atividade antimicrobiana foi inoculada em 5 mL de caldo

BTT, incubado por 5 dias a 28°C. Após o crescimento bacteriano o conteúdo foi

centrifugado por 5 minutos a 10.000 rotações por minuto (rpm) e o sobrenadante foi

descartado. O DNA genômico foi extraído a partir do sedimento microbiano

utilizando-se o kit comercial Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega),

segundo as instruções do fabricante. O DNA dos fungos foi extraído pela técnica

trituração com bastão de vidro e areia da praia estéril (ALVES, 2011). Em seguida o

material genômico obtido foi quantificado por eletroforese de gel de agarose a 0,8%

em tampão TBE 0,5X (Tris-borato-EDTA) [100 mM Tris-base; 2,0 mM de solução 0,5

EDTA (pH 8,0) e 50 mM ácido bórico] a 85 mV durante 1 hora (SAMBROOK;

FRITSCH; MANIATIS, 2001). Após a corrida os géis foram corados em uma solução

de brometo de etídio e água destilada (0,5 µg/mL), durante 20 minutos e observados

em transiluminador de UV, comparando-se a intensidade da coloração da banda

com um padrão comercial de massa molecular. O DNA extraído foi armazenado a -

20°C até o momento do uso.

6.2 Amplificação e análise dos amplicons

Todas as 95 reações foram feitas em termociclador Amplitherm e cada tubo

de reação recebeu 12,5 μL do Master Mix PCR-kit (Promega, Madison – WI, EUA), a

qual continha: 500 U de Taq DNA polimerase, 400 µM de dATP, dGTP, dCTP, dTTP

e 3 mM de MgCl2, acrescido de 10 pmoles (1 μL) de cada iniciador (senso e

antissenso), dependendo do tipo de microrganismo.

Os iniciadores empregados para a amplificação do DNA das actinobacterias

foram especialmente desenhados para este estudo e amplificam um fragmento de

842 pares de base. Estes iniciadores foram denominados: StrepFW: 5’ -

38

CATGCAAGTCGAACGATGAACCTCCT-3’ e StrepRV 5’ -

TCCTTTGAGTTTTAGCCTTGCGG-3’. Para a identificação de outros gêneros

bacterianos foi usado o par de iniciadores 08/FW: 5’ -AGAGTTGTATCCTGGCTCAG

-3’ e 1492/RV 5’ - GGTTACCTTGTTACGACTT-3’, considerados universais que

amplificam um fragmento específico de 1.500 pb da região 16S rDNA, previamente

descritos (WEISBURG et al., 1991). Como molde em cada ensaio de PCR foi

utilizado, aproximadamente, 100 ng do DNA bacteriano extraído e H2O estéril (livre

de nuclease) para completar o volume final de 25 µL. As condições de amplificação

para actinobacterias incluíram um ciclo inicial de 94°C por 5 minutos, seguidos de 30

ciclos de desnaturação a 94°C por 1 minuto, anelamento a 54°C por 1 minuto e

extensão a 72°C por 1 minuto e uma extensão final de 72°C por 6 minutos. As

condições de amplificação com o par de iniciadores universais para outras bactérias

foram um ciclo inicial de 94°C por 5 minutos, seguidos de 30 ciclos de desnaturação

a 94°C por 1 minuto e 10 segundos, anelamento a 53°C por 1 minuto e 10 segundos

e extensão a 72°C por 2 minutos e uma extensão final de 72°C por 7 minutos

(WEISBURG et al., 1991).

Para os fungos filamentosos os iniciadores usados foram FW (ITS1) 5’ -

TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’ e o RV (ITS4) 5’ -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’

que amplificam um fragmento de 645 pb. As amplificações do DNA genômico dos

fungos isolados foram realizados utilizando-se os iniciadores ITS1 e ITS4, os quais

são específicos para a região 18S do DNA ribossômico. As condições de

amplificação foram as seguintes: um ciclo inicial e 94°C por 5 minutos, seguidos de

30 ciclos de desnaturação a 94°C por 30 segundos, anelamento a 56°C por 45

segundos e extensão a 72°C por 2 minutos e uma extensão final de 72°C por 7

minutos (MIRHENDI et al, 2007) 97.

Todos os produtos amplificados nos ensaios de PCR foram analisados por

eletroforese em gel de agarose a 1,2% em tampão TBE 0,5X (Tris-borato-EDTA)

[100mM Tris-base; 2,0 mM de solução 0,5 EDTA (pH 8,0) e 50 mM ácido bórico] a

85 mV durante 1 hora (SAMBROOK; FRITSCH; MANIATIS, 2001). Após a

eletroforese, os géis foram corados em uma solução de brometo de etídio e água

destilada (0,5 µg/mL), durante 20 minutos e observados em transiluminador de UV.

Para a determinação do tamanho dos produtos amplificados pela PCR foi incluído

em cada corrida um marcador de peso molecular de 1Kb DNA ladder (Promega).

39

6.3 Identificação genotípica dos isolados pelo sequenciamento do fragmento

amplificado de DNA

Os produtos de PCR foram purificados com o kit Wizard® SV Gel and PCR

Clean-Up System (Promega), segundo as instruções do fabricante. O

sequenciamento de cada produto purificado foi realizado pelo método da terminação

da cadeia por dideoxinucleotídeos (SANGER; NICKELEN; COULSON, 1977), em

ambas as direções da dupla fita (senso positivo e senso negativo) com o “Kit ABI

Prism BigDye” no sequenciador automático ABI 3130 Genetic Analyser (Applied

Biosystems). Todas as amostras foram sequenciadas pela empresa Myleus

Biotecnologia Ltda, em Belo Horizonte-MG. Para as análises computacionais das

sequencias os eletroferogramas obtidos através do sequenciamento foram

analisados no programa ChromasPro (TechnelysiumPty. Ltd -

http://www.technelysium.com.au/chromas. html). A similaridade das sequências

nucleotídicas obtidas foi verificada com o auxílio do programa BLASTn do pacote

BLAST 2.0 (Basic AlignmentSearch Tool – http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)

(ALTSCHUL et al., 1997). Para as análises comparativas foram selecionadas

aleatoriamente sete amostras de referências de diferentes espécies de

Streptomyces, constantes do Genbank. As sequências foram alinhadas e analisadas

pelo programa MEGA (Molecular Evolutionary Genetics Analysis, versão 3.1)

disponível em: http://www.megasoftware.net/. O nível de reprodutibilidade da árvore

foi garantido pela análise de bootstrap de 1000 repetições.

http://www.technelysium.com.au/chromas.%20html

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/

http://www.megasoftware.net/

40

7 RESULTADOS

7.1 Isolados de solo com atividade antimicrobiano de diferentes cidades do Maranhão

Neste trabalho foram coletadas 65 amostras de solo, nos 19 municípios

pesquisados. Foi verificado que existe grande variedade de morfotipos nas

amostras, pertencentes a diferentes ecossistemas do Estado do Maranhão. Os

aspectos morfológicos de alguns isolados microbianos nos três meios de isolamento

utilizados foram mostrados na Figura 14. Foi selecionada pelo menos uma colônia

de cada tipo morfológico para os ensaios de atividade antimicrobiana, obtendo-se

um total de 599 colônias escolhidas aleatoriamente.

Figura 14. Demonstração do perfil de crescimento de isolados microbianos

recuperados de amostras de solo avaliadas neste estudo

Fonte: O autor (2015). Legenda: Em A: ágar amido-caseína, em B: ágar cobre e em C: ágar

Sabouraud-dextrose.

A B C A

41

7.2 Atividade antimicrobiana de isolados do solo contra cepas de referência

No ensaio de atividade antimicrobiana 95 (15,9%) dos isolados

apresentaram atividade antimicrobiana contra pelo menos um dos microrganismos

ATCC avaliados. Desses isolados, 79 (83,2%) eram bactérias e 16 (16,8%) eram

fungos. Os isolados do solo com atividade antimicrobiana foram detectados em

todas as 19 cidades incluídas no estudo. No entanto, a análise por munícipio revelou

um maior número de isolados por município eram provenientes de Morros (Tabela

2).

A atividade antimicrobiana dos 95 isolados foi caracterizada pela formação

de halo de inibição contra pelo menos uma das cepas padrão testadas (Figura 15).

Um total de 60 (63,2%) isolados apresentou atividade inibitória do crescimento

contra uma única cepa padrão, enquanto que 35 (36,8%) apresentaram atividade

antimicrobiana contra duas ou três das cepas padrão empregadas (S. aureus ATCC

25923, E. coli ATCC 25922 e C. albicans ATCC 18804). Dos isolados que

apresentaram atividade contra mais de uma cepa padrão, 22 (23,2%) eram contra S.

aureus e C. albicans e 10 (10,5%) foram ativos contra os três simultaneamente

(Tabela 3).

A maior frequência de atividade inibitória do crescimento específica foi

observada para C. albicans em 33 (34,7%) dos isolados do solo. No geral, 24

(25,3%) microrganismos apresentaram atividade inibitória contra S. aureus, 33

(34,7%) para C. albicans e apenas três (3,2%) inibiram E. coli. ( Tabela 3).

Dentre as bactérias que demonstraram capacidade inibitória contra os

patógenos de referência testados 40 foram classificadas como outras espécies de

bactérias, 39 como actinomicetos e 16 como fungos (Tabela 4).

Quanto à atividade dos isolados caracterizados como “outras bactérias”

dentre elas: Betaprotobacteria não cultivável, Bacillus, Burkholderia, Paenibacillus e

Pseudomonas foi observada uma frequência de atividade inibitória maior contra C.

albicans (84,6%), seguida por S. aureus (56,4%) e E. coli (17.9%). Os actinomicetos

inibiram em maior frequência C. albicans (65,5%), seguida por S. aureus (60,9%) e

E. coli (17.0%). Enquanto os fungos isolados apresentaram maior frequência de

atividade inibitória contra S. aureus (73,3%), seguida por C. albicans (40%) e E. coli

(13,3%), conforme demonstrado na Tabela 4.

42

Tabela 2. Número de amostras de solo e isolados microbianos testados oriundos

de diferentes cidades do Maranhão.

Cidade No.

Amostras

No. de isolados testados

Microrganismos com atividade

inibitória

Arari 04 43 06

Barreirinhas 04 22 03

Bequimão 03 36 01

Cachoeira Grande 04 26 11

Central do Maranhão 01 11 03

Guimarães 02 24 01

Icatu 04 21 03

Matinha 04 31 06

Morros 04 35 20

Olinda Nova 04 40 07

Palmeirândia 02 17 02

Perimirim 02 12 02

Pinheiro 02 41 01

São Bento 04 27 04

São Luís 07 79 02

São Vicente 04 34 05

Turiaçu 02 37 04

Viana 04 30 06

Vitória 04 33 08

TOTAL 65 599 95

43

Figura 15. Pesquisa da atividade antimicrobiana em isolados do solo pelo método

de difusão em ágar.

Fonte: O autor (2015). Legenda: Em A: Microrganismo do solo com atividade antimicrobiana

caracterizada pela formação de halo de inibição de crescimento ao redor de fragmentos de

crescimento em B microrganismo sem atividade inibitória (à direita).

Tabela 3. Espectro da atividade antimicrobiana dos microrganismos isolados do solo

testado inicialmente contra bactérias ATCC.

Legenda: *SA = S. aureus ATCC 25922; EC = E. coli ATCC 25923; CA = C. albicans ATCC18804

Cepas de referência* Isolados do solo com

atividade inibitória N (%)

SA 24 (25,3)

EC 3 (3,2)

CA 33 (34,7)

EC + SA 2 (2,1)

CA + SA 22 (23,2)

CA + EC 1 (1,0)

CA + EC + SA 10 (10,5)

TOTAL 95 (100)

A B

63,2%

36,8%

44

Tabela 4. Atividade antimicrobiana de isolados de solo contra microrganismos ATCC

por microrganismos identificados.

7.3 Atividade antimicrobiana dos isolados do solo contra amostras clínicas

Dos 95 isolados microbianos com atividade antimicrobiana contra bactérias

MDR e fungos de origem clínica, 43 (58,9%) isolados do solo apresentaram

atividade contra uma única linhagem, enquanto que 18 (24,7%) inibiram duas das

linhagens empregadas no ensaio, incluindo-se C. albicans SV85, E. faecalis IJF4, S.

aureus IJF1. Doze isolados (16,4%) apresentaram atividade contra três a sete

microrganismos, simultaneamente. A maior frequência de isolados com atividade

inibitória do crescimento específica foi observada em 36 (49,3%) isolados do solo

contra C. albicans SV85, seguida da atividade contra E. faecalis IJF4 evidenciada

em seis (8,2%) microrganismos (Tabela 5).

Neste estudo, pode-se verificar que houve maior frequência da atividade

inibitória dos isolados identificados como actinobacterias contra C. albicans SV85

(21/51,2%), seguida por S. aureus IJF1 (17/41,5%), E. faecalis IJF4 (13/31,7%), E.

coli IJF2 (4/9,8%), K. pneumoniae CNM7 (4/9,8%) e (3/7,3%) contra P. aeruginosa

IJF3 (Tabela 6).

Por outro lado, observou-se uma maior frequência de isolados classificados

como “outras bactérias” (76,9%) apresentando atividade inibitória do crescimento de

C. albicans SV85, seguida pela atividade contra bactérias Gram-positivas (S. aureus

IJF1 - 23,0% e E. faecalis IJF4 - 17,9%) e depois contra as bactérias Gram-

negativas (E. coli IJF2 - 10,3% e K. pneumoniae CNM7- 7,7%). Quanto aos fungos

Cepas ATCC Actinobactérias

(N = 39) n (%)

Outras bactérias (N = 40)

n (%)

Fungos (N = 16)

n (%)

Total (N =95) n (%)

C. albicans 27 (65,5) 33 (84,6) 6 (40,0) 66 (69,5)

E. coli 7 (17,0) 7 (17,9) 2 (13,3) 16 (16,8)

S. aureus 25 (60,9) 22 (56,4) 11 (73,3) 58 (61,0)

45

do solo a maior frequência de atividade foi evidenciada contra S. aureus IJF1

(40,0%), seguida por C. albicans SV85 (33,3%), sem evidenciação de atividade

antimicrobiana contra bactérias Gram-negativas.

Tabela 5. Espectro da atividade antimicrobiana dos microrganismos isolados do solo

contra isolados clínicos MDR.

Legenda: CA = C. albicans SV85; EC = E. coli IJF2; KP = K. pneumoniae CNM7; PAC = P. aeruginosa IJF3; SA = S. aureus IJF1; EF = E. faecalis IJF4.

Isolados clínicos N (%)

EF 1 (1,4)

CA 36 (49,3)

SA 6 (8,2)

CA + SA 3 (4,1)

CA + EF 3 (4,1)

CA + SA 3 (4,1)

SA + EF 9 (12,3)

CA + EC + SA 1 (1,4)

CA + SA + EF 4 (5,5)

CA + EC + EF 1 (1,4)

KP + EC + SA 1 (1,4)

CA + KP + EC + SA 1 (1,4)

CA + KP + EC + SA + EF 1 (1,4)

CA + KP + PA + EC + SA + EF 3 (4,1)

TOTAL 73 (100)

36,8%

16,4%

24,7%

58,9%

46

Tabela 6. Atividade antimicrobiana de isolados de solo contra isolados clínicos.

7.4 Avaliação da atividade enzimática de proteases, lipases e fosfatase alcalina

e atividade antimicrobiana após ebulição.

Com o objetivo de confirmar se a atividade inibitória observada era pela

produção de substâncias antimicrobianas e não em decorrência da eventual

participação de algumas enzimas que poderiam afetar a viabilidade dos

microrganismos teste, foram realizados ensaios para as enzimas fosfatase alcalina,

protease e lipase, com e sem ebulição, bem como da atividade antimicrobiana. No

geral, foi observado que a atividade era de fato causada por substâncias

antimicrobianas e não pela atividade enzimática (Tabela 7).

Contudo, alguns resultados inconclusivos foram obtidos, principalmente com

relação à pesquisa de protease. Quatorze isolados mostraram atividade de protease

após a ebulição, dos quais 11 (78.5%) apresentaram atividade antimicrobiana. Neste

caso, não se pode afirmar se a atividade inibitória observada era de fato decorrente

de algum antibiótico ou devido à ação de alguma enzima proteolítica. Quanto aos

Isolados clínicos

Actinobactérias (N = 39)

n (%)

Outras bactérias (N = 40)

n (%)

Fungos (N = 16)

n (%)

Total (N = 95)

n (%)

C. albicans 21 (51,2) 30 (76,9) 5 (33,3) 56 (58,9)

S. aureus 17 (41,5) 9 (23,0) 6 (40,0) 32 (33,7)

E. faecalis 13 (31,7) 7 (17,9) 2 (13,3) 22 (23,2)

E. coli 4 (9,8) 4 (10,3) - 8 (8,4)

K. pneumoniae 4 (9,8) 3 (7,7) - 7 (7,4)

P. aeruginosa 3 (7,3) - - 3 (3,2)

47

outros 81 isolados os resultados sugeriram se tratar da ação de alguma substância

antimicrobiana, seja um antibiótico conhecido ou não.

Tabela 7. Avaliação da atividade enzimática dos isolados do solo em relação à

atividade antimicrobiana antes e após ebulição.

Isolados do solo

Atividade antimicrobiana

Protease Lipase Fosfatase Alcalina

Ebulição

antes após antes após antes após antes após

Actinobactérias 39 32 19 4 30 1 34 -

Outras bactérias 40 32 17 8 24 - 29 1

Fungos 16 10 7 2 5 - 12 -

TOTAL 95 74 43 14 59 1 75 1

7.5. Identificação molecular dos isolados do solo

A análise de identificação genotípica dos isolados com atividade

antimicrobiana avaliados neste estudo mostrou a presença de seis gêneros

bacterianos: Kitasatospora, Streptomyces, Bacillus., Burkholderia, Paenibacillus e

Pseudomonas. Quanto aos fungos filamentosos foram identificados três gêneros:

Aspergillus, Penicillium, e Trichoderma.

Dos 95 isolados que apresentaram atividade antimicrobiana, 79 (83,2%)

foram identificados fenotipicamente como bactérias e 16 (16,8%) como fungos

filamentosos. Com o objetivo de fazer uma identificação molecular desses isolados,

iniciadores específicos foram desenhados baseados na região do rDNA da

subunidade 16S de Actinomicetos.



48

Os resultados de amplificação por PCR com os iniciadores mostraram um

fragmento específico de 842 pb, como esperado (Figura 16) para 39(41,1%) dos

isolados bacterianos. O DNA dos 40 restantes que não amplificaram com este par

de iniciadores foram submetidos a PCR com iniciadores universais 08F e 1492R e

todos mostraram um fragmento específico de 1.500 pb. Os isolados identificados

fenotipicamente como fungo tiveram o seu DNA amplificado com iniciadores

específicos para as regiões ITS1 e ITS4 sendo observado um fragmento de 645 pb

(Figura 16).

Figura 16: Perfis de amplificação pela Reação em Cadeia pela Polimerase de

alguns isolados do solo com os diferentes iniciadores utilizados no presente estudo.

Fonte: O autor (2015). Legenda: Gel de agarose 1,2% com os produtos da PCR de alguns

isolados do solo amplificados com iniciadores universais para bactérias 8F e 1492 RV (229, 474

e 360). Perfil do isolado nº. 299 com o iniciador para actinomicetos. Perfil do isolado 478 com os

iniciadores ITS1 e ITS4. PM = padrão de tamanho molecular 100 pb DNA ladder.

7.6 Análise de similaridade genética das sequências dos isolados em relação

às sequências do Genbank

Do total de 95 isolados microbianos de solos 50 foram identificados somente

em nível de gêneros, 35 em nível de espécies e nove ainda não identificados. Dos

39 isolados que tiveram o seu DNA amplificado por PCR com o par de iniciadores

desenhados para detectar Actinomicetos, 32 (82%) foram sequenciados até o

645pb

100pb 229 299 474 360 478

842 pb

1500 pb

49

momento. Destes 19 (48,7%) foi identificada como pertencente ao gênero

Streptomyces. Além desse, o gênero Kitasatospora também foi identificado com este

par de iniciadores. Dos 39 isolados amplificados, sete ainda não tiveram o seu

produto de PCR sequenciado para a identificação molecular da espécie (Tabelas 8 e

9).

Dos 40 isolados microbianos que tiveram seu DNA amplificado com o par de

iniciadores universais 08F e 1492R, 16 (40%) foram identificados como

Burkholderia. Outros gêneros bacteriano identificados foram: Paenibacillus (dois

isolados), Bacillus (um) e Pseudomonas (cinco isolados) (Tabelas 8 e 9).

Com relação aos 16 isolados fúngicos que tiveram o seu material genético

amplificado com os iniciadores específicos para a região intergênica (ITS1 e ITS4) a

maioria 14 (87,5%) foi utilizado através da sequenciada. Destes, 5 (35, 7%) foi

identificada como pertencente a espécie Aspergillus terreus. Além disso, outros

isolados foram identificados em nível de gênero: Aspergillus (quatro isolados),

Penicillium (um isolado) e Trichoderma (um isolado) (Tabelas 8 e 9).

A análise das sequencias dos isolados para a busca de similaridade

genética foi feita através da comparação com sequencias existentes no GenBank.

Para tal, foram utilizados os programas BLASTn do pacote BLAST 2.0 (BASIC

ALIGNMENT SEARCH TOOL), desenvolvido pelo NCBI (ALTSCHUL et al., 1997),

para a busca de sequencias similares. A análise comparativa das sequencias

obtidas dos produtos de PCR com os iniciadores desenhados para actinobactérias,

para o par de iniciadores universais para bactérias, bem como para os fungos,

revelaram similaridade que variou entre 99 a 100% com sequências depositadas no

Genbank (Tabela 9).



50

Tabela 8. Diversidade e frequência de microrganismos do solo identificados por

sequenciamento com iniciadores desenhados para Actinobactérias, Universais para

a região 16S do rDNA de bactérias e para região ITS de fungos.

Microrganismos N (%)

Actinobactérias 39 (41,1)

Kitasatospora spp. 05 (5,2)

Kitasatospora griseola 01 (1,0)

Streptomyces spp. 19 (20,5)

Streptomyces albospinus 01 (1,0)

Streptomyces aureofaciens 01 (1,0)

Streptomyces cinnamoneus 01 (1,0)

Streptomyces parvulus 01 (1,0)

Streptomyces rameus 01 (1,0)

Streptomyces racemochromogenes 01 (1,0)

Streptomyces lannensis 01 (1,0)

Ainda não sequenciado 07 (7,4)

Outras Bactérias 40 (42,1)

Bacillus amyloliquefaciens 04 (4,2)

Bacillus mojavensis 01 (1,0)

Bacillus sp. 01 (1,0)

Bacillus tequilensis 04 (4,2)

Betaprotobacteria não cultivável 01 (1,0)

Burkholderia cepacia 03 (3,1)

Burkholderia spp. 16 (17,1)

Paenibacillus polymyxa 02 (2,1)

Pseudomonas aeruginosa 02 (2,1)

Pseudomonas spp. 06 (6,3)

Fungo filamentoso 16 (16,8)

Aspergillus ochraceopetaliformis 01 (1,0)

Aspergillus tamari 01 (1,0)

Aspergillus fumigatus 01 (1,0)

Aspergillus spp. 02 (2,1)

Aspergillus terreus 05 (5,6)

Paecilomyces lilacinus 01 (1,0)

Penicillium singorense 01 (1,0)

Penicillium sp. 01 (1,0)

Trichoderma harzianum 01 (1,0)

Ainda não sequenciado 02 (2,1)

TOTAL 95








51

Tabela 9. Análise de similaridade genética das sequências dos isolados do solo das

diferentes cidades em relação às sequências do Genbank.

Local Isolado Tamanho pb

Identidade Similaridade (%)

Iniciadores

Arari 546 1406 B. tequilensis 99 GALKIEWICZ et al., 2008

553 1404 B. tequilensis 99 GALKIEWICZ et al., 2008

560 840 Kitasatospora sp. 99 O autor

545 1395 Pseudomonas sp. 99 GALKIEWICZ et al., 2008

526 734 Streptomyces sp. 99 O autor


Barreirinhas 601 894 B. tequilensis 99 GALKIEWICZ et al., 2008

599 1351 Burkholderia sp. 100 GALKIEWICZ et al., 2008

600 586 P. lilacinus 100 GALKIEWICZ et al., 2008

Bequimão 563 935 B. amyloliquefaciens 99 GALKIEWICZ et al., 2008

Cachoeira Grande

263 601 A. terreus 99 MIRHENDI et al., 2007

264 564 A. terreus 97 MIRHENDI et al., 2007




242 821 S. cinnamoneus 99 O autor





Central do Maranhão

578 594 A. fumigates 100 MIRHENDI et al., 2007

576 944 B.amyloliquefaciens 99 GALKIEWICZ et al., 2008

03 630 T. harzianum 99 MIRHENDI et al., 2007

Icatu 304 929 Burkholderia sp. 99 GALKIEWICZ et al., 2008


Matinha 430 963 Burkholderia sp. 99 GALKIEWICZ et al., 2008


407 840 K. grisiola 99 O autor



Morros

214 927 B. cepacia 99 GALKIEWICZ et al., 2008


213 917 Burkholderia sp. GALKIEWICZ et al., 2008








234 928 Betaprotobacteria não

cultivável 99 GALKIEWICZ et al., 2008























52

Local Isolado

Tamanho pb

Identidade Similaridade

(%) Iniciadores


221 842 S. aureofaciens 99 O autor

228 812 Streptomyces rameus 99 O autor





Olinda Nova 361 595 P. singorense 99 MIRHENDI et al., 2007


385 831 S. parvulus 99 O autor



Palmeirândia 196 645 A. tamari 99 MIRHENDI et al., 2007


Perimirim 193 974 Pseudomonas sp. 99 GALKIEWICZ et al., 2008


Pinheiro 586 498 Penicillium sp. 99 MIRHENDI et al., 2007

São Bento 278 600 A. terreus 99 MIRHENDI et al., 2007

275 937 Bacillus sp. 99 GALKIEWICZ et al., 2008

265 914 P.aeruginosa 99 GALKIEWICZ et al., 2008

268 835 S. lannensis 98 O autor

São Luís 574 596 A. ochraceopetaliformis 100 MIRHENDI et al., 2007

570 610 A. terreus 99 GALKIEWICZ et al., 2008

São Vicente 338 680 Burkholderia sp. 99 GALKIEWICZ et al., 2008

323 842 Kitasatospora sp 100 O autor

319 899 P. polymyxa 99 GALKIEWICZ et al., 2008

322 893 P. polymyxa 99 GALKIEWICZ et al., 2008


Turiaçu 09 957 B. mojavensis 99 GALKIEWICZ et al., 2008




Viana 463 589 Aspergillus sp. 99 MIRHENDI et al., 2007

453 609 A.terreus 99 MIRHENDI et al., 2007

451 909 B. tequilensis 99 GALKIEWICZ et al., 2008

458 920 P. aeruginosa 99 GALKIEWICZ et al., 2008

450 820 S. racemochromogenes 100 O autor


Vitória 487 618 Aspergillus sp. 99 MIRHENDI et al., 2007

474 985 B. amyloliquefaciens 99 GALKIEWICZ et al., 2008

502 948 B. amyloliquefaciens 99 GALKIEWICZ et al., 2008

516 810 S. albospinus 99 O autor



Nota: Nove isolados ainda não foram sequenciados: Cachoeira Grande (1), Guimarães (1), Icatu (1),

Morros (1), Olinda Nova (2), São Luís (1) e Vitória (2).

























53

Para a determinação da inferência filogenética entre as sequências

consensos obtidas a partir dos sequenciamentos dos produtos de PCR amplificados

com os três diferentes pares de iniciadores StrepFW/ StrepRV, (842pb) universais

8F e 1492R (1.500pb) e os específicos para a região ITS1 e ITS4 (645pb) de fungos,

foram feitos alinhamentos individualizados das sequencias de cada par de iniciador.

Para tal, diferentes sequencias existentes no Genbank foram utilizadas para a

construção da árvore filogenética com o uso do programa MEGA versão 5.2.2

(TAMURA et al., 2013). Os seguintes parâmetros foram utilizados: algoritmo

UPGMA-Unweighted Pair-Group Method using arithmetic Averages, no qual os

pares de sequências que mostram a menor distância evolutiva são agrupados em

primeiro lugar e o grau de confiança ou reprodutibilidade (Bootstrap) de 1.000

repetições.

Para as sequencias obtidas com o fragmento de 842pb para bactérias do

gênero Actinomyces foi feito o alinhamento com sequencias de diferentes espécies

pertencentes a esse gênero bacteriano: Streptomyces sp (17 sequencias);

Kitasatospora sp. (4 sequencias), Streptomyces aureofaciens (3 sequencias) e uma

de cada das seguintes espécies: Streptomyces owasiensis, Streptomyces violaceus,

Streptomyces parvulus, Streptomyces cinnamoneus, Streptomyces roseoverticillatus,

Streptomyces thioluteus, Streptomyces flocculus, Streptomyces sclerotialus,

Streptomyces chattanoogensis, Streptomyces albospinus, Streptomyces galbus,

Streptomyces racemochromogenes, Streptomyces chromofuscus, Streptomyces

lannensis, Kitasatospora azatica, Streptomyces purpeofuscus, Kitasatospora

griseola, Streptomyces cinereorectus, Streptomyces aureofaciens, Streptomyces

aburaviensis, Streptomyces avellaneus, Streptomyces psammoticus e Streptomyces

xanthocidicus (Figura 17).

Para o alinhamento das sequencias obtidas com os iniciadores universais

para a região 16S do rDNA dos isolados bacterianos, com diferentes sequencias do

Genbank dos seguintes gêneros Burkholderia spp, Pseudomonas spp e Bacillus spp.

(Figura 18).

As sequencias obtidas dos isolados com os iniciadores ITS1 e ITS4 de

fungos foram alinhadas com sequencias do Genbank de diferentes espécies dos

gêneros Aspergillus, Penicillium, e Trichorderma (Figura 19).

54

Figura 17. Árvore filogenética dos isolados de Actinomicetos isoladas de diferentes

tipos de solos do Estado do Maranhão.

55

Figura 18. Árvore filogenética obtida com sequencias dos isolados identificados com

o par de iniciadores universais 8F e 1492R e sequencias de bactérias existentes no

Genbank.

56

Figura 19. Árvore filogenética mostrando o grupamento das sequencias dos

fungos isolados a partir de amostras de solos do Estado do Maranhão.

57

8. DISCUSSÃO

A procura por microrganismos produtores de substâncias com algum tipo de

atividade biológica tem crescido muito nos últimos anos. Para esse fim, diferentes

ecossistemas têm sido pesquisados, entre os quais o solo tem sido uma importante

fonte para estudos de bioprospecção, a fim de se detectar microrganismos

produtores de novas moléculas com potencial aplicação na medicina (fármacos), na

agricultura (agroquímicos) e em estudos de processos biológicos (biologia química)

(BEATTIE et al., 2005)

Neste contexto, o presente estudo teve por objetivo investigar a atividade

antimicrobiana de bactérias e fungos isolados de solos de diferentes municípios do

Estado do Maranhão contra microrganismos de referência e isolados de importância

clínica. Os dados demonstraram uma variedade de microrganismos com a referida

atividade no solo dos municípios avaliados, com espectro de atividade contra S.

aureus (ATCC 25923), E. coli (ATCC 25922) e C. albicans (ATCC 18804), bem como

contra isolados clínicos Gram-positivos e Gram-negativos com perfil de

multirresistência.

Os métodos moleculares utilizados para identificar os isolados que

apresentaram atividade inibitória contra os patógenos testados mostram vários

gêneros e espécies de microrganismos. A maior frequência de atividade

antimicrobiana dos isolados identificados por biologia molecular como pertencentes

ao gênero Actinomyces foi evidenciada contra C. albicans do que contra bactérias,

no geral. Este achado corrobora com os resultados de diferentes pesquisadores.

Relatos prévios de Saadoun e Saadoun (2003) mostraram que 18%, dos 116

diferentes isolados de Streptomyces, de solo do norte da Jordânia, exibiram

atividade contra C. albicans. Semelhantemente Kang; Janice e Donald (2010)

encontraram actinobacterias isoladas do solo de Lewiston, Estados Unidos da

America, com forte atividade contra C. albicans. Também outros trabalhos

demonstraram que novos compostos químicos podem ser obtidos de

microrganismos do solo. Foram observados por Wang et al (2014) que quatro

compostos químicos denominados de (4S)-4,10-dihidroxidodeca-2-en-1,4-olide,

(4S)-4,8,10-trihidroxi-10-metildodeca-2-en-1,4-olide, MKN-003B e MKN-003C

58

produzidos por bactérias do solo caracterizada como Streptomyces, apresentaram

atividade antifúngica.

Os actinomicetos são reconhecidos pela produção de vários tipos de

antibióticos como peptídeos, glicopeptídeos, tetraciclinas, fenazinas, macrolídeos,

antraquinona, polienos, lactonas e outros (DEMAIN; FANG, 1999). Entre os gêneros

de Actinomicetos mais comumente associados a essa atividade estão algumas

espécies de Streptomyces produtoras de metabólitos de importância na medicina e

na indústria farmacêutica (CLARDY; 2005). Eles são responsáveis por mais de

2.400 de diferentes produtos de mais de 1.900 estirpes e subestirpes (WATVE;

TICKOO; JOG, 2001; LUCAS; SENGER; ERXLEBEN, 2013). Cerca de dois terços

de antibióticos e de uma grande variedade de metabólitos secundários, como

agentes anti-helmínticos, antifúngicos e herbicidas tem sido produzidos a partir de

culturas de Streptomyces spp. (BEKKER et al., 2014; KAWAGUCHI et al., 2013).

As cepas de referência de S. aureus avaliadas no presente estudo também

demonstraram sensibilidade aos metabólitos produzidos pelas bactérias do gênero

Streptomyces isoladas de solo. Estudo feito por Lee et al. (2014) evidenciou que um

isolado do gênero Streptomyces denominado de MUSC 135 contra S. aureus.

Semelhantemente outro estudo mostrou um novo actinomiceto denominado de BT-

408 produziu um antibiótico com excelente atividade contra S. aureus resistente a

meticilina (SUJATHA; RAJU; RAMANA, 2005).

A resistência de S. aureus aos antibióticos tem demonstrado ser um grave

problema de saúde pública e se destaca como um grande desafio na busca de

novos compostos químicos para debelar ou controlar os efeitos patogênicos desta

bactéria na clínica (MORELL; BALKIN, 2010).

Outro gênero isolado e identificado neste estudo e que também demonstrou

atividade contra C. albicans foi Burkholderia. Muitas espécies de Burkholderia tem

habilidade de produzir vários metabólitos biologicamente ativo, incluindo-se

compostos antifúngicos (PARTIDA-MARTINEZ, 2005). Quando Li et al (2008)

investigaram um composto denominado de CF66I produzido pela espécie de

Burkholderia cepacia verificaram uma excelente atividade contra C. albicans onde o

composto interagiu contra a parede celular do fungo e apresentou capacidade de

penetração na célula. Este dado corrobora com os resultados deste estudo e pode

explicar a ação antifúngica observada nos isolados de solos maranhenses.

59

O gênero Burkholderia está presente em vários nichos ecológicos, como

solo, água, rizosfera de plantas, em pessoas, vários animais e ambiente hospitalar

(COENYE; VANDAMME, 2003). Algumas espécies são patógenos humanos

oportunistas, como a Burkholderia pseudomallei, que é o agente causador da

melioidose, bem como o complexo Burkholderia cepacia (Bcc) que possui mais de

17 espécies diferentes dentre elas: B. cepacia, Burkholderia multivorans,

Burkholderia cenocepacia, Burkholderia stabilis, Burkholderia vietnamiensis,

Burkholderia dolosa, Burkholderia ambifaria, Burkholderia anthina, Burkholderia

pyrrocinia, Burkholderia ubonensis, Burkholderia latens, Burkholderia diffusa,

Burkholderia arboris, Burkholderia seminalis, Burkholderia metallica, Burkholderia

lata, Burkholderia contaminans. Embora algumas espécies de Burkholderia estejam

envolvidas em infecções humanas elas também são capazes de produzir

metabólitos biologicamente ativos como o composto antifúngico rizoxina (PARTIDA-

MARTINEZ; PIDOT et al., 2014; THOMAS, 2007). Outros estudos relatam, ainda, a

presença de compostos antifúngicos produzidos por Burkholderia como

lipopeptideos (Kang et al., 1998), cepaciamidas A e B (YING et al.,1996),

cepacidinas (LEE et al., 1994), altericidina (KIRINUKI; ICHIBA; KATAYAMA, 1984),

pirronitrina (ARIMA et al., 1964), glidobactinas (SHOJI et al., 1990;

SCHELLENBERG; BIGLER; DUDLER, 2007), fenazinas (CARTWRIGHT; CHILTON;

BENSON, 1995) e 2-hidroximetil-cromo-4-one (KANG al.,2004).

Os isolados de Burkholderia deste estudo também apresentaram atividade

antimicrobiana contra a cepa ATCC de S. aureus. Embora algumas espécies deste

gênero possuam representantes classificados como patógenos oportunistas

humanos, como do complexo Burkholderia cepacia, essas bactérias são também

capazes de produzir metabólitos biologicamente ativos, inclusive antimicrobianos

(CORDOVA-KREYLOS et al., 2013). O gênero Burkholderia além de produzir vários

compostos antifúngicos, já citados anteriormente, são também capazes de produzir

compostos de amplo espectro de ação, como a enaciloxina que possui atividade

antimicrobiana, contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas (WATANABE;

IZAKI; TAKAHASHI, 1982; PIDOT et al., 2014). É provável que a atividade

antimicrobiana de Burkholderia observada contra o S. aureus pode ser explicada

pela grande quantidade de metabólitos produzidos por essa bactéria, incluindo-se a

pirrolnitrina que tem ação contra bactérias Gram-positivas (VIAL et al., 2007). Já as

enaciloxinas, outro grupo de compostos antibacterianos produzidos por Burkholderia

60

(WATANABE; IZAKI; TAKAHASHI, 1982; MAHENTHIRALINGAM et al., 2011), tem

demonstrado atividade contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas. Esses

achados corroboram com os resultados da presente pesquisa, onde foi observada

uma excelente atividade antimicrobiana de Burkholderia contra S. aureus ATCC e

isolados clínicos com perfil de multirresistência.

Neste trabalho, os isolados do solo identificados como pertencentes ao

gênero Pseudomonas apresentaram atividade inibitória contra C. albicans, em

concordância com este resultado Morales et al. (2010) mostraram que P. aeruginosa

inibiu C. albicans através de um novo composto fenazinico denominado 5-metil-

fenazina-1-ácido carboxílico. Além disso, em outro estudo, Morales et al. (2013)

também observaram efeito toxico dos fenazínicos piocianina, metassulfato de

fenazina e fenazina-1-carboxilato contra C. albicans a partir de metabólitos

produzidos por P. aeruginosa. É possível que estes compostos sejam os

responsáveis pelos resultados da atividade inibitória das Pseudomonas isoladas

contra as C. albicans nesta pesquisa.

O gênero Pseudomonas é composto por mais de 60 espécies e estão

presentes em uma grande variedade de ambientes, como: solo, água, superfície de

plantas e animais. Algumas dessas bactérias estão envolvidas em infecções

humanas, incluindo-se P. aeruginosa, causando fibrose cística e outras infecções

oportunistas, mas também associada com a produção de metabólitos secundários,

inclusive alguns com atividade antibiótica (GROSS; LOPER, 2009).

Muitos metabólitos microbianos têm um papel importante na aquisição de

nutrientes, na virulência e na defesa contra competidores nos ambientes naturais

onde estão presentes. Dentre os metabólitos com atividade contra competidores e

predadores estão os antimicrobianos com ação contra fungos fitopatogenos

(ANJAIAH et al., 1998; NIELSEN et al., 2002; BOLWERK et al., 2003). A pirrolnitrina

é um metabólito biologicamente ativo que possui forte ação antifúngica sendo

produzido inicialmente por Pseudomonas pyrocinia (GROSS; LOPER, 2009) e

depois relatada por outras espécie de Pseudomonas, assim como outros

microrganismos, como: Enterobacter agglomerans, Myxococcus fulvus, Burkholderia

spp. e Serratia spp. Esse composto é muito usado na agricultura e também pela

indústria farmacêutica como antimicótico tópico (GROSS; LOPER, 2009).

O 2,4-diacetil-floroglucinol produzido por Pseudomonas é composto que

também possui ação antifúngica contra fitopatógenos (DE WERRA et al., 2011),

61

assim como outros compostos como o 2,5-dialquilresorcinol (NOWAK-THOMPSON

et al., 2003), orfamidas (GROSS et al., 2007), rizoquicinas (IWASAKI et al., 1984).

Dados sugestivos de que esses, ou outros compostos ainda não identificados,

podem estar relacionados à ação antifúngica dos isolados de Pseudomonas contra

C. albicans observada na presente pesquisa.

A atividade antifúngica que foi observada pelos isolados do solo identificados

como Paenibacillus polymyxa contra C. albicans pode estar relacionada, ou não,

com a produção de compostos como a piocianina, metasulfato de fenazina e a

fenazina -1-carboxilato descritos por Beatty e Jensen (2002). Estudos realizados

com a bactéria P. polymyxa SCE2, isolada de solo do cerrado brasileiro,

constataram uma inibição do crescimento de bactérias Gram-positivas, Gram-

negativas e de fungos (SELDIN et al., 1999; ROSADO; SELDIN, 1993), o que está

em consonância com o observado neste estudo.

Um achado interessante neste estudo foi que as amostras de C. albicans

testadas foram sensíveis à ação de metabólitos produzidos pelos fungos

filamentosos A. tamarii, A. fumigatus, A. terreus, P. lilacinus e Trichoderma

harzianum. Estudo de Kawaguchi et al. (2013) com 151 fungos isolados do solo de

Kanagawa e Tokyo, no Japão, dos quais 29 fungos de diferentes gêneros, com

atividade contra C. albicans, entre estes estão Aspergillus e Trichoderma. A

literatura relata que os fungos filamentosos são conhecidos pela produção de grande

variedade de compostos bioativos de baixo peso molecular, principalmente

antibióticos (BRAKHAGE; SCHROECKH, 2011).

Os isolados de fungos identificados por biologia molecular como: Aspergillus

sp., A. terreus, P. lilacinus, Penicillium spp., P. singorense e Trichoderma harzianum

sp., também apresentaram efeito inibitório contra S. aureus ATCC 25923 e S. aureus

de isolado clínico MDR. Esses fungos já foram relatados na literatura como

produtores de compostos com atividade antimicrobiana (ISOGAI et al., 1980;

CAZAR; SCHMEDA-HIRSCHMANN; ASTUDILLO, 2005; ELAASSER; ABDEL-AZIZ;

EL-KASSAS, 2011; AHLUWALIA et al., 2014). Quanto ao P. singorense, até onde se

sabe, este estudo foi o primeiro a relatar a sua atividade antimicrobiana. Na

realidade, trata-se de uma nova espécie recentemente catalogada (VISAGIE et al.,

2014).

Além dos fungos produtores de metabólitos biologicamente ativo isolados

por métodos tradicionais, o conhecimento de técnicas de biologia molecular através


62

do uso de estratégias de ativação de cassetes de genes silenciosos pode levar a

descoberta de inúmeros novos metabólitos de fungos filamentosos, principalmente

do gênero Aspergillus com diversas aplicações (BRAKHAGE; SCHROECKH, 2011).

É importante notar que existem isolados com atividade especifica, enquanto

outros podem apresentar atividade contra múltiplos agentes bacterianos e até

fungos. Nesse aspecto, a maioria dos isolados do solo maranhense apresentou

atividade específica, ou seja, contra apenas uma espécie de microrganismo, 60

(63,2%) dos isolados testados contra cepas ATCC e 43 (58,9%) dos isolados contra

microrganismos clínicos, enquanto outros mostraram ação contra dois ou mais

microrganismos. Existem algumas possibilidades que explicam este fato, uma é que

estes microrganismos produzam mais de um composto com atividade antimicrobiana

e a outra é que eles produzam um composto com intensa ação citotóxica, a qual

afetaria a viabilidade de qualquer célula inclusive bactérias e fungos ao mesmo

tempo. Espécies de Streptomyces produzem simultaneamente inúmeros compostos

com atividade biologicamente ativa contra bactérias Gram-negativas, Gram-positivas

e fungos (WATVE; TICKOO; JOG, 2001). Como a espécie S. albospinus, que produz

metabólito fungicida denominado fenamida (MAKKAR et al, 1995) e também

compostos com ação bactericida contra Gram-positivos, atribuída à fenelfamicina G

e H (BRÖTZ; et al., 2011). Nesse sentido, supõe-se que esses metabólitos, ou

outros, ainda não descritos, possam explicar a ação antimicrobiana observada no

presente estudo, com os isolados de S. albospinus do solo maranhense. Dessa

forma, acredita-se que existam espécies ainda desconhecidas pertencentes a

ecossistemas ainda não explorados, como observado na presente pesquisa, as

quais poderiam levar a grandes expectativas na descoberta de novos

antimicrobianos.

Poucos isolados tiveram atividade contra as bactérias Gram-negativas

avaliadas, tais como E. coli, K. pneumoniae e P. aeruginosa. Em um estudo feito por

Busti et al. (2006b), em solo da floresta de Gerenzeno, na Itália foi encontrado um

isolado, denominado Gamma 22, com ação contra bactérias Gram-positivas,

Micrococcus luteus e B. subtillis, porém o mesmo apresentou fraca atividade contra

E. coli. Ainda, outro estudo realizado com isolados de solo demonstrou maior

atividade contra bactérias Gram-positivas do que bactérias Gram-negativas

(GONZÁLEZ et al., 2005). Estes dados confirmam os resultados do presente estudo

63

que mostrou poucos isolados produtores de atividade antimicrobiana contra

bactérias Gram-negativas.

Nas duas últimas décadas, a busca de novos antimicrobianos tem mostrado

que há maior dificuldade na descoberta de novos metabólitos bioativos contra

bactérias Gram-negativas do que contra as Gram-positivas. Entre essas estão E.

coli, K. pneumoniae e P. aeruginosa, as quais são as bactérias Gram-negativas que

mais têm demonstrado perfil MDR (RICE, 2008; BASSETTI; FRANCESCA;

MALGORZATA, 2011).

As bactérias Gram-negativas são também mais resistentes aos

antimicrobianos do que as bactérias Gram-positivas por vários mecanismos,

inclusive porque as bactérias Gram-negativas possuem uma membrana externa

constituída de lipopolissacarídeos que funciona como uma barreira contra a entrada

de drogas antimicrobianas (HANCOCK, 1997). Outra explicação por esta pouca

suscetibilidade aos isolados de solo são os mecanismo de bomba de efluxo, que

bactérias como Pseudomonas e E. coli possuem, expulsando compostos estranhos

à célula bacteriana e desta forma os compostos responsável pela atividade

antimicrobiana não seriam capazes de atuar contra estas bactérias (LEVY, 1992).

Ainda outra hipótese poderia explicar este resultado através do mecanismo de

resistência mediada por enzimas inativadoras e modificadoras, onde compostos

produzindo pelos isolados do solo poderia ser destruído por enzimas das bactérias

Gram-negativas (LEVY; MARSHALL, 2004).

Considerando que a análise filogenética revelou a identidade potencial de 86

isolados e que 45 isolados não foram definidos em nível de espécie, pode-se deduzir

que a atividade antimicrobiana observada pode ser decorrente de metabólitos já

conhecidos e de outros ainda não descritos. A produção de metabólitos secundários

pode ser influenciada pelo nicho ecológico, produção de mecanismos de defesa com

o objetivo de manter sua sobrevivência contras outros microrganismos (KUMBHAR;

WATVE, 2013).

Por outro lado, vale ressaltar que a identificação molecular pelo

sequenciamento do fragmento de DNA da subunidade 16S e da região ITS dos

isolados permitiu o conhecimento das relações filogenéticas entre os

microrganismos deste estudo e as sequências de DNA microbiano existentes no

Genbank. Com isso, utilizou-se esta identificação para fazer uma análise

comparativa do perfil morfológico obtido, para cada um dos isolados, com imagens

64

disponíveis em artigos publicados. O resultado dessa análise mostrou que o

sequenciamento foi importante na determinação e/ou identificação final dos isolados.

Finalmente, o isolamento em solo maranhense de diferentes espécies de

microrganismos com atividade contra os patógenos: C. albicans, S. aureus, E.

faecalis e outras microrganismos testados, poderá mostrar novas perspectivas para

o desenvolvimento de antimicrobianos a partir desses isolados. Principalmente,

porque muitos deles não apresentaram similaridade genética com microrganismos

de antibióticos já conhecidos, indicando que pode-se estar diante de novos

microrganismos. Consequentemente, há um potencial inerente de descoberta de

novos antibióticos a serem caracterizados em estudos posteriores.

65

9. CONCLUSÕES

O solo do Estado do Maranhão contém microrganismos com ação

antimicrobiana, principalmente antifúngica e contra bactérias Gram-positivas,

contudo, uma boa parcela ainda não foi identificada. Entre estes gêneros é possível

haver espécies não catalogadas que produzem novos compostos antimicrobianos

farmacologicamente viáveis para tratamento de infecções causas por

microrganismos multirresistentes. A atividade inibitória observada neste estudo não

está relacionada a alguma atividade enzimática, o que sugere que, de fato, há uma

produção de metabólitos com atividade antimicrobiana afetando a viabilidade das

cepas e linhagens indicadoras testadas.

Houve uma predominância de isolados identificados apenas em nível de

gênero, ou seja, não foram caracterizados do ponto de vista molecular,

considerando-se a análise filogenética realizada. Desta forma, abre-se um leque de

possibilidades de refinamento do trabalho, com o objetivo de identificar as espécies

e os compostos responsáveis pelas atividades antimicrobianas aqui observadas.

Obviamente, mais estudos com o emprego de técnicas mais avançadas, como por

exemplo, a utilização de microchips para cultivos de microrganismo, são necessários

a fim de elucidar se estes compostos já foram descritos na literatura ou não.

66

10 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

AHLUWALIA, V.; KUMAR, J.; SISODIA R.; SHAKIL, N. A. Walia S. Green synthesis of silver nanoparticles by Trichoderma harzianum and their bioefficacy evaluation against Staphylococcus aureus and Klebsiella pneumonia. Ind. Crops Prod., v. 55, p. 202-206, 2014. ALTSCHUL, S. F.; MADDEN, T. L.; SCHÄFFER, A. A.; ZHANG, J.; ZHANG, Z.; MILLER, W.; LIPMAN, D. J. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res, v. 25, n. 17, p. 3389–3402,

1997. ALVES, M. B. Uso de marcadores ardra (Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis) para análise de polimorfismo genético de espécies do gênero Candida. Monografia 2011, instituto federal de educação ciência e tecnologia do Maranhao. American Academy of Microbiology Antimicrobial Resistance – an ecological perspective. Amer Acad of Microbiol, Washington, 2003. AMINOV, R. I. A brief history of the antibiotic era: lessons learned and challenges for the future. Frontiers in Microbiology, v.1, p. 1-7, 2010.

ANJAIAH, V.; KOEDAM, N.; NOWRK-THOMPSON, B.; LOPER, J.; HÖFTE, M.; TAMBONG, J.; CORNELIS, P. Involvement of phenazines and anthranilate in the antago nism of Pseudomonas aeruginosa PNA1 and Tn5 derivatives Toward Fusarium spp. and Pythium spp. Mol Plant Microbe Interact, v. 11, p. 847-854, 1998. ARIMA, K.; IMANAKA, H.; KOUSAKA, M.; FUKUDA, A.; TAMURA, G. Pyrrolnitrin, a new antibiotic substance, produced by Pseudomonas. Agric Biol Chem. v. 28, p. 575-576, 1964. BALTZ, R. H. Renaissance in antibacterial discovery from actinomycetes. Curr. Opin. Pharmaco, v. 8, p. 557-563, 2008. BARRIOS-GONZALEZ; TOMASINI, J. A. Microbial Secondary Metabolites Production and Strain Improvement, Indian J. of Biotech., v. 2, p. 322-333, 2003.

BASSETTI, M.; FRANCESCA, G.; MALGORZATA, M. “New Treatment Options against Gram-Negative Organisms.” Critical Care, v. 15, n. 2, p. 1-9, 2011. BEATTIE, A.J.; BARTHLOTT, W.; ELISABETSKY, E.; FARREL, R.; KHENG, C.T.; PRANCE, I.; ROSENTHAL, J.; SIMPSON, D.; LEAKEY, R.; WOLFSON, M.; TEN KATE, K.;. New products and industries from biodiversity. In: HASSAN, R.; SCHOLES, R.; ASH, N. (Eds.), Ecosystems and Human Well-Being: Current State and Trends, Island Press, Washington, DC, p. 271e 296, 2005.

67

BEATTY, P.H.; JENSEN, S. E. Paenibacillus polymyxa produces fusaricidin-type antifungal antibiotics active against Leptosphaeria maculans, the causative agent of blackleg disease of canola. Can. J. Microbiol., v. 48, p. 159-169, 2002.

BEKKER, V.; AMANDA D.; DEAN, B.; KARL R. Tools for metabolic engineering in Streptomyces. Bioengineered, p. 293–299, 2014. BÉRDY, J. Bioactive microbial metabolites. J Antibiot, v. 58, p. 1–26, 2005. BHATTACHARJEE, K.; BANERJEE, S.; JOSHI, S. R. Diversity of Streptomyces spp. in Eastern Himalayan region - computational RNomics approach to phylogeny. Bioinformation. v. 8, p. 548–554, 2012. BIBB, M. J. Regulation of secondary metabolism in streptomyces. Curr. Opin. Microbiol, v. 8, p. 208- 215, 2005.

BOLWERK, A.; LAGOPODI, A. L.; WIJFJES, A. H.; LAMERS, G. E.; CHIN, A. W. T.; LUGTENBERG, B. J.; BLOEMBERG, G. V. Interactions in the tomato rhizosphere of two Pseudomonas biocontrol strains with the phytopathogenic fungus Fusarium oxysporumf. sp. radicis-lycopersici. Mol Plant Microbe Interact, v. 16, p. 983-993, 2003. BOUCHER, H. W; TALBOT, G. H; BRADLEY, J. S. Bad bugs, no drugs: no ESKAPE! An update from the Infectious Diseases Society of America, Clinical Infectious Diseases, v. 48, p. 1-12, 2009.

BRAKHAGE, A; SCHROECKH, V. Fungal secondary metabolites-strategies to activate silent gene clusters. Fungal Genet. Biol, v. 48; p. 15-22, 2011. BRÖTZ, E.; KULIK, A.; VIKINESWARY, S.; LIM, C.-T.; TAN, G. Y. A.; ZINECKER, H.; IMHOFF, J. F.; PAULULAT T., FIEDLER, H. P. Phenelfamycins G and H, new elfamycin-type antibiotics produced by Streptomyces albospinus Acta 3619, J. Antibiot., v. 64, p. 256-266, 2011.

BUSTI, E.; CAVALETTI, L.; MONCIARDINI, P.; SCHUMANN, P.; ROHDE, M.; SOSIO, M.; DONADIO, S. Catenulispora acidiphila gen. nov., sp. nov., a novel, mycelium-forming actinomycete, and proposal of Catenulisporaceae fam. nov. Int J Syst Evol Microbiol. v. 56, p. 1741-1746, 2006a. BUSTI, E; MONCIARDINI, P., CAVALETTI, L;, BAMONTE, R; LAZZARINI, A; SOSIO, M; DONADIO, S. Antibiotic-producing ability by representatives of a newly discovered lineage of actinomycetes. Microbiology, v. 152, p. 675-683, 2006b. CARTWRIGHT, D. K.; CHILTON, W. S.; BENSON, D. M. Pyrrolnitrin and phenazine production by Pseudomonas cepacia, strain 5.5B., a biocontrol agent of Rhizoctonia solani. Appl Microbiol Biotech. v. 43, p. 211-216, 1995. CASIDA, L. E. Relation to copper of N-1, a nonobligate bacterial predator. Appl. Environ. Microbiol, v. 53, p. 1515-1518, 1987.

68

CAZAR, M. E.; SCHMEDA-HIRSCHMANN, G.; ASTUDILLO L. Antimicrobial butyrolactone I derivatives from the ecuadorian soil fungus Aspergillus terreus thorn. Var terreus World. J. Microb. Biotechnol. v. 21, p. 1067-1075, 2005.198

CHAIT, R.; VETSIGIAN, K.; KISHONY, R. What counters antibiotic resistance in nature? Nat. Chem. Biol., v. 8, p. 2-5, 2012. CHEN, L; YUE, Q.; ZHANG, X.; XIANG, M.; WANG, C.; LI, S.; CHE, Y.; ORTIZ-LOPEZ, F.J.; BILLS, G.F.; LIU, X. Genomics-driven discovery of the pneumocandin biosynthetic gene cluster in the fungus Glarea lozoyensis.BMC Genomics, v. 14, 2013. CLARDY, J. Using genomics to deliver natural products from symbiotic bacteria. Genome Biol. v. 6, p. 232, 2005. COATES, A.; HUE, Y.; BAX, R.; PAGE, C. The future challenges facing the development of new antimicrobial drugs. Nat Rev. Drug Discov, v.1, p. 895-910,

2002. COENYE, T.; VANDAMME, P. Diversity and significance of Burkholderia species occupying diverse ecological niches. Environ. Microbiol, v. 5, p. 719-729, 2003.

COOPER, M.A.; SHLAES, D. Fix the antibiotics pipeline, Nature, v.472, 2011.

CORDOVA-KREYLOS, A. L.; FERNANDES, L. E.; KOIVUNEN, M.; YANG, A.; WEILER, L. F.; MARRONE, P. G. Isolation and Characterization of Burkholderia rinojensis sp. nov., a Non-Burkholderia cepacia Complex Soil Bacterium with Insecticidal and Miticidal Activities. Applied Environm Microbiol, v. 79, p. 7669– 7678, 2013. DE WERRA, P.; HUSER, A.; TABACCHI, R.; KEEL, C.; MAURHOFER, M.; Plant and Microbe-Derived Compounds Affect the Expression of Genes Encoding Antifungal Compounds in a Pseudomonad with Biocontrol Activity. Applied Environm Microbiol, v. 77, p. 2807-2812, 2011. DEMAIN, A. L. From natural products discovery to commercialization: a success story. J. Indus Microb. Biotech., v. 33, p. 486-495, 2006.

DEMAIN, A. L; ZHANG, J. Cephalosporin C production by Cephalosporium acremonium: the methionine story. Crit. Rev.Biotechnol, v.18, p. 283-294, 1998. DEMAIN, A. L; SANCHEZ, S. Microbial drug discovery: 80 years of progress. J. Antibiot, v. 62, p. 5-16, 2009.

DEMAIN, A.L.; FANG, A. Pharmaceutically Active Secondary Metabolites of Microorganisms. Appl. Environm. and Biotec., v. 52, p. 455–63, 1999. DENNING, D. W. Echinocandin antifungal drugs. Lancet, v.4, p.1142-1151, 2003.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23688303


69

DOERN, G. V.; TILLOTSON G. S. What have we learned about antimicrobial prescribing? Antimicrob. Infect. Dis. Newsl, v. 18, p. 81- 86, 2002. DOMAGK, G. Ein beitrag zur chemotherapie der bakteriellen infektionen. Dtsch. Med. Wschr, v. 7, p. 250–253, 1935.

EDBERG, S. C; GALLO, P.; KONTNICK, C. Assessing health risk in drinking water from naturally occurring microbes. J Environ Health, v. 58, p. 18–24, 1996. ELAASSER, M. M.; ABDEL-AZIZ, M. M.; EL-KASSAS, R. A. Antioxidant, antimicrobial, antiviral and antitumor activities of pyranone derivative obtained from Aspergillus candidus. J. Microbiol. Biotech. Res., v. 4, p. 5-17, 2011. EMBLEY, T. M.; STACKEBRANDT E. The molecular phylogeny and systematics of the actinomycetes. Ann Rev Microbiol, v. 48, p. 257–289, 1994.

FEOFILOVA, E. P., The Kingdom fungi: Heterogeneity of physiological and biochemical properties and relationships with plants, animals, and prokaryotes (Review). Appl. Bioch. and Microbiol., v. 37, p. 124 – 137, 2001.

FERNANDES, P. Antibacterial discovery and development - the failure of success? Nat Biotechnol, v.24,p. 1497-503, 2006. FISCHBACH, M.A; WALSH, C.T. Antibiotics for emerging pathogens. Science. v. 325, p. 1089-1093, 2009. FLEMING, A. On the antibacterial action of cultures of a Penicillium, with special reference to their use in the isolation o B. influenzae. British J Experim Pathol, v. 10, p. 226-236, 1929 (reimpressão Review of Infectious Diseases 2:129-139, 1980). FOSTER, W.; RAOULT, A. Early descriptions of antibiosis. J R Coll Gen Pract., v.

24, p. 889-894, 1974. GALKIEWICZ, J.P.; KELLOGG, C.A. Cross-kingdom amplification using bacteria-specific primers: complications for studies of coral microbial ecology. Appl. Environ. Microbiol.,v. 74, p. 7828-783, 2008. GONZÁLEZ, I.; SACIDO, A. A.; ANDERSON, A.; GENILOUD, O. Actinomycetes isolated from lichens: Evaluation of their diversity and detection of biosynthetic gene sequences. FEMS Microbiol. Ecol., v. 54, p. 401-415, 2005. GROSS, H.; LOPER, J. E. Genomics of secondary metabolite production by Pseudomonas spp. Nat Prod Rep, v. 26, p.1408-1446, 2009. GROSS, H.; STOCKWELL, V. O.; HENKELS, M.; NOWAK-THOMPSON, B.; LOPER, J. E.; GERWICK, W. H. The genomisotopic approach A systematic method to isolate products of orphan biosynthetic gene clusters. Chemistry and Biology, v. 14, p. 53-

63, 2007.

70

GUPTA, A. K.; SAUDER, D. N.; SHEAR, N. H. Antifungal agents: an overview. Part I. J. Am. Acad. Dermatol. St. Louis, v. 31, n. 3, p. 51-55, 1994. HANCOCK, R. E.: The bacterial outer membrane as a drug barrier. Trends in Microbiology, v. 5, p. 37-42, 1997. HARVEY, A. L. Natural products in drug discovery. Drug Discov. Today, v. 13, p. 894–901, 2008. ISOGAI A, SUZUKI A, HIGASHIKAWA S, KUYAMA S, TAMURA S. Isolation and Biological Activity of a Peptidal Antibiotic P168. Agric. Biol. Chem. v. 4, p. 1023-1024, 1981. IWASAKI, S.; KOBAYASHI, H.; FURUKAWA, J; NAMIKOSHI, M.; OKUDA, S; SATO, Z; MATSUDA, I.; NODA, T. Studies on macrocyclic lactone antibiotics. VII. Structure of a phytotoxin "rhizoxin" produced by Rhizopus chinensis. J Antibiot, v. 37, p. 354-

362, 1984. JAGGER, K. S.; BAHNER, D. R.; WARREN, R. L. Protease phenotypes of Pseudomonas aeruginosa isolated from patients with cystic fibrosis. J. Clin. Microbiol., v. 17, p. 55-59, 1983. KANG, J. G.; SHIN, S. Y.; KIM, M. J.; BAJPAI, V.; MAHESHWARI, D. K.; KANG, S. C. Isolation and anti-fungal activities of 2-hydroxymethyl-chroman-4-one produced by Burkholderia sp. MSSP.J Antibiot, v. 57, p. 726-731, 2004. KANG, M. J.; JANICE, L. S.; DONALD, L. C. “Isolation and haracterization of Potent Antifungal Strains of the Streptomyces Violaceusniger Clade Active against Candida Albicans.” J. Ind. Microbiol. Biotech., v. 37, p. 35-41, 2010. KANG, Y.; CARLSON, R.; THARPE, W.; SCHELL, M. A. Characterization of Genes Involved in Biosynthesis of a Novel Antibiotic from Burkholderia cepacia BC11 and Their Role in Biological Control of Rhizoctonia solani. Appl. Environ. Microbiol., v. 64, n. 10, p. 3939-3947, 1998. KAWAGUCHI, M.; NONAKA, K.; MASUMA, R.; TOMODA. "New method for isolating antibiotic-producing fungi."The Journal of antibiotics, v. 66, n. 1, p. 17-21, 2012. KLEINKAUF, H.; VON DOHREN, H. A nonribosomal system of peptide biosynthesis. Eur. J. Biochem., v. 236, p. 135-151, 1996.

KIRINUKI, T.; ICHIBA, T.; KATAYAMA, K. General survey of action site of altericidins on metabolism of Alternaria kikuchiana and Ustilago maydis. J Pestic Sci, v. 9, p. 01-610, 1984. KOFLA, G.; RUHNKE, M. Pharmacology and metabolism of anidulafungin, caspofungin and micafungin in the treatment of invasive candidosis – review of the literature. Eur J Med Res, v.16, p. 159-66, 2011.

71

KUMBHAR, C.; WATVE, M. Why antibiotics: comparative evaluation of different hypotheses for the natural role of antibiotics and an evolutionary synthesis, Nat Sci, v. 5, p. 26-40, 2013.

LANDSBERG, H. Prelude to the discovery of penicillin. Isis, v. 40, p. 225-227, 1949.

LEE L. H.; ZAINAL, N.; AZMAN, A. S.; ENG, S. K; AB MUTALIB, N. S; YIN, W.F; CHAN K. G. Streptomyces pluripotens sp. nov., a bacteriocin-producing streptomycete inhibiting methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., v. 64, p. 3297 – 3306, 2014. LEE, C. H.; KIM, S.; HYUN, B.; SUH, J. W.; YON, C.; KIM, C. Cepacidine A, a novel antifungal antibiotic produced by Pseudomonas cepacia. I. Taxonomy, production, isolation and biological activity. J Antibiot, v. 47, p.1402-1405, 1994. LEVY, S. B. Active efflux mechanisms for antimicrobial resistance. Antimicrob. Agen. Chemot., v. 36, p. 695-703, 1992.

LEVY S. B.; MARSHALL, B., Antibiotic resistance worldwide: cause, challenges and response. Nat. Med., v.10, p. 122-129, 2004. LEWIS K. Platforms for antibiotic discovery. Nat. Rev. Drug Discov, v. 12, p. 371-387, 2013. LI, X.; QUAN, C. S.; YU, H. Y.; FAN, S. D. Multiple effects of a novel compound from Burkholderia cepacia against Candida albicans. FEMS Microbiol. Lett., v. 285, p. 250-256, 2008. LLOYD, N. C.; MORGAN, H. W.; NICHOLSON, B. K; RONIMUS, R. S. The Composition of Ehrlich's Salvarsan: Resolution of a Century-Old Debate. Angew. Chem. Int., v. 44, p. 941-944, 2005.

LUCAS, X.; SENGER, C.; ERXLEBEN. A. StreptomeDB: a resource for natural compounds isolated from Streptomyces species. Nucleic Acids Res, v. 41, p. 1130-1136, 2013. MAHENTHIRALINGAM, E.; SONG, L.; SASS, A.; WHITE, J.; WILMOT, C.; MARCHBANK, A.; BOAISHA, O.; PAINE, J.; KNIGHT, D.; CHALLIS, G.L. Enacyloxins are products of an unusual hybrid modular polyketide synthase encoded by a cryptic Burkholderia ambifaria Genomic Island. Chem. Biol., v. 18, p. 665-677, 2011. MARTINS, U. R.; GALILEO, M. H.; LIMEIRA-DE-OLIVEIRA, F.. Cerambycidae (Coleoptera) do estado do Maranhão, Brasil. Pap. Avulsos Zool., v. 49, p. 229-247, 2009. MAKKAR, N. S.; NICKSON, T. E.; TRAN, MINHTIEN; B. N.; MILLER-WIDEMAN, M. L. JON; MCGARY, CAROLYN, I.; STONARD, R. Phenamide, a fungicidal metabolite from Streptomyces albospinus A19301: Taxonomy, fermentation, isolation, physico-chemical and biological properties. J. Antibiot., v. 48, n. 5, p. 369-374, 1995.

72

MIRHENDI, H., DIBA, K., KORDBACHEH, P., JALALIZAND, N., MAKIMURA K. Identification of pathogenic Aspergillus species by a PCR-restriction enzyme method. J. Med. Microbiol., v. 56, p. 1568-1570, 2007. MORALES, D. K; GRAHL, N; OKEGBE, C; DIETRICH, L. E.; JACOBS, N. J; HOGAN, D. A.Control of Candida albicans metabolism and biofilm formation by Pseudomonas aeruginos a phenazines. MBio, v. 4, n. 1, p. 1-9, 2013. MORALES, D. K.; JACOBS, N. J.; RAJAMANI, S.; KRISHNAMURTHY, M.; CUBILLOS-RUIZ, J. R, HOGAN, D. A. Antifungal mechanisms by which a novel Pseudomonas aeruginosa phenazine toxin kills Candida albicans in biofilms. Mol Microbiol, v. 78, n. 6, p. 1379-92, 2010.

MORELL, E. A.; BALKIN, D. M. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus: a pervasive pathogen highlights the need for new antimicrobial development. Yale J Biomol Med, v. 83, p. 223-233, 2010.

MÜLLER, R.; WINK, J. Future potential for anti-infectives from bacteria - how to exploit biodiversity and genomic potential. Int. J. Med. Microbiol, v. 304, p. 3-13, 2014. NEILL, J.O. Review on Antimicrobial Resistance. Antimicrobial resistance: tackling a crisis for the health and wealth of nations. Review on Antimicrobial Resistance, London, United Kingdom, 2014. Disponível: http://amrreview.org/sites/default/files/-AMR%20Review%20Paper%20%20Tackling%20a%20crisis%20for%20the%20health%20and%20wealth%20of%20nations_1.pdf. NEWMAN, D. J.; CRAGG, G. M. Natural products as sources of new drugs over the last 25 years. J. Nat. Prod, v. 70, p. 461–477, 2007. NIELSEN, T. H.; SORENSEN, D.; TOBIASEN, C.; ANDERSEN, J. B.; CHRISTOPHERSEN, C.; GIVSKOV, M.; SORENSEN, J. Antibiotic and biosurfactant properties of cyclic lipopeptides produced by fluorescent Pseudomonas spp. from the sugar beet rhizosphere. Appl. Environ. Microbiol. v. 68, p. 3416-3423, 2002.

NOWAK-THOMPSON, B.; P. E. HAMMER, D. S.; HILL, J. STAFFORD, N.; TORKEWITZ, T. D.; GAFFNEY, S. T.; LAM, I. 2,5-Dialkylresorcinol biosynthesis in Pseudomonas aurantiaca: Novel head-to-head condensation of two fatty acid derived precursors. J. Bacteriol. 2,5-Dialkylresorcinol biosynthesis in Pseudomonas aurantiaca: Novel head-to-head condensation of two fatty acid derived precursors. J, v. 185, p. 860-869, 2003. OSBURNE, M. S.; GROSSMAN, T. H.; AUGUST, P. R.; MACNEIL, I. A. Tapping into microbial diversity for natural product drug discvery. ASM, v. 66, p. 411- 417, 2002.

OVERBYE, K. M; BARRETT, J.F., Antibiotics: where did we go wrong? Drug Discovery Today, v. 10, p. 45, 2005.





http://amrreview.org/sites/default/files/-AMR%20Review%20Paper%20%20Tackling%20a%20crisis%20for%20the%20health%20and%20wealth%20of%20nations_1.pdf



73

PARTIDA-MARTINEZ, L. P.; HERTWECK, C. Pathogenic fungus harbours endosymbiotic bacteria for toxin production. Nature, v. 437, p. 884-888, 2005. PELÁEZ, F. The historical delivery of antibiotics from microbial natural products can history repeat. Bioch. Pharmacol., v. 71, p. 981-990, 2006.

PENESYAN, A.; GILLINGS, M.; PAULSEN, I. Antibiotic discovery: combatting bacterial resistance in cells and in biofilm communities. Molecules. v. 20, p. 5286-5298, 2015. PIDOT, S. J.; COYNE, S.; KLOSS, F.; HERTWECK, C. Antibiotics from neglected bacterial sources. Int. J. Med. Microbiol., v. 304, p.14-22, 2014. POTTER, C. S.; MEYER, R. E. The Role of Soil Biodiversity in Sustainable Dryland Farming Systems. Adv. Soil Sci., v.13, p. 241-5, 1990. 219

RICE, L. B. Federal funding for the study of antimicrobial resistance in nosocomial pathogens: No ESKAPE. Journal of Infectious Diseases, v. 197, n. 8, p. 1079-108, 2008. ROLINSON, G. N.; GEDDES, A. M. The 50th anniversary of the discovery of 6-aminopenicillanic acid (6-APA). Int. J. Antimicrob. Agents., v. 29, p. 3-8, 2007. ROSADO, A. S; SELDIN, L. Production of a potentially novel anti-microbial substance by Bacillus polymyxa. World Journal of Microbiology and Biotechnology, v. 9, p. 521-528, 1993. SAADOUN, I., GHARAIBEH, R. The Streptomyces flora of Badia region of Jordan and its potential as a source of antibiotics active against antibiotic-resistant bacteria. J. Arid. Environ, v.53, p. 365-371, 2003. SAMBROOK, J.; FRITSCH, E. F.; MANIATIS, T. Molecular Cloning: a laboratory manual. 2nd ed. N.Y., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, v. 3, 2001. SANGER, F.; NICKELEN, S.; COULSON, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. v. 74, p. 5463-5467, 1977.

SARIKHANI, M. R.; MALBOOBI, M. A.; ALIASGHARZAD, N., GREINER, R.;YAKHCHALI, B. Functional screening of phosphatase-encoding genes from bacterial sources. Iran. J. Biotech., v. 8, p. 275-280, 2010.

SCHELLENBERG, B.; BIGLER, L.; DUDLER, R. Identification of genes involved in the biosynthesis of the cytotoxic compound glidobactin from a soil bacterium. Environ Microbiol, v. 9, p. 1640-1650, 2007. SELDIN, L.; DE AZEVEDO, F. S.; ALVIANO, D. S.; ALVIANO, C. S.; DE FREIRE BASTOS, M. C. Inhibitory activity of Paenibacillus polymyxa SCE2 against human pathogenic micro-organisms. Lett. Appl. Microbiol., v. 28, n. 6, p. 423-427, 1999.

74

SHLAES, D. M.; SAHM, D.; OPIELA, C.; SPELLBERG, B. The FDA reboot of antibiotic development. Antimic. Agen Chemot, v. 57, p. 4605-4607, 2013. SHOJI, J.; HINOO, H.; KATO, T.; HATTORI, T.; HIROOKA, K.; TAWARA, K. Isolation of cepafungins I, II and III from Pseudomonas species. J Antibiot, v. 43, p. 783-787,

1990. STACKEBRANDT, E.; RAINEY, F. A; WARD-RAINEY, N. L. Proposal for a new hierarchic classication system, Actinobacteria classis nov. Int. J. Syst. Bacteriol. v.

47, p. 479-491, 1997. STAUNTON, J.; WEISSMAN, K. J. Polyketide biosynthesis: a millennium review. Nat. Prod. Rep., v. 18, p. 380, 2001.

SUJATHA, K. V. S. N.; RAJU, B.; RAMANA, T. Studies on a New Marine Streptomyces BT- 408 Producing Polyketide Antibiotic SBR-22 Effective Against Methicillin Resistant Staphylococcus aureus. Microbiolog. Res, v. 169, p. 119 - 126,

2005. TAMURA, K.; STECHER, G.; PETERSON, D.; FILIPSKI, A.; KUMAR, S. MEGA 6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6. Mol. Biol Evolution, v.30,

p.2725-2729, 2013. WANG, T.; YI, J.; KAI-XIA, M. A; YI-QING L.I.; RONG, H., XIAO-SONG, X., SHAO-HUA, W.U. Two New Butenolides Produced by an Actinomycete Streptomyces

sp, Chem. Biodivers, v. 11, p. 929-933, 2014. TAVARES, W. Antibióticos e Quimioterápicos para o clínico, 1ª ed. São Paulo: Atheneu; 2006. THOMAS, M. S. Iron acquisition mechanisms of the Burkholderia cepacia complex. Biometals, v. 20, p. 431-452, 2007.

VARA, A. G., HOCHKOEPPLE, A., NIELSEN, J. AND VILLADSEN, J.. Production of teicoplanin by Actinoplanes teichomyceticus in continuous fermentation. Biotechnol. Bioeng., v. 77, p. 589–598, 2002.

VIAL, L.; GROLEAU, M.C; DEKIMPE, V.; DÉZIEL, E. Burkholderia diversity and versatility: an inventory of the extracellular products. J. Microbial. Biotechnol., v. 17, p. 1407 – 1429, 2007. VISAGIE, C. M; HOUBRAKEN, J; FRISVAD, J. C; HONG, S. B; KLAASSEN, C.H; PERRONE, G; SEIFERT, K. A; VARGA, J; YAGUCHI, T.; SAMSON, R. A. Aspergillus, Penicillium and Talaromyces isolated from house dust samples collected around the world, Stud. in Mycol, v. 78, p. 63–139, 2014.

WAKSMAN, S. A.; HENRICI, A. T. The nomenclature and classification of the actinomycetes. J. Bacteriol, v. 46, p. 337–341, 1943.

http://phdtree.org/pdf/26524607-two-new-butenolides-produced-by-an-actinomycete-streptomyces-sp/

http://phdtree.org/pdf/26524607-two-new-butenolides-produced-by-an-actinomycete-streptomyces-sp/

75

WAKSMAN, S. A. What is an antibiotic or an antibiotic substance? Mycologia, v. 39,

p. 565–569, 1947. WANG, J.; SOISSON, S. M.; YOUNG, K.; SHOOP, W.; KODALI, S.; GALGOCI, A.; PAINTER, R.; PARTHASARATHY, G.; TANG, Y. S.; CUMMINGS, R.; HÁ, S.; DORSO, K.; MOTYL, M.; JAYASURIYA, H.; ONDEYKA, J.; HERATH, K.; ZHANG, C.; HERNANDEZ, L.; ALLOCCO, J.; BASILIO, A.; TORMO, J.R.; GENILLOUD, O.; VICENTE, F.; PELAEZ, F.; COLWELL, L.; LEE, S. H.; MICHAEL. B.; FELCETTO, T.; GILL, C.; SILVER, L. L.; HERMES, J.D.; BARTIZAL, K.; BARRETT, J.; SCHMATZ, D.; BECKER, J. W.; CULLY, D.; SINGH, S. B. Platensimycin is a selective FabF inhibitor with potent antibiotic properties. Nature, v. 441, p. 358-361, 2006.

WATANABE, T.; IZAKI, K.; TAKAHASHI, H. New polyenic antibiotics active against Gram-positive and negative bacteria. I. Isolation and purification of antibiotics produced by Gluconobacter sp. W-315. J. Antibiot, v. 35, p. 1141-1147, 1982.

WATVE, M. G. R.; TICKOO, M. M. JOG, B. D. Bhole.How many antibiotics are produced by the genus Streptomyces? Arch Microbiol, v. 176, p. 386-390, 2001. WEISBURG, W. G. S. M; BARNS, D. A.; PELLETIER; LANE, D. J. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study. J. Bacteriol, v. 173, p. 697-703, 1991.

WENZEL, S. C.; MULLER, R. Formation of novel secondary metabolites by bacterial multimodular assembly lines: deviations from textbook biosynthetic logic. Curr. Opin. Chem. Biol., v. 9, p. 447-458, 2005.

WOODRUFF, H. B. Selman A. Waksman, Winner of the 1952 Nobel Prize for Physiology or Medicine. Appl. Environ. Microbiol., v. 80, p. 2–8, 2014. WRIGHT, G. D. The antibiotic resistome: the nexus of chemical and genetic diversity. Nat. Rev. Microbiol, v. 5, p. 175-186, 2007.

YADAV, G.; GOKHALE, R. S.; MOHANTY, D. Computational approach for prediction of domain organization and substrate specificity of modular polyketide synthases. J Mol Biol, v. 328, p. 335-363, 2003.

YILMAZ, M.; SORAN, H.; BEYATLI, Y. Antimicrobial activities of some Bacillus spp.strains isolated from the soil. Microbiol. Resear., v. 161, p. 127-131, 2006. YING, J.; YOSHIHARA, T.; ICHIHARA, A.; ISHIKURI, S.; UCHINO, H. Structural identification of cepaciamide A, a novel fungitoxic compound from Pseudomonas cepacia D-202. Tetrahedron Lettv. 37, p. 1039-1042, 1996. YU, J. H.; KELLER, N. Regulation of secondary metabolism in filamentous fungi. Annu. Rev. Phytopathol Annual, v. 43, p. 437- 458, 2005.

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