1

ISOLAMENTO, IDENTIFICAÇÃO, ESTUDOS FISIOLÓGICOS, CARACTERIZAÇÃO E VERIFICAÇÃO DE AÇÃO PROBIÓTICA DAS CEPAS

INTESTINAIS DE AVESTRUZ ( Struthio camelus)

Silmara Cadene1, Allan Henrique Panisson1, Elza Maria Galvão Ciffoni2.

1 Acadêmicos do curso de Tecnologia em Bioprocessos e Biotecnologia da Universidade Tuiuti do Paraná (Curitiba, PR); 2 Médica Veternirária, Prof. MSc.da Universidade Tuiuti do Paraná (Curitiba, PR).

elzaciffoni@utp.br ___________________________________________________________________________ RESUMO: Imuno suplementos (probióticos) são utilizados com o intuito de inibir o crescimento de microrganismos patogênicos e/ou promover resistência provocada pela imunoestimulação. Dentre as cepas utilizadas como probióticos, as bactérias ácido-lácticas possuem uma grande relevância para humanos e animais, auxiliando no combate contra patógenos. O objetivo desta pesquisa foi o isolamento, caracterização bioquímica e verificação da atividade antibiótica in vitro frente às cepas patogênicas Salmonella typhimuriu, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermides e Escherichia coli, de cepas isoladas da cloaca de avestruz (Struthio camelus) criados extensivamente. A cepa isolada foi identificada como Enterococcus faecallis a qual se mostrou resistente à bile 5%, e inibiu o crescimento de Staphylococcus aureus. Palavras-chave: Avestruz (Struthio camelus), bactéria ácido láticas, Enterococcus faecallis probióticos _________________________________________________________________________

ABSTRACT : Immune supplements (probiotics) are used in order inhibiting the growth of pathogenic microorganisms and/or promoting resistance caused by immunostimulation. Among the strains used as probiotics, the lactic acid bacteria have a great relevance for humans and animals, helping in the fight against pathogens. The objective of this research was the isolation, biochemical characterization and verification of antibiotic activity in vitro against the strains pathogenic Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermis, Escherichia coli, strains isolated from the cloaca of ostrich (Struthio camelus) reared extensively. The isolate was identified as Enterococcus faecallis which proved resistant to bile 5%, and inhibited growth of Staphylococcus aureus. Keywords: Ostrich (Struthio camelus), lactic acid bacteria, Enterococcus probiotics faecallis and probiotic. _______________________________________________________________________

INTRODUÇÃO

Novas tecnologias no século XXI permitiram o desenvolvimento de produtos, tanto

para humanos quanto para animais que contêm microrganismos em sua composição, com o

intuito de melhorar as condições fisiológicas e ou auxiliar no combate contra patógenos no

organismo. Em 1999, Bonneau e Laarvard definiram-nos como probióticos.

Probióticos do grupo de bactérias ácido láticas (BAL) são descritos como cocos ou

bacilos, gram positivos e não esporulados que, pela fermentação da lactose, produzem ácido

lático como principal produto final, baixando o pH do meio (MAGNUSSON, 2003). Outras

2

bactérias com ação probiótica, mas não BAL, incluem bacilos e leveduras Saccharomyces sp.

(MOMBELLI & GISMONDO, 2000).

Cada vez mais, produtores de aves utilizam os probióticos como meio de melhorar o

rendimento dos animais em suas produções, obtendo carcaças isentas de antibióticos

(promotores de crescimento) e como forma de controle de patógenos por meio da

imunoestimulação (REQUE, 1999).

O desenvolvimento natural do sistema imunitário depende de contínua estimulação

antigênica propiciada pela microbiota intestinal, que compete contra potenciais invasores, por

meio de vários mecanismos que suplementam as outras defesas físicas deste sistema, sendo

que os de ordem biológica são a competição com a microbiota normal, a antibiose e a geração

de condições anaeróbicas ou ácidas. Assim, na parte baixa do intestino, a microbiota residente

tende a assegurar que o pH seja mantido relativamente baixo e o conteúdo ligeiramente

anaeróbio. A dieta pode influenciar, por exemplo, com a ação de lactobacilos ingeridos, que

produzem grande quantidade de ácidos láticos e butírico bacteriostáticos, impedindo que

patógenos se instalem (TIZARD, 1998).

No ano de 1996 chegaram ao Brasil os primeiros avestruzes. A região sul apresenta

um plantel de 25.000 aves, sendo que o Paraná possui 36% desse total (CAMARGO &

COLPO, 2008). Atualmente, os produtores enfocam mais a produção do couro, uma vez que o

consumo de carne ainda necessita ter o mercado conquistado.

A Estrutiopar – Associação dos Estrutiocultores do Paraná, localizada em Curitiba,

conta com produtores envolvidos nos setores de cria, recria e engorda. O fato de não haver

muitas pesquisas relacionadas à melhoria na produção de aves, principalmente focadas na

estrutiocultura, é um estímulo aos pesquisadores deste projeto, cujo objetivo foi identificar e

estudar probióticos isolados de avestruz (Struthio camelus).

MATERIAIS E MÉTODOS

Foram colhidas amostras intestinais de 10 avestruzes (Struthio camelus) aparentemente

saudáveis, que não tinham recebido antibióticos recentemente. Os animais foram selecionados

aleatoriamente da Fazenda Pé-da-Serra de um plantel com 45 animais adultos, criados no

sistema extensivo em piquetes e alimentados com silagem de milho (Zea mays) e pastagem de

azevém L(olium multiflorum).

As amostras intestinais foram colhidas com swab estéril, introduzido diretamente na

cloaca através de uma sonda de tubo de pvc 2 polegadas, com aproximadamente 20 cm,

esterilizada. Após colheita, os swabs foram transportados em caldo MRS (de Man, Rogosa e

3

Sharp – OXOID) adicionado de 5% de bile canina, colhida no laboratório de patologia clínica

da UTP e cristalizado por uma semana em estufa de secagem1 a 60°C), estéril e autoclavado a

121oC, por 15 min. No laboratório de microbiologia da Universidade Tuiuti do Paraná (UTP)

os tubos foram para estufa bacteriológica para crescimento á 37°C/24 horas.

As bactérias resistentes a bile foram isoladas pela técnica da semeadura, com

esgotamento da alça de platina, em placas com ágar MRS à 37oC/24h, em estufa

bacteriológica2. Após este período as cepas foram submetidas à coloração de gram para

identificação morfológica. As cepas isoladas e identificadas foram incubadas em meio MRS,

verificando-se o pH (com pHmetro)3 após fermentação em estufa por 30ºC/ 24h. As cepas

foram semeadas em ágar sangue para testar a atividade hemolítica.

A identificação das cepas selecionadas foi realizada com testes API 20E, no VP

laboratório de análises LTDA.

Para avaliação da atividade antimicrobiana a cepa isolada foi inoculada em caldo MRS

e mantida por 24 horas a 37oC, e em seguida transferiu-se uma alíquota ao nível de 1% (v/v)

para frasco contendo 25 mL de caldo MRS e incubada a 37oC por 24 horas. As cepas

patogênicas (Salmonella typhimurium ATCC 14028, Staphylococcus aureus ATCC 6538,

Staphylococcus epidermides ATCC 12228 e Escherichia coli ATCC 35218)4, foram

previamente ativadas em caldo nutrientes (meio BHI) e semeadas em placas de petri contendo

ágar nutriente (Mueller-Hinton). Em seguida, de forma asséptica, fez-se um orifício no centro

da placa, com 0,5cm de diâmetro, onde se adicionou 30 µL do caldo MRS com as cepas

isoladas.

As placas foram incubadas a 37oC, e a medida da zona clara ao redor do orifício o

(halo de inibição) foi realizada com 6, 12, 18 e 24 horas, e mensurou-se o diâmetro em

centímetros das cepas selecionadas.

Realizou-se o antibiograma com os seguintes antibióticos5: tetraciclina (TET 30),

amoxilina (AMC 10) e (AMC 30) e oxacilina (OXA 01).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

As 10 amostras intestinais colhidas de avestruz (Struthio camelus) apresentaram cepas

resistentes à bile 5%, tendo fermentado o meio MRS, cujo pH foi reduzido para índices

1 Estufa de circulação de ar mod. 400/3ND, Nova Ética. www.novaetica.com.br 2 Estufa para Cultura Bacteriológica mod. 502A, Fanem. www.fanem.com.br 3 pHmetro mod. Q400A, Quimis. www.quimis.com.br 4 New Prov Produtos para Laboratório, www.newprov.com.br 5 DME – Diagnósticos Microbiológicos Especializados, Araçatuba, São Paulo

4

abaixo de 5,5 (tabela 1). Segundo MAGNUSSON (2003), as cepas com potencial probiótico

devem reduzir o pH por produzirem ácido lático.

As cepas foram incubadas em placa com meio MRS, observando-se o crescimento de

três colônias distintas: colônias redondas pequenas (0,1 cm) e brancas (cepas 7, 11, 13 e 18)

(fig 01); colônias de tamanho médio (± 0,3 cm) e branco leitosas (cepas 9, 10, 15, 16 e 17)

(fig. 02) e colônias grandes (0,5cm) amareladas e abauladas e muito leitosas (cepa 12) (fig.

03).

FIG. 01- Cepas gram positivas isoladas de aveztruz

(Struthio amelus) apresentando colônias redonda e pequenas

FIG. 02- Cepa gram positiva, isolada de cloaca de

avestruz (Struthio camelus), apresentando colônias de tamanho médio leitosas

5

FIG. 03- Cepa gram positiva, isolada de cloaca de

avestruz (Struthio camelus), apresentam colônias abauladas e amarelo leitosas

Na avaliação da atividade antimicrobiana, a cepa 18 apresentou halo de crescimento

(0,2cm) inibindo o Staphylococcus aureus (fig. 04), Quanto aos outros avaliados, não houve

inibição (fig. 05).

FIG. 04- Crescimento da cepa 18, formando halo (0,2cm)

de inibição do patógenos (Staphylococcus aureus)

FIG. 05 – Não crescimento da cepa gram positivo (18)

pela inibição do patôgeno (Escherichia coli)

6

Quanto às colônias crescidas em placas com meio MRS, notou-se na coloração de

Gram que, das 10 amostras colhidas, duas apresentaram cocos gram positivos e cocos gram

negativos (20%), uma bacilos gram positivo e bacilos gram negativo (10%), uma diplococos

gram positivo e bacilos gram negativo (10%), uma com diplococos gram positivo e cocos-

bacilos gram negativos (10%), cinco apresentaram cocos gram positivos e bacilos gram

negativas (50%), sendo que uma destas também apresentou colônias de Candida sp. (tabela

1).

TABELA 1 - CARACTERÍSTICAS DAS CEPAS GRAM POSITIVO ISOLADAS DE CLOACA DE AVESTRUZ AVESTRUZ (Struthio camelus)

N° de identificação

da cepa isolada Morfologia

pH do caldo MRS após 24

horas de incubação

± σ

Capacidade de hemólise em ágar sangue

Capacidade inibitória frente Staphylococcus.

aureus

7 cocos 4,37 ± 0,06 - - 9 cocos 4,38 ± 0,093 - - 10 cocos 4,68 ± 0,1529 + - 11 cocos 4,91 ± 0,1305 + - 12 diplococos 5,24 ± 0,2451 + - 13 bacilos 4,32 ± 0,1421 + - 15 diplococos 4,87 ± 0,0931 + - 16 cocos 4,41 ± 0,1157 - - 17 cocos 4,90 ± 0,3565 + - 18 cocos 4,93 ± 0,1462 + +

Legenda 1 - As cepas gram positivas isoladas foram identificadas com números, relacionados ao animal de qual foram retiradas, e verificou-se a morfologia, o pH do caldo MRS após 24 horas à 37°C de incubação (sendo que o pH de fermentação inicial foi de 6,50), a capacidade de hemólise em ágar sangue e a capacidade inibitória frente aos patógenos Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermides e Escherichia coli.

Na avaliação da atividade antimicrobiana, a cepa 18 apresentou halo de crescimento

(0,2cm) inibindo o Staphylococcus aureus (fig. 04), Quanto aos outros avaliados, não houve

inibição (fig. 05).

O antibiograma (fig 06) indicou que a cepa 18 é resistente a oxacilina , amoxilina e a

tetraciclina houve halo de inibição. O fato de uma BAL ser resistente aos antibióticos,

segundo Ciffoni, Pachaly & Soccol (2007) a possibilidade de uso como probiótico podendo

ser administrado por indivíduos em tratamentos.

7

FIG. -06 Teste de antibiograma com cepa 18

A cepa 18, que apresentou halo de inibição, foi identificada como Enterococcus

faecalis. (fig 07)

FIg. 07- Teste de atividade antibactericída frente a

Staphylococcus aureus

Para a identificação das BAL, os métodos fenotípicos são os mais utilizados (Curk et

al citado por CIFFONI, PACHALY & SOCOOL, 2007). A distinção entre as espécies homo e

heteroláticas se baseia no percentual de ácido lático produzido (DESMAZEUD &

ROISSART, 1994), sendo assim, as bactérias homolácticas produzem 90%, e as hetelolácticas

produzem 50% de ácido lático e os outros componentes (acetato, etanol e anidrido carbônico,

ácido fórmico, ácido propiônico, acetona e acetaldeído).

De acordo com Desmazeaud e Roissart (1994) e Konemam et. al (1997), o gênero

Enterococcus possiu um metabolismo homofermentativo pois produz principalmente ácidos

láticos pela fermentação dos açúcares do meio, o que permite à microbiota intestinal uma

8

redução do pH, favorecendo a inibição de patógenos (TIZARD,1998). O pH do meio

observado após a fermentação pela cepa inoculada foi reduzido de 6,5 para 4,96± 0,1462, o

que caracteriza uma BAL como probiótica, inclusive pelo fato das bactérias do gênero

Enterococcus serem resistentes a pH 9,6 (KONEMAM et. al, 1997)

A cepa de Enterococcus faecalis isolada apresentou halo de hemólise parcial, com

coloração esverdeada, caracterizando-se como α-hemolítica e catalase negativa, concordando

com Jorge (2008).

CONCLUSÃO

A cepa Enterococcus faecalis é uma cepa homofermentativa, que produz

preferencialmente ácido lático a partir da glicose, é resistente a 5% de bile, e aos antibióticos

Axocilina e Tetraciclina, e apresenta capacidade inibitória de patógenos in vitro.

O fato de existir inibição in vitro da cepa 18, indica a possibilidade de seu uso como

probiótico, necessitando testes in vivo para comprovar inocuidade e eficácia quanto a

capacidade de estimular uma flora benéfica e produtiva em aves.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

BONNEAU, M.; LAARVELD, B. Biotechnology in animal nutrition, physiology and health.

Livestock Production Science, 59 (2-3), 1999. p. 165-182.-1°

CAMARGO, B. V. & COLPO, K. D. Avaliação nas perfomances produtivas e reprodutivas

de avestruz (Struthio camelus), no município de Santiago, RS. A Hora Veterinária. Santa

Maria, 2008.

CIFFONI, E.M.; PACHALY, J.R. & SOCCOL, C.R. Isolamento de verificação de atividade

antibiótica in vitro de Lactobacillus plantarum de pequenos ruminantes. In: CONGRESSO

LATINOAMERICANO DE ESPECIALISTAS EN PEQUEÑOS RUMIANTES, V, 2007.

Mendoza. Memórias...Mendoza :ALEPRYCS, 2 – 4 de mayo.p. 274-276.

DESMAZEUD, M. J. & ROISSART, H. Métabolism general dês bactéries láctiques. In:

Bactéries Láctiques – Aspects fondamentaux et technologiques v.1, p. 169 – 207. 1994.

JORGE, O.C. Microbiologia atividades praticas. 2 ed. Livraria Santos Editora LTDA. 2008.

9

KONEMAN, Elmer W. et. al. Color atlas and textbook of Diagnostic Microbiology. 5 ed.

Philadelphia: JB Lippincott Co, 1997.

MAGNUSSON, J. Antifungal activity of lactic acid bactéria. 2003. 39 p. Thesis. Swedish

University of Agricultural Sciences. Uppsala, Sweden. – 2°ed.

MOMBELLI, & GISMONDO. The use of probiotics in medical practice. INTERNATIONAL

JOURNAL OF ANTIMICROBIAL AGENTS. v.16, p. 531-536. , 2000.

REQUE, E. F. Isolamento, identificação e estudos fisiológicos da bactéria de ação probiótica

(Lactobacillus fermentum LPB) para uso em frangos de corte. Curitiba, 1999, 96p.

(Dissertação Mestrado em tecnologia química), Universidade Federal do Paraná.

TIZARD, I.R. Imunologia Veterinária. São Paulo: Roca, 5°ed., 1998. 545 p.