Isolamento e caracterização fenotípica de bactérias ... ?· bactérias apresentou crescimento muito…

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Isolamento e caracterizao fenotpica de bactrias fixadoras de nitrognio em simbiose com Macroptiliumlathyroides(L.) Urb. em

Roraima (1).

Joselma Pedrosa da Silva(2); Vicente Gianlupi(3); Krisle da Silva(4).

(1) Trabalho executado com recursos de Embrapa Projeto Colees D & M: 01.09.01.003.02.07.

(2) Aluna de graduao em Cincias Biolgicas; Faculdade Cathedral; Boa Vista-RR; biojoselmalogia@yahoo.com.br;

(3) Eng Agrnomo, Pesquisador, EMBRAPA - Roraima, Br.174 Km 8, Distrito Industrial, Boa Vista, RR;

(4)Pesquisadora, Microbiologia do Solo; Embrapa Roraima,Rodovia BR-174, Km 8, Distrito Industrial, CEP 69301-970,

Boa Vista-RR; krisle.silva@embrapa.br.

RESUMO:Devido s caractersticas de

adaptabilidade a diferentes ambientes e ao curto

ciclo reprodutivo com facilidade de produo de

sementes, o feijo-dos-arrozais

(Macroptiliumlathyroides), constitui uma planta de

interesse agronmico. Est planta foi recentemente

encontrada em reas agrcolas em Roraima e tem

potencial como forrageira, pois esta leguminosa

estabelece simbiose com bactrias fixadora de

nitrognio. Portanto, o objetivo deste estudo foi

isolar e avaliar a diversidade de bactrias fixadoras

de nitrognio em simbiose com

Macroptiliumlatiroides(L.) Urb. As bactrias foram

isoladas de ndulos das razes de plantas coletadas

emuma propriedade agrcola no municpio de

Bonfim-RR. Cem ndulos de trs plantas foram

escolhidos ao acaso, e isoladas em meio YMA com

vermelho congo. Aps isolamento as bactrias

foram caracterizadas quanto morfo-fisiologia das

colnias em meio de cultivo YMA contendo azul de

bromotimol. Dos 100 ndulos escolhidos, foi

possvel isolar 129 bactrias. A maioria das

bactrias apresentou crescimento muito rpido e

acidificao do meio de cultura. O resultado do

dendrograma revelou uma elevada diversidade,

sendo formados 53 grupos com 70% de

similaridade. As 129 bactrias isoladas de

M.lathyroidesapresentaram elevada diversidade

morfo-fisiolgica, sendopromissoras para a fixao

biolgica de nitrognio.

Termos de indexao:Fixao biolgica de nitrognio; Feijo-dos-arrozais;Amaznia

INTRODUO

O gnero Macroptiliumengloba aproximadamente 20 espcies, sendo um dos mais conhecidos na subtribo Phaseolinae (Delgado-Salinas & Lewis, 2008). Dentre as espcies com uso econmico, se destacam Macroptiliumatropurpureum e M. lathyroidesque so

utilizadas como plantas forrageiras (Monkset al., 2006; Guerra et al., 2007; Vasconcelos et al., 2011). M. lathyroides conhecido por diferentesnomes: figo-de-pombo (Vasconcelos etal.,2011), feijo-dos-arrozais (Ferreira et al., 2004) ou feijo-de-rla (Basile et al., 2007). O feijo-dos-arrozais, particularmente, apresenta caractersticas apropriadas para solos midos, podendo alcanar altos rendimentos de forragem de qualidade. Pouco exigente em fertilidade,vegeta em locais mal drenados e com pH baixo, alm de ser adaptada a precipitaes pluviais anuais de 630 a 1800 mm (Monks et al., 2006; Vasconcelos et al., 2011).

Na safra de 2012/ 2013 em reas agrcolas de Roraima, foi detectada a presena desta leguminosa.Esta planta uma alternativa para a melhoria da qualidade das pastagens nas terras baixas do Rio Grande do Sul (Reis, 1988), e tambm pode ser uma alternativa paras as reas em Roraima desde que manejado corretamente.

Apesar de estabelecer simbiose com bactrias fixadoras de nitrognio, pouco se conhece sobre a diversidade destas bactrias. Assim, neste trabalho objetivou-se isolar e caracterizar fenotipicamente bactrias coletadas de ndulos de Macroptiliumlathyroides(L.) Urb.em Roraima.

MATERIAL E MTODOS

Origem das bactrias

A coleta foi realizada em uma rea de lavoura de soja em propriedade particular no Municpio de Bonfim, Roraima, que representa uma rea de cerrado (N 03

o1456.3W 0601628.9).

As razes foram retiradas no campo com

auxliocom auxlio de p reta. Estas foram

acondicionadas em sacos e levadas ao laboratrio

de Microbiologia do Solo da Embrapa Roraima,

onde foram lavadas, os ndulos retirados e

armazenados em frascos contendo slica gel. A

parte area de plantas contendo flores foi coletada

para confeco de exsicatas que foramdepositadas

no Herbrio do Museu Integrado de Roraima, onde

mailto:biojoselmalogia@yahoo.com.brmailto:krisle.silva@embrapa.br

2

foram identificadas botanicamente como

Macroptiliumlathyroides (L.) Urb. Foram coletadas

amostras de trs plantas.

Isolamento e purificao

Para o isolamento, 100 ndulos escolhidos

ao acaso das trs plantas, foram mantidos em gua

estril por duas horas para reidratao.

Posteriormente, procedeu-se a desinfestao com

etanol 92,8% por trs segundos, hipoclorito de sdio

a 1% por cinco minutos e sucessivas lavagens em

gua estril.Os ndulos desinfestados foram

esmagados com pina estril e o lquido intra-

nodular foi estriado utilizando ala de platina em

placas de Petri contendo meio de cultura YMA (Fred

&Waskman, 1928)contendo o indicador vermelho

congo a 0,25%. As placas foram incubadas a 28 C,

com verificaes dirias da formao de colnias.

Aps aparecimento das colnias, as mesmas foram

repicadas para outra placa de Petri contendo meio

de cultura YMA com indicador, azul de bromotimol

(0,5%) e novamente incubadas para a purificao.

As placas foram monitoradas diariamente visando

verificar o surgimento de colnias isoladas para

posterior caracterizao fenotpica atravs da

morfo-fisologia de colnias.

Caracterizao fenotpica

A caracterizao fenotpica foi realizada

atravs da morfo-fisiologia cultural das colnias.

Para isto, as bactrias foram cultivadas em meio de

cultura slida YMA (Fred &Waskman, 1928),

contendo azul debromotimol e incubadas a 28C. A

caracterizao foi iniciada a partir do aparecimento

das primeiras colnias isoladas. As caractersticas

avaliadas foram: crescimento em dias

(aparecimento de colnias isoladas), alterao do

pH do meio (neutro, cido e alcalino), dimetro das

colnias (mm), forma (puntiforme,circular ou

irregular), elevao das colnias (plana, convexa,

cncava, elevada e protuberante), borda (inteiraou

irregular), superfcie da colnia (lisa ou

rugosa),produo de muco (escassa, pouco,

moderada eabundante), transparncia (opaca,

transparente etranslcida), muco (homogneo ou

heterogneo).Devido s plantas se encontrarem em

uma lavoura de soja, alm das bactrias isoladas,

foram includas na caracterizao quatros estirpes

referncias para produo de inoculantes de soja,

SEMIA 587 e SEMIA 5019 (Bradyrhizobium elkanii);

SEMIA 5079 (B. japonicum) e SEMIA 5080 (B.

diazoefficiens).

As caractersticas foram comparadas e suas

semelhanas foram estimadas pelo coeficiente de

Jaccard. Os isolados foram agrupados pelo mtodo

UPGMA (averagelinkageclustering) e representados

graficamente por um dendrograma (NTSYS-pc,

verso 2.1t).

RESULTADOS E DISCUSSO Dos 100 ndulos submetidos ao isolamento,

foram recuperadas 129 bactrias. Isto ocorreu

devido observao de duas morfologias

bacterianas diferentes durante o processo de

isolamento. O que indica a presena de mais de

uma bactria dentro dos ndulos.

Quanto caracterizao fenotpica, atravs da

morfologia das colnias, verificou-se que a 79

bactrias apresentaram crescimento muito rpido 50

rpidos, no apresentando bactrias com

crescimento intermedirio e lento. Quanto

alterao do pH do meio, 52 bactrias apresentaram

reao cida; 30 neutra e 47 alcalina em meio YMA

acrescido de azul de bromotimol(Figura 1).

Bactrias de crescimento intermedirio a lento e

reao neutra a alcalina so caractersticas tpicas

do gnero Bradyrhizobium(Moreira & Siqueira,

2006).Isto demonstra que entre as 129 bactrias

isoladas, nenhuma apresentou essa caracterstica.

Quando foi gerado o dendrograma das bactrias

isoladas de feijo-dos-arrozais juntamente com as

estirpes referncias (SEMIA 597, SEMIA 5019,

SEMIA 5079 e SEMIA 5080), foi possvel observar

uma elevada diversidade, sendo formados 53

grupos a 70% de similaridade (Figura 2). Tambm

foi possvel observar que nenhuma bactria isolada

foi semelhante s estirpes referncia, indicando que

apesar das plantas estarem presentes em rea

cultivada com soja, as estirpes recomendadas para

produo de inoculantes (SEMIA 587, SEMIA 5019,

SEMIA 5079 e SEMIA 5080) no estabeleceram

simbiose com feijo-dos-arrozais. Os resultados

deste trabalho indicam que apesar de M.

lathyroidester sido introduzido em Roraima, esta

leguminosa foi capaz de estabelecer simbiose com

bactrias nativas com elevada diversidade morfo-

fisiolgica, favorecendo o seu crescimento nestes

solos.

CONCLUSES

As bactrias isoladas de M. lathyroides demonstraram umaelevada diversidade morfo-fisiolgica cultural.

3

Apesar de terem sido isoladas em lavouras de soja, as bactrias obtidas no se foram similares as bactrias utilizadas em inoculantes de soja.

REFERNCIAS

BASILE, A. G. et al. Controle qumico de feijo-de-rla (Macroptiliumlathyroides) com glyphosate. In: SIMPSIO INTERNACIONAL SOBRE GLYPHOSATE, 1., 2007, Botucatu. Anais... Botucatu: FCA, UNESP, 2007. 1 CD-ROM.

DELGADO-SALINAS, A.; LEWIS, G. P. A.new species of Macroptilium(Benth.)Urb.(Leguminosae: Papilionoideae: Phaseolinae)from North-Eastern Brazil. Kew Bulletin,v.63, n.1, p.151-154, 2008. FONSECA, J. A. &

MEURER, E. J. Inibio da absoro de magnsio pelo potssio em plntulas de milho em soluo nutritiva. Revista Brasileira de Cincia do Solo, 21:47-50, 1997. FERREIRA, O. G. L. et al. Efeito do corte da parte area e de pocas de colheita sobre o rendimento e qualidade das sementes de feijo-dos-arrozais. Revista Brasileira deAgrocincia, v.10, n.2, p.175-178, 2004.

GUERRA, J.G.M. et al. Desempenho deleguminosas tropicais perenes como plantas de cobertura do solo. Seropdica: EmbrapaAgrobiologia, 2007. 22 p. (EmbrapaAgrobiologia. Boletim de pesquisa e desenvolvimento, 20). MONKS, P.L. et al. Produo e qualidade de sementes de Macroptiliumlathyroides(L.). Rev. Bras. Herb., v.11, n.1, p.11-23, jan./abr. 2012 Urb. sob diferentes espaamentos e pocas de colheita. Pesquisa Agropecuria Tropical,

v.36, n.2, p.107-112, 2006. VASCONCELOS, W. A. et al. Germinao de sementes e desenvolvimento de plntulas de figo de pombo (Macroptiliumlathyroides). Revista Trpica, v.5, n.1, p.3-11, 2011.

Grfico 1. Caractersticas morfo-fisilgicas culturais das bactrias isoladas de feijo dos arrozais

(Macroptiliumlathyroides) coletadas em lavoura de soja em Roraima. pH; TC (tempo de crescimento); FC (forma da colnia); EC (elevao da colnia); BC (borda da colnia); SC (superfcie da colnia); PM (produo de muco); TM (transparncia do muco); CM (consistncia do muco); AM (aparncia do muco); CC (cor da colnia) e EM (elasticidade do muco).

52 47

30

79

50

97

823

86

20 23

2

123

5 6

122

39 45

1730

47 51

24 25

78

5944

20

81

49

0

129

0

20

40

60

80

100

120

140

cid

o

Alc

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Muito R

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Sim

No

pH TC FC EC BC SC PM TM CM CC AM EM

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lad

os

Caracteristicas Morfoculturais

4

Figura 2 - Dendrograma de similaridade de bactrias isoladas de feijo-dos-arrozais(Macroptiliumlathyroides) coletadas em rea de cultivode soja em Roraima.

0.00 0.25 0.50 0.75 1.00

SEMIA5079

S-93 S-19 S-29 S-44 S-15 S-96 S-38 S-45 S-32 S-50B SEMIA5079 SEMIA5080 S-85A S-30 S-25 S-47 S-21 S-10 S-90A S-79 S-74 S-59 S-33A S-65A S-73 S-39A S-89 S-98A S-92A S-2 S-7B S-13 S-17B S-34B S-94A S-24 S-53 S-54 S-52A S-51 S-55 S-16B S-61 S-90B S-12 S-16B S-60 S-95 S-6 S-77B S-37A S-5B S-5A S-78 S-16A S-33B S-22 S-88 S-48 S-72A S-86A S-40 S-100 S-14 S-69 S-50A

0.00 0.25 0.50 0.75 1.00

SEMIA5079

S-34C S-80B S-84 S-76B S-35 S-83B S-87A S-27 S-28 S-11 S-72B S-68 S-18 S-56 S-71 S-76A S-83A S-8B S-98B S-26 S-62B S-87B S-70A S-82 S-1 S-20 S-23B S-41 S-67 S-4 S-57 S-23A S-36A S-58A S-77A S-8A S-94B S-33C S-65B S-49A S-92B S-49B S-66 S-52B S-3B S-42 S-99A S-7A S-90C S-91A S-34A S-75 S-17A S-99B S-85B S-70B S-62A S-43 S-37B S-46 S-31 S-39B S-58B SEMIA5019 SEMIA587

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