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RENATA PROENÇA FERREIRA
INVESTIGAÇÃO DE ADESÃO PLAQUETÁRIA NA
ANEMIA FALCIFORME E O PAPEL DOS
NUCLEOTÍDEOS CÍCLICOS NESTA ADESÃO
CAMPINAS
2009
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RENATA PROENÇA FERREIRA
INVESTIGAÇÃO DE ADESÃO PLAQUETÁRIA NA
ANEMIA FALCIFORME E O PAPEL DOS
NUCLEOTÍDEOS CÍCLICOS NESTA ADESÃO
Dissertação de Mestrado apresentada à Pós-
Graduação da Faculdade de Ciências Médicas da
Universidade Estadual de Campinas para obtenção do
título de Mestre em Clínica Médica, área de
concentração em Ciências Básicas.
Orientadora: Dra. Nicola Amanda Conran Zorzetto
Co-Orientador: Prof. Dr. Fernando Ferreira Costa
CAMPINAS
2009
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FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA DA FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS DA UNICAMP
Bibliotecário: Sandra Lúcia Pereira – CRB-8ª / 6044
Ferreira, Renata Proença F413i “Investigação de adesão plaquetária na anemia falciforme e o papel
dos nucleotídeos cíclicos nesta adesão” / Renata Proença Ferreira. Campinas, SP : [s.n.], 2009.
Orientadores : Nicola Amanda Conran Zorzetto, Fernando Ferreira
Costa Dissertação ( Mestrado ) Universidade Estadual de Campinas.
Faculdade de Ciências Médicas. 1. Plaquetas (Sangue). 2. Anemia falciforme. 3. Citometria
de fluxo. I. Zorzetto, Nicola Amanda Conran. II. Costa, Fernando Ferreira. III. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Ciências Médicas. IV. Título.
Título em inglês : “Investigation of platelet adhesion in sickle cell disease and the role of cyclic nucleotides in this adhesion” Keywords: • Platelets (blood) • Sickle cell disease • Flow cytometry Titulação: Mestre em Clínica Médica Área de concentração: Ciências Básicas Banca examinadora: Profª. Drª. Nicola Amanda Conran Zorzetto Profº. Drº. Joyce Maria Annicchino-Bizzacchi Profª. Drª. Maria Stella Figueiredo Data da defesa: 28-08-2009
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AGRADECIMENTOS
Gostaria de agradecer à Dra. Nicola por me aceitar como sua aluna, sua experiência
e profissionalismo contribuíram para a minha formação, tanto profissional como pessoal.
Ela é uma pessoa muito humana e generosa, que nunca mediu esforços para conseguir
recursos e apoio nas horas que mais precisei. Tenho muito que agradecê-la. Meus
agradecimentos ao prof. Dr. Fernando que me recebeu em seu laboratório como estagiária,
e a toda equipe de alunos que apostaram e acreditaram no meu trabalho. À Flávia Pinho,
pois ela foi a primeira pessoa que tive contato no laboratório e que se tornou uma grande
amiga. Obrigada por tudo! À Carol e à Dri que me ensinaram como trabalhar numa sala de
cultura, pois a cultura de células foi o meu primeiro aprendizado no laboratório, muito
obrigada! À Dul que sempre me ajudou com os documentos para que eu conseguisse
transporte e bolsa de estudos, sempre muito prestativa para minha permanência no
laboratório. Muito obrigada! À minha grande amiga Ana Flávia, pois há muitos anos nossos
caminhos estão se cruzando. É com grande prazer que declaro o meu amor por essa amiga
que sempre esteve ao meu lado nas horas mais felizes e mais tristes da minha vida. Muito
obrigada, Ana! Também gostaria de agradecer às funcionárias Lena e Simone que sempre
trouxeram alegria e quitutes maravilhosos ao laboratório! Obrigada! Muito obrigada à
Camila, Lediana, Andréia, Sheley, Venina, Flávia, Flávia Boca, Vanessa, Renatinha,
Juliana, Regiane, Fernanda, Diana, Emília, Ucha, Tatiana, Carlinha, Marcos André,
Gabriela, Daniela, Denise e Anderson, que, direta ou indiretamente, me apoiaram.
Agradeço à minha família pela paciência e apoio, em especial ao meu noivo, pais e irmãos,
vocês foram imprescindíveis. Amo todos vocês.
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RESUMO
Anemia falciforme (AF) é uma doença causada por uma mutação de ponto, que
resulta na formação de hemoglobina S (HbS). A polimerização de HbS desoxigenada
resulta na deformação, enrijecimento e fragilização das células vermelhas, anemia
hemolítica e eventos vasos-oclusivos, principal causa de morbidade nos pacientes com AF.
A adesão anormal das células brancas e vermelhas ao endotélio diminui o fluxo de sangue
na circulação micro-vascular, principal fator envolvido na vaso-oclusão. O objetivo deste
trabalho foi comparar as propriedades adesivas de plaquetas de indivíduos sadios (AA) com
as plaquetas de pacientes com AF (SS) e em terapia com hidroxiuréia (HU), e quais
moléculas de adesão e sinalização estão envolvidas nesta adesão. A adesão basal de
plaquetas ao fibrinogênio (FB) do grupo de pacientes SS foi significativamente maior em
relação às plaquetas AA, entretanto, as plaquetas de pacientes SSHU mostraram uma
adesão similar às plaquetas AA. As plaquetas AA, SS e SSHU quando estimuladas com
trombina (TB), apresentaram uma adesão significativamente maior em relação às suas
adesões basais. Por outro lado, não houve diferenças significativas entre as adesões basais
das plaquetas AA, SS e SSHU ao colágeno como ligante. A citometria de fluxo foi utilizada
para comparar a expressão e ativação das principais moléculas de adesão nestas plaquetas, e
identificou-se um aumento de expressão da integrina αIIbß3 na sua conformação de ativação,
na superfície das plaquetas SS, em relação às plaquetas AA e SSHU. A molécula P-
selectina (CD62P) foi encontrada com maior expressão também na superfície das plaquetas
SS. Ensaios de adesão utilizando anticorpos específicos para as moléculas de adesão
indicaram um possível papel para a integrina αIIbß3 na adesão de plaquetas ao FB. O AMPc
é um importante inibidor de ativação plaquetária, e os níveis intraplaquetários de adenosina
manofosfato cíclica (AMPc) das plaquetas SS foram significativamente menores em
relação às plaquetas AA e SSHU. A co-incubação das plaquetas com TB reduziu
significativamente os níveis de AMPc nas plaquetas AA, e SSHU, e nas plaquetas SS essa
redução não foi significativa. Além disso, foi interessante notar que os níveis de
hemoglobina fetal (HbF) em pacientes SS e SSHU apresentaram uma significativa
correlação com os níveis de AMPc. Em relação aos níveis intraplaquetários de guanosina
monofosfato cíclica (GMPc), importante inibidor de agregação plaquetária, das plaquetas
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AA, SS e SSHU não houve diferenças estatisticamente significativas, entretanto
com estímulo de trombina houve um aumento significativo de GMPc nas plaquetas AA. A
incubação das plaquetas com o cilostazol (inibidor específico da fosfodiesterase 3A,
PDE3A) levou a uma redução da adesão de plaquetas SS, e sugere-se que as plaquetas SS
possuem a atividade de fosforilação da PDE3A aumentada, e esteja relacionada com a
degradação de AMPc nessas plaquetas. Além disso, dados indicam que as vias de
sinalização dependentes de PKA, PKG e PKC não estão envolvidas na adesão alterada das
plaquetas SS. A atividade funcional nos ensaios com agregação plaquetária de pacientes
com AF está alterada, mas será necessário que novos experimentos sejam realizados para
maiores conclusões. Os resultados sugerem que as plaquetas de pacientes AF circulam num
estado ativado e que elas possuem maior capacidade de aderirem às proteínas que podem
ser encontradas na matriz extracelular (MEC) e na superfície da parede vascular. Esta
adesão aumentada está associada com os níveis diminuídos de AMPc intraplaquetários e
ativação da integrina αIIbß3. Estas mesmas alterações parecem ser revertidas nos pacientes
em uso de HU. Resultados sugerem que as plaquetas podem ter um papel importante no
processo de vaso-oclusão. Quando estão ativadas, estas plaquetas servem como fonte
importante para mediadores inflamatórios que, por sua vez, podem levar à exacerbação da
inflamação e ativação celular no local.
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ABSTRACT
Sickle cell disease (SCD) is caused by a point mutation that results in the formation
of Hemoglobin S (HbS). The polymerization of deoxygenated HbS causes deformation of
red cells, which then adopt a sickle shape and become rigid and fragile. Hemolytic anemia
and vaso-occlusive events are the main cause of morbidity in SCD; abnormal adhesion of
white and red cells to the endothelium decreases the blood flow in the microcirculation and
appears to be the main factor involved in vaso-occlusion. The objective of this study was to
compare the adhesive properties of platelets from healthy individuals (AA platelets) with
those of platelets from SCD patients (SS platelets) and from patients on HU therapy (SSHU
platelets), as well as the adhesion molecules and signaling pathways that may be involved
in this adhesion. The basal adhesion of SS platelets to fibrinogen (FB) was significantly
higher than that of AA platelets; in contrast, SSHU platelets demonstrated a similar
adhesion to that of AA platelets. Platelets from AA, SS and SSHU individuals, when
stimulated with thrombin (TB), all presented significantly higher adhesions when compared
with their basal adhesions. In contrast, there were no significant differences between the
adhesions of AA, SS and SSHU platelets when collagen was used as a ligand. Flow
cytometry was utilized to compare the expression and activation of the main adhesion
molecules on AA, SS and SSHU platelets and identified a significantly higher expression of
the αIIbβ3 integrin in its activated conformation on the surface of the SS platelets, in relation
to the AA and SSHU. Expression of the P-selectin adhesion molecule (CD62P) was also
found to be increased on the surface of SSHU platelets. Adhesion assays utilizing specific
antibodies for the activated αIIbβ3 and P-selectin indicated a possible role for the αIIbβ3
integrin in the adhesion of platelets to FB. The cyclic nucleotide, cyclic adenosine
monophosphate (cAMP) is an important inhibitor of platelet aggregation. Intraplatelet
levels of cAMP were found to be significantly lower in SS platelets compared to AA and
SSHU platelets. Co-incubation of platelets with TB significantly reduced levels of cAMP in
the AA and SSHU platelets, but in SS platelets this decrease was not significant.
Interestingly, levels of fetal hemoglobin (HbF) in SCD patients (both SS and SSHU) were
found to correlate significantly with levels of platelet AMPc. With regard to intraplatelet
levels of cyclic guanosine monophosphate (cGMP), there were no significant differences
xiii
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found between AA, SS and SSHU platelets, however following a TB stimulus AA platelets
demonstrated a significant increase in intracellular cGMP. Phosphodiesterase 3A (PDE3A)
is the main cyclic nucleotide hydrolyzing enzyme in platelets. Incubation of SS platelets,
but not AA or SSHU platelets, with cilostazol (specific inhibitor of PDE3A) resulted in a
significant reduction in their adhesion to FB, suggesting that PDE3A activity in SS platelets
may be activated and that augmentation of cAMP is capable of reverting increased SS
platelet adhesion. Additional experiments indicate that Protein kinase A (PKA), PKG and
PKC dependent signaling pathways are not involved in the altered adhesion of SS platelets.
The functional activity of SS platelets was found to be altered in platelet aggregation
assays, however further experiments are required to draw conclusions from these data.
Results of this study suggest that platelets from SCD individuals circulate in an activated
state and that they present a greater ability to adhere to proteins that may be encountered on
the vessel wall. This augmented adhesion is associated with decreased levels of intraplatelet
cAMP and activation of the αIIbβ3 integrin. These alterations appear to be reversed in
patients on HU therapy. Results suggest that platelets may have an important role in the
vaso-occlusive process.When activated these cells are an important source of inflammatory
mediators that may, in turn, result in an exacerbation of cellular activation at the vaso-
occlusive site.
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LISTA DE ABREVIATURAS
AA – plaquetas de controles
AC – adenilato ciclase
ADP – adenosina difosfato
AF – anemia falciforme
AKT – serina/treonina quinase
AMPc – adenosina monofosfato cíclico
ATP – adenosina trifosfato
CEP – comitê de ética e pesquisa
Col – colágeno
CV – células vermelhas
FB – fibrinogênio
GC – guanilato ciclase
GMPc – guanosina monofosfato cíclico
GTP – guanosina trifosfato
HbF – hemoglobina fetal
HbS – hemoglobina S
HU – hidroxiuréia
IL-6 – interleucina 6
IL-8 – interleucina 8
MEC – matriz extracelular
NO – óxido nítrico
PAR-1 – receptor 1 de ativação de protease
PDE – fosfodiesterase
PGE1 – prostaglandina 1
PGE2 – prostaglandina 2
PI3K – fosfatidil-inositol-3-quinase
PKA – proteína quinase A
PKC - proteína quinase C
PKG - proteína quinase G
xvii
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PSGL-1 – ligante 1 para a glicoproteína p-selectina
RANTES – quimiocina secretada e expressa por células T normais
ROS – espécies reativas ao oxigênio
SS – plaquetas de pacientes
SSHU – plaquetas de pacientes com HU
TA – temperatura ambiente
TB – trombina
TCLE – termo de consentimento livre e esclarecido
TNF-α - fator de necrose tumoral α
vWF – fator de von Willebrant
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LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Aspectos clínicos dos controles AA, pacientes SS e pacientes SSHU que
participaram deste estudo. .................................................................................................... 66
Tabela 2: Expressão das moléculas de adesão na superfície das plaquetas dos
controles (AA), pacientes (SS) e pacientes em terapia com hidroxiuréia (SSHU). ............. 73
xxi
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Fisiopatologia da Anemia Falciforme (Adaptado do: Steinberg; Trends
Pharm Sci, 2006). A síntese de hemoglobina S é resultado de uma mutação de
ponto, que quando desoxigenada forma polímeros no interior das hemácias,
deformando-a e tornando-a rígida as (formato de foice). As hemácias, neutrófilos e
reticulócitos participam do processo de vaso-oclusão, além da hemólise
intravascular de hemácias, são eventos que caracterizam a anemia falciforme. .................. 39
Figura 2: Esquema das moléculas de adesão de plaquetas e seus respectivos
anticorpos como ligantes. GPIb/IX/V (CD42b/CD42a) presente em plaquetas; a
integrina α2β1 (GPIa/IIa; CD49b/CD29), ligante para o colágeno; a integrina αIIbß3
(GPIIb/IIIa; CD41a/CD61), ligante para o fibrinogênio e a molécula de adesão P-
selectina. ............................................................................................................................... 43
Figura 3: Adesão plaqueta/endotélio. Superfície do endotélio ativado expressa a P-
selectina. Os receptores de superfície de plaqueta GPIbα e PSGL-1 interagem com
a P-selectina endotelial e mediam o rolamento de plaquetas. Adesão firme é
mediada pelas integrinas αvβ3 e αIIbβ3 .(Adaptado do: J. Clin. Invest. Meinrad
Gawaz, et al., 2005). ............................................................................................................. 43
Figura 4: Regulação dos níveis intraplaquetários de AMPc via trombina. A
trombina (TB) regula os níveis de AMPc impedindo a síntese de ATP, e
consequentemente, acelerando a degradação do AMPc para 5’AMP via PDE3A. A
TB liga-se ao receptor de ativação plaquetária 1 (PAR-1), e a adenilato ciclase
(AC) é inibida através do acoplamento direto de PAR-1 à Gi, ou indiretamente pela
liberação de ADP. O ADP liga-se ao receptor P2Y, o qual se acopla à proteína Gi2, que inibe a AC e diminui o AMPc. Os efeitos da TB em diminuir o AMPc são
sinérgicos, porque TB bloqueia a formação de AMPc através da inibição da AC
via PDE3A. A outra via é pela fosforilação/ativação da via AKT/PI3K, onde AKT
pode diretamente ativar a PDE3A, proporcionando um mecanismo adicional que
regula o AMPc (adaptado do: HEMOSTASIS, THROMBOSIS, AND
VASCULAR BIOLOGY. Zhang e Colman, 2007). ............................................................. 46
xxiii
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Figura 5: Esquema do ensaio de ELISA para AMPc, de acordo com o fabricante
(Amershan Biosciense). ........................................................................................................ 61
xxv
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LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1: Adesão basal das plaquetas de indivíduos controles (AA), pacientes AF
(SS) e pacientes AF em terapia com HU (SSHU), 37ºC, 15 min. (A) adesão basal
das plaquetas ao FB (50 µg/ml), *p
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Gráfico 7: Adesão de plaquetas AA, SS e SSHU ao FB, na presença ou ausência
do inibidor específico de PDE3A (cilostazol), DMSO e estimulada com TB. (A)
ensaio de adesão ao FB (50 µg/ml) basal, DMSO(0.001 % v/v) e cilostazol (1.6
µM); e com TB (50 mU/ml, 15 min, 37°C) com plaquetas AA; (B) plaquetas SS;
(C) plaquetas SSHU; *p
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SUMÁRIO
AGRADECIMENTOS ......................................................................................................... vii
RESUMO .............................................................................................................................. ix
ABSTRACT ........................................................................................................................ xiii
LISTA DE ABREVIATURAS ........................................................................................... xvii
LISTA DE TABELAS ........................................................................................................ xxi
LISTA DE FIGURAS ....................................................................................................... xxiii
LISTA DE GRÁFICOS .................................................................................................... xxvii
SUMÁRIO ......................................................................................................................... xxxi
1 – INTRODUÇÃO .............................................................................................................. 37
1.1- Processo de vaso-oclusão na anemia falciforme ....................................................... 37
1.2- Hemoglobina Fetal .................................................................................................... 38
1.3- Hidroxiuréia .............................................................................................................. 38
1.4- Anemia falciforme como uma doença inflamatória crônica ..................................... 39
1.5- Plaquetas ................................................................................................................... 40
1.6- Adesão das plaquetas ao endotélio ............................................................................ 41
1.7- Nucleotídeos cíclicos e adesão plaquetária ............................................................... 44
2 – OBJETIVOS ................................................................................................................... 49
2.1- Objetivos Gerais ........................................................................................................ 49
2.2- Objetivos Específicos ................................................................................................ 49
3- CASUÍSTICA E ASPECTOS ÉTICOS ........................................................................... 53
3.1- Aspectos éticos da pesquisa ...................................................................................... 53
4- METODOLOGIA ............................................................................................................ 57
4.1- Separação de Plaquetas ............................................................................................. 57
4.2- Ensaio de Adesão Estático ........................................................................................ 57
4.3- Uso de drogas e/ou anticorpos em ensaios de adesão ............................................... 58
4.4- Citometria de Fluxo ................................................................................................... 59
4.5- Extração e mensuração dos Nucleotídeos Cíclicos (AMPc e GMPc) ....................... 60
4.6- Ensaio de Agregação Plaquetária .............................................................................. 61
xxxi
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4.7- Análise Estatística ..................................................................................................... 62
5 – RESULTADOS .............................................................................................................. 65
5.1- Aspectos clínicos dos indivíduos controles e pacientes que participaram do
estudo ................................................................................................................................ 65
5.2- Adesão de plaquetas AA, SS e SSHU ao FB in vitro. .............................................. 67
5.3- Adesão de plaquetas AA, SS e SSHU ao Col in vitro............................................... 67
5.4- Trombina induz um aumento na adesão de plaquetas ao FB e ao Col. ..................... 67
5.5- Avaliação da expressão e função de moléculas de adesão na superfície de
plaquetas AA SS SSHU, utilizando a técnica de citometria de fluxo. ............................. 70
5.6- Efeitos dos anticorpos anti-moléculas de adesão na adesão de plaquetas ao
FB ..................................................................................................................................... 71
5.7- Níveis intraplaquetários de AMPc em plaquetas AA, SS e SSHU ........................... 71
5.8- Efeito da trombina nos níveis intraplaquetários de AMPc em plaquetas
AA, SS e SSHU ................................................................................................................ 72
5.9- Correlação dos níveis de HbF em pacientes SS e SSHU com os níveis
intraplaquetários de AMPc ............................................................................................... 76
5.10- Níveis intraplaquetários de GMPc em plaquetas AA, SS e SSHU ......................... 76
5.11- Efeito do inibidor da PDE3A, cilostazol, na adesão de plaquetas AA, SS e
SSHU ao FB ..................................................................................................................... 76
5.12- Efeito dos inibidores das proteínas quinases PKA, PKG e PKC na adesão
de plaquetas AA, SS e SSHU ........................................................................................... 80
5.13- Agregação plaquetária e padronizações necessárias ............................................... 82
5.14- Comparação da agregação das plaquetas AA, SS e SSHU com os
agonistas plaquetário ADP, Col e TB ............................................................................... 84
6 – DISCUSSÃO .................................................................................................................. 89
7 – CONCLUSÃO ................................................................................................................ 97
8 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................................... 101
9 – APÊNDICES ................................................................................................................ 111
9.1- Artigo submetido em 25 de agosto de 2009 – HAEMATOLOGICA ..................... 111
xxxiii
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Introdução
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1 – INTRODUÇÃO
A anemia falciforme é conseqüência de uma mutação de ponto envolvendo a troca
do ácido glutâmico pela valina, na sexta posição da cadeia polipeptídica da β-globina e que
resulta na síntese de uma hemoglobina anômala, a hemoglobina S (HbS) (STUART e
NAGEL, 2004). A HbS quando desoxigenada forma polímeros e causa deformação,
enrijecimento e fragilização das células vermelhas, quando essas atravessam a
microvasculatura. Além disso, a hemólise intravascular que resulta em anemia, eventos
vasos-oclusivos, causa um aumento na susceptibilidade à infecção (FIGURA 1), que
caracterizam a AF. Vários fatores contribuem para a vaso-oclusão, principal causa de
morbidade em pacientes com AF. A adesão anormal das células brancas e vermelhas ao
endotélio desencadeia uma diminuição do fluxo de sangue na microcirculação, e é um dos
principais fatores envolvidos na vaso-oclusão (FADLON et al., 1998; ROSSE et al., 2000).
1.1- Processo de vaso-oclusão na anemia falciforme
A vaso-oclusão é um processo que envolve várias etapas. Eventos vasos-oclusivos
são iniciados pela adesão anormal de células vermelhas e brancas ao endotélio vascular e
interações heterogêneas. Essas interações podem ser mediadas, principalmente, pela
ativação das vias de sinalização dessas células e pelo aumento da atividade e expressão das
moléculas de adesão na superfície das células endoteliais, vermelhas e leucócitos
(HILLERY et al., 2000; STUART e NAGEL, 2004; ASSIS et al., 2005; GAMBERO et al.,
2007; CANALLI et al., 2008). Em paralelo à adesão das células vermelhas e leucócitos ao
endotélio, a hemostase catiônica anormal das hemácias ocasiona desidratação e a formação
de hemácias irreversivelmente falcizadas. O tônus vasomotor anormal favorece a
vasoconstrição, devido à diminuição da biodisponibilidade de óxido nítrico (NO) e
endotelina-1. Estes acontecimentos levam ao prolongamento do tempo de trânsito do
eritrócito na microvasculatura e, consequentemente, à polimerização da HbS devido à
desoxigenação das hemácias e o eventual bloqueio do vaso. O aumento da concentração
intracelular de HbS, a diminuição do pH sanguíneo, a liberação de espécies reativas ao
oxigênio (ROS), e a ativação da cascata de coagulação com geração secundária de
trombina, também contribuem para o processo de vaso-oclusão (HEAD et al., 1997)). O
NO é um gás solúvel com meia vida de alguns segundos, tornou-se uma substância de
Introdução 37
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grande interesse devido principalmente aos seus efeitos benéficos na manutenção do tônus
muscular e prevenção da agregação plaquetária (através do aumento do GMPc e diminuição
do Ca2+ intraplaquetário) (NATHAN, 1992).
1.2- Hemoglobina Fetal
O aumento significativo dos níveis de hemoglobina fetal (HbF) nas células
vermelhas (CV) normalmente proporciona uma melhora clínica para os pacientes com AF,
pois existem pacientes que apresentam níveis aumentados de HbF (ROSSE et al., 2000). A
hemoglobina fetal é uma molécula formada pela combinação de 2 cadeias α-globínicas e 2
cadeias γ-globínicas, substituindo as cadeias β-globínicas. Esta combinação inibe a
polimerização da hemoglobina e, conseqüentemente, a falcização das CV, reduzindo os
sintomas da AF (SERJEANT & SERJEANT, 2001). A cadeia γ-globínica é produzida em
altos níveis em células eritróides durante a fase embrionária, porém, após o nascimento
ocorre o “switching” (ou seja, a produção predominante passa a ser de cadeias β-
globínicas). Sendo assim, são necessários novos estudos com drogas capazes de reverter
esse efeito “gene switching”, por terapia gênica, para aumentar os níveis de HbF nas CV
reduzindo os sintomas da doença.
1.3- Hidroxiuréia
A hidroxiuréia (HU) promove a produção de HbF indiretamente (ROSSE et al.,
2000) e é a única droga disponível no momento, clinicamente comprovada, que diminui a
frequência de crises de vaso-oclusão e a necessidade de transfusões sanguíneas
(CHARECHE et al., 1995). Postula-se que a HU previne a formação da ribonucleotidase,
inibindo a síntese de DNA e, consequentemente, aumenta a produção de HbF (ROSSE et
al., 2000). Porém, alguns estudos têm mostrado que a HU pode exercer seu efeito através
de outros mecanismos. Um desses mecanismos seria o aumento da produção de NO através
da L-arginina (MORRIS et al., 2001). Gladwin e colaboradores (2002) demonstraram que a
terapia com HU promove a formação intracelular e intraeritrocítica de NO e sugerem que é
esse aumento de NO que eleva os níveis de HbF. Produtos da reação de oxidação do NO
(nitrato, nitrito e hemoglobina nitrosilada) foram medidos em alguns pacientes e os níveis
obtidos encontraram-se bastante elevados após a ingestão de HU (COKIC et al., 2003),
Introdução 38
-
levando a acreditar que alguns dos efeitos e benefícios da HU possam ser mediados pela
liberação intravascular de NO.
Vaso-oclusão
Hemólise intravascular
Figura 1: Fisiopatologia da Anemia Falciforme (Adaptado do: Steinberg; Trends
Pharm Sci, 2006). A síntese de hemoglobina S é resultado de uma mutação de ponto, que
quando desoxigenada forma polímeros no interior das hemácias, deformando-a e tornando-
a rígida as (formato de foice). As hemácias, neutrófilos e reticulócitos participam do
processo de vaso-oclusão, além da hemólise intravascular de hemácias, são eventos que
caracterizam a anemia falciforme.
1.4- Anemia falciforme como uma doença inflamatória crônica
Atualmente, pesquisadores possuem uma visão mais holística da anemia falciforme.
A obstrução e lesão do endotélio e dos tecidos desencadeiam uma resposta inflamatória
que, por sua vez, leva a um estado inflamatório crônico em pacientes com AF,
caracterizado por alterações significativas no repertório de citocinas inflamatórias e fatores
de crescimento. Tais citocinas, como a interleucina 6 (IL-6), interleucina 8 (IL-8), fator-α
de necrose tumoral (TNF- α) e o fator estimulador de colônia de macrófago-granulócito
Introdução 39
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(GM-CSF) são encontrados em níveis elevados nos pacientes com AF (DUITS et al., 1996;
CROIZAT, et al., 1999; CONRAN et al., 2004; LANARO et al., 2008). Níveis aumentados
dessas citocinas geram enormes consequências para a fisiopatologia da doença, como por
exemplo, a ativação dos leucócitos e mudança na produção e migração das células brancas
da medula óssea (PLATT, 2000).
Em condições fisiológicas normais, enzimas antioxidantes (NADPH oxidase e
xantina oxidase) e a formação ROS são resultados de uma atividade basal sem causar lesão
tecidual. Na AF, devido à resposta inflamatória associada à disfunção/ativação endotelial e,
consequentemente, ativação de células vermelhas, leucócitos e plaquetas, há um aumento
do stress oxidativo que contribuiu para a formação de espécies reativas ao oxigênio (ROS),
(WOOD e GRANGER, 2007).
1.5- Plaquetas
As plaquetas são produzidas por um processo de proliferação e diferenciação celular
dos megacariócitos, que ocorre durante a Megacariocitopoese no interior da medula óssea
(LOURENÇO et al., 2001). São pequenos fragmentos discóides que têm cerca de 2 µm de
diâmetro, anucleados, originárias do citoplasma dos megacariócitos que circulam na
corrente sangüínea (RUGGERI, 2002). Na sua membrana plasmática localizam-se
receptores como complexos de glicoproteínas, da família das integrinas, com domínios
extracelulares, transmembrana e citoplasmático que permitem a sua ativação para o meio
intraplaquetário durante a agregação, com a mudança da sua forma discóide para projeções
da membrana plasmática e liberação do conteúdo dos grânulos intraplaquetários. Existem 2
tipos de grânulos no interior das plaquetas: os grânulos alfa que contêm fibrinogênio,
fibronectina, fatores V e VIII e fatores de crescimento (fator de crescimento derivado de
plaquetas, PDGF, e o fator β transformador do crescimento, TGF-β); e os corpúsculos
eletro densos ou grânulos densos, que armazenam adenosina difosfato (ADP), adenosina
trifosfato (ATP), cálcio ionizado, histamina, serotonina e adrenalina (ROBBINS et al.,
1996). A ativação plaquetária (receptores de membrana) é um processo fisiológico
fundamental para a manutenção da função hemostática plaquetária (KULKARNI, 2000).
Em condições normais, cerca de 1012 plaquetas percorrem um fluxo de 1000 m2 na
superfície do endotélio sem aderência ou agregação. Quando ocorre uma desestabilização
Introdução 40
-
da integridade desse fluxo sanguíneo (lesão tecidual), as plaquetas são ativadas através dos
seus receptores de membrana (moléculas de adesão) que promovem a adesão às células
endoteliais, através das integrinas e das selectinas, e também pelas proteínas adesivas do
fator de von Willebrand (vFW) que é secretado pelas células endoteliais, e pelo
fibrinogênio encontrado no plasma sanguíneo e na matriz extracelular (MEC). As plaquetas
desempenham um importante papel na patogênese dos eventos vasculares agudos, como no
infarto do miocárdio e no acidente vascular cerebral (AVC). Quando as plaquetas estão
ativadas, a adesão ao endotélio pode ocorrer além da agregação, como nas tromboses
(LEVI, 2005). O aumento da ativação plaquetária em pacientes AF já foi investigado
(WUN et al., 1998 e 1999; TOMER et al., 2001). Pesquisadores evidenciaram que alguns
fatores estejam correlacionados com esta ativação, como: o aumento dos níveis de ß-
tromboglobulina no plasma sanguíneo (MEHTA, 1980; ADAMIDES et al., 1990),
diminuição na secreção de ADP/ATP (BUERLING-HARBURY et al., 1989) e eliminação
de tromboxano A2 pela urina (KURANSTIN-MILLS et al., 1992). A circulação e a
agregação de plaquetas na AF são significativamente anormais, mesmo durante os quadros
de estabilidade clínica dos pacientes, como a ausência de crises de vaso-oclusão. Existem
algumas terapias antiplaquetárias usadas na AF, como o efeito da aspirina (com ou sem
dipiridamol), que diminuem as crises álgidas (CHAPLIN et al., 1980; OSAMO et al.,
1981).
1.6- Adesão das plaquetas ao endotélio
A adesão das plaquetas ao endotélio é mediada pela exposição de moléculas
subendoteliais (colágeno) da MEC, e pelas moléculas de adesão das células endoteliais
(selectinas), que contribuem para a adesão plaquetária. O mecanismo da adesão das
plaquetas envolve o sequestro celular no local da lesão endotelial através da interação de
quatro receptores sinérgicos: a glicoproteína GPIb/IX/V (CD42b/CD42a) presente em
plaquetas; a integrina α2β1 (GPIa/IIa; CD49b/CD29), ligante para o colágeno; a integrina
αIIbß3 (GPIIb/IIIa; CD41a/CD61), ligante para o fibrinogênio e a integrina α5β1 (GPIc/IIIa;
CD51/CD61), ligante para a fibronectina (RUGGERI, 2002). A interação entre a GPIb
(subunidade do complexo GPIb/IX/V) e o vFW pode levar ao sequestro transitório de
plaquetas e adesão ao endotélio (FIGURA 2). Essa interação é amplificada pela ativação
Introdução 41
-
dos receptores da integrina αIIbβ3 das plaquetas e a ligação com o colágeno e estruturas
subendoteliais, resultando na formação de um agregado plaquetário estável, e ligações
irreversíveis com o fibrinogênio e vFW (KULKARNI et al., 2000). Os determinantes
moleculares que promovem a interação entre plaquetas e endotélio não são completamente
conhecidos (GAWAZ, et al., 2005). O contato inicial das plaquetas com o endotélio
durante o fluxo sanguíneo é mediado pelas selectinas presentes em plaquetas e células
endoteliais. As selectinas são moléculas de adesão celular Ca+2-dependentes com domínios
de reconhecimento para carboidratos (CRD), que pertencem ao grupo das lectinas
(KIERSZENBAUM, 2004). A P-selectina (CD62P), encontrada em plaquetas e células
endoteliais, é rapidamente expressa na superfície endotelial como mediadora da circulação
de plaquetas nas arteríolas e vênulas durante os processos inflamatórios (FRENETTE et al.,
1995, 1998) e é expressa na superfície da plaqueta após a sua ativação.
A PSGL-1 (ligante 1 para a glicoproteína P-selectina) ativa plaquetas ou células
endoteliais (KHARGHAN et al., 2006), foi primeiramente identificada em leucócitos
(KANSAS, 1996). A interação entre a P-selectina e PSGL-1 ou GPIb/IX/V é reversível e
insuficiente para estabilizar a adesão (GAWAZ et al., 2005), (FIGURA 3). Deficiências ou
inibidores de P-selectina diminuem a formação do tampão hemostático (PALABRICA et
al., 1992; SUBRAMANIAM et al., 1996). A rápida conversão para estabilizar a adesão
requer um contato adicional entre plaquetas e o endotélio. As integrinas αIIbβ3 (KASIRER-
FRIEDE et al., 2002; ARY et al., 2003) e α2β1 (NIESWANDT e WATSON, 2003; KAHN,
2004;) são as principais mediadoras de receptores de superfície que estabilizam a adesão
em células hematopoéticas (RUGGERI, 2002), (FIGURA 3). Estudos in vitro com a
integrina αIIbβ3 demonstraram uma adesão das plaquetas ao endotélio muito eficiente
(GAWAZ et al., 1997; Bombeli et al., 1998), e in vivo esta adesão é inibida com o
anticorpo anti-αIIbβ3 MAb (MASSBERG, 1999).
Introdução 42
-
Introdução 43
Figura 2: Esquema das moléculas de adesão de plaquetas e seus respectivos anticorpos
como ligantes. GPIb/IX/V (CD42b/CD42a) presente em plaquetas; a integrina α2β1 (GPIa/IIa; CD49b/CD29), ligante para o colágeno; a integrina αIIbß3 (GPIIb/IIIa;
CD41a/CD61), ligante para o fibrinogênio e a molécula de adesão P-selectina.
Figura 3: Adesão plaqueta/endotélio. Superfície do endotélio ativado expressa a P-
selectina. Os receptores de superfície de plaqueta GPIbα e PSGL-1 interagem com a P-
selectina endotelial e mediam o rolamento de plaquetas. Adesão firme é mediada pelas
integrinas αvβ3 e αIIbβ3 .(Adaptado do: J. Clin. Invest. Meinrad Gawaz, et al., 2005).
αα22ββ
ααIIIIbbββ33
ααIIIIbbββ33
ααIIIIbbββ
PP--sseelleeccttiinnaa
ααIIIIbbββ33
GGPPIIbb--IIXX--VV
MMeemmbbrraannaa PPllaassmmááttiiccaa
-
1.7- Nucleotídeos cíclicos e adesão plaquetária
Muitos antagonistas fisiológicos de função das plaquetas atuam pela ativação das
enzimas adenilato ciclase (AC) e guanilato ciclase (GC) (STEER e SALZMAN, 1980),
que, por sua vez, produzem aumento dos níveis intraplaquetários de nucleotídeos cíclicos
(NC), adenosina monofosfato cíclico (AMPc) e guanosina monofosfato cíclico (GMPc),
respectivamente (SCHWARZ et al., 2001). A elevação dos níveis de NC no interior das
plaquetas interfere na ativação da via de sinalização, e efetivamente bloqueia o complexo
intraplaquetário da rede de sinalização, rearranjo de citoesqueleto, ativação do receptor para
o fibrinogênio, liberação de grânulos plaquetários e a expressão de moléculas pró-
inflamatórias (BENETT et al., 1999; CALDERWOOD et al., 2000). Níveis de AMPc são
aumentados pela síntese de adenosina trifosfato (ATP) catalisado pela enzima de membrana
AC. O GMPc por sua vez é produzido a partir da guanosina trifosfato (GTP), pela enzima
citoplasmática GC das plaquetas. O NO media seus efeitos pela ativação da GC e,
consequentemente, eleva os níveis de GMPc. Os níveis dos NC são diminuídos por
degradação, através da hidrólise dos mesmos por enzimas fosfodiesterases (PDEs)
(SCHWARZ et al., 2001; ZHANG e COLMAN, 2007). Os principais alvos moleculares
dos NC em plaquetas são as proteínas quinases dependentes de NC, que mediam seus
efeitos através da fosforilação de substratos específicos (EIGENTHALER et al., 1992).
Aumento da concentração de AMPc e/ou GMPc em plaquetas, leva a uma inibição dos
níveis de Ca2+ intraplaquetário (SCHWARZ et al., 2001). O AMPc controla múltiplas vias
de sinalização em plaquetas, e atua como um regulador na ativação plaquetária (ZHANG e
COLMAN, 2007). Além disso, a ativação plaquetária estimulada por trombina (agonista
plaquetário) diminui os níveis intraplaquetários de AMPc via receptor de proteína Gi
(SIMONDS et al., 1989). Zhang e Colman (2007) demonstraram em estudos in vitro que a
Introdução 44
-
trombina pode inibir diretamente a AC através da proteína Gi, que se acopla ao receptor de
ativação plaquetária (PAR-1), ou inibir indiretamente através da secreção de ADP dos
grânulos densos das plaquetas. Para tanto, sugere-se que a via de sinalização onde TB
regula AMPc pela fosforilação/ativação da PI3/Akt (WOULFE, et al., 2004), esteja
envolvida na fosforilação/ativação da PDE3A induzida por trombina, responsável pela
hidrólise e degradação de AMPc (FIGURA 4).
O papel dos NC na adesão plaquetária ainda não está bem definido. O AMPc
geralmente é descrito como um inibidor de agregação plaquetária. A prostaglandina 2
(PGE2), por exemplo, estimula a produção de AMPc e inibe a adesão das plaquetas ao
endotélio em coelhos. Por outro lado, a adesão das plaquetas ao colágeno não é afetada pela
prostaglandina E1 (PGE1); e o forskolin (ativadores de AC) aumenta a adesão de plaquetas
ao colágeno. Possivelmente, o AMPc inibe efeitos secundários como o aumento dos níveis
intraplaquetário de Ca2+ citoplasmáticos induzidos por ADP, tromboxano A2 ou serotonina,
e não é a resposta principal ao colágeno (SCHWARZ et al., 2001). O GMPc aparenta ter
um papel inibidor na adesão plaquetária. A estimulação de GC por NO bloqueia a
agregação plaquetária e, possivelmente, este efeito acontece pela inibição das
fosfodiesterases de AMPc dependente de GMPc que proporciona o aumento dos níveis de
AMPc e, conseqüentemente, inibição pela PKA (POLANOWSKA-GRABOWSKA et al.,
1994).
Introdução 45
-
Figura 4: Regulação dos níveis intraplaquetários de AMPc via trombina. A trombina
(TB) regula os níveis de AMPc impedindo a síntese de ATP, e consequentemente,
acelerando a degradação do AMPc para 5’AMP via PDE3A. A TB liga-se ao receptor de
ativação plaquetária 1 (PAR-1), e a adenilato ciclase (AC) é inibida através do acoplamento
direto de PAR-1 à Gi, ou indiretamente pela liberação de ADP. O ADP liga-se ao receptor
P2Y, o qual se acopla à proteína Gi2, que inibe a AC e diminui o AMPc. Os efeitos da TB
em diminuir o AMPc são sinérgicos, porque TB bloqueia a formação de AMPc através da
inibição da AC via PDE3A. A outra via é pela fosforilação/ativação da via AKT/PI3K,
onde AKT pode diretamente ativar a PDE3A, proporcionando um mecanismo adicional que
regula o AMPc (adaptado do: HEMOSTASIS, THROMBOSIS, AND VASCULAR
BIOLOGY. Zhang e Colman, 2007).
Introdução 46
-
Objetivos
-
2 – OBJETIVOS
2.1- Objetivos Gerais
Investigação das propriedades adesivas e agregantes de plaquetas em pacientes com
anemia falciforme e em terapia com hidroxiuréia, e elucidação do papel dos nucleotídeos
cíclicos e outras vias de sinalização, como principais mediadores dos processos de vaso-
oclusão e adesão plaquetária.
2.2- Objetivos Específicos
2.2.1- Comparação das propriedades adesivas basais das plaquetas aos ligantes
fibrinogênio e colágeno, entre indivíduos saudáveis (AA), pacientes com
anemia falciforme (SS) e em terapia com hidroxiuréia (SSHU), utilizando-se
ensaio de adesão estático.
2.2.2- Avaliação da adesão plaquetária ao fibrinogênio após o estímulo com
trombina (agonista plaquetário).
2.2.3- Avaliação da adesão plaquetária ao fibrinogênio com inibidores de proteínas
quinase (KT5720 e H-89, inibidores de PKA; inibidor de PKG e o Ro-31-
8220, inibidor de PKC), um inibidor da fosfodiesterase 3A (cilostazol), e
com anticorpos específicos para P-selectina (CD62P) e integrina αIIbß3
(PAC-1), com plaquetas de AA, SS e SSHU, utilizando-se ensaio de adesão
estático.
2.2.4- Avaliação da expressão das moléculas de adesão na membrana plasmática
das plaquetas de indivíduos AA, SS e SSHU, utilizando-se a técnica de
citometria de fluxo.
2.2.5- Quantificação dos níveis intraplaquetários de GMPc e AMPc por ELISA, de
plaquetas de AA, SS e SSHU (com e sem estímulo de trombina).
2.2.6- Avaliação e comparação da função plaquetária com agonistas (ADP,
colágeno e trombina) de plaquetas AA, SS e SSHU, utilizando-se ensaio de
agregação plaquetária.
Objetivos 49
-
Casuística e Aspectos Éticos
-
3- CASUÍSTICA E ASPECTOS ÉTICOS
Médicos responsáveis pelos pacientes: prof. Dr. Fernando Ferreira Costa,
profaDra. Sara T.O. Saad e Dra. Fabíola Traina.
Foram selecionados pacientes com AF homozigotos para a HbS diagnosticados pelo
Hemocentro da UNICAMP, utilizando os métodos de eletroforese de hemoglobina e
cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) (VARIANTTM; Bio-Rad Laboratoryes,
Hercules, CA, EUA). Foram coletados aproximadamente 12 ml de sangue periférico, para a
separação das plaquetas, de um grupo de voluntários sadios (masculinos e femininos) e
pacientes com AF (masculinos e femininos). O grupo de pacientes foi composto por 2
grupos de pacientes com e sem terapia com HU, com idades entre 18-65 anos. O grupo de
voluntários sadios foi composto por alunos/funcionários da UNICAMP, que estiveram sem
uso de aspirina (ácido acetilsalisílico) por pelo menos 10 dias e não receberam nenhuma
compensação financeira. Os dois grupos de pacientes também estiveram sem uso de
aspirina por pelo menos 10 dias. Os grupos de pacientes apresentavam-se em fase estável,
ausência de crises de dores, infecção e transfusões prévias por pelo menos 3 meses
anteriores à data da coleta das amostras. O início do tratamento do grupo de pacientes em
terapia com HU (20-30 mg/Kg/dia) foi decidido pelo médico responsável de acordo com os
seguintes critérios de inclusão: crises de vaso-oclusão com frequência superior à 3 vezes
pelo período de um ano, e/ou repetidos episódios de síndrome torácica aguda. Foram
coletadas apenas amostras de pacientes que estavam em uso de HU há pelo menos 3 meses.
Os indivíduos (voluntários sadios e pacientes) assinaram o Termo de Consentimento Livre
e Esclarecido (TCLE) e seus dados clínicos estão na TABELA I (pág. 38).
3.1- Aspectos éticos da pesquisa
Este estudo foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) da
Faculdade de Ciências Médicas (FCM) da UNICAMP – CEP em 25/03/2007 e homologado
na Reunião ordinária do CEP/FCM, (registro inicial no CEP 5/12/2006 e aprovado em
4/4/2007). O Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) assinado por todos os
participantes desse estudo, também foi aprovado pelo conselho citado.
Casuística e Aspectos Éticos 53
-
Metodologia
-
4- METODOLOGIA
4.1- Separação de Plaquetas
A separação de plaquetas foi realizada coletando-se sangue periférico (12 ml) em
tubo contendo K2 EDTA (7.2 mg), de indivíduos normais e pacientes com AF.
Centrifugou-se por 15 minutos à 200g (21ºC), para separação do plasma rico em plaquetas
(PRP). Ao PRP foi adicionado um tampão de lavagem (140 mM NaCl / 0.5 mM KCl / 12
mM citrato de sódio / 10 mM glicose / 12.5 mM sacarose, pH 6) na proporção 5/7, com
delicada homogeneização. Centrifugou-se novamente por 12 minutos à 800 g (21ºC). O
sobrenadante foi descartado e o pellet de plaquetas ressuspendido, gentilmente, com 500 µl
de solução de Krebs (118 mM NaCl / 25 mM NaHCO3 / 1.2 mM KH2PO4 /1.7 mM MgSO4 /
5.6 mM glicose, pH 7.4). A concentração de plaquetas foi ajustada para 1,2 x 108
plaquetas/ml (Cell-Dyn® 1600, Mountain View, CA, USA). A reposição do cálcio foi
realizada com uma solução de 1 mM CaCl2 antes da realização dos experimento
4.2- Ensaio de Adesão Estático
O ensaio de adesão estático foi realizado de acordo com Bellavite, et al. (1994),
com algumas adaptações. A concentração padronizada de fibrinogênio (FB) como ligante
foi de 50 µg/ml, e a de colágeno (Col) como ligante, foi de 10 µg/ml (50 µl/poço). Placas
com 96 poços foram preparadas por coating individual com 50 μg/ml de fibrinogênio
(Calbiochem, La Jolla, CA, USA) ou 10 μg/ml de colágeno tipo I humano (SIGMA, St.
Louis, MO, USA), e foram incubadas over night (aproximadamente 18 h) à 4oC. Os poços
foram lavados duas vezes com 200 µl/poço de solução de Krebs e os sítios inespecíficos
foram bloqueados com 100µl/poço de uma solução de Krebs com 1% de BSA (LGCBio,
nacional) por 60 minutos à 37oC. As placas foram lavadas novamente como descritas
anteriormente, e os ensaios de adesão foram realizados em triplicata; adicionando-se 50
μl/poço da suspensão de plaquetas (1,2 x 108 plaquetas/ml) incubadas por 15 minutos à
37oC. Para cada amostra foi preparada uma curva padrão em placas não tratadas com FB
e/ou Col, em duplicata com diluições a partir da concentração original (1,2 x 108
plaquetas/ml); 5%, 10%, 20% 50% e 100%. Para todos os experimentos foi realizada uma
adesão basal (ausência de drogas) para cada amostra de controles e paciente. Após a
incubação, as plaquetas não aderentes foram desprezadas lavando-se a placa mais duas
Metodologia 57
-
vezes como descrito anteriormente. Foram adicionados 50 μl/poço de tampão de Krebs na
placa do ensaio, e 150 μl/poço do substrato da fosfatase ácida (0.1 M tampão citrato; pH
5.4; 5 mM p-fosfato de nitrofenila e 0.1% de Triton X-100, Sigma), nas placas do ensaio e
da curva padrão, e incubou-se por 1 h a temperatura ambiente (TA). Ao final da incubação,
a reação foi interrompida adicionando-se 100 μl/poço de NaOH (2N). O resultado foi
obtido no leitor de ELISA com comprimento de onda de 405 nm (Multisscan MS,
Labsystems, EUA), e a adesão foi calculada em porcentagem de plaquetas aderidas a partir
da comparação das absorbâncias dos poços com uma curva padrão, formada por diluições
da suspensão original de plaquetas.
4.3- Uso de drogas e/ou anticorpos em ensaios de adesão
Foram realizados diversos experimentos de ensaio de adesão com diferentes drogas.
A trombina foi utilizada na concentração de 50 mU/ml (Sigma, St. Louis, MO, USA),
inibidores de proteínas quinases e anticorpos específicos também foram utilizados.
Os inibidores da proteína quinase A (PKA), o KT5720 (Calbiochem, La Jolla, CA,
USA) e o H-89, Dihydrochloride, (Calbiochem, La Jolla, CA, USA) foram solubilizados
em DMSO (dimetilsulfóxido, Merk, KGaA, Darmstadt, Germany) e mantidos numa
concentração estoque 2 mM (KT5720) e 10 mM (H-89) e armazenados à -20°C. Na
padronização dos ensaios de adesão foram utilizados a seguintes concentrações: 0.5 µM, 1
µM e 3 µM. A concentração escolhida de KT5720 foi de 3 µM; e a concentração escolhida
de H-89 foi de 1 µM (ISHIKURA, et al., 2005).
O inibidor da proteína quinase G, o PKG (Calbiochem, La Jolla, CA, USA) foi
solubilizado com água de injeção (estéril) e mantido numa concentração estoque de 1 mM e
armazenados à -20°C. Na padronização dos ensaios de adesão foram utilizadas as seguintes
concentrações: 1 µM (concentração escolhida como padrão) e 10 µM de PKG.
O inibidor da proteína quinase C, o Ro-31-8220 (Calbiochem, La Jolla, CA, USA)
foi solubilizado com água de injeção (estéril) e mantido numa concentração estoque de 5
mM e armazenado à -20°C. Na padronização dos ensaios de adesão foram utilizadas as
seguintes concentrações: 1 µM e 5 µM (concentração escolhida como padrão) de Ro-31-
8220 (AMOR, et al., 2005).
Metodologia 58
-
O Cilostazol [6-(4-[1-cyclohexyl-1H-tetrazol-5-y]butoxy)-3,4-dihydro-2(1H)-
quinolinone, OPC-13013], (Sigma, St. Louis, MO, USA) é um inibidor específico da
fosfodiesterase 3A (PDE3A), é um vasodilatador, inibe a ativação e agregação plaquetária,
e trombose (DALAINAS, 2007). Foi solubilizado em DMSO e mantido na concentração
estoque de 10 mM e armazenado à -20°C. Na padronização dos ensaios de adesão foram
utilizadas as seguintes concentrações: 0.16 µM, 1.6 µM (concentrações escolhidas como
padrões)e 16.6 µM.
A Vinpocetina é um inibidor específico da PDE1 que foi solubilizado em etanol
absoluto (95%), e a concentração utilizada nos ensaios de adesão foi de 50 µM
(ALMEIDA, et al., 2008).
Todos os ensaios de adesão de plaquetas, as quais foram incubadas com drogas
solubilizadas com DMSO (KT5720, H-89 e cilostazol), foram comparados com uma adesão
basal de plaquetas incubadas apenas com DMSO na proporção de 0.001 % v/v.
Realizou-se o ensaio de adesão ao FB com anticorpos específicos para as seguintes
moléculas: o CD62P (clone AK6, Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) que reconhece a
molécula P-selectina das plaquetas ligando-se a ela, e o PAC-1 (Becton Dickinson, San
Jose, CA, USA) que reconhece a integrina αIIbß3 na sua conformação de alta afinidade,
ligando-se a ela e impedindo-a de ligar-se ao FB. As concentrações padronizadas dos
anticorpos foram: 2 µg/ml do PAC-1 (concentração estoque 25 µg/ml) e de 2 µg/ml do
CD62P (concentração estoque 50 µg/ml) do CD62P.
4.4- Citometria de Fluxo
A expressão superficial das moléculas CD41a (subunidade α da integrina αIIbβ3, receptor ao FB), CD49b (subunidade α da integrina α2β1, receptor ao Col), CD42b
(subunidade GPIb do complexo GPIb/IX/V, receptor ao vFW) e CD62P (P-selectina), nas
plaquetas foram determinadas por citometria de fluxo. As plaquetas de indivíduos
saudáveis e pacientes com AF (com e sem HU) foram incubadas com anticorpos anti-
CD41a conjugado FITC (clone PM6/248), anti-CD49b – FITC (clone AK7), anti-CD42b
ficoeritrina (PE) (clone AK2), anti-CD62P – FITC (clone AK6) e PAC-1 – FITC que
reconhece a integrina αIIbβ3 na sua conformação de alta afinidade, todos da Becton
Dickinson, San Jose, CA, USA. Cerca de 4 ml sangue periférico foram coletadas (9NC
Metodologia 59
-
citrato de sódio 3,2%; 1:10). O PRP foi obtido por centrifugação por 10 minutos à 800 rpm
(21°C). O PRP (5 µl, 1 x 108 PLTs/ml) foi fixado com 200 μl de solução de PBS
(phosphate-buffered saline, pH 7.4) com 1% de paraformaldeído por 10 minutos à TA. Em
seguida, as plaquetas foram lavadas com 2 ml de PBS e centrifugadas por 15 minutos à
1800 rpm (21°C). Desprezou-se o sobrenadante; e as plaquetas foram ressuspendidas em 45
μl de PBS e adicionou-se 5 μl do anticorpo correspondente, e incubado por 20 minutos
protegida da luz em TA. Em seguida, as plaquetas foram novamente lavadas como descrito
anteriormente. Ao final, o sobrenadante foi desprezado e as plaquetas foram ressuspendidas
em 500 μl de PBS, e as amostras foram analisadas à 488nm no FACScalibur (Becton-
Dickinson, San Jose, CA, USA). Foram obtidos 10000 eventos para cada amostra. No
SSC/FSC (side scatter/forward scatter), foram utilizados histogramas para a identificação
das populações de plaquetas. A intensidade da fluorescência de cada plaqueta foi
comparada com plaquetas incubadas com um controle negativo de isotipo IgG1/IgG1 (AbD
SEROTEC, MorphoSys UK Ltd, Endeavour House, Langford Business Park, Langford
Lane, Kidlington, Oxford, OX5 1GE, UK) conjugado com FITC e PE.
4.5- Extração e mensuração dos Nucleotídeos Cíclicos (AMPc e GMPc)
Os nucleotídeos cíclicos foram extraídos das plaquetas, de acordo com o protocolo de
separação de sangue periférico, como foi descrito anteriormente. Antes da extração, uma
solução de 1 mM CaCl2 foi adicionada as plaquetas (1,2 x 108 plaquetas em 250 µl de Krebs)
para repor o cálcio que foi quelado pelo K2 EDTA do tubo de coleta.
As plaquetas foram pré-incubadas com um inibidor inespecífico de fosfodiesterase,
2 mM do 3-isobutil-1-metil-xantina (IBMX, Calbiochem, San Diego, CA, USA) por 15
minutos em TA, a fim de se evitar a degradação dos nucleotídeos cíclicos. Após a
incubação, foram adicionados 11,5 µl de ácido perclórico (78%) para a extração dos NC, e
em seguida as amostras foram centrifugadas à 6000g por 20 minutos em TA. O
sobrenadante, contendo as nucleotidades cíclicas, foi retirado o pH foi neutralizado com
8M de hidróxido de potássio (KOH). As amostras foram armazenadas à -80ºC até o dia do
ensaio.
Metodologia 60
-
Metodologia 61
A quantificação dos níveis de AMPc e GMPc foi mensurada utilizando-se os kits de
ELISA específicos para AMPc ou GMPc (Amersham Biosciences, Bucks, UK, FIGURA
5), de acordo com o manual do fabricante.
Esquema do ensaio de ELISA para AMPc
Figura 5: Esquema do ensaio de ELISA para AMPc, de acordo com o fabricante
(Amershan Biosciense).
4.6- Ensaio de Agregação Plaquetária
A agregação plaquetária é um ensaio funcional com PRP ou sangue total, pelo
equipamento CHRONO-LOG CORPORATION, Modelo 700 (West Park Road,
Havertown, PA, EUA). Para o ensaio foram coletados cerca de 14 ml de sangue periférico
com o anticoagulante 3,2% citrato de sódio (VACUPLAST, Huangyn, China). As amostras
de sangue periférico foram centrifugadas a 800 rpm por 10 min a 21ºC. O PRP foi obtido e
transferido para um tubo falcon de 15 ml. Em seguida, uma segunda centrifugação foi
realizada de 3000 rpm por 15 min a 21°C, do que sobrou da amostra da qual foi extraído o
PRP, a fim de se obter o PPP (plasma pobre em plaqueta). O PPP também foi transferido
11MM HH22SSOO44 ((OODD 445500 nnmm))
++ TTMMBB
ppooççoo
AAMMPPcc--ppeerrooxxiiddaassee
AAMMPPcc ddaa aammoossttrraa
FFaassee ssóólliiddaa SSuubbssttrraattoo
IInnccuubbaaççããoo
AAmmeerrsshhaamm BBiioosscciieennssee
AAnnttii--IIggGG
AAnnttii--AAMMPPcc
RReeaaggeennttee ddoo KKiitt
-
Metodologia 62
para outro tubo falcon de 15 ml. A contagem das plaquetas foi realizada no equipamento
Cell Dyn, e as concentrações foram ajustadas para 250.000 plaquetas/ml com o próprio PPP
das amostras correspondentes. Para o ensaio foram utilizadas 250 µl de plaquetas (250.000
plaquetas/ml) por cubeta de vidro, e no interior de cada cubeta foi adicionada uma barra
magnética (ímã) para promover a agitação e propiciar a agregação a partir desta agitação
mecânica. Os agonistas plaquetários utilizados foram: 5 µM de ADP; 1 e 2 µg/ml de
colégeno e 500 mU/ml de trombina. Todo o ensaio foi realizado na temperatura de 37°C,
que corresponde à temperatura corporal humana fisiológica. O resultado foi dado por uma
curva de amplitude de agregação, expresso em porcentagem, dentro de um gráfico
representado pelas coordenadas X e Y.
4.7- Análise Estatística
Os resultados foram expressos pelas médias ± erro da média (SEM) de n de
indivíduos. Os grupos foram comparados através do teste não-paramétrico Mann-Whitney
(pareado), comparação entre 2 grupos, ou pelo teste não-paramétrico ANOVA (pareado e
não-pareado), comparação entre mais de 2 grupos, seguido pelo teste de Dunn’s Multiple
Comparisons. Os testes utilizados não foram relatados nos gráficos e tabelas, a não ser que
tenham sido utilizados outro teste. As análises de correlação através do teste de
Spearman’s. Os cálculos foram efetuados no programa GRAPHPAD INSTAT (GraphPad
Software Inc., San Diego, CA, USA), e valor de p menor ou igual a 0,05 foi considerado
estatisticamente significante.
-
Resultados
-
5 – RESULTADOS
5.1- Aspectos clínicos dos indivíduos controles e pacientes que participaram do
estudo
Todos os pacientes que participaram deste estudo foram submetidos a exames
clínicos, e os dados hematológicos como o hemograma e quantificação de HbF, estão
representados na TABELA I.
O grupo de pacientes em terapia com HU apresentou valores significativamente
maiores de hematócrito, hemoglobina, volume corpuscular médio (VCM) e hemoglobina
corpuscular média (HCM), em relação ao grupo de pacientes sem HU (SS). Porém, a
contagem de leucócitos (WBC) foi maior no grupo de pacientes SS em relação aos
pacientes SSHU.
Além disso, os pacientes SSHU apresentaram níveis aumentados de HbF, quando
comparados ao grupo de pacientes SS. Esse resultado mostra que a HU atua de maneira
diretamente ou indiretamente na produção de HbF, e existem vários estudos publicados na
literatura que também já comprovaram esse efeito da HU em pacientes com AF.
Resultados 65
-
Tabela 1: Aspectos clínicos dos controles AA, pacientes SS e pacientes SSHU que participaram deste estudo.
AA
SS
SSHU
P SS comp. SSHU
Masculino/feminino 20/29 11/25 16/15 Idade (anos) 33 (32.5; 19, 52) 39.8 (39, 20, 65) 36.4 (34, 22, 66) >0.05 Contagem total de células vermelhas (106/µl)
N/D 2.71 (2.66, 1.75, 4.48) 2.67 (2.67, 1.59, 3.53) >0.05
Hematócrito (%) 44 (45, 38, 50) 24.0 (24.4, 17.5, 33.6) 27.1 (27.3, 16.3, 37.4) 0.005 Hemoglobina (g/L) N/D 79.5 (80, 56, 106) 91.5 (90, 55, 141) 0.003 Volume Corpuscular Médio (fl) N/D 89.5 (91.3, 73.9, 105.1) 102.9 (105.0, 78.9, 120.8)
-
5.2- Adesão de plaquetas AA, SS e SSHU ao FB in vitro.
Observou-se que as plaquetas de pacientes SS (plaquetas SS) apresentaram uma
maior capacidade de aderirem ao FB, proteína plasmática, em relação às plaquetas de
indivíduos controles (plaquetas AA) e de pacientes SSHU (plaquetas SSHU), e este
resultado foi estatisticamente significativo, como representado no GRÁFICO 1A. Por sua
vez, as plaquetas de pacientes SSHU apresentaram uma adesão semelhante às plaquetas
AA, e uma diminuição significativa em relação às plaquetas SS.
5.3- Adesão de plaquetas AA, SS e SSHU ao Col in vitro.
Em contraste ao FB, a adesão basal das plaquetas ao Col, proteína da matriz
extracelular (MEC), não apresentou nenhuma diferença estatisticamente significativa entre
as plaquetas AA, SS e SSHU (GRÁFICO 1B).
5.4- Trombina induz um aumento na adesão de plaquetas ao FB e ao Col.
Foi utilizado um agonista plaquetário, a trombina (50 mU/ml), e realizada uma co-
incubação com as plaquetas. A trombina foi capaz de aumentar significativamente a adesão
das plaquetas AA, SS e SSHU ao FB, quando comparada com suas respectivas adesões
basais (GRÁFICO 2A). Esse efeito da trombina também foi observado para o ensaio de
adesão das plaquetas AA, SS e SSHU ao Col, quando comparada com as respectivas
adesões basais (GRÁFICO 2B).
Esses resultados podem indicar que as plaquetas SS possuem uma capacidade maior
de aderirem ao FB do que ao Col, assim como também podem indicar que, possivelmente, a
função de uma(s) molécula(s) de adesão receptora para fibrinogênio possa estar alterada, e
não do receptor ao colágeno.
Resultados 67
-
AA SS SSHU0
10
20
30
40
*
##
A
n=21 n=13 n=13
% a
desã
o pl
aque
tária
ao
FB (5
0μ
g/m
l)
AA SS SSHU0
10
20
30
40
n=15 n=11 n=12
B
% a
desã
o pl
aque
tária
ao
Col
(10μ
g/m
l)
Gráfico 1: Adesão basal das plaquetas de indivíduos controles (AA), pacientes AF (SS)
e pacientes AF em terapia com HU (SSHU), 37ºC, 15 min. (A) adesão basal das
plaquetas ao FB (50 µg/ml), *p
-
0
15
30
45
AA SS SSHU
Trombina(50 mU/ml)
A
P
-
5.5- Avaliação da expressão e função de moléculas de adesão na superfície de
plaquetas AA SS SSHU, utilizando a técnica de citometria de fluxo.
A expressão das principais moléculas de adesão das plaquetas foi determinada por
citometria de fluxo na superfície de plaquetas de indivíduos controles (AA), pacientes AF
(SS) e pacientes AF em terapia com HU (SSHU). O resultado foi expresso pela
porcentagem média de plaquetas que expressam as moléculas (% positiva ± SEM) e pela
média da intensidade de fluorescência (MIF) para cada amostra de plaquetas adquirida
(TABELA II). Para cada amostra de controle e paciente foi utilizado um controle isotipo
negativo IgG1/IgG1 conjugado FITC/PE.
Como demostrado na TABELA II, as plaquetas SS apresentaram maior marcação
positiva para a molécula P-selectina em comparação às plaquetas AA, e esse aumento foi
estatisticamente significativo (p=0.04). Além disso, a MIF também foi maior em plaquetas
SS em comparação às plaquetas AA. Entretanto, as plaquetas SSHU também apresentaram
um aumento na marcação positiva e da MIF em comparação às plaquetas AA, mas esse
resultado não foi estatisticamente significativo.
A expressão da integrina αIIbß3 através do anticorpo CD41a, que reconhece a
subunidade αIIb, não apresentou diferenças estatisticamente significativas nas plaquetas AA,
SS e SSHU, tanto para a marcação positiva (acima de 96%) e MIF (acima de 400).
O anticorpo PAC-1 que reconhece a integrina αIIbß3 (receptor ao FB) na sua
conformação de alta afinidade, nas plaquetas SS apresentou maior marcação positiva em
comparação às plaquetas AA, e esse aumento foi estatisticamente significativo (p=0.03). O
resultado da ligação desse anticorpo as plaquetas SSHU foi semelhantes às plaquetas AA,
mas não foi estatisticamente significativo quando comparado às plaquetas SS.
A expressão da subunidade GPIb do complexo GPIb/IX/V (receptora para o fator de
vWF) foi avaliada através do anticorpo CD42b, e não apresentou diferenças
estatisticamente significativas nas plaquetas AA, SS e SSHU, tanto para a marcação
positiva e MIF.
A expressão da subunidade α2 da integrina α2ß1 (colágeno como ligante), avaliado
através do anticorpo CD49b também não apresentou nenhuma diferença estatisticamente
significativa nas plaquetas AA, SS e SSHU, tanto para a marcação positiva MIF.
Resultados 70
-
5.6- Efeitos dos anticorpos anti-moléculas de adesão na adesão de plaquetas ao
FB
Foram realizados ensaios de adesão ao FB na presença de anticorpos específicos
para as seguintes moléculas de adesão: P-selectina (2 µg/ml - CD62-P), e para a integrina
αIIbβ3 na sua conformação de alta afinidade (2 µg/ml - PAC-1). Para cada amostra de
controle e pacientes com e sem HU foi realizado um ensaio basal e com estímulo de
trombina (50 mU/ml). No grupo de controles foi observada uma redução significativa da
adesão das plaquetas na presença do anticorpo PAC-1 incubado com trombina em relação à
sua basal. A adesão estimulada com trombina foi significativamente maior em relação à sua
adesão basal. Também foi observada uma diminuição da adesão com o anticorpo PAC-1
sem trombina em relação à sua basal, mas esse resultado não foi estatisticamente
significativo (GRÁFICO 3A).
No grupo de pacientes SS a adesão com o anticorpo PAC-1 foi significativamente
menor em relação à sua basal. A adesão na presença do PAC-1 e da trombina também foi
significativamente menor em relação à sua basal. A adesão estimulada com trombina
aumentou significativamente quando comparada com sua basal. O anticorpo CD62-P não
interferiu nos resultados de adesão quando comparada com a sua basal e basal estimulada
com trombina (GRÁFICO 3B).
No grupo de pacientes com HU o anticorpo PAC-1 incubado com trombina foi
capaz de diminuir significativamente a adesão em relação à sua basal estimulada com
trombina. A adesão com trombina foi aumentada significativamente em relação à sua basal.
O anticorpo CD62P não foi capaz de interferir na adesão em relação às suas basais com e
sem trombina (GRÁFICO 3C).
5.7- Níveis intraplaquetários de AMPc em plaquetas AA, SS e SSHU
Os níveis de AMPc das plaquetas SS foram significativamente diminuídos em
relação às plaquetas AA, e em relação ao grupo de pacientes SSHU. Plaquetas de pacientes
SSHU apresentaram níveis reduzidos de AMPc em relação ao grupo controle, mas essa
diferença não foi estatisticamente significativa (GRÁFICO 4A).
Resultados 71
-
Resultados 72
5.8- Efeito da trombina nos níveis intraplaquetários de AMPc em plaquetas
AA, SS e SSHU
Após o estímulo com trombina, observou-se uma redução significativa dos níveis
intracelulares de AMPc em plaquetas AA, e em plaquetas SSHU em relação aos seus níveis
basais (GRÁFICO 4B). No entanto, nas plaquetas SS a trombina não foi capaz de alterar os
já reduzidos níveis de AMPc. Este resultado pode sugerir que a ativação das plaquetas na
circulação de pacientes AF possa ser mediada, em parte, por uma redução dos níveis de
AMPc intraplaquetários.
-
Tabela 2: Expressão das moléculas de adesão na superfície das plaquetas dos controles (AA), pacientes (SS) e pacientes
em terapia com hidroxiuréia (SSHU).
AA (n≥18) SS (n≥17) SSHU (n≥13)
Anticorpo % Positivo MIF % Positivo MIF % Positivo MIF P
CD42b-FITC 97.2 ± 0.6 758.5 ± 85.6 98.1 ± 0.4 737.8 ± 47.3 95.5 ± 1.6 815.6 ± 81.7
CD62P-FITC 20.2 ± 2.3** 13.9 ± 1.4 * 29.4 ± 3.6** 20.7 ± 2.4 * 29.2 ± 4.6 24.2 ± 6.3 0.04** - 0.03*CD49b-FITC 70.5 ± 4.2 27.4 ± 2.0 70.1 ± 4.6 29.4 ± 2.9 68.5 ± 5.2 26.9 ± 2.0
CD41a-FITC 97.5 ± 0.5 412.9 ± 37.1 98.2 ± 0.4 406.7 ± 37.2 96.6 ± 1.1 447.0 ± 43.9
PAC-1-FITC 11.1 ± 3.7 # 8.6 ± 1.5 27.0 ± 6.3 # 14.4 ± 2.6 11.6 ± 2.6 8.6 ± 1.7 0.03#
TABELA II: CD42b (GPIb), CD62P (P-selectina), CD49b (subunidade α2 da integrina α2β1) e CD41a (subunidade αIIb
da integrina αIIbβ3), PAC-1 liga-se a integrina αIIbβ3 na sua conformação de alta afinidade. A expressão na superfície das
plaquetas foi determinada por citometria de fluxo. Os resultados da expressão das moléculas de adesão estão
representados na média ± desvio padrão (SEM) de porcentagem de plaquetas ligadas ao anticorpo (% positivo) e na
Intensidade Média de Fluorescência (MIF) de anticorpo ligado para cada plaqueta.
Resultados 73
-
Basal PAC-1 CD62P Basal PAC-1 CD62P0
10
20
30
40
*••
A
AA (n=9)
Trombina (50 mU/ml)
% a
desã
o pl
aque
tária
ao
FB (5
0μ
g/m
l)
Basal PAC-1 CD62P Basal PAC-1 CD62P0
10
20
30
40
Trombina (50 mU/ml)
*
•
B
••
SS (n=7)
% a
desã
o pl
aque
tária
ao
FB (5
0μ
g/m
l)
Basal PAC-1 CD62P Basal PAC-1 CD62P0
10
20
30
40
Trombina (50 mU/ml)
*••
C
SSHU (n=8)
% A
desã
o pl
aque
tária
ao
FB (5
0μ
g/m
l)
Gráfico 3: Ensaio de adesão de plaquetas AA, SS e SSHU ao FB na presença de
anticorpos funcionais para P-selectina e para integrina αIIbβ3. ativada. (A) adesão basal
ao FB (50 µg/ml) de plaquetas AA, CD62P (2 µg/ml), PAC-1 (2 µg/ml) com e sem
trombina (50 mU/ml), 15 min, 37°C; * p
-
AA SS SSHU0
5
10
15A
**
n=13 n=14 n=15
#A
MPc
(fm
ol/ 1
08 p
laqu
etas
)
0
5
10
15B
p 0.05 p
-
5.9- Correlação dos níveis de HbF em pacientes SS e SSHU com os níveis
intraplaquetários de AMPc
Houve uma correlação positiva, com valor significativo de p
-
estímulo de TB. Além disso, a trombina foi capaz de aumentar significativamente a adesão
em relação à basal sem estímulo (GRÁFICO 7A).
No grupo de pacientes SS, o cilostazol (1.6 µM) foi capaz de diminuir
significativamente a adesão em relação à basal e ao DMSO. Com o estímulo com trombina
(50 mU/ml), o cilostazol foi capaz de diminuir significativamente a adesão em relação à sua
basal e ao DMSO (GRÁFICO 7B).
No grupo de pacientes SSHU, o cilostazol (1.6 µM) foi capaz de diminuir
significativamente a adesão em relação à basal, mas não em relação ao DMSO. Além disso,
o DMSO diminuiu significativamente a adesão em relação à basal. Com o estímulo com
trombina (50 mU/ml), o cilostazol foi capaz de diminuir significativamente a adesão em
relação à sua basal e ao DMSO (GRÁFICO 7C).
2.5 5.0 7.5 10.0 12.50
10
20
30 n = 29r=0.461p < 0.02
AMPc (fmol/108 PLT)
% H
bF
Gráfico 5: Correlação dos níveis de HbF (g/dl) e níveis intraplaquetários de AMPc
(fmol/108 PLTs). Amostras de pacientes com AF (SS) e pacientes com AF em terapia com
HU (SSHU) p
-
AA SS SSHU0
25
50
75
100
n=15 n=20 n=24
AG
MPc
(fm
ol/ 1
08 p
laqu
etas
)
0
25
50
75
100trombina (50 mU/ml)
p0.05
AA (n≥6) SS (n≥11) SSHU (n≥9)
B
GM
Pc (f
mol
/108
plaq
ueta
s/m
l)
Gráfico 6: Níveis intraplaquetários de GMPc (fmol/108 plaquetas) de plaquetas AA,
SS e SSHU. A, níveis basais de GMPc em plaquetas AA, SS e SSHU, e em (B) níveis de
GMPc de plaquetas AA, SSe SSHU após estímulo com trombina (50 mU/ml por 15 min,
37°C).
Resultados 78
-
Basa
l
DMSO
Cilos
tBa
sal
DMSO
Cilos
t0
15
30
45
#***
A
Trombina (50 mU/ml)
⊗⊗
⊗⊗⊗
AA (n≥12)
⊗⊗⊗
⊗
% a
desã
o pl
aque
tzár
ia a
o FB
(50μ
g/m
l)
Basa
l
DMSO
Cilos
tBa
sal
DMSO
Cilos
t0
15
30
45
#
##
B
Trombina (50 mU/ml)
**
⊗⊗⊗
SS (n≥6)
⊗⊗⊗
% A
desã
o pl
aque
tária
ao
FB (5
0 m
U/m
l)
Basa
l
DMSO
Cilos
tBa
sal
DMSO
Cilos
t0
15
30
45
Trombina (50 mU/ml)
C*
⊗⊗⊗
#
SSHU (n≥6)
⊗⊗
⊗⊗
% A
desã
o pl
aque
tária
aoF
B (5
0μ
g/m
l)
Gráfico 7: Adesão de plaquetas AA, SS e SSHU ao FB, na presença ou ausência do
inibidor específico de PDE3A (cilostazol), DMSO e estimulada com TB. (A) ensaio de
adesão ao FB (50 µg/ml) basal, DMSO(0.001 % v/v) e cilostazol (1.6 µM); e com TB (50
mU/ml, 15 min, 37°C) com plaquetas AA; (B) plaquetas SS; (C) plaquetas SSHU;
*p
-
5.12- Efeito dos inibidores das proteínas quinases PKA, PKG e PKC na adesão
de plaquetas AA, SS e SSHU
Foram utilizados inibidores das proteínas quinases (PK) A, G e C nos ensaios de
adesão ao FB, com plaquetas de indivíduos controles (AA), pacientes com AF (SS) e
pacientes com AF em terapia com HU (SSHU). Foram utilizados 2 diferentes inibidores de
PKA, o KT5720 (1 µM) e o H-89 (1 µM) para investigar se a via de sinalização via PKA
está envolvida na adesão de plaquetas de pacientes com AF. Para cada amostra foi realizada
uma adesão com DMSO (0.001 % v/v), solvente dos inibidores, como controle. No grupo
de controles AA e de pacientes SS não houve diferença significativa na adesão das
plaquetas com os inibidores KT5720 e H-89, em relação à adesão com o DMSO
(GRÁFICO 8A).
Os inibidores de PKG (1 µM) e PKC (Ro-31-8220, 5 µM) foram solubilizados com
água estéril, e para cada amostra foi realizada uma adesão basal. No grupo controle AA, o
inibidor de PKG foi capaz de diminuir significativamente a adesão em relação à sua basal, e
o inibidor de PKC. Porém no grupo de pacientes SS, esses inibidores diminuíram a adesão
em relação à sua basal, PKG e PKC, mas essa diminuição não foi estatisticamente
significativa (GRÁFICO 8B).
Resultados 80
-
DMSO
KT57
20H-
89
DMSO
KT5
720
H-89
0
10
20
30A
AA (n=6) SS (n=8)
% a
desã
o pl
aque
tária
ao
FB (5
0μ
g/m
l)
Basa
lPK
G
RO-31
-8220
Basa
lPK
G
RO-31
-8220
0
5
10
15
20
25
30
35 B
* *
AA (n=10) SS (n=9)
*
% a
desã
o pl
aque
tária
ao
FB (5
0μ
g/m
l)
Gráfico 8: Ensaio de adesão de plaquetas AA, SS e SSHU ao FB na presença de
inibidores de PKA, PKG e PKC. Em (A) ensaio de adesão ao FB (50 µg/ml) com
inibidores de PKA: KT5720 (3 µM) e H-89 (1 µM), 15 min, 37°C, com plaquetas AA e
SS; BASAL=DMSO (B) ensaio de adesão ao FB (50 µg/ml) com inibidores de PKG (1
µM) e PKC (Ro-31-8220, 5 µM), 15 min, 37°C, com plaquetas AA e SS; * p
-
5.13- Agregação plaquetária e padronizações necessárias
Para a utilização do equipamento CHRONO-LOG Modelo 700 foi necessário
padronizá-lo previamente, porque havia sido comprado recentemente pelo Laboratório de
Hemostasia do Hemocentro II, UNICAMP, SP. Foram utilizados diversos doadores
voluntários (grupo de indivíduos saudáveis) para ajustar os parâmetros do aparelho,
utilizando agonistas plaquetários. A adenosina difosfato (ADP) é um importante agonista
plaquetário que atua em diversas vias de sinalização (AMPc), e foi utilizada nas seguintes
concentrações: 2.5 µM, 5 µM e 10 µM (GRÁFICO 9A), e a concentração de 5 µM foi a
escolhida para os experimentos. O colágeno, importante proteína da matriz extracelular,
intermedia o processo de agregação plaquetária na formação do trombo (coágulo), e foram
utilizadas as seguintes concentrações: 1 µg/ml, 2 µg/ml e 5 µg/ml, e as concentrações de 1
µg/ml e 2 µg/ml foram as escolhidas para os experimentos (GRÁFICO 9B). A trombina,
importante agonista plaquetário que atua na cascata da coagulação convertendo o
fibrinogênio plasmático em fibrina, foi utilizada nas seguintes concentrações: 50 mU/ml,
100 mU/ml, 250 mU/ml, 500 mU/ml e 1 U/ml (GRÁFICO 9C), e a concentração de
500 mU/ml foi a escolhida para os experimentos.
Resultados 82
-
2.5 uM 5 uM 10 uM 0
20
40
60
80
100
n=16 n=17 n=18
A
% A
mpl
itude
de
Agr
egaç
ão P
laqu
etár
ia c
om A
DP
1 μg/ml 2 μg/ml 5 μg/ml0
20
40
60
80
100
n=15 n=20 n=13
B
% A
mpl
itude
de
agre
gaçã
o pl
aque
tária
Col
50 m
U/ml
100 m
U/ml
250 m
U/ml
500 m
U/ml
1 U/m
l0
20
40
60
80
100
n=6 n=6 n=13 n=15 n=16
C
% A
mpl
itude
de
agre
gaçã
o pl
aque
tária
TB
Gráfico 9: Ensaio de agregação plaquetária com indivíduos saudáveis (AA). (A) após
o estímulo com ADP (2.5 µM; 5 µM e 10 µM; (B) após o estímulo com Col (1 µg/ml, 2
µg/ml e 5 µg/ml; (C) após o estímulo TB (50, 100, 250, 500 e 1 U/ml). Todas as amostras
de doadores foram incubadas por 5 min, 37°C.
Resultados 83
-
5.14- Comparação da agregação das plaquetas AA, SS e SSHU com os
agonistas plaquetário ADP, Col e TB
Foram coletadas amostras de sangue periférico com anticoagulante citrato de sódio
para preservar o cálcio, importante sinalizador intraplaquetário. O grupo de pacientes
SSHU apresentou uma diminuição da função plaquetária com ADP (5 µM) quando
comparado ao grupo controle (AA), mas esse resultado não foi estatisticamente
significativo. O grupo de pacientes SS também apresentou uma diminuição da agregação
plaquetária em relação ao grupo controle, mas esse resultado não foi estatisticamente
significativo (GRÁFICO 10).
A função plaquetária dos pacientes SSHU com TB (500 mU/ml) apresentou uma
redução significativa em relação ao grupo controle AA. O grupo de pacientes SS também
apresentou uma diminuição da sua função plaquetária com TB, em relação ao grupo
controle AA, mas esse resultado não foi estatisticamente significativo (GRÁFICO 11).
O grupo de pacientes SS apresentou um aumento significativo da sua agregação
plaquetária sob o estímulo do agonista plaquetário Col (1 µg/ml), em relação ao grupo
controle AA (GRÁFICO 12A). Esse mesmo grupo, também apresentou um aumento
significativo da sua função plaquetária ao Col (2 µg/ml), tanto em relação ao grupo
controle AA, quanto ao grupo de pacientes SSHU. A função plaquetária do grupo de
pacientes SSHU foi muito similar ao grupo controle (GRÁFICO 12B).
Resultados 84
-
AA SS SSHU0
20
40
60
80
100
5 μM
n=14 n=5 n=7
*
% A
mpl
itude
de
agre
gaçã
o pl
aque
tária
AD
P
Gráfico 10: Agregação plaquetária de plaquetas AA, SS e SSHU com ADP (5µM).
Porcentagem de amplitude da agregação plaquetária com o agonista plaquetário ADP (5
µM), * p
-
AA SS SSHU0
25
50
75
100
125
n=15 n=5 n=2
1 μg/ml
p=0.0037A
% A
mpl
itude
de
agre
gaçã
o pl
aque
tária
Col
AA SS SSHU0
25
50
75
100
125
n=20 n=3 n=6
2 μg/ml
p=0.0011p=0.0238B
% A
mpl
itude
de
agre
gaçã
o pl
aque
tária
Col
Gráfico 12: Agregação plaquetária de plaquetas AA, SS e SSHU com Col. Porcentagem
de amplitude de agregação plaquetária com o agonista plaquetário (A) Col (1 µg/ml), (B)
col (2 µg/ml); p
-
Discussão
-
6 – DISCUSSÃO
A principal função das plaquetas é impedir o sangramento, quando há lesão tecidual
com perda de sangue através da formação de um “tampão hemostático” ou coágulo que
ativa toda a cascata de coagulação. As plaquetas também contribuem para manter a
integridade do endotélio e atuam nos processos inflamatórios (VAN GIL’s et al., 2009). O
aumento da ativação plaquetária já foi descrito em pacientes com AF (TOMER, et al, 2001
e WUN, et al, 1999, 1998), e este aumento contribui para o desequilíbrio hemostático
destes pacientes (VILLAGRA, et al, 2007). O mecanismo e a via de sinalização
responsável por este aumento ainda não estão bem esclarecidos, mas alguns trabalhos
propuseram que esta ativação é resultado de processos pró-inflamatórios e pró-trombóticos,
característicos da micro-circulação da doença (SETTY, et al, 2001; BROWN, et al, 2001),
e também pelo estresse hematopoético da anemia e/ou hemólise intravascular (WUN et al,
1997). As plaquetas, quando ativadas, possuem alta capacidade inflamatória, pois podem