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Biodegradação de Biomateriais Estudo de Solubilidade dos Monómeros HDMA, MMA e IBMA Trabalho Realizado por:

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Page 1: Investigação Aplicada Susana  Priyanka e Micaela

Biodegradação de BiomateriaisEstudo de Solubilidade dos Monómeros HDMA, MMA e IBMA

Trabalho Realizado por:Priyanka Queshil nº 20070276

Micaela Hilário nº 20070144Susana Barros nº 20070018

Lisboa, 2011

Page 2: Investigação Aplicada Susana  Priyanka e Micaela

Índice

Pags.

1) Introdução 3

2) Preparação de Soluções 3

3) Procedimento Experimental 4

4) Resultados/Discussão de Resultados8

5) Conclusão 18

Page 3: Investigação Aplicada Susana  Priyanka e Micaela

Biodegradação de Biomateriais

Introdução

De acordo com o que foi planeado, o trabalho de investigação em curso tem

incidido no estudo do efeito de pH, da actividade enzimática da acetilcolinesterase e

da presença de microrganismos orais na estabilidade e/ou degradação de três

biomateriais. As reacções são estudadas recorrendo à espectrofotometria no Uv-Vis

(ou quando necessário recorrendo à HPLC) e os produtos e intermediários formados,

caracterizados recorrendo a várias técnicas espectroscópicas.

Este estudo pretende ser uma pequena contribuição para o conhecimento dos

mecanismos de degradação destes materiais em meios que tentam mimetizar o

ambiente oral e que de alguma forma contribuam para uma melhor compreensão do

que se passa in vivo.

A actual etapa do projecto de investigação incidiu sobre o estudo da

solubilidade de três monómeros usados usualmente em biomateriais dentários e do

seu comportamento quando expostos a meios de composição diferente e também

quando sujeitos a diferentes temperaturas. Os monómeros estudados são:

Metacrilato de Metilo (MMA) da MERCK

Dimetacrilato 1,6- Hexanodiol (1,6 HDMA) da ALDRICH

Metacrilato De Isobutilo (IBMA) da FLUKA

Preparação de Soluções Tampão pH=7,2

o Lote: 1.094.68.0100o [Na2HPO4.2H2O] = 0,63 g/Lo [KH2PO4]=0,31 g/Lo (Buffer tablets pH= 7,2)

Na preparaçção de solução, usa-se uma pastilha (Com a composição apresentada) por um litro de água destilada

Projecto de Investigação – 4ºAno Página 1

Page 4: Investigação Aplicada Susana  Priyanka e Micaela

Biodegradação de Biomateriais

Procedimento Experimental

Numa primeira parte deste trabalho experimental foi possível testar a solubilidade dos

monómeros em meio aquoso, traçando espectros de absorção no UV-Vis dos três

monómeros

Para a determinação do espectro de absorção dos monómeros MMA, IBMA e 1,6

HDMA, foi efectuado um ensaio para cada monómero utilizando células de quartzo

(uma célula de quartzo vazia na posição referência do porta amostras VS célula de

quartzo com monómeros puros).

Como cada monómero absorveu na gama dos UV e estando estes muito concentrados,

ou seja a 100%, não foi possível determinar o espectro de cada monómero, havendo

então necessidade de os diluir com água e ao diluir estas soluções em água verificou-se

que não são solúveis nesta, logo as soluções foram diluídas em solução tampão de pH

7,2.

Estas soluções foram também expostas a diferentes temperaturas e meio ambiente

(ao resguardo da luz) de forma a observar o seu comportamento e possível

degradação ou interacção com o tampão.

Sendo assim, foram efectuados pelo menos 5 espectros no UV-Vis de cada monómero

que consistiu em duas séries de soluções iguais mas conservadas em condições

diferentes, em que a:

SÉRIE A – As soluções foram mantidas a 4ºC e ao abrigo da luz durante as 48h a

seguir á sua preparação e designadas por:

Solução mãe

Solução mãe após 24h a 4ºC ao abrigo da luz

Solução mãe após 48h a 4ºC ao abrigo da luz

Projecto de Investigação – 4ºAno Página 2

Page 5: Investigação Aplicada Susana  Priyanka e Micaela

Biodegradação de Biomateriais

SÉRIE B – As soluções foram mantidas em condições normais de temperatura e luz e

designadas por:

Nova série de solução mãe

Nova série de solução mãe após 24h em condições normais de temperatura e

luz

Também foram traçados espectros de várias diluições de cada monómero, de acordo

com as características de solubilidade de cada um, e expostas às mesmas condições e

às soluções-mãe.

A) Dimetacrilato 1,6 Hexanodiol (1,6HDMA)

Procedeu-se então a outras tentativas, nomeadamente:

Projecto de Investigação – 4ºAno Página 3

1) 10µL HDMA em 100mL de tampão pH=7,2 não se dissolveu

2) 1µL HDMA em 100mL de tampão pH=7,2 não se dissolveu e tinha um

espectro de absorvâncias muito pequenas

Colocaram-se 100µL de HDMA em 25mL de água destiladaa emulsão não se

dissolveu por agitação, foi necessário colocá-la no ultrassom, sendo que a

solução continuou insolúvel (pois continha partículas em suspensão com uma

coloração branca), daí não se ter determinado o espectro deste monómero

pois a turbidez da solução afectou esta determinação.

Posteriormente foram efectuadas diversas tentativas de solubilização do HDMA sendo

que não foi possível dissolve-lo em água, ao qual foi então seleccionada uma solução

tampão com pH=7,2 (pH da boca) de forma a dissolver totalmente o monómero

HDMA, o que também não resultou, na medida em que também não se dissolveu.

Para que o HDMA se dissolvesse completamente recorremos à adição de um solvente

orgânico, tendo sido efectuada uma nova diluição em que foram adicionados num

balão de 25mL o seguinte: 1mL de etanol (solvente orgânico), 10µL de HDMA, perfez-

se o volume de 25 mL com solução tampão de pH=7,2, não se verificando novamente

a dissolução do HDMA.

Page 6: Investigação Aplicada Susana  Priyanka e Micaela

Biodegradação de Biomateriais

Após todas estas tentativas de dissolução do monómero HDMA, concluiu-se que não

era possível dissolvê-lo numa solução tampão e consequentemente tornou impossível

a determinação do seu espectro de absorção; o HDMA ficou assim excluído deste

estudo.

B) Metacrilato de Butilo (IBMA)

Solução mãe de IBMA

Projecto de Investigação – 4ºAno Página 4

3) 5µL HDMA em 100mL de tampão pH=7,2 não se dissolveu

4) 3µL HDMA em 100mL de tampão pH=7,2 não se dissolveu

5) 2µL HDMA em 100mL de tampão pH=7,2 como em 100mL o HDMA não

se dissolveu, experimentou-se aumentar a diluição:

6) 5µL HDMA em 250mL de tampão pH=7,2 não se dissolveu

7) 5µL HDMA em 500mL de tampão pH=7,2 não se dissolveu.

Page 7: Investigação Aplicada Susana  Priyanka e Micaela

Biodegradação de Biomateriais

Diluição 1:10 da solução mãe de IBMA

C) Metacrilato de Metilo (MMA)

Solução mãe de MMA

Diluição 1:10 da solução mãe de MMA

NOTA: os monómeros dissolveram no tampão (vidé Resultados/ Discussão de Resultados)

Resultados / Discussão de Resultados

1) Dimetacrilato 1,6 Hexanodiol (1,6HDMA)

Como todos os monómeros foi importante estudar em primeiro lugar a sua

solubilidade.

Projecto de Investigação – 4ºAno Página 5

Pipetou-se cuidadosamente 10µL de IBMA para um balão de 100mL, previamente cheio com tampão pH 7,2 e prefez-se o volume com tampão

Pipetou-se cuidadosamente 10µL da solução mãe de IBMA para um balão de 100mL, previamente cheio com tampão pH 7,2 e prefez-se o volume com tampão

Pipetou-se cuidadosamente 10µL de MMA para um balão de 100mL, previamente cheio com tampão pH 7,2 e prefez-se o volume com tampão

Pipetou-se cuidadosamente 10µL da solução mãe de MMA para um balão de 100mL, previamente cheio com tampão pH 7,2 e prefez-se o volume com tampão

Page 8: Investigação Aplicada Susana  Priyanka e Micaela

Biodegradação de Biomateriais

Procedeu-se a diversas tentativas, como se pode verificar no procedimento e após

todas as tentativas de dissolução do monómero HDMA, concluiu-se que não foi

possível dissolvê-lo, e consequentemente tornou impossível a determinação do seu

espectro de absorção, o HDMA ficou assim excluído deste estudo.

1) Metacrilato de Butilo (IBMA)

O Metacrilato De Isobutilo (IBMA) DA FLUKA foi estudado em relação a sua

solubilidade e o seu comportamento perante alterações de temperatura ao longo do

tempo. Assim sendo, foram realizados inúmeros ensaios na tentativa de dissolver este

monómero tanto em água como em solução tampão pH 7,2. Foi considerada a solução

mãe de IBMA com 10µL de IBMA em 100mL de tampão pH 7,2, e obteve-se um pico de

absorção muito elevado que nos levou a efectuar uma diluição de 1:10 da solução mãe

para que o pico máximo do espectro de absorção diminuísse. A partir destas soluções

foram então realizados ensaios de forma a determinar a estabilidade dos IBMA em

solução, sujeitando-o a variações de temperatura, de luz e de tempo (SÉRIE A e B).

Desta forma, foi possível eliminar possíveis erros de leitura ou de operador

procedendo-se á realização de novas soluções e suas consequentes leituras. Os

espectros de absorção das soluções de IBMA (SÉRIES a e B das soluções mãe e

diluições) estudadas estão esquematizados no gráfico nº 1 e nº 2.

Projecto de Investigação – 4ºAno Página 6

Page 9: Investigação Aplicada Susana  Priyanka e Micaela

Biodegradação de Biomateriais

Gráfico nº1 – sobreposição dos espectros obtidos das SÉRIES A e B das soluções mãe

de IBMA

De acordo com o gráfico anterior é possível observar-se um pico aos 260 nm da

solução mãe de IBMA, sendo que passadas 24h este pico diminui tornando-se mais

evidente um pico aos 200 nm. Isto poderá ser devido ao facto de existir uma outra

substancia a ser absorvida que não o IBMA. A diminuição do pico de Absorvância aos

260 nm pode estar relacionada com a possível degradação do IMBA. Sendo assim, foi

efectuado outro espectro passadas 48h nas mesmas condições. Com este novo

espectro foi observado um deslocamento do comprimento de onde, ou seja, uma

diminuição deste e um aumento significativo da Absorvância. Com estes dados

podemos então concluir que o IBMA pode não ser um monómero estável em tampão

de pH 7,2.

De forma a eliminar possíveis erros de leitura ou de operador procedeu-se à realização

de novas soluções e a suas consequentes leituras. Com esta nova série, observou-se

um pico aos 220 nm, enquanto na solução mãe efectuada posteriormente o pico foi de

260 nm, o que demonstra uma discrepância e provavelmente a instabilidade da

molécula de IBMA. Esta nova série foi então exposta a condições normais de

Projecto de Investigação – 4ºAno Página 7

Page 10: Investigação Aplicada Susana  Priyanka e Micaela

Biodegradação de Biomateriais

temperatura e luz e após 24h observou-se uma diminuição do pico, o que pode sugerir

a decomposição ou instabilidade do monómero IBMA.

Sendo assim, pode-se verificar através das sobreposições, que existem absorvâncias

muito próximas aos 260 nm, apesar de o pico máximo de absorvância na maioria das

soluções ter sido aos 220 nm, sendo que a discrepância entre os picos poder-se-á ser

dada a uma degradação gradual ao longo do tempo do monómero em estudo.

Foram também efectuadas diluições de 1:10 das soluções mãe estudadas

anteriormente sendo que os resultados estão esquematizados no Gráfico nº2.

Gráfico nº2 – sobreposição dos espectros obtidos das SÉRIES A e B das diluições de 1:10 das soluções mãe de IBMA

Quando realizados os espectros de absorção das diluições da solução-mãe, obtivemos

resultados muito idênticos aos resultados da solução-mãe. Como se pode ver no

Projecto de Investigação – 4ºAno Página 8

Page 11: Investigação Aplicada Susana  Priyanka e Micaela

Biodegradação de Biomateriais

gráfico nº 2 a diluição da solução mãe obteve um pico de Absorvância aos 220 nm, mas

passadas 24h acondicionadas a 4ºC e ao abrigo da luz, verificaram-se o aparecimento

de um novo pico aos 260 nm, o que sugere a absorção de uma substancia que não a

em estudo. Foi observado também a diminuição do pico de Absorvância do

monómero, podendo significar a degradação ou instabilidade do mesmo em solução

assim como também poderá ter sido influenciado pelas condições de

acondicionamento.

Após 48h de armazenamento da solução diluída de IBMA, o espectro de absorção

evidencia um pico aos 260nm, apesar de os valores de absorvância terem diminuído

significativamente, atingido valores negativos revelando assim a instabilidade da

molécula de IBMA, contudo para eliminar algum erro de leitura ou de operador,

procedeu-se paralelamente a novas séries de diluições de soluções mãe de IBMA em

condições de temperatura ambiente e luz para confirmar a instabilidade ou não do

monómero IBMA assim como também do seu comportamento.

Quando efectuado o espectro de absorção da solução diluída da Série B , sendo esta

solução preparada da mesma forma que as da série A, podemos verificar que o pico

aos 260 nm aumentou significativamente no valor de Absorvância, confirmando assim

a instabilidade do monómero de IBMA.

Para confirmação do pico máximo de absorvância das diluições da Solução-mãe de

IBMA procedeu-se à sobreposição de todos os espectros de absorção obtidos desde o

dia 15 ate dia 17/09/2010, incluindo as duas séries A e B.

Como se pode verificar através das sobreposições, concluímos que há absorvâncias

muito próximas aos 260nm (comprimento de onda comum a todos), apesar de o pico

máximo de absorvância em algumas das diluições ter sido aos 220nm, sendo que a

discrepância entre os picos poder-se-á dever a uma degradação ou instabilidade do

monómero IBMA.

C) Metacrilato de Metilo (MMA)

Projecto de Investigação – 4ºAno Página 9

Page 12: Investigação Aplicada Susana  Priyanka e Micaela

Biodegradação de Biomateriais

Diluíram-se 10µL de MMA em 25mL e 10 µL em 25mL de água destilada, mas como a

emulsão não se dissolveu por agitação, foi necessário colocá-la no ultrassom, sendo

que a solução continuou insolúvel (pois continha partículas em suspensão com uma

coloração branca), daí não se ter determinado o espectro deste monómero pois a

turbidez da solução afectou esta determinação.

Posteriormente foram efectuadas diversas tentativas de solubilização do MMA sendo

que não foi possível dissolve-lo em água:

Usou-se a solução tampão com pH=7,2 (pH da boca) de forma a dissolver totalmente o

monómero MMA, tendo sido efectuada uma solução mãe com 10µL de IBMA em

100mL de tampão verificando a dissolução do MMA, mas com absorvância elevada o

que nos levou a efectuar uma diluição de 1:10 da solução mãe para que a absorvância

diminuísse. Foram também realizados ensaios de forma a determinar a estabilidade da

solução expostas a variações de temperatura, e de tempo. De forma a eliminar

possíveis erros de leitura ou de operador procedeu-se à realização de novas soluções e

suas consequentes leituras (Nova Série). Sendo que os resultados foram os seguintes:

Projecto de Investigação – 4ºAno Página 10

Page 13: Investigação Aplicada Susana  Priyanka e Micaela

Biodegradação de Biomateriais

Grafico nº 3 – sobreposição dos espectros obtidos das SÉRIES A e B das soluções mãe

de MMA

Numa primeira instância realizou-se um espectro para verificar qual seria a

concentração ideal da solução mãe para se obter um pico de Absorvância, isto é , se

havia necessidade de diluir ou concentrar a solução. Este ensaio foi efectuado com

solução mãe MMA contra o tampão (branco) observando-se um primeiro pico aos

260nm e um segundo pico aos 220nm. Por se ter obtido um valor de Absorvância

elevado, houve necessidade de efectuar diluições da solução mãe, uma vez que o

tampão absorve muito.

Uma nova leitura foi efectuada após 24h a 4ºC e ao abrigo da luz para verificar a

estabilidade do monómero MMA, em que houve um deslocamento do comprimento

de onda, ou seja , uma diminuição deste. Assim como também um aumento do pico de

absorvância. Isto leva-nos a crer que possivelmente teremos de trabalhar as amostras

preparadas na hora e no dia, não podendo assumir os valores dos dias seguintes, visto

haver alterações da Solução-mãe. Estas alterações podem ser devido a vários factores

tais como:

• Aumento da solubilidade do monómero

• Temperatura

• Degradação do monómero no tampão

Para podermos eliminar estes possíveis interferentes fizemos um estudo acerca de

comportamento das amostras em solução. Este estudo consistiu em fazer as soluções

mães e suas respectivas diluições e colocá-las á temperatura ambiente e s em ser ao

abrigo da luz. De qualquer maneira continuámos paralelamente o estudo inicial e após

48h a 4ºC, traçamos um novo espectro da Solução-mãe de MMA. Neste ultimo

espectro verificamos, comparativamente ao anterior, ambos tem um pico em comum

aos 220 nm. Sendo assim podemos descartar o primeiro espectro realizado, que

apresentou dois picos. Com esta análise concluímos também que o nosso monómero

de MMA tem um comportamento estável relativamente ao anterior, não havendo

sinais de degradação por parte da temperatura e provavelmente da Luz.

Para confirmar os resultados anteriores, foi realizada uma nova série, a Série B, em

que foi exposto as mesmas condições que a série anterior.

Projecto de Investigação – 4ºAno Página 11

Page 14: Investigação Aplicada Susana  Priyanka e Micaela

Biodegradação de Biomateriais

Este espectro corresponde a uma nova solução mãe de MMA com o mesmo

tratamento da solução do dia 15/09/2010 de forma a comparar os espectros de

absorção.

E após a análise dos dois espectros podemos concluir que o primeiro foi mal efectuado

devido a possíveis interferentes de operador ou outros, assim como também devido a

uma possível leitura anómala, do espectrofotómetro, da primeira solução.

Esta solução foi acondicionada em condições normais, ou seja, á temperatura

ambiente e à exposição da luz para ser lida novamente após 24h e ser comparada

novamente. Sendo que observou-se que todos os espectros realizados , tanto 24h ou

48h apos acondicionamento, permanece idêntico á excepção de um aumento pouco

significativo de absorvancia. feitas também o estudo da diluição destas mesmas

soluções, uma vez que a sensibilidade do espectrofotómetro é limitada e não se

poderia aplicar a lei de Lambert Beer.

Sendo assim, concluímos que há absorvâncias muito próximas aos 220nm

(comprimento de onda comum a todos, excepto ao primeiro pelas razões acima

descritas).

Grafico nº 4– Sobreposição dos espectros obtidos das Diluições de 1:10 das soluções

mãe MMA

Projecto de Investigação – 4ºAno Página 12

Page 15: Investigação Aplicada Susana  Priyanka e Micaela

Biodegradação de Biomateriais

Para confirmação do pico máximo de absorvância das diluições das Solução-mãe de

MMA procedeu-se à sobreposição de todos os espectros de absorção obtidos,

incluindo a série A e B (temperatura ambiente e à exposição de luz)

De acordo com gráfico 4, podemos constatar que se obteve vários picos na mesma

zona de comprimentos de onda, mas com absorvâncias muito diferentes.

Quando realizado o espectro da solução mãe de MMA, observou-se um pico aos 260

nm, e após 24h quando realizada um novo espectro, verificou-se uma diminuição do

pico de Absorvância assim como também um deslocamento do comprimento de onda,

ou seja, uma diminuição deste. Após 48h e acondicionadas a4ºC e ao abrigo da luz

obtive-se um espectro semelhante ao primeiro espectro efectuado, onde se verificou

um pico aos 260 nm, o que nos leva a crer que houve algum interferente na leitura

anterior a esta. Sendo que o pico se mantém aos 260 nm.

Foram também realizadas novas soluções, a Série B, só que expostas a condições de

temperatura ambiente e exposição à luz. Sendo que após realização de novas soluções

e subsequentes diluições, compararam-se os espectros de forma a excluir

interferentes ou erros de leitura, e concluiu-se que existe um pico comum em todos os

espectros que é aos 260nm e para confirmar que o MMA é realmente estável deu-se

continuidade ao estudo, prosseguindo para a leitura das 24h e como esperado, o pico

de Absorvância manteve-se nos 260 nm.

Como se pode verificar através das sobreposições, concluímos que apesar de haver

absorvâncias diferentes, o pico de absorvância máximo é comum a todos os espectros,

ou seja aos 260nm.

Após o estudo das soluções Mãe e das suas respectivas diluições foi efectuado o

estudo da estabilidade do monómero MMA em solução em função do tempo. Para

isso foram realizadas novas Solução-mãe e novas diluições e foram colocadas ao

espectofotómetro para que seja possível traçar vários espectros de absorção durante

2h.

Projecto de Investigação – 4ºAno Página 13

Page 16: Investigação Aplicada Susana  Priyanka e Micaela

Biodegradação de Biomateriais

Gráfico 5 – Varrimento 100 min da solução mãe de MMA

Através dos dados do gráfico 5 concluímos que o monómero MMA é estável em

solução em pelo menos 2h, o que nos permite usar esse tempo para fazer os estudos

enzimáticos com o auxilio da enzima Acetilcolinesterase (estudos futuros)

Após 24h do varrimento foi realizada um novo espectro de absorção da mesma

solução para a observação de resultados concordantes :

Projecto de Investigação – 4ºAno Página 14

Page 17: Investigação Aplicada Susana  Priyanka e Micaela

Biodegradação de Biomateriais

Gráfico 7 – Espectro de absorção da solução mãe de MMA 24h após Varrimento 100

minutos

Conclusão

Após os ensaios efectuados aos três monómeros, concluímos que de todos o MMA é o

mais estável, através dos resultados acima descritos, e, quando em solução este deve

ser acondicionado á temperatura ambiente e á exposição da luz, pois não há

alterações significativas do comportamento do monómero nestas condições, mas

como a lei de lambert beer só é válida a Absorvâncias iguais ou inferiores a um, terá de

ser trabalhado em diluições de 1:10 da solução mãe de MMA. Este monómero foi o

escolhido para ser trabalhado na segunda etapa deste projecto, ou seja, com a adição

da enzima acetilcolinestrase, uma vez que com este primeiro estudo foi possível

verficar que o monómero de MMA é estável para trabalhar durante duas horas e até

mesmo durante 24h, com alterações pouco significativas do comportamento

monómero de um dia para o outro.

Projecto de Investigação – 4ºAno Página 15

Page 18: Investigação Aplicada Susana  Priyanka e Micaela

Biodegradação de Biomateriais

Projecto de Investigação – 4ºAno Página 16