1

1. INTRODUÇÃO

1.1. Staphylococcus aureus As bactérias classificadas como Staphylococcus aureus subespécie

aureus (freqüentemente referidas como Staphylococcus aureus) estão

alocadas na família Staphylococcaceae. Estes microrganismos são

encontrados na microbiota anfibiôntica presente na pele e nas membranas

mucosas de humanos, assim como de outros mamíferos e pássaros. No

homem, elevadas concentrações desses cocos Gram-positivos podem estar

presentes nas axilas, na parte anterior das narinas e no períneo e, menores

quantidades, na orofaringe, boca, vagina, trato intestinal e glândulas mamárias

(CHILLER, SELKIN & MURAKAWA, 2001; MURRAY et al., 2003).

A patogênese de infecções causadas pelos S. aureus pode ser dividida

em cinco estágios principais: (1) colonização, (2) infecção localizada,

(3) disseminação sistêmica e/ou sepse, (4) infecção disseminada, (5) toxemias

(ARCHER, 1998). A taxa de colonização por S. aureus em indivíduos sadios

pode chegar a aproximadamente 30% (SOARES et al., 1997). Acredita-se que

a colonização preceda à infecção. Assim, por exemplo, um abscesso localizado

na pele poderia surgir após o microrganismo ter sido introduzido, no local da

infecção, a partir de um sítio inicial de colonização. As infecções localizadas na

pele e nos tecidos moles podem se apresentar sob a forma de celulite,

ulcerações infectadas e impetigo bolhoso, e nos folículos pilosos como

foliculite, furunculose ou carbunculose, sendo esta última caracterizada pela

presença de vários furúnculos pequenos e coalescentes, localizados,

principalmente, na região da cabeça e pescoço. A partir da infecção na pele,

principalmente as mais profundas, o microrganismo pode ganhar a corrente

sangüínea e se disseminar para órgãos distantes, podendo levar, como

conseqüência, ao choque séptico, endocardite, osteomielite, infecção urinária,

artrite séptica, meningite, pneumonia e/ou carbúnculo renal. Este último quadro

é caracterizado por lesões sob a forma de abscesso no córtex renal, acomete

pacientes sem sintomas urológicos, e está sempre associado a bacteremia e a

presença de S. aureus na urina (JEMNI et al., 1992; PROJAN & NOVICK,

1997). Os S. aureus podem ainda causar doenças relacionadas à produção de

toxinas como, a síndrome da pele escaldada, a síndrome do choque tóxico e a

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intoxicação estafilocócica; sendo essas doenças resultantes da produção de

uma variedade de exotoxinas específicas, pelo microrganismo, as quais

funcionam como superantígenos (SAg; ARCHER, 1998; TENOVER &

GAYNES, 2000).

1.2. Staphylococcus aureus Resistentes à Meticilina (MRSA) No começo da década de 1960 a meticilina foi lançada no comércio

como o primeiro derivado semi-sintético da penicilina, contendo uma

modificação química que tornou a molécula capaz de resistir à ação da

penicilinase estafilocócica. Porém, logo após a introdução desse antibiótico na

clínica médica surgiram os S. aureus resistentes à meticilina (MRSA, do inglês:

Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus; BARBER, 1961).

O marco inicial (tempo zero) na escala evolutiva dos MRSA foi a

aquisição do gene mecA (codificador da PBP2a), o qual confere resistência à

meticilina ou às outras penicilinas semi-sintéticas, como a oxacilina. O gene

mecA é um segmento de DNA de 2,1 kb, o qual não é nativo da espécie

S. aureus, e que se encontra inserido em um grande bloco de DNA exógeno,

conhecido como elemento mec ou cassete cromossômico estafilocócico mec

(SCCmec; do inglês: staphylococcal cassette chromosome mec; KATAYAMA,

ITO & HIRAMATSU, 2000). O SCCmec é um elemento genético móvel,

integrado ao cromossomo dos MRSA, flanqueado por seqüências diretas e

repetidas. Este segmento de DNA, variando em torno de 21-67 kb, carreia

genes reguladores para a expressão do gene mecA (mecI: codificador de uma

proteína repressora do mecA e mecRI: codificador de uma proteína

transmembranosa sensora de β-lactâmicos e transdutora de sinal). Além disso,

o SCCmec também carreia o chamado complexo gênico ccr, o qual codifica

recombinases responsáveis pela mobilidade (inserção/excisão) do SCCmec no

cromossomo bacteriano (KATAYAMA, ITO & HIRAMATSU, 2000; HIRAMATSU

et al., 2002; ITO, et al., 2004). O SCCmec encontra-se integrado em um sítio

específico (attBscc), localizado na orfX (ORF, do inglês: open reading frame)

no terminal 3`, próximo à origem de replicação dos S. aureus. Ito e

colaboradores (ITO et al., 2001) identificaram, inicialmente, três diferentes

elementos SCCmec. Esses elementos são diferentes entre si e cada SCCmec

carreia uma combinação característica dos complexos gênicos ccr e mec e,

3

ainda, podem possuir ou não outros determinantes de resistência. O SCCmec

tipo I é encontrado nas cepas de MRSA que predominavam na década de

1960, anos relativamente recentes da quimioterapia antimicrobiana. Esta ilha

não contém gene de resistência a antibióticos, exceto o mecA. Ao contrário,

tanto o SCCmec tipo II, como o tipo III, detectados em amostras que se

tornaram dominantes a partir da década de 1980, carreiam múltiplos genes de

resistência. Alguns desses genes encontram-se no transposon (Tn) Tn554, que

codifica resistência à eritromicina e espectinomicina e no ΨTn554, que codifica

resistência ao cádmio. Foi sugerido que uma cópia do elemento de inserção

(IS; do inglês: insertion element) IS431, proximamente localizada ao gene

mecA, funcionaria como hot spot (região de alta freqüência de recombinação),

facilitando assim a aquisição de outros genes de resistência a antimicrobianos.

Os três tipos de SCCmec, citados acima, têm sido identificados em amostras

de MRSA associadas às infecções hospitalares.

Posteriormente, foi descrito o elemento SCCmec tipo IV, tanto em

amostras de MRSA hospitalares quanto nas adquiridas na comunidade (CA-

MRSA). Este elemento não carreia nenhum gene de resistência a

antimicrobianos, com exceção do gene mecA, e apresenta uma nova

combinação dos complexos ccr e mec (ITO et al., 2001). Em 2004, Ito e

colaboradores, descobriram um novo elemento mec em amostras de CA-

MRSA, o SCCmec tipo V. Este elemento possui 28 kb de tamanho e não

carreia nenhum outro gene de resistência, além do mecA (ITO et al., 2004).

Portanto, o complexo mec foi dividido em cinco principais classes A-E, como

descrito na tabela 1 (DEURENBERG et al., 2007).

Tabela 1. Principais classes de complexos mec.

Classe Estrutura SCCmec Espécies

A mecI–mecRI–mecA–IS431 II, III Staphylococcus aureus

B ΨIS1272–∆mecRI–mecA–IS431a I, IV Staphylococcus aureus

C IS431–∆mecRI–mecA–IS431 V Staphylococcus aureus

D ∆mecRI–mecA–IS431 b – Staphylococcus caprae

E ∆mecRI–mecA–IS431 c – Staphylococcus aureus

aΔ representa uma deleção no regulador mecRI; bclasse D: mecRI apresenta uma deleção de 847pb; cclasse E: mecRI apresenta uma deleção de 976pb. Adaptado de DEURENBERG et al., 2007.

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A classe A contém o complexo mec completo (mecI-mecRI-mecA) e as

classes B e C contêm os genes reguladores do mecA não-funcionais, devido à

presença das seqüências de inserção ΨIS1272 e/ou IS431 (KATAYAMA, ITO &

HIRAMATSU, 2001; HIRAMATSU et al., 2004). Por sua vez, as classes D e E,

apesar de apresentarem estruturas do complexo mec semelhantes, divergem

entre si quanto ao número de pares de bases (pb) deletadas na região do DNA

englobando os genes mecI e mecRI. A classe D apresenta uma deleção de

847 pb, enquanto a classe E de 976 pb (HIRAMATSU et al., 1992; KATAYAMA,

ITO & HIRAMATSU, 2001). Além disso, outros elementos genéticos também

podem estar presentes nos diferentes SCCmec, dentre eles os plasmídios

pUB110 e pT181, e o transposon Tn554. Desta forma, devido às características

acima citadas, o SCCmec pode ser definido como uma ilha de resistência a

antimicrobianos (HIRAMATSU et al., 2002). Variantes dos tipos principais de

SCCmec também têm sido descritas, com base nas diferenças de seqüências

nucleotídicas observadas em regiões conhecidas como regiões J (do inglês:

junkyard regions; ITO, KUWAHARA & HIRAMATSU, 2007). Oliveira e

colaboradores, mais recentemente, propuseram um novo tipo de elemento

SCCmec, o tipo VI, em substituição ao tipo IV alótipo 4 (um subtipo ccrAB),

uma vez que esse elemento encontra-se em diversas amostras pertencentes a

uma mesma linhagem estafilocócica (OLIVEIRA, MILHEIRIÇO & DE

LENCASTRE, 2006).

Desde a emergência do MRSA tem sido observado um aumento

crescente de infecções por esses microrganismos. Acredita-se que dois fatores

possam estar envolvidos neste cenário: a expansão clonal de linhagens de

MRSA já existentes e a conversão de algumas linhagens de S. aureus

susceptíveis à meticilina (MSSA) em MRSA, através da transferência horizontal

do elemento mec (NOTO et al., 2008). No final da década de 1980, surtos

hospitalares causados pelos MRSA aumentaram consideravelmente. Cepas

resistentes a diversos outros antimicrobianos, exceto à vancomicina, estavam

freqüentemente envolvidas nesses surtos. Atualmente a sigla MRSA implica

em resistência cruzada a todos os antibióticos β-lactâmicos (AL-MASSAUDI,

DAY & RUSSEL, 1991; TOMASZ, 1994; TEIXEIRA et al., 1995).

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A emergência e a ampla disseminação dos MRSA é resultante, em

parte, da forte pressão seletiva exercida pela imensa quantidade de agentes

antimicrobianos lançados no ambiente hospitalar. Além disso, a convergência

de diversos processos evolucionários raros, relacionados com a sobrevivência

e adaptação da bactéria neste cenário, certamente contribuiu para

disseminação global de clones epidêmicos de MRSA que estamos assistindo

na atualidade. Os determinantes genéticos que definem a superior

epidemicidade desses clones ainda não são conhecidos, mas parecem estar

associados a genes que são responsáveis pela colonização efetiva do

hospedeiro (AMARAL et al., 2005; DE LENCASTRE, OLIVEIRA & TOMASZ,

2007).

Outra característica evolucionária importante, também observada nas

populações de MRSA, é a distribuição de sua população em uma estrutura

altamente clonal (FENG et al., 2008). Com base nessa informação, para melhor

se estudar a epidemiologia local ou global dos MRSA, diversos métodos de

tipagem molecular vêm sendo utilizados. Uma das metodologias preconizadas,

e considerada mais discriminativa, portanto indicada em análises locais, é a

técnica de eletroforese sob campos elétricos alternados, conhecida pela sigla

PFGE (PFGE, do inglês: pulsed-field gel electrophoresis). Contudo, esta

técnica apresenta como sua principal desvantagem a dificuldade de

correlacionar, de forma precisa, os diferentes perfis de fragmentação genômica

obtidos a partir de clones de EMRSA (MRSA, do inglês: Epidemic Methicillin-

Resistant Staphylococcus aureus) em diferentes laboratórios. Entretanto, tal

correlação é possível quando se acrescentam aos géis de PFGE padrões com

tamanho de fragmentos conhecidos ou representantes de clones internacionais

circulantes na atualidade. Outros métodos moleculares, baseados em técnicas

de seqüenciamento de DNA, foram também desenvolvidos. Tais métodos

apresentam como principal vantagem a possibilidade de se gerar perfis

genéticos padronizados, permitindo a comparação acurada entre as diferentes

linhagens bacterianas. Uma dessas metodologias foi a tipagem através de

seqüenciamentos de multilócus enzimáticos (MLST, do inglês: multi locus

sequence typing; ENRIGHT et al., 2000). O MLST é atualmente um método de

tipagem molecular muito utilizado e fundamenta-se no seqüenciamento de sete

genes metabólicos constitutivamente expressos pela bactéria (para os

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S. aureus: arcC, aroE, glpF, gmk, pta, tpi e yqiL). Para cada um desses genes,

seqüências diferentes (com pequenas variações de nucleotídeos) são referidas

como alelos. O conjunto formado pelos diferentes alelos, de cada um dos sete

loci, fornece o perfil alélico, que define, por sua vez, a seqüência-tipo (ST) da

amostra analisada (ENRIGHT et al., 2000). A partir dessa nova abordagem,

clones epidêmicos de MRSA, anteriormente nomeados de acordo com a região

onde foram primeiramente detectados (como exemplo, o clone epidêmico

brasileiro) ou de acordo com o grupo de pacientes dos quais foram isolados

(como exemplo, o clone pediátrico), passam agora a ser designados por sua

ST e também pelo seu tipo de SCCmec (tabela 2).

Amostras clínicas de MRSA de uma mesma linhagem, ou de linhagens

geneticamente relacionadas, encontram-se hoje disseminadas por todo o

mundo, sendo capazes de causar infecções nosocomiais pandêmicas,

atingindo grandes extensões geográficas intercontinentais (TEIXEIRA et al.,

1995; VAN BELKUM et al., 1997a,b; DE SOUZA et al., 1998; SÁ-LEÃO et al.,

1999; COIMBRA et al., 2000; SOARES et al., 2001; COIMBRA et al., 2003).

Dessa forma, os MRSA tornaram-se os mais importantes patógenos

hospitalares, em termos de incidência e de gravidade das infecções, sendo

reconhecidos como um sério problema global de Saúde Pública (COIMBRA et

al., 2003). Um fato que chama atenção, com relação aos MRSA epidêmicos, é

a velocidade com que a diseminação desses clones ocorre (GRUNDMANN et

al., 2006). Nosso grupo foi o primeiro a demonstrar a ampla disseminação de

um clone de MRSA através de áreas geográficas de dimensões continentais

(TEIXEIRA et al., 1995). Detectamos amostras do clone epidêmico brasileiro

(ST239-SCCmecIIIA) em hospitais localizados de Manaus a Porto Alegre.

Estudos mais recentes, publicados também pelo nosso grupo (COIMBRA et al.,

2003), demonstraram que a linhagem ST5-SCCmecII (CNI/J; clone Nova

Iorque/Japão), descrita inicialmente na cidade de Nova Iorque (EUA) e em

Tóquio (Japão; AIRES DE SOUSA et al., 2000), estava, na realidade,

disseminada em hospitais de diversos estados do leste dos EUA (COIMBRA et

al., 2003). Desse modo, a cada ano, um grande número de novos estudos é

publicado na literatura científica, apontando linhagens específicas de MRSA

como sendo responsáveis por grandes surtos em hospitais distribuídos

mundialmente (DEURENBERG et al., 2007; KENNEDY et al., 2008). A

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disseminação geográfica das principais linhagens de MRSA envolvidas nessas

verdadeiras “pandemias hospitalares” está descrita na tabela 2.

Tabela 2. Distribuição geográfica das principais linhagens de MRSA envolvidas em surtos hospitalares.

Clonea Linhagem (ST-SCCmec)b Disseminação geográficac

Arcaico 250-I Alm, Ast, Din, EUA, RU, Sui, Uga

Berlin 45-IV Alm, Arm, Ast, Bel, Esp, EUA, Fin, Hol, Hun, Nor, Sue, Sui

CEB/Húngaro 239-III Aga, Alm, Arg, Ast, Aus, Bra, Chi, Chn, Cin, Cor, Esl, Esp, EUA, Fin, Gre, Hol, Ids, Ind, Ita, Mon, Pol, Por, RG, RT, RU, Sri, Sue, Tal, Tun, Uru, Vie

CI 247-I Alm, Bel, Cro, Din, Esl, Esp, EUA, Fin, Fra, Hol, Ita, Pol, Por, RT, RU, Sue, Sui

CNI/J 5-II Alm, Ast, Bel, Can, Cin, Cor, Din, EUA, Fin, Fra, Irl, Jap, Mex, RU, Sue, Uru

CP 5-IV ou VI Aga, Arg, Ast, Bra, Col, Cor, Din, Esp, EUA, Fra, Nor, Pol, Por, RU, Sue, Uru

Irlandês 1 8-II Ast, EUA, Irl, RU

Sudeste alemão 228-I Alm, Bel, Din, Esl, Esp, Ita, Sui

EMRSA 2, 6 8-IV Alm, Ast, Bel, EUA, Fin, Fra, Hol, Irl, Nor, RU,Tai

EMRSA 3 5-I Arg, Esl, Nor, Pol, RU

EMRSA 15 22-IV Alm, Ast, Bel, Cin, Din, Esp, Irl, Kuw, Nor, NZL, Por, RT, RU, Sue

EMRSA 16 36-II Ast, Bel, Can, Din, Esp, EUA, Fin, Gre, Irl, Mex, Nor, RU, Sue, Sui

aCEB, clone epidêmico brasileiro; CI, clone ibérico; CNI/J, clone Nova Iorque/Japão; CP, clone pediátrico; EMRSA, MRSA epidêmico. bST-SCCmec, classificação da linhagem baseada na seqüência-tipo, obtida a partir da tipagem por MLST, e do tipo de SCCmec encontrado. cAga, Argélia; Alm, Alemanha; Arg, Argentina; Arm, Armênia; Ast, Austrália; Aus, Áustria; Bel, Bélgica; Bra, Brasil; Can, Canadá; Chi, Chile; Chn, China; Cin, Cingapura; Col, Colômbia; Cor, Coréia; Cro, Croácia; Din, Dinamarca; Esl, Eslovênia; Esp, Espanha; EUA, Estados Unidos da América; Fin, Finlândia; Fra, França; Gre, Grécia; Hol, Holanda; Hun, Hungria; Ids, Indonésia; Ind, Índia; Irl, Irlanda; Ita, Itália; Jap, Japão; Kuw, Kuwait; Mex, México; Mon, Mongólia; Nor, Noruega; NZl, Nova Zelândia; Pol, Polônia; Por, Portugal; RG, República da Georgia; RT, República Tcheca; RU, Reino Unido; Sri, Sri Lanka; Sue, Suécia; Sui, Suíça; Tai, Taiwan; Tal, Tailândia; Tun, Tunísia; Uga, Uganda; Uru, Uruguai; Vie, Vietnam. Adaptado de CAMPANILE et al., 2001; JEMILI-BEN, BOUTIBA-BEN & BEN, 2006; DEURENBERG et al., 2007; BARTELS et al., 2008.

Devido ao fato da maioria desses clones apresentar resistência a uma

gama de agentes antimicrobianos, a vancomicina tem sido amplamente

utilizada, em todo o mundo, como a droga de escolha no tratamento empírico

das infecções nosocomiais causadas pelos MRSA (TEIXEIRA et al., 1995;

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COIMBRA et al, 2003; ELIOPOULOS, 2005). Entretanto, a utilização desse

quimioterápico (ministrado exclusivamente por via endovenosa) aumenta o

tempo de internação do paciente e também os riscos com os efeitos colaterais,

promovidos por sua toxicidade. Tais fatores, aliados ao valor comercial

relativamente elevado do tratamento do paciente infectado por MRSA, acabam

contribuindo para um aumento da morbidade e da mortalidade dos pacientes, o

qual é geralmente mais acentuado nos países menos favorecidos, e ainda para

um aumento significativo dos custos hospitalares.

Do mesmo modo, como observado para os diversos antimicrobianos

utilizados no tratamento de infecções associadas aos MRSA e, como

conseqüência da pressão seletiva exercida pelo intenso uso de vancomicina,

foi relatado em 1997, em um hospital japonês, o primeiro caso de falha

terapêutica da vancomicina (CDC, 1997; HIRAMATSU et al., 1997). Foi

observado que a amostra de S. aureus, isolada da ferida cirúrgica de um

recém-nascido, submetido a uma cirurgia cardíaca, apresentava resistência

intermediária à vancomicina (VISA, do inglês: vancomycin-intermediate

S. aureus; concentração mínima inibitória, CMI, entre 8-16 μg/mL). Nenhuma

das amostras VISA identificadas naquele, e em outros estudos, carreavam o

gene vanA ou qualquer outro determinante genético de resistência à

vancomicina (HIRAMATSU et al., 1997; SMITH et al., 1999; OLIVEIRA et al.,

2001; DENIS et al., 2002; KRZYSZTON-RUSSJAN et al., 2002). Por outro lado,

o espessamento e a compactação da matriz da parede celular, observados nas

amostras VISA, têm sido implicados como um possível mecanismo responsável

por esse fenótipo de resistência (SIERADZKI et al., 1997; HANAKI et al., 1998;

HIRAMATSU, 2001; WALSH & HOW, 2002; CUI et al., 2003). Posteriormente,

um novo caso envolvendo uma cepa resistente à vancomicina foi relatado em

junho de 2002, em Michigan, EUA (CHANG et al., 2003). Entretanto, nesse

relato a cepa de S. aureus isolada apresentava resistência plena à vancomicina

(VRSA, do inglês: vancomycin-resistant S. aureus, CMI, ≥32 μg/mL; NCCLS,

2003). Os testes genotípicos realizados com esta cepa indicaram a presença

de vanA, sugerindo que sua aquisição pelo VRSA tenha, provavelmente,

ocorrido através da transferência de material genético a partir de uma cepa de

Enterococcus faecalis resistente à vancomicina (VRE; do inglês: vancomycin-

9

resistant Enterococcus) carreadora de vanA, também isolada do mesmo sítio

infectado pelo MRSA (CHANG et al., 2003). Apenas dois meses após esse

último relato, mais um caso de VRSA foi detectado nos EUA, desta vez na

Pensilvânia (TENOVER et al., 2004; WHITENER et al., 2004). Felizmente, a

publicação de relatos sobre a emergência de VRSA em outros países tem sido

rara (TIWARI & SEN, 2006; WEIGEL et al., 2007; SAHA, et al., 2008), e até o

momento, não houve registro de isolamento de amostras de VRSA no Brasil.

Entretanto, um estudo realizado no ano de 2000, em nosso país, pelo nosso

grupo, demonstrou a presença de amostras VISA em um hospital localizado no

Piauí. Neste episódio, um dos pacientes envolvidos foi a óbito, provavelmente,

devido à falha no tratamento com a vancomicina (DOS SANTOS SOARES et

al., 2000). Posteriormente, outros pesquisadores também detectaram amostras

VISA em nosso meio (OLIVEIRA et al., 2001). Em conjunto, tais estudos

indicam a emergência de amostras de S. aureus apresentando resistência à

vancomicina, em diversos países, e alertam as autoridades da saúde para a

necessidade de uma vigilância rigorosa e constante nos hospitais, com relação

a prevenção e ao controle das infecções causadas pelos MRSA.

No final da década de 1990, dois novos agentes antimicrobianos, a

linezolida (da classe das oxazolidinonas) e a quinupristina-dalfopristina, este

último também conhecido como sinercide (um antibiótico semi-sintético da

classe das estreptograminas; MALBRUNY et al., 2002), foram desenvolvidos

por indústrias farmacêuticas. Tais drogas foram introduzidas no comércio com

indicações para pacientes portadores de quadros infecciosos severos

causados por patógenos Gram-positivos resistentes à vancomicina (DIEKEMA

& JONES, 2001; TVERDEK, CRANK & SEGRETI, 2008). Porém, a emergência

de amostras resistentes a esses agentes antimicrobianos já vem sendo

relatada em nosocômios de diversos países (TSIODRAS et al., 2001;

MALBRUNY et al., 2002; FARRELL et al., 2004; MEKA et al., 2004; PICAZO et

al., 2006; MENDES et al., 2008). Além disso, a quinupristina-dalfopristina

parece não ser a escolha mais indicada para o tratamento de pacientes com

pneumonia causada por MRSA. Essa observação baseia-se no fato da

utilização dessa droga ter sido associada a uma alta taxa de mortalidade

(25,3%) entre pacientes apresentando esse quadro infeccioso. E ainda, o alto

custo desse antimicrobiano, os riscos potenciais de seus efeitos colaterais e as

10

múltiplas interações com outras drogas restringem sua utilização no tratamento

de infecções severas por MRSA (TVERDEK, CRANK & SEGRETI, 2008). Uma

amostra clínica de MRSA resistente à linezolida também já foi isolada em 2006,

em nosso país (GALES et al., 2006).

A disseminação global de um pequeno número de linhagens específicas

e epidêmicas de MRSA representa elevados custos sociais e econômicos em

todo o mundo (COIMBRA et al., 2003). Um estudo realizado em 2002 avaliou o

impacto financeiro gerado nos gastos públicos pela política de vigilância

epidemiológica contra os MRSA, entre os anos de 1991 e 2000, no Centro

Médico Universitário Utrecht, Holanda. Também foram avaliadas as despesas

com o pagamento de médicos e outros profissionais dos departamentos de

cirurgia, microbiologia e farmácia e de funcionários da subdivisão de higiene e

prevenção de infecção bem como de outros serviços daquele hospital. A essas

despesas também foram associados os gastos com materiais, meios de

culturas, medicações específicas, descontaminação, descarte de materiais e

indumentárias. Além disso, durante o período de 10 anos desse estudo, foram

também estimados os prejuízos gerados com as 78.000 culturas adicionais

realizadas, assim como os 2.265 dias de trabalho perdidos com hospitalizações

e licenças temporárias devido a infecções e descolonização de MRSA em 29

profissionais de saúde daquele hospital. Os autores concluíram que a rigorosa

política de vigilância contra os MRSA adotada pelo hospital holandês, durante o

período avaliado no estudo, custou aos cofres públicos um total de 2.800.000

euros. Os mesmos autores projetaram ainda as conseqüências logísticas e

financeiras que seriam geradas caso essa política rígida de vigilância não fosse

adotada naquele hospital. Baseados nessas análises, os autores especularam

que os custos associados à utilização de antibióticos alternativos e de última

geração, que seriam requeridos no cenário de alta endemicidade de MRSA,

deveriam ser, pelo menos, 2 vezes maior que o montante gasto nos 10 anos

com as medidas de controle (VRIENS et al., 2002). No Brasil, foi realizada

recentemente (2005) uma análise do custo-benefício com a utilização da

linezolida e da vancomicina em pacientes com quadros de pneumonias

nosocomiais causadas por MRSA e associadas à ventilação mecânica

(MACHADO et al., 2005). Baseados nos valores unitários de cada

medicamento e de todos os dispositivos e equipamentos médicos necessários

11

à sua administração (dados do INCOR – Instituto do Coração do HC/FMUSP

obtidos em maio de 2004), foi demonstrado que, em 11 dias de internação, o

custo diário por paciente com a linezolida chegou a R$ 439,06 (total de

R$ 4.829,66) enquanto que com a vancomicina foi de R$ 255,01 (total de

R$ 2.805,11). Os mesmos autores concluíram, entretanto, que mesmo a

linezolida apresentando um custo direto 60% mais elevado que a vancomicina,

sua utilização ao final do tratamento representaria uma redução de custo de

41,3% por paciente em comparação à utilização da vancomicina (levando-se

em consideração o custo-benefício, uma vez que a taxa de cura dos pacientes

tratados com a primeira foi de 62,2% enquanto que com a segunda foi de

apenas 21,2%; MACHADO et al., 2005). Tais dados corroboram a problemática

causada pelos MRSA em quadros de infecções nosocomiais, impactando

sócio-economicamente a política de saúde pública tanto de países com uma

vigilância epidemiológica mais rigorosa como de países com um sistema de

vigilância deficiente.

Contudo, as infecções causadas pelos MRSA não estão associadas

somente às infecções hospitalares (HA-MRSA, do inglês: hospital-associated

methicillin-resistant Staphylococcus aureus). Clones de MRSA podem estar

também associados a infecções que ocorrem na comunidade (CA-MRSA, do

inglês: community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus).

Apesar dos surtos de infecções severas por MRSA em ambiente comunitário

serem raros, estes também têm sido motivo de grande preocupação por parte

de pesquisadores e profissionais da área da saúde de todo o mundo, uma vez

que podem atingir crianças e adultos sadios da comunidade. Tal preocupação

é ainda sustentada pelo fato dos antibióticos β-lactâmicos serem, amplamente,

utilizados no tratamento empírico dos diversos tipos de infecções causadas

pelos S. aureus na comunidade (DIEP et al., 2004). Além disso, tem sido

descrita a emergência de algumas linhagens de CA-MRSA apresentando uma

combinação “bem equilibrada” (em termos de vantagens adaptativas) de alguns

genes de resistência a drogas, elementos genéticos móveis (que favorecem de

alguma forma sua disseminação) e fatores de virulência, não apenas na

comunidade, mas também no ambiente hospitalar. Como conseqüência, não

são raros os eventos de substituição de algumas linhagens endêmicas de

MRSA hospitalar por algumas cepas de CA-MRSA bem adaptadas

12

(GRUNDMANN et al., 2006). Assim, é provável que diversos fatores

relacionados não somente ao perfil de resistência, mas também ao potencial de

virulência (poder de disseminação e manutenção das diferentes populações de

S. aureus) nos mais variados e hostis ambientes, sejam responsáveis pelo

sucesso observado desse patógeno bacteriano.

Como apontamos anteriormente, o primeiro estudo que ilustra bem a

última das características mencionadas (amplo poder de disseminação e

manutenção no hospedeiro) foi realizado no Brasil, em 1995, pelo nosso grupo

(TEIXEIRA et al., 1995). Naquele estudo foi demonstrado que a disseminação

hospitalar da linhagem ST239-SCCmecIIIA abrangia uma área de cerca de

5.300 Km, sendo esta detectada em diversos nosocômios localizados entre

Manaus e Porto Alegre (TEIXEIRA et al., 1995). Assim, o amplo poder de

disseminação de um clone de MRSA (o ST239-SCCmecIIIA) ficou evidente

(TEIXEIRA et al., 1995). A extraordinaria capacidade de expansão dessa

linhagem é demonstrada ainda pelo fato do ST239 ser hoje o MRSA mais

disseminado em hospitais de todo o mundo (tabela 2; GRUNDMANN et al.,

2006; BARTELS et al., 2008). Dados recentes demonstram que a incidência

das infecções nosocomiais causadas pelo ST239 são alarmantes, podendo

chegar a taxas tão elevadas quanto 90%, como foi verificado em hospitais

distribuídos pelo continente asiático (FEIL et al., 2008).

Além dos fatores associados diretamente com o microrganismo, como

os relacionados a sua virulência e patogenicidade, existem ainda diversos

fatores de risco associados ao hospedeiro e que contribuem para o aumento da

incidência das infecções nosocomiais causadas pelos MRSA. Dentre essas

condições estão incluídos os extremos de idades, representados pelos recém-

nascidos pré-maturos (que não apresentam o sistema imunológico

completamente formado) e pelos idosos (apresentando

imunocomprometimentos), o uso prolongado de antimicrobianos (afetando o

funcionamento de certos órgãos, devido aos seus efeitos colaterais e

toxicidade, e também exercendo uma pressão seletiva para a emergência de

multirresistência aos antimicrobianos), as doenças de base (comprometendo

parte da defesa imune), as deficiências imunológicas, o uso de terapias

imunossupressoras e a pré-exposição a procedimentos médicos invasivos (tais

como cirurgias, uso de cateteres endovenosos, ventilação mecânica, próteses

13

ou de outros dispositivos médicos). Com relação a esses últimos, os S. aureus

pertencem a um grupo de microrganismos capazes de se depositar sobre

superfícies lisas, como as superfícies plásticas dos biopolímeros, formando um

verdadeiro filme de bactérias, conhecido como biofilme. Por este motivo, o

biofilme tem sido reconhecido como um importante fator de virulência

associado, principalmente, às infecções nosocomiais.

1.3. Produção de Biofilme em Staphylococcus aureus

Nas últimas duas décadas diversas publicações têm apontado o gênero

Staphylococcus como um gênero bacteriano capaz de formar biofilme,

causando um novo tipo de infecção, as quais poderiam ser agrupadas e melhor

definidas como: “infecções crônicas associadas a biopolímeros” (GÖTZ, 2002).

Através de microscopia eletrônica de varredura, já havia sido observado que

esses microrganismos eram capazes de formar múltiplas camadas de células,

agregadas por uma matriz amorfa, na superfície do biopolímero (PETERS,

LOCCI, & PULVERER, 1981; CHRISTENSEN et al.,1982; MARRIE, NELLIGAN

& COSTERTON, 1982). O biofilme costuma ser definido como uma

comunidade microbiana (caracterizada por células de diferentes gêneros e

espécies que se aderem a um substrato, ou interface, e também a outras

células) inserida em uma matriz constituída de uma substância polimérica, de

natureza extracelular. Essa comunidade apresenta um fenótipo diferente no

que diz respeito ao crescimento celular, expressão gênica e síntese protéica

Na natureza, tal comunidade microbiana é formada por múltiplas espécies,

enquanto que os biofilmes associados às infecções nosocomiais são, de modo

geral, formados por uma única espécie (DONLAN & COSTERTON, 2002).

A composição química do principal polissacarídeo presente no biofilme

produzido pelos estafilococos é formada por uma homoglicana linear composta

de glicosaminoglicana, β-1,6-ligada (PNAG, do inglês: polymeric N-

acetylglucosamine), apresentando pelo menos 130 resíduos de 2-deoxi-2-

amino-D-glicopiranosil, dos quais 80-85% são N-acetilados, sendo o restante

não N-acetilados e contendo uma pequena quantidade de fosfato e resíduos

succinil éster-ligados (15-20%), tornando-o aniônico. Assim, de acordo com a

sua função de agregação intercelular, esse polissacarídeo foi denominado

adesina polissacarídica intercelular (PIA; do inglês: polysaccharide intercellular

14

adhesin; MACK, et al., 1996). A síntese de PIA in vitro ocorre a partir de

produtos codificados pelo operon ica (intercellular adhesion; CRAMTON et al.,

1999), mas até o momento pouco se sabe sobre as funções das proteínas

IcaA, D, B e C, codificadas por esse operon. Entretanto, diversas evidências

científicas indicam que a composição do biofilme sintetizado pelas espécies do

gênero Staphylococcus seja de natureza distinta. Estudos parecem apontar

importantes diferenças na composição da matriz do biofilme formado por

S. epidermidis e pelo S. aureus, sugerindo que proteínas, ou mesmo DNA,

possam ter um papel mais importante na formação do biofilme do S. aureus do

que o PIA/PNAG (O’NEILL et al. 2008; IZANO et al., 2008).

Uma importante característica dos filmes biológicos é que seu

microambiente fornece uma série de vantagens para as células que se

encontram ali inseridas (sésseis) em relação às demais células, que se

encontram na fase planctônica (dispersas fora dessa estrutura). Uma das

vantagens é a retenção e concentração, na matriz polimérica, de diversos

requerimentos nutricionais, tais como, carbono, nitrogênio e fosfato

(BEVERIDGE et al., 1997). Outra vantagem do crescimento bacteriano no

ambiente do biofilme é a resistência que essa estrutura fornece às células

contra uma gama de estratégias de remoção bacteriana intrínsecas ou

extrínsecas ao hospedeiro. Exemplos dos efeitos provocados pela barreira

física do biofilme seriam: a dificuldade de penetração de antibióticos até as

camadas mais internas dessa estrutura, a inibição da fagocitose, da ação de

radicais livres de oxigênio e proteases, da ação do complemento e de

anticorpos, dentre outros (BROWN, ALLISON, & GILBERT, 1988; IWATSUKI et

al., 2006; ULRICH et al., 2007).

Apesar da atuação do biofilme como uma barreira de difusão, diminuindo

a penetração dos agentes antimicrobianos, a resistência à drogas pode

também estar relacionada aos baixos níveis metabólicos e de crescimento

bacteriano, no ambiente do biofilme (XU, MCFETERS & STEWART, 2000). No

caso da vancomicina, ao contrário do observado para os demais grupos de

antibióticos, foi demonstrado em um modelo in vivo, utilizando cateter de

hemodiálise, que altas concentrações dessa droga foram encontradas nas

camadas mais profundas do biofilme estafilocócico após sua administração

(WILCOX et al., 2001). Os autores sugeriram que esta droga não seria efetiva

15

para a erradicação dos estafilococos, no filme biológico, pelo fato de possuir

grande afinidade de ligação aos componentes da matriz do biofilme, tornando-a

indisponível para atuar de forma eficaz no alvo bacteriano. Ao contrário da

vancomicina, baixas concentrações de linezolida foram encontradas nas

camadas mais internas do biofilme, apesar deste antimicrobiano ter diminuído a

carga bacteriana do filme biológico acumulado no cateter. Os autores

sugeriram que pelo fato da linezolida não se ligar aos componentes da matriz

polimérica do biofilme, esta droga poderia estar sendo removida durante a

etapa de lavagem para a retirada das células planctônicas do cateter, o que

explicaria a detecção de baixos níveis da mesma (CHIBA et al., 1998 apud

WILCOX et al., 2001). Finalmente, os autores concluíram que, apesar da

utilização desses antimicrobianos levar a uma diminuição da massa

estafilocócica na estrutura do biofilme, nenhum deles foi capaz de eliminar

100% das bactérias (WILCOX et al., 2001). Outro fator, muito importante,

relacionado ao filme biológico é o aumento da oportunidade de troca de

material genético entre os microrganismos localizados neste ambiente, uma

vez que estes se encontram muito próximos fisicamente devido à alta

densidade populacional e pela ligação célula-célula. Assim, trocas genéticas

podem levar a um fenótipo de múltipla resistência aos antimicrobianos, e ainda,

provavelmente, a um aumento da patogenicidade, devido a aquisição de genes

relacionados aos fatores de virulência, dentre outras possíveis aquisições

(PARSEK & SINGH, 2003; DE ARAÚJO et al., 2006). E ainda, o acúmulo de

ácidos oriundos do metabolismo bacteriano pode levar a alterações de pH

nesse microambiente, antagonizando a ação de agentes antibióticos que

estejam sendo administrados ao paciente e que estejam conseguindo penetrar

nessa barreira formada pelo filme biológico (STEWART & CONSTERTON,

2001). Por outro lado, o aumento populacional bacteriano no biofilme

representa um potencial para a dispersão de microcolônias, através da ação

mecânica do fluxo de fluídos ou de processos bacterianos (regulados de

acordo com sinais ambientais), resultando na sua migração e adesão a novos

sítios de colonização no hospedeiro (BOYD & CHAKRABARTY, 1994;

CONLON, HUMPHREYS & O’GARA, 2004). Por outro lado, acredita-se que o

ambiente de biofilme possa facilitar a sobrevivência bacteriana em superfícies

inanimadas. Em um estudo recente, foi demonstrado que a maioria dos

16

patógenos nosocomiais, mais incidentes, pode sobreviver sobre superfícies

secas e inanimadas por longos períodos, como no caso dos MRSA (cuja

persistência durou 7 meses; KRAMER et al., 2006).

Através da observação experimental in vitro, por microscopia, do biofilme

bacteriano, foram sugeridas duas etapas para que ocorra sua formação: a

primeira etapa estaria relacionada à adesão bacteriana inicial à superfície do

polímero. Já a segunda etapa estaria associada à deposição (acúmulo) das

células de acordo com o crescimento bacteriano, formando múltiplas camadas

de um agregado de bactérias somadas ao acúmulo de material amorfo,

constituindo, deste modo, o biofilme (GÖTZ, 2002). Na primeira etapa a

bactéria pode se ligar diretamente, de forma não específica, ao polímero.

Acredita-se que este tipo de ligação deva ocorrer, principalmente, devido às

interações eletrostáticas e hidrofóbicas que ocorrem entre as proteínas

ancoradas na superfície bacteriana e a matriz polimérica do biomaterial

(FLEER & VERHOEF, 1989; MAIRA-LITRÁN et al., 2002).

Várias proteínas foram envolvidas nessa etapa inicial de formação do

biofilme (HEILMANN et al., 1997). Em S. aureus, foi observado que todas as

cepas carreadoras da proteína associada a biofilme, conhecida como Bap

(Bap, do inglês: biofilm-associated protein), são altamente aderentes e

fortemente produtoras de biofilme. Entretanto, até o momento, a proteína Bap

(codificada por um gene localizado em uma ilha de patogenicidade, SaPIbov2)

encontra-se apenas em amostras isoladas de mastite bovina e parece estar

associada tanto a primeira como a segunda fase de formação de biofilme

(CUCARELLA et al., 2004; TORMO et al., 2005; VAUTOR et al., 2008). Outros

exemplos de proteínas que têm sido citadas como envolvidas na adesão

celular primária às superfícies inertes seriam as proteínas ClpC e ClpX,

pertencentes ao complexo proteolítico Clp (Clp, do inglês: caseinolytic

protease; FREES et al., 2004) e a proteína A (O'SEAGHDHA et al., 2006). Um

outro componente dos S. aureus que também parece envolvido na produção de

biofilme é o ácido teicóico. Segundo Gross e colaboradores as interações entre

as cargas elétricas dessa estrutura e das superfícies de vidro ou de poliestireno

seria mais um fator facilitador da aderência do S. aureus nas etapas iniciais de

formação de biofilme (GROSS et al., 2001).

17

Ainda na primeira etapa de formação do biofilme, uma forma de

interação indireta da bactéria com o polímero também pode ocorrer. Esta via de

interação alternativa é promovida pela ligação da bactéria às proteínas da

matriz extracelular, presentes no plasma do hospedeiro, tais como a

fibronectina, o fibrinogênio, o colágeno, a laminina, a trombospondina, a

elastina, etc. (HEILMANN et al., 2003), que por sua vez se depositam sobre

superfícies plásticas. Neste tipo de interação indireta, através da ligação do

S. aureus ao filme condicionante (formado pela deposição das proteínas

plasmáticas ao biomaterial) estariam envolvidos, por exemplo, o fator

clumping A (ClfA) implicado na aderência a tubos de polietileno e de cloreto de

polivinil recobertos por proteínas plasmáticas obtidas de cão (VAUDAUX et al.,

1995) e a autolisina, que dentre outras funções também apresenta propriedade

de ligação à fibronectina, fibrinogênio e vitronectina (HEILMANN et al., 2005).

O envolvimento da proteína A na aderência dos S. aureus à matriz extracelular

do hospedeiro foi demonstrado em estudos utilizando tecidos epiteliais das vias

aéreas de humanos (MONGODIN et al., 2000).

A segunda etapa de formação de biofilme tem início quando a bactéria já

se encontra aderida, direta ou indiretamente, à superfície do polímero. Em

S. epidermidis, tal evento começa com o acúmulo de PIA/PNAG. Porém, em

S. aureus, o(s) principal(is) componente(s) desta matriz não está(ão)

claramente elucidado(s). De qualquer forma, acredita-se que através dessa

matriz as células bacterianas são unidas umas às outras, formando um

agregado celular (GÖTZ, 2002).

As infecções estafilocócicas associadas aos biopolímeros podem ocorrer

de forma precoce ou tardia após a implantação do biomaterial. A forma precoce

ocorre alguns dias ou semanas após a cirurgia ou implantação do dispositivo

no paciente, e em muitos casos, a introdução do agente etiológico se dá

durante a realização desses procedimentos médicos. Por outro lado, as

infecções tardias começam após um longo período (várias semanas, meses ou

anos) entre a implantação de uma prótese e o aparecimento da infecção.

Assim, devido à capacidade de se aderir a tais superfícies inertes, os S. aureus

têm se tornado os principais agentes de infecções hospitalares associados a

biopolímeros em todo o mundo (JAMES & JAYAKRISHNAN, 2003; IZANO et

al., 2008). Dentre as diversas formas de manifestações clínicas das doenças

18

estafilocócicas, as bacteremias causadas pelos S. aureus, são sem dúvida, um

dos quadros infecciosos de maior gravidade. Um dos principais fatores que

contribui para o desenvolvimento deste quadro é a utilização de cateteres

endovenosos centrais, que aumentam a predisposição de pacientes

hospitalizados para desenvolver infecções associadas à formação de biofilme.

Diversos autores já relataram que mais da metade dos casos de bacteremias e

a maioria dos casos de endocardite causados por MRSA, em ambiente

hospitalar, são originados a partir de procedimentos cirúrgicos ou uso deste

tipo de dispositivo implantável (PETTI & FOWLER, 2002; TAK et al. 2002;

GIACOMETTI et al., 2005). Um estudo recente que confirma essa observação

foi publicado por Edgeworth e colaboradores. Neste estudo, envolvendo um

surto, durante um período de 2 anos, causado por uma variante (TW) do MRSA

ST239, na unidade de tratamento intensivo do Hospital-Escola Guy’s and St.

Thomas’ (Londres, Inglaterra), foi observada uma forte correlação entre os

altos indices de bacteremias causadas por essa linhagem epidêmica de MRSA

(47% dos casos) e a utilização de acessos vasculares em 59% dos pacientes

internados naquela unidade de tratamento (EDGEWORTH et al., 2007).

Uma importante dificuldade enfrentada por profissionais da saúde no

tratamento de infecção associadas a biomateriais é o fato de que, mesmo com

o início de uma terapia antimicrobiana empírica, a probabilidade de se obter

uma resposta satisfatória com a terapia antibiótica é muito baixa e, em alguns

casos, nula. Sendo assim, não raramente, a retirada do dispositivo médico é a

única alternativa para o reestabelecimento da saúde do paciente (WILCOX et

al., 2001; GIACOMETTI et al., 2005; STOODLEY et al., 2005). Porém, com

freqüência, a substituição do implante infectado acaba contribuindo para uma

maior debilidade do paciente, além de gerar prejuízos econômicos, e de não

garantir a ausência de complicações futuras, promovidas pelo risco continuado

de recorrência ou, até mesmo, de nova infecção (FUX et al., 2003).

1.4. Principais Sistemas Reguladores de Fatores de Virulência em

Staphylococcus aureus

Por serem patógenos extremamente versáteis, os S. aureus apresentam

outras notáveis características além da sobrevivência em sítios inanimados.

Como dito anteriormente, essa espécie bacteriana é capaz de colonizar e

19

infectar vários nichos no hospedeiro animal, como pele, membranas mucosas e

tecidos. Por isso, esses microrganismos são responsáveis por uma série de

doenças, desde infecções de pele e toxemias até doenças sistêmicas severas

(ARCHER, 1998; TENOVER & GAYNES, 2000; NOVICK, 2003).

Essa versatilidade depende de um amplo sistema de genes acessórios,

muitas vezes envolvidos na patogênese, que são responsáveis pela adaptação

da bactéria ao ambiente hostil do hospedeiro. A maior parte dos genes

envolvidos na virulência bacteriana codifica para proteínas de superfície ou

para proteínas secretadas para o ambiente extracelular. São exemplos de

proteínas associadas à parede bacteriana, a proteína A (SpA), a coagulase

(Coa), proteínas que se ligam à fibronectina A e B (FnBPA e B), que se ligam

ao fibrinogênio (FbPs) ou ao colágeno (CoBPs), e como exoproteínas, as α-, β-,

δ-, γ-hemolisinas, as leucocidinas, proteases, lipases, superantígenos

enterotoxinas, TSST-1, toxinas esfoliativas (ETA-D), dentre outras agressinas

que causam danos na célula hospedeira, degradando componentes da matriz

extracelular, danificando membranas ou as que estão envolvidas na evasão da

bactéria ao sistema de defesa específico do hospedeiro (PROJAN & NOVICK,

1997; WESSON et al., 1998; JARRAUD et al., 2000; NOVICK, 2000; AMARAL

et al., 2005). Além disso, a invasão de células epiteliais potencializa a

habilidade bacteriana de persistir no organismo do hospedeiro, aumentando,

conseqüentemente, a morbidade e o estado de portador (NOVICK, 2003;

AMARAL et al., 2005).

Esses fatores de virulência dos S. aureus encontram-se finamente

regulados por uma complexa e intrincada rede de sistemas reguladores da

virulência dos S. aureus, tais como: o agr, sar, sigB, arl, dentre outros (NOVICK

et al., 2000; SAID-SALIM et al., 2003; BRONNER, MONTEIL & PRÉVOST,

2004). O principal regulador de genes envolvidos na virulência dos

estafilococos é o agr (agr, do inglês: accessory gene regulator). Este sistema

funciona como um sensor de densidade populacional (quorum-sensing) que

promove a regulação negativa de proteínas de superfície, envolvidas na

colonização do hospedeiro, e a regulação positiva de proteínas extracelulares,

mais envolvidas nos processos de agressão ao hospedeiro (JANZON &

ARVIDSON, 1990; NOVICK et al., 1993, 1995; MORFELDT, TEGMARK &

20

ARVIDSON, 1996; JI, BEAVIS & NOVICK, 1997; LINA et al., 1998; NOVICK &

MUIR, 1999; LYON et al, 2002; ZHANG et al, 2002).

A estrutura do lócus agr é constituída de duas regiões divergentes de

transcrição que codificam os RNA conhecidos como RNAII e RNAIII,

coordenadas pelos promotores agrP2 e agrP3, respectivamente (figura 1;

JARRAUD et al., 2000). O RNAII corresponde à molécula transcrita pelo

operon P2 que é composto de quatro genes: agrB, D, C e A. O gene agrD

codifica para uma proteína que dá origem ao peptídeo autoindutor do sistema

Agr, conhecido como AIP (AIP, do inglês: autoinducing peptide) ou peptídeo

Agr (JI, BEAVIS & NOVICK, 1997; JARRAUD et al., 2000). Os peptídeos

indutores, produzidos a partir do lócus agr, possuem algumas variações na

seqüência de aminoácidos e nos domínios histidina-quinase de seus

receptores. A partir dessas diferenças foram determinados quatro tipos

polimórficos de agr, até o momento: AgrI, II, III e IV (JI, BEAVIS & NOVICK,

1997; JARRAUD et al., 2000; 2002). A biossíntese do AIP ocorre em algumas

etapas, como veremos a seguir. Primeiramente, a proteína AgrD (produto do

agrD) é sintetizada em nível ribossomal e ancorada a parte interna da

bicamada de fosfolipídios da membrana celular bacteriana, através de uma

hélice com domínios anfipáticos na sua região N-terminal, que a dirige ao

mesmo compartimento onde se encontra a proteína AgrB (produto do gene

agrB; ZHANG, LIN & JI 2004). Chegando até a AgrB, começa o processamento

da proteína AgrD, que dará origem ao peptídeo Agr. A AgrB efetua a digestão

proteolítica da AgrD e, posteriormente, uma ligação tioéster é formada, sendo

seu produto, já em forma de AIP, secretado pela AgrB. Já as proteínas AgrC e

AgrA participam de um sistema de tradução de sinais via dois componentes

que é responsável pela ativação do lócus agr. Com a secreção de AIP no meio

extracelular, tal peptídeo se liga hidrofobicamente à proteína AgrC, que

encontra-se exposta na membrana da célula bacteriana e que apresenta,

portanto, um domínio transmembranoso e um outro domínio citoplasmático

histidina-quinase (WRIGHT III et al., 2004). Assim, quando o peptídeo AIP se

liga à AgrC, essa se autofosforila em seu domínio histidina-quinase,

transferindo posteriormente o grupamento fosfato para o domínio aspartato da

proteína AgrA. Uma vez fosforilada, a AgrA torna-se ativada e, como apresenta

o papel de reguladora de resposta do sistema de dois componentes, se liga

21

(através de seu segundo domínio) à região promotora agrP2 e agrP3, ativando

a transcrição dos RNAII e RNAIII, respectivamente (figura 1). Cabe ressaltar

que a ativação e expressão do lócus agr pode ser pontencializada quando a

proteína AgrA atua em sinergismo com a proteína SarA (codificada em trans,

por outro operon), sendo capazes de se ligar a regiões distintas dos

promotores agrP2P3, ativando assim a transcrição de todo o operon agr

(JANZON & ARVIDSON, 1990; NOVICK et al., 1993, 1995; MORFELDT,

TEGMARK & ARVIDSON, 1996; JI, BEAVIS & NOVICK, 1997; LINA et al.,

1998; NOVICK & MUIR, 1999; LYON et al., 2002; ZHANG et al., 2002;

NOVICK, 2003). Figura 1. Diagrama esquemático do sistema Agr, mostrando os dois promotores agr divergentes (P2 e P3) e suas regiões de transcrição. O operon P2 é responsável pela transcrição do RNAII codificando os genes agrBDCA. Dois desses, agrC e agrA codificam proteínas do sistema de tradução de sinais, via dois componentes, e os outros dois, agrB e agrD, codificam para proteínas que irão gerar um peptídeo autoindutor (AIP), ligante da proteína receptora de sinal (AgrC). Quando o AIP se liga a AgrC leva à fosforilação da histidina-quinase no domínio carboxi-terminal citoplasmático. A seguir o grupamento fosfato é transferido para a AgrA, que uma vez fosforilada, ativa a transcrição dos promotores agrP2P3. A ativação do promotor P3 é responsável pela transcrição do RNAIII (molécula efetora do agr).

O RNAIII, por sua vez, é a molécula efetora do lócus agr dos

estafilococos, que contém uma pequena ORF que codifica para a δ-hemolisina

22

em seu terminal 5` e uma região não-codificadora, esta última responsável pela

regulação em trans (à distância), de diversos fatores de virulência, em nível de

tradução direta ou indireta. Porém a δ-hemolisina não apresenta funções nesta

regulação (NOVICK, 2003). Desta forma, quando um processo infeccioso

estafilocócico se inicia, como a densidade populacional bacteriana é ainda

baixa (correspondendo ao ínicio/metade da fase logarítimica do crescimento),

pouco peptídeo Agr é produzido, levando, conseqüentemente, a expressão de

RNAIII em níveis basais. Como o RNAIII é responsável pela regulação direta e

negativa de genes codificadores de proteínas de superfície, a menor expressão

desse RNA regulador determina uma maior biossíntese de tais proteínas,

essenciais para a aderência/invasão do patógeno na fase de colonização do

hospedeiro. Foi demonstrado que, a regulação direta e negativa acontece

através do pareamento de domínios de seqüências ricas em citosinas, na

região conservada da molécula de RNAIII, com seqüências RBS (RBS, do

inglês: ribosome-binding site) de seus mRNA-alvos (mecanismo antisensing;

BENITO et al., 2000; NOVICK, 2003; GEISINGER et al., 2006; BOISSET et al.,

2007). Um exemplo seria a repressão da expressão da proteína A (codificada

pelo gene spa). Neste caso, um dos domínios localizados no terminal 3’ do

RNAIII se liga ao RBS do mRNA spa, formando uma dupla fita de RNA

(RNAdf), impedindo o acoplamento do ribossomo para a posterior tradução do

RNAspa e induzindo uma rápida e específica degradação deste RNAdf pela

ação da endoribonuclease III (RNase III; HUNTZINGER et al., 2005).

Por outro lado, nas etapas mais avançadas do processo infeccioso, nas

quais a bactéria já se encontra melhor adaptada ao nicho em que se localiza e

em alta densidade populacional (equivalendo ao final da fase logarítimica e

início da fase estacionária de crescimento), uma maior quantidade de peptídeo

Agr é excretado, promovendo uma maior ativação do sistema Agr e,

conseqüentemente, uma maior transcrição de RNAIII. Assim, além da

regulação direta e negativa, esse RNA regulador também é responsável pela

regulação indireta e positiva de toxinas secretadas (agressinas) envolvidas na

agressão ao hospedeiro. Na regulação indireta e positiva, o RNAIII interage

com o mRNA de um gene que codifica para a proteína repressora Rot (Rot, do

inglês: repressor of toxins), envolvida na inibição da expressão dos genes

23

codificadores de exoproteínas (BENITO et al., 2000; NOVICK, 2003). Rot é um

regulador negativo, constitutivamente expresso nos S. aureus, que atua na

inibição da transcrição de uma série de agressinas estafilocócicas (SAID-

SALIM et al., 2003). Assim, como para o RNAspa, a complementariedade de

bases entre seqüências do RNAIII e do RNArot promovem a degradação do

RNAdf através da RNase III, diminuindo a síntese de Rot, liberando,

conseqüentemente, a síntese de diversas toxinas estafilocócicas que estavam

reprimidas pelo Rot (NOVICK et al., 1995; MORFELDT, TEGMARK &

ARVIDSON, 1996; GEISINGER et al., 2006; BOISSET et al., 2007).

Outro importante integrante da rede reguladora da virulência dos

S. aureus é o regulador de genes acessórios sarA (sar, do inglês:

staphylococcal accessory regulator). Este lócus regulador codifica uma proteína

de 14,5 kDa (SarA) com propriedades de ligação a moléculas de DNA, e que é

requerida, pelo menos sob algumas condições de crescimento bacteriano, para

a máxima ativação em trans dos promotores do lócus agr e,

conseqüentemente, da expressão da molécula de RNAIII (regulação agr-

dependente; HEINRICHS, BAYER & CHEUNG, 1996; PRAGMAN e

SCHILIEVERT, 2004). A expressão de sarA é promovida por três promotores,

sarP1, sarP2 e sarP3, responsáveis pela síntese de três transcritos

sobrepostos (figura 2).

sarAP1P3 P2

sarB

sarC

sarA

Figura 2. Esquema do operon sarA. Os retângulos P1, P2 e P3 representam as posições dos promotores P1, P2 e P3. As setas representam os transcritos de sar. Pontilhados cinza representam a ORF sarA e a sobreposição da mesma nos transcritos sarC e sarB. Adaptado de BAYER, HEINRICHS & CHEUNG, 1996.

Desta forma, o operon sarA pode ser expresso durante todas as fases

de crescimento bacteriano, sendo sarP1 e sarP2 responsáveis por sua

expressão no início/metade da fase exponencial de crescimento e, sarP3,

responsável por sua expresão no final da fase exponencial/início da fase

24

estacionária ou ainda durante condições de estresse ambiental (MANNA,

BAYER & CHEUNG, 1998). Nesta última, a ativação de sarA, promovida por

sarP3, é dependente do fator σB (DEORA, TSENG & MISRA, 1997). Além

disso, SarA também participa da regulação positiva e negativa de vários fatores

de virulência dos S. aureus, podendo esta regulação ocorrer de forma

independente da ativação do lócus agr (agr-independente). Dados obtidos a

partir da análise da estrutura secundária de SarA indicam que seu papel como

ativador na expressão gênica seria, possivelmente, promovido pelo seu

domínio hélice-volta-hélice (helix-turn-helix) que permite sua ligação aos sulcos

maiores (formados pela estrutura em alfa-hélice) das moléculas de DNA-alvo,

enquanto as regiões flanqueadoras a este domínio seriam responsáveis pela

interação com os sulcos menores do mesmo DNA. Desta forma, o complexo

SarA-DNA facilitaria a transcrição dos genes-alvo (LIU et al., 2006). Por outro

lado, tal propriedade de ligação a regiões promotoras pode, para certos genes,

funcionar como um mecanismo de repressão, caso a conformação produzida

pela interação SarA-DNA dificulte a transcrição gênica, como sugerido, por

exemplo, para o gene spa. Tem sido proposto que a regulação agr-

independente, promovida por SarA, possa ainda ocorrer através da ligação

desta proteína aos trancritos de genes que codificam para certos fatores de

virulência, aumentando assim a estabilidade do mRNA, durante a fase

logarítmica do crescimento bacteriano (CHEUNG et al., 2004; ROBERTS et al.,

2006). Dentre os fatores de virulência regulados positivamente pelo SarA,

incluem-se as proteínas de ligação à fibronectina (FnBPs) e ao fibrinogênio

(FbBP), a TSST-1 e a enterotoxina estafilocócica B (SEB). Dentre os fatores

regulados negativamente podemos citar as diversas proteases estafilocócicas

(CHAN & FOSTER, 1998; CHEUNG et al., 2004). Por outro lado, com o avanço

das pesquisas em torno de SarA, novas proteínas homólogas Sar foram

descobertas em S. aureus (tabela 3).

25

Tabela 3. Membros pertencentes à família de proteínas homólogas Sar.

Proteínas* Principais funções sugeridas Referência

MgrAa Regulador de autólise e do agr TRUONG-BOLDUC, ZHANG, & HOOPER, 2003

Rot Repressor da síntese de toxinas, com função oposta ao agr

SAID-SALIM et al., 2003

SarA Ativador de genes por vias dependentes ou independentes do agr

CHAN & FOSTER, 1998; CHEUNG et al., 2004

SarR Regulador negativo de sarA e positivo do agr CHEUNG et al., 2004

SarSb Ativador da síntese da proteína A TEGMARK et al., 2000

SarT Ativador de sarS e repressor da síntese de α-hemolisina

CHEUNG et al., 2004

SarU Regulador positivo do agr CHEUNG et al., 2004

SarV Regulador de autólise reprimido por SarA e MgrA

MANNA et al., 2004

SarX Regulador negativo do agr e ativado por MgrA MANNA & CHEUNG, 2006

SarY Função desconhecida KURODA et al., 2001

SarZ Regulador positivo de hlac KAITO et al., 2006

*Proteínas homólogas Sar codificadas no genoma da cepa de S. aureus N315. aMgrA, regulador também conhecido como Rat ou NorR. bSarS, ativador também conhecido como SarH1. chla, gene que codifica para a α-hemolisina. Adaptado de CHEUNG et al., 2008.

Uma dessas proteínas é a MgrA, pertencente a subfamília de

reguladores MarR (TRUONG-BOLDUC, ZHANG, & HOOPER, 2003). A função

deste regulador foi primeiramente evidenciada em um estudo que demonstrou

que uma mutação no gene mgrA resultava em um fenótipo de autólise

aumentado e em uma diminuição da transcrição dos genes agr, sarS e sarX

(INGAVALE et al., 2005). Posteriormente, estudos de perfis transcricionais

(LUONG et al., 2006) revelaram que MgrA estava envolvida na regulação de

355 genes, promovendo a regulação positiva de 175 genes (dentre estes,

genes codificadores de exoproteínas) e a negativa dos 180 genes restantes

(dentre os quais encontram-se genes codificadores de proteínas de superfície;

INGAVALE et al., 2005; LUONG et al., 2006). Adicionalmente, o efeito de MgrA

na autólise bacteriana parece ser mediado por sarV, que é um regulador

positivo de diversas enzimas autolíticas, como veremos a seguir.

Outro membro da família Sar, é a proteína Rot, uma repressora da

biossíntese de toxinas estafilocócicas (SAID-SALIM et al., 2003). A função de

Rot foi investigada a partir de estudos utilizando a tecnologia de RNA-

microarrays, que revelaram que tal proteína estava envolvida na repressão da

26

transcrição de 168 genes, incluindo, os genes codificadores das α- e β-

hemolisinas, de proteases, de uma lípase e urease estafilocócicas. Rot parece

também atuar na regulação positiva da proteína A e de SarS, influenciando a

expressão desses genes de forma antagônica ao agr (SAID-SALIM et al.,

2003).

Além destas proteínas homólogas Sar também é membro desta famíla o

repressor SarR. Esta proteína, da mesma forma como SarA, é capaz de se

ligar a regiões promotoras, promovendo, através da mudança conformacional

gerada pelo híbrido SarR-DNA, a repressão de genes-alvo. Foi observado que

SarR atua como um modulador negativo da expressão do operon sar (MANNA

& CHEUNG, 2001; CHEUNG et al., 2004).

A proteína SarS, também conhecida como SarH1, teve sua identificação

baseada em sua habilidade de ligação aos promotores agrP3, hla (codificador

da α-hemolisina) e ssp (codificador de uma serina protease; TEGMARK,

KARLSSON, & ARVIDSON, 2000). SarS, diferentemente das proteínas SarA e

SarR (com estruturas diméricas), apresenta-se em uma estrutura monomérica,

podendo atuar na ativação da transcrição de spa ou na repressão da

transcrição de hla (TEGMARK et al., 2000; CHEUNG et al., 2004). Análises

transcricionais indicaram que sarS é reprimido pelo agr e mgrA e ativado pelas

proteases ClpX e ClpP (FREES, SORENSEN, & INGMER, 2005). Em um

estudo recente (2006) foi sugerido que SarA pode atuar tanto como um

importante repressor quanto como um modesto ativador de hla. No primeiro

caso, a repressão de hla ocorreria devido a regulação positiva promovida por

SarA sobre sarS (OSCARSSON, et al., 2006). Contudo, este resultado foi

obtido a partir de experimentos realizados com a cepa de S. aureus, SH1000

(uma cepa laboratorial que apresenta baixa produção de α-toxina), sendo,

portanto, necessárias informações adicionais sobre este dado em amostras

clínicas de S. aureus (CHEUNG et al., 2008).

Mais um integrante da família de proteínas homólogas Sar, é a proteína

SarT, que é normalmente reprimida pelos reguladores agr e sarA. A ativação

de sarT resulta na regulação positiva de sarS (CHEUNG et al., 2004), levando

a repressão de hla e a ativação de spa (SCHMIDT et al., 2001, SCHMIDT,

MANNA & CHEUNG, 2003).

27

Adjacentemente ao gene sarT localiza-se o gene de mais um homólogo

Sar, o sarU. Este gene codifica para uma proteína dimérica que é transcrita de

forma divergente a sarT. sarU é reprimido por SarT, que por sua vez, é

regulado negativamente pelo agr. Como sarU é em ativador da expressão do

agr, quando este último encontra-se mais expresso, menor a síntese de SarT e

maior a de SarU, o que, conseqüentemente, amplifica o sinal do agr (MANNA &

CHEUNG, 2003, CHEUNG et al., 2004, 2008).

O gene sarV (codificador de SarV, outro homólogo Sar) é muito pouco

expresso (sendo muitas vezes não detectado) sob condições de crescimento

bacteriano in vitro. Entretanto, estudos utilizando cepas de S. aureus mutantes

em mgrA e sarA apresentam um aumento significativo na expressão desse

gene, indicando que a repressão de sarV seja promovida por mgrA e sarA

(CHEUNG et al., 2004). Ao contrário do observado nos mutantes mgrA e sarA,

o mutante sarV foi mais resistente a lise da parede celular mediada pela ação

de antibiótico ou detergente, quando comparado com sua cepa isogênica

selvagem (hiper-expressando sarV e apresentando uma maior susceptibilidade

à lise). De acordo com esses resultados, sarV parece participar de uma via de

modulação de autólise comum nos S. aureus (CHEUNG et al., 2004).

Assim como SarV, SarX é mais um homólogo Sar formado por um único

domínio protéico. SarX tem sua síntese ativada pela MgrA (MANNA &

CHEUNG, 2006) e apresenta a função de repressor do agr. Desta forma,

quando MgrA é expresso, ativa a expressão do agr e de sarX. Este último, por

sua vez, promove a repressão do agr de forma dependente de mgrA,

demonstrando a complexidade e o intrincamento de toda a rede reguladora da

família de homólogos Sar.

De acordo com o genoma da cepa de S. aureus N315, sarY é mais um

gene putativo codificador de uma proteína homóloga Sar. Entretanto, sua

função não foi ainda elucidada (KURODA et al., 2001; CHEUNG et al. 2008).

Finalmente, SarZ é o último dos membros da família de reguladores

homólogos Sar descrito até o momento. SarZ também apresenta homologia

com a subfamília MarR, (CHEUNG et al., 2004) e foi identificado recentemente,

em 2006. Kaito e colaboradores (KAITO et al., 2006) identificaram este novo

homólogo Sar a partir de experimentos que evidenciaram a habilidade desta

proteína de restaurar a atividade hemolítica em um mutante de S. aureus em

28

cvfA (um regulador de virulência com atividade de fosfodiesterase), o qual era

defectivo para a expressão de hla. Através de modelos de infecção em

camundongos e bicho-da-seda foi observado que o mutante sarZ derivado da

cepa de S. aureus RN4220 apresentou uma virulência atenuada. Contudo

estes resultados devem ser interpretados com cautela, uma vez que a cepa

RN4220 foi geneticamente manipulada através de mutagêneses com

nitrosoguanidina. E ainda, quando as mutações em sarZ foram transduzidas na

cepa 8325-4 (defectiva para os genes rsbU e sigB) foi observada apenas uma

sutil diminuição da atividade hemolítica, sendo este fenótipo parcialmente

restaurado com a complementação de sarZ em trans. Isto sugere que outros

genes, downstream a sarZ, possam contribuir para a expressão do fenótipo

hemolítico (CHEUNG et al., 2008).

Como dito anteriormente, além dos reguladores agr e sar, outros

reguladores também participam da modulação dos diversos fatores de

virulência dos S. aureus. O sigB, por sua vez, codifica um fator sigma

alternativo (σB) para a transcrição de genes mais envolvidos na resposta dos

S. aureus às condições ambientais adversas, geralmente observadas na fase

estacionária do crescimento bacteriano. Algumas dessas variações ambientais

podem ocorrer, por exemplo, no interior do biofilme maduro, levando a um

estado de estresse bacteriano, gerado pelo esgotamento de nutrientes e de

íons essenciais para o metabolismo, pelos extremos de pH (devido ao acúmulo

de produtos metabólicos bacterianos naquele microambiente) e também pelo

desequilíbrio osmótico. Outro exemplo seria a variação de temperatura

observada no local da infecção e, ainda as condições promovidas pela

resposta inflamatória do hospedeiro, em resposta a ação de agressinas

secretadas pelas bactérias (LORENZ et al., 2008). Por outro lado, quando os

S. aureus encontram-se em condições ideais de crescimento, sigB torna-se

inativo, devido à repressão promovida pela proteína RsbW (um fator anti-σ;

PANÉ-FARRÉ et al., 2006).

Similarmente ao sistema Agr, o lócus arl também codifica um sistema

regulador de virulência via dois componentes, o ArlR-ArlS. Este sistema está

diretamente envolvido na regulação de alguns genes de virulência, tais como o

hld (codificador da δ-hemolisina), hlc (codificador da hemolisina Hlc), lukD e

29

lukE (codificadores de leucocidinas) e genes relacionados ao metabolismo

bacteriano. Entretanto, sua função parece estar mais relacionada ao processo

de autólise bacteriana e a atividade proteolítica extracelular, apresentando

também um papel na regulação negativa da aderência dos S. aureus a

polímeros de poliestireno (FOURNIER & HOOPER, 2000). Apesar do agr e de

sarA serem requeridos para regulação de spa, através da ativação de ArlRS,

este último pode promover a diminuição da transcrição do agr e aumentar a

transcrição de sarA (FOURNIER, KLIER, & RAPOPORT, 2001); demonstrando

assim a complexidade e intrincamento desses sistemas de regulação.

1.5. Regulação de genes envolvidos na formação de biofilme glicose-induzido ica-independente em Staphylococcus aureus

Muitos estudos vêm indicando a existência de um ou mais mecanismos

de formação de biofilme PIA/PNAG-independente, tanto em S. epidermidis

como em S. aureus (BEENKEN et al., 2004; FITZPATRICK, HUMPHREYS &

O’GARA, 2005; ROHDE et al., 2005, 2007, KOGAN et al., 2006). Beenken e

colaboradores, através de experimentos de DNA-microarrays, utilizando uma

amostra clínica de S. aureus, demonstraram que mutações deletérias no lócus

ica, levando à completa inibição de PIA/PNAG, causavam apenas um pequeno

impacto na formação de biofilme, que continuava a ser produzido e acumulado

normalmente, tanto em ensaios realizados in vitro como in vivo (BEENKEN et

al., 2004).

Um gene indicado como aparentemente envolvido na regulação da

produção de biofilme ica-independente de S. aureus é o rbf (rbf, do inglês:

regulator of biofilm formation). Esse gene codifica para a proteína Rbf que

pertence à família AraC/XylS (cujas proteínas apresentam domínios de ligação

a moléculas de DNA) e que, portanto, não apresenta características de

proteínas de superfície e nem de secretadas. Segundo Lim e colaboradores, a

Rbf parece regular positivamente uma proteína de 190 kDa, envolvida na

produção de biofilme em resposta a certas alterações ambientais, tais como as

promovidas por variações nas concentrações de glicose e NaCl. Ainda de

acordo com os autores deste trabalho, a Rbf atuaria, provavelmente, através de

uma via independente de ica, uma vez que a transcrição deste operon não foi

afetada em um mutante isogênico para o rbf (LIM et al., 2004). Posteriormente,

30

em outro trabalho, foi observado que a indução da síntese de biofilme por NaCl

foi mais freqüente em amostras de MSSA do que em MRSA. Ao contrário do

que foi demonstrado para as amostras de MSSA, foi ainda observado que a

indução por NaCl não levou à produção de PIA/PNAG pelos MRSA, apesar do

aumento da transcrição do icaADBC detectado, (O’NEILL et al., 2007). Em um

estudo anterior, já havia sido demonstrado que o desenvolvimento de biofilme

em amostras de MRSA seria, principalmente, induzido por glicose, além de ser

ica-independente, estando aparentemente relacionado à produção de uma ou

mais proteínas com características de adesinas (FITZPATRICK, HUMPHREYS

& O'GARA, 2005).

Mais recentemente (2008), utilizando amostras clínicas de S. aureus,

O’Neill e colaboradores, aprofundando as investigações anteriores, avaliaram

quais seriam as possíveis proteínas que estariam envolvidas na estrutura do

biofilme. Foi demonstrado que as FnBPAB estavam associadas ao biofilme

glicose-induzido, ica-independente, tanto em MSSA como MRSA, em

condições experimentais de formação de biofilme sob fluxo ou estáticas

(O’NEILL et al., 2008).

A SasG é uma proteína de S. aureus, descrita recentemente, que foi

também associada à produção de biofilme ica-independente (CORRIGAN et

al., 2007). Esta proteína é homóloga à proteína Aap, sendo também, esta

última, relacionada à acumulação do biofilme em amostras clínicas de

S. epidermidis (DE ARAÚJO et al., 2006). A SasG foi ainda associada à

aderência bacteriana à superfície de células epiteliais nasais, demonstrando

seu envolvimento tanto na formação de biofilme como na colonização do

hospedeiro (CORRIGAN et al., 2007).

O envolvimento do ácido teicóico, outra estrutura também relacionada ao

processo inicial de aderência bacteriana a superfícies, através de mecanismo

ica-independente, foi descrito por Gross e colaboradores em 2001. Os autores

deste trabalho demonstraram que amostras de S. aureus dltA-nocautes e,

portanto, deficientes do resíduo de D-alanina em seu ácido teicóico,

apresentaram um fenótipo de biofilme negativo (GROSS et al., 2001). Um outro

estudo que corrobora o envolvimento do ácido teicóico na fase inicial de

formação de biofilme dos S. aureus foi recentemente publicado. Neste estudo

Vergara-Irigaray e colaboradores (2008), utilizando construções nocautes no

31

gene tagO (envolvido na síntese de ácido teicóico da parede celular),

demonstraram que os mutantes apresentaram menor habilidade para formar

biofilme. Porém, essa diminuição do biofilme não pôde ser relacionada a um

possível efeito dessa mutação na diminuição de PIA/PNAG ou em seu

ancoramento à superfície da célula (VERGARA-IRIGARAY et al., 2008).

Apesar dos estudos citados acima, pouco se conhece sobre a exata

composição do biofilme ica-independente dos S. aureus. Portanto, mais

estudos são necessários para a elucidação de tais mecanismos e das vias

envolvidas na regulação do filme biológico desenvolvido pelos S. aureus.

Entretanto, alguns estudos têm demonstrado que sistemas reguladores

da virulência dos S. aureus parecem estar também envolvidos na regulação do

biofilme, um desses sistemas é o ArlR-ArlS, um sistema de tradução de sinais

via dois componentes. Mutações neste lócus resultaram em um aumento da

aderência inicial e na produção de PIA/PNAG pela cepa de S. aureus 15981.

Entretanto, a ativação da síntese de biofilme neste mutante não foi afetada pela

deleção do operon ica, indicando que PIA/PNAG não é um componente

essencial da matriz do biofilme produzido pela amostra 15981 (TOLEDO-

ARANA et al., 2005). Similarmente, a deleção do gene da principal autolisina

dos S. aureus, atl (regulada pelo sistema ArlRS), não exerceu efeito no fenótipo

do biofilme do mutante arlRS (TOLEDO-ARANA et al., 2005). Por outro lado,

estudos prévios já haviam demonstrado uma dramática diminuição na atividade

proteolítica extracelular em mutações em arlS (FOURNIER & HOOPER, 2000).

Desta forma, é interessante citar que a ativação da síntese de biofilme no

mutante arlRS, descrita por Toledo-Arana e colaboradores (2005), foi sarA-

dependente (sabendo-se que SarA regula negativamente a produção de

proteases extracelulares). Assim, é provável que a ativação do biofilme nos

mutantes arlRS possa ter ocorrido pela inibição da atividade proteolítica, a qual,

quando ativada, degradaria uma proteína importante para a formação deste

fenótipo de biofilme. Em contraste ao observado com as mutações em sarA, a

deleção do agr ativou o biofilme no mutante arlRS (TOLEDO-ARANA et al.,

2005). Acredita-se que a regulação negativa do agr sobre este biofilme tenha

ocorrido de forma indireta. Tal conclusão se deve ao fato desse sistema arlRS

atuar regulando positivamente o lócus agr (LIANG et al., 2005).

32

Não apenas o estudo citado acima, mas também outros estudos têm

demonstrado que mutações no lócus sarA resultam na reduzida capacidade de

amostras de S. aureus em formar biofilme (BEEKEN, BLEVINS & SMELTZER,

2003; VALLE et al., 2003; CONLON, HUMPHREYS & O’GARA, 2004). Tal fato,

como dito anteriormente, parece ser devido à função reguladora negativa de

SarA sobre as proteases, uma vez que proteínas parecem ter um papel

importante na formação do biofilme estafilocócico (KARLSSON et al., 2001;

O´NEILL et al., 2007). Ao contrário de sarA, foi observado que mutações no

lócus agr de 21 amostras clínicas de S. aureus não acarretaram nenhuma

alteração significativa (efeito neutro) no fenótipo de acumulação de biofilme de

16 destas e induziram um aumento de sua síntese (regulação negativa) em

apenas 5 (23%) das demais amostras analisadas (O’NEILL et al., 2007). Em

oposição a este estudo, no ano de 2000, Vuong e colaboradores, haviam

relatado que de um total de 105 amostras de S. aureus estudadas, 78% das

amostras agr negativas foram capazes de produzir biofilme, mas que apenas

5% das agr positivas expressaram o filme biológico. Deste modo, este estudo

parece sugerir que o agr deva ter um profundo impacto no fenótipo de

formação de biofilme. E ainda, foi concluido, pelos autores, que o efeito do agr

no biofilme não estaria relacionado à expressão diferenciada da proteína Atl

(principal autolisina de parede celular) ou do PIA/PNAG, mas parecia estar

associado, pelo menos em parte, à propriedade surfactante da δ-hemolisina

(codificada na região do RNAIIIagr). Foi sugerido que tal propriedade, quando

presente, poderia impedir interações hidrofóbicas entre a célula e a superfície

do polímero (VUONG et al., 2000).

Em conjunto, esses dados parecem indicar a participação de diversas

proteínas estafilocócicas na intermediação da aderência bacteriana inicial a

polímeros e na acumulação do biofilme glicose-induzido e ica-independente em

amostras de S. aureus, apontando para um mecanismo multifatorial. Em

adição, tais dados evidenciam a complexidade da rede genética reguladora

envolvida e sugerem que os loci agr e sarA parecem estar (direta ou

indiretamente) comprometidos na modulação deste fenótipo de produção de

biofilme.

33

2. OBJETIVOS

Nesta Tese nós partimos do pressuposto que a variante epidêmica do

CEB, predominante em hospitais brasileiros, deveria apresentar alguma

vantagem adaptativa que explicasse sua ampla colonização hospitalar, em

relação às demais variantes. Estudos anteriores de nosso laboratório

demonstraram que a variante predominante do CEB apresentava maior

capacidade para se aderir e invadir células epiteliais brônquicas humanas

(AMARAL et al. 2005). Como a formação de biofilme é considerado um

importante mecanismo de virulência nas infecções associadas a biopolímeros

biomateriais, neste trabalho de tese nós nos propomos a estudar

comparativamente a produção de biofilme em um total de 199 amostras de

S. aureus pertencentes ou não ao CEB e estudar os mecanismos moleculares

envolvidos na virulência.

Objetivos específicos:

(i) Analisar comparativamente a produção de biofilme em amostras

pertencentes ao CEB, a clones de MRSA raros nos hospitais

brasileiros e em amostras de MSSA, através de ensaios de

formação de biofilme em microplacas de poliestireno inerte.

(ii) Analisar a expressão do lócus agr nas amostras acima, através da

análise da atividade da δ-hemolisina e de ensaios de Northern-

blotting.

(iii) Analisar os mecanismos moleculares envolvidos na atenuação do

lócus agr, detectada neste estudo em algumas representantes de

amostras CEB, envolvendo: Northern-blotting para se estudar a

expressão do mRNA sarA e seqüenciamento de DNA para os loci

agr e sarA.

34

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1. Amostras bacterianas Para os experimentos de biofilme foi utilizado um total de 199 amostras

clínicas de S. aureus (149 MRSA e 50 MSSA), isoladas de humanos, em

diversos hospitais localizados no país, e cuja caracterização molecular foi

realizada previamente (AMARAL et al., 2005). Destas, 100 eram amostras

relacionadas ao CEB (ST239-SCCmecIIIA), sendo 50 classificadas como

variante epidêmica do CEB, pois apresentavam um perfil predominante e

idêntico de bandas no PFGE, entre as amostras CEB estudadas. Tal perfil foi

designado por nós como “perfil A1”. As outras 50 amostras CEB possuiam um

perfil no PFGE que variava de 1 a 6 bandas do perfil apresentado pela amostra

BMB9393 (protótipo do perfil A1) e foram aqui agrupadas como “perfil não-A1”.

Por sua vez, as 49 amostras restantes de MRSA possuiam perfis de PFGE que

diferiam em mais de 6 bandas do perfil da amostra BMB9393 e foram

classificadas como clones esporádicos, uma vez que eram raramente

observados em hospitais brasileiros. Finalmente, as 50 amostras de S. aureus

remanescentes eram MSSA. (AMARAL et al., 2005). A amostra de

Streptococcus pyogenes 75194 foi utilizada neste estudo como controle

negativo do biofilme, uma vez que não adere às superfícies lisas, e a amostra

de Staphylococcus epidermidis 70D como controle positivo, por se tratar de

uma espécie altamente produtora de biofilme.

As amostras de S. aureus RN6390B e RN4220 (ambas apresentando

loci agr e sarA funcionais) e a contrução agr-nula RN6911 (Δagr::tetM) foram

utilizadas como amostras-padrão ou controle em vários experimentos aqui

realizados. Estas últimas amostras nos foram gentilmente cedidas pelo Dr.

Richard P. Novick (New York University School of Medicine, EUA).

As amostras deste estudo, BMB9393 (agr-funcional) e GV69 (agr-

atenuado) foram utilizadas como protótipos.

Todas as amostras encontravam-se estocadas a –70ºC, em TSB (Tryptic

Soy Broth) adicionado de glicerol, para uma concentração final de 10% (p/v).

35

3.2. Ensaio de biofilme O ensaio de biofilme foi realizado em microplaca de poliestireno inerte

(96 poços; Nunc; Nunclon). A partir do estoque, a amostra bacteriana foi

semeada, com o auxílio de uma alça bacteriológica, em placas de Petri

contendo TSA (Tryptic Soy Agar) e incubada por 24 h a 37ºC.

Posteriormente, 3 colônias foram repicadas para 2 mL de TSB e a

cultura incubada sob agitação (200 rpm) por 18 h. A cultura foi diluída (1:100)

em TSB suplementado com glicose, para uma concentração final de 1%

(SAKOULAS et al., 2002). A partir de então, 200 µL foram aplicados em cada

um dos poços da placa de microtitulação e esta incubada por 20 h a 37ºC.

Foram utilizados 4 poços da placa de microtitulação para cada amostra. Após

incubação, a microplaca foi lida em leitor de ELISA (microplate reader model

550; Bio-Rad), no qual foi feita uma primeira leitura para medir a densidade

óptica (DO) do crescimento bacteriano a 570 nm. A seguir, o sobrenadante da

cultura foi removido e os poços foram gentilmente lavados por 4 vezes com

solução salina estéril (NaCl a 0,85% p/v). Na etapa seguinte, as células

aderidas foram fixadas a 65ºC por 1 h. Posteriormente, foram aplicados 200 μL

de cristal violeta para coloração de Gram em cada poço e, após 2 min, cada

poço foi lavado gentilmente (por pelo menos 4 vezes) com água destilada

estéril para a retirada de excesso de resíduos do corante. A placa foi seca em

forno a 45ºC (SAKOULAS et al., 2002) e a DO do biofilme foi medida a 570 nm.

A fórmula abaixo foi utilizada para se calcular a unidade de biofilme (UB).

DO do Biofilme = Unidade de Biofilme (UB) DO do Crescimento

A maior leitura da DO do biofilme da amostra de S. pyogenes 75194 foi

utilizada como base para a comparação e interpretação da unidade de biofilme

das amostras de S. aureus estudadas. Assim, se a UB fosse menor ou igual a

2 vezes (2X) o valor da maior leitura da UB do biofilme do S. pyogenes, a

amostra era considerada como não produtora. Se o valor da UB estivesse entre

2-4X o valor da maior leitura da UB do biofilme do S. pyogenes, a amostra era

considerada fracamente produtora. Entre 4-8X, a amostra era considerada

moderadamente produtora, e acima de 8X, fortemente produtora.

36

A técnica de triagem em microplaca de poliestireno inerte tem sido

amplamente utilizada para se testar a produção de biofilme em S. aureus

(BEENKEN et al. 2003; TOLEDO-ARANA et al. 2005; O’NEILL et al. 2008) e

tem sido considerada um excelente método de triagem quando se deseja testar

múltiplos microrganismos (CASSAT, LEE & SMELTZER, 2006).

Adicionalmente, recentes estudos têm obtido resultados semelhantes ao comparar esta técnica com outros métodos, nos quais o desenvolvimento do

biofilme ocorre sob condições de fluxo ou in vivo (BEENKEN et al., 2004).

3.2.1. Cálculos estatísticos Os valores das UB obtidos foram utilizados nos cálculos estatísticos

(teste t de Students’) para averiguação da hipótese nula, em populações não

pareadas, com variâncias desconhecidas, estipulando-se α = 0,05 (DUNM,

1964a).

3.3. Triagem de atividade da δ-hemolisina

Inicialmente, para avaliarmos a atividade do lócus agr, entre as amostras

CEB (perfil A1 e não-A1) estudadas, realizamos uma triagem que se baseia na

detecção da atividade da δ-hemolisina em hemácias de carneiro. Tal estratégia

tem sido utilizada para esta finalidade (NOVICK, et al., 1995; SAKOULAS et al.,

2002; ADHIKARI, ARVIDSON & NOVICK, 2007) e se fundamenta no fato de

que o gene que codifica para a δ-hemolisina (hld) encontra-se sobreposto ao

gene que codifica para o RNAIII. Desta forma, a tradução da δ-hemolisina é

uma indicação de que o RNAIII está sendo transcrito. Para a realização do

teste, as amostras pertencentes ao CEB e as amostras-controle RN6390B (agr-

funcional), RN4220 (produtora de β-hemolisina) e RN6911 (Δagr-nula) foram

semeadas por esgotamento em placas de TSA e incubadas a 37ºC por 24 h.

Colônias isoladas foram repicadas em TSB e a cultura incubada a 37ºC por

18 h, sob agitação (250 rpm). Após incubação, a cepa RN4220 foi estriada

verticalmente no centro da placa contendo ágar sangue desfibrinado de

carneiro (AS) a 5% (v/v; PlastLabor). A seguir, na mesma placa, foram também

estriadas, perpendicularmente à RN4220 e proximamente (sem tocar) à estria

desta, as amostras CEB (perfil A1 e não-A1) e amostras-controle.

37

A caracterização da δ-hemolisina, através deste teste, baseia-se na

ocorrência de um sinergismo entre a δ-hemolisina e a β-hemolisina. A

interpretação deste teste foi realizada de acordo com os padrões hemolíticos

descritos anteriormente por Adhikari e colaboradores (ADHIKARI, ARVIDSON

& NOVICK, 2007).

3.3.1. Cálculos estatísticos A proporção de indivíduos dentro dos diferentes grupos de amostras

(CEB A1 e não-A1) que produziram δ-hemólise forte, fraca ou não detectada foi

utilizada nos cálculos estatísticos, utilizando-se o teste do Chi-quadrado para

averiguação da hipótese nula, com variância igual a 2 e α = 0,05 (DUNM,

1964b).

O mesmo teste também foi utilizado nos cálculos estatísticos para a

análise da proporção de indivíduos dentro dos diferentes grupos de amostras

produtoras de biofilme (fenótipos forte/moderado e fraco/não produtor) que

apresentaram δ-hemólise forte, fraca ou não detectada.

3.4. Experimentos de Northern-blotting Os experimentos de Northern-blotting foram realizados para

representantes de amostras CEB que apresentaram atividade de δ-hemolisina

visivelmente diminuida no screening em AS. Também foram utilizadas para o

controle destes experimentos 2 amostras clínicas de MSSA, além da amostra

BMB9393 (protótipo agr-funcional) e a amostra padrão agr-funcional RN6390B. O RNA total foi obtido utilizando-se o kit RNeasy Mini Kit (Qiagen). O RNA foi

quantificado no GeneQuant RNA/DNA calculator da Pharmacia Biotech. Um

volume contendo 10 μg da preparação de RNA foi aplicado em um gel de

agarose a 1%, em presença de tampão MOPS e formaldeído, conforme

recomendado no manual do fabricante do RNeasy Mini Kit. A transferência do

RNA do gel de agarose para a membrana de náilon (Hybond-N+, Amersham

Pharmacia) foi realizada através de vácuo (Vacum geneXL; Pharmacia) por 2 h

a 55 mm Hg, conforme recomendações do fabricante. Após transferência, a

membrana foi colocada sobre papel de filtro e deixada por 30 min à

38

temperatura ambiente. Após secagem, a membrana foi colocada em um forno

a 80°C por 2 h para fixação do RNA.

3.4.1. Obtenção da sonda para o rnaIII, sarA e 16S rrna

3.4.1.1. Extração do DNA

A técnica utilizada foi a descrita por Sambrook, Fritsch & Maniatis (1989)

com algumas modificações, conforme relatamos a seguir. Para a obtenção do

DNA genômico da amostra RN6390B, esta foi cultivada em TSB (37°C/18 h, a

200 rpm), centrifugada a 2500 x g e o sedimento lavado 2X com TE (Tris 1 M,

pH 7,5; Sigma, EDTA 0,1 mM, pH 8,0). O sedimento foi homogeneizado e

acrescido de lisostafina, para uma concentração final de 5.000 U/mL (Sigma),

para degradação da parede bacteriana. Após incubação por 1 h a 37°C. Os

protoplastos obtidos foram lisados em SDS para uma concentração final de 1%

(p/v). A digestão protéica foi realizada por 1 h a 37°C com proteinase K, para

uma concentração final de 455 U/mL (Sigma). Posteriormente, igual volume de

uma mistura de fenol-clorofórmio (1:1; v/v), previamente saturado com tampão,

foi adicionado. O tubo foi agitado, manual e vigorosamente, por cerca de 10

min e centrifugado a 2500 x g por 30 min. A fase aquosa superior foi retirada,

transferida para novo tubo descartável cônico e adicionada de RNAse para

uma concentração final de 600 UK/mL (Sigma). O lisado bacteriano foi

incubado por 1 h a 37°C. Após esse período, igual volume de fenol-clorofórmio

foi acrescentado e o tubo novamente agitado por 10 min. Posteriormente, foi

realizada uma centrifugação a 2500 x g por 30 min. Novamente, a fase aquosa

superior foi transferida para um novo tubo descartável, onde foi acrescentado o

dobro do volume de etanol absoluto gelado. O lisado foi gentilmente misturado

com o etanol através de movimentos circulares, manuais, por

aproximadamente 5 min, de forma a enrolar o DNA. O DNA assim precipitado

foi coletado com auxílio de uma alça bacteriológica descartável e transferido

para um tubo estéril. Posteriormente, duas lavagens com álcool etílico a 70%

(v/v) foram realizadas, sendo o material centrifugado em microcentífuga por

10 min, sob máxima rotação. Finalmente, o DNA foi deixado por 15 min na

estufa (37°C) para a evaporação do etanol. O DNA foi diluído em água

39

bidestilada estéril e estocado a -20°C até o momento do uso (SAMBROOK,

FRITSCH & MANIATIS, 1989).

3.4.1.2. Amplificação das sondas para o rnaIII, sarA e 16S rrna As sondas específicas foram obtidas através do método da reação em

cadeia da polimerase (PCR; do inglês: polymerase chain reaction), utilizando-

se DNA total obtido da cepa RN6390B. Primers específicos foram utilizados

para amplificar fragmentos internos de DNA correspondentes a 212 pb para o

rnaIII, 460 pb para o sarA e de 368 pb para o 16S rrna. Os seguintes primers

foram utilizados: rnaIII (primer 1: 5´ catagcactgagtccaagga 3´ e primer 3:

5´ caatcggtgacttagtaaaatg 3´; desenhados a partir da seqüência com número

de acesso no GenBank X52543), sarA (primer SARAF1:

5´ gtatcatctatcaaacttcacc 3´ e primer SARAF2: 5´ ggcaaatgtatcgagcaagatg 3´;

desenhados a partir da seqüência com número de acesso no GenBank

NC_009782) e 16S rrna (primer F16S: 5´ aacgcattaagcactccgc 3´ e primer

R16S: 5´ gtgtgtagcccaaatcataa 3´; desenhados a partir da seqüência com

número de acesso no GenBank NC_009782). Para as respectivas reações de

amplificação os seguintes reagentes foram utilizados: mistura de dNTPs (dNTP

mix), para uma concentração final de 200 μM para cada dNTP; 10 pmol de

cada primer; 0,125 U TaqDNA polimerase (Gibco); 200 ng do DNA molde

(dosado espectrofotometricamente); 1,5 μM de MgCl2 e 5 μL do tampão da

enzima 10 vezes (10X) concentrado, em um volume final de 50 μL de reação.

Todas as amplificações acima foram realizadas no termociclador

GeneAmp PCR System 2.400 (PE Applied Biosystems), programado de acordo

com as seguintes etapas: pré-desnaturação a 94ºC/4 min (sem a adição da

Taq), posteriormente, adicionou-se a Taq e realizou-se 30 ciclos: desnaturação

(94ºC/30 s); anelamento (55ºC/30 s) e extensão (72ºC/1 min). Finalmente, foi

realizada uma extensão final (72ºC/4 min; INNIS et al., 1990).

3.4.1.3. Eletroforese do produto da amplificação Após amplificação, uma alíquota de cada amplicon, e do marcador de

corrida “low DNA mass ladder” (Invitrogen), foram adicionados,

separadamente, ao corante de corrida contendo glicerol (azul de bromofenol a

40

0,25% (p/v); xyleno-cianol FF a 0,25% (p/v); glicerol a 30% (p/v) em água) e os

DNA aplicados nas canaletas de um mini-gel de agarose preparado a 1,5% em

tampão TAE 1X (tris-acetato, 40 mM; EDTA 1 mM, pH 8,0). O gel foi,

posteriormente, tratado com brometo de etídio a 0,5 μg/mL e o DNA visualizado

com auxílio de um transiluminador de luz ultravioleta (UV) e fotografado com

filme Polaroid tipo 667 (SAMBROOK, FRITSCH & MANIATIS, 1989).

3.4.1.4. Purificação e marcação das sondas para o rnaIII, sarA e 16S rrna

A purificação do amplicon, diretamente a partir da reação de PCR, foi

realizada utilizando-se o kit “QIAquick PCR purification” (Qiagen), de acordo

com as recomendações do fabricante. O produto purificado foi marcado com o

kit “alkphos direct nucleic acid labelling and detection system” (Amersham

Biosciences do Brasil Ltda) de acordo com a recomendação do fabricante. Para

hibridização do RNA com as sondas marcadas foi utilizado o sistema acima,

conforme recomendação do fabricante (Amersham Biosciences do Brasil Ltda).

Finalmente, para detecção do sinal, a membrana foi exposta a um filme de

raios-X (X-OMAT-XK1; Kodak, São Paulo, Brasil), por pelo menos 15 min, e o

filme revelado automaticamente (X-OMAT/M20-BR; Kodak). Em alguns

experimentos de Northern-blotting, as sondas foram retiradas da membrana

através incubação em SDS (duodecil sulfato de sódio) 0,5% a 60°C, durante

60 min e de lavagem com Tris 100 mM (pH 8.0) por 5 min em temperatura

ambiente, e a membrana re-utilizada para novas hibridizações com outras

sondas.

3.5. Seqüenciamento dos loci agr e sarA Para o seqüenciamento completo do operon agr foram utilizadas 2

amostras pertencentes ao CEB (GV24 e GV69). O seqüenciamento parcial

(correspondente a região trailer do RNAIIagr) do lócus agr da amostra protótipo

CEB (agr-funcional) BMB9393 também foi realizado. Além disso, por

constatarmos erros na seqüência da amostra RN6390B, depositada no

GenBank, o seqüenciamento completo do operon agr desta amostra foi

também realizado. Para o sequenciamento das regiões contíguas upstream e

downstream aos promotores de sarA (sarP1, sarP2 e sarP3) foram utilizadas

41

as três amostras CEB acima. Para as reações de sequenciamento, o DNA

cromossômico das amostras foi extraído conforme descrito anteriormente no

item 3.4.1.1.

3.5.1. Desenho dos primers para a amplificação de fragmentos de DNA do operon agr e da região promotora de sarA

Inicialmente, os desenhos dos primers 1 (forward) e 2 (reverse) para a

amplificação do operon agr foram baseados nas seqüências do lócus agr das

cepas agr+ tipo I designadas RN6390B e RN4220, disponíveis no GenBank sob

os números de acesso X52543 e AF230358, respectivamente. Posteriormente,

foi feita uma análise visual das regiões que flanqueiam os fragmentos de DNA

a serem amplificados, visando-se escolher seqüências de nucleotídeos

variando entre 18 e 22 bases, com conteúdo de G e C em torno de 50% e

evitando-se seqüências repetitivas ou que pudessem vir a formar estruturas

secundárias. Uma vez realizada essa primeira análise da seqüência, os primers

desenhados foram analisados com o auxílio do programa Primer Analysis, da

Cybergene (http://www.cybergene.se/primer.html), visando-se à detecção de

palíndromos e hairpins.

Por se tratar de um operon com mais de 3.000 pb, foram necessários

desenhos de vários sets de primers para que todo o operon agr fosse

seqüenciado. Assim sendo, após o seqüenciamento da região dos promotores

P2 e P3 do operon agr (primeira região seqüenciada da fita 5’-3’), os primers

forwards para a continuação do seqüenciamento foram desenhados com base

nos eletrosferogramas resultantes do seqüenciamento de cada fragmento de

DNA amplificado. Os desenhos dos primers reverses para o seqüenciamento

da fita 3’-5’ foram, por sua vez, baseados nas seqüências do operon agr de

S. aureus tipo I, disponíveis no GenBank (X52543/RN6390B;

AF230358/RN4220 e AF210055/CMRSA-1), conforme especificado acima.

Os desenhos dos primers sarP1F (forward) e sarP1R (reverse), sarP2F

e sarP2R e sarP3F e sarP3R, que foram utilizados para a amplificação das

regiões contíguas upstream e downstream aos três promotores de sarA, sarP1,

sarP2 e sarP3, respectivamente, foram baseados na seqüência da cepa de

S. aureus RN6390B, disponível no GenBank sob o número de acesso U46541.

42

Todos os primers utilizados neste estudo e os seus respectivos números

de acesso no GenBank encontram-se descritos na tabela 4.

3.5.2. Desenho do programa de PCR (polymerase chain reaction) As amplificações das seqüências genômicas do operon agr e das

regiões promotoras de sarA foram realizadas como descrito anteriormente no

item 3.4.1.2. com uma única modificação: a temperatura programada de

anelamento variou de acordo com a Tm°C calculada para cada primer (tabela

4). A eletroforese dos produtos das amplificações e a purificação dos mesmos

foram realizadas como descrito anteriormente nos itens 3.4.1.3. e 3.4.1.4.,

respectivamente.

3.5.3. Seqüenciamento dos produtos de PCR purificados Os seqüenciamentos foram realizados através da técnica de primer

walking utilizando-se um seqüenciador automático MegaBACE 1000

(Amersham Biosciences). As reações de seqüenciamento foram realizadas de

acordo com o protocolo para o MegaBACE 1000, utilizando o DYEnamic ET

Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (com Thermo Sequenase™ II DNA

Polimerase). As seqüências foram analisadas pelo software Sequence

Analyser utilizando o Base Caller Cimarron 3.12.

3.5.4. Edição das seqüências As seqüências oriundas dos seqüenciamentos realizados neste estudo

foram analisadas visualmente, comparando-se o nucleotídeo da seqüência

linear com o pico do gráfico do eletrosferograma correspondente, obtido

através do software Chromas (http://www.technelysium.com.au/chromas.html).

3.6.5. Alinhamento múltiplo das seqüências O alinhamento das seqüências correspondentes às regiões amplificadas

das amostras CEB, RN6390B e das seqüências de S. aureus não pertencente

ao CEB (RN9107 e D22, ambas agr tipo I, disponíveis no GenBank sob os

números de acesso DQ229854 e DQ157983, respectivamente) foi realizado

através do software CLUSTALW (THOMPSON, HIGGINS & GIBSON, 1994).

43

Posteriormente, foi realizada uma análise visual do alinhamento das

seqüências obtidas, visando-se o mapeamento de possíveis mutações nas

regiões amplificadas das amostras CEB, em relação às seqüências de

S. aureus não pertencente ao CEB previamente publicadas e a da amostra

RN6390B.

3.6. Modelagem da estrutura secundária da molécula de RNAm agr Para a predição da estrutura secundária da molécula de RNAII (RNA

mensageiro do lócus agr), através de modelagem computacional, foi utilizado o

software RNAstructure versão 4.2 © 1996-2004 (MATHEWS et al., 2004).

44

4. RESULTADOS

4.1. Produção de biofilme em microplaca de poliestireno

Uma vez que a produção de biofilme tem sido associada ao aumento da

persistência bacteriana no hospedeiro e à patogênese de diversas infecções

nosocomiais; e pelo fato de amostras CEB (ST239) estarem ampla e

mundialmente disseminadas em diversos hospitais, formulamos a hipótese de

que tais amostras poderiam apresentar uma superior produção de biofilme.

Para averiguarmos essa hipótese, foi realizada uma análise da formação

de biofilme sobre poliestireno inerte, sob condições estáticas, em 4 diferentes

populações de S. aureus compostas por 50 amostras pertencentes a variante

epidêmica do CEB (CEB A1), 50 variantes não-epidêmicas do CEB (CEB não-

A1), 49 amostras de MRSA pertencentes a clones não relacionados ao CEB

(clones esporádicos, CE) e 50 amostras de S. aureus sensíveis à meticilina

(MSSA). Todas as amostras utilizadas neste estudo encontram-se relacionadas

na tabela 4.

Após o cálculo das unidades de biofilme (UB; tabela 5), observamos que

a média dos valores das UB (UBmédia) para as amostras CEB A1, foi de 2,09,

sendo significativamente maior que as médias calculadas para as amostras de

MSSA (UBmédia de 0,5; p<0,001), clones esporádicos de MRSA (UB Bmédia de 0,6;

p<0,001) e outras amostras pertencentes a subclones CEB não-A1, (UBmédia de

0,6; p<0,001). Portanto, o valor da UBmédia obtido para a população de

amostras pertencentes ao CEB A1 foi de aproximadamente 3 a 4 vezes maior

que os observados para os três outros grupos de S. aureus analisados. A figura

3 apresenta uma fotografia do biofilme produzido sobre a superfície de

poliestireno, por amostras representantes dos 4 diferentes fenótipos: forte,

moderado, fraco e não produtor. Nesta podemos observar o grande acúmulo

de biofilme (fenótipo forte produtor) desenvolvido pela variante CEB A1,

comparável somente, em quantidade, ao biofilme formado pelos S. epidermidis.

Além disso, nesta mesma figura, encontra-se representada a distribuição das

proporções de cada população estudada versus o fenótipo de produção de

biofilme apresentado.

Os dados deste estudo demonstraram que somente 2% das amostras

CEB A1 foram classificadas como não produtoras de biofilme, enquanto que um

45

número significativamente maior de amostras não produtoras de biofilme (16%,

18,3% e 26%) foi observado dentre as variantes do CEB não-A1, as amostras

pertencentes aos clones esporádicos de MRSA e as amostras de MSSA,

respectivamente. Um dos fatores marcantes, que também contribuiu para o

incremento nos valores da UB para a população formada pelas amostras CEB

A1, foi que a maioria dessas amostras (74%) apresentou um fenótipo forte

produtor de biofilme (figura 3). Porém, foi observado que nas outras

populações de S. aureus analisadas, as amostras classificadas como

produtoras de biofilme apresentaram, predominantemente, um fenótipo de

biofilme fraco, com taxas de 54%, 35% e 50%, para CEB não-A1, clones de

MRSA esporádicos e MSSA, respectivamente (figura 3).

4.2. Screening da expressão de δ-hemolisina

Uma vez que o agr tem sido implicado na modulação de diversos fatores

de virulência de S. aureus, e que dados da literatura científica indicam que este

quorum-sensing regula tanto positivamente como negativamente diversos

fatores de virulência dos S. aureus, testamos a hipótese de que a atividade do

lócus agr na população de amostras CEB estudadas poderia se encontrar de

alguma forma alterada, uma vez que dentre os membros dessa população se

destacava uma variante com habilidade superior para produzir e acumular

biofilme (variante A1). Inicialmente, devido ao grande número de amostras a

serem analisadas, optamos por uma triagem rápida da produção de δ-

hemolisina (codificada pelo gene hld, cujo mRNA é co-transcrito na molécula

de RNAIII), utilizando ágar sangue de carneiro. Assim, a presença da δ-

hemolisina, significa que o agr está sendo expresso (ativo) e a diminuição ou

ausência de sua detecção poderia significar que o agr encontra-se inibido

(expressão do RNAIII atenuada ou ausente).

A hemólise causada pela δ-hemolisina pode ser claramente observada,

na placa de ágar sangue de carneiro, pela formação de uma zona hemolítica

que lembra uma ponta de seta, na interseção das estrias de semeaduras da

amostra teste (produtora de δ-hemolisina) com a RN4220 (produtora de β-

hemolisina). A forma em ponta de seta é proveniente do sinergismo entre a β-

hemolisina da amostra RN4220 e a δ-hemolisina da amostra teste (figura 4B).

46

Nas amostras que produzem α-hemolisina (regulada positivamente pelo

RNAIII), a formação de ponta de seta (devido ao sinergismo entre β- e δ-

hemolisinas) não é tão clara ou não se forma. Adicionalmente, a expressão de

α-hemolisina é positivamente regulada pelo agr e na ausência da atividade

deste a α-hemolisina não é expressa (figura 4B). Desta forma, a presença de

uma zona clara e estreita de hemólise ao redor da estria bacteriana é

considerada positiva para δ-hemolisina (mesmo quando não há formação de

ponta de seta). A β-hemólise se caracteriza por uma zona de hemólise mais

escura (turva) e, freqüentemente mais ampla, ao redor da estria bacteriana. Do

total das amostras CEB testadas para a produção de δ-hemolisina em placas

de AS, em 31% a δ- e α-hemolisinas não foram detectadas (figura 4A), ou seja,

não houve formação de ponta de seta ou de zona hemolítica estreita ao redor

da estria bacteriana teste, indicando que o sistema Agr deveria estar atenuado

ou totalmente inibido nessas amostras. É importante ressaltar que dentre as 31

amostras não δ-hemolíticas, apenas 3 (10%) eram representantes CEB tipo A1

e 28 (90%) CEB não-A1. E ainda, do total de 58 amostras CEB (A1 e não-A1),

apresentando um fenótipo de acumulação de biofilme forte ou moderado, 43

amostras (74%) expressaram normalmente a δ-hemolisina (tendo como

parâmetro de comparação as amostras protótipo BMB9393, apresentando uma

atividade de δ-hemólise em ponta de seta; e GV69, apresentando atividade de

δ-hemólise muito fraca ou em algumas vezes imperceptível). Tais dados

sugerem uma forte associação entre o caráter de biofilme forte/moderado e a

regulação positiva do agr (p<0,0001). Por outro lado, uma relação inversa foi

observada para muitas das amostras que possuíam o lócus agr inibido. Ou

seja, 62% das amostras nas quais a δ-hemólise estava inibida apresentaram

fenótipo de biofilme fraco/não produtor (p<0,0001; figura 5).

4.3. Experimentos de Northern-blotting utilizando sonda específica para o RNAIII Os resultados obtidos na triagem fenotípica para a avaliação da

atividade do lócus agr indicavam fortemente que certas representantes CEB

(majoritariamente as classificada no grupo CEB não-A1) apresentavam o lócus

agr inibido. Desta forma, de modo a confirmar os dados acima, 7

47

representantes das amostras estudadas (5 apresentado atividade de δ-

hemólise inibida e 2 apresentando atividade normal de δ-hemólise,

representada pela formação de ponta de seta na placa de AS) foram

escolhidas, aleatoriamente, para confirmação do funcionamento do lócus agr,

através dos experimentos de Northern-blotting. Além disso, utilizou-se a

amostra RN6390B (apresentando agr-funcional) como controle do experimento.

Todas as 5 amostras analisadas, cujo lócus agr parecia inibido,

apresentaram uma nítida diminuição da expressão do RNAIII, quando o sinal

quimioluminescente foi comparado com o das 2 outras amostras clínicas de

S. aureus (que apresentavam atividade normal de δ-hemólise) e com a amostra

RN6390B (figura 6A). Na figura 6B, a amostra BMB9393 (CEB A1),

apresentando uma atividade de δ-hemólise em ponta de seta, e a amostra

GV69 (CEB A1), apresentando atividade de δ-hemólise extremamente fraca ou

algumas vezes imperceptível, tiveram a expressão do lócus agr

genotipicamente comparadas, confirmando a atenuação da expressão do

RNAIII na GV69 em relação à expressão detectada para a BMB9393, que

transcreveu normalmente essa molécula reguladora (tendo como parâmetro de

comparação a expressão da sonda controle para o 16S rRNA, hibridizado na

mesma membrana). Desta forma, as amostras BMB9393 (CEB A1) e GV69

(CEB A1) foram escolhidas como protótipos neste estudo e colocadas lado a

lado nos experimentos de Northern-blotting e em outros experimentos deste

trabalho.

Os resultados dos experimentos de Northern-blotting claramente

demonstraram que a transcrição do RNAIII em algumas das amostras

estudadas estava atenuada, confirmando os dados obtidos através da triagem

em placas de ágar sangue, que indicavam que várias amostras CEB

(principalmente as amostras não-A1) apresentavam uma atenuação

significativa no lócus agr.

4.4. Seqüenciamento do lócus agr

A partir deste ponto, concentramos nossos estudos na tentativa de

compreendermos os mecanismos envolvidos na atenuação do lócus agr nas

amostras CEB. Inicialmente, partimos da hipótese de que tal atenuação poderia

48

ser devido a uma mutação no operon agr, levando a uma menor transcrição do

RNAIII. Para testarmos tal suposição, realizamos o seqüenciamento completo

dos loci agr de 2 representantes CEB A1 (GV24 e GV69), com o objetivo de

averiguarmos se a atenuação natural do agr observada nessas amostras, tanto

a partir do teste de triagem, quanto a partir dos experimentos de Northern-

blotting, seria devido a uma possível mutação pontual nesse lócus regulador

global. O agr da cepa RN6390B também foi completamente seqüenciado neste

estudo, uma vez que detectamos erros importantes na seqüência original

depositada no GenBank (número de acesso X52543). Inicialmente, verificamos

que as duas amostras CEB apresentavam um polimorfismo agr do tipo I.

Comparando essas seqüências, verificamos que as 2 amostras CEB

primeiramente seqüenciadas apresentavam uma mutação pontual (substituição

de guanina por timina) na região do DNA corresponde ao 3’ trailer do RNAII

policistrônico do agr, quando o alinhamento múltiplo dessas seqüências foi

realizado em conjunto com a seqüência da amostra RN6390B (apresentando

polimorfismo agr tipo I) e com seqüências completas do lócus agr das amostras

de MSSA RN9107 e D22 (agr tipo I) que encontram-se depositadas no

GenBank (números de acesso: DQ229854 e DQ157983, respectivamente). O

resultado desse alinhamento pode ser observado na figura 7.

Para averiguarmos se a mutação pontual encontrada no lócus agr seria

responsável por uma alteração conformacional na molécula de RNAIIagr, o que

poderia explicar a atenuação do lócus agr nas representantes CEB, realizamos

uma modelagem computacional da estrutura secundária da seqüência do

RNAII, através do software RNAstructure versão 4.2. Como resultado, a

estrutura secundária predita do RNAII para as amostras CEB apresentou uma

alteração significativa nos hairpins na região 3’ trailer do RNAII quando

comparada com a estrutura predita obtida a partir da seqüência da cepa

RN6390B (figura 8).

Posteriormente, a região 3’ do RNAII de outra representante CEB A1,

porém apresentando o agr funcional, a amostra protótipo BMB9393, também

teve o seu lócus agr parcialmente seqüenciado, com o intuito de averiguarmos

se essa mutação era, realmente, uma característica das variantes agr

atenuadas ou uma característica comum dessa linhagem. Após

49

seqüenciamento, edição e alinhamento, verificamos que a amostra BMB9393,

assim como as demais amostras CEB seqüenciadas, também apresentava a

mesma mutação pontual na região do DNA correspondente ao 3’ trailer do

RNAII (figura 7). Portanto, este resultado parecia indicar que tal mutação era

uma característica comum às amostras pertencentes a esta linhagem e, desta

forma, não poderia ser diretamente responsabilizada pela atenuação do lócus

agr observada nas amostras CEB GV24 e GV69.

4.5. Determinação do papel do sarA na atenuação do agr detectada nas amostras CEB

Como SarA é uma proteína reguladora transcricional que atua

positivamente na expressão do agr, se ligando nas regiões dos promotores P2

e P3 deste lócus, nossa próxima etapa foi testar a hipótese de que o sarA

poderia estar atenuado e, conseqüentemente, influenciando à expressão do

agr nessas amostras. Decidimos assim, verificar tal suposição através de

experimentos de Northern-blotting com uma sonda específica para sarA, e

utilizando RNA total das amostras CEB A1 protótipos: GV69 (agr-atenuada) e

BMB9393 (agr-funcional). Os resultados destes experimentos demonstraram,

claramente, uma reduzida expressão do mRNAsarA para a amostra GV69

quando comparados aos resultados da amostra BMB9393 (figura 6B). Nesta

mesma figura, pode-se observar ainda o ensaio controle com a sonda

específica 16S rrna, gene constitutivamente expresso nos S. aureus,

confirmando que o sinal mais fraco observado na GV69 não foi resultado de

uma aplicação de menor quantidade de RNA total na canaleta correspondente,

mas sim de uma diminuição na expressão do mRNAsarA, uma vez que

utilizamos a mesma membrana (após retirada da sonda) para realizar os

experimentos com a sonda para o 16S rrna. Assim, a figura 6B representa

fotografias de uma mesma membrana hibridizada, separadamente, com as

sondas específicas para o agr, sarA e 16S rrna, após retirada de cada sonda

através de fervura em SDS. Conseqüentemente, nossa suspeita de que uma

atenuação na expressão do sarA poderia estar envolvida no mecanismo de

atenuação do lócus agr foi confirmada (figura 6B).

Para averiguarmos se essa atenuação na transcrição do mRNAsarA

estava sendo causada por uma mutação no operon sar, ou se era causada por

50

um defeito upstream sar, realizamos o seqüenciamento das regiões contíguas

(upstream e downstream) aos 3 promotores sar nas três representantes CEB,

para as quais o agr havia sido seqüenciado: GV24, GV69 e BMB9393. Após o

alinhamento múltiplo das seqüências sar obtidas para as amostras CEB com as

seqüências das amostras de MSSA, RN9107 e D22, disponíveis no GenBank

(números de acesso DQ229854 e DQ157983, respectivamente), não foi

evidenciada nenhuma alteração na região abrangendo os promotores de sar

nas seqüências CEB das amostras analisadas.

51

5. DISCUSSÃO

Os Staphylococcus aureus são patógenos que apresentam um potencial

de variabilidade genética, relativamente, elevado, o que contribuiu para sua

rápida adaptação ao hospedeiro e capacidade para causar doenças

(KENNEDY et al., 2008). Esta característica marcante pôde ser, repetidamente,

verificada através da emergência de cepas que adquiriram, de forma

excepcionalmente rápida, mecanismos de resistência a virtualmente quase

todos os agentes antimicrobianos, logo após a introdução dos mesmos na

prática médica (OLIVEIRA, TOMASZ & DE LENCASTRE, 2002; NOTO et al.,

2008). O MRSA ST239-SCCmecIIIA, denominado clone epidêmico brasileiro

(CEB), teve seu amplo poder de disseminação (através de distâncias de

dimensões continentais) reconhecido pela primeira vez, na literatura científica,

em um estudo de nosso grupo que relatou seu espalhamento em hospitais

localizados de norte a sul do Brasil (TEIXEIRA et al. 1995). Posteriormente, foi

relatado por Edgeworth e colaboradores (EDGEWORTH et al., 2007) que este

clone era geneticamente semelhante a um clone anteriormente detectado na

Inglaterra, na década de 1980, o qual naquela época era denominado de

EMRSA-1 (MARPLES, RICHARDSON & DE SAXE, 1986). Atualmente

amostras de MRSA ST239 vêm sendo detectadas em hospitais de todo o

mundo (JEMILI-BEN, BOUTIBA-BEN & BEN, 2006; DEURENBERG et al.,

2007). Este clone, que parece descender da recombinação de duas linhagens

dominantes, ST8 e ST30 (ROBINSON & ENRIGHT, 2004), faz parte de um

grupo seleto de clones específicos de MRSA pandêmicos que se encontram

amplamente disseminados, em diversos hospitais dos 5 continentes

(DEURENBERG et al., 2007), sendo este, na atualidade, o clone de MRSA

mais disseminado no mundo.

Foi sugerido, anteriormente, que o sucesso de clones pandêmicos de

MRSA, como patógenos hospitalares, seria reflexo de sua rápida evolução,

frente à pressão exercida pela utilização intensa e indiscriminada de

antimicrobianos em todo o mundo (DAY et al., 2001). Porém, além do fenótipo

de multirresistência, os S. aureus apresentam outras características notáveis,

como a capacidade de sobreviver por longos períodos em superfícies

52

inanimadas (KRAMER, SCHWEBKE & KAMPF, 2006) e de colonizar e/ou

infectar vários nichos no hospedeiro, incluindo pele, membranas mucosas,

sangue e vários outros tecidos e órgãos, inclusive os vitais. Devido a essas e

outras propriedades, esses microrganismos são hoje responsáveis por uma

série de doenças, desde infecções de pele, toxemias, e até doenças sistêmicas

extremamente severas (ARCHER, 1998; TENOVER & GAYNES, 2000;

NOVICK, 2003). Porém, o papel dos diferentes fatores de virulência no

desenvolvimento das infecções estafilocócicas permanece até o momento por

ser totalmente esclarecido.

Pelo fato do ST239 ser, no momento, o clone pandêmico de MRSA mais

disseminado, e o biofilme estar sendo apontado como um importante fator de

virulência em infecções hospitalares, principalmente nas associadas aos

biopolímeros, decidimos testar a hipótese de que as amostras CEB poderiam

estar acumulando mais biofilme do que outras amostras de MRSA. Neste

estudo desenvolvemos então um modelo experimental para avaliar a habilidade

desses estafilococos para desenvolver biofilme. O modelo escolhido foi o da

formação do filme bacteriano sobre poliestireno inerte, em condições estáticas

de crescimento bacteriano, em presença de glicose. Este foi selecionado por

ser o teste de triagem indicado para se avaliar um número elevado de amostras

(CASSAT, LEE & SMELTZER, 2007). Além disso, a maioria dos estudos

anteriores, publicados, sobre desenvolvimento do biofilme em S. aureus, não

detectou diferenças significativas no biofilme formado, sob condições de

crescimento bacteriano estáticas (sem troca do meio de cultura) ou de fluxo

(com fluxo contínuo de meio de cultura novo), in vivo ou in vitro (BEENKEN et

al. 2004; TOLEDO-ARANA et al. 2005; O’NEILL et al. 2008). Os resultados

aqui apresentados demonstraram que a maioria das amostras CEB testadas foi

capaz de produzir biofilme (91%). Por outro lado, biofilme foi também uma

característica comum entre as outras amostras de MRSA (82%) e de MSSA

(74%) analisadas. Essas elevadas taxas de produção de biofilme observadas

em S. aureus devem, certamente, contribuir não somente na patogênese das

infecções associadas à biomateriais, como também para uma maior

sobrevivência desses microrganismos sobre superfícies inanimadas, como

mobiliário e utilitários hospitalares, equipamentos e materias de uso médicos,

como por exemplo, um simples estetoscópio (HILL, KING & DAY, 2006). Em

53

estudos anteriores de nosso grupo foram detectadas taxas de produção de

biofilme de 76% para uma coleção de amostras hospitalares de S. epidermidis,

enquanto que amostras isoladas da comunidade apresentavam uma

percentagem significativamente menor, de cerca de 60% (DE ARAÚJO et al.,

2006). Assim, a partir do presente estudo, podemos concluir que a produção de

biofilme (em amostras hospitalares) de S. aureus é uma característica tão (ou

mais) comum quanto a observada em amostras de S. epidermidis.

É importante ressaltar aqui que a variante CEB A1 apresentou um

significante aumento na acumulação do biofilme (3-4 vezes maior) em relação

às outras amostras analisadas (p<0.001). Assim, é razoável supor que tal

propriedade poderia ser, pelo menos em parte, responsável pela ampla

propagação dessa linhagem pandêmica em hospitais de todo o mundo. Chama

atenção o fato de amostras de MRSA relacionadas ao ST239 terem sido

relatadas como agentes de infecções nosocomiais na Alemanha, Argélia,

Argentina, Austrália, Áustria, Brasil, Chile, China, Cingapura, Coréia, Eslovênia,

Espanha, EUA, Finlândia, Grécia, Holanda, Índia, Indonésia, Itália, Mongólia,

Polônia, Portugal, Reino Unido, República da Geórgia, República Tcheca, Sri

Lanka, Suécia, Tailândia, Tunísia, Uruguai e Vietnam (CAMPANILE et al.,

2001; JEMILI-BEN, BOUTIBA-BEN & BEN, 2006; DEURENBERG et al., 2007;

BARTELS et al., 2008). Um estudo recente de Edgeworth e colaboradores

(2007) demonstrou que pacientes que adquiriram infecções causadas por uma

variante (TW) do ST239, em um hospital do Reino Unido, apresentaram maior

risco de desenvolver bacteremia (47% vs. 13%; p<0.001) e de apresentar

cultura positiva para MRSA, a partir de ponta de cateter (59% vs. 26%;

p<0.001). Porém, foi observada entre tais pacientes menor chance de

colonização nasal por TW (p<0.001). Não sabemos se TW corresponde a

variante A1 de nosso estudo (a qual apresentou elevada capacidade para

acumular biofilme), mas de qualquer modo, nos parece lógico supor que uma

maior acumulação do filme biológico desta variante ST239 possa ter sido o

mecanismo responsável pela sua superior capacidade para causar bacteremia

(EDGEWORTH et al., 2007). Portanto, um experimento interessante seria

testar a hipótese de que essas duas variantes (A1 e TW) se tratam de um

mesmo indivíduo. A maioria das amostras utilizadas em nosso estudo não

54

estava envolvida em infecções na corrente sangüínea e, portanto, a associação

entre produção de biofilme e bacteremias não pôde ser aqui avaliada.

A versatilidade bacteriana depende de um amplo conjunto de genes

acessórios, muitos dos quais envolvidos na patogênese, e que são

responsáveis pela adaptação da bactéria ao ambiente hostil do hospedeiro. Os

S. aureus produzem uma gama de fatores de virulência, tantos associados a

sua superfície como liberados para o meio extracelular. Apesar de sabermos

que a patogênese das infecções estafilocócicas é multifatorial, como dissemos

anteriormente, pouco se conhece com relação aos principais mecanismos

associados a essas doenças (PROJAN & NOVICK, 1997; WESSON et al, 1998; JARRAUD et al., 2000; NOVICK, 2000; GRUNDMANN et al., 2006). Em

estudo anterior, evidenciamos que amostras CEB A1 apresentavam maior

habilidade para aderir e colonizar a superfície de células epiteliais brônquicas

humanas. Nossos dados comprovaram que a invasão maciça promovida pelas

amostras CEB A1, nas células epiteliais respiratórias 16HBEo–, foi paralela a

maior capacidade dessas amostras de se ligar à fibronectina humana

imobilizada, através de um mecanismo integrina RGD-dependente. Assim, é

possível que a capacidade do MRSA de se ligar eficientemente à fibronectina e

invadir, maciçamente, células epiteliais respiratórias humanas aumente a sua

habilidade para persistir no organismo do hospedeiro, contribuindo,

conseqüentemente, para o estado de portador e aumento da morbidade

(AMARAL et al., 2005). Dados recentes de O'Neill e colaboradores

demonstraram que as FnBPAB parecem também estar envolvidas na produção

de biofilme ica-independente, glicose-induzido, tanto em amostras de MRSA

como em amostras de MSSA (O'NEILL et al., 2008). Assim, nos parece

provável que uma maior expressão de FnBPAB pelas amostras CEB A1

poderia ser responsável, pelo menos em parte, pela elevada acumulação de

biofilme observada neste estudo. Seria interessante se estudos fossem

realizados para se comprovar tal hipótese. Apesar desses dados recentes, a

composição do biofilme ica-independente dos S. aureus não se encontra ainda

totalmente elucidada, uma vez que outras moléculas protéicas têm sido

também apontadas como mediadoras deste biofilme (O’NEILL et al., 2008). Resumindo, nossos resultados (AMARAL et al. 2005) representam os

primeiros dados experimentais, registrados na literatura científica, demostrando

55

que, dentro de uma mesma linhagem de MRSA, variantes epidêmicas,

apresentando características específicas associadas à virulência do

microrganismo, podem prevalescer, expressando, de modo diferencial, fatores

que conferem propriedades vantajosas para sua sobrevivência, persistência e

disseminação global.

Estudos envolvendo genômica comparativa, entre as amostras

protótipos GV69 (biofilme moderado; agr atenuado) e BMB9393 (biofilme forte;

agr funcional) realizados pelo nosso grupo (dados não publicados), através da

metodologia de microarrays da Affymetrix, demonstraram que essas duas

variantes apresentavam, basicamente, o mesmo core genômico e que as

principais diferenças entre essas amostras estavam relacionadas a elementos

móveis (principalmente bacteriófagos), à presença de cls1 (gene que codifica

para cardiolipina sintetase) somente na amostra BMB9393 e, ainda, em relação

a diferenças relacionadas à presença de alguns genes hipotéticos. É possível

que esses elementos móveis possam criar regiões de instabilidade no

cromossomo desses microrganismos gerando mutações que afetariam a

expressão de determinados genes, ou ainda, poderiam ocorrer mutações

pontuais em genes de virulência ou em seus reguladores que resultariam na

virulência diferenciada observada entre essas duas variantes.

De modo similar, em um amplo estudo sobre genômica comparativa dos

MRSA, através de microarrays, foi também demonstrado que a principal

diferença entre as amostras estudadas encontrava-se relacionada à presença

ou ausência de determinados bacteriófagos, inclusive em amostras dentro de

uma mesma linhagem (LINDSAY et al., 2006). Da mesma forma, ao realizar um

estudo de genômica comparativa, através de microarrays, com 16 amostras

ST239 (variante TW), aqueles autores, como nós, não detectaram genes que

poderiam estar especificamente ligados a maior patogenicidade da variante

epidêmica (EDGEWORTH et al., 2007). Recentemente, Kennedy e

colaboradores (2008) realizaram estudos de genômica comparativa, através do

seqüenciamento completo de 10 amostras representantes do clone de CA-

MRSA, conhecido como USA300, amplamente disseminado nos EUA. Esses

autores demonstraram que 8 das 10 amostras analisadas apresentaram

poliformismo de apenas um nucleotídeo (SNP; do inglês: single nucleotide

polymorphism), o que indica divergência recente. Inexplicavelmente, duas

56

dessas amostras apresentaram reduzida mortalidade em um modelo animal de

sepse, comparada com a cepa de referência (p = 0,0002). Tais dados em

conjunto corroboram a idéia de que diferenças genéticas mínimas no genoma

dos MRSA poderiam exercer profunda influência sobre a expressão da

virulência (KENNEDY et al., 2008).

No Brasil, e em outros países, incluindo os Estados Unidos,

aproximadamente 60% dos S. aureus envolvidos em casos de infecção

hospitalar são MRSA (GALES et al., 2000; NNIS system, 2004). Paralelamente

ao aumento dos procedimentos invasivos, na medicina moderna, tem sido

observado um aumento significativo no número de infecções nosocomiais

associadas ao biofilme, pois parte significativa dessas doenças está associada

ao uso de cateteres e proteses médicas. Do mesmo modo, mais recentemente,

detectou-se um aumento significativo nos índices de mortalidade em

bacteremias causadas pelos MRSA (ALLARD et al., 2008; LIBERT et al.,

2008). Quadros de endocardites associadas a bacteremias causadas por

MRSA (com taxas variando entre 12% e 31% dos casos analisados) também

foram relatados em uma recente revisão publicada sobre o assunto

(BAMBERGER, 2007). A capacidade dos S. aureus de produzirem biofilme

sobre tais dispositivos médicos implantáveis é, sem dúvida, um grave problema

de saúde pública global, e resolver tal questão nos parece um dos maiores

desafios a serem enfrentados pela humanidade, para os próximos anos, com

relação às infecções nosocomiais.

Segundo Cramton e colaboradores, o lócus ica, responsável pela

biossíntese de PIA/PNAG (adesina intercelular polissacarídica/poli-N-acetil-

glicosamina), presente no genoma dos S. aureus e dos S. epidermidis, seria

essencial para a produção de biofilme, uma vez que a deleção do ica na cepa

de S. aureus, ATCC 35556, inibiu o desenvolvimento dessa estrutura em

superfícies de poliestireno, sob condições estáticas (CRAMTON et al., 1999).

Entretanto, estudos posteriores demonstraram que a biossíntese do biofilme

induzido por glicose em S. aureus pode ocorrer de forma independente de ica.

Mutantes obtidos por inserção de transposon, isogênicos à cepa de S. aureus

parental MT23142 (uma derivada da cepa NCTC 8325-4), desenvolveram um

mecanismo alternativo, ica-independente, para a produção de biofilme sob

condições estáticas, na ausência do sistema de dois componentes ArlRS

57

(FOURNIER & HOOPER, 2000). Desenvolvimento de biofilme ica-

independente também pôde ser observado, mais recentemente, quando O’Neill

e colaboradores, em 2007, utilizando mutantes icaADBC-deletados não

detectaram efeito algum dessa deleção sobre a produção de biofilme induzido

pela glicose em 6 amostras de MRSA. Entretanto, os mesmos autores

verificaram a completa interrupção na biosíntese de biofilme para 4 amostras

de MSSA (O’NEILL et al., 2007). Neste mesmo estudo, o tratamento do

biofilme ica-independente com proteases foi capaz de eliminar completamente

o biofilme formado, sugerindo uma composição protéica, o que também foi

confirmado por estudo recente realizado por nós com amostras CEB A1

(COELHO et al., 2008).

Boles e Horswill, em 2008, em estudos utilizando um mutante Δica::tet,

derivado do S. aureus SH1000, verificaram que a inibição do agr aumentava o

biofilme ica-independente nesta amostra e que sua ativação, no biofilme pré-

formado, levava à dispersão (destacamento) do biofilme. Como os autores

detectaram, no sobrenadante do biofilme, um paralelo aumento da serina

protease (regulada positivamente pelo agr), sugeriram que este mecanismo

poderia estar envolvido na dispersão do biofilme mediada pelo agr. Além disso,

observaram que o duplo mutante nos genes agr-regulados aur e splABCDEF

(codificando para metalo e serina proteases, respectivamente) apresentou uma

diminuição da atividade proteásica, aumento da acumulação e diminuição do

destacamento do biofilme (BOLES & HORSWILL, 2008). Diversas proteínas,

tanto reguladas positivamente pelo agr, tais como as α- (Hla) e δ-hemolisinas

(Hld; VUONG et al., 2000; CAIAZZA & O’TOOLE, 2003; ADHIKARI et al.,

2007), como as reguladas negativamente, incluindo as proteínas de ligação à

fibronectina A e B (FnBPAB; O'NEILL et al., 2008), têm sido implicadas na

formação/acumulação do biofilme glicose-induzido, ica-independente. Foi

demonstrado, recentemente, que na realidade é o pH moderadamente ácido,

induzido pelo crescimento na presença de glicose, o fator que induz este tipo

de biofilme dos S. aureus (O'NEILL et al., 2008). Porém, esses estudos são

ainda incipientes e mais dados são necessários para a elucidação da(s)

mólecula(s)-chave envolvida(s) no desenvolvimento do biofilme ica-

58

independente pelos S. aureus e suas implicações na patogênese das infecções

causadas pelos MRSA.

Foi observado, previamente, que um mutante nulo para o gene hla,

derivado da cepa NCTC8325-4, foi incapaz de colonizar eficientemente

superfícies plásticas, tanto sob condições estáticas como de fluxo (CAIAZZA &

O'TOOLE, 2003). Recentemente, Yarwood e colaboradores demonstraram o

surgimento de colônias variantes agr-inibidas, no ambiente do biofilme,

apresentando a expressão de vários fatores de virulência alterados, inclusive

uma diminuição da expressão de hla (YARWOOD, et al., 2007). Sabe-se que a

transcrição do hla, assim como a de outros genes codificadores de toxinas

estafilocócicas, é positivamente regulada pelo RNAIII (molécula efetora do

lócus agr). Em um outro estudo interessante, realizado com um modelo animal

de abscesso, foi verificado que a expressão do quorum-sensing Agr podia

variar dependendo da localização da infecção, nos diferentes nichos do animal

(VAN WAMEL et al., 2002).

Outra hemolisina estafilocócica, a δ-hemolisina, foi associada ao

biofilme. Foi sugerido que as propriedades surfactantes desta hemolisina,

codificada pelo hld, o qual se encontra sobreposto na região do transcrito

RNAIII, poderiam estar envolvidas no aumento do biofilme formado por um

mutante designado mut6, obtido por inserção de transposon no lócus agr,

(VUONG et al., 2000). Mais recentemente, estudos realizados por O’Neill e

colaboradores (2008) demonstraram que a perda da sortase (enzima

responsável pelo ancoramento ao peptídeoglicana das proteínas apresentando

o sinal LPXTG) reduziu o fenótipo de biofilme na construção srtA nocaute de

S. aureus (SRTA1), uma derivada da amostra SH1000, a qual, por sua vez, é

uma derivada da NTCT8325-4 apresentando um sigB funcional. Tais dados

corroboram com uma natureza protéica do biofilme de S. aureus. Além disso,

os autores demonstraram que a introdução de dupla mutação em fnbAB

(codificando para as FnBPA e B) reduziu severamente a formação de biofilme

na construção fnbA::tetM, fnbB::ermA, designada DU5883, também derivada

da NTCT8325-4. Adicionalmente, observaram que a promoção do filme

bacteriano pelas FnBP ocorreu em nível de acumulação e não de adesão

primária ao polímero. Mutação em fnbA ou fnbB, isoladamente, não afetou,

59

substancialmente, a expressão do biofilme e, a complementação do duplo

mutante fnbAB, através de plasmídio carreando fnbA ou fnbB, restaurou a

expressão do biofilme. Os autores ainda demonstraram que a formação do

biofilme promovida pelas FnBP era dependente de SarA, não dependia dos

domínios de ligação à fibronectina ou ao fibrinogênio, e que mutações em fnBP

não tiveram efeito sobre as amostras de MSSA analisadas (O’NEILL

et al., 2008). Porém, como as FnBPs são reguladas negativamente pelo Agr,

seria de se esperar que a atenuação do agr levasse ao aumento da

acumulação do biofilme e não à diminuição. Em nossos estudos, na amostra

agr-atenuada GV69 o sarA também encontra-se atenuado, o que poderia

também estar contribuindo para a diminuição do biofilme nesta amostra.

Estudos recentes de Boles e Horswill (2008) demonstraram que SarA inibe a

ação de certas proteases bacterianas, inibindo a dispersão do filme biológico e

aumentando assim sua acumulação. Ao contrário, a inibição de sarA levaria a

um aumento da dispersão, levando, conseqüentemente, à diminuição do

biofilme. Outras proteínas de superfície, como a proteína Bap (presente em 5%

dos S. aureus bovinos; LASA & PANEDÉS, 2006) e a proteína SasG de

S. aureus (Aap – homóloga de S. epidermidis; CORRIGAN et al., 2007), têm

sido implicadas no desenvolvimento de biofilme dos S. aureus.

A proteína SasG está presente na superfície dos S. aureus sob a forma

de fibrilas peritríqueas (CORRIGAN et al., 2007). Através de estudos de

aderência, utilizando microscopia de transmissão, verificamos que fibrilas

peritríqueas estão claramente envolvidas na aderência da variante CEB A1,

através de um delicado contato às extremidades de não mais que três

microvilosidades da célula brônquica humana (AMARAL et al., 2005). A

presença do gene sasG foi também detectada em amostras CEB A1, através

de experimentos de microarrays realizados, previamente, pelo nosso grupo

(Lócus Affymetrix: SA2505; dados não publicados). Assim é possível que tal

proteína possa estar também implicada, tanto no aumento da adesividade,

como da acumulação de biofilme observado em amostras CEB A1. Não existe

até o momento na literatura científica, que seja do nosso conhecimento,

nenhum estudo sobre a regulação gênica da proteína SasG.

Acredita-se que o sucesso dos S. aureus como patógenos deve-se,

dentre outros fatores, à fina regulação, coordenada de forma harmônica e

60

global, de um vasto repertório de sistemas genéticos, responsáveis pela

modulação de um conjunto de fatores de virulência. Dentre esses reguladores

podemos destacar o agr, sar, sigB, arl e sae (NOVICK et al., 2000; SAID-

SALIM et al., 2003; BRONNER, MONTEIL & PRÉVOST, 2004). Assim, parece

lógica a suposição de que a atenuação, ou maior expressão, desses sistemas

reguladores globais, em amostras clínicas, possa representar um importante

mecanismo para a adaptação bacteriana ao hospedeiro e assim contribuir para

o sucesso de clones específicos de MRSA (ou mesmo de variantes de um

mesmo clone), apresentando um maior potencial patogênico.

Um dos primeiros estudos sobre a formação de biofilme induzido por

glicose, sob superfície de poliestireno, foi publicado em 2000, na Alemanha.

Nessa investigação ficou confirmada, estatisticamente, a forte correlação entre

o genótipo agr-nulo das cepas RN6911(Δagr::tetM) e mut6 (mutante por

inserção do transposon no gene agrC), com o aumento da formação de

biofilme por estas amostras, em comparação às cepas selvagens isogênicas

(VUONG et al., 2000). Contudo, em um estudo publicado por Beenken e

colaboradores, em 2003, nos EUA, utilizando 8 construções agr-nulas, o agr

não apresentou efeito relevante sobre a formação do biofilme, exceto em uma,

a amostra RN6911 (BEENKEN et al., 2003). Similarmente, no mesmo ano,

também foi demonstrado, por outro grupo na Espanha, que deleções no agr,

em duas cepas de S. aureus, 15981 e v329, não resultaram em alteração

importante na formação de biofilme glicose-induzido, em condições de fluxo ou

estáticas, e ainda indicaram a participação da proteína SarA na ativação da

síntese de biofilme em S. aureus (VALLE et al., 2003).

Como pode ser observado, pesquisadores têm estudado os mecanismos

moleculares e genéticos envolvidos no desenvolvimento do biofilme pelos

S. aureus, mas, apesar do envolvimento, pelo menos em parte, do sistema de

quorum-sensing Agr, descrito por alguns, os dados relatados são

extremamente contraditórios. Uma das hipóteses para explicar tais

controvérsias foi levantada por Yarwood e colaboradores que demonstraram

que a modulação da formação do biofilme de S. aureus, promovida pelo agr,

poderia divergir sob diferentes condições ambientais (YARWOOD et al., 2004).

É importante ressaltar, que na maioria desses estudos, envolvendo agr e

biofilme, poucas cepas foram utilizadas, sendo uma grande parte destas

61

oriunda de construções genéticas derivadas da cepa NCTC8325-4, incluindo a

RN6911, que possui uma mutação natural devido a uma deleção de 11pb no

gene rsbU (codificador de um regulador positivo do σB; PALMA & CHEUNG,

2001), além de uma mutação nonsensing no agrA (ADHIKARI et al., 2007).

Mais recentemente, O’Neill e colaboradores, ainda na tentativa de

elucidar o papel do agr na formação no filme biológico de S. aureus,

observaram um pequeno impacto do quorum-sensing Agr na formação de

biofilme, uma vez que mutações nesse lócus apresentaram aumento

(>2 vezes) na produção de biofilme em apenas 5 dos 21 mutantes agr-nocaute

(23%) analisados (O’NEILL et al., 2007). Esses mesmos autores sugeriram que

SarA possuia um papel mais relevante no desenvolvimento do biofilme em

S. aureus (O’NEILL et al., 2007). A importância do sarA na formação de

biofilme também já havia sido relatada nos estudos de Beenken e

colaboradores, citados acima. Esses autores demonstraram que se sarA fosse

deletado, isoladamente ou simultaneamente ao agr, nas amostras de S. aureus

analisadas observava-se uma redução na capacidade de formação de biofilme.

Desta forma foi concluído que mutações no sarA seriam responsáveis pela

inibição do fenótipo de síntese de biofilme, tanto em condições estáticas,

quanto de fluxo (BEENKEN et al., 2003). Como SarA é um inibidor de

proteases, é possível que a deleção de sarA leve a um destacamento do

biofilme e, conseqüentemente, a diminuição de sua acumulação (BOLES &

HORSWILL, 2008). Estudos recentes de nosso laboratório (COELHO et al., 2008), utilizando

14 construções nocaute Δagr::tetM derivadas de amostras clínicas circulantes

na atualidade, e construções complementadas com plasmídio contendo rnaIII,

indicaram que o agr afetou, significativamente, a acumulação do biofilme de

S. aureus (MRSA ou MSSA), podendo este efeito ser tanto positivo, como

negativo, ou ainda neutro. Demonstramos ainda que tal divergência foi

independente da linhagem estudada, mas que podia ser predita pela

quantidade de biofilme acumulado pela amostra selvagem isogênica;

indicando, assim, a natureza multifatorial do biofilme; ou seja, que mecanismos

diversos devem estar envolvidos na sua formação/acumulação.

62

Os estudos de Boles & Horswill (2008), com um mutante agr nulo

derivado da amostra SH1000, demonstraram que a construção apresentando o

agr deletado possuia uma maior propensão para acumulação de biofilme,

enquanto a amostra selvagem apresentava maior tendência para dispersão,

sugerindo que o agr teria um papel importante no destacamento do biofilme,

por ativar certas proteases bacterianas, degradando a matriz proteinácea do

filme biológico (BOLES & HORSWILL, 2008). Ao contrário, no estudo aqui

apresentado verificamos que a maior acumulação de biofilme, na variante CEB

A1, estava associada, com extrema significância, à funcionalidade do lócus agr

(p<0.0001). Paralelamente, as amostras CEB não-A1, as quais acumulavam

menos biofilme, apresentaram o agr inibido (p<0.0001). Nossos resultados

sugerem que 31% das amostras CEB analisadas apresentaram atenuação

natural do lócus agr e que esta inibição parece ser determinada geneticamente,

uma vez que a maioria das amostras CEB, agr atenuadas, foi classificada

como CEB-não A1. Os resultados divergentes entre nossos dados e os obtidos

pelos autores acima poderiam ser explicados pelo fato daqueles autores terem

utilizado somente um mutante agr, derivado do S. aureus SH1000, ou ainda,

pela ativação e maior expressão de determinadas proteases nas amostras CEB

não-A1 pela concomitante atenuação de sarA, como observado na amostra

GV69. Esta última proposição nos parece instigante e interessante e, portanto,

deveria também ser testada. Cabe ressaltar que diferenças importantes na

expressão de proteases foram detectadas, através de estudos de microarrays,

realizados com as amostras GV69 e BMB9393 (dados não publicados). Como o agr regula negativamente FnBP, nos parece, em uma primeira

análise, que a regulação de FnBP pelo agr não poderia ser o mecanismo chave

na acumulação do biofilme observado nas amostras CEB A1; pois se assim

fosse, as amostras agr atenuadas deveriam apresentar uma capacidade de

biofilme aumentada em relação ao CEB A1, e não diminuida como foi aqui

demonstrado. Corroborando com esta hipótese, dados recentes de nosso

laboratório (COELHO et al., 2008) indicaram que a inibição ou deleção do agr

em amostras que acumulam fortemente o biofilme, incluindo o CEB A1,

diminuiram significativamente a expressão do filme biológico; apesar de não ter

eliminado totalmente o mesmo. Como não existem estudos sobre o papel do

63

agr na expressão da proteína SasG não podemos avaliar uma possível

influência do RNAIII (na modulação de SasG) no fenômeno aqui observado.

A circulação de amostras clínicas agr-inibidas foi verificada também por

Fowler e colaboradores (2004) que descreveram uma associação significativa

entre amostras de S. aureus isoladas de bacteremias persistentes e inibição da

atividade da δ-hemolisina, sugerindo uma disfunção no lócus agr. Os autores

observaram que tais amostras compartilhavam o mesmo perfil de PFGE e

maior resistência às atividades microbicidas de proteínas plaquetárias

induzidas pela trombina (FOWLER et al., 2004). Esses resultados reforçam os

dados obtidos em nossos estudos e parecem demonstrar que a detecção de

amostras clínicas apresentando agr atenuado não parece ser um fenômeno

isolado e que poderia, portanto, possuir uma significativa importância clínica.

Os ensaios de triagem para a detecção da atividade da δ-hemolisina e

Northern-blotting para a análise da transcrição do RNAIII aqui realizados,

confirmaram que indivíduos dentro de uma mesma população clonal (clone

epidêmico brasileiro), apresentando backgrounds genéticos bastante

semelhantes, podem apresentar alterações importantes na expressão do agr

(principal quorum-sensing dos S. aureus). Estudos anteriores realizados por

Papakyriacou e colaboradores (PAPAKYRIACOU et al., 2000) demonstraram

que um clone de MRSA (CMRSA-3) envolvido em infecções hospitalares no

Canadá, no final da década de 1990 e início da de 2000, parecia estar mais

associado à infecção do que à colonização, quando comparado a outras cepas

de MRSA. Semelhantemente aos resultados por nós obtidos, estudando uma

única representante deste clone, aqueles autores verificaram que esta possuia

o agr naturalmente atenuado e um aumento na expressão da atividade de

ligação à fibronectina humana. Traber e Novick, demonstraram, em 2006, que

a ausência da produção de α- e δ-hemolisinas na cepa RN4220 (uma cepa

laboratorial derivada da cepa clínica RN450) ocorreu devido a uma mutação na

extremidade 3’ do gene agrA, que levou a uma alteração do tipo frameshift,

ocasionando a adição de 3 resíduos aminoacil à região C-terminal da proteína

AgrA. Foi relatado ainda, que essa mutação não inativaria o lócus agr, mas

atrasaria sua ativação em 2-3h, resultando em falhas das traduções das α- e δ-

hemolisinas. Esses autores concluíram então, que a ocorrência dessa mutação

64

pode não se tratar apenas de um fenômeno laboratorial, mais do que isso,

poderia representar um mecanismo natural de modulação da atividade do agr

(TRABER & NOVICK, 2006). Porém, em nosso estudo, demonstramos que a

menor expressão do RNAIII foi paralela a uma expressão diminuida de SarA

(proteína reguladora global da transcrição dos S. aureus). Entretanto, o(s)

defeito(s) responsável(is) por tais alterações não estavam localizados no agr e

nem nas regiões promotoras do operon sar, mas sim em uma região upstream ao sar. Estudos sobre a expressão gênica global através de microarrays

(Affymetrix), utilizando cDNA das protótipos BMB9393 e GV69, realizados

anteriormente pelo nosso grupo (dados não publicados), revelaram que não

somente as expressões de sarA e do agr estavam afetadas na amostra CEB A1

agr-atenuada GV69, como também a expressão de um inibidor de sarA,

designado sarR. Esses dados sugerem que o aumento da expressão de sarR

na fase estacionária de crescimento, observado na GV69, foi o mecanismo

regulador responsável pela atenuação do sarA e, conseqüentemente, do agr,

observada nas amostras CEB. SarR parece atuar se ligando à região

promotora sarA, através de seu promotor P1, para regular negativamente sua

transcrição, e assim reduzir a expressão da proteína SarA (HSIEH, TSENG &

STEWART, 2008).

De modo semelhante ao fenômeno aqui descrito, a seleção experimental

no ambiente de biofilme, de variantes de uma cepa de S. aureus apresentando

inibição no agr, foi relatada por Yarwood e colaboradores (YARWOOD et al.,

2007). Esses autores também verificaram que membros da família gênica sar

(sar homólogos) estavam envolvidos na atenuação observada no lócus agr

nessas variantes. Foi observado naquele estudo que a transcrição de sarU

(regulador positivo indireto do agr, por se ligar à região promotora de sarT,

regulador negativo do agr) estava também diminuida nas amostras agr-

atenuadas. Esses dados, em conjunto com os nossos resultados, sugerem que

a atenuação natural do agr, em amostras clínicas, ocorre de forma indireta,

devido à intervenção de outros fatores upstream a este quorum-sensing via sar

homólogos. De qualquer modo, uma vez que tanto o agr quanto o sarA são loci

reguladores globais da virulência dos S. aureus, o padrão de acumulação de

biofilme, observado na variante CEB-A1, deve estar relacionado, pelo menos

em parte, com as diferenças observadas entre essa variante e as variantes

65

CEB não-A1, quanto ao perfil de expressão desses e de outros genes

reguladores, como o sarA e o sarR.

Day e colaboradores, em um interessante estudo sobre evolução clonal

em S. aureus, demonstraram que a variante predominante de um determinado

complexo clonal (CC), definido por tipagem de seqüenciamento de multilócus

enzimáticos (MLST), era sempre apontada (em um modelo de algoritmos

matemáticos) como o ancestral predito, quando diversos CC de S. aureus

foram estudados. Além disso, seus estudos indicaram que amostras

relacionadas aos clones patogênicos de S. aureus apresentavam maior

capacidade de colonização nasal do que as amostras relacionadas a clones

isolados da microbiota anfibiôntica da narina. Esses autores sugeriram que as

variantes predominantes dos clones patogênicos eram, dentre os membros da

população clonal, as que retinham maior potencial de aderência às células

nasais (DAY et al., 2001). Desta forma, nossos resultados estão de acordo com

os estudos de Day e colaboradores e levantam a possibilidade que a variante

CEB A1 possa ter sido a ancestral da população CEB estudada. Em conjunto,

esses resultados sustentam a hipótese que o domínio de clones de S. aureus

resistentes a uma grande variedade de drogas, em um cenário epidemiológico

particular, parece resultar não somente da pressão seletiva exercida pelo uso

continuado e intenso de antimicrobianos, mas também, provavelmente, das

influências promovidas pelas associações dinâmicas dos diferentes fatores

envolvidos na co-evolução bactéria-hospedeiro, o que poderia culminar na

seleção de patógenos melhor adaptados (condicionados) para causar

infecções nosocomiais. Assim, parece provável que, de tempos em tempos, ao

longo da história da evolução dos S. aureus, cepas com maior capacidade de

virulência possam emergir.

Concluindo, o sucesso que temos observado de alguns clones

específicos, hospitalares e pandêmicos de MRSA, como no caso do ST239,

poderia ser creditado a uma superior capacidade de colonização; além da

aquisição da resistência aos β-lactâmicos conferir uma vantagem óbvia no

ambiente nosocomial, em relação aos demais competidores sensíveis. Em

adição a maior acumulação de biofilme aqui observada, dados anteriores,

obtidos por nós, demonstraram que a variante CEB predominante (A1)

66

apresenta maior adesividade e invasibilidade para células epiteliais

respiratórias humanas (AMARAL et al., 2005).

Assim, é possível que diferentes combinações de características

genotípicas e fenotípicas poderiam produzir a variabilidade necessária para a

expressão de determinados conjuntos de fatores bacterianos (apropriados para

a colonização e infecção), nos diferentes nichos do hospedeiro.

Adicionalmente, tais características poderiam contribuir para a epidemicidade

de determinados clones pandêmicos, ou mesmo de variantes dentro de um

mesmo clone. Dados obtidos por Edgeworth e colaboradores (2007),

demonstrando uma nítida associação entre o desenvolvimento de bacteremia e

a detecção de uma variante do ST239, designada TW (EDGEWORTH et al.,

2007), corroboram com esta hipótese e, juntamente com os dados obtidos a

partir de nossos estudos sobre a virulência experimental diferenciada do CEB

(AMARAL et al., 2005), representam os primeiros dados da literatura científica

indicando que certos clones de MRSA podem ter evoluído de forma a se tornar

patógenos nosocomiais de sucesso. Outras implicações seriam as de que

estes resultados parecem demonstrar que, pelo menos em certos casos, o

MLST pode não possuir amplo significado epidemiológico (TURNER & FEIL,

2007), uma vez que variantes de um mesmo clone podem se tornar

epidêmicas, sendo inclusive responsáveis por surtos de dimensões

continentais.

O ônus para esta acelerada evolução dos MRSA, que estamos

testemunhando, na atualidade, se volta para os governos e autoridades de

saúde, que necessitam criar sistemas eficazes de monitoramento desses

clones multirresistentes e responsáveis por surtos pandêmicos; visando

organizar e promover dados para o pronto controle de sua disseminação, bem

como para o estabelecimento de protocolos de tratamento eficazes das

doenças a eles associadas. Por outro lado, a grande responsabilidade e

desafio dos profissionais da saúde estaria em exercer um controle rígido e

eficaz da disseminação desses clones no ambiente hospitalar, de forma que os

hospitais possam continuar sendo locais onde as expectativas sejam de cura e

não de aquisição de mais doenças.

67

Tabela 4. Primers utilizados nos seqüenciamentos parciais do operon agr e das regiões contíguas upstream e downstream aos promotores de sarA de cepas pertencentes ao CEB e da RN6390.

Primers Forward (5’–3’) Reverse (5’–3’) TaºC* N°. acesso GenBank

Promotores agrP2P3

catagcactgagtccaagga agacatgcacatggtgcacat 56 X52543; AF230358

Gene agrB taaatcgtataatgacagtgag ggtgttatgtagaaagtattat 52 X52543; AF230358; AF210055

Gene agrD ttgcaagtacgattagggatg gagagtgtgatagtaggtgg 55 X52543; AF230358

Gene agrC (1º set)

aacattggtaacatcgcagc cgactatcttactgcttac 51 X52543; AF210055

Gene agrC (2º set)

agcttttttgtagtttatgtgac gtcacagtattggtattattctt 55 X52543; AF210055

Gene agrC (3º set)

tcgagaagatgacatgcctg tggaaattgccctcgcaact 55 X52543

Gene agrA (1º set)

caactagccataaggatgtga gtggcagtaattcagtgtatg 55 X52543

Gene agrA (2º set)

agttgcagcgatggattttatt gcactgtatagctggcttttt 55 X52543

Promotores sarP2

tgggtagtatgctttgacaca ctttaacgtgctatagattggt 55 U46541

Promotores sarP3

ctttaacgtgctatagattggt gcgctaaatcgtttcattaaata 55 U46541

Promotores sarP1

gcgctaaatcgtttcattaaata gggcaaatgtatcgagcaag 55 U46541

*Ta°C, temperatura de anelamento dos primers forward e reverse para a amplificação através de PCR dos fragmentos de DNA que foram seqüenciados.

68

Tabela 5. Análise da produção de biofilme nas amostras de Staphylococcus aureus estudadas.

Amostras Tipo Clonala Unidade de biofilme (UB)

Fenótipo do biofilmeb

BE04 CEB A1 0,844 Moderado

BE08 CEB A1 0,433 Fraco

BE36 CEB A1 1,032 Forte

BE38 CEB A1 3,483 Forte

BE49 CEB A1 0,315 Fraco

BE62 CEB A1 3,983 Forte

BE80 CEB A1 0,315 Fraco

BE96 CEB A1 4,682 Forte

BE97 CEB A1 0,899 Moderado

BE100 CEB A1 0,518 Moderado

BE105 CEB A1 1,017 Forte

BMB9393 CEB A1 2,612 Forte

GV02 CEB A1 0,313 Fraco

GV04 CEB A1 0,230 Fraco

GV11 CEB A1 2,389 Forte

GV12 CEB A1 5,220 Forte

GV13 CEB A1 0,258 Fraco

GV14 CEB A1 3,686 Forte

GV17 CEB A1 0,671 Moderado

GV24 CEB A1 2,336 Forte

GV39 CEB A1 1,861 Forte

GV48 CEB A1 2,507 Forte

GV49 CEB A1 1,510 Forte

GV50 CEB A1 4,303 Forte

GV51 CEB A1 3,902 Forte

GV56 CEB A1 1,618 Forte

GV57 CEB A1 2,216 Forte

GV61 CEB A1 1,806 Forte

GV65 CEB A1 3,897 Forte

GV66 CEB A1 3,197 Forte

GV69 CEB A1 0,903 Moderado

GV73 CEB A1 3,705 Forte

GV74 CEB A1 3,869 Forte

GV83 CEB A1 0,925 Forte

GV84 CEB A1 1,400 Forte

GV87 CEB A1 3,477 Forte

GV88 CEB A1 3,652 Forte

69

GV93 CEB A1 1,823 Forte

GV94 CEB A1 1,921 Forte

GV111 CEB A1 0,554 Moderado

GV112 CEB A1 1,572 Forte

GV113 CEB A1 0,606 Moderado

GV121 CEB A1 2,096 Forte

GV122 CEB A1 5,429 Forte

GV128 CEB A1 0,048 NP

GV130 CEB A1 3,329 Forte

GV131 CEB A1 1,991 Forte

GV150 CEB A1 2,054 Forte

GV152 CEB A1 1,511 Forte

GV153 CEB A1 1,519 Forte

BE03 CEB não-A1 2,663 Forte

BE15 CEB não-A1 0,783 Moderado

BE24 CEB não-A1 3,781 Forte

BE33 CEB não-A1 0,310 Fraco

BE37 CEB não-A1 3,407 Forte

BE46 CEB não-A1 0,958 Forte

BE61 CEB não-A1 0,662 Moderado

BE131 CEB não-A1 0,069 NP

BE171 CEB não-A1 0,395 Fraco

BE172 CEB não-A1 1,427 Forte

BE214 CEB não-A1 0,115 NP

BE216 CEB não-A1 0,154 NP

HC34 CEB não-A1 0,136 NP

HC76 CEB não-A1 0,368 Fraco

HC83 CEB não-A1 0,335 Fraco

HC97 CEB não-A1 0,266 Fraco

HC144 CEB não-A1 1,035 Forte

HC146 CEB não-A1 0,272 Fraco

HC173 CEB não-A1 0,403 Fraco

HC176 CEB não-A1 0,363 Fraco

HC178 CEB não-A1 0,320 Fraco

HC262 CEB não-A1 0,499 Moderado

HC290 CEB não-A1 0,241 Fraco

HC298 CEB não-A1 0,267 Fraco

HC299 CEB não-A1 0,237 Fraco

HC333 CEB não-A1 0,296 Fraco

70

HC355 CEB não-A1 0,728 Moderado

HC387 CEB não-A1 0,212 NP

HC489 CEB não-A1 0,239 Fraco

HC534 CEB não-A1 0,208 NP

HC556 CEB não-A1 0,417 Fraco

HC618 CEB não-A1 0,222 NP

HC648 CEB não-A1 0,349 Fraco

HC731 CEB não-A1 0,195 NP

HC796 CEB não-A1 0,293 Fraco

HC879 CEB não-A1 0,235 Fraco

HC916 CEB não-A1 0,278 Fraco

HC946 CEB não-A1 1,406 Forte

HC956 CEB não-A1 0,383 Fraco

HC1043 CEB não-A1 0,344 Fraco

HC1110 CEB não-A1 0,400 Fraco

HC1197 CEB não-A1 0,246 Fraco

HC1215 CEB não-A1 0,318 Fraco

HC1301 CEB não-A1 0,251 Fraco

HC1302 CEB não-A1 0,330 Fraco

HC1329 CEB não-A1 0,262 Fraco

HC1335 CEB não-A1 0,862 Moderado

HC1340 CEB não-A1 0,683 Moderado

HC1590 CEB não-A1 1,995 Forte

HC1657 CEB não-A1 0,693 Moderado

BE12 CE 1,954 Forte

BE48 CE 0,093 NP

BE68 CE 0,243 Fraco

BE71 CE 0,500 Moderado

BE75 CE 0,611 Moderado

BE91 CE 1,526 Forte

BE122 CE 0,063 NP

BE126 CE 0,739 Moderado

BE135 CE 0,391 Fraco

BE168 CE 3,062 Forte

BE176 CE 1,350 Forte

BE177 CE 1,066 Forte

BE178 CE 0,120 NP

BE187 CE 0,181 NP

BGH8161 CE 0,479 Moderado

71

BGH8371 CE 1,379 Forte

BGH8381 CE 1,002 Forte

BIMC6853 CE 0,325 Fraco

BMB6192 CE 0,317 Fraco

BMB9092 CE 0,472 Moderado

BMB11492 CE 1,036 Forte

BMB13192 CE 1,333 Forte

BMB13392 CE 0,359 Fraco

BMB13792 CE 0,893 Moderado

C36/93 CE 0,389 Fraco

C53/93 CE 0,618 Moderado

CPH16927 CE 0,509 Moderado

CPH16939 CE 0,882 Moderado

CPH18630 CE 0,451 Fraco

E840/92 CE 0,388 Fraco

F296 CE 1,568 Forte

FH1203 CE 0,368 Fraco

FHMC17835 CE 1,349 Forte

HC460 CE 0,229 NP

HC462 CE 0,590 Moderado

HC476 CE 0,190 NP

HC568 CE 0,340 Fraco

HC574 CE 0,219 NP

HC619 CE 0,212 NP

HC753 CE 0,253 Fraco

HC913 CE 0,209 NP

HC1241 CE 0,417 Fraco

HC1394 CE 0,308 Fraco

HC1473 CE 0,631 Moderado

HC1627 CE 0,270 Fraco

HU22 CE 1,409 Forte

HU30 CE 0,421 Fraco

HU34 CE 0,383 Fraco

HU35 CE 0,255 Fraco

HC05 MSSA 0,214 NP

HC40 MSSA 0,236 Fraco

HC68 MSSA 0,310 Fraco

HC105 MSSA 0,834 Moderado

HC127 MSSA 3,041 Forte

72

HC143 MSSA 0,185 NP

HC150 MSSA 0,240 Fraco

HC152 MSSA 0,112 NP

HC168 MSSA 0,378 Fraco

HC170 MSSA 0,302 Fraco

HC243 MSSA 0,275 Fraco

HC290 MSSA 0,158 NP

HC296 MSSA 0,381 Fraco

HC356 MSSA 0,190 NP

HC367 MSSA 0,246 Fraco

HC395 MSSA 1,826 Forte

HC397 MSSA 2,918 Forte

HC410 MSSA 0,316 Fraco

HC435 MSSA 0,204 NP

HC441 MSSA 0,145 NP

HC449 MSSA 0,347 Fraco

HC459 MSSA 0,236 Fraco

HC473 MSSA 0,256 Fraco

HC474 MSSA 0,418 Fraco

HC520 MSSA 0,246 Fraco

HC554 MSSA 1,825 Forte

HC560 MSSA 0,314 Fraco

HC569 MSSA 0,534 Moderado

HC577 MSSA 0,298 Fraco

HC587 MSSA 0,622 Moderado

HC595 MSSA 0,248 Fraco

HC609 MSSA 0,474 Moderado

HC642 MSSA 0,226 NP

HC654 MSSA 0,654 Moderado

HC660 MSSA 0,308 Fraco

HC668 MSSA 0,687 Moderado

HC677 MSSA 0,204 NP

HC680 MSSA 0,175 NP

HC706 MSSA 0,262 Fraco

HC708 MSSA 0,192 NP

HC713 MSSA 0,266 Fraco

HC716 MSSA 1,041 Forte

HC723 MSSA 0,366 Fraco

HC724 MSSA 0,491 Moderado

73

HC742 MSSA 0,133 NP

HC752 MSSA 0,387 Fraco

HC764 MSSA 0,312 Fraco

HC921 MSSA 0,270 Fraco

HC1017 MSSA 0,262 Fraco

HC1080 MSSA 0,065 NP

aCEB A1: amostras de MRSA do CEB apresentando o perfil de PFGE predominante (A1); CEB não-A1: amostras de MRSA pertencentes a subclones do CEB (perfil de PFGE diferindo de 1 a 6 bandas do perfil do CEB A1); CE: amostras de MRSA pertencentes a clones esporádicos (raramente detectados em hospitais e com perfil de PFGE diferindo em mais de 6 bandas do perfil do CEB A1); MSSA: amostras de S. aureus susceptíveis à meticilina. bFenótipo do biofilme: classificação do fenótipo de produção de biofilme com base na comparação da maior leitura da UB do biofilme (0,115) da amostra de S. pyogenes 75194. NP: amostras de S. aureus não produtoras de biofilme (UB ≤ 0,230); Fraco: amostras de S. aureus fracamente produtoras de biofilme (UB ≥ 0,231 e ≤ 0,459); Moderado: amostras de S. aureus moderadamente produtoras de biofilme (UB ≥ 0,460 e ≤ 0,919); Forte: amostras de S. aureus fortemente produtoras de biofilme (UB ≥ 0,920).

74

Figura 3. Distribuição das amostras de acordo com o fenótipo de biofilme detectado e fotografia dos diferentes fenótipos produzidos sobre superfície de poliestireno inerte.

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

CE CEB não-A1

Per

cent

agem

de

amos

tras

CEB A1MSSA

Fraco

Forte Moderado

S. epidermidis Branco

Não produtor

MSSA: amostras de S. aureus susceptíveis à meticilina; CE: amostras de MRSA pertencentes a clones esporádicos (raramente detectados em hospitais e com perfil de PFGE diferindo em mais de 6 bandas do perfil do CEB A1); CEB não-A1: amostras de MRSA pertencentes a subclones do CEB (perfil de PFGE diferindo de 1 a 6 bandas do perfil do CEB A1); CEB A1: amostras de MRSA do CEB apresentando um perfil de PFGE predominante (A1). Branco: TSB suplementado com glicose a 1%; S. epidermidis cepa 70D: controle positivo. Fenótipos do biofilme descritos como forte, moderado, fraco e não produtor foram atribuídos de acordo com o cálculo das Unidades de Biofilme (UB). A ilustração representativa dos fenótipos de biofilme detectados (no canto direito da figura) corresponde à acumulação de biofilme das amostras CEB A1 (GV88, forte; GV17, moderado; GV02, fraco e GV128, não produtor).

75

Figura 4. Atividade do lócus agr em cepas CEB, através da produção de δ-hemolisina.

57,2%

5,8% 5,8%

RN6390B

GV69

BMB9393

HC1302

RN6911GV13

GV12

GV17

GV48

HC76

RN4220

GV73

HC648

GV128

BMB9393

HC1301

GV65

RN4220

B

AForte atividade da δ-hemolisina Fraca atividade da δ-hemolisina Sem atividade da δ-hemolisina

CEB A1 CEB não-A1

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

CEB

(A) Distribuição do perfil de atividade da δ-hemolisina das cepas CEB em placas de agar sangue. CEB: Total de cepas CEB (com perfis de PFGE A1 e não-A1) utilizadas neste estudo; CEB A1: CEB predominante (PFGE A1); CEB não-A1: Variantes do CEB (PFGE não-A1). (B) Atividade hemolítica em agar sangue de carneiro por cepas de S. aureus. Estria vertical: cultura da cepa RN4220 (produtora da β-hemolisina); estrias horizontais: controles (RN6390B, produtora de α-, β- e δ-hemolisinas; RN6911, agr-nula; BMB9393, agr funcional) e algumas representantes CEB. Amostra HC76 e GV69 representam a inibição na produção de hemolisinas. HC1302 representante de amostra produtora de β-hemolisina. Seta verde mostra a formação da zona hemolítica lembrando a ponta de seta por amostras produtoras de δ-hemolisina. Seta amarela mostra a produção de α- e δ-hemolisinas, com a formação de uma zona clara de hemólise ao redor da semeadura bacteriana. Seta azul mostra a fraca atividade da δ-hemolisina em amostras também produtoras de α-hemolisina.

76

Figura 5. Associação entre a atividade do lócus agr, através da produção de δ-hemolisina, e o fenótipo de acumulação de biofilme em cepas CEB (PFGE A1 e não-A1).

Produtor de biofilme forte ou moderado

Produtor de biofilme fraco ou não produtor

agr funcional agr inibido

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

agr funcional: o nível de expressão do lócus agr foi avaliado através da detecção da atividade da δ-hemolisina nas amostras CEB A1 e não-A1 estudadas. agr inibido: representa a expressão atenuada, ou completamente inibida do lócus agr, através da detecção de pouca ou de nenhuma δ-hemolisina produzida pelas amostras CEB estudadas.

77

Figura 6. Experimentos de Northern-blotting utilizando RNA total de amostras de S. aureus e sondas específicas para os loci agr, sarA e 16S rrna.

GV69 BMB9393

rnaIII

sarA

16Srrna

B

rnaIII

A

1 2 3 4 5 6 7 8

(A) Northern-blotting utilizando uma sonda específica para uma região interna do rnaIIIagr. Números de 1 a 5: amostras representativas do CEB apresentando uma atenuação do agr. Números 6 e 7: amostras clínicas de MSSA apresentando o agr funcional. Número 8: amostra controle RN6390B com agr-funcional. (B) Northern-blotting utilizando sondas específicas para uma região interna do rnaIIIagr, sarA e 16S rrna. GV69 e BMB9393 (protótipos das variantes CEB A1 apresentando agr-atenuado e -funcional; respectivamente).

78

Figura 7. Alinhamento múltiplo das seqüências da região 3’ trailer do RNAIIagr demonstrando uma mutação pontual nas amostras CEB (GV69 e BMB9393) em comparação com outras amostras de S. aureus (RN6390B, RN9107 e D22).

A seqüência das amostras de S. aureus RN6390B, RN9107 e D22 estão disponíveis no GenBank sob os números de acesso X52543, DQ229854 e DQ157983, respectivamente. Destaque em cinza: mutação pontual com a substituição de uma guanina (G) por uma timina (T). Os asterísticos e os pontos representam o consenso e a continuidade das seqüências, respectivamente.

79

Figura 8. Estrutura secundária da molécula de RNAIIagr predita por análise computacional.

Representação das estruturas secundárias da molécula de RNAIIagr predita para as cepas CEB GV24, GV69 e BMB9393 (A) e para a cepa RN6390B (B). Representação, em maior aumento, das áreas alteradas das estruturas secundárias da molécula de RNAIIagr predita paras as cepas CEB (C) e para a cepa RN6390B (D).

80

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