INTRODUÇÃO À TÉCNICA HISTOLÓGICA

(TECIDOS ANIMAIS)

Sumário:

Introdução

Obtenção de preparações definitivas

Fixação

Inclusão

Cortes

Colagem dos cortes

Coloração

Montagem

Preparações que não necessitam de inclusão

Tecido epitelial

Tecido conjuntivo

Tecido cartilagíneo

Tecido ósseo

Tecido sanguíneo

Tecido muscular

Tecido nervoso

Preparação de soluções e reagentes

Solução de Ringer

Hemalumen de Mayer

Ao pretendermos estudar os tecidos animais deparamos com duas dificuldades básicas:

- os tecidos animais constituem na sua grande maioria estruturas opacas que não podem ser estudadas directamente ao microscópio.

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- falta de contraste entre os componentes dos tecidos, bem como falta de contraste entre os organitos celulares.

No primeiro caso a dificuldade pode, em grande parte, ser ultrapassada reduzindo as estruturas a cortes suficientemente finos para que sejam transparentes, ou alternativamente dissociando tanto quanto possível os componentes do tecido. A segunda dificuldade pode também em parte ser ultrapassada com auxílio de corantes selectivos.

Atendendo às limitações de material que existem na maioria das Escolas Secundárias, pensamos que a execução de cortes finos em tecidos animais e a elaboração das respectivas preparações definitivas não será viável, pelo que faremos aqui apenas uma descrição sumária destas técnicas.

Todavia, mesmo com material muito elementar é possível ilustrar certos aspectos morfológicos dos tipos básicos de tecidos. Na segunda parte deste manual descrevem-se experiências que envolvem unicamente técnicas de dissociação e coloração e que por conseguinte não requerem material sofisticado para a sua execução.

OBTENÇÃO DE PREPARAÇÕES DEFINITIVAS A PARTIR DE CORTES

A preparação de material biológico para observação ao microscópio leva algum tempo e corre-se o risco de enzimas celulares destruírem parte das estruturas que pretendíamos observar (autólise). Para impedir este processo procede-se em primeiro lugar à chamada fixação. Após a fixação o material tem de ser reduzido a cortes finos. A fraca consistência dos tecidos animais (exceptuam-se os tecidos ósseo e cartilagíneo) não permite todavia que se façam manualmente cortes finos. Assim os tecidos tem de ser previamente endurecidos, o que se consegue por congelamento ou por inclusão em celoidina ou em parafina, e em seguida cortados com auxílio de instrumentos mais ou menos sofisticados chamados micrótomos. Uma vez obtidos os cortes procede-se à coloração e montagem do material.

Fixação

A fixação consiste por um lado em matar rapidamente as células e interromper os processos autolíticos já iniciados; por outro lado endurecer parcialmente os tecidos para poderem suportar sem deformação a acção de reagentes e manipulações técnicas a utilizar posteriormente.

O fixador mais vulgar é o líquido Boiun que tem a seguinte composição:

- Formol ............................................................ 5 partes

- Soluto aquoso saturado de ácido pícrico ..........15 partes

- Ácido acético .................................................. 1 parte

As peças são deixadas 24 horas neste líquido e passam-se depois para álcool a 70º.

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Resumo da técnica de inclusão

Como já foi referido a inclusão tem por fim endurecer os tecidos para que se possam executar cortes finos. As diferentes etapas que a seguir se descrevem podem racionalizar-se assim: 1) remoção da água dos tecidos com alcoois de grau cada vez mais elevado; 2) substituição do álcool por um líquido que seja capaz de funcionar como veículo de parafina; 3) parafina. Indicamos a seguir as etapas e tempos utilizados correntemente.

primeiro dia

Deixar as peças em álcool a 70º de um dia para o outro.

segundo dia

às 9h ....................................................... álcool a 90º

11h ......................................................... álcool absoluto

12h ......................................................... renovar o álcool absoluto

13h ......................................................... xilol e álcool (partes iguais)

15h ......................................................... xilol puro

17h ......................................................... xilol c/ parafina (soluto saturado)

terceiro dia

11h ......................................................... xilol e parafina na estufa

13h ......................................................... banho de parafina mole

14h ......................................................... banho de parafina fundida na estufa

15h ......................................................... formação do bloco

Cortes

Os blocos de parafina devem ser arrefecidos em água e cortados com a forma de tronco de pirâmide. Em seguida os blocos são colocados na "cabeça do micrótomo". Esta colagem é feita por fusão da parafina da base do bloco.

A faca do micrótomo deve estar inclinada em relação ao bloco de tal modo que a face voltada para a peça seja paralela à superfície do bloco. Se a inclusão estiver bem feita, após cada movimento da peça sai um corte, e o que se segue vem colar-se ao anterior pela aresta vizinha de forma que se constituem assim fitas ou ténias de cortes.

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Colagem de cortes

Os cortes são separados da faca com um pequeno pincel ou uma agulha e em seguida são colocados sobre lâminas. A colagem faz-se geralmente com água albuminosa (albumina glicerinada) ou com uma substância conhecida pelo nome comercial de "tissue tac". A água albuminosa prepara-se da seguinte maneira: deita-se uma clara de ovo num copo graduado, adiciona-se igual volume de glicerina, agita-se até à homogeneização e filtra-se.

Para se efectuar a colagem procede-se da seguinte maneira: coloca-se uma gota de substância colante, espalha-se e espera-se que seque. Seguidamente coloca-se uma gota de água e sobre ela o corte. Escorre-se a água e leva-se a lâmina à chama de uma lamparina para que o corte distenda, mas evitando a fusão da parafina.

Coloração

Para se proceder à coloração torna-se necessário remover a parafina e hidratar os cortes. A sequência que se utiliza neste passo é pois inversa da inclusão:

- xilol para desparafinar

- álcool a 90º para remover o xilol

- álcool a 70º

- hidratação com água destilada

- coloração e lavagem

Existem várias técnicas de coloração. A que a seguir indicamos é uma das mais simples e em regra dá bons resultados. Na etapa de coloração distinguem-se duas fases: coloração nuclear e coloração citoplasmática. Para a coloração dos núcleos filtram-se umas gotas de hemalúmen sobre os cortes, aguarda-se 15 minutos, escorre-se o corante e lava-se com água. Para a coloração citoplasmática pode utilizar-se soluto de eosina que se deixa actuar o tempo necessário para o aparecimento de um tom róseo, escorre-se o corte e lava-se com água.

Montagem

A montagem, última fase das preparações definitivas, é feita em bálsamo do Canadá ou em euparal, substâncias que são insolúveis em água. Daí que após a coloração se torna necessário desidratar os cortes como se indica a seguir:

- álcool a 70º

- álcool absoluto

- xilol

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- bálsamo ou euparal

- colocação da lamela

 PREPARAÇÕES QUE NÃO NECESSITAM INCLUSÃO

Seguidamente descrevem-se algumas preparações que podem ser facilmente executadas em qualquer Escola Secundária uma vez que não requerem micrótomos ou outro material sofisticado.

Tecido epitelial

Um material de fácil obtenção para ilustração da morfologia do epitélio pavimentoso é a camada superficial da pele da rã. Efectivamente os Batráquios largam e renovam com grande facilidade a camada superficial da pele. Para o efeito proceder da seguinte maneira:

1. Deixar uma ou mais rãs num recipiente com água durante 2 ou 3 dias à temperatura ambiente. Notar-se-á o aparecimento de farrapos epiteliais. Caso isso não aconteça, tentar raspar com um escalpelo o ventre da rã dentro de água.

2. Com um pincel recolher alguns farrapos e agitá-los em água. Com duas agulhas estendê-los sobre uma lâmina de maneira a obter uma preparação sem pregas.

3. Colocar uma gota de água, cobrir com uma lamela e observar.

Se se pretender obter uma preparação definitiva fazer o seguinte:

4. Estender um fragmento de epitélio numa lâmina e deitar sobre esta umas gotas de álcool a 90º. Deixar actuar 5-10 minutos (fixação).

5. Lavá-lo com água. Adicionar umas gotas de hemalúmen (ver "Preparação de Soluções e Corantes").

6. Passados 10 minutos lavar novamente o fragmento de epitélio agitando-o dentro de água. recolhê-lo com a lâmina e corá-lo com eosina por mais 10 minutos (coloração).

7. Lavá-lo e estendê-lo outra vez sobre a lâmina.

8. Deitar sobre o fragmento umas gotas de álcool a 90º e renovar o álcool por várias vezes. repetir este processo utilizando agora álcool absoluto (desidratação).

9. Esclarecer com xilol (diafinização), com duas agulhas secas estender o fragmento de modo a evitar pregas.

10. Montar a preparação utilizando bálsamo ou euparal.

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Tecido conjuntivo propriamente dito

Os aspectos genéricos da morfologia do tecido conjuntivo propriamente dito podem ser estudados utilizando a variedade tecido conjuntivo frouxo. Para o efeito proceder da seguinte forma:

1. Sacrificar um coelho. Fazer uma incisão na pele da linha média do abdómen. Puxar com as mãos, rasgando a pele em direcção às patas posteriores. Notar-se-ão finas lamelas de tecido subcutâneo que ligam a pele às aponevroses do músculo. Estas lamelas aparecem com maior dimensão na região posterior da perna do animal.

2. Introduzir uma lamela, bem limpa e desengordurada, sob uma destas membranas conjuntivas de modo que ela adira à superfície do vidro. Quando o tecido tiver aderido cortá-lo em torno da lamela e dobrar as margens que excederam esta, para que o tecido continue distendido durante as fases subsequentes.

3. Fixar com umas gotas de álcool a 90º.

4. Lavar com água e corar com hemalúmen e eosina conforme descrito na preparação anteriror.

Se se pretender uma preparação definitiva proceder conforme foi explicado na preparação anterior.

Tecido cartilagíneo

A estrutura básica do tecido cartilagíneo pode ser estudada utilizando a cartilagem hialina do externo da rã ou a cartilagem que recobre superfícies articulares. No primeiro caso proceder assim:

1. Cortar as partes inferior ou superior do externo da rã.

2. Colocar um fragmento de tecido numa gota de soluto isotónico de NaCl (0,15 M) e cobrir com uma lamela.

No caso de se pretender utilizar uma cartilagem articular proceder assim:

1. Com uma navalha de barba bem afiada (alternativamente com uma lâmina de bisturi ou uma lâmina do tipo "Gillette") fazer cortes tão finos quanto possível na cartilagem que se encontra na extremidade do fémur da rã.

2. Montar e examinar como no caso anterior.

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Se se pretender uma preparação corada fixar com o fixador de Boiun e corar com hemalúmen e eosina conforme descrito anteriormente.

Tecido ósseo

Esta preparação é um pouco morosa e requer muita paciência.

1. Com uma serra de dente muito fino cortar, longitudinalmente ou transversalmente, lâminas delgadas (< 1mm) de um osso seco.

2. Colocar o fragmento do osso entre dois pedaços de pedra pomes, com faces planas, ou entre duas pedras de afiar. Adelgaçar o fragmento raspando-o com duas pedras até ficar praticamente transparente.

3. Montar o fragmento em bálsamo do Canadá ou em euparal. No caso de utilizar bálsamo deve aquecer a Lâmina, tendo todavia o cuidado de não deixar que o bálsamo fique demasiado líquido para que não penetre nas cavidades ósseas.

  Tecido sanguíneo

A técnica mais correntemente utilizada para observação das células do sangue é conhecida pela designação de esfregaço:

1. Limpar a ponta de um dedo (de preferência o anelar da mão menos utilizada) com algodão embebido em álcool ou éter. Picar a parte desinfectada com uma agulha ou uma lanceta esterilizada e desprezar a 1ª gota de sangue.

2. Colocar uma gota de sangue a cerca de 1 cm da extremidade de uma lâmina que tenha permanecido em álcool durante algumas horas.

3. Encostar uma lâmina de bordos esmerilados à lâmina normal de maneira que as duas formem um ângulo de 45º. Fazer deslizar a Lâmina de bordos esmerilados até que ela contacte com a gota de sangue. Aguardar que o sangue se estenda ao longo da aresta; em seguida deslocar a Lâmina em sentido inverso, sem interrupções e mantendo o ângulo de 45º.

4. Secar o esfregaço ao ar.

5. Cobrir o esfregaço com 5 gotas de reagente de Wright e deixar actuar por 2,5 minutos. Adicionar umas gotas de água, homogeneizar a mistura e deixar actuar 3 a 4 minutos.

6. Escorrer o corante e lavar com água destilada.

7. Secar ao ar.

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Se pretender obter uma preparação definitiva basta colocar uma gota de bálsamo do Canadá ou de euparal, cobrir com uma lamela e deixar secar alguns dias.

Tecido muscular

O tecido muscular liso pode ser estudado por observação directa da bexiga de um Batráquio.

1. Sacrificar uma rã. Abrir a cavidade abdominal tendo o cuidado de não cortar a bexiga. Cortar a bexiga no ponto em que ela se liga à cloaca. Se a bexiga estiver cheia melhor será, pois isso facilita as operações subsequentes. Neste caso dever-se-á, com auxílio de um fio, dar um nó para que o órgão seja extraído com líquido.

2. Abrir a bexiga no sentido do comprimento e encostar-lhe uma lamela fazendo o possível para que a face interna fique voltada e colada à lamela.

3. Montar o conjunto numa lâmina contendo uma gota de NaCl (0,15 M).

Para um estudo simples do tecido muscular estriado poder-se-á utilizar um fragmento do músculo das patas posteriores do animal sacrificado na preparação anterior.

1. cortar um pedacinho de músculo de uma pata posterior da rã. Dissociar rapidamente com auxílio de duas agulhas numa gota de NaCl (0,15 M). Cobrir com uma lamela e observar.

2. Os núcleos podem ser tornados mais evidentes removendo a solução de NaCl e adicionando agora uma gota de ácido acético a 1%.

Tecido nervoso

O estudo do tecido nervoso pode ser acompanhado da execução de duas preparações muito simples: dissociação de células da medula de boi (ilustração de tipos de células de tecido nervoso); dissociação do nervo ciático da rã (ilustração da estrutura de um nervo).

Para a dissociação das células da medula de boi proceder assim:

1. Obter uma secção de medula de boi e cortá-la transversalmente de modo a conseguir alguns fragmentos com 2-3 mm de espessura. Colocar os fragmentos em álcool a 30% durante 24 h.

2. Com auxílio de uma agulha retirar pedacinhos de substância cinzenta da "zona dos corpos anteriores" de um dos fragmentos. Introduzir o material retirado num tubo de ensaio contendo água até 1/4 da sua altura.

3. Tapar o tubo e agitá-lo fortemente. Juntar em seguida umas gotas de picro-carmim.

4. Uma hora depois adicionar algumas gotas de ácido ósmico a 1%.

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5. Decorridas algumas horas decantar o sobrenadante e lavar o sedimento várias vezes com água destilada.

6. Após a última lavagem deixar o material sedimentar novamente. Com auxílio de uma pipeta retirar uma gota do fundo e colocá-la numa lâmina, cobrir com uma lamela e observar.

Para estudar a estrutura do nervo ciático da rã proceder como se indica a seguir:

1. Sacrificar uma rã, tirar a pele dos membros posteriores e dissecar os músculos com auxílio de 2 agulhas. Ver-se-á aparecer um "cordão" branco-amarelado que é o nervo ciático.

2. Seccionar o nervo na parte superior e inferior e com o auxílio de um palito colocá-lo num frasco contendo ácido ósmico a 1% (evitar aqui o contacto com objectos metálicos com o ácido ósmico).

3. No dia seguinte retirar o nervo e lavá-lo com água numa tina pequena. Cortá-lo em 3 ou 4 fragmentos e colocar um deles numa lâmina contendo uma gota de água.

4. Prender uma das pontas do fragmento com uma agulha e dissociar longitudinalmente com outra.

5. Retirar o excesso de água e observar.

 

PREPARAÇÃO DE SOLUÇÕES E CORANTES

Solução de Ringer

Podem-se preparar várias soluções de Ringer de acordo com o material em que vão ser usadas. Todas elas são soluções isotónicas tamponadas, isto é, amortecedoras das variações de pH.

Para preparar 1 litro de solução de Ringer para tecidos de rã:

1. Pesar: 0,42 g de cloreto de potássio

0, 24 g de cloreto de cálcio

0, 20 g de bicarbonato de sódio

7,50 g de cloreto de sódio

2. Dissolver em água;

3. Acertar o volume com água até 1 litro.

Hemalumen de Mayer

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hematoxilina cristalizada .............................. 1 g

iodato de sódio ou de potássio ..................0,2 g

alúmen de potássio ....................................50 g

água destilada ........................................1000 g

 

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