Introduo Anlise Fitoqumica

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Introduo Anlise Fitoqumica Os produtos naturais possuem um papel importante, sendo uma das principais fontes de novas drogas nos prximos anos, pelas seguintes razes: a) incomparvel diversidade estrutural, b) pequenas dimenses relativas de muitas molculas (peso molecular < 2000 Da), c) grande variedade de propriedades farmacolgicas, como a capacidade de ser absorvida e metabolizada. Produtos naturais so metablitos secundrios extrados de plantas, organismos marinhos, microorganismos e animais. O isolamento de produtos naturais ainda necessrio e urgente: - estado da arte: metodologias para os processos de separao e fracionamento. Planta: milhares de componentes - Isolamento: combina vrias tcnicas de separao - Dependem da solubilidade, volatilidade e estabilidade dos compostos a serem separados Por qu estudar plantas? Possuem centenas de compostos, Produtos naturais biologicamente ativos constituem modelos para a sntese de um grande nmero de frmacos, Diversidade em termos de estrutura e de propriedades fsicoqumicas e biolgicas, Estima-se que apenas 10% das plantas tenham sido estudadas fitoquimicamente, O Brasil o pas com maior diversidade gentica vegetal do mundo, com mais de 55.000 espcies catalogadas. Mercado Mundial Drogas de origem vegetal movimentam um mercado de US$ 12,4 bilhes. Europa responsvel por 50% do mercado. Fitofrmacos e fitoterpicos so responsveis por 25% do receiturio mdico em pases desenvolvidos e 80% em pases em desenvolvimento. 1983-1994 nos EUA - 520 frmacos aprovados pelo FDA - 157 (30%) produtos naturais ou derivados - 61% dos frmacos anticncer derivados de produtos naturais 1996 no Brasil - US$ 8 bilhes de faturamento na indstria farmacutica - 25% originados de medicamentos derivados de plantas Pesquisa Fitoqumica: - Conhecer os constituintes qumicos de espcies vegetais. - Avaliar a presena dos mesmos. Anlise Fitoqumica Preliminar: - Pode indicar os grupos de metablitos secundrios relevantes em uma espcie. Etapas da Pesquisa Fitoqumica: Coleta do material vegetal Preparao do material vegetal Extrao Anlise fitoqumica preliminar Fracionamento Isolamento Elucidao estrutural Coleta do material vegetal Primeira etapa da investigao fitoqumica. essencial que se prepare uma exsicata para identificao botnica. - Evitar partes afetadas por doenas, parasitas e materiais estranhos. Registrar local, hora e data da coleta. Mesmo utilizando material fresco, h necessidade de preparao de exsicata. Preparao do material vegetal Material fresco - Deteco de alguns componentes especficos. - Vantagem: evita a presena de substncias oriundas do metabolismo de morte da planta. - Desvantagem: deve ser processado imediatamente ou conservado a baixas temperaturas. Material seco - Vantagem: maior estabilidade qumica. - Desvantagem: cuidados especiais para interromper o metabolismo aps coleta da planta. a) Estabilizao e secagem: Estabilizao: a desnaturao protica das enzimas celulares, seja por ao de agentes desidratantes quanto pelo calor. Objetivo: impedir a ao enzimtica, evitando a alterao de compostos qumicos originalmente presentes na amostra. Secagem: a retirada de gua da planta. Objetivos: impedir reaes de hidrlise e de crescimento microbiano. A umidade residual depende do tipo de rgo que constitui o material vegetal. A secagem se caracteriza pela exposio a temperaturas relativamente baixas, normalmente inferiores a 60C, por longo perodo de tempo, geralmente em torno de 7 dias. O material deve ser finamente dividido e disposto em camadas finas. A secagem pode ser feita ao ar livre ou em estufas. Secagem ao ar livre - mais econmica, - Maior vigilncia para garantir uniformidade das condies, - Deve ser realizada sombra,

- Local seco e protegido de ataque de insetos ou contaminantes ambientais. Secagem em estufas - Utiliza-se estufas equipadas com termostato produzindo ar quente, - Manuteno da temperatura constante durante a secagem, - Estufas equipadas com sistema de circulao de ar so mais eficazes. - A secagem propicia a reduo de peso e volume e facilita a moagem dos materiais. b) Moagem: Reduo do material vegetal mecanicamente a fragmentos de pequenas dimenses. A escolha da dimenso do material vegetal depende da textura do rgo. Quanto mais rgido forem os tecidos, maior o grau de diviso necessrio. As metodologias utilizadas para reduzir o tamanho do material vegetal so escolhidas conforme as caractersticas deste. Diviso grosseira: - Seccionamento: tesouras, podes ou facas - Impacto: Reduo a fragmentos por meio de choques repetidos ( por exemplo, no gral) - Rasurao: raspadores ou processadores de alimentos. Pulverizao: - Com gral: empregando ou no um intermedirio de pulverizao. - Moinhos: pinos, jato de ar, discos, martelos, facas. Extrao Extrao significa retirar, de forma mais seletiva e completa possvel, as substncias ou frao ativa contida na droga vegetal, utilizando, para isso, um lquido ou mistura de lquidos apropriados e toxicologicamente seguros. O produto resultante dessa extrao slido-lquido chamada de soluo extrativa, que no deve ser confundida com o produto de uma extrao lquido-lquido, quando so obtidas fraes enriquecidas ou substncias purificadas. Fatores que afetam a operao de extrao: - Caractersticas do material vegetal, - Grau de diviso do material vegetal, - O meio extrator (solvente), - Metodologia. Anlise fitoqumica preliminar Classicamente, a caracterizao dos principais grupos de substncias vegetais de interesse tem sido conseguida pela realizao de reaes qumicas que resultem no desenvolvimento de colorao e/ou precipitao caractersticos. As reaes feitas diretamente com o extrato bruto podem mascarar o resultado. O fracionamento do extrato e o teste com as fraes obtidas possibilita reaes mais ntidas. A amostra pode precisar de um tratamento preliminar: a) Partio de substncias entre duas fases imiscveis, uma aquosa e outra orgnica, b) Formao de sais com diferenas de solubilidade em relao s bases ou aos cidos que lhes deram origem. Com o avano dos mtodos de extrao e isolamento, na maioria das vezes, desnecessrio submeter extratos vegetais a tratamentos qumicos preliminares. Fracionamento e Isolamento Os processos de fracionamento de extratos vegetais com vistas ao isolamento de substncias ativas podem ser monitorados por ensaios direcionados para a avaliao de atividade biolgica. Fracionamento: o processo em que se consegue uma frao parcialmente pura, ou seja, obtm-se um grupo de substncias. Isolamento: o processo em que se consegue uma substncia ou composto puro. Para o fracionamento e isolamento das substncias tm-se dois grupos de mtodos que so mais comuns: Partio por solventes: mais simples e barata, sendo utilizada para vrias finalidades. Mtodos cromatogrficos: so mais variados, podendo ser utilizados para o fracionamento, purificao e isolamento das substncias. Elucidao estrutural Os primeiros pesquisadores que se dedicaram elucidao estrutural das substncias no dispunham das tcnicas de anlise disponveis atualmente. As tcnicas atuais permitem a elucidao de estruturas extremamente complexas, com amostras da ordem de miligramas ou menos. Os pioneiros levavam s vezes anos tentando purificar e identificar uma nica substncia. Os mtodos eram pouco sensveis. Consumiam grandes quantidades de amostras, pois ela precisava ser submetida a transformaes qumicas diversas. Entre os mtodos fsicos de anlise empregados atualmente na determinao estrutural esto: A Espectrometria de Massas (EM). A espectroscopia no Ultravioleta (UV), Visvel e no Infravermelho (IV). A Ressonncia Magntica Nuclear de Hidrognio e de Carbono 13 (RMN de 1H e de 13C). a) Espectroscopia no Infravermelho (IV) O espectro no Infravermelho (IV) de uma substncia orgnica corresponde ao conjunto de bandas de absoro apresentadas pela amostra submetida radiao infravermelha e estas bandas correspondem s mudanas na energia vibracional dos compostos. A energia seletivamente absorvida da radiao IV provoca alteraes transitrias nas ligaes interatmicas que podem sofrer estiramentos ou deformaes nos ngulos de ligao. Diversos grupos funcionais vibram e do origem a bandas de absoro caractersticas. Cada grupo absorve luz em freqncia especfica. Aprender reconhecer algumas bandas de absoro mais notveis.

As freqncias em que ocorrem as vibraes dependem da natureza das ligaes em particular, mas so tambm afetadas pela vizinhana qumica e pela molcula como um todo. A presena de insaturaes (conjugadas ou no), sistemas aromticos e grupos funcionais especficos pode ser verificada atravs de bandas caractersticas, que tm grande importncia na anlise estrutural. b) Espectroscopia de RMN de 1H e de 13C A espectroscopia de RMN de 1H e de 13C uma das ferramentas mais valiosas para a determinao estrutural de compostos orgnicos contribuindo para o esqueleto da molcula. Permite a caracterizao de ncleos individuais e muito importante para a elucidao estrutural de todas as classes de produtos naturais, incluindo metablitos secundrios vegetais. Ressonncia magntica nuclear basicamente uma outra forma de espectroscopia de absoro. Campo magntico aplicado _ absoro de radiao eletromagntica na regio de radiofrequncia. Espectro de RMN um registro grfico das frequncias dos picos de absoro contra suas intensidades. Os espectros de RMN de 1H e de 13C so os mais utilizados e sua interpretao permite caracterizar o nmero e os tipos de tomos de H e de C, em funo da localizao e do desdobramento dos sinais correspondentes absoro de energia eletromagntica. Os espectros de RMN de 1H e de 13C so os mais utilizados e sua interpretao permite caracterizar o nmero e o tipos de tomos de H e de C, em funo da localizao e do desdobramento dos sinais correspondentes absoro de energia eletromagntica. A grande variedade de tcnicas disponveis de RMN (COSY, NOESY, HMQC, HSQC, HMBC, INEPT) permite identificar a proximidade espacial ou mesmo conectividade de alguns tomos em particular, auxiliando dessa maneira, na montagem do quebracabea constitudo pelas diferentes partes da molcula. c) Espectroscopia no Ultravioleta (UV) A espectroscopia no Ultravioleta (UV) basicamente mais uma tcnica de absoro, sendo simples e rpida. Uma vez determinado o esqueleto carbnico e o tipo de molcula, indica a presena de certos grupos funcionais, bem como a posio dos substituintes na molcula. uma tcnica muito til para flavonides, porque proporciona informaes sobre a presena e a posio de grupamentos hidroxila no sistema de anis, ao mesmo tempo em que possibilitam a diferenciao entre os vrios tipos de flavonides. uma tcnica utilizada tanto para a deteco quanto para o monitoramento da pureza de derivados flavnicos durante o processo de isolamento. d) Espectrometria de Massas (EM) A espectrometria de massas juntamente com a espectroscopia de RMN de 1H e de 13C uma das ferramentas mais valiosas para a determinao estrutural de compostos orgnicos. Permite determinar a massa molecular e a frmula molecular de uma substncia, alm de certas caractersticas estruturais como os padres de fragmentao. A massa molecular permite estabelecer a frmula molecular da substncia, enquanto o padro de fragmentao pode ajudar a caracterizar a presena, bem como a localizao de certos grupos funcionais e cadeias laterais. A espectrometria de massas utiliza apenas uma pequena quantidade de amostra, sendo rpida e simples. A grande desvantagem por ser uma tcnica cara. Das tcnicas instrumentais a nica que no envolve radiao eletromagntica, por isso chamada de espectrometria. Mtodos de Extrao Extrao significa retirar, de forma mais seletiva e completa possvel, as substncias ou frao ativa contida na droga vegetal, utilizando, para isso, um lquido ou mistura de lquidos apropriados e toxicologicamente seguros. O produto resultante dessa extrao slido-lquido chamada de soluo extrativa, que no deve ser confundida com o produto de uma extrao lquido-lquido, quando so obtidas fraes enriquecidas ou substncias purificadas. Fatores que afetam a operao de extrao: - Caractersticas do material vegetal, - Grau de diviso do material vegetal, - O meio extrator (solvente), - Metodologia. Grau de diviso do material vegetal: - Influencia diretamente a eficincia da extrao, - Consistncia das partes da planta bastante heterognea (razes e caules so muito compactos, enquanto folhas e flores so mais delicadas), - O poder de penetrao do solvente depende da consistncia do tecido que forma o material vegetal (quanto mais rgido, mais difcil a extrao), - Quanto mais rgido o material, menor deve ser sua granulometria. Solvente: - Deve ser o mais seletivo possvel, - Extrai-se apenas substncias desejadas ou em maior quantidade, - O conhecimento do grau de polaridade do grupo de substncias que se deseja extrair determina o solvente ou mistura de solventes que mais se aproxima do timo de seletividade para aquela extrao.

- Quando no se conhece previamente o contedo do material, faz-se sucessivas extraes com solventes de polaridades crescentes, uma extrao fracionada, obtendo-se substncias com polaridades tambm crescentes. - Poucas substncias lquidas so utilizadas na extrao de drogas vegetais, - Fatores importantes: propriedades extrativas, toxicidade ou risco de manuseio, disponibilidade e custo do solvente. - Propriedades extrativas Compreendem a eficincia e seletividade com que o lquido extrator dissolve, temperatura ambiente, uma substncia de interesse, dependendo sobretudo dos parmetros de solubilidade do solvente e do soluto. Praticamente todos os constituintes de interesse apresentam alguma solubilidade em solues metanlicas ou etanlicas a 80%, sendo empregadas com frequncia. A gua um dos lquidos extratores mais empregados, sendo utilizada na extrao de substncias hidroflicas, como aminocidos, acares, alcalides na forma de sal, saponinas, heterosdeos flavonodicos e mucilagens. A extrao de determinadas substncias ainda pode ser infuenciada pelo pH do lquido extrator. O exemplo clssico a extrao de alcalides (natureza alcalina) com solues cidas. - Toxicidade ou risco de manuseio Solventes txicos como metanol e diclorometano devem ser pouco utilizados. O uso de clorofrmio deve ser o mnimo possvel. - Disponibilidade e custo do solvente Quanto mais abundante e mais barato o solvente, mais ele pode ser utilizado, como por exemplo, gua e etanol. Metodologia: - Os fatores relacionados aos processos de extrao dizem respeito a agitao, temperatura e tempo necessrio para execut-los. 1. Agitao: pode diminuir o tempo do processo extrativo, j que esse depende de fenmenos de difuso, 2. Temperatura: o aumento provoca um aumento da solubilidade das substncias, por isso, os processos de extrao a quente so mais rpidos. Limitao - muitas substncias so instveis em altas temperaturas, 3. Tempo de extrao: varia em funo da rigidez do material e seu estado de diviso, natureza das substncias a extrair, do solvente e emprego ou no, de agitao e temperatura. - Na escolha de um processo extrativo deve-se avaliar ainda, a eficincia, a estabilidade das substncias extradas, a disponibilidade dos meios e o custo do processo escolhido. - Uma das formas mais aceitas de classificar os processos de extrao segundo a sua eficincia: Processos de extrao parcial (extrao sem esgotamento): macerao e suas variveis, turbo-extrao. Processos de extrao exaustiva: permitem o esgotamento da matria prima, como por exemplo, percolao, a extrao em contra-corrente, etc. Mtodos de Extrao Slido-Lquido 1.Extraes a frio Os mtodos de extrao a frio a macerao e a percolao. Os mtodos so realizados a baixas temperaturas. Pode-se empregar agitao ou no. a) Macerao e metodologias derivadas: o mtodo no qual a extrao da matria-prima vegetal realizada em recipiente fechado, a baixas temperaturas, durante um perodo prolongado (horas ou dias), sob agitao ocasional e sem renovao do lquido extrator. Pela sua natureza, no conduz ao esgotamento da matria-prima vegetal, seja devido a saturao do lquido extrator ou ao estabelecimento do lquido difusional entre o meio extrator e a clula. Diversas variaes so conhecidas objetivando, essencialmente, o aumento da eficincia da extrao: Macerao dinmica: macerao feita sob agitao mecnica constante, Remacerao: quando a operao repetida utilizando o mesmo material vegetal, renovando-se apenas o lquido extrator. Os principais fatores que influenciam a eficincia da macerao esto vinculados: - Material vegetal: quantidade, natureza, teor de umidade, tamanho da partcula, capacidade de intumescimento. - Lquido extrator: seletividade e quantidade. - Sistema: proporo droga / lquido extrator, temperatura, agitao, pH, tempo de extrao. As drogas mais indicadas para serem extradas por macerao so aquelas ricas em substncias ativas que no apresentam uma estrutura celular, como gomas, resinas e alginatos. Em homeopatia, na preparao de tinturas-mes, os lquidos extratores preferidos so etanol e solues hidroetanlicas. Lquidos volteis so raramente utilizados. Solues hidroetanlicas com concentrao de etanol maior que 20% para evitar crescimento microbiano. b) Percolao e metodologias afins: Este mtodo tem como caracterstica a extrao exaustiva das substncias ativas. Na percolao, a droga vegetal moda colocada em um recipiente cnico ou cilndrico (percolador), de vidro ou de metal, atravs do qual feito passar o lquido extrator. O procedimento usual de percolao caracteriza a percolao simples e a percolao fracionada. O produto obtido o percolado. A percolao uma operao dinmica, indicada na extrao de substncias, farmacologicamente ativas, presentes em pequenas quantidades ou pouco solveis e quando o preo da droga relevante. Variaes: repercolao, percolao em bateria ou sequencial, extrao em carrossel e contra-corrente. Percolao simples: - Intumescimento da droga com o lquido extrator, durante 1 ou 2 horas, fora do percolador, - Empacotamento homogneo e no compacto do percolador, - A altura do enchimento deve ser na proporo e 5:1 em relao ao dimetro mdio do recipiente, - Velocidade de fluxo em percoladores oficinais, considerando um tamanho de partcula de 1 a 3 mm Lenta (0,5 a 1 mL/min/kg) Moderada (1 a 2 mL/min/kg) Rpida (2 a 5 mL/min/kg) - Desvantagem: quantidade de lquido extrator requerido para esgotar a droga vegetal. Soluo: uso de percoladores em srie. Percolao fracionada: - Implica na separao das duas ou trs primeiras fraes do percolado, que contm, normalmente, em torno de 75-80% das substncias passveis de extrao, das fraes seguintes mais diludas. 2. Extraes a quente em sistemas abertos

So exemplos de mtodos de extrao a quente em sistemas abertos a turbo - extrao, a infuso e a decoco. Os mtodos so realizados com aquecimento e contato com o solvente quente durante um certo perodo de tempo. a) Turbo - extrao: o mtodo no qual a extrao ocorre com simultnea reduo de tamanho de partcula, resultado da aplicao de elevadas foras de cisalhamento, geradas no pequeno espao compreendido entre o estator e um rotor de alta velocidade de 5.000 a 20.000 rpm. A reduo drstica do tamanho de partcula e o conseqente rompimento das clulas favorece a rpida dissoluo as substncias ativas. O tempo de extrao fica na ordem de minutos, com quase total esgotamento da droga vegetal. Vantagens: Simplicidade, rapidez e versatilidade do mtodo, Fcil utilizao em processamentos em pequena e mdia escala. Desvantagens: - Difcil separao da soluo extrativa por filtrao, - Gerao de calor durante o procedimento (necessidade de controlar a temperatura, restringindo o uso de lquidos volteis), - Limitao quando se trata de caules, razes e materiais de elevada dureza. b) Infuso: o mtodo no qual a extrao se d pela permanncia, durante certo tempo, do material vegetal em gua fervente, num recipiente tapado. aplicvel a partes vegetais de estrutura mole, as quais devem ser contundidas, cortadas ou pulverizadas grosseiramente, conforme a sua natureza, a fim de que possam ser mais facilmente penetradas e extradas pela gua. c) Decoco: o mtodo no qual a extrao do material vegetal se d pelo contato, durante certo tempo, com o solvente (normalmente a gua) em ebulio. um mtodo de emprego restrito, pois muitas substncias ativas so alteradas por um aquecimento prolongado. Costuma-se empreg-la com materiais vegetais duros ou de natureza lenhosa, como cascas, caule, raiz, sementes e frutos secos. 3. Extraes a quente em sistemas fechados So exemplos de mtodos de extrao a quente em sistemas fechados a extrao sob refluxo e extrao em aparelho Soxhlet. Os mtodos so realizados com aquecimento e contato com o solvente quente durante um certo perodo de tempo. a) Extrao sob refluxo: o mtodo no qual a extrao se d pelo contato do material vegetal com um solvente em ebulio, em um aparelho dotado de um recipiente, onde ser colocado o material e o solvente, acoplado a um condensador. Neste mtodo, o solvente evaporado durante o processo recuperado e volta ao conjunto. Desvantagem: as substncias ativas podem ser alteradas por um aquecimento prolongado. b) Extrao em aparelho Soxhlet: utilizada, sobretudo, para extrair slidos com solventes volteis, exigindo o emprego do aparelho de Soxhlet. Em cada ciclo de operao, o material vegetal entra em contato com o solvente renovado. Vantagens: Extrao altamente eficiente, Emprego de uma quantidade reduzida de solvente em comparao com outros mtodos extrativos. Desvantagem: as substncias ativas podem ser alteradas por um aquecimento prolongado. Anlise Fitoqumica Preliminar Para algumas substncias, em certos vegetais, pode-se realizar reaes de caracterizao diretamente sobre os tecidos do material vegetal. Entretanto, na maioria das vezes, a caracterizao de um determinado grupo de substncias presentes em um vegetal s pode ser feita aps sua extrao com um solvente adequado. Classicamente, a caracterizao dos principais grupos de substncias vegetais de interesse tem sido conseguida pela realizao de reaes qumicas que resultem no desenvolvimento de colorao e/ou precipitao caractersticos. Para algumas reaes, o extrato pode ser empregado diretamente, enquanto para outras, o solvente deve ser previamente retirado. Essas reaes podem ser realizadas em tubos de ensaio ou por deteco cromatogrfica com reagentes especficos. As reaes feitas diretamente com o extrato bruto podem mascarar o resultado. O fracionamento do extrato e o teste com as fraes obtidas possibilitam reaes mais ntidas. Um dos primeiros roteiros de anlise sistemtica de misturas complexas, foi proposto em 1850 pelo qumico belga J. S. Stas e modificado pelo farmacutico alemo F. J. Otto. O roteiro se baseia em dois princpios: a) Partio de substncias entre duas fases imiscveis, uma aquosa e outra orgnica, b) Formao de sais com diferenas de solubilidade em relao s bases ou aos cidos que lhes deram origem. O mtodo proposto por Stas e Otto adequado para substncias como alcalides, por exemplo. Entretanto, muitas substncias so sensveis a cidos e bases, o que impede o uso deste mtodo (cumarinas). Com o avano dos mtodos de extrao e isolamento, na maioria das vezes, desnecessrio submeter extratos vegetais a tratamentos qumicos preliminares. Caracterizao de algumas classes de compostos por mtodos qumicos 1.Cumarinas: - Deteco em cromatografia em camada delgada (CCD), - Aparecem manchas de cores como azul, amarela e roxa, sob ao da luz UV (360 nm), que podem ser realadas aps exposio ao vapor de amnio, ou revelao com KOH a 5% em MeOH. - Em solues alcalinas, desenvolvem colorao amarela, devido ao rompimento do anel lactnico, que revertida pela adio de soluo cida. 2. Polifenis:

- So substncias redutoras e, portanto, oxidam-se com facilidade, resultando em substncias coradas devido ao elevado grau de conjugao. - Substncias oxidantes podem ser empregadas para a caracterizao de polifenis, tais como o cloreto frrico (FeCl3), que d a colorao azul ou verde-azulada. a) Flavonides: Ensaios cromticos: - Reao de cianidina, Shinoda ou hidrogenao: consiste em adicionar um pequeno pedao de magnsio a soluo alcolica cida da substncia. Colorao passa de amarelo para vermelho. - Reao citro-brica ou Reativo de Wilson: as solues cetnicas de flavonas, flavonis e chalconas adquirem tons amarelados e fluorescncia amarelo-esverdeada quando os cidos ctrico e brico so dissolvidos em acetona, ou solues vermelho-alaranjado quando os mesmos so dissolvidos em anidrido actico. - Reao com H2SO4 concentrado: os compostos flavnicos formam sais de oxnio com cido sulfrico concentrado, que podem ser precipitados pela adio de gua. Formam fortemente amareladas, laranja a vermelho e vermelho a carmim, dependendo do tipo de flavonide. - Reao de Marini-Bettolo: o pentacloreto de antimnio em tetracloreto de carbono reage de forma anloga. As chalconas formam precipitados vermelho escuro ou violceo e, as flavonas, precipitado amarelo ou laranja. Ensaios cromatogrficos em CCD: - O adsorvente pode ser slica gel, poliamida ou celulose. - A presena de flavonides no extrato vegetal bruto pode ser caracterizada pelo aparecimento de fluorescncias sob a incidncia de luz UV (254 e 365 nm). NP / PEG (difenilboriloxietilamina 1,0% em metanol, seguida de soluo de polietilenoglicol 4000 5,0% em etanol): intensifica as fluorescncias dos flavonides quando observadas no UV a 254 nm. - Reagente de Folin-Ciocalteau (fosfomolibdato-fosfotungstato) seguido da exposio aos vapores de amnia o reagente de escolha para a deteco de flavonides, aparecendo manchas azuladas ou acinzentadas. b) Taninos: - Vrios mtodos conhecidos e tradicionais so usados para o reconhecimento de taninos: Teste com soluo de gelatina a 1%, contendo 10% de NaCl: fornece precipitado ou mesmo turvao. Precipitao com alcalides, podendo ser usado solues de cinchonina, cafena ou estricnina a 1-2%. Ensaios cromticos: - Reao com cloreto frrico (FeCl3): os taninos hidrolisveis produzem, com soluo diluda de FeCl3 em meio bsico, uma forte colorao azul, j taninos condensados em soluo aquosa resultam numa colorao verde, cuja intensidade mais fraca do que dos taninos hidrolisveis. - Reativo de Stiasny (HCl concentrado e formol): uma soluo de taninos mantida sob refluxo com HCl concentrado e formol por 30 minutos. Taninos condensados formam precipitados e so separados por filtrao. A presena de cido glico no filtrado pode ser verificada pela adio de cloreto frrico. - Reao de Borntragr: em solues alcalinas os compostos antraquinnicos adquirem intensa colorao violeta a prpura, inclusive com bases fracas como NH4OH. - Pode-se tambm borrifar uma soluo aquosa alcalina sobre a superfcie do vegetal, para caracterizar a presena de derivados hidroxiantracnicos. 3. Alcalides: - As reaes gerais para alcalides baseiam-se na formao de complexos insolveis (precipitados). - Como os resultados falso-positivos so bastante comuns para essas reaes, previamente o material a ser analisado deve ser submetido a extraes cido-base. - Os alcalides podem ser detectados por diversos mtodos: Exemplos: Observao da extino de luz UV em 254 nm, em placas de slica gel com indicador de fluorescncia. Deteco de fluorescncia em 366 nm pode ser muito til para diversos alcalides, como por exemplo, os alcalides do esporo-decenteio. - As reaes gerais empregam: Reagente de Dragendorff (soluo de iodo-bismutato de potssio em cido diludo): precipitados laranja-avermelhados. Reagente de Mayer (soluo de iodo-mercurato de potssio): precipitados brancos. Iodo-platinato de potssio: manchas violeta a azul acinzentadas. - Alcalides tropnicos: A reao mais utilizada aquela desenvolvida por Vitali e Gerard, em que uma quantidade mnima (at 0,0001 mg) de atropina, hiosciamina e escopolamina tratada com HNO3 concentrado e ao resduo obtido, adiciona-se soluo de KOH em EtOH. Desenvolvese colorao prpura, passando a vermelho escuro e, finalmente incolor. - Alcalides indlicos: Um revelador utilizado o reagente de Ehrlich, que consiste na soluo de cloreto de p-dimetilaminobenzaldedo a 5% em etanol. Desenvolve-se colorao laranja a marrom. 4.Triterpenos e esterides: - A reao de Liebermann-Burchard comumente empregada para a deteco de esterides e triterpenos, consistindo de anidrido actico e cido sulfrico concentrado. - Colorao que varia de azul ao verde. - Para a deteco de esterides insaturados, tambm pode ser empregada a reao de Salkowsky (cido sulfrico concentrado). a) Saponinas: - Para detectar a presena de saponinas, emprega-se o teste de formao de espuma, estvel na presena de cidos minerais diludos. b) Glicosdeos cardiotnicos:

- A deteco da presena de glicosdeos cardiotnicos realizada atravs de uma reao que caracteriza a existncia do ncleo esteroidal (Liebermann-Burchard), alm de outras que detectam a presena da lactona insaturada em C-17 e dos desoxi-acares. Fracionamento e Isolamento Os processos de fracionamento de extratos vegetais com vistas ao isolamento de substncias ativas podem ser monitorados por ensaios direcionados para a avaliao de atividade biolgica. Fracionamento: o processo em que se consegue uma frao parcialmente pura, ou seja, obtm-se um grupo de substncias. Isolamento: o processo em que se consegue uma substncia ou composto puro. Atualmente, o monitoramento tem sido feito por cromatografia lquida de alta eficincia acoplada a espectrometria de massas (CLAE/EM) e ressonncia magntica nuclear (CLAE/RMN) . Essa combinao possibilita direcionar as operaes de fracionamento para o isolamento de compostos considerados de maior interesse em funo dos dados espectrais. Para o fracionamento e isolamento das substncias tm-se dois grupos de mtodos que so mais comuns: Partio por solventes: mais simples e barata, sendo utilizada para vrias finalidades. Mtodos cromatogrficos: so mais variados, podendo ser utilizados para o fracionamento, purificao e isolamento das substncias. Partio por solventes um processo muito antigo. Desde tempos remotos usado com diversas variantes para extrair, por exemplo, essncias de flores. H mais de um sculo j vem sendo amplamente utilizada em diversos ramos das cincias e das tecnologias. A partio abrange uma gama de fenmenos, que se estende desde a extrao de contaminantes metlicos por solventes em plantas, do tratamento de efluentes industriais at a correlao do carter lipoflico com as propriedades biolgicas de um determinado grupo de substncias. tambm conhecida como extrao lquido-lquido. um mtodo mais simples, rpido e barato que os mtodos cromatogrficos convencionais. Utiliza-se apenas um funil de separao (ou de decantao) e os solventes apropriados para cada extrao. Pode-se iniciar o fracionamento de um extrato vegetal atravs da partio por solventes orgnicos de polaridade crescente ou atravs da partio cido-base. A extrao lquido-lquido uma tcnica em que uma soluo aquosa ou hidroalcolica colocada em contato com um segundo solvente orgnico imiscvel com o primeiro solvente, a fim de colocar a transferncia de um ou de mais de um soluto para o segundo solvente. Esse mtodo est baseado na propriedade fsica da substncia: a solubilidade. A partio implica numa dissoluo seletiva e distribuio entre as fases de dois solventes imiscveis entre si. A concentrao de cada um dos componentes em cada fase est relacionada com o coeficiente de partio ou distribuio apresentado por cada substncia. O coeficiente de partio entre dois solventes imiscveis entre si pode ser representado pela frmula. kp= concentrao do soluto na fase orgnica/concentrao do soluto na fase aquosa A partio utilizando-se mais de um solvente chamada de extrao mltipla. Os melhores rendimentos de extrao so obtidos quando o volume total de solvente a ser utilizado na partio dividido em alquotas. Mtodos cromatogrficos So os procedimentos de separao e isolamento mais amplamente utilizados atualmente. Identificao e anlise de misturas e de substncias isoladas: cromatografia analtica. Isolamento de compostos: cromatografia preparativa. A cromatografia uma tcnica de separao baseada na distribuio dos componentes de uma mistura entre um fluido (fase mvel ou eluente) e um adsorvente (fase estacionria). A fase estacionria pode ser um slido ou um lquido depositado num slido inerte, empacotado numa coluna (aberta ou fechada) ou espalhado por uma superfcie formando uma camada fina. Fase estacionria: slica gel, alumina, poliamida. Fase mvel (eluente): solvente puro ou mistura de solventes. A cromatografia de origem no termo grego chroma+graphein ganhou importncia como mtodo de separao por volta de 1903, com o botnico Mikhail Semenovich Tswett, nascido em Asti (Itlia), sendo a sua famlia de origem russa. Desenvolveu vrios trabalhos experimentais no domnio da separao de extratos de plantas por adsoro diferencial em colunas. Carbonato de clcio: fase estacionria Dissulfeto de carbono: eluente Nestes experimentos, verificou-se a formao de bandas de cores diferentes nas colunas utilizadas devido adsoro diferencial dos pigmentos corados, que migravam com velocidades diferentes e emergiam separadamente da coluna. Este investigador foi mais tarde considerado o pai da cromatografia devido sua valiosa contribuio no desenvolvimento desta tcnica. A cromatografia tem inmeras aplicaes como mtodo de separao. A cromatografia gasosa utilizada para separar componentes relativamente volteis como lcoois, cetonas, aldedos e outros. A cromatografia lquida empregada normalmente para purificar produtos farmacuticos, protenas, aminocidos, cidos nuclicos, vitaminas e esterides. CLASSIFICAO DOS PROCESSOS CROMATOGRFICOS A classificao da cromatografia, segundo o modo de separao, leva em conta os princpios fsicos e qumicos na partio dos solutos entre as 2 fases. a)Cromatografia de adsoro: As separaes ocorrem atravs de interaes eletrostticas e foras de Van Der Waals entre a fase estacionria (slido) e os componentes a separar da fase mvel (lquido ou gs). A natureza da fase estacionria pode ser muito diversa, slica gel, alumina ou celulose. b) Cromatografia de partio:

baseada nas diferenas de solubilidade dos componentes na fase estacionria (lquido) e na fase mvel (lquido). c) Cromatografia de permuta inica: A separao ocorre devido diferentes tendncias dos componentes inicos ou ionizados permutarem com ons da fase estacionria, que, assim, so deslocados para a fase mvel. A afinidade entre os ons da fase mvel e o suporte pode ser controlada por alterao do pH e da fora inica do eluente. d) Cromatografia de afinidade: Ocorre uma ligao molecular especfica e reversvel entre o soluto e um ligante imobilizado na fase estacionria. Esta tcnica utilizada especificamente para separar produtos biolgicos. Ex. ligaes enzimas-substratos, anticorpos com substratos e receptores de hormnios. e) Cromatografia por excluso molecular, denominada tambm como filtrao em gel ou separao por peneiras moleculares: Separa os componentes segundo o tamanho efetivo (raio hidrodinmico) das molculas. Molculas grandes no penetram no interior do suporte (partculas porosas de gel) e movem-se mais rapidamente ao longo da coluna de onde emergem primeiro. As molculas pequenas tm a sua velocidade de deslocamento retardada porque penetram no gel, portanto, emergem da coluna mais tardiamente. A classificao da cromatografia, segundo a natureza da fase mvel, no leva em conta a fase estacionria. a)Cromatografia gasosa: uma tcnica que permite a separao de substncias volteis arrastadas por um gs atravs de uma fase estacionria. A fase estacionria pode ser um slido ou um lquido que propicia a distribuio dos componentes da mistura entre as duas fases atravs de processos fsicos e qumicos, tais como a adsoro, diferenas de solubilidade, volatilidade ou partilha. A fase mvel utilizado um gs, denominado gs de arraste, que transporta a amostra atravs da coluna cromatogrfica at ao detector onde os componentes separados so detectados. Os gases mais utilizados so o hidrognio, hlio e argnio. A cromatografia gasosa usada, em geral, para fins analticos. b) Cromatografia lquida: uma tcnica adequada para a separao dos componentes (espcies inicas, macromolculas, constituintes termolbeis, ) de solues lquidas e pode ser utilizada para fins analticos, fins preparativos e em escala comercial. A amostra injetada na coluna usando uma micro-seringa (na cromatografia analtica) ou uma vlvula de injeo (em sistemas preparativos) e homogeneamente distribuda no topo da coluna. A fase mvel transportando a amostra forada a passar atravs da coluna por uma ao externa, que pode ser: A simples fora da gravidade cromatografia de baixa presso. Uma fora mais intensa gerada por uma bomba cromatografia de alta presso tambm chamada cromatografia de alta preciso (CLAE) de modo a superar a resistncia da coluna ao escoamento da fase mvel. No processo de percolao os componentes os componentes migram com velocidades diferentes e so identificados sada da coluna num detector que fornece um registo contnuo da composio da amostra analisada - cromatograma. Os detectores mais usados so os fotomtricos (UV), de fluorescncia sensveis a espcies que fluorescem - e os de ndice de refrao.