Introdução à Análise Fitoquímica

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Introduo Anlise Fitoqumica Os produtos naturais possuem um papel importante, sendo uma das principais fontes de novas drogas nos prximos anos, pelas seguintes razes: a) incomparvel diversidade estrutural, b) pequenas dimenses relativas de muitas molculas (peso molecular < 2000 Da), c) grande variedade de propriedades farmacolgicas, como a capacidade de ser absorvida e metabolizada. Produtos naturais so metablitos secundrios extrados de plantas, organismos marinhos, microorganismos e animais. O isolamento de produtos naturais ainda necessrio e urgente: - estado da arte: metodologias para os processos de separao e fracionamento. Planta: milhares de componentes - Isolamento: combina vrias tcnicas de separao - Dependem da solubilidade, volatilidade e estabilidade dos compostos a serem separados Por qu estudar plantas? Possuem centenas de compostos, Produtos naturais biologicamente ativos constituem modelos para a sntese de um grande nmero de frmacos, Diversidade em termos de estrutura e de propriedades fsicoqumicas e biolgicas, Estima-se que apenas 10% das plantas tenham sido estudadas fitoquimicamente, O Brasil o pas com maior diversidade gentica vegetal do mundo, com mais de 55.000 espcies catalogadas. Mercado Mundial Drogas de origem vegetal movimentam um mercado de US$ 12,4 bilhes. Europa responsvel por 50% do mercado. Fitofrmacos e fitoterpicos so responsveis por 25% do receiturio mdico em pases desenvolvidos e 80% em pases em desenvolvimento. 1983-1994 nos EUA - 520 frmacos aprovados pelo FDA - 157 (30%) produtos naturais ou derivados - 61% dos frmacos anticncer derivados de produtos naturais 1996 no Brasil - US$ 8 bilhes de faturamento na indstria farmacutica - 25% originados de medicamentos derivados de plantas Pesquisa Fitoqumica: - Conhecer os constituintes qumicos de espcies vegetais. - Avaliar a presena dos mesmos. Anlise Fitoqumica Preliminar: - Pode indicar os grupos de metablitos secundrios relevantes em uma espcie. Etapas da Pesquisa Fitoqumica: Coleta do material vegetal Preparao do material vegetal Extrao Anlise fitoqumica preliminar Fracionamento Isolamento Elucidao estrutural Coleta do material vegetal Primeira etapa da investigao fitoqumica. essencial que se prepare uma exsicata para identificao botnica. - Evitar partes afetadas por doenas, parasitas e materiais estranhos. Registrar local, hora e data da coleta. Mesmo utilizando material fresco, h necessidade de preparao de exsicata. Preparao do material vegetal Material fresco - Deteco de alguns componentes especficos. - Vantagem: evita a presena de substncias oriundas do metabolismo de morte da planta. - Desvantagem: deve ser processado imediatamente ou conservado a baixas temperaturas. Material seco - Vantagem: maior estabilidade qumica. - Desvantagem: cuidados especiais para interromper o metabolismo aps coleta da planta. a) Estabilizao e secagem: Estabilizao: a desnaturao protica das enzimas celulares, seja por ao de agentes desidratantes quanto pelo calor. Objetivo: impedir a ao enzimtica, evitando a alterao de compostos qumicos originalmente presentes na amostra. Secagem: a retirada de gua da planta. Objetivos: impedir reaes de hidrlise e de crescimento microbiano. A umidade residual depende do tipo de rgo que constitui o material vegetal. A secagem se caracteriza pela exposio a temperaturas relativamente baixas, normalmente inferiores a 60C, por longo perodo de tempo, geralmente em torno de 7 dias. O material deve ser finamente dividido e disposto em camadas finas. A secagem pode ser feita ao ar livre ou em estufas. Secagem ao ar livre - mais econmica, - Maior vigilncia para garantir uniformidade das condies, - Deve ser realizada sombra,

- Local seco e protegido de ataque de insetos ou contaminantes ambientais. Secagem em estufas - Utiliza-se estufas equipadas com termostato produzindo ar quente, - Manuteno da temperatura constante durante a secagem, - Estufas equipadas com sistema de circulao de ar so mais eficazes. - A secagem propicia a reduo de peso e volume e facilita a moagem dos materiais. b) Moagem: Reduo do material vegetal mecanicamente a fragmentos de pequenas dimenses. A escolha da dimenso do material vegetal depende da textura do rgo. Quanto mais rgido forem os tecidos, maior o grau de diviso necessrio. As metodologias utilizadas para reduzir o tamanho do material vegetal so escolhidas conforme as caractersticas deste. Diviso grosseira: - Seccionamento: tesouras, podes ou facas - Impacto: Reduo a fragmentos por meio de choques repetidos ( por exemplo, no gral) - Rasurao: raspadores ou processadores de alimentos. Pulverizao: - Com gral: empregando ou no um intermedirio de pulverizao. - Moinhos: pinos, jato de ar, discos, martelos, facas. Extrao Extrao significa retirar, de forma mais seletiva e completa possvel, as substncias ou frao ativa contida na droga vegetal, utilizando, para isso, um lquido ou mistura de lquidos apropriados e toxicologicamente seguros. O produto resultante dessa extrao slido-lquido chamada de soluo extrativa, que no deve ser confundida com o produto de uma extrao lquido-lquido, quando so obtidas fraes enriquecidas ou substncias purificadas. Fatores que afetam a operao de extrao: - Caractersticas do material vegetal, - Grau de diviso do material vegetal, - O meio extrator (solvente), - Metodologia. Anlise fitoqumica preliminar Classicamente, a caracterizao dos principais grupos de substncias vegetais de interesse tem sido conseguida pela realizao de reaes qumicas que resultem no desenvolvimento de colorao e/ou precipitao caractersticos. As reaes feitas diretamente com o extrato bruto podem mascarar o resultado. O fracionamento do extrato e o teste com as fraes obtidas possibilita reaes mais ntidas. A amostra pode precisar de um tratamento preliminar: a) Partio de substncias entre duas fases imiscveis, uma aquosa e outra orgnica, b) Formao de sais com diferenas de solubilidade em relao s bases ou aos cidos que lhes deram origem. Com o avano dos mtodos de extrao e isolamento, na maioria das vezes, desnecessrio submeter extratos vegetais a tratamentos qumicos preliminares. Fracionamento e Isolamento Os processos de fracionamento de extratos vegetais com vistas ao isolamento de substncias ativas podem ser monitorados por ensaios direcionados para a avaliao de atividade biolgica. Fracionamento: o processo em que se consegue uma frao parcialmente pura, ou seja, obtm-se um grupo de substncias. Isolamento: o processo em que se consegue uma substncia ou composto puro. Para o fracionamento e isolamento das substncias tm-se dois grupos de mtodos que so mais comuns: Partio por solventes: mais simples e barata, sendo utilizada para vrias finalidades. Mtodos cromatogrficos: so mais variados, podendo ser utilizados para o fracionamento, purificao e isolamento das substncias. Elucidao estrutural Os primeiros pesquisadores que se dedicaram elucidao estrutural das substncias no dispunham das tcnicas de anlise disponveis atualmente. As tcnicas atuais permitem a elucidao de estruturas extremamente complexas, com amostras da ordem de miligramas ou menos. Os pioneiros levavam s vezes anos tentando purificar e identificar uma nica substncia. Os mtodos eram pouco sensveis. Consumiam grandes quantidades de amostras, pois ela precisava ser submetida a transformaes qumicas diversas. Entre os mtodos fsicos de anlise empregados atualmente na determinao estrutural esto: A Espectrometria de Massas (EM). A espectroscopia no Ultravioleta (UV), Visvel e no Infravermelho (IV). A Ressonncia Magntica Nuclear de Hidrognio e de Carbono 13 (RMN de 1H e de 13C). a) Espectroscopia no Infravermelho (IV) O espectro no Infravermelho (IV) de uma substncia orgnica corresponde ao conjunto de bandas de absoro apresentadas pela amostra submetida radiao infravermelha e estas bandas correspondem s mudanas na energia vibracional dos compostos. A energia seletivamente absorvida da radiao IV provoca alteraes transitrias nas ligaes interatmicas que podem sofrer estiramentos ou deformaes nos ngulos de ligao. Diversos grupos funcionais vibram e do origem a bandas de absoro caractersticas. Cada grupo absorve luz em freqncia especfica. Aprender reconhecer algumas bandas de absoro mais notveis.

As freqncias em que ocorrem as vibraes dependem da natureza das ligaes em particular, mas so tambm afetadas pela vizinhana qumica e pela molcula como um todo. A presena de insaturaes (conjugadas ou no), sistemas aromticos e grupos funcionais especficos pode ser verificada atravs de bandas caractersticas, que tm grande importncia na anlise estrutural. b) Espectroscopia de RMN de 1H e de 13C A espectroscopia de RMN de 1H e de 13C uma das ferramentas mais valiosas para a determinao estrutural de compostos orgnicos contribuindo para o esqueleto da molcula. Permite a caracterizao de ncleos individuais e muito importante para a elucidao estrutural de todas as classes de produtos naturais, incluindo metablitos secundrios vegetais. Ressonncia magntica nuclear basicamente uma outra forma de espectroscopia de absoro. Campo magntico aplicado _ absoro de radiao eletromagntica na regio de radiofrequncia. Espectro de RMN um registro grfico das frequncias dos picos de absoro contra suas intensidades. Os espectros de RMN de 1H e de 13C so os mais utilizados e sua interpretao permite caracterizar o nmero e os tipos de tomos de H e de C, em funo da localizao e do desdobramento dos sinais correspondentes absoro de energia eletromagntica. Os espectros de RMN de 1H e de 13C so os mais utilizados e sua interpretao permite caracterizar o nmero e o tipos de tomos de H e de C, em funo da localizao e do desdobramento dos sinais correspondentes absoro de energia eletromagntica. A grande variedade de tcnicas disponveis de RMN (COSY, NOESY, HMQC, HSQC, HMBC, INEPT) permite identificar a proximidade espacial ou mesmo conectividade de alguns tomos em particular, auxiliando dessa maneira, na montagem do quebracabea constitudo pelas diferentes partes da molcula. c) Espectroscopia no Ultravioleta (UV) A espectroscopia no Ultravioleta (UV) basicamente mais uma tcnica de absoro, sendo simples e rpida. Uma vez determinado o esqueleto carbnico e o tipo de molcula, indica a presena de certos grupos funcionais, bem como a posio dos substituintes na molcula. uma tcnica muito til para flavonides, porque proporciona informaes sobre a presena e a posio de grupamentos hidroxila no sistema de anis, ao mesmo tempo em que possibilitam a diferenciao entre os vrios tipos de flavonides. uma tcnica utilizada tanto para a deteco quanto para o monitoramento da pureza de derivados flavnicos durante o processo de isolamento. d) Espectrometria de Massas (EM) A espectrometria de massas juntamente com a espectroscopia de RMN de 1H e de 13C uma das ferramentas mais valiosas para a determinao estrutural de compostos orgnicos. Permite determinar a massa molecular e a frmula molecular de uma substncia, alm de certas caractersticas estruturais como os padres de fragmentao. A massa molecular permite estabelecer a frmula molecular da substncia, enquanto o padro de fragmentao pode ajudar a caracterizar a presena, bem como a localizao de certos grupos funcionais e cadeias laterais. A espectrometria de massas utiliza apenas uma pequena quantidade de amostra, sendo rpida e simples. A grande desvantagem por ser uma tcnica cara. Das tcnicas instrumentais a nica que no envolve radiao eletromagntica, por isso chamada de espectrometria. Mtodos de Extrao Extrao significa retirar, de forma mais seletiva e completa possvel, as substncias ou frao ativa contida na droga vegetal, utilizando, para isso, um lquido ou mistura de lquidos apropriados e toxicologicamente seguros. O produto resultante dessa extrao slido-lquido chamada de soluo extrativa, que no deve ser confundida com o produto de uma extrao lquido-lquido, quando so obtidas fraes enriquecidas ou substncias purificadas. Fatores que afetam a operao de extrao: - Caractersticas do material vegetal, - Grau de diviso do material vegetal, - O meio extrator (solvente), - Metodologia. Grau de diviso do material vegetal: - Influencia diretamente a eficincia da extrao, - Consistncia das partes da planta bastante heterognea (razes e caules so muito compactos, enquanto folhas e flores so mais delicadas), - O poder de penetrao do solvente depende da consistncia do tecido que forma o material vegetal (quanto mais rgido, mais difcil a extrao), - Quanto mais rgido o material, menor deve ser sua granulometria. Solvente: - Deve ser o mais seletivo possvel, - Extrai-se apenas substncias desejadas ou em maior quantidade, - O conhecimento do grau de polaridade do grupo de substncias que se deseja extrair determina o solvente ou mistura de solventes que mais se aproxima do timo de seletividade para aquela extrao.

- Quando no se conhece previamente o contedo do material, faz-se sucessivas extraes com solventes de polaridades crescentes, uma extrao fracionada, obtendo-se substncias com polaridades tambm crescentes. - Poucas substncias lquidas so utilizadas na extrao de drogas vegetais, - Fatores importantes: propriedades extrativas, toxicidade ou risco de manuseio, disponibilidade e custo do solvente. - Propriedades extrativas Compreendem a eficincia e seletividade com que o lquido extrator dissolve, temperatura ambiente, uma substncia de interesse, dependendo sobretudo dos parmetros de solubilidade do solvente e do soluto. Praticamente todos os constituintes de interesse apresentam alguma solubilidade em solues metanlicas ou etanlicas a 80%, sendo empregadas com frequncia. A gua um dos lquidos extratores mais empregados, sendo utilizada na extrao de substncias hidroflicas, como aminocidos, acares, alcalides na forma de sal, saponinas, heterosdeos flavonodicos e mucilagens. A extrao de determinadas substncias ainda pode ser infuenciada pelo pH do lquido extrator. O exemplo clssico a extrao de alcalides (natureza alcalina) com solues cidas. - Toxicidade ou risco de manuseio Solventes txicos como metanol e diclorometano devem ser pouco utilizados. O uso de clorofrmio deve ser o mnimo possvel. - Disponibilidade e custo do solvente Quanto mais abundante e mais barato o solvente, mais ele pode ser utilizado, como por exemplo, gua e etanol. Metodologia: - Os fatores relacionados aos processos de extrao dizem respeito a agitao, temperatura e tempo necessrio para execut-los. 1. Agitao: pode diminuir o tempo do processo extrativo, j que esse depende de fenmenos de difuso, 2. Temperatura: o aumento provoca um aumento da solubilidade das substncias, por isso, os processos de extrao a quente so mais rpidos. Limitao - muitas substncias so instveis em altas temperaturas, 3. Tempo de extrao: varia em funo da rigidez do material e seu estado de diviso, natureza das substncias a extrair, do solvente e emprego ou no, de agitao e temperatura. - Na escolha de um processo extrativo deve-se avaliar ainda, a...