Introdução à Análise Fitoquímica• Os produtos naturais possuem um papel importante, sendo uma das principais fontes de novas drogas nos próximos anos, pelas seguintes razões:a) incomparável diversidade estrutural,b) pequenas dimensões relativas de muitas moléculas (peso molecular < 2000 Da),c) grande variedade de propriedades farmacológicas, como a capacidade de ser absorvida e metabolizada.• Produtos naturais são metabólitos secundários extraídos de plantas, organismos marinhos, microorganismos e animais.• O isolamento de produtos naturais ainda é necessário e urgente:- “estado da arte”: metodologias para os processos de separação e fracionamento.• Planta: milhares de componentes- Isolamento: combina várias técnicas de separação- Dependem da solubilidade, volatilidade e estabilidade dos compostos a serem separados

Por quê estudar plantas?• Possuem centenas de compostos,• Produtos naturais biologicamente ativos constituem modelos para a síntese de um grande número de fármacos,• Diversidade em termos de estrutura e de propriedades físicoquímicas e biológicas,• Estima-se que apenas 10% das plantas tenham sido estudadas fitoquimicamente,• O Brasil é o país com maior diversidade genética vegetal do mundo, com mais de 55.000 espécies catalogadas.

Mercado Mundial• Drogas de origem vegetal movimentam um mercado de US$ 12,4 bilhões.• Europa é responsável por 50% do mercado.• Fitofármacos e fitoterápicos são responsáveis por 25% do receituário médico em países desenvolvidos e 80% em países em desenvolvimento.• 1983-1994 nos EUA- 520 fármacos aprovados pelo FDA- 157 (30%) produtos naturais ou derivados- 61% dos fármacos anticâncer derivados de produtos naturais• 1996 no Brasil- US$ 8 bilhões de faturamento na indústria farmacêutica- 25% originados de medicamentos derivados de plantas• Pesquisa Fitoquímica:- Conhecer os constituintes químicos de espécies vegetais.- Avaliar a presença dos mesmos.• Análise Fitoquímica Preliminar:- Pode indicar os grupos de metabólitos secundários relevantes em uma espécie.• Etapas da Pesquisa Fitoquímica:Coleta do material vegetal – Preparação do material vegetal – Extração Análise fitoquímica preliminar – Fracionamento Isolamento – Elucidação estrutural

Coleta do material vegetal• Primeira etapa da investigação fitoquímica.• É essencial que se prepare uma exsicata para identificação botânica.- Evitar partes afetadas por doenças, parasitas e materiais estranhos.• Registrar local, hora e data da coleta.• Mesmo utilizando material fresco, há necessidade de preparação de exsicata.

Preparação do material vegetal• Material fresco- Detecção de alguns componentes específicos.- Vantagem: evita a presença de substâncias oriundas do metabolismo de morte da planta.- Desvantagem: deve ser processado imediatamente ou conservado a baixas temperaturas.• Material seco- Vantagem: maior estabilidade química.- Desvantagem: cuidados especiais para interromper o metabolismo após coleta da planta.a) Estabilização e secagem:• Estabilização: é a desnaturação protéica das enzimas celulares, seja por ação de agentes desidratantes quanto pelo calor.Objetivo: impedir a ação enzimática, evitando a alteração de compostos químicos originalmente presentes na amostra.• Secagem: é a retirada de água da planta.Objetivos: impedir reações de hidrólise e de crescimento microbiano. A umidade residual depende do tipo de órgão que constitui o material vegetal.• A secagem se caracteriza pela exposição a temperaturas relativamente baixas, normalmente inferiores a 60°C, por longo período de tempo, geralmente em torno de 7 dias.• O material deve ser finamente dividido e disposto em camadas finas.• A secagem pode ser feita ao ar livre ou em estufas.• Secagem ao ar livre- É mais econômica,- Maior vigilância para garantir uniformidade das condições,- Deve ser realizada à sombra,

- Local seco e protegido de ataque de insetos ou contaminantes ambientais.• Secagem em estufas- Utiliza-se estufas equipadas com termostato produzindo ar quente,- Manutenção da temperatura constante durante a secagem,- Estufas equipadas com sistema de circulação de ar são mais eficazes.- A secagem propicia a redução de peso e volume e facilita a moagem dos materiais.b) Moagem:• Redução do material vegetal mecanicamente a fragmentos de pequenas dimensões.• A escolha da dimensão do material vegetal depende da textura do órgão. Quanto mais rígido forem os tecidos, maior o grau de divisão necessário.• As metodologias utilizadas para reduzir o tamanho do material vegetal são escolhidas conforme as características deste.• Divisão grosseira:- Seccionamento: tesouras, podões ou facas- Impacto: Redução a fragmentos por meio de choques repetidos ( por exemplo, no gral)- Rasuração: raspadores ou processadores de alimentos.• Pulverização:- Com gral: empregando ou não um intermediário de pulverização.- Moinhos: pinos, jato de ar, discos, martelos, facas.

Extração• Extração significa retirar, de forma mais seletiva e completa possível, as substâncias ou fração ativa contida na droga vegetal, utilizando, para isso, um líquido ou mistura de líquidos apropriados e toxicologicamente seguros.• O produto resultante dessa extração sólido-líquido é chamada de solução extrativa, que não deve ser confundida com o produto de uma extração líquido-líquido, quando são obtidas frações enriquecidas ou substâncias purificadas.• Fatores que afetam a operação de extração:- Características do material vegetal,- Grau de divisão do material vegetal,- O meio extrator (solvente),- Metodologia.

Análise fitoquímica preliminar• Classicamente, a caracterização dos principais grupos de substâncias vegetais de interesse tem sido conseguida pela realização de reações químicas que resultem no desenvolvimento de coloração e/ou precipitação característicos.• As reações feitas diretamente com o extrato bruto podem mascarar o resultado.• O fracionamento do extrato e o teste com as frações obtidas possibilita reações mais nítidas.• A amostra pode precisar de um tratamento preliminar:a) Partição de substâncias entre duas fases imiscíveis, uma aquosa e outra orgânica,b) Formação de sais com diferenças de solubilidade em relação às bases ou aos ácidos que lhes deram origem.• Com o avanço dos métodos de extração e isolamento, na maioria das vezes, é desnecessário submeter extratos vegetais a tratamentos químicos preliminares.

Fracionamento e Isolamento• Os processos de fracionamento de extratos vegetais com vistas ao isolamento de substâncias ativas podem ser monitorados por ensaios direcionados para a avaliação de atividade biológica.• Fracionamento: é o processo em que se consegue uma fração parcialmente pura, ou seja, obtém-se um grupo de substâncias.• Isolamento: é o processo em que se consegue uma substância ou composto puro.• Para o fracionamento e isolamento das substâncias têm-se dois grupos de métodos que são mais comuns:• Partição por solventes: é mais simples e barata, sendo utilizada para várias finalidades.• Métodos cromatográficos: são mais variados, podendo ser utilizados para o fracionamento, purificação e isolamento das substâncias.Elucidação estrutural• Os primeiros pesquisadores que se dedicaram à elucidação estrutural das substâncias não dispunham das técnicas de análise disponíveis atualmente.• As técnicas atuais permitem a elucidação de estruturas extremamente complexas, com amostras da ordem de miligramas ou menos.• Os pioneiros levavam às vezes anos tentando purificar e identificar uma única substância.• Os métodos eram pouco sensíveis.• Consumiam grandes quantidades de amostras, pois ela precisava ser submetida a transformações químicas diversas.• Entre os métodos físicos de análise empregados atualmente na determinação estrutural estão:• A Espectrometria de Massas (EM).• A espectroscopia no Ultravioleta (UV), Visível e noInfravermelho (IV).• A Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio e de Carbono 13 (RMN de 1H e de 13C).

a) Espectroscopia no Infravermelho (IV)• O espectro no Infravermelho (IV) de uma substância orgânica corresponde ao conjunto de bandas de absorção apresentadas pela amostra submetida à radiação infravermelha e estas bandas correspondem às mudanças na energia vibracional dos compostos.• A energia seletivamente absorvida da radiação IV provoca alterações transitórias nas ligações interatômicas que podem sofrer estiramentos ou deformações nos ângulos de ligação.Diversos grupos funcionais vibram e dão origem a bandas de absorção características.Cada grupo absorve luz em freqüência específica.

Aprender reconhecer algumas bandas de absorção mais notáveis.• As freqüências em que ocorrem as vibrações dependem da natureza das ligações em particular, mas são também afetadas pela vizinhança química e pela molécula como um todo.• A presença de insaturações (conjugadas ou não), sistemas aromáticos e grupos funcionais específicos pode ser verificada através de bandas características, que têm grande importância na análise estrutural.

b) Espectroscopia de RMN de 1H e de 13C• A espectroscopia de RMN de 1H e de 13C é uma das ferramentas mais valiosas para a determinação estrutural de compostos orgânicos contribuindo para o esqueleto da molécula.• Permite a caracterização de núcleos individuais e é muito importante para a elucidação estrutural de todas as classes de produtos naturais, incluindo metabólitos secundários vegetais.• Ressonância magnética nuclear é basicamente uma outra forma de espectroscopia de absorção.• Campo magnético aplicado _ absorção de radiação eletromagnética na região de radiofrequência.• Espectro de RMN é um registro gráfico das frequências dos picos de absorção contra suas intensidades.• Os espectros de RMN de 1H e de 13C são os mais utilizados e sua interpretação permite caracterizar o número e os tipos de átomos de H e de C, em função da localização e do desdobramento dos sinais correspondentes à absorção de energia eletromagnética.• Os espectros de RMN de 1H e de 13C são os mais utilizados e sua interpretação permite caracterizar o número e o tipos de átomos de H e de C, em função da localização e do desdobramento dos sinais correspondentes à absorção de energia eletromagnética.• A grande variedade de técnicas disponíveis de RMN (COSY, NOESY, HMQC, HSQC, HMBC, INEPT) permite identificar a proximidade espacial ou mesmo conectividade de alguns átomos em particular, auxiliando dessa maneira, na montagem do quebra-cabeça constituído pelas diferentes partes da molécula.

c) Espectroscopia no Ultravioleta (UV)• A espectroscopia no Ultravioleta (UV) é basicamente mais uma técnica de absorção, sendo simples e rápida.• Uma vez determinado o esqueleto carbônico e o tipo de molécula, indica a presença de certos grupos funcionais, bem como a posição dos substituintes na molécula.• É uma técnica muito útil para flavonóides, porque proporciona informações sobre a presença e a posição de grupamentos hidroxila no sistema de anéis, ao mesmo tempo em que possibilitam a diferenciação entre os vários tipos de flavonóides.• É uma técnica utilizada tanto para a detecção quanto para o monitoramento da pureza de derivados flavônicos durante o processo de isolamento.

d) Espectrometria de Massas (EM)• A espectrometria de massas juntamente com a espectroscopia de RMN de 1H e de 13C é uma das ferramentas mais valiosas para a determinação estrutural de compostos orgânicos.• Permite determinar a massa molecular e a fórmula molecular de uma substância, além de certas características estruturais como os padrões de fragmentação.• A massa molecular permite estabelecer a fórmula molecular da substância, enquanto o padrão de fragmentação pode ajudar a caracterizar a presença, bem como a localização de certos grupos funcionais e cadeias laterais.• A espectrometria de massas utiliza apenas uma pequena quantidade de amostra, sendo rápida e simples.• A grande desvantagem é por ser uma técnica cara.• Das técnicas instrumentais é a única que não envolve radiação eletromagnética, por isso é chamada de espectrometria.

Métodos de Extração• Extração significa retirar, de forma mais seletiva e completa possível, as substâncias ou fração ativa contida na droga vegetal, utilizando, para isso, um líquido ou mistura de líquidos apropriados e toxicologicamente seguros. • O produto resultante dessa extração sólido-líquido é chamada de solução extrativa, que não deve ser confundida com o produto de uma extração líquido-líquido, quando são obtidas frações enriquecidas ou substâncias purificadas. • Fatores que afetam a operação de extração: - Características do material vegetal,

- Grau de divisão do material vegetal,

- O meio extrator (solvente),

- Metodologia.

• Grau de divisão do material vegetal: - Influencia diretamente a eficiência da extração, - Consistência das partes da planta é bastante heterogênea (raízes e caules são muito compactos, enquanto folhas e flores são mais delicadas), - O poder de penetração do solvente depende da consistência do tecido que forma o material vegetal (quanto mais rígido, mais difícil a extração), - Quanto mais rígido o material, menor deve ser sua granulometria.

• Solvente: - Deve ser o mais seletivo possível, - Extrai-se apenas substâncias desejadas ou em maior quantidade,

- O conhecimento do grau de polaridade do grupo de substâncias que se deseja extrair determina o solvente ou mistura de solventes que mais se aproxima do ótimo de seletividade para aquela extração.- Quando não se conhece previamente o conteúdo do material, faz-se sucessivas extrações com solventes de polaridades crescentes, uma extração fracionada, obtendo-se substâncias com polaridades também crescentes.- Poucas substâncias líquidas são utilizadas na extração de drogas vegetais, - Fatores importantes: propriedades extrativas, toxicidade ou risco de manuseio, disponibilidade e custo do solvente.- Propriedades extrativas Compreendem a eficiência e seletividade com que o líquido extrator dissolve, à temperatura ambiente, uma substância de interesse, dependendo sobretudo dos parâmetros de solubilidade do solvente e do soluto.Praticamente todos os constituintes de interesse apresentam alguma solubilidade em soluções metanólicas ou etanólicas a 80%, sendo empregadas com frequência. A água é um dos líquidos extratores mais empregados, sendo utilizada na extração de substâncias hidrofílicas, como aminoácidos, açúcares, alcalóides na forma de sal, saponinas, heterosídeos flavonoídicos e mucilagens. A extração de determinadas substâncias ainda pode ser infuenciada pelo pH do líquido extrator. O exemplo clássico é a extração de alcalóides (natureza alcalina) com soluções ácidas.- Toxicidade ou risco de manuseio Solventes tóxicos como metanol e diclorometano devem ser pouco utilizados. O uso de clorofórmio deve ser o mínimo possível. - Disponibilidade e custo do solvente Quanto mais abundante e mais barato o solvente, mais ele pode ser utilizado, como por exemplo, água e etanol.

• Metodologia: - Os fatores relacionados aos processos de extração dizem respeito a agitação, temperatura e tempo necessário para executá-los.

1. Agitação: pode diminuir o tempo do processo extrativo, já que esse depende de fenômenos de difusão, 2. Temperatura: o aumento provoca um aumento da solubilidade das substâncias, por isso, os processos de extração a

quente são mais rápidos. Limitação - muitas substâncias são instáveis em altas temperaturas, 3. Tempo de extração: varia em função da rigidez do material e seu estado de divisão, natureza das substâncias a extrair, do

solvente e emprego ou não, de agitação e temperatura.- Na escolha de um processo extrativo deve-se avaliar ainda, a eficiência, a estabilidade das substâncias extraídas, a disponibilidade dos meios e o custo do processo escolhido. - Uma das formas mais aceitas de classificar os processos de extração é segundo a sua eficiência: Processos de extração parcial (extração sem esgotamento): maceração e suas variáveis, turbo-extração. Processos de extração exaustiva: permitem o esgotamento da matéria prima, como por exemplo, percolação, a extração em contra-corrente, etc.

Métodos de Extração Sólido-Líquido1.Extrações a frio • Os métodos de extração a frio a maceração e a percolação. • Os métodos são realizados a baixas temperaturas. • Pode-se empregar agitação ou não. a) Maceração e metodologias derivadas: • É o método no qual a extração da matéria-prima vegetal é realizada em recipiente fechado, a baixas temperaturas, durante um período prolongado (horas ou dias), sob agitação ocasional e sem renovação do líquido extrator. • Pela sua natureza, não conduz ao esgotamento da matéria-prima vegetal, seja devido a saturação do líquido extrator ou ao estabelecimento do líquido difusional entre o meio extrator e a célula. • Diversas variações são conhecidas objetivando, essencialmente, o aumento da eficiência da extração: Maceração dinâmica: maceração feita sob agitação mecânica constante, Remaceração: quando a operação é repetida utilizando o mesmo material vegetal, renovando-se apenas o líquido extrator. • Os principais fatores que influenciam a eficiência da maceração estão vinculados: - Material vegetal: quantidade, natureza, teor de umidade, tamanho da partícula, capacidade de intumescimento. - Líquido extrator: seletividade e quantidade. - Sistema: proporção droga / líquido extrator, temperatura, agitação, pH, tempo de extração.• As drogas mais indicadas para serem extraídas por maceração são aquelas ricas em substâncias ativas que não apresentam uma estrutura celular, como gomas, resinas e alginatos. • Em homeopatia, na preparação de tinturas-mães, os líquidos extratores preferidos são etanol e soluções hidroetanólicas. • Líquidos voláteis são raramente utilizados. • Soluções hidroetanólicas com concentração de etanol maior que 20% para evitar crescimento microbiano. b) Percolação e metodologias afins: • Este método tem como característica a extração exaustiva das substâncias ativas. Na percolação, a droga vegetal moída é colocada em um recipiente cônico ou cilíndrico (percolador), de vidro ou de metal, através do qual é feito passar o líquido extrator. • O procedimento usual de percolação caracteriza a percolação simples e a percolação fracionada. O produto obtido é o percolado. • A percolação é uma operação dinâmica, indicada na extração de substâncias, farmacologicamente ativas, presentes em pequenas quantidades ou pouco solúveis e quando o preço da droga é relevante. • Variações: repercolação, percolação em bateria ou sequencial, extração em carrossel e contra-corrente. • Percolação simples: - Intumescimento da droga com o líquido extrator, durante 1 ou 2 horas, fora do percolador, - Empacotamento homogêneo e não compacto do percolador, - A altura do enchimento deve ser na proporção e 5:1 em relação ao diâmetro médio do recipiente, - Velocidade de fluxo em percoladores oficinais, considerando um tamanho de partícula de 1 a 3 mm Lenta (0,5 a 1 mL/min/kg) Moderada (1 a 2 mL/min/kg) Rápida (2 a 5 mL/min/kg) - Desvantagem: quantidade de líquido extrator requerido para esgotar a droga vegetal. Solução: uso de percoladores em série.• Percolação fracionada: - Implica na separação das duas ou três primeiras frações do percolado, que contêm, normalmente, em torno de 75-80% das substâncias passíveis de extração, das frações seguintes mais diluídas.

2. Extrações a quente em sistemas abertos • São exemplos de métodos de extração a quente em sistemas abertos a turbo - extração, a infusão e a decocção. • Os métodos são realizados com aquecimento e contato com o solvente quente durante um certo período de tempo. a) Turbo - extração: • É o método no qual a extração ocorre com simultânea redução de tamanho de partícula, resultado da aplicação de elevadas forças de cisalhamento, geradas no pequeno espaço compreendido entre o estator e um rotor de alta velocidade de 5.000 a 20.000 rpm. • A redução drástica do tamanho de partícula e o conseqüente rompimento das células favorece a rápida dissolução as substâncias ativas. • O tempo de extração fica na ordem de minutos, com quase total esgotamento da droga vegetal. • Vantagens: Simplicidade, rapidez e versatilidade do método,

Fácil utilização em processamentos em pequena e média escala. • Desvantagens: - Difícil separação da solução extrativa por filtração, - Geração de calor durante o procedimento (necessidade de controlar a temperatura, restringindo o uso de líquidos voláteis), - Limitação quando se trata de caules, raízes e materiais de elevada dureza. b) Infusão: • É o método no qual a extração se dá pela permanência, durante certo tempo, do material vegetal em água fervente, num recipiente tapado. • É aplicável a partes vegetais de estrutura mole, as quais devem ser contundidas, cortadas ou pulverizadas grosseiramente, conforme a sua natureza, a fim de que possam ser mais facilmente penetradas e extraídas pela água. c) Decocção: • É o método no qual a extração do material vegetal se dá pelo contato, durante certo tempo, com o solvente (normalmente a água) em ebulição. • É um método de emprego restrito, pois muitas substâncias ativas são alteradas por um aquecimento prolongado. • Costuma-se empregá-la com materiais vegetais duros ou de natureza lenhosa, como cascas, caule, raiz, sementes e frutos secos.

3. Extrações a quente em sistemas fechados • São exemplos de métodos de extração a quente em sistemas fechados a extração sob refluxo e extração em aparelho Soxhlet. • Os métodos são realizados com aquecimento e contato com o solvente quente durante um certo período de tempo. a) Extração sob refluxo: • É o método no qual a extração se dá pelo contato do material vegetal com um solvente em ebulição, em um aparelho dotado de um recipiente, onde será colocado o material e o solvente, acoplado a um condensador. • Neste método, o solvente evaporado durante o processo é recuperado e volta ao conjunto. • Desvantagem: as substâncias ativas podem ser alteradas por um aquecimento prolongado. b) Extração em aparelho Soxhlet: • É utilizada, sobretudo, para extrair sólidos com solventes voláteis, exigindo o emprego do aparelho de Soxhlet. Em cada ciclo de operação, o material vegetal entra em contato com o solvente renovado. • Vantagens: Extração altamente eficiente, Emprego de uma quantidade reduzida de solvente em comparação com outros métodos extrativos. • Desvantagem: as substâncias ativas podem ser alteradas por um aquecimento prolongado.

Análise Fitoquímica Preliminar• Para algumas substâncias, em certos vegetais, pode-se realizar reações de caracterização diretamente sobre os tecidos do material vegetal.• Entretanto, na maioria das vezes, a caracterização de um determinado grupo de substâncias presentes em um vegetal só pode ser feita após sua extração com um solvente adequado.• Classicamente, a caracterização dos principais grupos de substâncias vegetais de interesse tem sido conseguida pela realização de reações químicas que resultem no desenvolvimento de coloração e/ou precipitação característicos.• Para algumas reações, o extrato pode ser empregado diretamente, enquanto para outras, o solvente deve ser previamente retirado.• Essas reações podem ser realizadas em tubos de ensaio ou por detecção cromatográfica com reagentes específicos.• As reações feitas diretamente com o extrato bruto podem mascarar o resultado.• O fracionamento do extrato e o teste com as frações obtidas possibilitam reações mais nítidas.• Um dos primeiros roteiros de análise sistemática de misturas complexas, foi proposto em 1850 pelo químico belga J. S. Stas e modificado pelo farmacêutico alemão F. J. Otto.• O roteiro se baseia em dois princípios:a) Partição de substâncias entre duas fases imiscíveis, uma aquosa e outra orgânica,b) Formação de sais com diferenças de solubilidade em relação às bases ou aos ácidos que lhes deram origem.• O método proposto por Stas e Otto é adequado para substâncias como alcalóides, por exemplo.• Entretanto, muitas substâncias são sensíveis a ácidos e bases, o que impede o uso deste método (cumarinas).• Com o avanço dos métodos de extração e isolamento, na maioria das vezes, é desnecessário submeter extratos vegetais a tratamentos químicos preliminares.Caracterização de algumas classes de compostos por métodos químicos1.Cumarinas:- Detecção em cromatografia em camada delgada (CCD),- Aparecem manchas de cores como azul, amarela e roxa, sob ação da luz UV (360 nm), que podem ser realçadas após exposição ao vapor de amônio, ou revelação com KOH a 5% em MeOH.- Em soluções alcalinas, desenvolvem coloração amarela, devido ao rompimento do anel lactônico, que é revertida pela adição de solução ácida.

2. Polifenóis:- São substâncias redutoras e, portanto, oxidam-se com facilidade, resultando em substâncias coradas devido ao elevado grau de conjugação.- Substâncias oxidantes podem ser empregadas para a caracterização de polifenóis, tais como o cloreto férrico (FeCl3), que dá a coloração azul ou verde-azulada.a) Flavonóides:• Ensaios cromáticos:- Reação de cianidina, Shinoda ou hidrogenação: consiste em adicionar um pequeno pedaço de magnésio a solução alcoólica ácida da substância.Coloração passa de amarelo para vermelho.- Reação citro-bórica ou Reativo de Wilson: as soluções cetônicas de flavonas, flavonóis e chalconas adquirem tons amarelados e fluorescência amarelo-esverdeada quando os ácidos cítrico e bórico são dissolvidos em acetona, ou soluções vermelho-alaranjado quando os mesmos são dissolvidos em anidrido acético.- Reação com H2SO4 concentrado: os compostos flavônicos formam sais de oxônio com ácido sulfúrico concentrado, que podem ser precipitados pela adição de água.Formam fortemente amareladas, laranja a vermelho e vermelho a carmim, dependendo do tipo de flavonóide.- Reação de Marini-Bettolo: o pentacloreto de antimônio em tetracloreto de carbono reage de forma análoga. As chalconas formam precipitados vermelho escuro ou violáceo e, as flavonas, precipitado amarelo ou laranja.• Ensaios cromatográficos em CCD:- O adsorvente pode ser sílica gel, poliamida ou celulose.- A presença de flavonóides no extrato vegetal bruto pode ser caracterizada pelo aparecimento de fluorescências sob a incidência de luz UV (254 e 365 nm).NP / PEG (difenilboriloxietilamina 1,0% em metanol, seguida de solução de polietilenoglicol 4000 5,0% em etanol): intensifica as fluorescências dos flavonóides quando observadas no UV a 254 nm.- Reagente de Folin-Ciocalteau (fosfomolibdato-fosfotungstato) seguido da exposição aos vapores de amônia é o reagente de escolha para a detecção de flavonóides, aparecendo manchas azuladas ou acinzentadas.b) Taninos:- Vários métodos conhecidos e tradicionais são usados para o reconhecimento de taninos:

Teste com solução de gelatina a 1%, contendo 10% de NaCl: fornece precipitado ou mesmo turvação.Precipitação com alcalóides, podendo ser usado soluções de cinchonina, cafeína ou estricnina a 1-2%.

• Ensaios cromáticos:- Reação com cloreto férrico (FeCl3): os taninos hidrolisáveis produzem, com solução diluída de FeCl3 em meio básico, uma forte coloração azul, já taninos condensados em solução aquosa resultam numa coloração verde, cuja intensidade é mais fraca do que dos taninos hidrolisáveis.- Reativo de Stiasny (HCl concentrado e formol): uma solução de taninos é mantida sob refluxo com HCl concentrado e formol por 30 minutos. Taninos condensados formam precipitados e são separados por filtração. A presença de ácido gálico no filtrado pode ser verificada pela adição de cloreto férrico.- Reação de Borntragër: em soluções alcalinas os compostos antraquinônicos adquirem intensa coloração violeta a púrpura, inclusive com bases fracas como NH4OH.- Pode-se também borrifar uma solução aquosa alcalina sobre a superfície do vegetal, para caracterizar a presença de derivados hidroxiantracênicos.

3. Alcalóides:- As reações gerais para alcalóides baseiam-se na formação de complexos insolúveis (precipitados).- Como os resultados falso-positivos são bastante comuns para essas reações, previamente o material a ser analisado deve ser submetido a extrações ácido-base.- Os alcalóides podem ser detectados por diversos métodos:

Exemplos:• Observação da extinção de luz UV em 254 nm, em placas de sílica gel com indicador de fluorescência.• Detecção de fluorescência em 366 nm pode ser muito útil para diversos alcalóides, como por exemplo, os alcalóides do esporão-de-centeio.- As reações gerais empregam:Reagente de Dragendorff (solução de iodo-bismutato de potássio em ácido diluído): precipitados laranja-avermelhados.Reagente de Mayer (solução de iodo-mercurato de potássio): precipitados brancos.Iodo-platinato de potássio: manchas violeta a azul acinzentadas.- Alcalóides tropânicos:A reação mais utilizada é aquela desenvolvida por Vitali e Gerard, em que uma quantidade mínima (até 0,0001 mg) de atropina, hiosciamina e escopolamina é tratada com HNO3 concentrado e ao resíduo obtido, adiciona-se solução de KOH em EtOH. Desenvolve-se coloração púrpura, passando a vermelho escuro e, finalmente incolor.- Alcalóides indólicos:Um revelador utilizado é o reagente de Ehrlich, que consiste na solução de cloreto de p-dimetilaminobenzaldeído a 5% em etanol. Desenvolve-se coloração laranja a marrom.

4.Triterpenos e esteróides:- A reação de Liebermann-Burchard é comumente empregada para a detecção de esteróides e triterpenos, consistindo de anidrido acético e ácido sulfúrico concentrado.- Coloração que varia de azul ao verde.- Para a detecção de esteróides insaturados, também pode ser empregada a reação de Salkowsky (ácido sulfúrico concentrado).a) Saponinas:- Para detectar a presença de saponinas, emprega-se o teste de formação de espuma, estável na presença de ácidos minerais diluídos.

b) Glicosídeos cardiotônicos:- A detecção da presença de glicosídeos cardiotônicos é realizada através de uma reação que caracteriza a existência do núcleo esteroidal (Liebermann-Burchard), além de outras que detectam a presença da lactona insaturada em C-17 e dos desoxi-açúcares.

Fracionamento e Isolamento • Os processos de fracionamento de extratos vegetais com vistas ao isolamento de substâncias ativas podem ser monitorados por ensaios direcionados para a avaliação de atividade biológica. • Fracionamento: é o processo em que se consegue uma fração parcialmente pura, ou seja, obtém-se um grupo de substâncias. • Isolamento: é o processo em que se consegue uma substância ou composto puro. • Atualmente, o monitoramento tem sido feito por cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a espectrometria de massas (CLAE/EM) e ressonância magnética nuclear (CLAE/RMN) . • Essa combinação possibilita direcionar as operações de fracionamento para o isolamento de compostos considerados de maior interesse em função dos dados espectrais. • Para o fracionamento e isolamento das substâncias têm-se dois grupos de métodos que são mais comuns: • Partição por solventes: é mais simples e barata, sendo utilizada para várias finalidades. • Métodos cromatográficos: são mais variados, podendo ser utilizados para o fracionamento, purificação e isolamento das substâncias. Partição por solventes • É um processo muito antigo. Desde tempos remotos é usado com diversas variantes para extrair, por exemplo, essências de flores. • Há mais de um século já vem sendo amplamente utilizada em diversos ramos “das ciências e das tecnologias”. • A partição abrange uma gama de fenômenos, que se estende desde a extração de contaminantes metálicos por solventes em plantas, do tratamento de efluentes industriais até a correlação do caráter lipofílico com as propriedades biológicas de um determinado grupo de substâncias. • É também conhecida como extração líquido-líquido. • É um método mais simples, rápido e barato que os métodos cromatográficos convencionais. • Utiliza-se apenas um funil de separação (ou de decantação) e os solventes apropriados para cada extração. • Pode-se iniciar o fracionamento de um extrato vegetal através da partição por solventes orgânicos de polaridade crescente ou através da partição ácido-base. • A extração líquido-líquido é uma técnica em que uma solução aquosa ou hidroalcoólica é colocada em contato com um segundo solvente orgânico imiscível com o primeiro solvente, a fim de colocar a transferência de um ou de mais de um soluto para o segundo solvente. • Esse método está baseado na propriedade física da substância: a solubilidade. • A partição implica numa dissolução seletiva e distribuição entre as fases de dois solventes imiscíveis entre si. • A concentração de cada um dos componentes em cada fase está relacionada com o coeficiente de partição ou distribuição apresentado por cada substância. • O coeficiente de partição entre dois solventes imiscíveis entre si pode ser representado pela fórmula. kp= concentração do soluto na fase orgânica/concentração do soluto na fase aquosa • A partição utilizando-se mais de um solvente é chamada de extração múltipla. • Os melhores rendimentos de extração são obtidos quando o volume total de solvente a ser utilizado na partição é dividido em alíquotas.

Métodos cromatográficos • São os procedimentos de separação e isolamento mais amplamente utilizados atualmente. • Identificação e análise de misturas e de substâncias isoladas: cromatografia analítica. • Isolamento de compostos: cromatografia preparativa. • A cromatografia é uma técnica de separação baseada na distribuição dos componentes de uma mistura entre um fluido (fase móvel ou eluente) e um adsorvente (fase estacionária). • A fase estacionária pode ser um sólido ou um líquido depositado num sólido inerte, empacotado numa coluna (aberta ou fechada) ou espalhado por uma superfície formando uma camada fina. Fase estacionária: sílica gel, alumina, poliamida. Fase móvel (eluente): solvente puro ou mistura de solventes.• A cromatografia de origem no termo grego “chroma+graphein” ganhou importância como método de separação por volta de 1903, com o botânico Mikhail Semenovich Tswett, nascido em Asti (Itália), sendo a sua família de origem russa. • Desenvolveu vários trabalhos experimentais no domínio da separação de extratos de plantas por adsorção diferencial em colunas. Carbonato de cálcio: fase estacionária Dissulfeto de carbono: eluente• Nestes experimentos, verificou-se a formação de bandas de cores diferentes nas colunas utilizadas devido à adsorção diferencial dos pigmentos corados, que migravam com velocidades diferentes e emergiam separadamente da coluna. • Este investigador foi mais tarde considerado o pai da cromatografia devido à sua valiosa contribuição no desenvolvimento desta técnica. • A cromatografia tem inúmeras aplicações como método de separação. A cromatografia gasosa é utilizada para separar componentes relativamente voláteis como álcoois, cetonas, aldeídos e outros. A cromatografia líquida é empregada normalmente para purificar produtos farmacêuticos, proteínas, aminoácidos, ácidos nucléicos, vitaminas e esteróides.

CLASSIFICAÇÃO DOS PROCESSOS CROMATOGRÁFICOS • A classificação da cromatografia, segundo o modo de separação, leva em conta os princípios físicos e químicos na partição dos solutos entre as 2 fases. a)Cromatografia de adsorção: As separações ocorrem através de interações eletrostáticas e forças de Van Der Waals entre a fase estacionária (sólido) e os componentes a separar da fase móvel (líquido ou gás).

A natureza da fase estacionária pode ser muito diversa, sílica gel, alumina ou celulose.b) Cromatografia de partição: É baseada nas diferenças de solubilidade dos componentes na fase estacionária (líquido) e na fase móvel (líquido). c) Cromatografia de permuta iônica: A separação ocorre devido diferentes tendências dos componentes iônicos ou ionizados permutarem com íons da fase estacionária, que, assim, são deslocados para a fase móvel. A afinidade entre os íons da fase móvel e o suporte pode ser controlada por alteração do pH e da força iônica do eluente. d) Cromatografia de afinidade: Ocorre uma ligação molecular específica e reversível entre o soluto e um ligante imobilizado na fase estacionária.

Esta técnica é utilizada especificamente para separar produtos biológicos.

Ex. ligações enzimas-substratos, anticorpos com substratos e receptores de hormônios. e) Cromatografia por exclusão molecular, denominada também como filtração em gel ou separação por peneiras moleculares: Separa os componentes segundo o tamanho efetivo (raio hidrodinâmico) das moléculas.

Moléculas grandes não penetram no interior do suporte (partículas porosas de gel) e movem-se mais rapidamente ao longo da coluna de onde emergem primeiro.

As moléculas pequenas têm a sua velocidade de deslocamento retardada porque penetram no gel, portanto, emergem da coluna mais tardiamente.

• A classificação da cromatografia, segundo a natureza da fase móvel, não leva em conta a fase estacionária. a)Cromatografia gasosa: É uma técnica que permite a separação de substâncias voláteis arrastadas por um gás através de uma fase estacionária. A fase estacionária pode ser um sólido ou um líquido que propicia a distribuição dos componentes da mistura entre as duas fases através de processos físicos e químicos, tais como a adsorção, diferenças de solubilidade, volatilidade ou partilha. A fase móvel é utilizado um gás, denominado gás de arraste, que transporta a amostra através da coluna cromatográfica até ao detector onde os componentes separados são detectados. Os gases mais utilizados são o hidrogênio, hélio e argônio. A cromatografia gasosa é usada, em geral, para fins analíticos. b) Cromatografia líquida: É uma técnica adequada para a separação dos componentes (espécies iônicas, macromoléculas, constituintes termolábeis, …) de soluções líquidas e pode ser utilizada para fins analíticos, fins preparativos e em escala comercial. A amostra é injetada na coluna usando uma micro-seringa (na cromatografia analítica) ou uma válvula de injeção (em sistemas preparativos) e é homogeneamente distribuída no topo da coluna. A fase móvel transportando a amostra é forçada a passar através da coluna por uma ação externa, que pode ser:

A simples força da gravidade – cromatografia de baixa pressão. Uma força mais intensa gerada por uma bomba – cromatografia de alta pressão também chamada cromatografia de alta

precisão (CLAE) de modo a superar a resistência da coluna ao escoamento da fase móvel. No processo de percolação os componentes os componentes migram com velocidades diferentes e são identificados à saída da coluna num detector que fornece um registo contínuo da composição da amostra analisada - cromatograma. Os detectores mais usados são os fotométricos (UV), de fluorescência – sensíveis a espécies que fluorescem - e os de índice de refração.