Interação entre Theobroma cacao e Crinipellis perniciosa

Dr. Abelmon GesteiraDCB/UESC

Interaction cacao-Crinipellis

Crinipellis (Cp) Basidiomiceto Fase patogênica e saprofitica

Sintomas Desenvolvimento anormal dos

caules e flores Formação de vassouras Infecção dos frutos

Conseqüências Econômicas Sociais Ambientais

Interação cacau-Cp: os sintomas

Bibliotecas de cDNA das interações compatível e incompatível Objetivo: Monitorar comparativamente a

expressão diferencial de genes resultantes interação cacau-Cp

Acessos utilizados

- TSH1188 (resistente) RT

- Catongo (susceptível) SP

Plantas cultivadas em casa de vegetação (Ceplac)

Inoculação e cultura controladas (mistura de esporos, spray, umidade,…)

75.000 basidiósporos/mL

Sintomas e pontos de coleta

Catongo

Plantio

24h, 48h, 72h 5 DAI

Inoculação (30d)

0

Extração de RNA: um novo método

Extração de RNA de cacau

rRNA 5S

rRNA 18SrRNA 28S

RNA extraído dos diferentes pontos de coletas de TSH e Catongo

Pool de RNA

24h, 48h, 72h Cada 5 DAI

70 diasPlantio Inoculação (30d)

0

Confecção das bibliotecas

Smart Creator Kit (Clontech)

Características das bibliotecas

The cocoa-Cp interaction libraries show a high library specificity (79.7 and 71.2%).

a Vector sequences and sequences of low quality were eliminated.bThe singletons present in each library independent of other libraries. The percentage was calculated as number of singletons/number

of sequences analyzed from the library.cTC = tentative contig. The contigs present in each library independent of other libraries.dThe unigene set for each library is the sum of singleton plus contigs for the library.eThe mean size of the unigene sequences.fThe redundancy of each library calculated as 1-(unigene library/number of sequence analyzed).g The unigenes(singletons+contigs) specific to the library. The percentage was calculated as (library-specific unigenes/unigene total).hThe percentage contribution of unigenesspecific to each library as a percentage of total unigenes.

2. Statistical analysis of the cocoa-Cplibraries

a Vector sequences and sequences of low quality were eliminated.bThe singletons present in each library independent of other libraries. The percentage was calculated as number of singletons/number

of sequences analyzed from the library.cTC = tentative contig. The contigs present in each library independent of other libraries.dThe unigene set for each library is the sum of singleton plus contigs for the library.eThe mean size of the unigene sequences.fThe redundancy of each library calculated as 1-(unigene library/number of sequence analyzed).g The unigenes(singletons+contigs) specific to the library. The percentage was calculated as (library- specific unigenes/unigene total).hThe percentage contribution of unigenesspecific to each library as a percentage of total unigenes.

2. Statistical analysis of the cocoa-Cplibraries

-

29.3

46.8

Contribution (%)h

52

58

46

Redundancy(%)f

1207 (42)

1719 (54)

Unigene

(%)d

2585 1065 (37)

Singletons (%)b

6884 3790

3355

Sequences generateda

2230347.53416024 Total

859 (71.2)3541422852 (87) SP1371 (79.7) 1153172 (88) RT

Library specific unigene (%)g

Mean size of the

sequencese

cSequences analyzed

Library

-

Contribution (%)h

Redundancy(%)f

2926

Unigene

(%)d

1520 (48)

Singletons (%)b

3271

3613

Sequences generateda

Total

SP

341199RT

Library specific unigene (%)g

Mean size of the

sequenceseTC

Sequences analyzed

Library

Distribuição dos ESTs por contigRT and SP libraries are represented by and ,

respectively.

ESTs as mais abundantesLibrary TC

N° de ESTs

in TC (%) Putative function of the gene family Species Expected Size (bp)

74 41 Unknown function homologue to Orf107a Arabido psis thaliana 2.10 - 27 521

9 37 Metallothionein - like protein Betula platyphylla 6.10 - 26 651

19 32 Seed protein homolog to trypsin inhibitor Theobroma cacao 2.10 - 93 929

112 28 Pathogenesis - related protein 4b Oryza sativa 1.10 - 34 1058

184 13 Proline -rich protein Gossypium hirsutum 5.10 - 10 184

76 12 Ribosomal RNA 18S Poncirus trifoliata 0.0 893

60 10 Unknown function Oryza sativa 6.10- 22 386

10 9 Metallothionein - like protein Petuniaxhybrida 2.10 - 16 489

20 9 No hit - - 829

RT

42 9 Dehydrin Vaccinium corymbosum 2.10-6 618

13 144 Metallothionein - like protein Betula platyphylla 6.10 - 26 669

42 49 Unknown function homologue to Orf107a Arabidopsis thaliana 1.10 - 27 266

20 29 Metallothionein - like protein Petuniaxhybrida 3.10 - 16 535

141 26 Ankyrin repeat family protein Arabidopsis thaliana 1.10-9 625

103 13 Metallothionein - like protein Gossypium hirsutum 1.10 - 24 495

57 10 Ankyrin repeat family protein Arabidopsis thaliana 7.10-7 505

1 8 Unknown function Oryza sativa 7.10-4 494

132 8 Putativ e copper chaperone Arabidopsis thaliana 2.10 - 28 631

38 6 Nuclear factor 1 Mus musculus 1.10 - 10 447

52 6 Unknown function Homo sapiens 1.10-8 497

SP

124 6 Unknown function Mus musculus 1.10-4 499

Comparação com outras bibliotecas de cacau

Venn diagram showing the distribution of the sequences present in cacao libraries.a. From Verica et al., 2004. b. From Jones et al., 2002.

Outros genes de interesse

Resistência/defesa: quitinases, HPRP, proteina rica em leucina, PRs, Bax inhibidor, U-box, cistatina, glucanase

PCD/necrose: superoxide dismutase, oxalato oxidase, proteínas relacionadas a senescência, proteases, proteasoma 26S

Parede celular: expansin, celulose sintase, peroxidases Detoxificação: transportador ABC, proteína de reparo Hormônios: proteína regulada por auxina, proteína reprimida por

auxina, Fatores de transcrição: myb fator, WRKY, bzip Transdução: receptor kinase, calmodulina, MAP kinase Outros: Formato deshidrogenase, acido cafeico, glicerol

aciltransferase, diacilglicerol kinase, transportador de sacarose

RT

SP Poucas diferenças quantitativas com

relação a classificação dos genes

Estudos funcionais de genes de interessem

Glicanase Proteases Factor de transcription WRKY Bax Inhibidor (regulador de morte celular) PR 10

Estudo funcional da PR10

Clonagem em vetor de expressão (pET28a) Expressão em bacteria pLysBl21 Purificação da proteina em coluna His-Tag

Estudo funcional da PR10

Teste de atividade anti-fungica (Cp) Em pseudo-colonias (Freitas et al. 2005)

Com 10 ug de PR10

Controle PR10 10 ug

Screening da biblioteca BACColaboração com o Cirad

Estudos de promotores; Sondas: 27 cDNA interação cacao-Cp; Identificação de 21 clones BACs; sub-clonagem e sequenciamento de

promotores.

Estudos de expressão / ArraysColaboração com o Cirad

PCR de todos ESTs de cada biblioteca de cDNA

Confeção dos macroarrays (Nylon) Hibridização com sondas Catongo e TSH Projeto en andameto

Tese Defendidas

Dahyana Santos Britto. Estudos funcionais de genes que codificam proteínas PR ( Pathogenesis Related Proteins) expressas em theobroma cacoa em resposta ao ataque de crinipellis perniciosa. 2005. Dissertação (Mestrado em Genética e Biologia Molecular) - Universidade Estadual de Santa Cruz,. Orientador: Abelmon da Silva Gesteira.

Stênio Carvalho Santos. Caracterização de hidrofobinas do fungo Crinipellis perniciosa (Stahel) Singer, Causador da Doença vassoura-de-bruxa do cacaueiro . 2005. 53 f. Dissertação (Mestrado em Genética e Biologia Molecular) - Universidade Estadual de Santa Cruz. Orientador: Julio Cezar de Mattos Cascardo

Joci Neuby Alves Macêdo. Caracterização funcional do indutor de necrose de Crinipellis perniciosa EM Theobroma Cacao L.. 2004. 54 f. Dissertação (Mestrado em Mestrado Em Genética e Biologia Molecular) - Universidade Estadual de Santa Cruz Orientador: Julio Cezar de Mattos Cascardo

Tese em Andamento

Braz Tavares da Hora Junior. Determinação de genes envolvidos na resistência do cacau ao Crinipellis perniciosa via arrays. Início: 2006. Dissertação (Mestrado em Genética e Biologia Molecular) - UESC, Orientador - Fabienne Micheli

Heliana Argolo Santos Carvalho. Estudo funcional de genes envolvidos na interação cacau-Crinipellis. Início: 2005. Dissertação (Mestrado em Genética e Biologia Molecular) - Universidade Estadual de Santa Cruz. Orientador – Fabienne Micheli

Livia Santos Lima. Mapeamento de genes de resistência obtidos pela genômica da interação cacau-crinipellis, aplicados à programas de melhoramento. Início: 2005. Dissertação (Mestrado em Genética e Biologia Molecular) - UESC. Orientador Fabienne Micheli

Maiza Alves Lopes. Estudo funcional de fatores de transcrição WRKY da interação cacau-Crinipellis perniciosa. Início: 2006. Tese (Doutorado em Genetica e Biologia Molecular) - Universidade Estadual de Santa Cruz. Orientador Fabienne Micheli

Sarah Alves de Melo. Análise bioquímica e funcional do gene relacionada à patogênese (PR10) isolado de uma biblioteca de cDNA da interação entre Theobroma cacao e Crinipellis perniciosa . Início: 2006. Dissertação (Mestrado em Genética e Biologia Molecular) - Universidade Estadual de Santa Cruz Orientador - Abelmon Gesteira

Agradecimentos

Fapesb UESC CIRAD Dr. Júlio Cascardo Dr. Nicolas Carles e Dra. Fabienne Micheli

pela a análise de bioinformática Dra. Karina Gramacho Aos Bolsistas Aline Clara, Lorena Blosi e

Antônio Carlos Rodrigues