Ciência Rural, Santa Maria, v. 29, n. 3, p. 527-531, 1999ISSN 0103-8478

Recebido para publicação em 01.06.98. Aprovado em 18.11.98

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INTEGRIDADE DAS MEMBRANAS PLASMÁTICA, NUCLEARE MITOCONDRIAL DE ESPERMATOZÓIDES OVINOS

CRIOPRESERVADOS COM ETILENO GLICOL 1

INTEGRITY OF SPERM PLASM MEMBRANE, NUCLEUS AND MITOCHONDRIAAFTER FREEZING RAM SEMEN WITH ETHYLENE GLYCOL

Luciana Bignardi de Soares Brisola2 Jairo Pereira Neves3 Paulo Bayard Dias Gonçalves3

João Francisco Coelho de Oliveira4 Marcelo Marcos Montagner5

1Trabalho realizado com suporte financeiro da FAPERGS, CNPq e EMBRAPA.2Médico Veterinário, autônomo, Palotina, PR.3Professor Titular, Doutor, Departamento de Clínicas de Grandes Animais, Centro de Ciências Rurais (CCR), Universidade Federal deSanta Maria (UFSM), Santa Maria, RS, 97105-900. E-mail: jpneves@lince.hcv.ufsm.br. Autor para correspondência.

4Professor Assistente, MSc., Departamento de Clínica de Grandes Animais, CCR, UFSM.5Médico Veterinário, aluno de mestrado do Programa de Pós-graduação, UFSM.

RESUMO

Este trabalho foi conduzido com o objetivo de avali-ar o sêmen ovino criopreservado com etileno glicol em relaçãoao glicerol, quanto à motilidade progressiva e vigor e, especial-mente, quanto à integridade das membranas plasmática, nucleare mitocondrial. Foram utilizados ejaculados de sêmen proveni-entes de dois carneiros da raça Ile-de-France, com padrõesmínimos de volume (0,5ml), turbilhonamento (2 de 0-5), motili-dade progressiva (65%), vigor (3 de 0-5), aspecto (cremoso fino,3x106 espermatozóides/mm3) e células normais (80%). Um totalde 25 pools foi dividido em duas alíquotas, as quais foram, poste-riormente, congeladas com etileno glicol a 0,5M ou glicerol a0,72M em pellets. Os parâmetros utilizados, para avaliar odesempenho dos crioprotetores, foram a motili dade progressiva,vigor espermático e integridade do acrossomo e das membranasplasmáticas dos espermatozóides. A motilidade e vigor foramaferidos no sêmen fresco, resfriado, descongelado, mantido a38°C por 5 horas de incubação (TTL- teste de termorresistêncialento) e à temperatura de 45°C por 30 minutos (TTR- teste determorresistência rápido). Não houve diferença entre o etilenoglicol e o glicerol para a avaliação da morfologia do acrossomo,motilidade progressiva e vigor. As células espermáticas criopre-servadas com etileno glicol apresentaram maior integridade dasmembranas plasmática, nuclear e mitocondrial do espermatozói-de. O etileno glicol é mais eficiente do que o glicerol para pre-servar a integridade das membranas espermáticas na congelaçãode sêmen ovino.

Palavras-chave: sêmen, etileno glicol, membranas, ovinos.

SUMMARYThe aim of the present experiment was to evaluate

the effect of ethylene glycol, in relation to glycerol, as acryoprotective agent for preserving ovine spermatic cells. Thesemen had to present a minimal quality to be used, regardingvolume (0.5 ml), wave motion (score of 2, from 0 to 5),percentage of progressively motile spermatozoa (65%), rate ofprogressive motility (score of 3, from 0 to 5), sperm cellconcentration (3x106 cells/mm3) and normal sperm morphology(80%). Each pool of semen from ejaculates of two rams wasdivided into two equal subsamples. One subsample was frozenwith ethylene glycol and the other with glycerol. The parametersused to evaluate the semen were sperm motility, vigor, acrossomestatus and membrane integrity. Sperm motility was evaluated infresh semen, cooled semen, frozen semen, after 5 hours at 38oC orafter 30 minutes at 45oC. No difference was observed betweenethylene glycol and glycerol for acrossome status and spermmotility. The sperm cells that were preserved with ethylene glycolshowed more integrity of the plasmatic, nuclear andmitochondrial membranes. From the viewpoint of cell membraneintegrity, it can be concluded that ethylene glycol gives higherprotection to the sperm cell than glycerol.

Key words: semen, ethylene glycol, membrane integrity, ram.

INTRODUÇÃO

A inseminação artificial (IA) é a técnicamais difundida e importante para o melhoramento

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genético. Através da IA, grande número de fêmeaspodem ser inseminadas com sêmen de um reprodu-tor com alto valor genético, possibilitando elevar, acurto prazo e com menor custo, a qualidade genéticado rebanho. Desde a primeira preservação criobioló-gica de sêmen ovino, realizada por EMMENS &BLACKSHAW (1950), até o momento, não há mé-todo eficiente de preservação espermática e deposi-ção na fêmea que proporcione percentagens de pari-ção semelhantes àqueles encontrados com montanatural ou quando se utiliza inseminação por vialaparoscópica. Esta última técnica tem sido restrita arebanhos de elevado valor genético em função doelevado custo com sincronização de cios, equipa-mentos e mão-de-obra especializada. Não haveriaesse custo elevado, se a IA com sêmen congeladofosse por via cervical com satisfatórios índices deparição. Portanto, é importante desenvolver ummétodo eficaz de criopreservação de sêmen ovino.Por isso, as investigações sobre os crioprotetores esua ação sobre as células espermáticas são funda-mentais.

Os resultados de prenhez dos animais quesão submetidos a IA por via cervical atingem índicesmáximos de 40% (MAXWELL & SALAMON,1993). A baixa fertilidade do sêmen ovino congela-do é atribuída, em grande parte, às alterações sofri-das na estrutura das membranas plasmática, acros-somal e mitocondrial durante o resfriamento, con-gelação e descongelação (PARKS & GRAHAM,1992). A utilização de corantes biológicos permiteavaliar a integridade do acrossomo e da membranaplasmática da célula espermática nas diferentesespécies (GREEN, 1992; VÁSQUEZ et al., 1992;CROSS & WATSON, 1994).

O presente trabalho teve por objetivoprincipal avaliar o sêmen ovino criopreservado cometileno glicol ante o glicerol quanto à motilidade evigor e, especialmente, quanto à integridade dasmembranas plasmática, nuclear e mitocondrial.

MATERIAL E MÉTODOS

Foram utilizados dois carneiros da raçaIle-de-France, com dois anos de idade, previamentesubmetidos à avaliação andrológica, em bom estadosanitário e nutricional, mantidos em regime de semi-confinamento. Um total de 25 pools de sêmen foiobtido a partir de coletas com vagina artificial eauxílio de manequim. Após a coleta, o sêmen foicolocado em banho-maria à temperatura de 30°C,quando se procedeu a sua análise. Os ejaculados queforam utilizados apresentaram os seguintes padrõesmínimos: volume de 0,5ml, turbilhonamento nível 2(0-5), motilidade progressiva de 65%, vigor 3 (0-5),

aspecto cremoso fino (3x106 espermatozóides/mm3)e 80% de células normais. A congelação do sêmenfoi realizada segundo a técnica de EVANS &MAXWELL (1987), modificada por MORAES(1996) para pellets com volume de 130µl, corres-pondendo a uma concentração mínima de 100 x 106

espermatozóides por dose. Utilizou-se diluente TRISna proporção de 1+3 (uma parte de sêmen para trêsde diluidor), dividido em duas alíquotas de acordocom o crioprotetor utilizado. Os diluentes continhametileno glicol (0,5M) e glicerol (0,72M). A congela-ção foi realizada em vapor de nitrogênio líquido,utilizando placa de acrílico de 4,0mm de espessura,mantida a uma distância de 3,0 cm acima do nível donitrogênio. O descongelamento foi realizado embanho-maria a 38°C por 30 segundos, colocando-seos pellets em tubo de ensaio de vidro, contendo0,5ml de solução fisiológica e agitando até completadiluição.

Para a avaliação do desempenho dos crio-protetores, a motilidade progressiva e vigor foramaferidos no sêmen fresco, resfriado, descongelado,mantido a 38°C por 5 horas de incubação, corres-pondendo ao TTL e mantido à temperatura de 45°Cpor 30 minutos de incubação, correspondendo aoTTR. Tendo em vista a avaliação da integridade doacrossomo, foram confeccionadas lâminas comesfregaços de sêmen, empregando-se posteriormentea técnica de KOVÁCS & FOOTE (1992). No senti-do de classificar as alterações acrossomáticas e asobrevivência espermática, foram consideradas seisclasses: espermatozóide vivo com acrossomo íntegro(AVI), espermatozóide vivo com acrossomo lesado(AVL), espermatozóide vivo com acrossomo au-sente (AVS), espermatozóide morto com acrossomoíntegro (AMI), espermatozóide morto com acrosso-mo lesado (AML), espermatozóide morto comacrossomo ausente (AMS).

A integridade da membrana plasmáticafoi avaliada através da coloração fluorescente, utili-zando-se da mistura de corantes biológicos, sondasfluorescentes, à base de diacetato de carboxifluores-ceínaa (DIC) e iodeto de propídioa (IP), de acordocom o método descrito por HARRISON &VICKERS (1990). Foram consideradas células es-permáticas com membranas plasmáticas íntegrasquando foi observado acúmulo de DIC (fluorescên-cia verde) ao longo da cabeça e flagelo do esperma-tozóide, sem acúmulo de IP (fluorescência verme-lha). Ao detectar um acúmulo de DIC na peça inter-mediária e acúmulo de IP somente na cabeça, consi-deraram-se células espermáticas com membranasplasmática e acrossomal danificadas e membranasmitocondriais intactas. Foram classificadas comocélulas espermáticas com membranas plasmáticas

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danificadas e mitocondriais intactas ao observar umacúmulo de DIC na peça intermediária e regiãoacrossomal e acúmulo de IP somente na cabeça doespermatozóide. Ao verificar acúmulo de DIC naregião acrossomal e acúmulo de IP na cabeça e peçaintermediária, as células espermáticas foram consi-deradas como apresentando membranas plasmática emitocondriais danificadas e membrana acrossomalíntegra. Finalmente, ao observar acúmulo de IP nacabeça e peça intermediária, sem acúmulo de DIC,as células espermáticas foram classificadas comotendo membranas plasmáticas, acrossomal e mito-condriais danificadas.

O experimento foi implementado seguin-do o desenho experimental em blocos casualizados.Cada pool de sêmen foi considerado um bloco e foidividido em dois grupos, sendo que uma fração desêmen alocada para um dos grupos foi congeladacom etileno glicol e a outra fração com glicerol.Tendo em vista que os dados não apresentavam umadistribuição normal, os mesmos foram reescritossegundo seus postos (CONOVER & IMAN, 1981),utilizando o PROC RANK no programa estatísticoSAS. Os resultados foram analisados pelo PROCGLM, utilizando o seguinte modelo estatístico(NETER et al. 1985):

Yij = µ+αi+βj +(αβ)ij +εij

onde Yij são os parâmetros estudados submetidos àtransformação para obter uma distribuição possívelde ser analisada por métodos paramétricos, µ é aconstante comum a todas as observações, αi é oefeito do grupo (glicerol ou etileno glicol), βj é oefeito do bloco (pool de sêmen), os efeitos do blocosão aleatórios, (αβ)ij é a interação entre os fatores,tendo sido retirado do modelo quando a interaçãonão foi significativa, e εij é o efeito do erro experi-mental.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A avaliação da motilidade e vigor esper-mático no transcorrer do processo de congelação,como após os testes de termorresistência, utilizandocomo crioprotetores o etileno glicol (0,5M), forne-ceu índices similares àqueles resultantes com o em-prego do glicerol (0,72M), conforme demonstradonas figuras 1 e 2. Os testes de termorresistênciaavaliam o comportamento das células espermáticasapós período de incubação, confrontando a resistên-cia à temperatura e o tempo de incubação. Em rela-ção à morfologia acrossomal, é possível afirmar quenão houve diferença significativa entre os dois crio-protetores empregados para as classes AVI, AVL,

AVS, AMI, AML e AMS (Figura 3). No decorrer daavaliação das lesões acrossomáticas, pela técnica deKOVÁCS & FOOTE (1992), observou-se que essasocorrem similarmente tanto nas células vivas comonas mortas. A percentagem de acrossomos morfolo-gicamente lesados, detectados por essa técnica, nãoultrapassou o limite máximo de 70% proposto porEVANS & MAXWELL (1987) para sêmen ovinosubmetido à congelação. Em acordo comSALAMON & MAXWELL (1995), de que apenas20-30% das células espermáticas ovinas permane-cem íntegras após a congelação e descongelação, osíndices verificados no presente trabalho permanece-ram em torno de 36% no sêmen congelado, tantocom etileno glicol, como com glicerol.

Figura 1 - Percentagem comparativa da motilidade espermáticaentre etileno glicol (0,5M) e glicerol (0,72M) avalia-da no sêmen resfriado (RESF), descongelado(DESC), mantido a 46ºC por 30 minutos (Teste determorresistência rápido, TTR) e mantido a 38ºC por5 horas (Teste de termorresistência lento, TTL). Osdois crioprotetores apresentaram índices similaresquanto à motilidade progressiva (p>0,05).

Figura 2 - Valores comparativos do vigor espermático (0-5) entreetileno glicol (0,5M) e glicerol (0,72M), avaliadas nosêmen resfriado (RESF), descongelado (DESC), man-tido a 46ºC por 30 minutos (Teste de termorresistênciarápido, TTR) e mantido a 38ºC por 5 horas (Teste determorresistência lento, TTL). Os dois crioprotetoresapresentaram índices similares quanto ao vigor(p>0,05).

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Foram observadas diferenças significati-vas entre os dois crioprotetores empregados quanto àintegridade das membranas espermáticas (P<0,001;figura 4). As percentagens de membranas íntegras(verde), danificadas (vermelhas) e parcialmentedanificadas (verde/vermelha) foram de 36,42%;53,64%; 9,94% e 33,62%; 58,44%; 7,94% de mem-branas íntegras, respectivamente, para o etilenoglicol e glicerol. A categoria que apresenta fluores-cência verde ao longo de toda célula e que indicaintegridade das membranas está fundamentada nosachados de GARNER et al. (1986), quando propuse-ram o mecanismo de ação dos corantes fluorescen-tes, DIC e IP. Esses autores salientaram que o DIC,por ser um éster polar, não fluorescente, atravessa amembrana plasmática e, dentro da célula, é hidroli-sado por esterases inespecíficas, resultando na for-mação de um composto impermeável à membranaplasmática que fluoresce em verde, denominado de6-carboxifluoresceína. Ao contrário, o IP possuiforte afinidade pelos ácidos nucléicos, mostrando-seimpermeável à membrana plasmática, fluorescendoem vermelho somente em células com membranasdanificadas. A iluminação, com luz ultravioleta eutilização do filtro para fluoresceína (luz azul), re-velou espermatozóides fluorescentes de cor verde,indicando que o IP não atravessa a membrana ínte-gra. Na segunda categoria, que apresentou fluores-cência vermelha na cabeça e peça intermediária,segundo as observações do mecanismo de ação doscorantes semelhantes aos citados anteriormente, econsiderando que a cabeça e a peça intermediária dogameta masculino contém DNA, espera-se a colora-

ção vermelha. Lesões na membrana mitocondrialtambém são referidas como as principais injúriasinduzidas pelo processamento de congelação e pelochoque térmico causados às células durante a prepa-ração para a inseminação. Se a célula espermáticaovina for dependente do metabolismo respiratóriodurante a passagem cervical, esta injúria à membra-na mitocondrial pode representar um fator de limita-ção da fertilidade em sêmen descongelado, comoafirmam WINDSOR & WHITE (1995) eMAXWELL & WATSON (1996).

A interpretação da terceira categoria, in-dicando espermatozóides que apresentavam fluores-cência verde na peça intermediária, acúmulo de DIC,foi que as membranas das mitocôndrias estavamíntegras, resultado da atividade das esterases dentrodas organelas. O acúmulo de IP na cabeça dos es-permatozóides é indicativo da penetração do corantenas membranas plasmática e nuclear danificadas, oqual, unindo-se ao DNA do núcleo, produz umafluorescência de coloração vermelha, revelada pelaincidência da luz ultravioleta.

HOLT & NORTH (1984 e 1986) relata-ram a ocorrência de alterações na organização lipídi-ca das membranas no decorrer de diferentes fasestérmicas, com modificação de sua permeabilidade.Fato semelhante foi constatado no presente experi-mento, utilizando sondas fluorescentes. Após osprocedimentos de criopreservação, aos quais ascélulas espermáticas foram expostas, foi observadoum incremento de células com lesões nas membra-nas plasmáticas. Importante destacar o efeito que o

Figura 3 - Avaliação da integridade acrossomática e percentagemde células vivas e mortas utilizando como crioproteto-res o etileno glicol (0,5M) e o glicerol (0,72M). Os pa-râmetros avaliados foram espermatozóides vivos comacrossomo íntegro (AVI), vivos com acrossomo lesado(AVL), vivos com acrossomo ausente (AVS), mortoscom acrossomo íntegro (AMI), mortos com acrossomolesado (AML) e mortos com acrossomo ausente(AMS). Quanto à integridade acrossomática e percen-tual de células vivas e mortas não houve diferença en-tre os crioprotetores testados (p>0,05).

Figura 4 - Índices de integridade das membranas plasmática,nuclear e mitocondrial, com sondas fluorescentes,nos diferentes tratamentos. A categoria VD (mem-branas íntegras) é fluorescência verde ao longo detoda célula, a VM (membranas danificadas) é fluo-rescência vermelha na cabeça e peça intermediária eVD/VM (membranas parcialmente danificadas) éfluorescência verde na peça intermediária e fluores-cência vermelha na cabeça do espermatozóide. Apercentagem de membranas espermáticas íntegras foisuperior quando foi utilizado o etileno glicol em umaconcentração de 0,5M. Letras distintas, acima decada barra, representam diferença estatística entre ostratamentos (p<0,001).

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processo de congelação exerce sobre as células es-permáticas, aumentando a incidência de acrossomosdanificados (KOVÁCS & FOOTE, 1992), e mesmoaqueles espermatozóides morfologicamente conside-rados normais podem apresentar-se com a membra-na plasmática lesada (HARRISON & VICKERS,1990).

A melhor preservação das membranas es-permáticas, verificada nas células criopreservadascom etileno glicol, pode ser explicada pela sua maiorvelocidade de penetração celular, diminuindo a con-centração de sais no interior dos espermatozóides,atenuando os efeitos deletérios das estruturas esper-máticas (MORAES, 1996). MERYMAN et al.(1977) destacam que o etileno glicol possui a propri-edade de conferir maior estabilidade às estruturaslipídicas das membranas espermáticas, protegendoas células das alterações provocadas pelo choquetérmico.

Os baixos índices da inseminação artifici-al via cervical com sêmen congelado, obtidos emovinos, podem ser em conseqüência de alteraçõesprovocadas nas células espermáticas durante a con-gelação do sêmen. Nesse experimento, foi constata-do que o sêmen congelado com etileno glicol ouglicerol apresentou um decréscimo acentuado namotilidade progressiva nos testes de termorresistên-cia, considerado por MOLINIA et al. (1994) comosendo conseqüência de um aumento no metabolismocelular de espermatozóides submetidos à congelaçãoem decorrência da hiperatividade espermática. Noentanto, houve um incremento no percentual demembranas espermáticas íntegras quando o sêmenfoi congelado na presença de etileno glicol em rela-ção ao glicerol. Considerando os resultados obtidos,conclui-se que o etileno glicol é mais eficiente doque o glicerol para preservar a integridade das mem-branas espermáticas na congelação do sêmen ovino.

FONTES DE AQUISIÇÃO

a – Sigma Chemical Company. St. Louis. Mo. USA.

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