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CAMILA SANCHES CIBANTOS AMARAL DE MODENA INFLUÊNCIAS DE UM INIBIDOR SELETIVO DA MONOAMINO-OXIDASE TIPO-B (IMAO-B) NA SENSIBILIZAÇÃO COMPORTAMENTAL PARA
ANFETAMINA EM CAMUNDONGOS
São Paulo 2006
Dissertação apresentada ao Instituto de Psicologia da Universidade de São Paulo como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Psicologia.
CAMILA SANCHES CIBANTOS AMARAL DE MODENA INFLUÊNCIAS DE UM INIBIDOR SELETIVO DA MONOAMINO-OXIDASE TIPO-B (IMAO-B) NA SENSIBILIZAÇÃO COMPORTAMENTAL PARA
ANFETAMINA EM CAMUNDONGOS
São Paulo 2006
Dissertação apresentada ao Instituto de Psicologia da Universidade de São Paulo como parte dos requisitos para obtenção do grau de Mestre em Psicologia. Área de concentração: Neurociências e Comportamento Orientador: Profa. Dra. Antonia Gladys Nasello
Data da Defesa: 09/06/2006
Banca Examinadora
Prof. Dr. Luciano Freitas Felício
Julgamento: Aprovada Assinatura:
Profa. Dra.Rosana Camarini
Julgamento: Aprovada Assinatura:
Profa. Dra. Antonia Gladys Nasello
Julgamento: Aprovada Assinatura:
Engraçado perceber que buscamos, enveredamos por tantos caminhos,
aprendemos, crescemos, para no final descobrir que é na simplicidade das coisas,
dos atos e das pessoas que residem todos os segredo de ser feliz. A poesia está presente no dia-a-dia, nas ações que consideramos irrelevantes,
nas conversas que avaliamos como irrelevantes, nas conversas que avaliamos como banais,
nas gargalhadas despretenciosas ao lado dos amigos. Viva a simplicidade das coisas!
Edras Matheus
Dedico
Aos meus pais:
Jayle e Eliana
…..à vocês que sempre me ensinaram, apoiaram, acreditaram,
confiaram, obrigada por todo carinho, incentivo, exemplos, apoio,
ajuda e AMOR!!
AMO MUITO VOCÊS!!
AO MEU AMOR
Guilherme
Por sempre estar ao meu lado me apoiando, incentivando, acreditando,
confiando, por todo o seu amor!!
A VOCÊ, MEU AMOR ETERNO!!
Agradecimentos
À minha orientadora, Professora Dra.Antonia Gladys Nasello, minha mãe cientifica, pelo exemplo, orientação, atenção, amizade, carinho, por ter acreditado e confiado em mim. Ao Professor Dr.Luciano Freitas Felício, meu pai cientifico, pela ajuda, carinho, amizade, paciência. À Professora Dra.Luciele Guaraldo pelas sugestões apresentadas por ocasião do exame de qualificação. À Fabiana Costa pelos ensinamentos, paciência e amizade. Às minhas MELHORES AMIGAS Beth, Belzinha e Marcinha pelo apoio, carinho e amizades incondicionais! Por todos os momentos maravilhosos e inesquecíveis que passamos juntas. AMO VOCÊS!!! Às minhas amigas Aline, Amanditas, Cynthia, Daniely, Domenica, Érika, Gabriela, Iara, Ivone Isabel, Luciana Faccas, Luciana “Dark”, Soraya, Tatiane, Viviane. À professora Dra.Claudia Cuningan do laboratório de Hipertensão do Incor pela ajuda, apoio, ensinamentos e paciência. Ao Leandro Cardoso do Laboratório de Hipertensão do Incor pela ajuda, apoio, paciência e ensinamentos. Ao Gustavo pela ajuda e ensinamentos. Ao Prof. Dr.Cláudio Alvarenga de Oliveira e a Priscila do laboratório de dosagens Hormonais do Departamento de Reprodução da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo. Ao Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo onde realizei este trabalho. A todo pessoal do Biotério da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo: Claudia, Idalina, Rosires, Herculano e Nelsinho. Ao pessoal do laboratório de Farmacologia do Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo: Magali, Ricardo e Priscila. A toda minha família e a todos os meus amigos que sempre estiveram presentes, confiando, torcendo e me incentivando durante a realização deste trabalho. A Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo –FAPESP- pelo auxílio-pesquisa concedido.
A todas as pessoas que estiveram presentes na minha vida durante o período de realização deste trabalho, que acreditaram, me apoiaram, incentivaram nesta etapa tão importante na minha vida!
Este trabalho foi desenvolvido nas dependências do Laboratório de Biologia Molecular em Neurociências e Comportamento da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo. Teve suporte financeiro do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) processo n°130700/2005-3. E da Fundação de Amparo à Pesquisa do estado de São Paulo (FAPESP) processo n°04/12700-8.
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
RESUMO
ABSTRACT
1 INTRODUÇÃO.....................................................................................
1.1 Dependência à drogas......................................................................
1.2 Sensibilização comportamental........................................................
1.3 Circuitos dopaminérgicos cerebrais..................................................
1.4 Eixo hipotálamo-pituitário-adrenal....................................................
1.4.1 Mineralocorticóides......................................................................
1.4.2 Glicocorticóides............................................................................
1.4.3 Corticosterona..............................................................................
1.5 Sistema cardiovascular e pressão arterial........................................
1.5.1 Sistema renina-angiotensina.........................................................
1.5.2 Sistema nervoso autonômico........................................................
1.5.3 Noradrenalina e acetilcolina..........................................................
1.6 Anfetamina........................................................................................
1.7 Selegilina..........................................................................................
18
18
19
21
24
24
25
26
27
27
28
29
30
31
2 OBJETIVOS.........................................................................................
2.1 Objetivo Geral...................................................................................
2.2 Objetivos Específicos.......................................................................
37 37 37
3 MATERIAL E MÉTODOS....................................................................
3.1 Animais.............................................................................................
3.2 Drogas..............................................................................................
3.3 Avaliações Comportamentais...........................................................
3.3.1 Quantificação da atividade locomotora em campo aberto.............
3.3.2 Avaliação do comportamento no labirinto em cruz elevado..........
3.4 Medida da pressão arterial...............................................................
3.5 Dosagem Hormonal..........................................................................
3.6 Análise Estatística............................................................................
39
39
40
40
40
42
43
44
45
4 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL E RESULTADOS.......................
4.1 Delineamento Experimental Geral – tratamento crônico..................
4.2 Delineamento Experimental Geral – tratamento agudo....................
4.3 Delineamento Experimental Geral – pressão arterial.......................
4.4 Experimento 1...................................................................................
4.4.1 Experimento 2................................................................................
4.4.2 Experimento 3................................................................................
4.5 Experimento 4...................................................................................
4.5.1 Experimento 5................................................................................
4.5.2 Experimento 6................................................................................
4.6 Experimento 7...................................................................................
47
44
48
50
51
61
63
65
73
75
77
5 DISCUSSÃO........................................................................................
85
6 CONCLUSÃO......................................................................................
96
REFERÊNCIAS......................................................................................
99
LISTA DE FIGURAS
Figura n. Página
1 Biotransformação da selegilina........................................................
33
2 Produção de radicais livres pelo metabolismo da DA.....................
35
3 (A) Aparelho do campo aberto......................................................... (B) Esquema do aparelho do campo aberto com zonas central e
periférica....................................................................................
41
41
4 Labirinto em cruz elevado.................................................................
43
5 Sistema Computadorizado de medida da pressão arterial indireta..
44
6 Efeitos da anfetamina em animais tratados com solução salina a 0,9% na fase de pré-tratamento.......................................................
18
7 Efeitos da anfetamina em animais tratados com anfetamina na fase de pré-tratamento.....................................................................
18
8 Efeitos da anfetamina em animais tratados com solução salina 0,9% na fase de pré-tratamento e que receberam IMAO-B durante a abstinência.....................................................................................
18
9 Efeitos da anfetamina em animais tratados com anfetamina durante a fase de pré-tratamento e que receberam IMAO-B durante a abstinência.......................................................................
19
10 Efeitos da IMAO-B em animais tratados com solução salina 0,9% durante a fase de pré-tratamento.....................................................
19
11 Efeitos da IMAO-B em animais tratados com IMAO-B na fase de pré-tratamento..................................................................................
19
12 Efeitos da anfetamina em animais tratados com IMAO-B na fase de pré-tratamento.............................................................................
20
13 Efeitos da administração aguda de solução salina 0,9% no comportamento avaliado no campo aberto e no labirinto em cruz elevado.............................................................................................
20
14 Efeitos da administração aguda de anfetamina no comportamento avaliado no campo aberto e no labirinto em cruz elevado...............
21
15 Efeitos da administração aguda de IMAO-B no comportamento avaliado no campo aberto e no labirinto em cruz elevado...............
21
16 Efeitos da administração aguda de solução salina na freqüência
cardíaca e pressão arterial...............................................................
17 Efeitos da administração aguda de anfetamina na freqüência cardíaca e pressão arterial...............................................................
18 Efeitos da administração aguda de selegilina na freqüência cardíaca e pressão arterial...............................................................
19 Efeitos do tratamento crônico com IMAO-B ou anfetamina na avaliação da distância percorrida (cm) no campo aberto.................
26
20 Efeitos do tratamento crônico com IMAO-B ou anfetamina na avaliação da velocidade média (cm/s) no campo aberto..................
27
21 Efeitos do tratamento crônico com IMAO-B ou anfetamina na avaliação do tempo em movimento (s) no campo aberto.................
28
22 Efeitos do tratamento crônico com IMAO-B ou anfetamina na avaliação do tempo de permanência (s) no campo aberto...............
29
23 Efeitos do tratamento crônico com IMAO-B ou anfetamina na avaliação do número de levantar e no campo aberto.......................
30
24 Efeitos do tratamento crônico com IMAO-B ou anfetamina na avaliação da porcentagem do número de entradas nos braços abertos no labirinto em cruz elevado................................................
32
25 Efeitos do tratamento crônico com IMAO-B ou anfetamina na avaliação da porcentagem do tempo de permanência nos braços abertos no labirinto em cruz elevado................................................
32
26 Efeitos do tratamento crônico com selegilina ou anfetamina, nas concentrações séricas de corticosterona (ng/ml).............................
27 Efeitos do tratamento crônico com selegilina ou anfetamina, nas concentrações séricas de corticosterona (ng/ml).............................
28 Efeitos do tratamento agudo com selegilina ou anfetamina na avaliação da distância percorrida (cm) no campo aberto.................
37
29 Efeitos do tratamento agudo com selegilina ou anfetamina na avaliação da velocidade média (cm/s) no campo aberto..................
38
30 Efeitos do tratamento agudo com selegilina ou anfetamina na avaliação do tempo em movimento (s) no campo aberto.................
39
31 Efeitos do tratamento agudo com selegilina ou anfetamina na avaliação do tempo de permanência (s) no campo aberto...............
40
33 Efeitos do tratamento agudo com selegilina ou anfetamina na avaliação da porcentagem do número de entradas nos braços abertos no labirinto em cruz elevado................................................
43
34 Efeitos do tratamento agudo com selegilina ou anfetamina na avaliação da porcentagem do tempo de permanência nos braços abertos no labirinto em cruz elevado................................................
43
35A
Efeitos do tratamento agudo com selelegilina, nas concentrações séricas de corticosterona (ng/ml)......................................................
35B
Efeitos do tratamento agudo com selegilina, nas concentrações séricas de corticosterona (ng/ml)......................................................
36 Efeitos do tratamento agudo com solução salina, anfetamina ou selegilina na freqüência cardíaca.....................................................
37 Efeitos do tratamento agudo com solução salina, anfetamina ou selegilina na pressão arterial............................................................
39 Biossíntese das catecolaminas........................................................ 91
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ACTH Hormônio adrenocorticotrópico
AD Adrenalina
AMPc Monofosfato de adenosina cíclico
CRH Hormônio de liberação da corticotropina
DA Dopamina
ECA Enzima conversora de angiotensina
HPA Hipotálamo-pituitária-adrenal
NA Noradrenalina
MAO Monoamina-oxidase
NIDA National Institute on Drug Abuse
SNC Sistema Nervoso Central
5-HT Serotonina
K+ Potássio
Ca2+ Cálcio
Na+ Sódio
RESUMO
MODENA, C.C. Influências de um inibidor seletivo da monoamino-oxidase tipo-B (IMAO-B) na sensibilização comportamental para anfetamina em camundongos. São Paulo, 2006......p. Dissertação (Mestrado em Neurociências e Comportamento). Instituto de Psicologia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2006.
A sensibilização comportamental é caracterizada por aumento no efeito comportamental de uma droga após administrações repetidas. Este fenômeno é intensamente aplicado em estudos com modelos animais que enfocam a dependência de drogas. A maioria destas drogas promove adaptações em sistemas de neurotransmissão, (ex. sistema dopaminérgico), como é o caso da anfetamina, morfina e etanol. No entanto, estudos que avaliam os efeitos de drogas administradas durante a abstinência e posterior expressão de sensibilização comportamental são escassos. Neste trabalho avaliou-se as influências de um inibidor seletivo da monoamino-oxidase tipo-B (selegilina, 10mg/Kg) na sensibilização comportamental para anfetamina (2mg/Kg) observada em camundongos. Os resultados mostraram que o tratamento crônico com anfetamina promoveu sensibilização comportamental, efeito também observado no tratamento com selegilina, o qual resultou em sensibilização prévia para a anfetamina, além de potencializar os efeitos desta. Evidenciou-se também que a sensibilização comportamental não é um processo dependente dos níveis de corticosterona. O tratamento agudo com selegilina reduziu a atividade locomotora observada em campo aberto devido a hipotensão e bradicardia causadas pela mesma. Além disso, a selegilina agudamente também causou diminuição nos níveis de coticosterona motivo pelo qual é utilizada em clínica veterinária para o tratamento da Síndrome de Cushing. O tratamento agudo com anfetamina promoveu aumento no parâmetro comportamental, evidenciando seu efeito estimulante, mas não causou hipertensão. Palavras-chave: Sensibilização. Anfetamina. Selegilina. Camundongos
ABSTRACT
MODENA, C.C. Influences of a selective inhibitor monoamine oxidase type-B (IMAO-B) in behavior sensitization for amphetamine in mice. São Paulo, 2005. 80p. Boneco da Dissertação de Mestrado para qualificação. Neurociências e Comportamento, Instituto de Psicologia, Universidade de São Paulo.
The behavior sensitization is defined by a progressive enhancement of the behavioral response after repeated treatments. This phenomenon is intensely applied in studies with animal models that focus drug addiction. The majority of these drugs promote adaptations in neurotransmission (ex. dopaminergic system) as is the case of amphetamine, morphine and ethanol. However, studies which evaluate the drugs effects during abstinence and the induction of behavioral sensitization are scarce. In the present study we evaluated the influences of a selective inhibitor monoamine oxidase type-B (selegiline, 10mg/Kg) in the behavioral sensitization for amphetamine (2mg/Kg) in mice. The results shown that the chronic treatment with amphetamine promoted behavioral sensitization, like selegiline treatment that results in previous sensitization for amphetamine therefore potentiate the effects of this drug. Showed up that behavioral sensitization is not dependent process of the levels of corticosterone. The acute treatment with selegiline reduced the locomotor activity in open field test because of hypotension and decrease in heart rate. Another important acute effect of selegiline is the decrease in corticosterone levels; this is the cause that this drug is using in treatment of Cushing syndrome in veterinary. The acute treatment with amphetamine promoted increase in the locomotor activity, showing this stimulant effect but did not show effects in the blood pressure. Key-words: Sensitization. Amphetamine. Selegiline. Mice.
1 INTRODUÇÃO
1.1 Dependência à Drogas
A dependência à drogas é um fenômeno complexo caracterizado
por um desejo compulsivo de buscar/obter a droga, persistindo mesmo em
face às conseqüências adversas de seu uso. Para muitas pessoas, a
dependência à drogas se torna crônica, reincidindo após longos períodos
de abstinência (ROBINSON e BERRIDGE, 1993). Segundo LAMBERT e
KINSLEY (2005) a dependência envolve o aspecto fisiológico e o
psicológico do usuário. O fisiológico é caracterizado por modificações na
fisiologia do usuário durante o uso contínuo da droga. O aspecto
psiológico se caracteriza pelos efeitos da droga no usuário que a necessita
para realizar suas tarefas ou somente para poder “viver” cada novo dia!
Mais de três décadas de pesquisas têm mostrado que a
dependência de drogas é passível tanto por tratamento medicamentoso
quanto psicológico. Segundo relatórios do NIDA (National Institute on Drug
Abuse, 1997), os melhores resultados no tratamento de indivíduos
dependentes de drogas são conseguidos quando o tipo de droga e as
características individuais são levadas em consideração na escolha da
terapia medicamentosa. Entre os fatores individuais, um dos mais
importantes é a coexistência de outros distúrbios psiquiátricos, como por
exemplo, depressão, ansiedade e stress. Segundo LAMBERT e KINSLEY
(2005) o stress tem sido identificado como um fator contribuinte para a
aquisição e a manutenção da dependência de drogas. Desse modo,
tratamentos que considerem a droga de dependência em conjunto com
outros distúrbios psiquiátricos existentes tendem a ser mais eficazes.
1.2- Sensibilização Comportamental
Um fenômeno intensamente utilizado em pesquisas de laboratório
que enfocam a dependência à drogas é a sensibilização comportamental,
que se caracteriza por uma exacerbação no efeito comportamental de uma
droga após administrações repetidas que persiste mesmo após longos
períodos de abstinência(PIERCE e KALIVAS, 1997; TSAI e HONG, 2003).
Foi caracterizada em 1932 quando os efeitos psicomotores da anfetamina
estavam sendo estudados em animais de laboratório (DOWNS e EDDY,
1932). Em 1958 esse fenômeno foi registrado em humanos em relação
aos efeitos psicóticos da anfetamina; esta induz uma psicose indistinguível
da esquizofrenia paranóica (CONNELL, 1958).
Evidências sugerem que o substrato neural da sensibilização
comportamental seja o sistema dopaminérgico mesotelencefálico
(KUCZENSKI e SEGAL, 1990).
Devido ao papel potencial da sensibilização comportamental na
dependência de drogas, tem havido grande interesse em identificar drogas
que atuam em receptores para nicotina, GABA, glutamato do tipo NMDA
(TZSCHENTKE e SCHMIDT, 1999), e colecistocinina (FELÍCIO et al.,
2001) e neurotensina (COSTA et al., 2001; ROMPRE e PERRON, 2000;
HORGER et al., 1994) que prejudicam tanto a indução quanto a expressão
da sensibilização comportamental. No entanto, avaliações dos efeitos de
drogas administradas durante a abstinência da droga de abuso e na
posterior expressão da sensibilização são escassas. É interessante
observar que esse período de abstinência corresponderia ao período no
qual costuma-se iniciar o tratamento da dependência em humanos.
Assim, fica clara a relevância desse tipo de abordagem na sensibilização
comportamental para avaliação da eficácia de drogas no tratamento da
dependência.
Outro aspecto interessante da sensibilização comportamental é a
sua modulação por variáveis comportamentais. Por exemplo, tanto o
estresse quanto o isolamento social induzem sensibilização cruzada aos
efeitos psicomotores de drogas de abuso (PIAZZA et al., 1990). Não
obstante a essas observações, PIAZZA et al., (1989) verificaram que a
resposta locomotora inata de ratos a um ambiente novo estaria
correlacionada com o desenvolvimento da sensibilização comportamental.
Assim, animais com alta atividade locomotora, quando expostos a um
ambiente novo, apresentaram maior predisposição para o
desenvolvimento da sensibilização comportamental em relação aos
animais com resposta locomotora baixa. Além disso, PIAZZA et al., (1991)
observaram que os animais com resposta comportamental exacerbada ao
ambiente novo também apresentam uma hiperatividade dopaminérgica no
núcleo accumbens em relação aos animais com resposta baixa. O núcleo
accumbens também está envolvido na sensibilização comportamental uma
vez que, como já citado anteriormente, existe um aumento da liberação de
dopamina (DA) (PIERCE e KALIVAS, 1997). Assim, esses resultados em
conjunto apontam que diferenças comportamentais prévias à
sensibilização comportamental estariam associadas com a predisposição
ao desenvolvimento desse fenômeno.
Trabalhos para a avaliação da sensibilização comportamental têm
sido feitos utilizando-se anfetamina, entre outras drogas (COSTA et al.,
2001; FELICIO, 2001). Como visto anteriormente, a sensibilização
comportamental está intimamente relacionada com a dependência de
drogas. Paralelamente, um aspecto clínico importante na dependência de
drogas é a coexistência de outros distúrbios psiquiátricos, como por
exemplo, depressão e ansiedade, e a necessidade de considerar esses
distúrbios em conjunto com a dependência para melhor eficácia
terapêutica (NIDA, 1997). Desse modo, seria interessante considerar o
papel da variabilidade das respostas comportamentais em modelos
animais de depressão e ansiedade no fenômeno de sensibilização
comportamental. Atenta-se ainda para o fato da sensibilização
comportamental poder ser induzida por outras drogas, que não são
consideradas drogas de abuso, além da anfetamina ou também poder ser
induzida por outras drogas associadas a esta (SPANAGEL, 1995).
1.3- Circuitos dopaminérgicos cerebrais
As drogas que induzem dependência química representam um
grupo diverso de compostos que diferem em suas ações
comportamentais e neuroquímicas. Entretanto, praticamente todas
essas drogas podem induzir neuroadaptações em sistemas de
neurotransmissão (ex. dopaminérgico) como é o caso da anfetamina,
morfina e etanol (PIERCE e KALIVAS, 1997).
Hoje se sabe que a DA representa mais de 50% das catecolaminas
centrais, sendo encontrada em altas concentrações nos núcleos da base,
no núcleo accumbens, tubercúlos olfatórios, núcleo central da amígdala,
eminência média e algumas áreas do córtex frontal (KANDEL et al., 2003).
As vias dopaminérgicas são de suma importância devido as suas
implicações comportamentais, neuroendócrinas entre outras. O
mapeamento destas vias começou em 1965 com trabalhos que
demonstraram a existência de três vias dopaminérgicas principais no
cérebro: nigroestriatal, mesocortical e mesolimbica que compreende a
túbero-infundibular e a da área postrema (FALLON, 1988; LINDVALL e
BJÖRKLUND, 1974; UNGERSTEDT, 1971).
O trato nigroestriatal é formado pelos neurônios da parte compacta
da substância negra, denominados A9, que se projetam através do feixe
do mesencéfalo para o corpo estriado (DOMESICK, 1988; MONGENSON
et al., 1988; THIERRY et al., 1988).
Os neurônios dopaminérgicos do trato mesolímbico se projetam
primeiramente da área ventral tegmental, do grupo de células
denominadas A10, inervando núcleo accumbens, núcleo septal lateral,
amígdala e núcleo caudado lateral. Os corpos celulares desses neurônios
também dão origem ao sistema dopaminérgico mesocortical, se
projetando para o córtex pré-frontal, girus cinguli e sítios alvo e
neocorticais (DOMESICK, 1988; MONGENSON et al., 1988; THIERRY et
al., 1988). Os neurônios do grupo A8, que ocupam a porção retrorubral,
contribuem para a inervação das áreas mesolímbica e estriatal, mas não
para sítios neocorticais (BERMAN, 1968; DEUTCH, 1988; UNGERSTEDT,
1971).
Os receptores dopaminérgicos estão divididos em duas subfamílias
D1 e D2. A subfamília D1 inclui os receptores D1, e os receptores D5. A
subfamília D2 inclui além dos receptores D2, D3 e D4. Os receptores da
subfamília D1 ativam a adenilato ciclase aumentando os níveis
intracelulares de AMPc (CLARK e WHITE, 1987), sendo expressos em
alta concentração no corpo estriado, núcleo accumbens e tubérculo
olfatório (MANSUR e WATSON, 1995). A subfamilia D2 tem influência
inibitória na adenilciclase além de agir por meio de outros segundos
mensageiros que incluem ativação dos canais de potássio (K+) e inibição
dos canais de cálcio (Ca2+) (VALLAR e MELDOLESI, 1989). As áreas de
maior expressão desses receptores concentram-se na substância negra
pars compacta, na área ventral do tegmento mesencefálico, no corpo
estriado, no núcleo accumbens e no tubérculo olfatório (MANSUR e
WATSON, 1995).
A anfetamina e a cocaína induzem neuroplasticidade, uma vez que
a primeira aumenta a liberação de DA e a segunda inibe a recaptação,
prolongando o tempo em que a DA permanece na fenda sináptica
(KANDEL et al., 2003). ROBINSON e BERRIDGE (1993) defendem que a
sensibilização do circuito dopaminérgico mesolímbico está correlacionada
com aspectos motivacionais atribuídos ao ato de buscar/obter a droga,
introduzindo o componente compulsivo na dependência. Esses autores
ainda sugerem que a ocorrência de neuroadaptações relacionadas à
sensibilização gera nos dependentes uma hipersensibilidade às drogas e
estímulos relacionados a elas. Tal fenômeno seria efetivo em precipitar
recaída em indivíduos desintoxicados. Corroborando com isto,
MOGENSON et al., (1988), afirmam que o sistema dopaminérgico
mesolímbico transforma estímulos biologicamente relevantes em
respostas comportamentais a estímulos ambientais e farmacológicos,
regulando o limite e a intensidade da resposta comportamental ao
estímulo recebido.
1.4.1 Eixo hipotálamo-pituitário-adrenal
O hipotálamo-pituitário adrenal (HPA) mantém os níveis apropriados
de glicocorticóides que são determinadas por flutuações na liberação de
hormônio adrenocorticotrópico (ACTH) pelos corticotropos hipofisários.
Esses são regulados pelo hormônio de liberação da corticotropina (CRH)
que é liberado por neurônios de CRH do hipotálamo endócrino. Esses três
órgãos em conjunto são designados como eixo HPA. A regulação deste
eixo é realizada de três maneiras: o ritmo diurno na esteroidogenese
basal, a regulação de retroalimentação negativa pelos corticosteróides
supra-renais e os aumentos acentuados da esteroidogenese em resposta
ao stress (SCHIMMER e PARKER, 2003).
1.4.3 Mineralocorticóides
O principal mineracolocorticóide, como já citado anteriormente, é a
aldosterona. Sua síntese e liberação dependem da composição de
eletrólitos no plasma e do sistema angiotensina II. As baixas
concentrações plasmáticas de sódio (Na+) e altos níveis plasmáticos de K+
afetam as células da zona glomerular da supra-renal, estimulando a
liberação de aldosterona (SCHIMMER e PARKER, 2003).
Os mineralcocorticóides causam alterações no sistema
cardiovascular, devido ao controle na excreção renal de sódio podendo
causar hipertensão (SCHIMMER e PARKER, 2003).
1.4.2 Glicocorticóides
O principal estímulo fisiológico responsável pela síntese dos
glicocorticóides é a presença de ACTH (como já citado anteriormente). A
substância inicial para síntese de glicocorticóides é o colesterol obtido do
plasma e também nos grânulos lípidicos das células da camada média do
córtex da supra-renal que é convertido em pregnenoloma e a velocidade
deste processo é regulada pelo ACTH. Os glicocorticóides exercem seus
efeitos sob três aspectos principais: efeitos metabólicos e sistêmicos
gerais, efeitos da retroalimentação negativa sobre a adeno-hipófise e o
hipotálamo e efeitos antiinflamatórios e imunosupressores (SCHIMMER e
PARKER, 2003).
À liberação dopaminérgica no córtex frontal (CLAUSTRE et al.,
1986) aumenta a corticosterona e está relacionada também a
sensibilização comportamental. Estes efeitos segundo BUUSE et al.,
(2004) seriam possivelmente devido a um efeito indireto como o hormônio
de liberação de CRH.
No sistema cardiovascular os glicocorticóides causam hipertensão
aumentando a expressão dos receptores adrenérgicos na parede vascular
causando vasonconstrição. Em contrapartida também se observa
hipertensão em pacientes com secreção excessiva de glicocorticóides, por
exemplo, pacientes com síndrome de Cushing (BAXTER e ROSSEAU,
1979).
1.4- Corticosterona
O córtex da supra-renal é estimulado pelo ACTH para fabricar seus
esteróides que são os mineralocoticóides e os glicocorticóides. Os
mineralocorticóides afetam o equilíbrio hidroeletrolítico e o principal
hormônio é a aldosterona. Os glicocorticóides afetam o metabolismo dos
carboidratos e das proteínas, atividade antiinflamatória e imunosupressora
e os principais hormônios em animais são: a hidrocorticosona e a
corticosterona (SCHIMMER e PARKER, 2003).
O ACTH estimula a supra-renal porque reage com o receptor
especifico de membrana que é acoplado a proteína G. O ACTH atua
através da proteína G para ativar a adenilil-ciclase e aumentar o conteúdo
intracelular de AMP cíclico que é um segundo mensageiro dos efeitos de
ACTH sobre a esteroidogênese. Além disso, a esteroidogênese também é
regulada fisilogicamente pela angiotensina II e K+ (SCHIMMER e
PARKER, 2003).
1.5- Sistema cardiovascular e pressão arterial
A pressão arterial é determinada pelo débito cardíaco e pela
resistência ao fluxo de sangue nos vasos sanguíneos. Os sistemas renina-
angiotensina, hipotálamo, simpático e parassimpático participam do
controle do sistema cardiovascular e da pressão arterial (JACKSON,
2003).
1.5.1- Sistema renina-angiotensina
A renina é uma enzima sintetizada, armazenada e secretada na
circulação arterial renal pelas céluas justaglomerulares granulares. Esta
atua no angiotensinogênio para catalisar a formação do decapeptídio
angiotensina I. Este é clivado pela enzima conversora de angiotensina
(ECA) em angiotensina II. Esta atua através de mecanismos diferentes
para elevar a pressão arterial. Possui uma importante função que é a de
inibir a excreção de Na2+ e água pelos rins para estabilização da pressão
arterial.
A resposta pressórica rápida a angiotensina II é devida a um aumento na
resistência periférica total, esta ajuda a manter a pressão arterial diante de
um estímulo hipotensivo agudo. A angiotensina II também aumenta a
contratibilidade e a freqüência cardíaca. O mecanismo pelo qual a
resistência periférica total acontece é pela abertura dos canais de cálcio
regulados pela voltagem nos miócitos cardíacos. A contratibilidade e a
freqüência cardíaca ocorrem através da facilitação do tônus simpático,
aumento da neurotransmissão noradrenérgica e liberação supra-renal de
catecolaminas (JACKSON, 2003).
Provoca também uma resposta pressórica lenta que estabiliza a
pressão arterial por um longo período. Isto é mediado pela redução na
função excretora renal. Facilita a neurotransmissão noradrenérgica
periférica aumentando a liberação de noradrenalina (NA) pelos terminais
nervosos simpáticos, inibindo a recaptação de NA por estes e aumentando
a resposta vascular à noradrenalina (JACKSON, 2003).
1.5.2 Sistema Nervoso autonômico
O sistema nervoso autonômico tem três principais divisões:
simpático, parassimpático e entérico. As divisões simpática e
parassimpática inervam a musculatura cardíaca, lisa e tecidos glandulares,
também medeiam uma variedade de respostas viscerais. O sistema
entérico consiste em neurônios sensórios e motores do trato
gastrointestinal que medeiam os reflexos digestivos (MONTANO et al.,
2001).
No sistema cardiovascular o sistema simpático aumenta a freqüência
cardíaca e a força de contração e o sistema parassimpático induz
bradicardia. A estimulação simpática aumenta a pressão arterial pelo
aumento do débito cardíaco e da resistência periférica. O tônus
vasoconstritor simpático resulta de um disparo contínuo de neurônios
adrenérgicos localizados principalmente no bulbo ventrolateral rostral, e
que inervam os neurônios pré-ganglionares simpáticos vasoconstritores
(MONTANO et al., 2001).
A estimulação parassimpática tem efeito pequeno sobre a
resistência periférica. A vasodilatação parassimpática pode envolver
mensageiros químicos, como o óxido-nítrico. A ação da noradrenalina e
acetilcolina sobre o coração é um exemplo do complexo sistema
regulatório celular envolvido no sistema autonômico (MONTANO et al.,
2001).
1.5.3 Noradrenalina e acetilcolina
A NA age sobre o músculo cardíaco estimulando a freqüência
cardíaca e a força de contração. Aumenta a força de contração porque
age sobre os receptores B-adrenérgicos, que ativam o sistema de
segundo-mensageiro que utiliza o monofosfato de adenosina cíclico
(AMPc), que aumenta a corrente de longa duração de canais de Ca2+ do
tipo L do músculo. A ativação dos receptores B-adrenérgicos também
diminui o limiar de disparo das células marcapasso cardíacas do nódulo
sinoatrial, aumentando a freqüência cardíaca. A adrenalina (AD) circulante
liberada pela medula adrenal reforça estes efeitos da noradrenalina
(HOFFMAN e LIF KOWITZ, 2003).
A acetilcolina é liberada nos terminais nervosos parassimpáticos e diminui
a freqüência cardíaca pela ação dos receptores muscarínicos a células
dos nodos sinoatrial e atrioventricular, aumentando assim a condutância
de potássio de repouso nessas células. A acetilcolina também diminui a
freqüência cardíaca pelo aumento do limiar para o disparo das células
marcapasso de maneira oposta à NA, diminuindo a freqüência cardíaca.
inda reduz a força de contração pela diminuição do AMPc intracelular
(MILUTINOVIC et al., 2006).
1.6- Anfetamina
A anfetamina é uma amina simpaticomimética de ação indireta. No
SNC, libera monoaminas (como por exemplo, DA, NA e 5-HT) de estoques
não vesiculares por meio da ligação da mesma aos transportadores de
monoaminas, os quais funcionam como falsos substratos, promovendo
assim um transporte reverso do neurotransmissor (VANDERSCHUREN e
KALIVAS, 2000). Como resultado há maior quantidade destas aminas na
fenda sináptica e por um período maior. Devido a estes fatores, seus
principais efeitos em humanos são estimulação locomotora, euforia,
comportamento estereotipado e anorexia, enquanto que em animais
experimentais são aumento do estado de alerta e da atividade locomotora.
Estes efeitos estão relacionados à ativação das vias dopaminérgicas
mesolimbica, mesocortical e nigroestriatal (KUCZENSKI ET AL., 1997).
Além disso, sabe-se que a anfetamina, utilizada repetidamente em
tratamento farmacológico causa dependência e tolerância. A tolerância
aos efeitos anorexigênicos e simpaticomiméticos periféricos desenvolvem-
se rapidamente. Quando administrada repetidamente, a anfetamina causa
alterações em padrões comportamentais que persistem mesmo após um
período de abstinência, e este fenômeno é por muitos pesquisadores
chamada de sensibilização comportamental (KUCKZENSKI et al., 1997). A
sensibilização comportamental, como já citado anteriormente, ocorre como
já citado anteriormente, devido a um aumento dos níveis de DA nas vias
mesoestriatal e mesolimbica; estas áreas estão sabidamente envolvidas
na estimulação da atividade locomotora. Estudos têm demonstrado que a
anfetamina exerce também uma ação simpaticomimética periférica,
produzindo aumento da pressão arterial, vasoconstrição e inibição da
motilidade gastrointestinal (KUCKZENSKI et al., 1997; CREESE e
IVERSEN, 1974; KELLY, 1977; COLE, 1978; SESSIONS et al., 1980;
KEHNE et al., 1981; SWERDLOW et al., 1986).
1.7- Selegilina
A sensibilização comportamental pode ser induzida não só por
drogas que causam dependência mais também por outros tipos de drogas
ou drogas associadas às de abuso. Devido a isto, a selegilina (Deprenyl),
um inibidor seletivo da monoamino–oxidase (MAO) e que é comumente
empregada no tratamento da Doença de Parkinson, tem sido
recentemente estudada. A MAO é uma enzima que se encontra no interior
das células, ligada a membrana de superfície das mitocôndrias. Converte
as catecolaminas em seus respectivos aldeídos que, na periferia, são
rapidamente metabolizados pela aldeído desidrogenase nos ácidos
carboxílicos correspondentes. Também oxida outras monoaminas como
DA e serotonina (5-HT). No interior de neurônios do sistema nervoso
simpático ela controla o conteúdo de DA e noradrenalina (NA) (KNOLL,
1989; RINNE et al., 1991).
Em 1968, descobriu-se que havia dois tipos da MAO: MAO-A: a
qual inativa a 5-HT, NA, tiramina e, em níveis menores, a DA e a AD, b)
MAO-B: que inativa prioritariamente DA e feniletilamina, esta está presente
apenas em traços no cérebro. A MAO-B está presente predominantemente
no
estriado onde é responsável pelo mecanismo oxidativo de DA nesta
região (STANDART e YOUNG, 2001). Por meio da inibição da MAO pode-
se atuar no sistema dopaminérgico, proporcionando assim um aumento
significativo da concentração cerebral de DA.
A selegilina foi descoberta entre 1964 e 1965, por KNOLL et al.,
sendo que as primeiras perspectivas farmacológicas desta droga se
voltaram para o metabolismo cerebral, onde possivelmente atua como um
estimulante. Sendo assim, esta substância foi motivo de intensas
pesquisas nos últimos 36 anos. No princípio, KNOLL não percebeu que
tinha desenvolvido uma molécula com peculiar atividade sobre
“catecolaminas neurotransmissoras”, provocando especificamente o
aumento de DA e de feniletilamina (KNOLL, 1983). A selegilina é
absorvida rapidamente (Tmáx= 0,5 - 2 horas) (HEINONEN et al, 1989b;
GERLACK et al, 1996) e sua metabolização hepática produz
desmetilselegilina, metaanfetamina e esta em anfetamina (Fig. 1)
(GERLACK et al, 1996; CHRISP et al, 1991).
Selegilina
Desmetilselegilina
Metaanfetamina
Anfetamina
Figura 1 – Biotransformação da selegilina (adaptado de Oliver, 2002)
A selegilina inibe irreversivelmente a MAO-B e o transportador de
DA, interferindo na recaptação, síntese e liberação desta. A peculiaridade
dessa molécula é a sua característica como inibidora seletiva dose-
dependente da MAO: até a dosagem de 15mg/dia, inibe apenas a MAO-B;
acima dessa dosagem, especialmente a partir de 20mg/dia, pode atuar
também sobre a MAO-A. Provoca também uma inibição na recaptação de
NA e tiramina, o que inibe o efeito “simpatomimético” indireto da tiramina e
aumenta ainda a feniletilamina, tem rápida ação, aumentando a DA sobre
os receptores dopaminérgicos estriados pós-sinápticos e uma ação
prolongada sobre a liberação de DA (isto se refere a seu papel
neuromodulador) (KNOLL, 1989).
Além disso, a selegilina tem uma ação sobre os radicais livres de
oxigênio por meio de uma diminuição na formação de peróxido de
hidrogênio proveniente do metabolismo de DA, ao inibir a MAO-B e
aumentar a atividade de radicais endógenos superóxido “desmutase e
catalase” (Fig. 2) (KNOLL, 1989; MARSDEN, 1990), sendo capaz de
retardar a morte neuronal (RINNE et al, 1991). Outro trabalho sugere
ainda que a selegilina estaria ligada à liberação de fatores de crescimento
neuronais (RICHARDSON, 1993).
Observando-se as peculiaridades da selegilina pode-se avaliar sua
associação com a anfetamina durante o tratamento e a abstinência desta
droga no comportamento de camundongos. No entanto, praticamente não
existem trabalhos descritos cujo enfoque seja a interação anfetamina -
selegilina, sob o ponto de vista da sensibilização comportamental.
DA + O2 + H2O
DOPAC + NH3 + H2O2
H2O2 + Fe2+
OH + OH- + Fe3+
Figura 2 – Produção de radicais livres pelo metabolismo da DA.
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Avaliar as influências de um inibidor seletivo da monoamino-oxidase
Tipo B (selegilina) na sensibilização comportamental para anfetamina em
camundongos.
2.2 Objetivos Específicos
Avaliar a influência do tratamento da selegilina em:
• aspectos motores de camundongos observados no campo aberto.
• aspectos comportamentais de camundongos avaliados no labirinto
em cruz elevado.
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Animais
Foram utilizados camundongos Swiss, machos, mantidos no
biotério do laboratório de Farmacologia Aplicada e Toxicologia do
Departamento de Patologia da FMVZ-USP, acondicionados em gaiolas de
polipropileno medindo 41x34x16 cm e com cama de maravalha
autoclavada. Água e comida foram fornecidas ad libitum, durante todo
procedimento experimental. Os animais permaneceram em salas com
temperatura controlada (20 a 23°C), umidade relativa do ar entre 65 e 70%
e com ciclo de luz de 12 horas claro/escuro (luzes acesas às 6:00 horas).
Nos dias de observação os animais foram levados para a sala de
experimentação uma hora antes do início das manipulações. Os animais
controle e experimental foram observados intercaladamente durante a fase
clara do ciclo de luz, entre 13:00 e 17:00 horas. Todos os procedimentos
experimentais obedeceram às normas relativas ao uso de animais de
experimentação descritas pelo Comitê de Manutenção e Uso de Animais
de Laboratório da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da
Universidade de São Paulo e foram aprovados pela Comissão de Bioética
da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da universidade de São
Paulo processo número: 728/2005.
3.2 Drogas
• Sulfato de d-anfetamina – Sigma
• Selegilina – L-Deprenyl Hidrocloryde - Sigma
As drogas foram preparadas em soluções que permitiam injetar um
volume de 1,0ml.Kg-1 de peso corporal. A anfetamina e selegilina foram
dissolvidas em solução salina 0,9%. Os animais controle receberam
volumes de solução salina iguais aqueles dos animais dos grupos
experimentais. Todas as injeções foram administradas por via
intraperitoneal (i.p.).
3.3 Avaliações Comportamentais
3.3.1 Quantificação da atividade locomotora em campo aberto
O registro da atividade locomotora foi realizado em campo aberto,
(Fig. 3A) que é constituído por uma arena circular de madeira com 40cm
de diâmetro por 40cm de altura, pintada na cor cinza chumbo fosco. A
arena é dividida em zonas central e periférica (região tigmotáxica)
(Fig.3B).
(A)
(B)
Figura 3 – (A) Aparelho de campo aberto, utilizado nos procedimentos experimentais, (B) constituído por duas zonas: C - central e P - periférica.
As observações foram realizadas com o auxílio de um sistema de
rastreamento de imagem computadorizado (Ethovision - Noldus
Information Technology). Esse sistema inclui o programa Ethovision Pro-
Color 1.9, câmera filmadora (Sony CCD-Iris color video camera), monitor
de vídeo (Sony), placa de captura de vídeo (TARGA+Truevision, 2D,
NTSC) e computador pessoal (Pentium 133, 16 mB de memória RAM,
1.2gB de disco rígido), com monitor, teclado e mouse.
PC
PC
A partir de imagens recebidas pela câmera filmadora e digitalizadas
na placa de captura, o programa cria coordenadas espaciais (x e Y) do
centro de gravidade do animal em intervalo de tempo determinado
segundo taxa de amostragem pré-configurada. A taxa de amostragem
ideal para roedores é entre 2 a 8 amostras por segundo, sendo que uma
amostragem superior a 8 excede a dinâmica do roedor, capturando
movimentos corporais que não indicam deslocamento, e portanto
superestimando a distância movida. A taxa de amostragem utilizada foi de
6,6 amostras por segundo.
Para o estudo, cada animal foi colocado individualmente no centro
da arena e sua atividade registrada por períodos de 15 minutos pelo
Ethovision. Entre as observações de cada animal o campo aberto foi
limpo com solução de álcool a 5%.
Os parâmetros quantificados pelo Ethovision foram: distância
percorrida total e nas zonas central e periférica (cm), velocidade média
total e nas zonas central e periférica (cm/s), tempo nas zonas central e
periférica (s), tempo de movimento nas zonas central e periférica (s) e
levantar na arena.
Vale ainda ressaltar, que com a utilização do Ethovision a
observação comportamental é feita sem a presença do observador,
minimizando as influências humanas sobre o teste comportamental.
3.3.2 Avaliação do comportamento no labirinto em cruz elevado
O aparelho consiste num labirinto em cruz elevado feito de madeira,
elevado à 50cm do chão e com dois braços abertos opostos de 28,5x7,0
cm cruzados em ângulos retos com dois braços nas mesmas dimensões
fechados por paredes de 14 cm de altura, tendo o teto aberto (Fig.4 A e
B). Os animais foram colocados individualmente no centro do aparelho e
observados por 5 minutos. Para a quantificação dos parâmetros foi
utilizado um sistema de rastreamento por imagem (Ethovision), como
descrito no item 3.3.1, com 6,6 medidas por segundo. Os parâmetros
quantificados foram: número total de entradas nos braços abertos e tempo
de permanência nos braços abertos. O aparelho foi limpo com álcool a 5%
entre a observação de cada animal.
Figura 4 – Labirinto em cruz elevado, utilizado nos procedimentos experimentais evidenciando (A) braços abertos e (B) braços fechados.
3.4 Medida da pressão arterial
As medidas caudais da pressão arterial sistólica e da freqüência
cardíaca foram determinadas durante o período experimental pelo método
de medida indireta, utilizando-se um sistema computadorizado de medida
caudal (BP 2000 Visitech Systems, figura 5). A pressão arterial e a
(B)
(A)
freqüência cardíaca para cada animal foram determinadas após uma
semana de habituação dos animais no aparato e foram feitas 20 medidas
para cada animal.
Figura 5 – BP 2000 Visitech System – Sistema Computadorizado de medida da pressão arterial indireta.
3.5 Dosagem hormonal
A corticosterona foi medida por radioimunoensaio. A dosagem foi
determinada em fase sólida, empregando-se o Kit Comercial da COAT-A-
COUNT®, seguindo protocolo descrito pelo fabricante (DPC-Medlab). Este
Kit usa como elemento traçador o I125. O parâmetro de qualidade foi
estabelecido de acordo com a rotina do Laboratório de Dosagens
Hormonais FMVZ-USP onde se realizou a dosagem. Os resultados foram
expressos em ng de hormônio/ml de soro. A variação intra-ensaio foi
abaixo de 3,63%.
3.6 Análise estatística
Os resultados da atividade locomotora no campo aberto e a
resposta ao labirinto em cruz elevado, foram avaliadas pelo Teste de
Análise de Variância (ANOVA), seguido de teste post hoc de Bonferroni,
quando necessário.
Os resultados de freqüência cardíaca e de pressão arterial foram
avaliados pelo teste t de student.
Os níveis de Corticosterona do experimento crônico foram
avaliados pelo teste não paramétrico de Análise de Variância (Kruskal-
Wallis), seguida de Dunn.
Os níveis de Corticosterona do experimento agudo foram avaliados
pelo teste de Mann-Whitney.
Para todas as análises estatísticas foi utilizado o programa
GraphPad Instat. Foi considerada diferença estatisticamente significante
quando p<0,05.
4 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL E RESULTADOS
4.1 Delineamento Experimental Geral – Tratamento crônico
Foram utilizados 105 camundongos machos divididos em 7 grupos
iguais. Os animais foram submetidos a um pré-tratamento com solução
salina 0,9% (V), anfetamina (A, 2mg/Kg) ou selegilina (S, 10mg/Kg) por 14
dias, em dias alternados. Durante o período de abstinência, os animais
receberam injeção de solução salina 0,9% ou selegilina (10mg/Kg), por 7
dias consecutivos. No 21°dia foi administrada anfetamina (2mg/Kg), ou
selegilina (10mg/Kg) sendo esta considerada dose desafio. Após 15
minutos, os animais foram testados em campo aberto por um período de
15 minutos e em seguida foram testados no labirinto em cruz elevado por
5 minutos. No dia seguinte, pela manhã, os animais receberam uma
injeção de anfetamina ou selegilina e após 15 minutos foram decapitados
para coleta do sangue. O sangue foi então centrifugado durante 10
minutos, o soro foi coletado e mantido em temperatura adequada (-20°C)
até o dia da dosagem hormonal.
Segue abaixo o delineamento dos tratamentos que foram realizados
em cada grupo experimental:
Pré - tratamento Abstinência Des
Solução salina Solução salina Anf Anf Dias 1↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ 14 ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ 21 ↓ 22 ↓ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ ____ ____ ↓ injeções de solução salina ↓ injeções de anfetamina (Anf.) Pré-tratamento: 7 injeções em dias alternados Abstinência: 7 injeções consecutivas Des: desafio CA: campo aberto LCE: labirinto em cruz elevado Decap: decapitação Figura 6 - Efeitos da anfetamina em animais tratados com solução salina 0,9% na fase de pré-tratamento (VVA, n=11).
Pré-tratamento Abstinência Des
Anfetamina Solução salina Anf Anf Decap Dias 1↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ 14 ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ 21 ↓ 22 ↓ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ ____ ____
↓ injeções de solução salina ↓ injeções de anfetamina (Anf.) Pré-tratamento: 7 injeções em dias alternados Abstinência: 7 injeções consecutivas Des: desafio CA: campo aberto LCE: labirinto em cruz elevado Decap: decapitação Figura 7 - Efeitos da anfetamina em animais tratados com anfetamina na fase de pré-tratamento (AVA, n=12).
Decap CA +
LCE
CA +
LCE
Figura 8 - Efeitos da anfetamina em animais tratados com solução salina 0,9% na fase de pré-tratamento e que receberam selegilina durante a abstinência (VSA, n=10).
Figura 9 - Efeitos da anfetamina em animais tratados com anfetamina durante a fase de pré-tratamento e que receberam selegilina durante a abstinência (ASA, n=11).
Pré-tratamento Abstinência Des
Solução salina Selegilina Anf Anf Decap Dias1↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ 14 ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ 21 ↓ 22 ↓ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ ____ ____ ↓ injeções de solução salina ↓ injeções de anfetamina (Anf.) ↓ injeções de selegilina Tratamento: 7 injeções em dias alternados Abstinência: 7 injeções consecutivas Des: desafio CA: campo aberto LCE: labirinto em cruz elevado Decap: decapitação
Pré-tratamento Abstinência Des
Anfetamina Selegilina Anf Anf Decap Dias1↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ 14 ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ 21 ↓ 22 ↓ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ ____ ____
↓ injeções de anfetamina (Anf.) ↓ injeções de selegilina Tratamento: 7 injeções em dias alternados Abstinência: 7 injeções consecutivas Des: desafio CA: campo aberto LCE: labirinto em cruz elevado Decap: decapitação
CA +
LCE
CA +
LCE
CA +
LCE
Figura 11 - Efeitos da selegilina em animais tratados com selegilina na fase de pré-tratamento (SVS, n=11).
CA +
LCE
Pré-tratamento Abstinência Des
Solução salina Solução salina Selegilina Selegilina Decap Dias1↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ 14 ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ 21 ↓ 22 ↓ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ ____ ____ ↓ injeções de solução salina ↓ injeções de selegilina Tratamento: 7 injeções em dias alternados Abstinência: 7 injeções consecutivas Des: desafio CA: campo aberto LCE: labirinto em cruz elevado Decap: decapitação Figura 10 - Efeitos da selegilina em animais tratados com solução salina 0,9% durante a fase de pré-tratamento (VVS, n=11).
Pré-tratamento Abstinência Des
Selegilina Solução salina Selegilina Selegilina Decap Dias1↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ 14 ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ 21 ↓ 22 ↓ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ ___ ___
↓ injeções de solução salina ↓ injeções de selegilina Tratamento: 7 injeções em dias alternados Abstinência: 7 injeções consecutivas Des: desafio CA: campo aberto LCE: labirinto em cruz elevado Decap: decapitação
CA +
LCE
Pré-tratamento Abstinência Des
Selegilina Solução salina Anf Anf Decap Dias1↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ 14 ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ 21 ↓ 22 ↓ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ ___ ___
↓ injeções de solução salina ↓ injeções de selegilina ↓ injeções de anfetamina (Anf) Tratamento: 7 injeções em dias alternados Abstinência: 7 injeções consecutivas Des: desafio CA: campo aberto LCE: labirinto em cruz elevado Decap: decapitação
Figura 12 - Efeitos da anfetamina em animais tratados com selegilina na fase de pré-tratamento (SVA, n=11).
4.2 Delineamento Experimental Geral – Tratamento agudo
Foram utilizados 45 camundongos machos divididos em 3 grupos
iguais. Os animais foram submetidos a uma dose aguda de solução salina
0,9%, anfetamina (2mg/Kg) ou selegilina (10mg/Kg). Após 15 minutos, os
animais foram testados em campo aberto por um período de 15 minutos e
logo após foram testados no labirinto em cruz elevado por 5 minutos.
Imediatamente após os animais dos grupos salina e selegilina foram
decapitados para coleta do sangue. O sangue foi então centrifugado
durante 10 minutos, e o soro foi coletado e mantido em temperatura
adequada (-20°C) até o dia da dosagem hormonal.
Segue abaixo o delineamento dos tratamentos que foram realizados em
cada grupo experimental:
Figura 13 - Efeitos da administração aguda de solução salina 0,9% no comportamento avaliado em campo aberto e labirinto em cruz elevado.
Figura 14 - Efeitos da administração aguda de anfetamina no comportamento em campo aberto e labirinto em cruz elevado.
CA LCE DECAP Solução salina ↓ ↓ ↓ ↓ ________ _______ _________ _________ ↓ dose aguda de solução salina CA campo aberto LCE labirinto em cruz elevado DECAP decapitação
CA LCE DECAP Anfetamina ↓ ↓ ↓ ↓ ________ _______ ________ ________ ↓ dose aguda de anfetamina CA campo aberto LCE labirinto em cruz elevado DECAP decapitação
CA LCE DECAP Selegilina ↓ ↓ ↓ ↓ ________ _______ ________ ________ ↓ dose aguda de selegilina CA campo aberto LCE labirinto em cruz elevado DECAP decapitação
Figura 15 – Efeitos da administração aguda de selegilina no comportamento em campo aberto e labirinto em cruz elevado.
Figura 16 - Efeitos da administração aguda de solução salina 0,9% na freqüência cardíaca e pressão arterial.
Figura 17 - Efeitos da administração aguda de anfetamina na freqüência cardíaca e pressão arterial.
4.3 Delineamento Experimental Geral – Pressão Arterial
Foram utilizados 30 camundongos machos divididos em 3 grupos
iguais. Os animais foram submetidos ao aparelho de medida indireta da
pressão arterial Conforme descrito em item 3.4 de material e métodos.
Após estas medidas os animais receberam uma dose aguda de solução
salina 0,9%, anfetamina (2mg/Kg) ou selegilina (10mg/Kg). Após 15
minutos, os animais foram testados novamente no aparelho para mais 20
medidas.
Segue abaixo o delineamento dos tratamentos que foram realizados em
cada grupo experimental:
Medidas Medidas Basais (20) Desafio (20) Salina ↓ ↓ ↓ ________ _______ ________ ↓ dose aguda de solução salina 0,9% Medidas realizadas por medida indireta de pressão arterial
Medidas Medidas Basais (20) Desafio (20) Anfetamina ↓ ↓ ↓ ________ _______ ________ ↓ dose aguda de anfetamina Medidas realizadas por medida indireta de pressão arterial
15 minutos
15 minutos
4.4 Experimento 1. Efeitos do tratamento crônico com selegilina ou
anfetamina na sensibilização comportamental para
anfetamina, observado no campo aberto.
Os animais foram submetidos a um pré-tratamento, à abstinência e
ao desafio conforme item 4.1 do Delineamento Experimental Geral. Após
15 minutos, os animais foram testados em campo aberto por um período
de 15 minutos conforme item 3.3.1 de material e métodos.
Para este experimento foram formados os seguintes grupos: VVA,
VVS, AVA, SVS, VSA, SVA, ASA.
Medidas Medidas Basais (20) Desafio (20) Selegilina ↓ ↓ ↓ ________ _______ ________ ↓ dose aguda de selegilina Medidas realizadas por medida indireta de pressão arterial
Figura 18 - Efeitos da administração aguda de selegilina na freqüência cardíaca e pressão arterial.
15 minutos
Resultados
Distância Percorrida
A)Total
A análise estatística mostrou aumento significante do grupo AVA em
relação aos grupos VVA, VVS, SVS, VSA. O grupo SVS mostrou redução
significante em relação aos grupos VVA, AVA, VSA, SVA, ASA. O grupo
AIA apresentou aumento significante em relação aos grupos VVA, VVS,
AVA, SVS, VSA, SVA (F6,70=26.604; Fig.19).
B)Central
A análise estatística da distância percorrida na zona central mostrou
aumento significante do grupo AVA em relação aos grupos VVA, VVI e
SVS. O grupo IVI mostrou redução significante em relação aos grupos:
AVA, VSA, SVA e ASA. O grupo ASA apresentou aumento significante em
relação aos grupos VVA, VVS, SVS, VSA e SVA (F6,70=15,165; Fig.19).
C)Periférica
A análise estatística da distância percorrida na zona periférica mostrou
aumento significante do grupo AVA em relação aos grupos VVA, VVS,
SVS, VSA e SVA. O grupo SVS mostrou redução significante em relação
aos grupos: VVA, AVA, VSA e ASA. O grupo ASA apresentou aumento
significante em relação aos grupos VVA, VVI, SVS, e SVA ((F6,70=15,678;
Fig.19).
Velocidade Média
A)Total
A velocidade média (cm/s) na total mostrou aumento significante do
grupo AVA em relação aos grupos VVA, VVS, e SVS. O grupo SVS
mostrou redução significante em relação aos grupos: AVA, VSA, SVA e
ASA. O grupo ASA apresentou aumento significante em relação aos
grupos VVA, VVS, AVA, SVS, VSA e SVA (F6,70=28.335; Fig.20).
B)Central
A velocidade média (cm/s) na zona central mostrou aumento
significante do grupo AVA em relação aos grupos VVA, VVS, SVS e SVA.
O grupo SVS mostrou redução significante em relação aos grupos: AVA,
VSA, SVA e ASA. O grupo ASA apresentou aumento significante em
relação aos grupos VVA, VVS, SVS, VSA e SVA (F6,70=13,826; Fig.20).
C)Periférica
A velocidade média (cm/s) na zona periférica mostrou aumento
significante do grupo AVA em relação aos grupos VVA, VVS e SVS. O
grupo SVS mostrou redução significante em relação aos grupos: AVA,
VSA, SVA e ASA. O grupo ASA apresentou aumento significante em
relação aos grupos VVA, VVS, AVA, SVS, VSA e SVA (F6,70=24,840;
Fig.20).
Tempo em movimento
A)Total
O tempo em movimento apresentou aumento significante do grupo
AVA em relação aos grupos VVA, VVS e SVS. O grupo SVS mostrou
diminuição significante em relação aos grupos AVA, VSA, SVA e ASA. O
grupo ASA apresentou aumento significante em relação aos grupos VVA,
VVS, SVS, VSA e SVA (F6,70=21,213; Fig.21).
B)Central
O tempo em movimento apresentou diminuição significante no grupo
AVA em relação ao grupo ASA. O grupo SVS também mostrou diminuição
significante em relação aos grupos AVA, VSA, SVA e ASA. O grupo ASA
apresentou aumento significante em relação aos grupos VVA, VVS, AVA,
SVS, VSA, e SVA (F6,70=13,624; Fig.21).
C)Periférica
O tempo em movimento apresentou aumento significante no grupo
ASA em relação aos grupos VVA,VVS, SVS e VSA. O grupo SVS mostrou
diminuição significante em relação aos grupos AVA, VSA, SVA e ASA. O
grupo ASA apresentou aumento significante em relação aos grupos VVA,
VVS, SVS, VSA e SVA (F6,70=16,328; Fig.21).
Tempo na zona
A)Central
Não houve alteração no tempo de permanência (s) na zona central
(F6,70=0,507; Fig. 22).
B)Periférica
Não houve alteração no tempo de permanência (s) na zona
periférica (F6,70=0,486; Fig. 22).
Levantar
O levantar apresentou aumento significante no grupo AVA em
relação aos grupos VVA, VVS, SVS, e SVA. O grupo SVS mostrou
diminuição significante em relação aos grupos AVA, VSA, SVA e ASA. O
grupo ASA apresentou aumento significante em relação aos grupos VVA,
VVS, SVS, VSA e SVA (F6,70=17,46; Fig.23).
VVA VVS AVA SVS VSA SVA ASA0
2500
5000
7500
10000
***
**
***
***
Dis
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VVA VVS AVA SVS VSA SVA ASA0
1000
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4000
5000 Central
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VVA VVS AVA SVS VSA SVA ASA0
1000
2000
3000
4000
5000 Periférica
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(cm
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**
*
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#α α
αα
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Figura 19 - Efeitos do tratamento crônico com IMAO-B ou anfetamina na avaliação da distância percorrida (cm) no campo aberto. Resultados expressos em média ± erro padrão. * p<0,05, ** p<0,01, *** p<0,001 em relação ao grupo VVA. & p<0,001 em relação ao grupo VVI. # p<0,05, ## p<0,001 em relação ao grupo AVA. α p<0,01, αα p<0,001 em relação ao grupo SVS. θ p<0,05, θθ p<0,001 em relação ao grupo ASA. ANOVA, Bonferroni.
VVA VVS AVA SVS VSA SVA ASA0.0
2.5
5.0
7.5
10.0 Total
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cm/s
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10.0 Periférica
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Vel
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(cm
/s)
Figura 20 - Efeitos do tratamento crônico com IMAO-B ou anfetamina na avaliação da velocidade média (cm/s) no campo aberto. Resultados expressos em média ± erro padrão. * p<0,05, ** p<0,01, *** p<0,001 em relação ao grupo VVA. & p<0,001 em relação ao grupo VVS. # p<0,05, ## p<0,001 em relação ao grupo AVA. α p<0,01, αα p<0,001 em relação ao grupo SVS. θ p<0,05, θθ p<0,001 em relação ao grupo ASA. ANOVA, Bonferroni.
VVA VVS AVA SVS VSA SVA ASA0
100
200
300
400
500 Total
***
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VVA VVS AVA SVS VSA SVA ASA0
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θθαα
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Tem
po
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mo
vim
ento
(s) #
Figura 21 - Efeitos do tratamento crônico com IMAO-B ou anfetamina na avaliação do tempo em movimento (s) no campo aberto. Resultados expressos em média ± erro padrão. * p<0,05, ** p<0,01, *** p<0,001 em relação ao grupo SSA. & p<0,001 em relação ao grupo SSI. # p<0,05, ## p<0,001 em relação ao grupo ASA. α p<0,01, αα p<0,001 em relação ao grupo ISI. θ p<0,05, θθ p<0,001 em relação ao grupo AIA. ANOVA, Bonferroni.
VVA VVS AVA SVS VSA SVA ASA0
100
200
300
400
500 Central
Tem
po
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VVA VVS AVA SVS VSA SVA ASA0
250
500
750 Periférica
Tem
po
de
per
man
ênci
a(s
)
Figura 22 – Efeitos do tratamento crônico com IMAO-B ou anfetamina na avaliação do tempo de permanência (s) no campo aberto. Resultados expressos em média ± erro padrão. Não houve diferenças estatisticamente significantes entre os grupos. p<0,05; ANOVA, Bonferroni.
VVA VVS AVA SVS VSA SVA ASA0
100
200
******
***
*
&
&&
&
##
#α α
α
θ
Lev
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r
θθ
Figura 23 – Efeitos do tratamento crônico com IMAO-B ou anfetamina na avaliação do número de levantar no campo aberto. Resultados expressos em média ± erro padrão. * p<0,05, *** p<0,001 em relação ao grupo VVA. & p<0,001 em relação ao grupo VVS. # p<0,05, ## p<0,001 em relação ao grupo AVA. α p<0,001 em relação ao grupo SVS. θ p<0,05, θθ p<0,01 em relação ao grupo ASA. ANOVA, Bonferroni.
4.4.1 Experimento 2: Efeitos do tratamento crônico com IMAO-B ou
anfetamina na sensibilização comportamental para
anfetamina, no labirinto em cruz elevado.
Os animais foram submetidos a um pré-tratamento, à abstinência e
ao desafio conforme item 4.1 do Delineamento Experimental Geral.
Imediatamente após a avaliação em campo aberto, os animais foram
testados no labirinto em cruz elevado por 5 minutos, conforme item 3.3.2
de material e métodos.
Para este experimento foram formados os seguintes grupos: VVA,
VVS, AVA, SVS, VSA, SVA e ASA.
Resultados
Porcentagem do número de entradas nos braços abertos
Análise estatística mostrou que não houve alteração na
porcentagem de entradas nos braços abertos nos grupos avaliados
(F6,70=0,889; Fig.24.).
Porcentagem do tempo de permanência nos braços abertos
Análise estatística mostrou aumento significante do grupo AVA em
relação ao grupo VVS na porcentagem do tempo de permanência nos
braços abertos (F6,70=1,045; Fig.25).
VVA VVS AVA SVS VSA SVA ASA0
10
20
30
40
50
% d
e en
trad
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VVA VVS AVA SVS VSA SVA ASA0
10
20
30
*
% d
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cia
no
sb
raço
s ab
erto
s (s
)
Figura 24 – Efeitos do tratamento crônico com IMAO-B ou anfetamina na avaliação da porcentagem do número de entradas nos braços abertos no labirinto em cruz elevado. Resultados expressos em média ± erro padrão. Não houve alteração estatisticamente significante entre os grupos. p>0,05; ANOVA; Bonferroni.
Figura 25 – Efeitos do tratamento crônico com IMAO-B ou anfetamina na avaliação da porcentagem de tempo de permanência nos braços abertos no labirinto em cruz elevado. Resultados expressos em média ± erro padrão. * p<0,05 em relação ao grupo VVS. ANOVA; Bonferroni.
4.4.2 Experimento 3: Efeitos do tratamento crônico com selegilina ou
anfetamina, nos níveis de corticosterona.
Os animais foram submetidos a um pré-tratamento, à
abstinência e ao desafio conforme item 4.1 do Delineamento Experimental
Geral. Imediatamente após a avaliação em campo aberto os animais
foram testados no labirinto em cruz elevado. No dia seguinte os animais
receberam uma injeção de solução salina, anfetamina ou selegilina e após
15 minutos foram decapitados e o sangue foi coletado. A corticosterona foi
dosada a partir do soro conforme item 3.3.4 de material e métodos.
Para este experimento foram formados os seguintes grupos: VVA,
VVS, AVA, SVS, VSA, SVA, ASA.
Resultados Níveis de corticosterona
A análise estatística mostrou aumento significante do grupo SVS em
relação aos grupos VVA e VVS. O grupo ASA mostrou aumento
estatisticamente significante em relação aos grupos VVA, VVS, AVA e
VSA (KW= 18.220) (figuras 26 e 27).
VVA VVS AVA SVS VSA SVA ASA0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
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*
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VVA VVS AVA SVS VSA SVA ASA0
100
200
300
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(ng
/ml)
Figura 27. Efeitos do tratamento crônico com selegilina ou anfetamina, nas concentrações séricas de corticosterona (ng/ml). Resultados expressos em mediana ± coeficiente de variação. * p<0,05 em relação ao grupo VVA. &p<0,01, &&p<0,001 em relação ao grupo VVS. # p<0,05, ## p<0,01 em relação ao grupo AVA. θ p<0,05 em relação ao grupo VSA. Kruskall-Wallis, Dunn.
Figura 26. Efeitos do tratamento crônico com selegilina ou anfetamina, nas concentrações séricas de corticosterona (ng/ml). Resultados expressos em valores individuais ± medianas. * p<0,05 em relação ao grupo VVA. & p<0,01, && p<0,001 em relação ao grupo VVS. # p<0,05, ## p<0,01 em relação ao grupo AVA. θ p<0,05 em relação ao grupo VSA. Kruskall-Wallis, Dunn.
4.5 Experimento 4: Efeitos do tratamento agudo com selegilina ou
anfetamina, na atividade locomotora em campo
aberto.
Os animais foram submetidos à administração aguda de selegilina,
anfetamina ou solução salina conforme item 4.1 do Delineamento
Experimental Geral. Após 15 minutos, os animais foram testados em
campo aberto conforme item 3.3.1 de material e métodos.
Resultados
Distância percorrida
A) Total
A análise estatística mostrou aumento significante na distância
percorrida observada no grupo anfetamina em relação aos demais grupos.
(F2,21=17,284; Fig.28).
B) Central
A análise estatística mostrou diminuição significante na distância
percorrida observada no grupo selegilina em relação aos demais grupos
(F2,21=22,371; Fig. 28).
C) Periférica
A análise estatística mostrou aumento significante na distância
percorrida observada no grupo anfetamina em relação aos demais grupos.
(F2,21=11,217; Fig. 28).
Velocidade Média
A)Total
A análise estatística mostrou efeito significante na velocidade média
(cm/s) observada no grupo anfetamina a qual apresenta-se aumentada em
relação aos demais grupos (F2,21=17,297; Fig.29).
B) Central
A velocidade média dos animais do grupo anfetamina mostrou
aumento estatisticamente significante em relação aos demais grupos
(F2,21=6,149; Fig.29).
C) Periférica
A velocidade média dos animais do grupo anfetamina na zona
periférica mostrou aumento estatisticamente significante em relação aos
demais grupos (F2,21=15,793; Fig.29).
Tempo em movimento
A)Total
A análise estatística demonstrou aumento significante do grupo
anfetamina em relação aos demais grupos. O grupo selegilina apresentou
diminuição estatisticamente significante em relação ao grupo anfetamina
(F2,21=10,771; Fig. 30).
B)Central
O grupo selegilina apresentou diminuição estatisticamente significante
em relação aos demais grupos (F2,21=22,264; Fig.30).
C)Periférica
O grupo anfetamina apresentou aumento estatisticamente significante
em relação aos demais grupos (F2,21=7,346; Fig.30).
Tempo na zona
A)Central
O grupo anfetamina apresentou diminuição estatisticamente
significante em relação ao grupo solução salina (F2,21=2,738; Fig.31).
B)Periférica
O grupo anfetamina apresentou aumento estatisticamente significante
em relação ao grupo solução salina (F2,21=2,740; Fig.31).
Levantar
O número de levantar dos animais do grupo anfetamina apresentou
diferença estatisticamente significante em relação aos demais grupos. O
grupo selegilina apresentou uma diminuição estatisticamente significante
deste parâmetro em relação aos outros dois grupos (F2,21=33,838; Fig.32).
Salina Anfetamina Selegilina0
2500
5000
7500
**##
Total
Dis
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(cm
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*
Salina Anfetamina Selegilina0
1000
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3000 Central
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#*
Salina Anfetamina Selegilina0
1000
2000
3000
4000 Periférica *
##
Dis
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cia
per
corr
ida
(cm
)
Figura 28. Efeitos do tratamento agudo com selegilina ou anfetamina na avaliação da distância percorrida (cm/s) no campo aberto. Resultados expressos em média ± erro padrão. * p<0,01, ** p<0,01 em relação ao grupo solução salina. # p<0,05, ## p<0,001 em relação ao grupo anfetamina. ANOVA, Bonferroni.
Salina Anfetamina Selegilina0.0
2.5
5.0
7.5 *
**###
Total
Vel
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dad
e m
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(cm
/s)
Salina Anfetamina Selegilina0
10
20
30
*
##
Vel
oci
dad
e m
édia
(cm
/s)
Central
Salina Anfetamina Selegilina0.0
2.5
5.0
7.5
**
*
###
Vel
oci
dad
e M
édia
(cm
/s) Periférica
Figura 29. Efeitos do tratamento agudo com selegilina ou anfetamina na avaliação da velocidade média (cm/s) no campo aberto. Resultados expressos em média ± erro padrão. *p<0,01, ** p<0,01 em relação ao grupo solução salina. # p<0,05, ## p<0,01, ### p<0,001 em relação ao grupo anfetamina. ANOVA, Bonferroni.
Salina Anfetamina Selegilina0
50
100
150
Tem
po
em
mo
vim
ento
(s)
Central
**###
Salina Anfetamina Selegilina0
100
200
300
Tem
po
em
mo
vim
ento
(s)
Periférica
*
#
Figura 30 - Efeitos do tratamento agudo com selegilina ou anfetamina na avaliação do tempo de permanência (s) no campo aberto. Resultados expressos em média ± erro padrão. *p<0,05, ** p<0,001 em relação ao grupo solução salina. # p<0,01, ## p<0,001 em relação ao grupo Anfetamina. ANOVA, Bonferroni.
Salina Anfetamina Selegilina0
100
200
300
400
Tem
po
em
mo
vim
ento
(s)
Total*
*#
Salina Anfetamina Selegilina0
100
200
300
400
500 Central
*
Tem
po
de
per
man
ênci
a(s
)
Salina Anfetamina Selegilina0
250
500
750
Tem
po
de
per
man
ênci
a(s
)
Periférica
*
Figura 31 - Efeitos do tratamento agudo com selegilina ou anfetamina na avaliação do tempo de permanência (s) no campo aberto. Resultados expressos em média ± erro padrão. * p<0,05 em relação ao grupo solução salina. ANOVA, Bonferroni.
Salina Anfetamina Selegilina0
100
200
*
**#
Lev
anta
r
Figura 32 - Efeitos do tratamento agudo com selegilina ou anfetamina no levantar dos animais no campo aberto. Resultados expressos em média ± erro padrão. * p<0,01, ** p<0,001 em relação ao grupo salina. # p<0,001 em relação ao grupo anfetamina. ANOVA, Bonferroni.
4.5.1 Experimento 5: Efeitos do tratamento agudo com selegilina ou
anfetamina avaliado no labirinto em cruz elevado.
Os animais foram submetidos a uma administração aguda de
selegilina, anfetamina ou solução salina conforme item 4.2 do
Delineamento Experimental Geral. Imediatamente após a observação no
campo aberto os animais foram testados no labirinto em cruz elevado por
5 minutos conforme item 3.3.2 de material e métodos.
Resultados
Porcentagem do número de entradas nos braços abertos
A porcentagem do número de entradas nos braços abertos não
apresentou diferenças estatisticamente significantes entre os grupos
(F2,21=2,042; Fig.33).
Porcentagem do tempo de permanência nos braços abertos
A porcentagem do tempo de permanência nos braços abertos não
apresentou diferenças estatisticamente significantes entre os grupos
(F2,21=0,698; Fig.34).
Salina Anfetamina Selegilina0
25
50
75
% d
o n
úm
ero
de
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s b
raço
sab
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s
Figura 33. Efeitos do tratamento agudo com selegilina ou anfetamina na avaliação da porcentagem do número de entradas nos braços abertos no labirinto em cruz elevado. Resultados expressos em média ± erro padrão. Não houve diferença estatisticamente significante entre os grupos. p>0,05; ANOVA; Bonferroni.
Sallina Anfetamina Selegilina0
10
20
30
% d
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emp
o d
ep
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no
sb
raço
s ab
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s (s
)
Figura 34. Efeitos do tratamento agudo com selegilina e anfetamina na avaliação da porcentagem do tempo de permanência nos braços abertos no labirinto em cruz elevado. Resultados expressos em média ± erro padrão. Não houve diferença estatisticamente significante entre os grupos. p>0,05; ANOVA; Bonferroni.
4.5.2 Experimento 6: Efeitos do tratamento agudo com selegilina nos
níveis de corticosterona.
Os animais foram submetidos a uma administração aguda de
solução salina ou selegilina conforme item 4.3 do Delineamento
Experimental Geral. Imediatamente após o labirinto em cruz elevado os
animais foram decapitados e o sangue foi coletado. A corticosterona foi
dosada a partir do soro conforme item 3.3.4 de material e métodos.
Resultados
Níveis de corticosterona
A análise estatística mostrou redução estatisticamente significante
do grupo selegilina em relação ao grupo salina (U=151) (figuras 35 e 36).
Salina Selegilina0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
600*
Salina Selegilina0
250
500
750
*
Co
rtic
ost
ero
na
(ng
/ml)
Figura 35. Efeitos do tratamento agudo com selegilina, nas concentrações séricas de corticosterona (ng/ml). Resultados expressos em valores individuais ± medianas. * p<0,05 em relação ao grupo salina. Mann-Whitney.
Figura 36. Efeitos do tratamento agudo com selegilina, nas concentrações séricas de corticosterona (ng/ml). Resultados expressos em mediana ± coeficiente de variação. * p<0,05 em relação ao grupo salina. Mann-Whitney.
4.6 Experimento 7: Efeitos do tratamento agudo com solução salina,
anfetamina ou selegilina na pressão arterial e
freqüência cardíaca.
Os animais foram submetidos a uma administração aguda de
solução salina, anfetamina ou selegilina conforme item 4.3 do
Delineamento Experimental Geral. As medidas de pressão arterial e
freqüência cardíaca foram realizadas utilizando-se o método de medida
indireta descrito no item 3.4 de Material e Métodos.
Resultados
Freqüência Cardíaca
A) Grupo Salina
A freqüência cardíaca não apresentou diferença estatisticamente
significante nos animais que receberam solução salina 0,9% quando
comparados aos seus níveis basais (t=1,076; Fig.37A).
B) Grupo Anfetamina
A freqüência cardíaca não apresentou diferença estatisticamente
significante nos animais que receberam anfetamina quando comparados
aos seus níveis basais (t=2,516; fig. 37B).
C) Grupo Selegilina
Os animais pertencentes a este grupo apresentaram redução
estatisticamente significante na freqüência cardíaca (t=8,819; fig.37C).
Pressão Arterial Sistólica
A) Grupo Salina
Não houve diferença estatisticamente significante deste parâmetro
(t=0,1571; Fig.38A).
B) Grupo Anfetamina
Não houve diferença estatisticamente significante deste parâmetro
(t=1,716; Fig.38B).
C) Grupo Selegilina
A pressão arterial nos animais deste grupo apresentou redução
estatisticamente significante quando comparados aos seus níveis basais
(t=7,243; Fig.38C).
Basal Salina0
250
500
750
Fre
qu
ênci
a C
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íaca
Basal Selegilina0
250
500
750
*
Fre
qu
ênci
a C
ard
íaca
Figura 37. Efeitos do tratamento agudo com A-solução salina, B-anfetamina ou C-selegilina na freqüência cardíaca. Resultados expressos em média ± erro padrão. * p<0,05, em relação ao resultado basal. Teste t de student.
Basal Anfetamina0
250
500
750
Fre
qu
ênci
a C
ard
íaca
B
C
A
Basal Salina0
50
100
150
Pre
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l
Basal Anfetamina0
50
100
150
Pre
ssão
Art
eria
l
Basal Selegilina0
50
100
150
*
Pre
ssão
Art
eria
l
Figura 38. Efeitos do tratamento agudo com A-solução salina, B-anfetamina ou C-selegilina na pressão arterial. Resultados expressos em média ± erro padrão. Resultados expressos em média ± erro padrão. * p<0,05, em relação ao resultado basal. Teste t de student.
A
B
C
5 DISCUSSÃO
A sensibilização, caracterizada por um aumento no efeito
comportamental de uma droga após administrações repetidas, se deve a
ocorrência de neuroadaptações que geram nos dependentes uma
hipersensibilidade a droga e estímulos relacionados a ela. Drogas como a
anfetamina promovem modificações em sistemas de neurotransmissão,
(ex. sistema dopaminérgico) (ROBINSON e BERRIDGE 1993; PIERCE e
KALIVAS, 1997). Além disto, a anfetamina induz neuroplasticidade,
aumento de DA no núcleo accumbens (KANDEL et al., 2003) e
estimulação do eixo HPA (BARR te al., 2002; VANDERSCHUREN et al.,
1999).
A administração repetida de anfetamina resulta em uma complexa
mudança do padrão comportamental em camundongos, que inclui,
aumento de alguns comportamentos em resposta a uma dose desafio
após um período sem a droga (KUCZENSKI et al., 1997). Este aumento
na expressão do comportamento (por exemplo, na locomoção) persiste
mesmo após prolongados períodos de abstinência. Isto caracteriza a
sensibilização comportamental pela anfetamina, o que segundo BARR et
al., (2002) e VANDERSCHUREN et al., (1999) é também dependente do
aumento da liberação de corticosterona devido à estimulação do eixo HPA
pelo psicoestimulante.
Experimentos têm sido realizados para se averiguar as bases neurais
desta alteração comportamental, que parece estar relacionada com os
sistemas dopaminérgicos mesolímbicos e nigroestriatal devido ao seu
envolvimento na estimulação locomotora (CREESE e IVERSEN, 1974;
COLE, 1978; KEHNE et al., 1981).
Relacionado a isto, o experimento 1 (item 4.4 do delineamento
experimental e resultados) mostra primeiramente, que em nossas
condições experimentais, foi desenvolvida sensibilização comportamental
pela anfetamina, revelada por um aumento da atividade locomotora (grupo
AVA, figura 19). A diminuição na locomoção na zona central, em contraste
ao aumento da locomoção na zona periférica, sugere que a segunda seria
um parâmetro mais sensível para revelar a sensibilização.
Os resultados acima descritos, concomitantemente ao aumento do
tempo em movimento dos animais do grupo AVA (figura 21) na zona
periférica e aumento da velocidade média na zona central (figura 20) em
relação aos animais do grupo VVA, podem também evidenciar a
correlação entre a atividade locomotora e os efeitos ansiogênicos
induzidos pela anfetamina (PELLOW et al., 1985; LISTER et al., 1987).
Segundo BARNETT (1996), os roedores preferem locais perto de
superfícies verticais onde eles estão menos expostos a predadores.
Todavia, embora este experimento tenha demonstrado a expressão
da sensibilização comportamental, o experimento 1 (figura 19) nos mostra
que isto não é dependente do aumento nos níveis de corticosterona como
pode observado em estudos anteriores (BARR et al., 2000,
VANDERSCHUREN et al., 1999). Estes resultados estão de acordo com
os nossos. Isto pode ser devido ao desvio padrão muito grande. Entretanto
este resultado também foi evidenciado por SCHMIDT et al., (1999) que
demonstraram que a sensibilização comportamental e o eixo HPA não são
interdependentes indicando que a hipersecreção de corticosterona não é
crucial na determinação da expressão da sensibilização comportamental.
Isto também é evidenciado quando se administra um antagonista de
receptor CRH que tem como efeito abolir a hipersecreção de
corticosterona pela anfetamina e isto não afeta a expressão da
sensibilização. Sendo assim, a hipersecreção de corticosterona e a
sensibilização comportamental parecem não ser processos dependentes
(SCHMIDT et al., 1999).
A presença de diferenças estatisticamente significantes entre os
animais do grupo ASA (figura 19), que receberam selegilina no período de
abstinência, comparado com o grupo AVA, demonstra que a selegilina
potencia o efeito da anfetamina. Isto pode ser devido ao efeito inibidor
desta droga sobre a MAO, na dose utilizada. Inibindo-se a MAO-B pode-se
então modular o sistema dopaminérgico, acarretando assim um aumento
significativo na concentração cerebral de DA livre. A anfetamina por sua
vez, também teria efeito semelhante, uma vez que aumenta os níveis de
DA por aumento da liberação e bloqueio da recaptação, prolongando o
tempo em que a DA permanece na fenda sináptica (KANDEL et al., 2003).
Sendo assim, as duas drogas juntas (anfetamina e selegilina) fariam com
que as concentrações de DA cerebral estivessem muito aumentadas. Para
explicar tal hipótese pode-se inferir que a anfetamina aumenta o tempo em
que a DA permanece na fenda sináptica, e isto é possivelmente
potenciado por: (A) da selegilina inibir a MAO, fazendo com que não
ocorra degradação de DA (e das demais catecolaminas) e deste modo à
quantidade de DA livre no citoplasma, do neurônio pré-sináptico, esteja
aumentada e a quantidade nas vesículas também, resultando em uma
maior quantidade de DA sendo liberada na fenda, e (B) a selegilina
também bloqueia a recaptação fazendo com que mais DA fique livre na
fenda.
Quando houver falta das drogas irá ocorrer uma diminuição da
concentração de DA os receptores ficarão mais sensíveis e o neurônio
pós-sináptico irá aumentar o número destes receptores para que consiga
melhorar a eficiência da ligação neurotransmissor-receptor (KANDEL et
al., 2003). Entretanto segundo PIERCE e KALIVAS (1997) esta não é a
causa da expressão da sensibilização comportamental ser permanente.
Além disso, a selegilina, quando é metabolizada, produz
desmetilselegilina, metaanfetamina e esta é convertida em anfetamina
(GERLACK et al, 1996; CHRISP et al, 1991).
Observou-se também resultados semelhantes nos parâmetros
velocidade média (figura 20) e no tempo em movimento na arena e nas
duas zonas (central e periférica) (figura 21). Além disso, a selegilina
provavelmente potencia os efeitos ansiogênicos induzidos pela anfetamina
uma vez que os animais do grupo AIA (figuras 26 e 27) permaneceram
mais tempo em movimento na zona periférica. Os animais deste grupo
também apresentaram um aumento nos níveis de corticosterona (figuras
26 e 27) quando comparados aos animais do grupo AVA. Todavia, isto
não ocorre quando comparados aos animais do grupo SVS, o que
corrobora com a afirmação descrita anteriormente de que a selegilina
potencia os efeitos da anfetamina.
Os animais dos grupos VSA e SVA apresentaram diferença
estatisticamente significante em relação aos grupos VVS e SVS, e ainda o
grupo VSA apresentou diferença estatística quando comparado ao grupo
AVA (figura 19). Sendo assim, pode-se inferir que os animais dos grupos
VSA e SVA tiveram locomoção semelhante aos animais do grupo ASA,
evidenciou-se também que os grupos VSA e SVA apresentaram aumento
significante em relação aos animais que receberam apenas selegilina
(VVS, SVS) ou desafio com anfetamina (VVA). Estes resultados
corroboram com a afirmação feita anteriormente de que provavelmente a
selegilina e a anfetamina, quando administradas concomitantemente,
promovem potenciação dos seus efeitos. Além disso, a selegilina parece
criar uma sensibilização prévia para anfetamina o que é evidenciado pelo
grupo VSA.
Segundo estudos realizados até o momento, para se observar à
sensibilização seria necessário, primeiramente, um aumento da oferta de
DA na fenda sináptica e posteriormente uma diminuição abrupta desta
como ocorre no período de abstinência. Este período seria necessário
para o aumento da sensibilidade, o que levaria a uma maior resposta no
desafio. Isto é corroborado por nossos resultados com os grupos AVA e
SVS quando comparados a seus respectivos controles (VVA e VVS). No
entanto, nos grupos ASA e VSA pode-se observar uma potenciação do
efeito da anfetamina. Nestes grupos houve um aumento da oferta de DA
no período de abstinência, no lugar de uma diminuição. Este aumento é
devido a dois mecanismos: menor metabolização de DA em presença da
selegilina e o aumento da liberação deste neurotransmissor, já que pelo
processo de biotransformação, a selegilina origina anfetamina. Estes
resultados levam a sugerir que o período de abstinência não seria
necessário para o desenvolvimento da sensibilização.
Observando-se o grupo SVS, no parâmetro distância percorrida
(figura 19), onde os animais apresentaram tendência a aumento quando
comparados aos animais do grupo VVS, pode-se inferir que a selegilina
possivelmente sensibiliza para ela mesma, o que cofirma dados prévios de
outros autores (THEMANN et al., 2002). Por outro lado, no grupo VVS a
locomoção foi significantemente menor que a do grupo VVA (experimento
1, figura 19). Nos níveis de corticosterona houve um aumento
estatisticamente significante nos animais do grupo VVS e os do grupo SVS
(figuras 26 e 27), evidenciando que a selegilina cronicamente estimula o
eixo HPA e aumenta o ACTH, fazendo com que haja aumento nos níveis
de corticosterona. Resultado semelhante pode ser observado no
experimento 4(item 4.5 do delineamento experimental e resultados) onde
os animais que receberam selegilina agudamente apresentaram redução
na distância percorrida total (figura 28), bem como redução do tempo em
movimento (figura 30), redução no levantar (comportamento exploratório)
(figura 32) e redução nos níveis de corticosterona (figuras 35 e 36).
A diminuição no efeito comportamental é devido ao efeito da
selegilina na pressão arterial e na freqüência cardíaca como evidenciado
no experimento 7 (item 4.6 do delineamento experimental e resultados,
figuras 37C e 38C). Embora dados de literatura demonstrem que a
administração de anfetamina promove aumento da pressão arterial, em
nossos experimentos, este efeito não foi evidenciado (experimento 7,
figuras 37B e 38B). Já a selegilina provoca uma hipotensão de curta
duração acompanhado por uma diminuição na freqüência cardíaca,
provocada por diminuição do tônus simpático, que atua no controle da
pressão arterial por três mecanismos diferentes:
1- Vamos primeiramente observar a biossíntese das catecolaminas:
Em uma situação normal, ou seja, sem o uso de substâncias que
atuem no SNC, a tirosina por ação da enzima DOPA descarboxilase
transforma a tirosina em tiramina que é o principal substrato da MAO.
Quando se administra selegilina a um paciente, a MAO é inativada, a
tiramina fica livre e através da enzima dopamina β-hidroxilase é
transformada num falso neurotransmissor (octopamina) que compete com
a NA nas vesículas. Sendo assim, menos NA será liberada para fenda
Figura 39: Biossíntese das catecolaminas (adaptado de Goodman e Gilman 2000).
Tirosina LTirosina L--DOPA DA NA DOPA DA NA
Tirosina
hidroxilase
DOPA
descarboxilase
DA
β-hidroxilaseTirosina
hidroxilase
DOPA
descarboxilase
DA
β-hidroxilase
sináptica e menos NA agirá sobre o músculo cardíaco estimulando a
freqüência cardíaca e a força de contração (como descrito anteriormente
no item 1.5.3 da introdução), assim haverá uma diminuição da pressão
arterial bem como da freqüência cardíaca.
2- A selegilina irá agir deprimindo o centro vasomotor bulbar. Este é
estimulado pela NA que faz com que ocorra hipotensão, uma vez que esta
está aumentada no SNC devido à inibição da MAO, ocorrerá então
diminuição na pressão arterial e na freqüência cardíaca.
3- A selegilina irá agir nos gânglios simpáticos fazendo com que
haja uma via colinérgica atuando em uma dopaminérgica inibitória sobre o
eixo pós-ganglionar. Isto promoveria liberação de menos NA causando
uma diminuição na pressão arterial e na freqüência cardíaca.
A diminuição nos níveis de corticosterona quando da administração
aguda de selegilina, provavelmente se deve a uma sobrestimulação do
eixo HPA. Este resultado concorda com o uso clínico desta substância
para o tratamento de Cushing em cães e gatos onde ela atua causando
uma diminuição nos níveis de corticosterona e uma diminuição na pressão
arterial (PETERSON, 1999; PETERSON, 2001; REUSCH et al., 1999).
Esta diminuição dos níveis de corticosterona segundo REUSCH et al.,
(1999) acontece devido ao fenômeno de “down-regulation” de ACTH pelo
aumento da concentração de DA. Nos animais isto estaria relacionado à
parte intermediária e distal da hipófise, sendo que em 70% dos casos em
cães isto é causado por adenoma na parte distal. Já em humanos isto é
devido a microadenoma no lobo anterior ou parte distal da hipófise.
Durante muitos anos a selegilina foi usada como antidepressivo.
Sua eficácia clínica para fobia social foi muito investigada e comprovada
(LIEBOWITZ et al., 1992; VERSIANI et al., 1992;). Seu efeito ansiolítico
também foi evidenciado para estresse pós-traumático, síndrome do pânico
e fobia momentânea (VAN VLIET et al., 1993). Entretanto, segundo MAKI
(2000) poucos estudos existem evidenciando o efeito ansiolítico dos
inibidores da MAO.
FONTANA et al., (1989) demonstraram, em experimento com teste
de conflito, que os inibidores da MAO apresentam efeito ansiolítico com
tratamento crônico e não agudo. Com o labirinto em cruz elevado existem
poucos trabalhos publicados.
No experimento 2 (item 4.4.1 do delineamento experimental e
resultados, figura 25), o grupo SVS apresentou uma diminuição na % de
tempo de permanência nos braços abertos, evidenciando um possível
efeito ansiogênico também observado no grupo VVS (figura 24). No
experimento 5 (item 4.5.1 do delineamento experimental e resultados,
figuras 33 e 34) isto também é evidenciado, uma vez que o grupo
selegilina mostrou tendência à diminuição na % do tempo de permanência
nos braços abertos bem como na % do número de entradas nos braços
abertos.
O tratamento agudo com anfetamina segundo VANDERSCHUREN
et al., (1999) é suficiente para acarretar conseqüências neuroendócrinas,
neuroquímicas e comportamentais, o que levaria a um aumento da
atividade locomotora e aos seus efeitos ansiogênicos, o que seria devido a
uma hiperatividade no núcleo accumbens, no caudato putamem e no
estriado. Nos experimentos 4 (distância percorrida, figura 28) e 5 (figuras
33 e 34) pode-se observar o efeito agudo da anfetamina aumentando a
atividade locomotora (figura 28), e também que os animais permaneceram
mais tempo em movimento na zona periférica, demonstrando o efeito
ansiogênico da anfetamina (figuras 30 e 31). No experimento 5 (figura 34)
pode-se observar que os animais mostram que a porcentagem do tempo
de permanência nos braços abertos é baixa.
Assim, nossos dados confirmam que fármacos que aumentam a
disponibilidade de DA na fenda sináptica, como, por exemplo, anfetamina
e selegilina, podem apresentar um efeito ansiogênico.
6 CONCLUSÃO Em todos os itens a seguir nos referimos exclusivamente aos
efeitos comportamentais, endócrinos e cardíacos dos fármacos.
a) O tratamento com anfetamina, seguido de um período de
abstinência sensibiliza o animal para anfetamina;
b) Os níveis de corticosterona não estão aumentados nos animais
sensibilizados por anfetamina (ver selegilina item g da conclusão);
c) A sensibilização comportamental e a corticosterona não são
processos dependentes;
d) A administração de selegilina no período de abstinência potencia os
efeitos da anfetamina;
e) A administração da selegilina no período de abstinência do
tratamento com anfetamina potencia a sensibilização
comportamental para anfetamina;
f) O tratamento com selegilina, seguido de um período de abstinência
aumenta o efeito de uma dose aguda de anfetamina;
g) O tratamento com selegilina, seguido de um período de abstinência,
sensibiliza o animal para selegilina. Bem como aumenta os níveis
de corticosterona;
h) A abstinência não seria necessária para o desenvolvimento da
sensibilização comportamental;
i) Uma dose de anfetamina mostrou os conhecidos efeitos deste
fármaco estimulando a atividade motora;
j) Anfetamina agudamente, não teve efeito sobre a pressão arterial e
nem sobre a freqüência cardíaca;
k) Uma dose de selegilina tem efeitos opostos aos da anfetamina na
atividade motora;
l) Selegilina agudamente causa hipotensão e bradicardia;
m) Uma dose aguda de selegilina causa diminuição nos níveis de
corticosterona.
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