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CAMILA SANCHES CIBANTOS AMARAL DE MODENA INFLUÊNCIAS DE UM INIBIDOR SELETIVO DA MONOAMINO-OXIDASE TIPO-B (IMAO-B) NA SENSIBILIZAÇÃO COMPORTAMENTAL PARA ANFETAMINA EM CAMUNDONGOS São Paulo 2006 Dissertação apresentada ao Instituto de Psicologia da Universidade de São Paulo como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Psicologia.

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CAMILA SANCHES CIBANTOS AMARAL DE MODENA INFLUÊNCIAS DE UM INIBIDOR SELETIVO DA MONOAMINO-OXIDASE TIPO-B (IMAO-B) NA SENSIBILIZAÇÃO COMPORTAMENTAL PARA

ANFETAMINA EM CAMUNDONGOS

São Paulo 2006

Dissertação apresentada ao Instituto de Psicologia da Universidade de São Paulo como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Psicologia.

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CAMILA SANCHES CIBANTOS AMARAL DE MODENA INFLUÊNCIAS DE UM INIBIDOR SELETIVO DA MONOAMINO-OXIDASE TIPO-B (IMAO-B) NA SENSIBILIZAÇÃO COMPORTAMENTAL PARA

ANFETAMINA EM CAMUNDONGOS

São Paulo 2006

Dissertação apresentada ao Instituto de Psicologia da Universidade de São Paulo como parte dos requisitos para obtenção do grau de Mestre em Psicologia. Área de concentração: Neurociências e Comportamento Orientador: Profa. Dra. Antonia Gladys Nasello

Data da Defesa: 09/06/2006

Banca Examinadora

Prof. Dr. Luciano Freitas Felício

Julgamento: Aprovada Assinatura:

Profa. Dra.Rosana Camarini

Julgamento: Aprovada Assinatura:

Profa. Dra. Antonia Gladys Nasello

Julgamento: Aprovada Assinatura:

Engraçado perceber que buscamos, enveredamos por tantos caminhos,

aprendemos, crescemos, para no final descobrir que é na simplicidade das coisas,

dos atos e das pessoas que residem todos os segredo de ser feliz. A poesia está presente no dia-a-dia, nas ações que consideramos irrelevantes,

nas conversas que avaliamos como irrelevantes, nas conversas que avaliamos como banais,

nas gargalhadas despretenciosas ao lado dos amigos. Viva a simplicidade das coisas!

Edras Matheus

Dedico

Aos meus pais:

Jayle e Eliana

…..à vocês que sempre me ensinaram, apoiaram, acreditaram,

confiaram, obrigada por todo carinho, incentivo, exemplos, apoio,

ajuda e AMOR!!

AMO MUITO VOCÊS!!

AO MEU AMOR

Guilherme

Por sempre estar ao meu lado me apoiando, incentivando, acreditando,

confiando, por todo o seu amor!!

A VOCÊ, MEU AMOR ETERNO!!

Agradecimentos

À minha orientadora, Professora Dra.Antonia Gladys Nasello, minha mãe cientifica, pelo exemplo, orientação, atenção, amizade, carinho, por ter acreditado e confiado em mim. Ao Professor Dr.Luciano Freitas Felício, meu pai cientifico, pela ajuda, carinho, amizade, paciência. À Professora Dra.Luciele Guaraldo pelas sugestões apresentadas por ocasião do exame de qualificação. À Fabiana Costa pelos ensinamentos, paciência e amizade. Às minhas MELHORES AMIGAS Beth, Belzinha e Marcinha pelo apoio, carinho e amizades incondicionais! Por todos os momentos maravilhosos e inesquecíveis que passamos juntas. AMO VOCÊS!!! Às minhas amigas Aline, Amanditas, Cynthia, Daniely, Domenica, Érika, Gabriela, Iara, Ivone Isabel, Luciana Faccas, Luciana “Dark”, Soraya, Tatiane, Viviane. À professora Dra.Claudia Cuningan do laboratório de Hipertensão do Incor pela ajuda, apoio, ensinamentos e paciência. Ao Leandro Cardoso do Laboratório de Hipertensão do Incor pela ajuda, apoio, paciência e ensinamentos. Ao Gustavo pela ajuda e ensinamentos. Ao Prof. Dr.Cláudio Alvarenga de Oliveira e a Priscila do laboratório de dosagens Hormonais do Departamento de Reprodução da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo. Ao Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo onde realizei este trabalho. A todo pessoal do Biotério da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo: Claudia, Idalina, Rosires, Herculano e Nelsinho. Ao pessoal do laboratório de Farmacologia do Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo: Magali, Ricardo e Priscila. A toda minha família e a todos os meus amigos que sempre estiveram presentes, confiando, torcendo e me incentivando durante a realização deste trabalho. A Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo –FAPESP- pelo auxílio-pesquisa concedido.

A todas as pessoas que estiveram presentes na minha vida durante o período de realização deste trabalho, que acreditaram, me apoiaram, incentivaram nesta etapa tão importante na minha vida!

Este trabalho foi desenvolvido nas dependências do Laboratório de Biologia Molecular em Neurociências e Comportamento da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo. Teve suporte financeiro do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) processo n°130700/2005-3. E da Fundação de Amparo à Pesquisa do estado de São Paulo (FAPESP) processo n°04/12700-8.

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

RESUMO

ABSTRACT

1 INTRODUÇÃO.....................................................................................

1.1 Dependência à drogas......................................................................

1.2 Sensibilização comportamental........................................................

1.3 Circuitos dopaminérgicos cerebrais..................................................

1.4 Eixo hipotálamo-pituitário-adrenal....................................................

1.4.1 Mineralocorticóides......................................................................

1.4.2 Glicocorticóides............................................................................

1.4.3 Corticosterona..............................................................................

1.5 Sistema cardiovascular e pressão arterial........................................

1.5.1 Sistema renina-angiotensina.........................................................

1.5.2 Sistema nervoso autonômico........................................................

1.5.3 Noradrenalina e acetilcolina..........................................................

1.6 Anfetamina........................................................................................

1.7 Selegilina..........................................................................................

18

18

19

21

24

24

25

26

27

27

28

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30

31

2 OBJETIVOS.........................................................................................

2.1 Objetivo Geral...................................................................................

2.2 Objetivos Específicos.......................................................................

37 37 37

3 MATERIAL E MÉTODOS....................................................................

3.1 Animais.............................................................................................

3.2 Drogas..............................................................................................

3.3 Avaliações Comportamentais...........................................................

3.3.1 Quantificação da atividade locomotora em campo aberto.............

3.3.2 Avaliação do comportamento no labirinto em cruz elevado..........

3.4 Medida da pressão arterial...............................................................

3.5 Dosagem Hormonal..........................................................................

3.6 Análise Estatística............................................................................

39

39

40

40

40

42

43

44

45

4 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL E RESULTADOS.......................

4.1 Delineamento Experimental Geral – tratamento crônico..................

4.2 Delineamento Experimental Geral – tratamento agudo....................

4.3 Delineamento Experimental Geral – pressão arterial.......................

4.4 Experimento 1...................................................................................

4.4.1 Experimento 2................................................................................

4.4.2 Experimento 3................................................................................

4.5 Experimento 4...................................................................................

4.5.1 Experimento 5................................................................................

4.5.2 Experimento 6................................................................................

4.6 Experimento 7...................................................................................

47

44

48

50

51

61

63

65

73

75

77

5 DISCUSSÃO........................................................................................

85

6 CONCLUSÃO......................................................................................

96

REFERÊNCIAS......................................................................................

99

LISTA DE FIGURAS

Figura n. Página

1 Biotransformação da selegilina........................................................

33

2 Produção de radicais livres pelo metabolismo da DA.....................

35

3 (A) Aparelho do campo aberto......................................................... (B) Esquema do aparelho do campo aberto com zonas central e

periférica....................................................................................

41

41

4 Labirinto em cruz elevado.................................................................

43

5 Sistema Computadorizado de medida da pressão arterial indireta..

44

6 Efeitos da anfetamina em animais tratados com solução salina a 0,9% na fase de pré-tratamento.......................................................

18

7 Efeitos da anfetamina em animais tratados com anfetamina na fase de pré-tratamento.....................................................................

18

8 Efeitos da anfetamina em animais tratados com solução salina 0,9% na fase de pré-tratamento e que receberam IMAO-B durante a abstinência.....................................................................................

18

9 Efeitos da anfetamina em animais tratados com anfetamina durante a fase de pré-tratamento e que receberam IMAO-B durante a abstinência.......................................................................

19

10 Efeitos da IMAO-B em animais tratados com solução salina 0,9% durante a fase de pré-tratamento.....................................................

19

11 Efeitos da IMAO-B em animais tratados com IMAO-B na fase de pré-tratamento..................................................................................

19

12 Efeitos da anfetamina em animais tratados com IMAO-B na fase de pré-tratamento.............................................................................

20

13 Efeitos da administração aguda de solução salina 0,9% no comportamento avaliado no campo aberto e no labirinto em cruz elevado.............................................................................................

20

14 Efeitos da administração aguda de anfetamina no comportamento avaliado no campo aberto e no labirinto em cruz elevado...............

21

15 Efeitos da administração aguda de IMAO-B no comportamento avaliado no campo aberto e no labirinto em cruz elevado...............

21

16 Efeitos da administração aguda de solução salina na freqüência

cardíaca e pressão arterial...............................................................

17 Efeitos da administração aguda de anfetamina na freqüência cardíaca e pressão arterial...............................................................

18 Efeitos da administração aguda de selegilina na freqüência cardíaca e pressão arterial...............................................................

19 Efeitos do tratamento crônico com IMAO-B ou anfetamina na avaliação da distância percorrida (cm) no campo aberto.................

26

20 Efeitos do tratamento crônico com IMAO-B ou anfetamina na avaliação da velocidade média (cm/s) no campo aberto..................

27

21 Efeitos do tratamento crônico com IMAO-B ou anfetamina na avaliação do tempo em movimento (s) no campo aberto.................

28

22 Efeitos do tratamento crônico com IMAO-B ou anfetamina na avaliação do tempo de permanência (s) no campo aberto...............

29

23 Efeitos do tratamento crônico com IMAO-B ou anfetamina na avaliação do número de levantar e no campo aberto.......................

30

24 Efeitos do tratamento crônico com IMAO-B ou anfetamina na avaliação da porcentagem do número de entradas nos braços abertos no labirinto em cruz elevado................................................

32

25 Efeitos do tratamento crônico com IMAO-B ou anfetamina na avaliação da porcentagem do tempo de permanência nos braços abertos no labirinto em cruz elevado................................................

32

26 Efeitos do tratamento crônico com selegilina ou anfetamina, nas concentrações séricas de corticosterona (ng/ml).............................

27 Efeitos do tratamento crônico com selegilina ou anfetamina, nas concentrações séricas de corticosterona (ng/ml).............................

28 Efeitos do tratamento agudo com selegilina ou anfetamina na avaliação da distância percorrida (cm) no campo aberto.................

37

29 Efeitos do tratamento agudo com selegilina ou anfetamina na avaliação da velocidade média (cm/s) no campo aberto..................

38

30 Efeitos do tratamento agudo com selegilina ou anfetamina na avaliação do tempo em movimento (s) no campo aberto.................

39

31 Efeitos do tratamento agudo com selegilina ou anfetamina na avaliação do tempo de permanência (s) no campo aberto...............

40

33 Efeitos do tratamento agudo com selegilina ou anfetamina na avaliação da porcentagem do número de entradas nos braços abertos no labirinto em cruz elevado................................................

43

34 Efeitos do tratamento agudo com selegilina ou anfetamina na avaliação da porcentagem do tempo de permanência nos braços abertos no labirinto em cruz elevado................................................

43

35A

Efeitos do tratamento agudo com selelegilina, nas concentrações séricas de corticosterona (ng/ml)......................................................

35B

Efeitos do tratamento agudo com selegilina, nas concentrações séricas de corticosterona (ng/ml)......................................................

36 Efeitos do tratamento agudo com solução salina, anfetamina ou selegilina na freqüência cardíaca.....................................................

37 Efeitos do tratamento agudo com solução salina, anfetamina ou selegilina na pressão arterial............................................................

39 Biossíntese das catecolaminas........................................................ 91

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ACTH Hormônio adrenocorticotrópico

AD Adrenalina

AMPc Monofosfato de adenosina cíclico

CRH Hormônio de liberação da corticotropina

DA Dopamina

ECA Enzima conversora de angiotensina

HPA Hipotálamo-pituitária-adrenal

NA Noradrenalina

MAO Monoamina-oxidase

NIDA National Institute on Drug Abuse

SNC Sistema Nervoso Central

5-HT Serotonina

K+ Potássio

Ca2+ Cálcio

Na+ Sódio

RESUMO

MODENA, C.C. Influências de um inibidor seletivo da monoamino-oxidase tipo-B (IMAO-B) na sensibilização comportamental para anfetamina em camundongos. São Paulo, 2006......p. Dissertação (Mestrado em Neurociências e Comportamento). Instituto de Psicologia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2006.

A sensibilização comportamental é caracterizada por aumento no efeito comportamental de uma droga após administrações repetidas. Este fenômeno é intensamente aplicado em estudos com modelos animais que enfocam a dependência de drogas. A maioria destas drogas promove adaptações em sistemas de neurotransmissão, (ex. sistema dopaminérgico), como é o caso da anfetamina, morfina e etanol. No entanto, estudos que avaliam os efeitos de drogas administradas durante a abstinência e posterior expressão de sensibilização comportamental são escassos. Neste trabalho avaliou-se as influências de um inibidor seletivo da monoamino-oxidase tipo-B (selegilina, 10mg/Kg) na sensibilização comportamental para anfetamina (2mg/Kg) observada em camundongos. Os resultados mostraram que o tratamento crônico com anfetamina promoveu sensibilização comportamental, efeito também observado no tratamento com selegilina, o qual resultou em sensibilização prévia para a anfetamina, além de potencializar os efeitos desta. Evidenciou-se também que a sensibilização comportamental não é um processo dependente dos níveis de corticosterona. O tratamento agudo com selegilina reduziu a atividade locomotora observada em campo aberto devido a hipotensão e bradicardia causadas pela mesma. Além disso, a selegilina agudamente também causou diminuição nos níveis de coticosterona motivo pelo qual é utilizada em clínica veterinária para o tratamento da Síndrome de Cushing. O tratamento agudo com anfetamina promoveu aumento no parâmetro comportamental, evidenciando seu efeito estimulante, mas não causou hipertensão. Palavras-chave: Sensibilização. Anfetamina. Selegilina. Camundongos

ABSTRACT

MODENA, C.C. Influences of a selective inhibitor monoamine oxidase type-B (IMAO-B) in behavior sensitization for amphetamine in mice. São Paulo, 2005. 80p. Boneco da Dissertação de Mestrado para qualificação. Neurociências e Comportamento, Instituto de Psicologia, Universidade de São Paulo.

The behavior sensitization is defined by a progressive enhancement of the behavioral response after repeated treatments. This phenomenon is intensely applied in studies with animal models that focus drug addiction. The majority of these drugs promote adaptations in neurotransmission (ex. dopaminergic system) as is the case of amphetamine, morphine and ethanol. However, studies which evaluate the drugs effects during abstinence and the induction of behavioral sensitization are scarce. In the present study we evaluated the influences of a selective inhibitor monoamine oxidase type-B (selegiline, 10mg/Kg) in the behavioral sensitization for amphetamine (2mg/Kg) in mice. The results shown that the chronic treatment with amphetamine promoted behavioral sensitization, like selegiline treatment that results in previous sensitization for amphetamine therefore potentiate the effects of this drug. Showed up that behavioral sensitization is not dependent process of the levels of corticosterone. The acute treatment with selegiline reduced the locomotor activity in open field test because of hypotension and decrease in heart rate. Another important acute effect of selegiline is the decrease in corticosterone levels; this is the cause that this drug is using in treatment of Cushing syndrome in veterinary. The acute treatment with amphetamine promoted increase in the locomotor activity, showing this stimulant effect but did not show effects in the blood pressure. Key-words: Sensitization. Amphetamine. Selegiline. Mice.

1 INTRODUÇÃO

1.1 Dependência à Drogas

A dependência à drogas é um fenômeno complexo caracterizado

por um desejo compulsivo de buscar/obter a droga, persistindo mesmo em

face às conseqüências adversas de seu uso. Para muitas pessoas, a

dependência à drogas se torna crônica, reincidindo após longos períodos

de abstinência (ROBINSON e BERRIDGE, 1993). Segundo LAMBERT e

KINSLEY (2005) a dependência envolve o aspecto fisiológico e o

psicológico do usuário. O fisiológico é caracterizado por modificações na

fisiologia do usuário durante o uso contínuo da droga. O aspecto

psiológico se caracteriza pelos efeitos da droga no usuário que a necessita

para realizar suas tarefas ou somente para poder “viver” cada novo dia!

Mais de três décadas de pesquisas têm mostrado que a

dependência de drogas é passível tanto por tratamento medicamentoso

quanto psicológico. Segundo relatórios do NIDA (National Institute on Drug

Abuse, 1997), os melhores resultados no tratamento de indivíduos

dependentes de drogas são conseguidos quando o tipo de droga e as

características individuais são levadas em consideração na escolha da

terapia medicamentosa. Entre os fatores individuais, um dos mais

importantes é a coexistência de outros distúrbios psiquiátricos, como por

exemplo, depressão, ansiedade e stress. Segundo LAMBERT e KINSLEY

(2005) o stress tem sido identificado como um fator contribuinte para a

aquisição e a manutenção da dependência de drogas. Desse modo,

tratamentos que considerem a droga de dependência em conjunto com

outros distúrbios psiquiátricos existentes tendem a ser mais eficazes.

1.2- Sensibilização Comportamental

Um fenômeno intensamente utilizado em pesquisas de laboratório

que enfocam a dependência à drogas é a sensibilização comportamental,

que se caracteriza por uma exacerbação no efeito comportamental de uma

droga após administrações repetidas que persiste mesmo após longos

períodos de abstinência(PIERCE e KALIVAS, 1997; TSAI e HONG, 2003).

Foi caracterizada em 1932 quando os efeitos psicomotores da anfetamina

estavam sendo estudados em animais de laboratório (DOWNS e EDDY,

1932). Em 1958 esse fenômeno foi registrado em humanos em relação

aos efeitos psicóticos da anfetamina; esta induz uma psicose indistinguível

da esquizofrenia paranóica (CONNELL, 1958).

Evidências sugerem que o substrato neural da sensibilização

comportamental seja o sistema dopaminérgico mesotelencefálico

(KUCZENSKI e SEGAL, 1990).

Devido ao papel potencial da sensibilização comportamental na

dependência de drogas, tem havido grande interesse em identificar drogas

que atuam em receptores para nicotina, GABA, glutamato do tipo NMDA

(TZSCHENTKE e SCHMIDT, 1999), e colecistocinina (FELÍCIO et al.,

2001) e neurotensina (COSTA et al., 2001; ROMPRE e PERRON, 2000;

HORGER et al., 1994) que prejudicam tanto a indução quanto a expressão

da sensibilização comportamental. No entanto, avaliações dos efeitos de

drogas administradas durante a abstinência da droga de abuso e na

posterior expressão da sensibilização são escassas. É interessante

observar que esse período de abstinência corresponderia ao período no

qual costuma-se iniciar o tratamento da dependência em humanos.

Assim, fica clara a relevância desse tipo de abordagem na sensibilização

comportamental para avaliação da eficácia de drogas no tratamento da

dependência.

Outro aspecto interessante da sensibilização comportamental é a

sua modulação por variáveis comportamentais. Por exemplo, tanto o

estresse quanto o isolamento social induzem sensibilização cruzada aos

efeitos psicomotores de drogas de abuso (PIAZZA et al., 1990). Não

obstante a essas observações, PIAZZA et al., (1989) verificaram que a

resposta locomotora inata de ratos a um ambiente novo estaria

correlacionada com o desenvolvimento da sensibilização comportamental.

Assim, animais com alta atividade locomotora, quando expostos a um

ambiente novo, apresentaram maior predisposição para o

desenvolvimento da sensibilização comportamental em relação aos

animais com resposta locomotora baixa. Além disso, PIAZZA et al., (1991)

observaram que os animais com resposta comportamental exacerbada ao

ambiente novo também apresentam uma hiperatividade dopaminérgica no

núcleo accumbens em relação aos animais com resposta baixa. O núcleo

accumbens também está envolvido na sensibilização comportamental uma

vez que, como já citado anteriormente, existe um aumento da liberação de

dopamina (DA) (PIERCE e KALIVAS, 1997). Assim, esses resultados em

conjunto apontam que diferenças comportamentais prévias à

sensibilização comportamental estariam associadas com a predisposição

ao desenvolvimento desse fenômeno.

Trabalhos para a avaliação da sensibilização comportamental têm

sido feitos utilizando-se anfetamina, entre outras drogas (COSTA et al.,

2001; FELICIO, 2001). Como visto anteriormente, a sensibilização

comportamental está intimamente relacionada com a dependência de

drogas. Paralelamente, um aspecto clínico importante na dependência de

drogas é a coexistência de outros distúrbios psiquiátricos, como por

exemplo, depressão e ansiedade, e a necessidade de considerar esses

distúrbios em conjunto com a dependência para melhor eficácia

terapêutica (NIDA, 1997). Desse modo, seria interessante considerar o

papel da variabilidade das respostas comportamentais em modelos

animais de depressão e ansiedade no fenômeno de sensibilização

comportamental. Atenta-se ainda para o fato da sensibilização

comportamental poder ser induzida por outras drogas, que não são

consideradas drogas de abuso, além da anfetamina ou também poder ser

induzida por outras drogas associadas a esta (SPANAGEL, 1995).

1.3- Circuitos dopaminérgicos cerebrais

As drogas que induzem dependência química representam um

grupo diverso de compostos que diferem em suas ações

comportamentais e neuroquímicas. Entretanto, praticamente todas

essas drogas podem induzir neuroadaptações em sistemas de

neurotransmissão (ex. dopaminérgico) como é o caso da anfetamina,

morfina e etanol (PIERCE e KALIVAS, 1997).

Hoje se sabe que a DA representa mais de 50% das catecolaminas

centrais, sendo encontrada em altas concentrações nos núcleos da base,

no núcleo accumbens, tubercúlos olfatórios, núcleo central da amígdala,

eminência média e algumas áreas do córtex frontal (KANDEL et al., 2003).

As vias dopaminérgicas são de suma importância devido as suas

implicações comportamentais, neuroendócrinas entre outras. O

mapeamento destas vias começou em 1965 com trabalhos que

demonstraram a existência de três vias dopaminérgicas principais no

cérebro: nigroestriatal, mesocortical e mesolimbica que compreende a

túbero-infundibular e a da área postrema (FALLON, 1988; LINDVALL e

BJÖRKLUND, 1974; UNGERSTEDT, 1971).

O trato nigroestriatal é formado pelos neurônios da parte compacta

da substância negra, denominados A9, que se projetam através do feixe

do mesencéfalo para o corpo estriado (DOMESICK, 1988; MONGENSON

et al., 1988; THIERRY et al., 1988).

Os neurônios dopaminérgicos do trato mesolímbico se projetam

primeiramente da área ventral tegmental, do grupo de células

denominadas A10, inervando núcleo accumbens, núcleo septal lateral,

amígdala e núcleo caudado lateral. Os corpos celulares desses neurônios

também dão origem ao sistema dopaminérgico mesocortical, se

projetando para o córtex pré-frontal, girus cinguli e sítios alvo e

neocorticais (DOMESICK, 1988; MONGENSON et al., 1988; THIERRY et

al., 1988). Os neurônios do grupo A8, que ocupam a porção retrorubral,

contribuem para a inervação das áreas mesolímbica e estriatal, mas não

para sítios neocorticais (BERMAN, 1968; DEUTCH, 1988; UNGERSTEDT,

1971).

Os receptores dopaminérgicos estão divididos em duas subfamílias

D1 e D2. A subfamília D1 inclui os receptores D1, e os receptores D5. A

subfamília D2 inclui além dos receptores D2, D3 e D4. Os receptores da

subfamília D1 ativam a adenilato ciclase aumentando os níveis

intracelulares de AMPc (CLARK e WHITE, 1987), sendo expressos em

alta concentração no corpo estriado, núcleo accumbens e tubérculo

olfatório (MANSUR e WATSON, 1995). A subfamilia D2 tem influência

inibitória na adenilciclase além de agir por meio de outros segundos

mensageiros que incluem ativação dos canais de potássio (K+) e inibição

dos canais de cálcio (Ca2+) (VALLAR e MELDOLESI, 1989). As áreas de

maior expressão desses receptores concentram-se na substância negra

pars compacta, na área ventral do tegmento mesencefálico, no corpo

estriado, no núcleo accumbens e no tubérculo olfatório (MANSUR e

WATSON, 1995).

A anfetamina e a cocaína induzem neuroplasticidade, uma vez que

a primeira aumenta a liberação de DA e a segunda inibe a recaptação,

prolongando o tempo em que a DA permanece na fenda sináptica

(KANDEL et al., 2003). ROBINSON e BERRIDGE (1993) defendem que a

sensibilização do circuito dopaminérgico mesolímbico está correlacionada

com aspectos motivacionais atribuídos ao ato de buscar/obter a droga,

introduzindo o componente compulsivo na dependência. Esses autores

ainda sugerem que a ocorrência de neuroadaptações relacionadas à

sensibilização gera nos dependentes uma hipersensibilidade às drogas e

estímulos relacionados a elas. Tal fenômeno seria efetivo em precipitar

recaída em indivíduos desintoxicados. Corroborando com isto,

MOGENSON et al., (1988), afirmam que o sistema dopaminérgico

mesolímbico transforma estímulos biologicamente relevantes em

respostas comportamentais a estímulos ambientais e farmacológicos,

regulando o limite e a intensidade da resposta comportamental ao

estímulo recebido.

1.4.1 Eixo hipotálamo-pituitário-adrenal

O hipotálamo-pituitário adrenal (HPA) mantém os níveis apropriados

de glicocorticóides que são determinadas por flutuações na liberação de

hormônio adrenocorticotrópico (ACTH) pelos corticotropos hipofisários.

Esses são regulados pelo hormônio de liberação da corticotropina (CRH)

que é liberado por neurônios de CRH do hipotálamo endócrino. Esses três

órgãos em conjunto são designados como eixo HPA. A regulação deste

eixo é realizada de três maneiras: o ritmo diurno na esteroidogenese

basal, a regulação de retroalimentação negativa pelos corticosteróides

supra-renais e os aumentos acentuados da esteroidogenese em resposta

ao stress (SCHIMMER e PARKER, 2003).

1.4.3 Mineralocorticóides

O principal mineracolocorticóide, como já citado anteriormente, é a

aldosterona. Sua síntese e liberação dependem da composição de

eletrólitos no plasma e do sistema angiotensina II. As baixas

concentrações plasmáticas de sódio (Na+) e altos níveis plasmáticos de K+

afetam as células da zona glomerular da supra-renal, estimulando a

liberação de aldosterona (SCHIMMER e PARKER, 2003).

Os mineralcocorticóides causam alterações no sistema

cardiovascular, devido ao controle na excreção renal de sódio podendo

causar hipertensão (SCHIMMER e PARKER, 2003).

1.4.2 Glicocorticóides

O principal estímulo fisiológico responsável pela síntese dos

glicocorticóides é a presença de ACTH (como já citado anteriormente). A

substância inicial para síntese de glicocorticóides é o colesterol obtido do

plasma e também nos grânulos lípidicos das células da camada média do

córtex da supra-renal que é convertido em pregnenoloma e a velocidade

deste processo é regulada pelo ACTH. Os glicocorticóides exercem seus

efeitos sob três aspectos principais: efeitos metabólicos e sistêmicos

gerais, efeitos da retroalimentação negativa sobre a adeno-hipófise e o

hipotálamo e efeitos antiinflamatórios e imunosupressores (SCHIMMER e

PARKER, 2003).

À liberação dopaminérgica no córtex frontal (CLAUSTRE et al.,

1986) aumenta a corticosterona e está relacionada também a

sensibilização comportamental. Estes efeitos segundo BUUSE et al.,

(2004) seriam possivelmente devido a um efeito indireto como o hormônio

de liberação de CRH.

No sistema cardiovascular os glicocorticóides causam hipertensão

aumentando a expressão dos receptores adrenérgicos na parede vascular

causando vasonconstrição. Em contrapartida também se observa

hipertensão em pacientes com secreção excessiva de glicocorticóides, por

exemplo, pacientes com síndrome de Cushing (BAXTER e ROSSEAU,

1979).

1.4- Corticosterona

O córtex da supra-renal é estimulado pelo ACTH para fabricar seus

esteróides que são os mineralocoticóides e os glicocorticóides. Os

mineralocorticóides afetam o equilíbrio hidroeletrolítico e o principal

hormônio é a aldosterona. Os glicocorticóides afetam o metabolismo dos

carboidratos e das proteínas, atividade antiinflamatória e imunosupressora

e os principais hormônios em animais são: a hidrocorticosona e a

corticosterona (SCHIMMER e PARKER, 2003).

O ACTH estimula a supra-renal porque reage com o receptor

especifico de membrana que é acoplado a proteína G. O ACTH atua

através da proteína G para ativar a adenilil-ciclase e aumentar o conteúdo

intracelular de AMP cíclico que é um segundo mensageiro dos efeitos de

ACTH sobre a esteroidogênese. Além disso, a esteroidogênese também é

regulada fisilogicamente pela angiotensina II e K+ (SCHIMMER e

PARKER, 2003).

1.5- Sistema cardiovascular e pressão arterial

A pressão arterial é determinada pelo débito cardíaco e pela

resistência ao fluxo de sangue nos vasos sanguíneos. Os sistemas renina-

angiotensina, hipotálamo, simpático e parassimpático participam do

controle do sistema cardiovascular e da pressão arterial (JACKSON,

2003).

1.5.1- Sistema renina-angiotensina

A renina é uma enzima sintetizada, armazenada e secretada na

circulação arterial renal pelas céluas justaglomerulares granulares. Esta

atua no angiotensinogênio para catalisar a formação do decapeptídio

angiotensina I. Este é clivado pela enzima conversora de angiotensina

(ECA) em angiotensina II. Esta atua através de mecanismos diferentes

para elevar a pressão arterial. Possui uma importante função que é a de

inibir a excreção de Na2+ e água pelos rins para estabilização da pressão

arterial.

A resposta pressórica rápida a angiotensina II é devida a um aumento na

resistência periférica total, esta ajuda a manter a pressão arterial diante de

um estímulo hipotensivo agudo. A angiotensina II também aumenta a

contratibilidade e a freqüência cardíaca. O mecanismo pelo qual a

resistência periférica total acontece é pela abertura dos canais de cálcio

regulados pela voltagem nos miócitos cardíacos. A contratibilidade e a

freqüência cardíaca ocorrem através da facilitação do tônus simpático,

aumento da neurotransmissão noradrenérgica e liberação supra-renal de

catecolaminas (JACKSON, 2003).

Provoca também uma resposta pressórica lenta que estabiliza a

pressão arterial por um longo período. Isto é mediado pela redução na

função excretora renal. Facilita a neurotransmissão noradrenérgica

periférica aumentando a liberação de noradrenalina (NA) pelos terminais

nervosos simpáticos, inibindo a recaptação de NA por estes e aumentando

a resposta vascular à noradrenalina (JACKSON, 2003).

1.5.2 Sistema Nervoso autonômico

O sistema nervoso autonômico tem três principais divisões:

simpático, parassimpático e entérico. As divisões simpática e

parassimpática inervam a musculatura cardíaca, lisa e tecidos glandulares,

também medeiam uma variedade de respostas viscerais. O sistema

entérico consiste em neurônios sensórios e motores do trato

gastrointestinal que medeiam os reflexos digestivos (MONTANO et al.,

2001).

No sistema cardiovascular o sistema simpático aumenta a freqüência

cardíaca e a força de contração e o sistema parassimpático induz

bradicardia. A estimulação simpática aumenta a pressão arterial pelo

aumento do débito cardíaco e da resistência periférica. O tônus

vasoconstritor simpático resulta de um disparo contínuo de neurônios

adrenérgicos localizados principalmente no bulbo ventrolateral rostral, e

que inervam os neurônios pré-ganglionares simpáticos vasoconstritores

(MONTANO et al., 2001).

A estimulação parassimpática tem efeito pequeno sobre a

resistência periférica. A vasodilatação parassimpática pode envolver

mensageiros químicos, como o óxido-nítrico. A ação da noradrenalina e

acetilcolina sobre o coração é um exemplo do complexo sistema

regulatório celular envolvido no sistema autonômico (MONTANO et al.,

2001).

1.5.3 Noradrenalina e acetilcolina

A NA age sobre o músculo cardíaco estimulando a freqüência

cardíaca e a força de contração. Aumenta a força de contração porque

age sobre os receptores B-adrenérgicos, que ativam o sistema de

segundo-mensageiro que utiliza o monofosfato de adenosina cíclico

(AMPc), que aumenta a corrente de longa duração de canais de Ca2+ do

tipo L do músculo. A ativação dos receptores B-adrenérgicos também

diminui o limiar de disparo das células marcapasso cardíacas do nódulo

sinoatrial, aumentando a freqüência cardíaca. A adrenalina (AD) circulante

liberada pela medula adrenal reforça estes efeitos da noradrenalina

(HOFFMAN e LIF KOWITZ, 2003).

A acetilcolina é liberada nos terminais nervosos parassimpáticos e diminui

a freqüência cardíaca pela ação dos receptores muscarínicos a células

dos nodos sinoatrial e atrioventricular, aumentando assim a condutância

de potássio de repouso nessas células. A acetilcolina também diminui a

freqüência cardíaca pelo aumento do limiar para o disparo das células

marcapasso de maneira oposta à NA, diminuindo a freqüência cardíaca.

inda reduz a força de contração pela diminuição do AMPc intracelular

(MILUTINOVIC et al., 2006).

1.6- Anfetamina

A anfetamina é uma amina simpaticomimética de ação indireta. No

SNC, libera monoaminas (como por exemplo, DA, NA e 5-HT) de estoques

não vesiculares por meio da ligação da mesma aos transportadores de

monoaminas, os quais funcionam como falsos substratos, promovendo

assim um transporte reverso do neurotransmissor (VANDERSCHUREN e

KALIVAS, 2000). Como resultado há maior quantidade destas aminas na

fenda sináptica e por um período maior. Devido a estes fatores, seus

principais efeitos em humanos são estimulação locomotora, euforia,

comportamento estereotipado e anorexia, enquanto que em animais

experimentais são aumento do estado de alerta e da atividade locomotora.

Estes efeitos estão relacionados à ativação das vias dopaminérgicas

mesolimbica, mesocortical e nigroestriatal (KUCZENSKI ET AL., 1997).

Além disso, sabe-se que a anfetamina, utilizada repetidamente em

tratamento farmacológico causa dependência e tolerância. A tolerância

aos efeitos anorexigênicos e simpaticomiméticos periféricos desenvolvem-

se rapidamente. Quando administrada repetidamente, a anfetamina causa

alterações em padrões comportamentais que persistem mesmo após um

período de abstinência, e este fenômeno é por muitos pesquisadores

chamada de sensibilização comportamental (KUCKZENSKI et al., 1997). A

sensibilização comportamental, como já citado anteriormente, ocorre como

já citado anteriormente, devido a um aumento dos níveis de DA nas vias

mesoestriatal e mesolimbica; estas áreas estão sabidamente envolvidas

na estimulação da atividade locomotora. Estudos têm demonstrado que a

anfetamina exerce também uma ação simpaticomimética periférica,

produzindo aumento da pressão arterial, vasoconstrição e inibição da

motilidade gastrointestinal (KUCKZENSKI et al., 1997; CREESE e

IVERSEN, 1974; KELLY, 1977; COLE, 1978; SESSIONS et al., 1980;

KEHNE et al., 1981; SWERDLOW et al., 1986).

1.7- Selegilina

A sensibilização comportamental pode ser induzida não só por

drogas que causam dependência mais também por outros tipos de drogas

ou drogas associadas às de abuso. Devido a isto, a selegilina (Deprenyl),

um inibidor seletivo da monoamino–oxidase (MAO) e que é comumente

empregada no tratamento da Doença de Parkinson, tem sido

recentemente estudada. A MAO é uma enzima que se encontra no interior

das células, ligada a membrana de superfície das mitocôndrias. Converte

as catecolaminas em seus respectivos aldeídos que, na periferia, são

rapidamente metabolizados pela aldeído desidrogenase nos ácidos

carboxílicos correspondentes. Também oxida outras monoaminas como

DA e serotonina (5-HT). No interior de neurônios do sistema nervoso

simpático ela controla o conteúdo de DA e noradrenalina (NA) (KNOLL,

1989; RINNE et al., 1991).

Em 1968, descobriu-se que havia dois tipos da MAO: MAO-A: a

qual inativa a 5-HT, NA, tiramina e, em níveis menores, a DA e a AD, b)

MAO-B: que inativa prioritariamente DA e feniletilamina, esta está presente

apenas em traços no cérebro. A MAO-B está presente predominantemente

no

estriado onde é responsável pelo mecanismo oxidativo de DA nesta

região (STANDART e YOUNG, 2001). Por meio da inibição da MAO pode-

se atuar no sistema dopaminérgico, proporcionando assim um aumento

significativo da concentração cerebral de DA.

A selegilina foi descoberta entre 1964 e 1965, por KNOLL et al.,

sendo que as primeiras perspectivas farmacológicas desta droga se

voltaram para o metabolismo cerebral, onde possivelmente atua como um

estimulante. Sendo assim, esta substância foi motivo de intensas

pesquisas nos últimos 36 anos. No princípio, KNOLL não percebeu que

tinha desenvolvido uma molécula com peculiar atividade sobre

“catecolaminas neurotransmissoras”, provocando especificamente o

aumento de DA e de feniletilamina (KNOLL, 1983). A selegilina é

absorvida rapidamente (Tmáx= 0,5 - 2 horas) (HEINONEN et al, 1989b;

GERLACK et al, 1996) e sua metabolização hepática produz

desmetilselegilina, metaanfetamina e esta em anfetamina (Fig. 1)

(GERLACK et al, 1996; CHRISP et al, 1991).

Selegilina

Desmetilselegilina

Metaanfetamina

Anfetamina

Figura 1 – Biotransformação da selegilina (adaptado de Oliver, 2002)

A selegilina inibe irreversivelmente a MAO-B e o transportador de

DA, interferindo na recaptação, síntese e liberação desta. A peculiaridade

dessa molécula é a sua característica como inibidora seletiva dose-

dependente da MAO: até a dosagem de 15mg/dia, inibe apenas a MAO-B;

acima dessa dosagem, especialmente a partir de 20mg/dia, pode atuar

também sobre a MAO-A. Provoca também uma inibição na recaptação de

NA e tiramina, o que inibe o efeito “simpatomimético” indireto da tiramina e

aumenta ainda a feniletilamina, tem rápida ação, aumentando a DA sobre

os receptores dopaminérgicos estriados pós-sinápticos e uma ação

prolongada sobre a liberação de DA (isto se refere a seu papel

neuromodulador) (KNOLL, 1989).

Além disso, a selegilina tem uma ação sobre os radicais livres de

oxigênio por meio de uma diminuição na formação de peróxido de

hidrogênio proveniente do metabolismo de DA, ao inibir a MAO-B e

aumentar a atividade de radicais endógenos superóxido “desmutase e

catalase” (Fig. 2) (KNOLL, 1989; MARSDEN, 1990), sendo capaz de

retardar a morte neuronal (RINNE et al, 1991). Outro trabalho sugere

ainda que a selegilina estaria ligada à liberação de fatores de crescimento

neuronais (RICHARDSON, 1993).

Observando-se as peculiaridades da selegilina pode-se avaliar sua

associação com a anfetamina durante o tratamento e a abstinência desta

droga no comportamento de camundongos. No entanto, praticamente não

existem trabalhos descritos cujo enfoque seja a interação anfetamina -

selegilina, sob o ponto de vista da sensibilização comportamental.

DA + O2 + H2O

DOPAC + NH3 + H2O2

H2O2 + Fe2+

OH + OH- + Fe3+

Figura 2 – Produção de radicais livres pelo metabolismo da DA.

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral

Avaliar as influências de um inibidor seletivo da monoamino-oxidase

Tipo B (selegilina) na sensibilização comportamental para anfetamina em

camundongos.

2.2 Objetivos Específicos

Avaliar a influência do tratamento da selegilina em:

• aspectos motores de camundongos observados no campo aberto.

• aspectos comportamentais de camundongos avaliados no labirinto

em cruz elevado.

3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Animais

Foram utilizados camundongos Swiss, machos, mantidos no

biotério do laboratório de Farmacologia Aplicada e Toxicologia do

Departamento de Patologia da FMVZ-USP, acondicionados em gaiolas de

polipropileno medindo 41x34x16 cm e com cama de maravalha

autoclavada. Água e comida foram fornecidas ad libitum, durante todo

procedimento experimental. Os animais permaneceram em salas com

temperatura controlada (20 a 23°C), umidade relativa do ar entre 65 e 70%

e com ciclo de luz de 12 horas claro/escuro (luzes acesas às 6:00 horas).

Nos dias de observação os animais foram levados para a sala de

experimentação uma hora antes do início das manipulações. Os animais

controle e experimental foram observados intercaladamente durante a fase

clara do ciclo de luz, entre 13:00 e 17:00 horas. Todos os procedimentos

experimentais obedeceram às normas relativas ao uso de animais de

experimentação descritas pelo Comitê de Manutenção e Uso de Animais

de Laboratório da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da

Universidade de São Paulo e foram aprovados pela Comissão de Bioética

da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da universidade de São

Paulo processo número: 728/2005.

3.2 Drogas

• Sulfato de d-anfetamina – Sigma

• Selegilina – L-Deprenyl Hidrocloryde - Sigma

As drogas foram preparadas em soluções que permitiam injetar um

volume de 1,0ml.Kg-1 de peso corporal. A anfetamina e selegilina foram

dissolvidas em solução salina 0,9%. Os animais controle receberam

volumes de solução salina iguais aqueles dos animais dos grupos

experimentais. Todas as injeções foram administradas por via

intraperitoneal (i.p.).

3.3 Avaliações Comportamentais

3.3.1 Quantificação da atividade locomotora em campo aberto

O registro da atividade locomotora foi realizado em campo aberto,

(Fig. 3A) que é constituído por uma arena circular de madeira com 40cm

de diâmetro por 40cm de altura, pintada na cor cinza chumbo fosco. A

arena é dividida em zonas central e periférica (região tigmotáxica)

(Fig.3B).

(A)

(B)

Figura 3 – (A) Aparelho de campo aberto, utilizado nos procedimentos experimentais, (B) constituído por duas zonas: C - central e P - periférica.

As observações foram realizadas com o auxílio de um sistema de

rastreamento de imagem computadorizado (Ethovision - Noldus

Information Technology). Esse sistema inclui o programa Ethovision Pro-

Color 1.9, câmera filmadora (Sony CCD-Iris color video camera), monitor

de vídeo (Sony), placa de captura de vídeo (TARGA+Truevision, 2D,

NTSC) e computador pessoal (Pentium 133, 16 mB de memória RAM,

1.2gB de disco rígido), com monitor, teclado e mouse.

PC

PC

A partir de imagens recebidas pela câmera filmadora e digitalizadas

na placa de captura, o programa cria coordenadas espaciais (x e Y) do

centro de gravidade do animal em intervalo de tempo determinado

segundo taxa de amostragem pré-configurada. A taxa de amostragem

ideal para roedores é entre 2 a 8 amostras por segundo, sendo que uma

amostragem superior a 8 excede a dinâmica do roedor, capturando

movimentos corporais que não indicam deslocamento, e portanto

superestimando a distância movida. A taxa de amostragem utilizada foi de

6,6 amostras por segundo.

Para o estudo, cada animal foi colocado individualmente no centro

da arena e sua atividade registrada por períodos de 15 minutos pelo

Ethovision. Entre as observações de cada animal o campo aberto foi

limpo com solução de álcool a 5%.

Os parâmetros quantificados pelo Ethovision foram: distância

percorrida total e nas zonas central e periférica (cm), velocidade média

total e nas zonas central e periférica (cm/s), tempo nas zonas central e

periférica (s), tempo de movimento nas zonas central e periférica (s) e

levantar na arena.

Vale ainda ressaltar, que com a utilização do Ethovision a

observação comportamental é feita sem a presença do observador,

minimizando as influências humanas sobre o teste comportamental.

3.3.2 Avaliação do comportamento no labirinto em cruz elevado

O aparelho consiste num labirinto em cruz elevado feito de madeira,

elevado à 50cm do chão e com dois braços abertos opostos de 28,5x7,0

cm cruzados em ângulos retos com dois braços nas mesmas dimensões

fechados por paredes de 14 cm de altura, tendo o teto aberto (Fig.4 A e

B). Os animais foram colocados individualmente no centro do aparelho e

observados por 5 minutos. Para a quantificação dos parâmetros foi

utilizado um sistema de rastreamento por imagem (Ethovision), como

descrito no item 3.3.1, com 6,6 medidas por segundo. Os parâmetros

quantificados foram: número total de entradas nos braços abertos e tempo

de permanência nos braços abertos. O aparelho foi limpo com álcool a 5%

entre a observação de cada animal.

Figura 4 – Labirinto em cruz elevado, utilizado nos procedimentos experimentais evidenciando (A) braços abertos e (B) braços fechados.

3.4 Medida da pressão arterial

As medidas caudais da pressão arterial sistólica e da freqüência

cardíaca foram determinadas durante o período experimental pelo método

de medida indireta, utilizando-se um sistema computadorizado de medida

caudal (BP 2000 Visitech Systems, figura 5). A pressão arterial e a

(B)

(A)

freqüência cardíaca para cada animal foram determinadas após uma

semana de habituação dos animais no aparato e foram feitas 20 medidas

para cada animal.

Figura 5 – BP 2000 Visitech System – Sistema Computadorizado de medida da pressão arterial indireta.

3.5 Dosagem hormonal

A corticosterona foi medida por radioimunoensaio. A dosagem foi

determinada em fase sólida, empregando-se o Kit Comercial da COAT-A-

COUNT®, seguindo protocolo descrito pelo fabricante (DPC-Medlab). Este

Kit usa como elemento traçador o I125. O parâmetro de qualidade foi

estabelecido de acordo com a rotina do Laboratório de Dosagens

Hormonais FMVZ-USP onde se realizou a dosagem. Os resultados foram

expressos em ng de hormônio/ml de soro. A variação intra-ensaio foi

abaixo de 3,63%.

3.6 Análise estatística

Os resultados da atividade locomotora no campo aberto e a

resposta ao labirinto em cruz elevado, foram avaliadas pelo Teste de

Análise de Variância (ANOVA), seguido de teste post hoc de Bonferroni,

quando necessário.

Os resultados de freqüência cardíaca e de pressão arterial foram

avaliados pelo teste t de student.

Os níveis de Corticosterona do experimento crônico foram

avaliados pelo teste não paramétrico de Análise de Variância (Kruskal-

Wallis), seguida de Dunn.

Os níveis de Corticosterona do experimento agudo foram avaliados

pelo teste de Mann-Whitney.

Para todas as análises estatísticas foi utilizado o programa

GraphPad Instat. Foi considerada diferença estatisticamente significante

quando p<0,05.

4 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL E RESULTADOS

4.1 Delineamento Experimental Geral – Tratamento crônico

Foram utilizados 105 camundongos machos divididos em 7 grupos

iguais. Os animais foram submetidos a um pré-tratamento com solução

salina 0,9% (V), anfetamina (A, 2mg/Kg) ou selegilina (S, 10mg/Kg) por 14

dias, em dias alternados. Durante o período de abstinência, os animais

receberam injeção de solução salina 0,9% ou selegilina (10mg/Kg), por 7

dias consecutivos. No 21°dia foi administrada anfetamina (2mg/Kg), ou

selegilina (10mg/Kg) sendo esta considerada dose desafio. Após 15

minutos, os animais foram testados em campo aberto por um período de

15 minutos e em seguida foram testados no labirinto em cruz elevado por

5 minutos. No dia seguinte, pela manhã, os animais receberam uma

injeção de anfetamina ou selegilina e após 15 minutos foram decapitados

para coleta do sangue. O sangue foi então centrifugado durante 10

minutos, o soro foi coletado e mantido em temperatura adequada (-20°C)

até o dia da dosagem hormonal.

Segue abaixo o delineamento dos tratamentos que foram realizados

em cada grupo experimental:

Pré - tratamento Abstinência Des

Solução salina Solução salina Anf Anf Dias 1↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ 14 ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ 21 ↓ 22 ↓ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ ____ ____ ↓ injeções de solução salina ↓ injeções de anfetamina (Anf.) Pré-tratamento: 7 injeções em dias alternados Abstinência: 7 injeções consecutivas Des: desafio CA: campo aberto LCE: labirinto em cruz elevado Decap: decapitação Figura 6 - Efeitos da anfetamina em animais tratados com solução salina 0,9% na fase de pré-tratamento (VVA, n=11).

Pré-tratamento Abstinência Des

Anfetamina Solução salina Anf Anf Decap Dias 1↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ 14 ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ 21 ↓ 22 ↓ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ ____ ____

↓ injeções de solução salina ↓ injeções de anfetamina (Anf.) Pré-tratamento: 7 injeções em dias alternados Abstinência: 7 injeções consecutivas Des: desafio CA: campo aberto LCE: labirinto em cruz elevado Decap: decapitação Figura 7 - Efeitos da anfetamina em animais tratados com anfetamina na fase de pré-tratamento (AVA, n=12).

Decap CA +

LCE

CA +

LCE

Figura 8 - Efeitos da anfetamina em animais tratados com solução salina 0,9% na fase de pré-tratamento e que receberam selegilina durante a abstinência (VSA, n=10).

Figura 9 - Efeitos da anfetamina em animais tratados com anfetamina durante a fase de pré-tratamento e que receberam selegilina durante a abstinência (ASA, n=11).

Pré-tratamento Abstinência Des

Solução salina Selegilina Anf Anf Decap Dias1↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ 14 ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ 21 ↓ 22 ↓ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ ____ ____ ↓ injeções de solução salina ↓ injeções de anfetamina (Anf.) ↓ injeções de selegilina Tratamento: 7 injeções em dias alternados Abstinência: 7 injeções consecutivas Des: desafio CA: campo aberto LCE: labirinto em cruz elevado Decap: decapitação

Pré-tratamento Abstinência Des

Anfetamina Selegilina Anf Anf Decap Dias1↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ 14 ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ 21 ↓ 22 ↓ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ ____ ____

↓ injeções de anfetamina (Anf.) ↓ injeções de selegilina Tratamento: 7 injeções em dias alternados Abstinência: 7 injeções consecutivas Des: desafio CA: campo aberto LCE: labirinto em cruz elevado Decap: decapitação

CA +

LCE

CA +

LCE

CA +

LCE

Figura 11 - Efeitos da selegilina em animais tratados com selegilina na fase de pré-tratamento (SVS, n=11).

CA +

LCE

Pré-tratamento Abstinência Des

Solução salina Solução salina Selegilina Selegilina Decap Dias1↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ 14 ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ 21 ↓ 22 ↓ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ ____ ____ ↓ injeções de solução salina ↓ injeções de selegilina Tratamento: 7 injeções em dias alternados Abstinência: 7 injeções consecutivas Des: desafio CA: campo aberto LCE: labirinto em cruz elevado Decap: decapitação Figura 10 - Efeitos da selegilina em animais tratados com solução salina 0,9% durante a fase de pré-tratamento (VVS, n=11).

Pré-tratamento Abstinência Des

Selegilina Solução salina Selegilina Selegilina Decap Dias1↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ 14 ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ 21 ↓ 22 ↓ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ ___ ___

↓ injeções de solução salina ↓ injeções de selegilina Tratamento: 7 injeções em dias alternados Abstinência: 7 injeções consecutivas Des: desafio CA: campo aberto LCE: labirinto em cruz elevado Decap: decapitação

CA +

LCE

Pré-tratamento Abstinência Des

Selegilina Solução salina Anf Anf Decap Dias1↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ 14 ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ 21 ↓ 22 ↓ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ ___ ___

↓ injeções de solução salina ↓ injeções de selegilina ↓ injeções de anfetamina (Anf) Tratamento: 7 injeções em dias alternados Abstinência: 7 injeções consecutivas Des: desafio CA: campo aberto LCE: labirinto em cruz elevado Decap: decapitação

Figura 12 - Efeitos da anfetamina em animais tratados com selegilina na fase de pré-tratamento (SVA, n=11).

4.2 Delineamento Experimental Geral – Tratamento agudo

Foram utilizados 45 camundongos machos divididos em 3 grupos

iguais. Os animais foram submetidos a uma dose aguda de solução salina

0,9%, anfetamina (2mg/Kg) ou selegilina (10mg/Kg). Após 15 minutos, os

animais foram testados em campo aberto por um período de 15 minutos e

logo após foram testados no labirinto em cruz elevado por 5 minutos.

Imediatamente após os animais dos grupos salina e selegilina foram

decapitados para coleta do sangue. O sangue foi então centrifugado

durante 10 minutos, e o soro foi coletado e mantido em temperatura

adequada (-20°C) até o dia da dosagem hormonal.

Segue abaixo o delineamento dos tratamentos que foram realizados em

cada grupo experimental:

Figura 13 - Efeitos da administração aguda de solução salina 0,9% no comportamento avaliado em campo aberto e labirinto em cruz elevado.

Figura 14 - Efeitos da administração aguda de anfetamina no comportamento em campo aberto e labirinto em cruz elevado.

CA LCE DECAP Solução salina ↓ ↓ ↓ ↓ ________ _______ _________ _________ ↓ dose aguda de solução salina CA campo aberto LCE labirinto em cruz elevado DECAP decapitação

CA LCE DECAP Anfetamina ↓ ↓ ↓ ↓ ________ _______ ________ ________ ↓ dose aguda de anfetamina CA campo aberto LCE labirinto em cruz elevado DECAP decapitação

CA LCE DECAP Selegilina ↓ ↓ ↓ ↓ ________ _______ ________ ________ ↓ dose aguda de selegilina CA campo aberto LCE labirinto em cruz elevado DECAP decapitação

Figura 15 – Efeitos da administração aguda de selegilina no comportamento em campo aberto e labirinto em cruz elevado.

Figura 16 - Efeitos da administração aguda de solução salina 0,9% na freqüência cardíaca e pressão arterial.

Figura 17 - Efeitos da administração aguda de anfetamina na freqüência cardíaca e pressão arterial.

4.3 Delineamento Experimental Geral – Pressão Arterial

Foram utilizados 30 camundongos machos divididos em 3 grupos

iguais. Os animais foram submetidos ao aparelho de medida indireta da

pressão arterial Conforme descrito em item 3.4 de material e métodos.

Após estas medidas os animais receberam uma dose aguda de solução

salina 0,9%, anfetamina (2mg/Kg) ou selegilina (10mg/Kg). Após 15

minutos, os animais foram testados novamente no aparelho para mais 20

medidas.

Segue abaixo o delineamento dos tratamentos que foram realizados em

cada grupo experimental:

Medidas Medidas Basais (20) Desafio (20) Salina ↓ ↓ ↓ ________ _______ ________ ↓ dose aguda de solução salina 0,9% Medidas realizadas por medida indireta de pressão arterial

Medidas Medidas Basais (20) Desafio (20) Anfetamina ↓ ↓ ↓ ________ _______ ________ ↓ dose aguda de anfetamina Medidas realizadas por medida indireta de pressão arterial

15 minutos

15 minutos

4.4 Experimento 1. Efeitos do tratamento crônico com selegilina ou

anfetamina na sensibilização comportamental para

anfetamina, observado no campo aberto.

Os animais foram submetidos a um pré-tratamento, à abstinência e

ao desafio conforme item 4.1 do Delineamento Experimental Geral. Após

15 minutos, os animais foram testados em campo aberto por um período

de 15 minutos conforme item 3.3.1 de material e métodos.

Para este experimento foram formados os seguintes grupos: VVA,

VVS, AVA, SVS, VSA, SVA, ASA.

Medidas Medidas Basais (20) Desafio (20) Selegilina ↓ ↓ ↓ ________ _______ ________ ↓ dose aguda de selegilina Medidas realizadas por medida indireta de pressão arterial

Figura 18 - Efeitos da administração aguda de selegilina na freqüência cardíaca e pressão arterial.

15 minutos

Resultados

Distância Percorrida

A)Total

A análise estatística mostrou aumento significante do grupo AVA em

relação aos grupos VVA, VVS, SVS, VSA. O grupo SVS mostrou redução

significante em relação aos grupos VVA, AVA, VSA, SVA, ASA. O grupo

AIA apresentou aumento significante em relação aos grupos VVA, VVS,

AVA, SVS, VSA, SVA (F6,70=26.604; Fig.19).

B)Central

A análise estatística da distância percorrida na zona central mostrou

aumento significante do grupo AVA em relação aos grupos VVA, VVI e

SVS. O grupo IVI mostrou redução significante em relação aos grupos:

AVA, VSA, SVA e ASA. O grupo ASA apresentou aumento significante em

relação aos grupos VVA, VVS, SVS, VSA e SVA (F6,70=15,165; Fig.19).

C)Periférica

A análise estatística da distância percorrida na zona periférica mostrou

aumento significante do grupo AVA em relação aos grupos VVA, VVS,

SVS, VSA e SVA. O grupo SVS mostrou redução significante em relação

aos grupos: VVA, AVA, VSA e ASA. O grupo ASA apresentou aumento

significante em relação aos grupos VVA, VVI, SVS, e SVA ((F6,70=15,678;

Fig.19).

Velocidade Média

A)Total

A velocidade média (cm/s) na total mostrou aumento significante do

grupo AVA em relação aos grupos VVA, VVS, e SVS. O grupo SVS

mostrou redução significante em relação aos grupos: AVA, VSA, SVA e

ASA. O grupo ASA apresentou aumento significante em relação aos

grupos VVA, VVS, AVA, SVS, VSA e SVA (F6,70=28.335; Fig.20).

B)Central

A velocidade média (cm/s) na zona central mostrou aumento

significante do grupo AVA em relação aos grupos VVA, VVS, SVS e SVA.

O grupo SVS mostrou redução significante em relação aos grupos: AVA,

VSA, SVA e ASA. O grupo ASA apresentou aumento significante em

relação aos grupos VVA, VVS, SVS, VSA e SVA (F6,70=13,826; Fig.20).

C)Periférica

A velocidade média (cm/s) na zona periférica mostrou aumento

significante do grupo AVA em relação aos grupos VVA, VVS e SVS. O

grupo SVS mostrou redução significante em relação aos grupos: AVA,

VSA, SVA e ASA. O grupo ASA apresentou aumento significante em

relação aos grupos VVA, VVS, AVA, SVS, VSA e SVA (F6,70=24,840;

Fig.20).

Tempo em movimento

A)Total

O tempo em movimento apresentou aumento significante do grupo

AVA em relação aos grupos VVA, VVS e SVS. O grupo SVS mostrou

diminuição significante em relação aos grupos AVA, VSA, SVA e ASA. O

grupo ASA apresentou aumento significante em relação aos grupos VVA,

VVS, SVS, VSA e SVA (F6,70=21,213; Fig.21).

B)Central

O tempo em movimento apresentou diminuição significante no grupo

AVA em relação ao grupo ASA. O grupo SVS também mostrou diminuição

significante em relação aos grupos AVA, VSA, SVA e ASA. O grupo ASA

apresentou aumento significante em relação aos grupos VVA, VVS, AVA,

SVS, VSA, e SVA (F6,70=13,624; Fig.21).

C)Periférica

O tempo em movimento apresentou aumento significante no grupo

ASA em relação aos grupos VVA,VVS, SVS e VSA. O grupo SVS mostrou

diminuição significante em relação aos grupos AVA, VSA, SVA e ASA. O

grupo ASA apresentou aumento significante em relação aos grupos VVA,

VVS, SVS, VSA e SVA (F6,70=16,328; Fig.21).

Tempo na zona

A)Central

Não houve alteração no tempo de permanência (s) na zona central

(F6,70=0,507; Fig. 22).

B)Periférica

Não houve alteração no tempo de permanência (s) na zona

periférica (F6,70=0,486; Fig. 22).

Levantar

O levantar apresentou aumento significante no grupo AVA em

relação aos grupos VVA, VVS, SVS, e SVA. O grupo SVS mostrou

diminuição significante em relação aos grupos AVA, VSA, SVA e ASA. O

grupo ASA apresentou aumento significante em relação aos grupos VVA,

VVS, SVS, VSA e SVA (F6,70=17,46; Fig.23).

VVA VVS AVA SVS VSA SVA ASA0

2500

5000

7500

10000

***

**

***

***

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VVA VVS AVA SVS VSA SVA ASA0

1000

2000

3000

4000

5000 Central

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*

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θθ

θ

Dis

tân

cia

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corr

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(cm

) **

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VVA VVS AVA SVS VSA SVA ASA0

1000

2000

3000

4000

5000 Periférica

***Dis

tân

cia

per

corr

ida

(cm

)

**

*

***&

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&

#

##

#α α

αα

θθθ

Figura 19 - Efeitos do tratamento crônico com IMAO-B ou anfetamina na avaliação da distância percorrida (cm) no campo aberto. Resultados expressos em média ± erro padrão. * p<0,05, ** p<0,01, *** p<0,001 em relação ao grupo VVA. & p<0,001 em relação ao grupo VVI. # p<0,05, ## p<0,001 em relação ao grupo AVA. α p<0,01, αα p<0,001 em relação ao grupo SVS. θ p<0,05, θθ p<0,001 em relação ao grupo ASA. ANOVA, Bonferroni.

VVA VVS AVA SVS VSA SVA ASA0.0

2.5

5.0

7.5

10.0 Total

***

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VVA VVS AVA SVS VSA SVA ASA0

10

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30 Central

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αα

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méd

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cm/s

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VVA VVS AVA SVS VSA SVA ASA0.0

2.5

5.0

7.5

10.0 Periférica

***

*

***

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##

#

αααα

αα

θθθθθθ

Vel

oci

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e m

édia

(cm

/s)

Figura 20 - Efeitos do tratamento crônico com IMAO-B ou anfetamina na avaliação da velocidade média (cm/s) no campo aberto. Resultados expressos em média ± erro padrão. * p<0,05, ** p<0,01, *** p<0,001 em relação ao grupo VVA. & p<0,001 em relação ao grupo VVS. # p<0,05, ## p<0,001 em relação ao grupo AVA. α p<0,01, αα p<0,001 em relação ao grupo SVS. θ p<0,05, θθ p<0,001 em relação ao grupo ASA. ANOVA, Bonferroni.

VVA VVS AVA SVS VSA SVA ASA0

100

200

300

400

500 Total

***

*

**

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αα

αα

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VVA VVS AVA SVS VSA SVA ASA0

100

200

300 Central

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po

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mo

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VVA VVS AVA SVS VSA SVA ASA0

100

200

300 Periférica

***

*

**

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###

α

αα

θθαα

θθ

Tem

po

em

mo

vim

ento

(s) #

Figura 21 - Efeitos do tratamento crônico com IMAO-B ou anfetamina na avaliação do tempo em movimento (s) no campo aberto. Resultados expressos em média ± erro padrão. * p<0,05, ** p<0,01, *** p<0,001 em relação ao grupo SSA. & p<0,001 em relação ao grupo SSI. # p<0,05, ## p<0,001 em relação ao grupo ASA. α p<0,01, αα p<0,001 em relação ao grupo ISI. θ p<0,05, θθ p<0,001 em relação ao grupo AIA. ANOVA, Bonferroni.

VVA VVS AVA SVS VSA SVA ASA0

100

200

300

400

500 Central

Tem

po

de

per

man

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)

VVA VVS AVA SVS VSA SVA ASA0

250

500

750 Periférica

Tem

po

de

per

man

ênci

a(s

)

Figura 22 – Efeitos do tratamento crônico com IMAO-B ou anfetamina na avaliação do tempo de permanência (s) no campo aberto. Resultados expressos em média ± erro padrão. Não houve diferenças estatisticamente significantes entre os grupos. p<0,05; ANOVA, Bonferroni.

VVA VVS AVA SVS VSA SVA ASA0

100

200

******

***

*

&

&&

&

##

#α α

α

θ

Lev

anta

r

θθ

Figura 23 – Efeitos do tratamento crônico com IMAO-B ou anfetamina na avaliação do número de levantar no campo aberto. Resultados expressos em média ± erro padrão. * p<0,05, *** p<0,001 em relação ao grupo VVA. & p<0,001 em relação ao grupo VVS. # p<0,05, ## p<0,001 em relação ao grupo AVA. α p<0,001 em relação ao grupo SVS. θ p<0,05, θθ p<0,01 em relação ao grupo ASA. ANOVA, Bonferroni.

4.4.1 Experimento 2: Efeitos do tratamento crônico com IMAO-B ou

anfetamina na sensibilização comportamental para

anfetamina, no labirinto em cruz elevado.

Os animais foram submetidos a um pré-tratamento, à abstinência e

ao desafio conforme item 4.1 do Delineamento Experimental Geral.

Imediatamente após a avaliação em campo aberto, os animais foram

testados no labirinto em cruz elevado por 5 minutos, conforme item 3.3.2

de material e métodos.

Para este experimento foram formados os seguintes grupos: VVA,

VVS, AVA, SVS, VSA, SVA e ASA.

Resultados

Porcentagem do número de entradas nos braços abertos

Análise estatística mostrou que não houve alteração na

porcentagem de entradas nos braços abertos nos grupos avaliados

(F6,70=0,889; Fig.24.).

Porcentagem do tempo de permanência nos braços abertos

Análise estatística mostrou aumento significante do grupo AVA em

relação ao grupo VVS na porcentagem do tempo de permanência nos

braços abertos (F6,70=1,045; Fig.25).

VVA VVS AVA SVS VSA SVA ASA0

10

20

30

40

50

% d

e en

trad

a n

os

bra

ços

aber

tos

VVA VVS AVA SVS VSA SVA ASA0

10

20

30

*

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anên

cia

no

sb

raço

s ab

erto

s (s

)

Figura 24 – Efeitos do tratamento crônico com IMAO-B ou anfetamina na avaliação da porcentagem do número de entradas nos braços abertos no labirinto em cruz elevado. Resultados expressos em média ± erro padrão. Não houve alteração estatisticamente significante entre os grupos. p>0,05; ANOVA; Bonferroni.

Figura 25 – Efeitos do tratamento crônico com IMAO-B ou anfetamina na avaliação da porcentagem de tempo de permanência nos braços abertos no labirinto em cruz elevado. Resultados expressos em média ± erro padrão. * p<0,05 em relação ao grupo VVS. ANOVA; Bonferroni.

4.4.2 Experimento 3: Efeitos do tratamento crônico com selegilina ou

anfetamina, nos níveis de corticosterona.

Os animais foram submetidos a um pré-tratamento, à

abstinência e ao desafio conforme item 4.1 do Delineamento Experimental

Geral. Imediatamente após a avaliação em campo aberto os animais

foram testados no labirinto em cruz elevado. No dia seguinte os animais

receberam uma injeção de solução salina, anfetamina ou selegilina e após

15 minutos foram decapitados e o sangue foi coletado. A corticosterona foi

dosada a partir do soro conforme item 3.3.4 de material e métodos.

Para este experimento foram formados os seguintes grupos: VVA,

VVS, AVA, SVS, VSA, SVA, ASA.

Resultados Níveis de corticosterona

A análise estatística mostrou aumento significante do grupo SVS em

relação aos grupos VVA e VVS. O grupo ASA mostrou aumento

estatisticamente significante em relação aos grupos VVA, VVS, AVA e

VSA (KW= 18.220) (figuras 26 e 27).

VVA VVS AVA SVS VSA SVA ASA0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

550

600

*

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Co

rtic

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(ng

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VVA VVS AVA SVS VSA SVA ASA0

100

200

300

*

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#

##θ

Co

rtic

ost

ero

na

(ng

/ml)

Figura 27. Efeitos do tratamento crônico com selegilina ou anfetamina, nas concentrações séricas de corticosterona (ng/ml). Resultados expressos em mediana ± coeficiente de variação. * p<0,05 em relação ao grupo VVA. &p<0,01, &&p<0,001 em relação ao grupo VVS. # p<0,05, ## p<0,01 em relação ao grupo AVA. θ p<0,05 em relação ao grupo VSA. Kruskall-Wallis, Dunn.

Figura 26. Efeitos do tratamento crônico com selegilina ou anfetamina, nas concentrações séricas de corticosterona (ng/ml). Resultados expressos em valores individuais ± medianas. * p<0,05 em relação ao grupo VVA. & p<0,01, && p<0,001 em relação ao grupo VVS. # p<0,05, ## p<0,01 em relação ao grupo AVA. θ p<0,05 em relação ao grupo VSA. Kruskall-Wallis, Dunn.

4.5 Experimento 4: Efeitos do tratamento agudo com selegilina ou

anfetamina, na atividade locomotora em campo

aberto.

Os animais foram submetidos à administração aguda de selegilina,

anfetamina ou solução salina conforme item 4.1 do Delineamento

Experimental Geral. Após 15 minutos, os animais foram testados em

campo aberto conforme item 3.3.1 de material e métodos.

Resultados

Distância percorrida

A) Total

A análise estatística mostrou aumento significante na distância

percorrida observada no grupo anfetamina em relação aos demais grupos.

(F2,21=17,284; Fig.28).

B) Central

A análise estatística mostrou diminuição significante na distância

percorrida observada no grupo selegilina em relação aos demais grupos

(F2,21=22,371; Fig. 28).

C) Periférica

A análise estatística mostrou aumento significante na distância

percorrida observada no grupo anfetamina em relação aos demais grupos.

(F2,21=11,217; Fig. 28).

Velocidade Média

A)Total

A análise estatística mostrou efeito significante na velocidade média

(cm/s) observada no grupo anfetamina a qual apresenta-se aumentada em

relação aos demais grupos (F2,21=17,297; Fig.29).

B) Central

A velocidade média dos animais do grupo anfetamina mostrou

aumento estatisticamente significante em relação aos demais grupos

(F2,21=6,149; Fig.29).

C) Periférica

A velocidade média dos animais do grupo anfetamina na zona

periférica mostrou aumento estatisticamente significante em relação aos

demais grupos (F2,21=15,793; Fig.29).

Tempo em movimento

A)Total

A análise estatística demonstrou aumento significante do grupo

anfetamina em relação aos demais grupos. O grupo selegilina apresentou

diminuição estatisticamente significante em relação ao grupo anfetamina

(F2,21=10,771; Fig. 30).

B)Central

O grupo selegilina apresentou diminuição estatisticamente significante

em relação aos demais grupos (F2,21=22,264; Fig.30).

C)Periférica

O grupo anfetamina apresentou aumento estatisticamente significante

em relação aos demais grupos (F2,21=7,346; Fig.30).

Tempo na zona

A)Central

O grupo anfetamina apresentou diminuição estatisticamente

significante em relação ao grupo solução salina (F2,21=2,738; Fig.31).

B)Periférica

O grupo anfetamina apresentou aumento estatisticamente significante

em relação ao grupo solução salina (F2,21=2,740; Fig.31).

Levantar

O número de levantar dos animais do grupo anfetamina apresentou

diferença estatisticamente significante em relação aos demais grupos. O

grupo selegilina apresentou uma diminuição estatisticamente significante

deste parâmetro em relação aos outros dois grupos (F2,21=33,838; Fig.32).

Salina Anfetamina Selegilina0

2500

5000

7500

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Total

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corr

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(cm

)

*

Salina Anfetamina Selegilina0

1000

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3000 Central

Dis

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#*

Salina Anfetamina Selegilina0

1000

2000

3000

4000 Periférica *

##

Dis

tân

cia

per

corr

ida

(cm

)

Figura 28. Efeitos do tratamento agudo com selegilina ou anfetamina na avaliação da distância percorrida (cm/s) no campo aberto. Resultados expressos em média ± erro padrão. * p<0,01, ** p<0,01 em relação ao grupo solução salina. # p<0,05, ## p<0,001 em relação ao grupo anfetamina. ANOVA, Bonferroni.

Salina Anfetamina Selegilina0.0

2.5

5.0

7.5 *

**###

Total

Vel

oci

dad

e m

édia

(cm

/s)

Salina Anfetamina Selegilina0

10

20

30

*

##

Vel

oci

dad

e m

édia

(cm

/s)

Central

Salina Anfetamina Selegilina0.0

2.5

5.0

7.5

**

*

###

Vel

oci

dad

e M

édia

(cm

/s) Periférica

Figura 29. Efeitos do tratamento agudo com selegilina ou anfetamina na avaliação da velocidade média (cm/s) no campo aberto. Resultados expressos em média ± erro padrão. *p<0,01, ** p<0,01 em relação ao grupo solução salina. # p<0,05, ## p<0,01, ### p<0,001 em relação ao grupo anfetamina. ANOVA, Bonferroni.

Salina Anfetamina Selegilina0

50

100

150

Tem

po

em

mo

vim

ento

(s)

Central

**###

Salina Anfetamina Selegilina0

100

200

300

Tem

po

em

mo

vim

ento

(s)

Periférica

*

#

Figura 30 - Efeitos do tratamento agudo com selegilina ou anfetamina na avaliação do tempo de permanência (s) no campo aberto. Resultados expressos em média ± erro padrão. *p<0,05, ** p<0,001 em relação ao grupo solução salina. # p<0,01, ## p<0,001 em relação ao grupo Anfetamina. ANOVA, Bonferroni.

Salina Anfetamina Selegilina0

100

200

300

400

Tem

po

em

mo

vim

ento

(s)

Total*

*#

Salina Anfetamina Selegilina0

100

200

300

400

500 Central

*

Tem

po

de

per

man

ênci

a(s

)

Salina Anfetamina Selegilina0

250

500

750

Tem

po

de

per

man

ênci

a(s

)

Periférica

*

Figura 31 - Efeitos do tratamento agudo com selegilina ou anfetamina na avaliação do tempo de permanência (s) no campo aberto. Resultados expressos em média ± erro padrão. * p<0,05 em relação ao grupo solução salina. ANOVA, Bonferroni.

Salina Anfetamina Selegilina0

100

200

*

**#

Lev

anta

r

Figura 32 - Efeitos do tratamento agudo com selegilina ou anfetamina no levantar dos animais no campo aberto. Resultados expressos em média ± erro padrão. * p<0,01, ** p<0,001 em relação ao grupo salina. # p<0,001 em relação ao grupo anfetamina. ANOVA, Bonferroni.

4.5.1 Experimento 5: Efeitos do tratamento agudo com selegilina ou

anfetamina avaliado no labirinto em cruz elevado.

Os animais foram submetidos a uma administração aguda de

selegilina, anfetamina ou solução salina conforme item 4.2 do

Delineamento Experimental Geral. Imediatamente após a observação no

campo aberto os animais foram testados no labirinto em cruz elevado por

5 minutos conforme item 3.3.2 de material e métodos.

Resultados

Porcentagem do número de entradas nos braços abertos

A porcentagem do número de entradas nos braços abertos não

apresentou diferenças estatisticamente significantes entre os grupos

(F2,21=2,042; Fig.33).

Porcentagem do tempo de permanência nos braços abertos

A porcentagem do tempo de permanência nos braços abertos não

apresentou diferenças estatisticamente significantes entre os grupos

(F2,21=0,698; Fig.34).

Salina Anfetamina Selegilina0

25

50

75

% d

o n

úm

ero

de

entr

ada

no

s b

raço

sab

erto

s

Figura 33. Efeitos do tratamento agudo com selegilina ou anfetamina na avaliação da porcentagem do número de entradas nos braços abertos no labirinto em cruz elevado. Resultados expressos em média ± erro padrão. Não houve diferença estatisticamente significante entre os grupos. p>0,05; ANOVA; Bonferroni.

Sallina Anfetamina Selegilina0

10

20

30

% d

o t

emp

o d

ep

erm

anên

cia

no

sb

raço

s ab

erto

s (s

)

Figura 34. Efeitos do tratamento agudo com selegilina e anfetamina na avaliação da porcentagem do tempo de permanência nos braços abertos no labirinto em cruz elevado. Resultados expressos em média ± erro padrão. Não houve diferença estatisticamente significante entre os grupos. p>0,05; ANOVA; Bonferroni.

4.5.2 Experimento 6: Efeitos do tratamento agudo com selegilina nos

níveis de corticosterona.

Os animais foram submetidos a uma administração aguda de

solução salina ou selegilina conforme item 4.3 do Delineamento

Experimental Geral. Imediatamente após o labirinto em cruz elevado os

animais foram decapitados e o sangue foi coletado. A corticosterona foi

dosada a partir do soro conforme item 3.3.4 de material e métodos.

Resultados

Níveis de corticosterona

A análise estatística mostrou redução estatisticamente significante

do grupo selegilina em relação ao grupo salina (U=151) (figuras 35 e 36).

Salina Selegilina0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

550

600*

Salina Selegilina0

250

500

750

*

Co

rtic

ost

ero

na

(ng

/ml)

Figura 35. Efeitos do tratamento agudo com selegilina, nas concentrações séricas de corticosterona (ng/ml). Resultados expressos em valores individuais ± medianas. * p<0,05 em relação ao grupo salina. Mann-Whitney.

Figura 36. Efeitos do tratamento agudo com selegilina, nas concentrações séricas de corticosterona (ng/ml). Resultados expressos em mediana ± coeficiente de variação. * p<0,05 em relação ao grupo salina. Mann-Whitney.

4.6 Experimento 7: Efeitos do tratamento agudo com solução salina,

anfetamina ou selegilina na pressão arterial e

freqüência cardíaca.

Os animais foram submetidos a uma administração aguda de

solução salina, anfetamina ou selegilina conforme item 4.3 do

Delineamento Experimental Geral. As medidas de pressão arterial e

freqüência cardíaca foram realizadas utilizando-se o método de medida

indireta descrito no item 3.4 de Material e Métodos.

Resultados

Freqüência Cardíaca

A) Grupo Salina

A freqüência cardíaca não apresentou diferença estatisticamente

significante nos animais que receberam solução salina 0,9% quando

comparados aos seus níveis basais (t=1,076; Fig.37A).

B) Grupo Anfetamina

A freqüência cardíaca não apresentou diferença estatisticamente

significante nos animais que receberam anfetamina quando comparados

aos seus níveis basais (t=2,516; fig. 37B).

C) Grupo Selegilina

Os animais pertencentes a este grupo apresentaram redução

estatisticamente significante na freqüência cardíaca (t=8,819; fig.37C).

Pressão Arterial Sistólica

A) Grupo Salina

Não houve diferença estatisticamente significante deste parâmetro

(t=0,1571; Fig.38A).

B) Grupo Anfetamina

Não houve diferença estatisticamente significante deste parâmetro

(t=1,716; Fig.38B).

C) Grupo Selegilina

A pressão arterial nos animais deste grupo apresentou redução

estatisticamente significante quando comparados aos seus níveis basais

(t=7,243; Fig.38C).

Basal Salina0

250

500

750

Fre

qu

ênci

a C

ard

íaca

Basal Selegilina0

250

500

750

*

Fre

qu

ênci

a C

ard

íaca

Figura 37. Efeitos do tratamento agudo com A-solução salina, B-anfetamina ou C-selegilina na freqüência cardíaca. Resultados expressos em média ± erro padrão. * p<0,05, em relação ao resultado basal. Teste t de student.

Basal Anfetamina0

250

500

750

Fre

qu

ênci

a C

ard

íaca

B

C

A

Basal Salina0

50

100

150

Pre

ssão

Art

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l

Basal Anfetamina0

50

100

150

Pre

ssão

Art

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l

Basal Selegilina0

50

100

150

*

Pre

ssão

Art

eria

l

Figura 38. Efeitos do tratamento agudo com A-solução salina, B-anfetamina ou C-selegilina na pressão arterial. Resultados expressos em média ± erro padrão. Resultados expressos em média ± erro padrão. * p<0,05, em relação ao resultado basal. Teste t de student.

A

B

C

5 DISCUSSÃO

A sensibilização, caracterizada por um aumento no efeito

comportamental de uma droga após administrações repetidas, se deve a

ocorrência de neuroadaptações que geram nos dependentes uma

hipersensibilidade a droga e estímulos relacionados a ela. Drogas como a

anfetamina promovem modificações em sistemas de neurotransmissão,

(ex. sistema dopaminérgico) (ROBINSON e BERRIDGE 1993; PIERCE e

KALIVAS, 1997). Além disto, a anfetamina induz neuroplasticidade,

aumento de DA no núcleo accumbens (KANDEL et al., 2003) e

estimulação do eixo HPA (BARR te al., 2002; VANDERSCHUREN et al.,

1999).

A administração repetida de anfetamina resulta em uma complexa

mudança do padrão comportamental em camundongos, que inclui,

aumento de alguns comportamentos em resposta a uma dose desafio

após um período sem a droga (KUCZENSKI et al., 1997). Este aumento

na expressão do comportamento (por exemplo, na locomoção) persiste

mesmo após prolongados períodos de abstinência. Isto caracteriza a

sensibilização comportamental pela anfetamina, o que segundo BARR et

al., (2002) e VANDERSCHUREN et al., (1999) é também dependente do

aumento da liberação de corticosterona devido à estimulação do eixo HPA

pelo psicoestimulante.

Experimentos têm sido realizados para se averiguar as bases neurais

desta alteração comportamental, que parece estar relacionada com os

sistemas dopaminérgicos mesolímbicos e nigroestriatal devido ao seu

envolvimento na estimulação locomotora (CREESE e IVERSEN, 1974;

COLE, 1978; KEHNE et al., 1981).

Relacionado a isto, o experimento 1 (item 4.4 do delineamento

experimental e resultados) mostra primeiramente, que em nossas

condições experimentais, foi desenvolvida sensibilização comportamental

pela anfetamina, revelada por um aumento da atividade locomotora (grupo

AVA, figura 19). A diminuição na locomoção na zona central, em contraste

ao aumento da locomoção na zona periférica, sugere que a segunda seria

um parâmetro mais sensível para revelar a sensibilização.

Os resultados acima descritos, concomitantemente ao aumento do

tempo em movimento dos animais do grupo AVA (figura 21) na zona

periférica e aumento da velocidade média na zona central (figura 20) em

relação aos animais do grupo VVA, podem também evidenciar a

correlação entre a atividade locomotora e os efeitos ansiogênicos

induzidos pela anfetamina (PELLOW et al., 1985; LISTER et al., 1987).

Segundo BARNETT (1996), os roedores preferem locais perto de

superfícies verticais onde eles estão menos expostos a predadores.

Todavia, embora este experimento tenha demonstrado a expressão

da sensibilização comportamental, o experimento 1 (figura 19) nos mostra

que isto não é dependente do aumento nos níveis de corticosterona como

pode observado em estudos anteriores (BARR et al., 2000,

VANDERSCHUREN et al., 1999). Estes resultados estão de acordo com

os nossos. Isto pode ser devido ao desvio padrão muito grande. Entretanto

este resultado também foi evidenciado por SCHMIDT et al., (1999) que

demonstraram que a sensibilização comportamental e o eixo HPA não são

interdependentes indicando que a hipersecreção de corticosterona não é

crucial na determinação da expressão da sensibilização comportamental.

Isto também é evidenciado quando se administra um antagonista de

receptor CRH que tem como efeito abolir a hipersecreção de

corticosterona pela anfetamina e isto não afeta a expressão da

sensibilização. Sendo assim, a hipersecreção de corticosterona e a

sensibilização comportamental parecem não ser processos dependentes

(SCHMIDT et al., 1999).

A presença de diferenças estatisticamente significantes entre os

animais do grupo ASA (figura 19), que receberam selegilina no período de

abstinência, comparado com o grupo AVA, demonstra que a selegilina

potencia o efeito da anfetamina. Isto pode ser devido ao efeito inibidor

desta droga sobre a MAO, na dose utilizada. Inibindo-se a MAO-B pode-se

então modular o sistema dopaminérgico, acarretando assim um aumento

significativo na concentração cerebral de DA livre. A anfetamina por sua

vez, também teria efeito semelhante, uma vez que aumenta os níveis de

DA por aumento da liberação e bloqueio da recaptação, prolongando o

tempo em que a DA permanece na fenda sináptica (KANDEL et al., 2003).

Sendo assim, as duas drogas juntas (anfetamina e selegilina) fariam com

que as concentrações de DA cerebral estivessem muito aumentadas. Para

explicar tal hipótese pode-se inferir que a anfetamina aumenta o tempo em

que a DA permanece na fenda sináptica, e isto é possivelmente

potenciado por: (A) da selegilina inibir a MAO, fazendo com que não

ocorra degradação de DA (e das demais catecolaminas) e deste modo à

quantidade de DA livre no citoplasma, do neurônio pré-sináptico, esteja

aumentada e a quantidade nas vesículas também, resultando em uma

maior quantidade de DA sendo liberada na fenda, e (B) a selegilina

também bloqueia a recaptação fazendo com que mais DA fique livre na

fenda.

Quando houver falta das drogas irá ocorrer uma diminuição da

concentração de DA os receptores ficarão mais sensíveis e o neurônio

pós-sináptico irá aumentar o número destes receptores para que consiga

melhorar a eficiência da ligação neurotransmissor-receptor (KANDEL et

al., 2003). Entretanto segundo PIERCE e KALIVAS (1997) esta não é a

causa da expressão da sensibilização comportamental ser permanente.

Além disso, a selegilina, quando é metabolizada, produz

desmetilselegilina, metaanfetamina e esta é convertida em anfetamina

(GERLACK et al, 1996; CHRISP et al, 1991).

Observou-se também resultados semelhantes nos parâmetros

velocidade média (figura 20) e no tempo em movimento na arena e nas

duas zonas (central e periférica) (figura 21). Além disso, a selegilina

provavelmente potencia os efeitos ansiogênicos induzidos pela anfetamina

uma vez que os animais do grupo AIA (figuras 26 e 27) permaneceram

mais tempo em movimento na zona periférica. Os animais deste grupo

também apresentaram um aumento nos níveis de corticosterona (figuras

26 e 27) quando comparados aos animais do grupo AVA. Todavia, isto

não ocorre quando comparados aos animais do grupo SVS, o que

corrobora com a afirmação descrita anteriormente de que a selegilina

potencia os efeitos da anfetamina.

Os animais dos grupos VSA e SVA apresentaram diferença

estatisticamente significante em relação aos grupos VVS e SVS, e ainda o

grupo VSA apresentou diferença estatística quando comparado ao grupo

AVA (figura 19). Sendo assim, pode-se inferir que os animais dos grupos

VSA e SVA tiveram locomoção semelhante aos animais do grupo ASA,

evidenciou-se também que os grupos VSA e SVA apresentaram aumento

significante em relação aos animais que receberam apenas selegilina

(VVS, SVS) ou desafio com anfetamina (VVA). Estes resultados

corroboram com a afirmação feita anteriormente de que provavelmente a

selegilina e a anfetamina, quando administradas concomitantemente,

promovem potenciação dos seus efeitos. Além disso, a selegilina parece

criar uma sensibilização prévia para anfetamina o que é evidenciado pelo

grupo VSA.

Segundo estudos realizados até o momento, para se observar à

sensibilização seria necessário, primeiramente, um aumento da oferta de

DA na fenda sináptica e posteriormente uma diminuição abrupta desta

como ocorre no período de abstinência. Este período seria necessário

para o aumento da sensibilidade, o que levaria a uma maior resposta no

desafio. Isto é corroborado por nossos resultados com os grupos AVA e

SVS quando comparados a seus respectivos controles (VVA e VVS). No

entanto, nos grupos ASA e VSA pode-se observar uma potenciação do

efeito da anfetamina. Nestes grupos houve um aumento da oferta de DA

no período de abstinência, no lugar de uma diminuição. Este aumento é

devido a dois mecanismos: menor metabolização de DA em presença da

selegilina e o aumento da liberação deste neurotransmissor, já que pelo

processo de biotransformação, a selegilina origina anfetamina. Estes

resultados levam a sugerir que o período de abstinência não seria

necessário para o desenvolvimento da sensibilização.

Observando-se o grupo SVS, no parâmetro distância percorrida

(figura 19), onde os animais apresentaram tendência a aumento quando

comparados aos animais do grupo VVS, pode-se inferir que a selegilina

possivelmente sensibiliza para ela mesma, o que cofirma dados prévios de

outros autores (THEMANN et al., 2002). Por outro lado, no grupo VVS a

locomoção foi significantemente menor que a do grupo VVA (experimento

1, figura 19). Nos níveis de corticosterona houve um aumento

estatisticamente significante nos animais do grupo VVS e os do grupo SVS

(figuras 26 e 27), evidenciando que a selegilina cronicamente estimula o

eixo HPA e aumenta o ACTH, fazendo com que haja aumento nos níveis

de corticosterona. Resultado semelhante pode ser observado no

experimento 4(item 4.5 do delineamento experimental e resultados) onde

os animais que receberam selegilina agudamente apresentaram redução

na distância percorrida total (figura 28), bem como redução do tempo em

movimento (figura 30), redução no levantar (comportamento exploratório)

(figura 32) e redução nos níveis de corticosterona (figuras 35 e 36).

A diminuição no efeito comportamental é devido ao efeito da

selegilina na pressão arterial e na freqüência cardíaca como evidenciado

no experimento 7 (item 4.6 do delineamento experimental e resultados,

figuras 37C e 38C). Embora dados de literatura demonstrem que a

administração de anfetamina promove aumento da pressão arterial, em

nossos experimentos, este efeito não foi evidenciado (experimento 7,

figuras 37B e 38B). Já a selegilina provoca uma hipotensão de curta

duração acompanhado por uma diminuição na freqüência cardíaca,

provocada por diminuição do tônus simpático, que atua no controle da

pressão arterial por três mecanismos diferentes:

1- Vamos primeiramente observar a biossíntese das catecolaminas:

Em uma situação normal, ou seja, sem o uso de substâncias que

atuem no SNC, a tirosina por ação da enzima DOPA descarboxilase

transforma a tirosina em tiramina que é o principal substrato da MAO.

Quando se administra selegilina a um paciente, a MAO é inativada, a

tiramina fica livre e através da enzima dopamina β-hidroxilase é

transformada num falso neurotransmissor (octopamina) que compete com

a NA nas vesículas. Sendo assim, menos NA será liberada para fenda

Figura 39: Biossíntese das catecolaminas (adaptado de Goodman e Gilman 2000).

Tirosina LTirosina L--DOPA DA NA DOPA DA NA

Tirosina

hidroxilase

DOPA

descarboxilase

DA

β-hidroxilaseTirosina

hidroxilase

DOPA

descarboxilase

DA

β-hidroxilase

sináptica e menos NA agirá sobre o músculo cardíaco estimulando a

freqüência cardíaca e a força de contração (como descrito anteriormente

no item 1.5.3 da introdução), assim haverá uma diminuição da pressão

arterial bem como da freqüência cardíaca.

2- A selegilina irá agir deprimindo o centro vasomotor bulbar. Este é

estimulado pela NA que faz com que ocorra hipotensão, uma vez que esta

está aumentada no SNC devido à inibição da MAO, ocorrerá então

diminuição na pressão arterial e na freqüência cardíaca.

3- A selegilina irá agir nos gânglios simpáticos fazendo com que

haja uma via colinérgica atuando em uma dopaminérgica inibitória sobre o

eixo pós-ganglionar. Isto promoveria liberação de menos NA causando

uma diminuição na pressão arterial e na freqüência cardíaca.

A diminuição nos níveis de corticosterona quando da administração

aguda de selegilina, provavelmente se deve a uma sobrestimulação do

eixo HPA. Este resultado concorda com o uso clínico desta substância

para o tratamento de Cushing em cães e gatos onde ela atua causando

uma diminuição nos níveis de corticosterona e uma diminuição na pressão

arterial (PETERSON, 1999; PETERSON, 2001; REUSCH et al., 1999).

Esta diminuição dos níveis de corticosterona segundo REUSCH et al.,

(1999) acontece devido ao fenômeno de “down-regulation” de ACTH pelo

aumento da concentração de DA. Nos animais isto estaria relacionado à

parte intermediária e distal da hipófise, sendo que em 70% dos casos em

cães isto é causado por adenoma na parte distal. Já em humanos isto é

devido a microadenoma no lobo anterior ou parte distal da hipófise.

Durante muitos anos a selegilina foi usada como antidepressivo.

Sua eficácia clínica para fobia social foi muito investigada e comprovada

(LIEBOWITZ et al., 1992; VERSIANI et al., 1992;). Seu efeito ansiolítico

também foi evidenciado para estresse pós-traumático, síndrome do pânico

e fobia momentânea (VAN VLIET et al., 1993). Entretanto, segundo MAKI

(2000) poucos estudos existem evidenciando o efeito ansiolítico dos

inibidores da MAO.

FONTANA et al., (1989) demonstraram, em experimento com teste

de conflito, que os inibidores da MAO apresentam efeito ansiolítico com

tratamento crônico e não agudo. Com o labirinto em cruz elevado existem

poucos trabalhos publicados.

No experimento 2 (item 4.4.1 do delineamento experimental e

resultados, figura 25), o grupo SVS apresentou uma diminuição na % de

tempo de permanência nos braços abertos, evidenciando um possível

efeito ansiogênico também observado no grupo VVS (figura 24). No

experimento 5 (item 4.5.1 do delineamento experimental e resultados,

figuras 33 e 34) isto também é evidenciado, uma vez que o grupo

selegilina mostrou tendência à diminuição na % do tempo de permanência

nos braços abertos bem como na % do número de entradas nos braços

abertos.

O tratamento agudo com anfetamina segundo VANDERSCHUREN

et al., (1999) é suficiente para acarretar conseqüências neuroendócrinas,

neuroquímicas e comportamentais, o que levaria a um aumento da

atividade locomotora e aos seus efeitos ansiogênicos, o que seria devido a

uma hiperatividade no núcleo accumbens, no caudato putamem e no

estriado. Nos experimentos 4 (distância percorrida, figura 28) e 5 (figuras

33 e 34) pode-se observar o efeito agudo da anfetamina aumentando a

atividade locomotora (figura 28), e também que os animais permaneceram

mais tempo em movimento na zona periférica, demonstrando o efeito

ansiogênico da anfetamina (figuras 30 e 31). No experimento 5 (figura 34)

pode-se observar que os animais mostram que a porcentagem do tempo

de permanência nos braços abertos é baixa.

Assim, nossos dados confirmam que fármacos que aumentam a

disponibilidade de DA na fenda sináptica, como, por exemplo, anfetamina

e selegilina, podem apresentar um efeito ansiogênico.

6 CONCLUSÃO Em todos os itens a seguir nos referimos exclusivamente aos

efeitos comportamentais, endócrinos e cardíacos dos fármacos.

a) O tratamento com anfetamina, seguido de um período de

abstinência sensibiliza o animal para anfetamina;

b) Os níveis de corticosterona não estão aumentados nos animais

sensibilizados por anfetamina (ver selegilina item g da conclusão);

c) A sensibilização comportamental e a corticosterona não são

processos dependentes;

d) A administração de selegilina no período de abstinência potencia os

efeitos da anfetamina;

e) A administração da selegilina no período de abstinência do

tratamento com anfetamina potencia a sensibilização

comportamental para anfetamina;

f) O tratamento com selegilina, seguido de um período de abstinência

aumenta o efeito de uma dose aguda de anfetamina;

g) O tratamento com selegilina, seguido de um período de abstinência,

sensibiliza o animal para selegilina. Bem como aumenta os níveis

de corticosterona;

h) A abstinência não seria necessária para o desenvolvimento da

sensibilização comportamental;

i) Uma dose de anfetamina mostrou os conhecidos efeitos deste

fármaco estimulando a atividade motora;

j) Anfetamina agudamente, não teve efeito sobre a pressão arterial e

nem sobre a freqüência cardíaca;

k) Uma dose de selegilina tem efeitos opostos aos da anfetamina na

atividade motora;

l) Selegilina agudamente causa hipotensão e bradicardia;

m) Uma dose aguda de selegilina causa diminuição nos níveis de

corticosterona.

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