INFLUÊNCIAS DE POLIMORFISMOS DE CITOCINAS NA SUSCEPTIBILIDADE AO DENGUE

Marcelo Jun Sakiyama, Viviane Lika Masaki (PIBIC/Fundação Araucária-UEM), Jeane Eliete Laguila Visentainer (Co-orientadora), Ricardo Alberto

Moliterno (Orientador), e-mail: ramoliterno@uem.br.

Universidade Estadual de Maringá/Departamento de Ciências Básicas da Saúde/Maringá, PR.

Ciências da Saúde.

Palavras-chave: citocina, polimorfismo, genotipagem

Resumo:

Dengue é a doença viral mais importante transmitida por vetores artrópodes. Além de fatores ambientais, os fatores genéticos parecem ter importância na manifestação da doença, pois mesmo em áreas endêmicas somente uma pequena proporção de pessoas desenvolve a forma mais grave da doença. Recentemente, polimorfismos de genes de citocinas têm sido relacionados com sua produção e, assim, poderiam conferir flexibilidade na resposta imune do individuo. Alguns estudos têm mostrado a influência de certos alelos de citocinas no curso de infecções virais e bacterianas. A proposta deste estudo foi a genotipagem de alelos dos seguintes genes de citocinas: IL1 alfa (-889), IL1 beta (-511, +3962), IL12 (-1188), IFN-gama (+874), TGF-beta1 (-819, -1082), TNF (-238, -318), IL2 (-330, +166), IL4 (-33, -590, -1098), IL-6 (-174), IL-10 (-592, -819, -1082), pela técnica PCR-SSP, de uma população saudável não aparentada e de uma população com dengue da região sul do Brasil. Os resultados de genotipagem foram utilizados nos cálculos das freqüências genotípicas e fenotípicas destes alelos, com o objetivo de avaliar a existência de associação entre o polimorfismo destas citocinas e a ocorrência da dengue. Com relação aos genótipos, observou-se uma diferença significativa entre pacientes e controles na freqüência de genótipos de IL-4 nos três locus analisados (-1098, -590, -33). Observou-se, ainda, um aumento da freqüência do genótipo T/C no códon 10 de TGF-beta. Com relação à freqüência alélica, apenas o alelo T de IL4 -1098 apresentou-se menos freqüente nos controles.

Introdução

Dengue é uma doença de etiologia viral transmitida principalmente pela picada de mosquito Aedes aejhipty. O vírus do dengue é classificado como RNA-vírus pertencente ao gênero Flavivirus (Flaviviridae). Atualmente, são conhecidos quatro sorotipos do vírus, DEN 1, 2, 3 e 4.(1)

Na resposta imune contra o vírus da dengue os linfócitos ativados liberam de citocinas, as quais possuem um papel importante na patogênese

da infecção pelo dengue. IFN-gama TNF-alfa, IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-18 e TGF-beta1 são exemplos de citocinas envolvidas na resposta imunológica ao vírus da dengue.(2)

Recentemente, genes de regiões reguladoras de citocinas têm sido descritos, os quais parecem estar correlacionados com a sua produção. Devido à influência exercida na produção de citocinas, estes polimorfismos podem conferir flexibilidade na resposta imune. A presença de certos alelos poderia, então, influenciar no curso de infecções virais, como o dengue, onde as citocinas exercem importante papel na imunopatogenicidade.(3-8)

Desta forma, um estudo de associação de genótipos de citocinas com o desenvolvimento do dengue poderia determinar os indivíduos susceptíveis à doença. Além disso, como o padrão de citocinas em indivíduos que evoluem para formas mais graves parece bem estabelecido, o estudo dos genótipos de citocinas (referentes à sua produção) em indivíduos que desenvolveram dengue poderia informar ao clínico o risco de um paciente com dengue evoluir para uma forma mais grave da doença.

Materiais e métodos COLETA E CONGELAMENTO DAS AMOSTRAS DE SANGUE:No total, foram coletadas 420 amostras de indivíduos com sintomas de dengue na região de Maringá. Trezentas amostras foram coletadas sem anticoagulante pela Secretaria de Saúde de Maringá, para a realização de sorologia de detecção de anticorpos IgM específicos para o vírus da dengue. Outras 120 amostras foram coletadas com anticoagulante EDTA. Destas 420 amostras, 239 (56,9%) confirmaram diagnóstico de Dengue por ELISA, sendo que 101 amostras foram analisadas neste estudo, compondo o grupo de pacientes. Das 181 amostras que não confirmaram o diagnóstico de dengue, 100 compuseram o grupo controle neste estudo.

TIPIFICAÇÃO DOS ALELOS DE CITOCINA PELA TÉCNICA DE BIOLOGIA MOLECULAR

No Laboratório de Imunogenética (Bloco I-90 sala 102) da Universidade Estadual de Maringá foi realizada a técnica de Biologia Molecular para genotipagem dos genes de citocinas (IL1 alfa (-889), IL1 beta (-511, +3962), IL12 (-1188), IFN-gama (+874), TGF-beta1 (-819, -1082), TNF-alfa (-238, -318), IL2 (-330, +166), IL4 (-33, -590, -1098), IL-6 (-174), IL-10 (-592, -819, -1082) dos 101 pacientes e 100 controles. Extração do DNA: Após o descongelamento das amostras de sangue, o DNA foi extraído, usando o kit de extração PuregeneTM (Gentra System, Mineapolis, MN, USA). Após avaliação da pureza do DNA e ajuste da concentração por densidade ótica, as tipagens dos alelos dos genes de citocinas foram realizadas pela técnica PCR-SSP (“polymerase chain reaction-sequence specific primers”), usando o kit de genotipagem de citocinas (One Lambda, Canoga Park, CA, USA). Os fragmentos de DNA amplificados foram separados por eletroforese, em cuba micro SSP gel System (MGS-B, One Lambda, CA, USA), em gel de agarose a 2,5%, a 150 volts por 10 minutos.

A visualização das bandas, quando expostas à luz ultravioleta, foi realizada pela coloração com brometo de etídio e a interpretação dos resultados foi baseada na presença ou ausência do fragmento específico de DNA amplificado. Para verificar a integridade da reação de PCR, foi utilizado um par de iniciadores como controle interno. Para a interpretação do produto amplificado, foram utilizadas fichas-padrão fornecidas pelo fabricante. As reações foram documentadas em fotografias. (aparelho de fotografia Polaroide MP-4 Land). As freqüências genotípicas e alélicas para cada SNP foram obtidas por contagem direta e comparadas pelo teste do qui-quadrado com correção de Yates ou pelo teste exato de Fisher. Valores de P iguais ou inferiores a 0,05 foram considerados significativos.

Resultados e Conclusão O grupo de pacientes foi constituído por 53,5% mulheres e 46,4% homens, com idade entre 6 a 75 anos (média = 35,5 anos; desvio padrão = 17,0), sendo 88% caucasóides, 8,3% pardos e 3,7% negros. Já o grupo controle foi constituído de 181 indivíduos (43,1%); destes, 58,6% eram mulheres e 41,4% homens, com idade entre 7 e 80 anos (média = 36,9 anos; desvio padrão = 17,0); 87,3% eram caucasóides, 8,8% pardos e 3,9% negros.

Com relação à freqüência alélica, apenas os alelos de IL4 -1098 apresentaram discrepância quando comparado o grupo controle e o grupo de pacientes (Tab 1).

Com relação aos genótipos, observou-se uma diferença significativa entre pacientes e controles na freqüência de genótipos de TGFβ1 -1082 e IL-4 nos três locus analisados (-1098, -590, -33) (Tab.2). Os genótipos C/T na posição -1082 para citocina TGFβ1 e T/T nas posições -1098, -590 e -33 para citocina IL4 foram mais freqüentemente encontrados em pacientes que nos controles. Já os genótipos T/G na posição -1098 e T/C nas posições -590 e -33 para citocina IL4 foram mais freqüentes no grupo controle.

Em resumo, os resultados demonstram que os genótipos de IL4-1089 TT, -590 TC e -33TC e o genótipo de TGFB1 -1082 CG apresentaram-se mais freqüente nos pacientes, enquanto os genótipos de IL4 -1098 TG, -590 TT e -33 TT, e o alelo -1098 G apresentaram-se mais freqüente nos contro-les. Observa-se que estas citocinas são anti-inflamatórias e que os genóti-pos que se apresentaram mais freqüentes nos pacientes são alto produto-res, indicando a importância de uma boa resposta inflamatória para controle da infecção.

Tabela 1. Freqüência alélica dos genes de citocinas que apresentaram diferença significativa entre o grupo de pacientes que desenvolveram Dengue em Maringá e região em 2008 e o grupo controle.

DP (N=101) DC (N=100) Citocina Alelo n % n % P

IL4 T 187 92,6 169 84,5 0,02(-1098) G 15 7,4 31 15,5 0,02

DP= pacientes, DC= controles, n= número de indivíduos que apresentaram o alelo, % Freqüência alélica, N= número total de indivíduos.

Tabela 2. Freqüência genotípica dos genes de citocinas que apresentaram diferença significativa entre o grupo de pacientes que desenvolveram Dengue em Maringá e região em 2008 e o grupo controle.

DP= pacientes, DC= controles, n= número de indivíduosque apresentaram o alelo, % Freqüência genotípica, N= número total de indivíduos.

Referências

1. Sabin A.B.; Schlesinger RW. Production of immunity to Dengue virus modified by propagation in mice. Science. 1945,101,640-642.2. Braga E.L.A.; Moura P., Pinto L.M.O.; Ignácio S.R.N.; Oliveira M.J.C.; Cordeiro M.T. et al. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 2001,96,229-232. 3. Meenagh, A.; Williams, F.; Ross, O. A. et al. Frequency of cytokine polymorphisms in populations from Western Europe, Africa, Asia, the Middle East and South America. Human Immunol. 2002, 63, 1055-1061.4. Awad, M. R.; El-Gamel, A.; Hasleton, P. et al. Genotypic variation in the transforming growth factor-β1 gene. Transplantation. 1998, 66(8), 1014-1020.5. Fishman, D.; Faulds, G.; Jeffry, R. et al. The effect of novel polymorphisms in the interleukin-6 (IL-6) gene on IL-6 transcription and plasma IL-6 levels, and an association with systemic-onset juvenile chronic arthritis. J Clin Invest. 1998, 102: 1369-1376.6. Pravica, V.; Asderakis, A.; Perrey, C. et al. In vitro production of IFN-gamma correlates with CA repeat polymorphism in the human IFN-gamma gene. Eur. J. Immunogenet. 1999, 26, 1-3.7. Wilson, A. G.; Symons, J. A.; Mcdowell, T. L. et al. Effects of a polymorphism in the human tumor necrosis factor alpha promoter on transcriptional activation. Proc Natl Acad Sci USA. 1997, 94, 3195-3199.8. Turner, D. M.; Williams, D. M.; Sankaran, D. et al. An investigation of polymorphism in the interleukin-10 gene promoter. Eur. J. Immunogenet. 1997, 24, 1-8.

DP (N=101) DC (N=100) Citocina Genótipo n % n % PTGFβ1 C/C 17 16,8 21 21,0 0,56 (-1082) C/T 52 51,5 37 37,0 0,05

T/T 32 31,7 42 42,0 0,56 IL4 T/T 87 86,1 71 71,0 0,01

(-1098) T/G 13 12,9 27 27,0 0,02 G/G 1 1,0 2 2,0 0,99

(-590) T/T 12 11,9 2 2,0 0,01 T/C 38 37,6 53 53,0 0,04 C/C 51 50,5 45 45,0 0,52

T/T 9 8,9 1 1,0 0,02 (-33) T/C 32 31,7 46 46,0 0,05

C/C 60 59,4 53 53,0 0,44