VINÍCIUS SARDÃO COLARES

Influência do polimorfismo do gene do MYH9 na

doença renal progressiva em pacientes com nefrite

lúpica

Tese apresentada à Faculdade de Medicina da

Universidade de São Paulo para obtenção de

título de Doutor em Ciências

Programa de: Nefrologia

Orientadora: Dra Viktoria Woronik

São Paulo

2011

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)

Preparada pela Biblioteca da

Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo

reprodução autorizada pelo autor

Colares, Vinícius Sardão

Influência do polimorfismo do gene MYH9 na doença renal progressiva em

pacientes com nefrite lúpica / Vinícius Sardão Colares. -- São Paulo, 2011.

Tese(doutorado)--Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo.

Programa de Nefrologia.

Orientadora: Viktoria Woronik.

Descritores: 1.Lúpus eritematoso sistêmico 2.Nefrite lúpica 3.MYH9 4.Cadeias

pesadas de miosina 5.Polimorfismo de um único nucleotídeo 6.Falência renal crônica

USP/FM/DBD-366/11

 

DEDICATÓRIA

 

À minha querida esposa Helena, pelo

seu amor e apoio irrestrito.

Aos meus pais Luiz e Irene que

me fizeram chegar aqui às custas

de muito esforço e dedicação.

Ao meu recém chegado filho Mateus,

Por poder ver a alegria na continuidade da vida.

 

AGRADECIMENTOS

 

À Dra. Viktoria Woronik pela transmissão sem fronteiras do seu conhecimento, sua

amizade e pelo modelo na dedicação à pesquisa e ensino.

À Silvia Titan, querida amiga, pela enorme ajuda na realização desse trabalho e da

amizade que foi construída nesses anos de pós-graduação.

Às minhas irmãs Verônica e Elisa que apesar dos anos de distância, estamos cada vez

mais próximos.

Aos meus sogros Clô e Antônio Carlos pelo carinho com que fui adicionado à família.

Ao meu amigo Luciano Farage, que se não fosse sua utopia e seu desejo infinito de

crescimento não teria aproveitado tanto o curso de medicina.

À Dra. Eliane Martins sempre grande incentivadora e modelo de médica.

Às amigas Rosa Moyses e Zita Namura, que muito me ajudaram no crescimento pós-

residência.

À Dra Íris Ferrari e Ricardo Pratesi, que me iniciaram no mundo da pesquisa.

Ao Dr. Rui Toledo Barros, grande motivador da pós graduação da nefrologia do HC-

FMUSP.

 

                                                                   Esta dissertação ou tese está de acordo com as seguintes normas, em vigor no momento desta publicação: Referências: adaptado de International Committee of Medical Journals Editors (Vancouver). Universidade de São Paulo. Faculdade de Medicina. Divisão de Biblioteca e Documentação. Guia de apresentação de dissertações, teses e monografias. Elaborado por Anneliese Carneiro da Cunha, Maria Julia de A. L. Freddi, Maria F. Crestana, Marinalva de Souza Aragão, Suely Campos Cardoso, Valéria Vilhena. 3a ed. São Paulo: Divisão de Biblioteca e Documentação; 2011. Abreviaturas dos títulos dos periódicos de acordo com List of Journals Indexed in Index Medicus.

 

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS

LISTA DE TABELAS

LISTA DE ABREVIATURAS

RESUMO

SUMMARY

1.INTRODUÇÃO...........................................................................................................1

1.1 LÚPUS ERITEMATOSOS SISTÊMICO.....................................................3

1.2 NEFRITE LÚPICA.......................................................................................4

1.3 PROGRESSÃO DA NEFRITE LÚPICA.....................................................7

1.4 FATORES DE PROGRESSÃO DA DOENÇA RENAL CRÔNICA..........8  

1.4.1 Proteinúria......................................................................................8

1.4.2 Hipertensão arterial........................................................................9

1.4.3 Etnia...............................................................................................9

1.5 POLIMORFISMOS GÊNICOS..................................................................11  

1.6 MYH9.........................................................................................................13  

1.7 MYH9 E LÚPUS ERITEMATOSO SISTÊMICO.....................................18

2. HIPÓTESE................................................................................................................20

3.OBJETIVOS...............................................................................................................22

4. PACIENTES E MÉTODOS......................................................................................24

4.1 Análise do polimorfismo do gene do MYH9 por reação de cadeia

polimerase genômica.....................................................................................................28

5. RESULTADOS.........................................................................................................31

6. DISCUSSÃO.............................................................................................................47

7. CONCLUSÕES.........................................................................................................54

8. ANEXOS...................................................................................................................57

9. REFERÊNCIAS........................................................................................................60

 

LISTA DE FIGURAS  

FIG. 1 - Estrutura do podócito e provável localização da proteína do gene MYH9----18

FIG. 2 - Desequilíbrio de ligação dos polimorfismos do haplótipo E1------------------35

FIG. 3 - Curva de desfecho DRC/DC, por genótipo, do polimorfismo rs4821480-----41

FIG. 4 - Curva de desfecho DRC/DC, por genótipo, do polimorfismo rs2032487-----41

FIG. 5 - Curva de desfecho DRC/DC, por genótipo, do polimorfismo rs4821481-----42

FIG. 6 - Curva de desfecho DRC/DC, por genótipo, do polimorfismo rs3752462-----44

 

LISTA DE TABELAS

Tab. 1- Resumo das publicações que avaliaram o MYH9---------------------------------16

Tab. 2- Características clínico-laboratoriais ao início do estudo--------------------------32

Tab. 3- Perfil clínico-laboratorial dos pacientes distribuídos em 2 grupos: com e sem

necessidade de tratamento dialítico ao início do estudo-----------------------------------33

Tab. 4- Características clínico-laboratoriais dos progressores e não progressores-----34

Tab. 5- Distribuição dos genótipos dos polimorfismos dos SNP’s estudados do gene

MYH9 nos grupos progressor e não progressor---------------------------------------------36

Tab. 6- Análise do alelo de risco do polimorfismo e o risco de progressão-------------37

Tab. 7- Características clínico-laboratoriais dos pacientes com genótiposs GG vs

GT/TT (modelo recessivo) do polimorfismo rs4821480-----------------------------------38

Tab. 8- Características clínico-laboratoriais dos pacientes com genótiposs CC vs

CT/TT (modelo recessivo) do polimorfismo rs2032487-----------------------------------39

Tab. 9- Características clínico-laboratoriais dos pacientes com genótiposs CC vs

CT/TT (modelo recessivo) do polimorfismo rs4821481-----------------------------------40

Tab. 10- Características clínico-laboratoriais dos pacientes com genótiposs CC vs

CT/TT (modelo dominante) do polimorfismo rs3752462---------------------------------43

Tab. 11- Frequência dos haplótipos e o seu risco de progressão--------------------------45

Tab. 12- Distribuição dos genótipos dos polimorfismos do haplótipo E1 nos pacientes

com DRC terminal na abertura do quadro---------------------------------------------------46

 

LISTA DE SIGLAS

LES Lúpus Eritematoso Sistêmico MYH9 Non Muscle Myosin Heavy Chain 9 GESF Glomeruloesclerose Focal E Segmentar HIV Vírus da Imunodeficiência Humana DM2 Diabetes Mellitus tipo 2 SLEDAI Sistemic Lupus Eritematous Disease Activity Index DRC/DC Doença Renal Crônica DC Duplicação de Creatinina DRC/DC Doença Renal Crônica/ Duplicação de Creatinina SNP Single-Nucleotide Polymorphism IRC Insuficiência Renal Crônica  HAS Hipertensão Arterial Sistêmica  EBV Epstein-Barr Vírus GN Glomerulonefrite MO Microscopia Óptica MCP-1 Proteína Quimioatratora de Macrófagos IF Imunofluorescência ME Microscopia Eletrônica IL-8 Interleucina 8 TGF-β Transforming growth factor β TGF Taxa De Filtração Glomerular IECA Inibidor Da Enzima Conversora Da Angiotensina ARA2 Antagonista Do Receptor Da Angiotensina Il PA Pressão Arterial RFLPs Restriction Fragment Length Polymorphism DNA Ácido Desoxirribonucleico SNP Polimorfismos De Nucleotídeo Único HPLC Cromatografia Líquida De Alta Eficiência HIVAN Nefropatia Relacionada ao HIV RR Risco Relativo IC Intervalo de Confiança NIH National Institutes of Health FAN Fator Anti-Núcleo HC-FMUSP Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da

Universidade de São Paulo NL Nefrite Lúpica OMS Organização Mundial de Saúde EDTA Etilenodiamina Tetra-Acético PCR-RFLP Restriction Fragment Length Polymorfism Chain Reaction  C Citosina G Guanina T Timina APOL1 Apolipoproteína L1

 

Resumo

Colares, VS. Influência do polimorfismo do gene do MYH9 na doença renal progressiva em pacientes com nefrite lúpica [tese]. São Paulo: “Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo”; 2011. INTRODUÇÃO: A nefrite lúpica é uma complicação frequente e de alta morbi-mortalidade do lúpus eritematoso sistêmico (LES). A evolução para insuficiência renal crônica terminal varia entre 8 e 15% dos casos, após um período de 5 anos. A fase inicial da nefrite se deve a uma atividade imunológica exacerbada que leva a sequelas renais, como a fibrose intersticial, sinéquias glomerulares, e glomeruloesclerose. Uma vez instalada, vários fatores aceleram a velocidade de progressão da insuficiência renal, como a presença de proteinúria residual, hipertensão arterial sistêmica e a etnia do paciente. Estudos recentes mostraram que a presença de polimorfismos do MYH9 são altamente prevalentes em pacientes com GESF (glomeruloesclerose focal e segmentar), nefropatia do HIV e em pacientes com doença renal crônica não diabética. Os polimorfismos do MYH9 mais relacionados com essas doenças são os do haplótipo E1, causados pelos polimorfismos rs4821480, rs2032487, rs4821481 e rs3752462, presentes principalmente na população negra e de hispano-americanos. No Brasil não há estudos sobre a prevalência desse gene. MÉTODOS: Nosso estudo analisou retrospectivamente 196 pacientes com nefrite lúpica, acompanhadas no ambulatório de glomerulopatias do Hospital das Clínicas da USP. Foram recuperados os dados clínicos e laboratoriais dos pacientes de janeiro de 1999 a dezembro de 2010. Foi feita análise dos polimorfismos do haplótipo E1 do gene do MYH9 (rs4821480, rs2032487, rs4821481 e rs3752462) e correlacionados com suas características clínicas e laboratoriais, apresentando como desfecho a duplicação da creatinina ou a evolução para doença renal crônica terminal. RESULTADOS: O tempo de seguimento médio dos pacientes foi de 6,1 anos, com a creatinina inicial média de 1,6 g/dL e proteinúria média de 3,9 g/dia. Dezenove pacientes não recuperaram função renal, mantendo-se em diálise. Dos 177 pacientes restantes 43 (24%) apresentaram o desfecho de duplicação (DC) da creatinina, ou necessidade de diálise (DRCT). Pacientes progressores eram tinham maior SLEDAI renal (10 vs 8,9 p=0,04), maior índice de cronicidade renal à biópsia (5 vs 2, p<0,001) e maior frequência de reativações da doença renal (flare renal) (82,9% x 53,8%, p=0,002), assim menores índices de remissão completa ou parcial (p<0,0001). Os 4 polimorfismos se segregam em conjunto, ou seja, como um haplótipo, pelo modelo de Hardy-Weinberg. Analisando separadamente cada polimorfismo, apenas o rs3752462, apresenta associação com o desfecho DC/DRCT, na análise por genótipo (CC/CT/TT, p=0,03) e quando feita análise TT/CT vs CC (p=0,02). Não houve relação dos polimorfismos com a etnia negra ou parda. Pacientes com haplótipo E1 eram progressores em 28% dos casos, conferindo um OR de 1,79 (IC 1,02 a 3,0) de DC/DRC. DISCUSSÃO: A presença do haplótipo E1 têm alta prevalência em pacientes portadores de nefrite lúpica no Brasil, sendo fator de risco para progressão da doença renal crônica.

Descritores: Lúpus eritematoso sistêmico, Nefrite lúpica, MYH9, Cadeias pesadas de miosina, Polimorfismo de um único nucleotídeo, Falência renal crônica

 

Summary

Colares, VS. Influence of the MYH9 gene polymorphism in progressive kidney disease in patients with lupus nephritis [thesis]. São Paulo: “Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo”; 2011.  BACKGROUND: Lupus nephritis (LN) is a frequent complication with high morbidity and mortality of systemic lupus erythematosus (SLE). Chronic renal failure is observed in 8 to 15% of the patients after 5 years of follow up. LN is an inflammatory disease after a systemic autoimmune activation. Once inflammation is shutdown several renal and nonrenal factors, such as residual proteinuria, hypertension and ethnicity of the patient, may emerge and impose to the kidney a chronic phenotype (interstitial fibrosis, glomerular adhesions and glomerulosclerosis. Recently E1 haplotype (rs4821480, rs2032487, rs4821481 and rs3752462 polymorphisms) of the MYH9 gene was associated to progressive kidney diseases in patients with FSGS (focal segmental glomerulosclerosis), HIV nephropathy and non-diabetic chronic kidney disease, in african american and spanic american patients. In Brazil there is no data on this subject.  METHODS: Retrospective analysis of 196 patients with LN followed in our outpatient glomerular disease ward were enrolled glomerulopathies. Patients clinical data from January 1999 to December 2010 were retrieved and MYH9 rs4821480, rs2032487, rs4821481 and rs3752462 polymorphisms were genotyped. Outcome was defined as doubling of serum creatinine, or end stage renal disease (ESRD). RESULTS: The mean follow-up of patients was 6.1 years, with an initial mean creatinine of 1.6 g/dL and mean proteinuria 3.9 g/day. On enrollment nineteen patients were on dialysis and did not recover renal function, they were withdraw from analyses of progressive kidney disease. On follow up, from 177 remaining patients, 43 (24%) showed the composite outcome: dialysis, or doubling creatinine. Progressors had higher renal SLEDAI (10 vs 8.9, p = 0.04), higher chronicity index at biopsy (5 vs 2, p <0.001) and more frequently renal flares (82, 9% vs. 53.8%, p=0.002), as well as lower rates of complete or partial remission (p <0.0001). The four polymorphisms segregate as a haplotype, according the Hardy-Weinberg model. Analysing each polymorphism, only TT/CT genotype from rs3752462 polymorphism was associated with the outcome of DC/ESRD (p = 0.02). E1 haplotype were associated with progression with an OR of 1.79 (CI 1.02 to 3.0). DISCUSSION: The presence of the E1 haplotype is associated with worse prognosis of chronic renal failure in lupus nephritis patients.    Descriptors: Systemic Lupus Erythematosus, Lupus Nephritis, MYH9, Chronic Kidney Failure, Single Nucleotide Polymorphism, Myosin Heavy Chains

 

1. INTRODUÇÃO

 

Introdução 2

1. INTRODUÇÃO

O lúpus eritematoso sistêmico é uma doença auto-imune, multissistêmica, com

patogênese complexa, sendo que sua etiologia primária é a produção de auto-

anticorpos. Sua prevalência nos Estados Unidos encontra-se entre 15 a 50 casos por

100.000 pessoas, com uma incidência global estimada de 1,8 a 7,6 casos por 100.000

pessoas por ano.1

Quando o diagnóstico do LES ocorre entre a idade de 15 a 40 anos mais de

90% dos pacientes são do sexo feminino e no caso da doença se manifestar na infância

ou após os 65 anos a proporção entre homens e mulheres é de 2 mulheres para cada

homem.2 A taxa de incidência também varia amplamente de acordo com a etnia

da população estudada. Homens caucasianos e afro-americanos apresentam incidência

entre 0,3 a 0,9 e 0,7 a 2,5 por 100.000 pessoas por ano respectivamente, enquanto

mulheres caucasianas e afro-americanas tem incidência de 2,5 a 3,9 e de 8,1 a 11,45

por 100.000 pessoas por ano.3

Essas diferenças raciais são consistentes com a importância de fatores

genéticos no desenvolvimento do LES.  

A nefrite lúpica está presente em 40 a 75% dos pacientes com LES,

aumentando tanto a morbidade, como a mortalidade desta doença.2 Apesar dos

avanços na terapêutica imunossupressora pacientes com formas mais graves de nefrite

evoluem para insuficiência renal crônica em cerca de 20 a 30 % dos pacientes em 10

anos.4,5,6  

 

Introdução 3

Alguns fatores relacionados à progressão para IRC nesses pacientes são

devidos à gravidade da atividade do lúpus, à presença de resposta ao tratamento

imunossupressor e à ocorrência de recidivas. No entanto o peso dos fatores de

progressão presentes nas doenças renais crônicas como hipertensão arterial sistêmica

(HAS),7 proteinúria residual8 e etnia9,10 assim como fatores genéticos, são pouco

estudados na doença renal progressiva da nefrite lúpica.  

1.1. LÚPUS ERITEMATOSO SISTÊMICO

A fisiopatologia do LES está baseada na desregulação do sistema imune, com

hiperreatividade dos linfócitos B, ativação anormal dos linfócitos T e alteração no

clareamento das células apoptóticas e imunocomplexos. A deposição de

imunocomplexos no rim ocasiona a ativação de fatores inflamatórios locais, como o

sistema complemento, infiltração linfocítica, ativação de fatores pró-coagulantes,

citocinas e quimiocinas, ocasionando a proliferação de células glomerulares, como

células mesangiais e endoteliais.11

A susceptibilidade ao lúpus é herança complexa, multifatorial e poligênica.

Alguns lócus já foram associados à presença de nefrite lúpica, como os localizados nos

cromossomos 10q22.3, 2q34-q35 e 11p15.6.12 Alguns polimorfismos aumentam o

risco do desenvolvimento da doença, como o de genes da apopose (programmed cell

death 1 gene-TNFRSF6)13 da proteína C reativa (PCR2 e 4),14 de receptores da fração

Fc de imunoglobulinas (FcγRIIB).15

 

Introdução 4

Fatores ambientais também podem predispor ao lúpus e facilitar suas

exacerbações. Causas ambientais bem estabelecidas relacionadas ao desenvolvimento

do lúpus são: a exposição ao sol e o uso de certas drogas, como hidralazina e

procainamida (lúpus induzido por drogas). Fatores que ainda envolvem controvérsia

são a infecção pelo Epstein-Barr vírus (EBV) e uso de contraceptivos orais.16

1.2. NEFRITE LÚPICA

 

A nefrite lúpica se expressa com um amplo espectro clínico, apresentando

formas leves, em que a alteração clínica caracteriza-se apenas por proteinúria <1g/dia

e hematúria microscópica, até formas extremamente graves com perda rápida de

função renal e proteinúria associados a sedimento urinário com presença de

leucocitúria e hematúria.  

Várias classificações foram formuladas no decorrer dos anos na tentativa de

padronizar a terminologia da nefrite lúpica entre os vários centros, assim como para

estabelecer correlações clínico-patológicas.17  

A última classificação foi proposta em 2003 pela Sociedade Internacional de

Nefrologia e pela Sociedade de Patologia Renal subdividindo a nefrite lúpica nas

seguintes categorias mostradas no Quadro 1.18

 

Introdução 5

Quadro 1- Classificação da nefrite lúpica proposta pela Sociedade Internacional de Nefrologia e pela Sociedade de Patologia Renal (2003)19

 

Introdução 6

Clinicamente a nefrite classe II apresenta-se com função renal normal,

associada a hematúria, apresentando bom prognóstico, não havendo necessidade de

realização de qualquer tipo de tratamento voltado ao rim, mas sim ao LES.

A Classe III ocorre em 10 a 20 % das biópsias renais. Hematúria e proteinúria

estão presentes em quase todos os pacientes e alguns pacientes podem inclusive

apresentar síndrome nefrótica (cerca de 20%). Hipertensão arterial e perda de função

renal também ocorrem frequentemente.20  

A classe IV se assemelha clinicamente à classe III, porém esta mais

comumente se associa com perda de função renal e síndrome nefrótica (cerca de

40%).20 Não é possível distinguir clinicamente essas duas classes histológicas, sendo

imprescindível a biópsia renal para diferenciá-las.21 Essas 2 lesões são as formas mais

frequentemente encontradas nas biópsias renais, com uma prevalência de 20 a 35% de

classe III e de 35 a 60% de classe IV.

Em estudos de tratamento essas duas classes são geralmente estudadas em

conjunto (formas proliferativas). A IRC terminal ocorre em 8 a 15% dos casos após 5

anos de seguimento, com sobrevida do paciente aos 10 anos de 80%, sendo as

infeccões a maior causa de mortalidade.22

A nefrite lúpica classe V é a membranosa e apresenta depósitos imunes sub-

epiteliais de forma global ou segmentar. Sua frequência nas biópsias varia de 10% a

30%. Os pacientes com essa lesão apresentam proteinúria, geralmente de nível

nefrótico em cerca 80% dos casos, com função renal normal. Hematúria pode ser

observada, assim como HAS.20 A sobrevida em 10 anos dos pacientes varia de acordo

com os estudos de 90 a 98%, com sobrevida renal entre 72% e 100%.23  

 

Introdução 7

1.3. PROGRESSÃO DA NEFRITE LÚPICA  

 

A nefrite lúpica é a expressão renal de uma reposta imunológica e inflamatória

sistêmica modulada por características teciduais próprias do rim. A terapia

imunossupressora tem como objetivo diminuir a resposta imunológica, diminuindo

assim a ativação leucocitária e produção de moléculas pró-inflamatórias.  

Pacientes que apresentam atividade inflamatória sistêmica inicial muito intensa

apresentam uma pior evolução. Alguns marcadores que predizem a gravidade da

nefrite lúpica são: creatinina sérica inicial elevada, presença de anemia (Hematócrito

<26%) e presença de crescentes na histologia renal. Respostas ao tratamento, assim

como o número de recidivas (flare renal) são importantes. Pacientes com remissão

completa apresentam melhor evolução.24,25  

Quanto ao tecido renal, é conhecido que em paralelo à remissão clínica os

elementos inflamatórios celulares de uma reação aguda remitem, porém são pouco

conhecidos os mecanismos teciduais envolvidos na deposição de colágeno e matriz

extra-celular que apontam clinicamente para uma perda progressiva da função renal.26  

Nesse estágio os fatores de mau prognóstico passam a ser aqueles que

classicamente se associam a progressão da lesão renal crônica, como a persistência de

proteinúria, a etnia do paciente e a presença de HAS.25,27  

O atraso no diagnóstico da nefrite lúpica (intervalo de tempo entre o início dos

sintomas e a biópsia renal) e o tratamento instituído, também têm relação com a

progressão para IRC, independente da classe histológica. Provavelmente pelas lesões

mais graves que se instalaram pela falta de tratamento, com maior quantidade de

 

Introdução 8

fibrose tubulointersticial e de glomeruloesclerose, condicionando um maior grau de

cronicidade à biópsia e assim uma pior resposta ao tratamento imunossupressor.4

 

1.4. FATORES DE PROGRESSÃO DA DOENÇA RENAL CRÔNICA  

 

1.4.1 PROTEINÚRIA

A presença de proteinúria é um forte preditor de nefropatias crônicas, sendo

que a proteinúria basal é um fator independente para progressão em pacientes com

várias doenças metabólicas como HAS e nefropatia diabética.28,7 São diversos os

mecanismos envolvidos.

Admite-se que em células tubulares proximais a sobrecarga de proteínas

estimula a síntese de matriz extra-celular e fatores quimiotáticos como o MCP-1

(proteína quimioatratora de macrófagos 1), RANTES e IL-8 (interleucina 8).29,30

Ocorre também ativação da via alternativa do complemento, formação do complexo de

ataque a membrana, com mudanças no citoesqueleto da célula tubular, atração de

macrófagos e hiperexpressão de genes fibrogênicos como oTGF-β.31 A via da

apoptose também encontra-se ativada com hiperexpressão do Fas e Fas ligante.32

A diminuição da proteinúria com o tratamento com inibidores da enzima

conversora da angiotensina (IECA), atenua o declínio da taxa de filtração glomerular

(TGF),33 e correlaciona-se com a diminuição da expressão das moléculas

inflamatórias.

Dois estudos mostraram redução maior que 50% na proteinúria em pacientes lúpicos,

 

Introdução 9

normotensos, sem sinais de atividade de doença, mas que mantinham proteinúria

persistente e que foram tratados com inibidores da enzima de conversão da

angiotensina, ou do receptor da angiotensina II (ARA2).34,35 Esses resultados se

assemelham aos da população diabética em que os uso de ARA2 diminui a proteinúria

em cerca de 30%.36

1.4.2 HIPERTENSÃO ARTERIAL

A hipertensão arterial sistêmica tem maior prevalência na população negra, sendo

a etiologia da IRC em 34% dos pacientes afro-americano em programa de diálise nos

EUA, enquanto que nos caucasianos essa taxa é de 25%.37

Além da maior prevalência, o tratamento medicamentoso, incluindo o uso de

IECA e ARA2, mostra menos eficácia em afro-americanos do que em outras

populações. Pacientes negros submetidos a tratamento agressivo da pressão arterial

(PA) mantém um declínio da taxa de filtração glomerular acima do observado em

outras etnias.38

1.4.3 ETNIA

Nos EUA a nefrite lúpica é 2 a 4 vezes mais frequente em negros (62%), do

que na população branca (32%).39,40 Isto se deve provavelmente a fatores genéticos e

ambientais. Por outro lado, os pacientes negros apresentam uma doença renal mais

grave e um prognóstico pior.41

Assim sendo pacientes negros apresentam frequentemente mais lesões

 

Introdução 10

histológicas proliferativas difusas, quando comparados a brancos (76% vs 44%,

p<0,05), menores índices de remissão (59% vs 81%, p< 0.029) e menor sobrevida

renal (38% vs 68%, p= 0.015).41

Dados semelhantes foram encontrados por Contreras et al.10 Quando comparou

pacientes com nefrite lúpica: americanos negros, hispânicos e caucasianos constatou

níveis mais elevados de pressão arterial em negros do que em caucasianos (107 ±19,

102 ±15 e 99 ±13 mmHg, p <0,05), assim como maior creatinina sérica (1,66 ± 1,3,

1,25 ±1,0, e 1,31 ±1,0 mg/dL, p <0,025). Constatou também que a prevalência da

classe IV nos caucasianos, era menor que em hispânicos (30 vs 57%, p=0,03) e

numericamente menor do que em pacientes negros, porém sem significância estatística

(30% vs 51%, p=0,09).  

A sobrevida renal também é pior nos pacientes negros e hispânicos, com mais

casos de duplicação da creatinina e IRC terminal. A sobrevida renal em 5 anos em

brancos pode chegar a 95%, enquanto em negros ela encontra-se em torno de 60%.  

Estudo de Dooley et al, mostra que as diferenças raciais no desfecho renal são

independentes da idade, do tempo de lúpus, de antecedentes de hipertensão arterial, do

controle da hipertensão durante a terapia ou índices de atividade ou de cronicidade na

biópsia renal.9  

A condição sócio-econômica e classe social parecem não ter relação com a

progressão da lesão renal, com exceção da população hispano-americana de Nova

York.42  

Assim sendo, dados de literatura sugerem que a etnia do paciente com nefrite

lúpica é importante na evolução da doença.

 

Introdução 11

1.5. POLIMORFISMOS GÊNICOS  

As variações genéticas ocorrem normalmente nas populações. Quando mais de

1% da população apresenta o mesmo tipo de variação chamamos de polimorfismo

gênico.

O polimorfismo pode ser ou não funcional, dependendo se acarreta alteração de

síntese da proteína codificada originalmente pelo gene. Quando o polimorfismo ocorre

no íntron do gene, a proteína formada não se alterará. Porém se a mudança ocorrer em

um gene regulador a proteína produzida poderá ser alterada, tanto na quantidade

produzida, quanto na sua função.

São descritos dois tipos de polimorfismos: o primeiro deles é o polimorfismo

de restrição (restriction fragment length polymorphism -RFLPs), em que são

produzidos pequenos fragmentos de DNA através de digestão enzimática, sendo

detectados posteriormente por eletroforese.

O outro tipo de polimorfismo é aquele que ocorre por mudança de um único

nucleotídeo na seqüência do DNA e são denominados de polimorfismos de

nucleotídeo único (SNP), podendo ser determinados por seqüenciamento de DNA ou

por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC).43

A associação de alelos de diferentes polimorfismos dentro de uma população

causa o fenômeno do linkage desequilibrium (desequilíbrio de associação), em que o

baixo índice de recombinação em certa região do gene leva a polimorfismos com um

alto nível de associação. Tal achado permite, na prática, à predição da presença de um

alelo pela constatação da presença de outro adjacente. Áreas com uma grande

 

Introdução 12

quantidade de desequilíbrio de associação correlacionam-se com blocos de alelos, que

em conjunto formam os haplótipos.44

Por isso, misturas recentes entre populações geneticamente distintas geram a

longo prazo tanto desequilíbrios de associação, quanto de segmentos cromossômicos

originários das populações ancestrais, fator que pode ser explorado para mapear os

genes de doenças que são mais frequentes em uma população ancestral em relação a

outra.45  

Outro artifício usado no estudo de populações, é o princípio subjacente ao

mapeamento de miscigenação (admixture mapping). Este se baseia no fato de que a

maioria das variantes genéticas são semelhantes em suas freqüências alélicas na

mesma população ancestral. Assim, se um subconjunto de variantes genéticas mostrar

frequência diferente da esperada numa população é possível estimar uma

ancestralidade cromossômica regional.  

Os estudos de associação utilizam-se de modelos de transmissão gênica para a

avaliar o risco da doença. Os principais modelos são:  

- aditivo: estabelece que o risco da doença para homozigotos é 2 vezes

maior do que para heterozigotos.  

- dominante: o alelo de risco sobrepuja o segundo alelo, causando a

mudança fenotípica.  

- recessivo: mudança requer a presença das duas cópias do alelo para

ser expresso.46  

 

Introdução 13

1.6. MYH9

A maior prevalência de pacientes de doença renal crônica em pessoas do

mesmo grupo familiar, assim como a maior predisposição dos pacientes negros

apresentarem doença renal associada a hipertensão arterial, 47 GESF48 e nefropatia do

HIV49 fez com que fossem pesquisados fatores genéticos na etiologia da lesão renal.  

Estudos de desequilíbrio de ligação mostraram que havia uma maior

prevalência de genes do cromossomo 22q12 em pacientes negros e portadores de

insuficiência renal crônica,50 porém essa é uma região extensa, que possui mais de 30

genes.  

O primeiro gene a ser analisado foi o do MYH9 (nonmuscle myosin heavy

chain 9) por já ter sido estudado em algumas doenças renais. O gene MYH9 está

presente no cromossomo 22 (22q13.1), possui 44 éxons, com 27 mutações

identificadas, sendo que as mutações relacionadas com as doenças anteriormente

citadas, na sua maioria, apresentam uma mutação no éxon 4.  

O gene MYH9 codifica a proteína de cadeia pesada não muscular da miosina

IIA (NMM), proteína expressa em várias células, como plaquetas, macrófagos e

células T. No rim ela é expressa em podócitos e células mesangiais, interagindo com a

actina, contraindo o citoesqueleto do podócito, mantendo a ultra-estrutura

podocitária.51  

A descrição de alterações no gene MYH9 foram feitas inicialmente nas

síndromes de Fechtner; Sebastian e Epstein e na anomalia de May-Hegglin.  

 

 

Introdução 14

Essas doenças são autossômicas dominantes e se caracterizam pela tríade de

trombocitopenia, macro-plaquetas e corpúsculos de inclusão em leucócitos

(corpúsculos “Döhle-like”), sendo que nas síndromes de Fechtner e Epstein ainda

ocorre um quadro semelhante à síndrome de Alport, com surdez neuro-sensorial,

catarata e doença renal (hematúria e perda progressiva de função renal).52  

Pouco se sabe sobre as características clínicas, histológicas e prognósticas da

doença renal nesses pacientes. Estudo recente de Sekine et al53 avaliou 9 pacientes

que apresentavam duas mutações de novo (R702H e R702C). Os pacientes iniciavam

com hematúria microscópica e proteinúria não nefrótica antes dos 12 anos de idade. A

evolução para insuficiência renal crônica foi comum (4 pacientes), geralmente na

adolescência, e com rápida progressão assim que a creatinina atingia 1,0 g/dL.

Na literatura há apenas a descrição 5 casos de pacientes com síndrome de

Fechtner em que foi realizada biópsia renal. Os achados mais comuns são de

proliferação mesangial e esclerose segmentar glomerular. Presença de esclerose global

denota casos mais avançados da doença renal. 53, 54,55, 56,57

Na microscopia eletrônica dois pacientes apresentaram lesões semelhantes a da

síndrome de Alport, com locais de adelgaçamento e espessamento da membrana basal

glomerular,57 porém nos outros trabalhos o achado mais comum foram de

aplainamento podocitário, associado a diminuição do tamanho da fenda diafragmática,

com morfologia normal da membrana basal glomerular.53,55

Recentemente mutações nesse mesmo gene, no éxon 44, também foram

relacionadas a doenças renais, principalmente a glomeruloesclerose segmentar e focal

(GESF) primária, a nefropatia relacionada ao HIV (HIVAN) e a doença renal crônica

 

Introdução 15

relacionada com a HAS.

Análises de mapeamento de miscigenação (admixture mapping analyses)

comparando uma população negra americana com GESF e uma caucasiana controle,

mostram uma freqüência 10% maior, no cromossomo 22, do gene MYH9 (OR = 5.0,

IC 95%=3.5-7.1).58

Genotipagem e sequenciamento do gene MYH9 ajudaram na identificação de

dez SNP’s (single nucleotide polymorphism -SNP), associados a pacientes que

apresentavam doença renal crônica. Três deles apresentam segregação de forma

conjunta, ou seja, formando 3 haplótipos distintos (E, S e F).

O haplótipo E1 foi o mais estudado e consiste na presença dos nucleotídeos

G/C/C/T (que são respectivamente os polimorfismos rs4821480, rs2032487,

rs4821481 e rs3752462).

Esse haplótipo se relaciona com a doença renal crônica não diabética, a nefropatia do

HIV e a GESF idiopática.

Cerca de 35% dos afro-americanos e 1% da população caucasiana dos Estados

Unidos são homozigotos para o haplótipo de maior risco, o MYH9 E1, mas dentre os

portadores nem todos desenvolvem problemas renais; cerca de 4% dos homozigotos

desenvolvem GESF idiopática e 20% dos infectados pelo HIV apresentam o HIVAN.

Admite-se a possibilidade da presença de um segundo fator que desencadeie o

processo da insuficiência renal.59  

Outro estudo comparando uma população negra com IRC não causada por

DM2, com uma população européia, demonstrou que cada cópia do alelo europeu

diminuía o risco relativo de IRC em 50% (IC 95%= 0.39-0.63), mas a presença do

 

Introdução 16

gene MYH9 se associava a um risco 2 a 4 vezes maior de IRC.60 Já em pacientes

hipertensos o risco de IRC com o polimorfismo do MYH9 é 3 a 4 vezes maior. O

risco de um paciente negro americano, portador de IRC, apresentar o haplótipo E1 é de

60%, enquanto que no caucasiano é de 4%.61

A tabela 1 resume os artigos publicados com o risco associado ao genótipo do

MYH9.

 

Introdução 17

Ainda não se sabe por que as populações que apresentam o gene MYH9

apresentam maior risco de IRC. O gene MYH9 codifica a cadeia pesada não muscular

da miosina 9, essa proteína se agrega a outras subunidades formando a miosina II, que

possui uma função motora ligada a actina.

O MYH9 está expresso em podócitos, células mesangiais e capilares peri-

tubulares e arteríolas. Nas doenças de Fletcher e Epstein especula-se que o produto do

gene mutado altere as interações entre células glomerulares e plaquetas, porém não há

estudos sobre polimorfismos que predispõe à IRC.62

O podócito tem um papel de grande importância na filtração glomerular e na

barreira anti-proteinúrica. Ele é formado por um complexo de proteínas, que estão

agrupadas em três áeras funcionais distintas: citoesqueleto, interface com a membrana

basal e fenda diafragmática.56 Recentemente a proteína do gene MYH9 foi descrita

como integrante da estrutura podocitária, apresentando provavelmente uma função

contrátil (Fig 1).53

 

Introdução 18

Fig 1. Estrutura do podócito e provável localização da proteína do gene MYH9.63 Fonte: Reidy, K. & Kaskel, F.J. Pathophysiology of focal segmental glomerulosclerosis. Pediatr Nephrol 22, 350-354 (2007)

1.7. MYH9 E LÚPUS ERITEMATOSO SISTÊMICO

Apenas um artigo testou a associação entre nefrite lúpica e o gene MYH9, em

3 grupos diferentes, todos eles apenas com pacientes negros norte-americanas. 64

O primeiro grupo comparou 25 lúpicas, já em diálise, com 735 pessoas sem

alterações renais, sendo encontrado nas pacientes uma associação com o haplótipo E1

(RR 3.09; IC 95% 1.31–7.27; p=0.010) e 4 dos SNPs- rs11912763, rs4821480

rs2032487 rs4821481. (RR 2.37–4.31; p < 0.05).

O segundo grupo foi de 583 lúpicos, sendo 318 com nefrite lúpica e 265 sem

nefrite. Entre os 318 havia 10% de pacientes com a creatinina sérica maior do que 2,5

mg/dL. Nessa população não foi encontrada relação com o haplótipo E1 (RR 0.79; IC

95% 0.55 a 1.15; p=0.22).

 

Introdução 19

O terceiro grupo era de 60 lúpicas seguidas por pelo menos 2 anos no National  

Institutes of Health (NIH), sendo 39 com nefrite lúpica e 21 sem atividade renal, sendo

18% com creatinina maior do que 2,5 mg/dL. Também nesta população não foi

encontrado associação com o haplótipo E1, nem com seus SNPs isoladamente.

 

2. HIPÓTESE

 

Hipótese 21

2. HIPÓTESE

A presença de polimorfismos do gene MYH9, rs4821480, rs2032487,

rs4821481 e rs3752462, que fazem parte do haplótipo E1, podem predispor a uma pior

evolução nos pacientes com nefrite lúpica.

 

3. OBJETIVOS

 

Objetivos 23

3. OBJETIVOS

Avaliar a presença de polimorfismos do gene MYH9 em pacientes com nefrite

lúpica, correlacionando com os seguintes parâmetros:

Atividade clínica da doença pelo escore de SLEDAI65 (vide anexo 1),

Marcadores sorológicos de atividade de doença, como FAN, anti-DNA e

complemento sérico,

Progressão da doença,

Número de flares renais,

Tipos histológicos na biópsia renal, assim como seus índices de atividade e de

cronicidade,

 

4. PACIENTES E MÉTODOS

 

Pacientes e Métodos 25

4. PACIENTES E MÉTODOS

Banco de amostras de sangue coletado de 196 pacientes portadores de nefrite

lúpica, definidos pelos critérios do American College of Rheumatology,(vide anexo

2),66 em seguimento regular no Ambulatório da Unidade de Nefrologia do

Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de São Paulo (HC-FMUSP), no

período de janeiro de 1999 a dezembro de 2010. A coleta de sangue para

genotipagem foi realizada entre janeiro a dezembro 2006 e o DNA estocado em

freezer -80oC.

Todos os pacientes apresentavam diagnóstico histopatológico de nefrite

lúpica (NL), segundo a classificação da OMS,67 avaliados pelo Serviço de Anatomia

Patológica do Hospital das Clínicas como parte da investigação clínica de rotina,

por meio das técnicas de microscopia óptica e imunofluorescência.

Os dados clínicos e laboratoriais convencionais foram pesquisados no

prontuário dos pacientes, sendo considerados dados iniciais aqueles próximos ao

momento da biópsia renal e dados finais os da data do último seguimento.

Não foi possível recuperar os dados de progressão de 2 pacientes com os

polimorfismos rs4821480 e rs2032487 e de 3 pacientes com o polimorfismo

rs3752462.

Os pacientes que já se encontravam em tratamento dialítico ao diagnóstico e

não recuperaram função renal foram analisados em separado. Pacientes com menos

de 3 meses de seguimento no HC-FMUSP foram excluídos da análise.

Um flare renal foi definido como:

 

Pacientes e Métodos 26  (i) a recorrência ou o desenvolvimento de síndrome nefrótica (albumina sérica

≤3,5 g/dL e proteinúria 24 h ≥ 3 g/ dia);  

(ii) aumento maior que 30% da creatinina sérica dentro de um período de 1 mês,

diretamente atribuídas ao lúpus;

(iii) um aumento de três vezes na proteinúria 24 h, dentro de um período de 3

meses, acompanhado de hematúria microscópica (> 10 hemácias p/C) e

redução ≥ 33% do nível sérico de C3, dentro de um período de 3 meses

(aplicável apenas aos doentes com proteinúria de 24 h entre 0,5 g e 1 g).68

Remissão completa foi definida por proteinúria de 24 h menor que 0,3g, com

sedimento urinário normal e valores de creatinina sérica até 15% acima do

valor normal, em qualquer momento do seguimento.

Remissão parcial foi definida por proteinúria de 24 h entre 0,3 g e 2,9 g, ou

uma queda da proteinúria > 50% do basal nos pacientes nefróticos, em qualquer

momento do seguimento. A função renal devia se manter estável no período

analisado.

A falência de tratamento foi considerada quando os valores de proteinúria de

24 h fossem maiores que 3 g ou entre 0,3 g e 2,9 g, com albumina menor que 3 g/dl,

queda do clearence de creatinina maior que 15% em relação ao valor basal ou

interrupção do tratamento por efeitos colaterais.69

Foram avaliados marcadores sorológicos como: fator anti-núcleo (FAN),

complementos, anti-DNA e anticorpo anti-fosfolípide (anticorpo anti-cardiolipina IgG

e IgM e anticoagulante lúpico), assim como histopatológicos: índice de atividade e

cronicidade e presença de crescentes celulares no momento da biópsia renal.

 

Pacientes e Métodos 27

Também foram avaliados pelo Laboratório Central do Hospital das Clínicas da

Faculdade de Medicina de São Paulo os marcadores bioquímicos convencionais:

creatinina, uréia, proteinúria de 24 h, hemograma, colesterol total e frações,

triglicérides, proteínas totais e frações, urina I, proteína C reativa e velocidade de

hemossedimentação, como exames de rotina do paciente.

A função renal foi avaliada pela dosagem sérica de creatinina, sendo definidos

os pacientes com insuficiência renal aqueles portadores de creatinina acima de 1,2

mg/dL.

Foram excluídos tanto pacientes diabéticos quanto portadores de sorologia

positiva para Hepatite B, C ou HIV.

Como marcador da atividade clínica, foi utilizado o escore de SLEDAI e como

marcador de progressão da doença renal foi utilizada a duplicação de creatinina sérica

e/ou instalação de insuficiência renal dialítica em relação ao tempo de seguimento.

O protocolo foi aprovado pela Comissão de Ética do Hospital das Clínicas da

FMUSP e os pacientes deram seu consentimento mediante informações prévias.

Para análise estatística foi usado o software SPSS, sendo utilizados ANOVA

variáveis contínuas paramétricas e o teste do qui-quadrado para variáveis categóricas.

As análises de sobrevida foram feitas através de curvas de Kaplan Meier e regressão

de Cox. Para as análises gênicas foram utilizados os softwares Haploview para

Windows (Broad Institute MIT/ Harvard) e Haplostat 3.0 (Harvard). Todos os testes

foram bi-caudais com nível de significância de 0,05.

     

 

Pacientes e Métodos 28    

4.1 Análise do polimorfismo do gene do MYH9 por reação de cadeia

polimerase genômica

Todos os pacientes foram submetidos à genotipagem dos polimorfismos do

gene MYH9.

Amostras de sangue total periférico foram colhidas em seringas contendo

ácido etilenodiamina tetra-acético (EDTA). O DNA genômico foi extraído por meio

da técnica salting-out, que utiliza uma solução de NaCl saturada.

Oito (8) ml de sangue foram transferidos para um tubo de 50ml e o volume

completado para 30ml com tampão A (1mM NH4HCO3 + 144mM NH4Cl). A

mistura foi agitada em vórtex por 20 segundos e deixada a 4°C por 10 minutos. Em

seguida o material foi centrifugado a 4°C por 10 minutos a 3000 rpm. O sobrenadante

foi descartado e o pellet foi submetido ao mesmo procedimento descrito acima.

O sedimento leucocitário foi finalmente ressuspenso em 3 mL de tampão B (10

mM Tris-HCl pH 8 + 400 mM NaCl 2 mM Na2EDTA pH 8) + 200 µl de SDS 10% +

500 µl de tampão C (50 µl de SDS 10% + 2µl de Na2EDTA 0,5 M pH 8 + 488 mL de

água destilada) com proteinase K (2 µl de proteinase K 20 mg/mL diluída em 5 mL de

tampão C) e deixado a 37°C por aproximadamente 12-18 horas.

A segunda parte do protocolo começa com a adição de 1 mL de solução D

(NaCl 6M), vigorosamente agitada em vórtex por 1 minuto e em seguida centrifugada

a 4°C por 20 minutos a 3000 rpm. O sobrenadante foi transferido para um tubo de 15

mL e a ele foi adicionado 10 mL de etanol absoluto gelado. Com uma leve agitação já

 

Pacientes e Métodos 29

se nota a precipitação do DNA que pode ser "pescado" e transferido para um

eppendorf de 1,5 mL de capacidade contendo 1 mL de etanol 70% gelado. O

eppendorf foi então centrifugado a 4°C por 15 minutos a 13500 rpm, o etanol

descartado e o sedimento (DNA) deixado a temperatura ambiente até ser totalmente

seco. Em seguida, este pellet é ressuspenso em 1 ml de TE (10 mM Tris- HCl pH 8 +

1 mM EDTA pH 8).

Após a completa diluição, a determinação da concentração do DNA foi

realizada diluindo-se 20 µl do material em 980 µl de TE e em seguida a mistura foi

submetida à leitura em espectrofotômetro no comprimento de onda de 260 nm. A

concentração final foi corrigida para 100 ng/µl.

A identificação do polimorfismo do MYH9 foi realizada através da técnica

de reação em cadeia da polimerase associada a polimorfismo de fragmentos de

DNA, obtidos por enzima de restrição (PCR-RFLP), por meio de primers

específicos.

rs4821481:CTCACGGCTGGCAAAGAAGAGCTTTC[C/T]AGAGGGGAAA

GGACAAACCCTTCCC

rs2032487:AGAGGCTGCCACACGGCGCTCACCTG[C/T]GCCACCAGG

CCACCTTCTCCGTGCC

rs4821480:ATTTTCCTAGATCAAAGGATAATTTT[G/T]AAAGGTCACG

AGCTCCCCTGAAACA

rs3752462:CAGGTGTGAGGTCAAAGCAAGCCTGG[C/T]ACTCACTGG

CTTCTCAATGAGGTCG

Após extração de DNA genômico, os genótipos do polimorfismo do gene

 

Pacientes e Métodos 30

MYH9 foram determinados através de análise de restrição alelo-específica.

A reação de polimerase em cadeia foi realizada após etapa inicial de

desnaturação a 95oC por 5 minutos, seguida de 35 ciclos caracterizados pelas

seguintes temperaturas: 95oC por 1 minuto, 54oC por 1 minuto, e 72oC por 1 minuto.

Ao final dos ciclos utilizou-se 7 minutos de extensão a 72oC. Após

amplificação digestão enzimática utilizando a endonuclease de restrição RsaI foi

realizada no material amplificado.

O genótipo na posição MYH9 foi identificado através da observação de

padrão de digestão específico para cada genótipo em gel de agarose na concentração

de 2.5%, corado em brometo de etídio na concentração de 50µg/mL.

 

5. RESULTADOS

 

Resultados 32

5. RESULTADOS

Foram admitidos no estudo 196 pacientes do sexo feminino, cujas

características clínico-laboratoriais estão descritas na tabela 2.

Os pacientes eram adultos jovens (média de 28,6 anos), com freqüência de

33% de negros ou pardos, com uma atividade lúpica sistêmica e renal intensas

(SLEDAI médio de 21 e SLEDAI renal médio de 9,1).

A doença renal era acompanhada de perda de função renal (creatinina média

1,6 g/dL e a mediana do MDRD de 50,8 ml/min) e síndrome nefrótica (mediana da

proteinúria de 3,9 g/dia).

 

Resultados 33

À histologia renal, os achados de atividade predominavam (atividade média de

4,2), porém já com achados de cronicidade (cronicidade média de 3,0), expresso pelo

encontro de fibrose túbulo-intersticial acima de 50%, presente em 9% da população.

Entre os 196 pacientes admitidos no estudo 19 se apresentaram em hemodiálise

e em nenhum momento do seguimento recuperaram função renal, sendo estudados em

separado e excluídos da análise de pacientes progressores.

O perfil clínico-laboratorial desse grupo, assim como o dos pacientes com

função renal presente, está na tabela 3.

Comparando-se os dois grupos constatamos que os pacientes dialíticos

mostravam-se frequentemente mais hipertensos (100% vs 74,6%, p=0,008), possuíam

uma creatinina inicial mais elevada (6,9 mg/dL vs 1,5 mg/dL, p< 0,001), à biópsia

renal o índice de cronicidade era mais elevado (7 x 2, p=0,001) e com maior

frequência de fibrose extensa do interstício (26% x 7,3%, p=0,006).

 

Resultados 34

Excluindo-se os pacientes dialíticos à entrada do estudo, dividiremos a

população, 177 pacientes, em dois grupos quanto ao seu desfecho no seguimento:

progressores e não progressores. Suas características ao início do seguimento estão na

tabela 4.

Ao longo do seguimento 43 pacientes (24%) apresentaram o desfecho clínico

de duplicar sua creatinina inicial ou necessitar de tratamento dialítico crônico.

Pacientes progressores e não progressores não diferiram quanto a apresentação

das classes histológicas: III+IV (72,1% vs 62,7%) e V (23,3% vs 36,6%).

Pacientes progressores apresentaram-se com maior freqüência hipertensos

(86% vs 70,9%, p=0,05), maior SLEDAI renal à apresentação inicial (10 vs 8,9

 

Resultados 35

p=0,04), maior índice de cronicidade renal à biópsia (5 vs 2, p<0,001) e mais

crescentes fibroblásticos, além de maior frequência de reativações da doença renal

(flare renal) (82,9% x 53,8%, p=0,002), bem como de menores índices de remissão

completa ou parcial (p<0,0001).

Na análise do desequilíbrio de ligação, pelo modelo de Hardy-Weinberg, ficou

demonstrado que os 4 polimorfismos segregam conjuntamente, ou seja, em forma de

haplótipo (Figura 2).

Estudando separadamente cada polimorfismo do gene MYH9 apenas o

rs3752462 mostrou-se associado ao risco para progressão da doença renal (p=0,03). O

estudo de cada polimorfismo do haplótipo E1 do gene MYH9 está na tabela 5.

 

Resultados 36

No entanto quando avaliamos os alelos de risco dos mesmos polimorfismos

estudados não encontramos associação com risco de progressão da doença renal

(tabela 6).

 

Resultados 37

Estudamos então possíveis associações entre parâmetros clínico-laboratoriais

dos pacientes e a distribuição gênica em cada um dos polimorfismos associados.

Com relação aos polimorfismos rs4821480, rs4821481 e rs2032487

observamos uma

segregação racial, com menos pacientes pardos e negros portando os alelos de risco

do MYH9. Não houve nenhuma outra associação com parâmetros clínicos e

laboratoriais, assim como quanto à sobrevida renal, como estão nas tabelas 7,8 e 9 e

figuras 2, 3 e 4.

 

Resultados 38

 

Resultados 39

 

Resultados 40

 

Resultados 41

 

Resultados 42

Na análise do polimorfismo rs3752462, observamos uma associação do

desfecho primário com os pacientes do grupo TT/CT. Constatamos também uma

tendência (porém sem significância estatística) de associação da mesma distribuição

genotípica com valores de creatinina sérica inicial. Não houve relação com a raça

(tabela 10).

 

Resultados 43

Com relação à sobrevida renal houve uma tendência (p=0,05) de portadores

dos genótipo TT/CT evoluírem com mais eventos do que o grupo CC. (Figura 6)

 

Resultados 44

Com relação ao haplótipo de risco GCCT constatamos que ele se encontrava

presente em 28,5% dos pacientes progressores e em 18,5% dos pacientes não

progressores, o que confere um OR 1,76 (IC 1,02 a 3,0) ao paciente com esse

haplótipo em apresentar o desfecho DC/DRC.

Nenhum dos outros haplótipos se associou ao maior risco de doença renal

progressiva (Tabela 11).

 

Resultados 45

Considerando-se agora os pacientes que necessitaram de hemodiálise à

admissão e não apresentaram melhora da função renal com o tratamento instituído

constatamos que o polimorfismo rs3752462 também mostrou uma associação

(p=0,003) com uma doença mais grave, o quê não foi encontrado quando analisamos

os outros polimorfismos gênicos. (tabela 12)

 

Resultados 46

 

6. DISCUSSÃO

 

Discussão 48

6. DISCUSSÃO

O LES é uma doença de etiologia auto-imune, sendo a base do seu tratamento

o uso de imunossupressores. Porém alguns pacientes mesmo com a supressão de

atividade imunológica sistêmica evoluem com perda progressiva de função renal.

Estudos que abordam mecanismos não imunológicos de progressão da nefrite lúpica

são escassos na literatura.

Levey et al, avaliou por um tempo médio de 6,5 anos 59 pacientes com nefrite

lúpica que evoluíram com DC/DRCT, sendo que 64,4% deles iniciaram a terapia renal

substitutiva apesar da supressão da atividade imunológica de doença.70

Estudo de histomorfometria renal, realizado com biópsias seriadas (tempo 0,

com 12 e 36 meses) em 10 pacientes tratados com irradiação linfóide total e

corticosteróides, mostrou aos 12 meses um aumento significativo da área do tufo

glomerular, apesar do menor índice de atividade renal sendo que aos 36 meses 57%

dos glomérulos apresentavam nefroesclerose global, com os glomérulos restantes

apresentando um aumento de 59% em sua área, sugerindo que o mecanismo de

hipertensão intra-glomerular possa ser ser importante na progressão não imunológica

do LES.71

Entre outros fatores não imunológicos relacionados ao risco de progressão da

nefrite lúpica estão a etnia do paciente, com pacientes negros e hispânicos evoluindo

com mais frequência para DC/DRCT do que pacientes caucasianos.10

Nesta linha de investigação estudos realizados por mapeamento de

miscigenação e por associação de varredura genômica mostraram haver uma maior

 

Discussão 49

prevalência de genes do cromossomo 22q, onde se localiza o MYH9, em pacientes

negros e portadores de insuficiência renal crônica.72,73

Nossos resultados mostram associação significativa (p=0,02) da etnia não

branca com os genes GT/TT do rs4821480 e uma associação limítrofe (p=0,05) com

os genes CT/TT do rs4821481. Estas populações, no entanto, não expressam nenhuma

associação com desfechos, nem com perfil clínico e laboratorial renal.

Esses dados não nos surpreendem dada a alta miscigenação da população

brasileira, com uma composição étnica composta por uma vasta gama de populações

ancestrais.

Estudo de Parra et al74 dividiu 173 pessoas como brancas, pardas ou negras

analisando 5 características fenotípicas (cor da pele e cabelo, espessura capilar, tipo do

nariz e lábios) e a seguir determinou geneticamente o grau de ancestralidade africana

das populações e não encontrou diferença entre elas.

Uma segunda parte do estudo analisou 200 pessoas de várias regiões

geográficas do Brasil que se auto-declaravam brancas. Constatou-se que seu índice de

ancestralidade africana foi semelhante aos de negros e pardos com a avaliação

fenotípica prévia.

Corroborando esses dados um estudo de Lins et al75 avaliando 28 SNP’s, que

trazem informações de ancestralidade, mostrou que indivíduos puros são

extremamente raros e em média, um Brasileiro possui como principal contribuição

gênica, a européia (77%), seguida da africana (14%) e em último lugar a contribuição

ameríndia (0,8%).

 

Discussão 50

Estes estudos mostram que a cor da pele é um mau preditor de ancestralidade

no Brasil.

Avaliando agora, nossos resultados do estudo genético em relação a progressão

da doença renal, observamos que apenas pacientes com o polimorfismo rs3752462

mostram associação com desfecho renal (duplicação de creatinina/ hemodiálise) ao

longo do seguimento. Os outros polimorfismos estudados rs4821480, rs4821481 e

rs2032487 não mostraram associação com desfechos.

Dados de literatura demonstram associação entre o gene MYH9 e doenças bem

estabelecidas como síndrome de Fechtner e Epstein.54 Nestas situações aventam-se

alterações da proteína codificada por este gene e normalmente expressa em podócitos.

76,77

É sabido que a proteína codificada pelo gene MYH9, a miosina não muscular

IIA (NMM-IIA) tem uma ação bem estabelecida em fibroblastos. Ela atua

estabilizando o citoesqueleto, mantendo sua polaridade e estrutura tridimensional e

participando na sua contração, através da conexão com filamentos de actina. Sofre

modulação das forças de tração exercidas pelo meio.78,79 No rim já foi demonstrada

expressão da NMM-IIA em podócitos, capilares peritubulares e túbulos.77

Assim sendo a desorganização do citoesqueleto do podócito causado pela

mutação da NMM-IIA, com a quebra na barreira de filtração glomerular seria um

possível mecanismo na microalbuminúria e na esclerose glomerular, mas isso ainda

requer comprovação experimental.

Com a realização da genotipagem e sequenciamento do gene MYH9 dez SNP’s

(single nucleotide polymorphism -SNP), foram encontrados em indivíduos que

 

Discussão 51

apresentavam doença renal crônica. Três deles se segregam de forma conjunta,

formando 3 haplótipos distintos (E, S e F).

O haplótipo E1 consiste na presença dos nucleotídeos G/C/C/T,

respectivamente dos polimorfismos rs4821480, rs2032487, rs4821481 e rs3752462.

Esse haplótipo foi o mais relacionado com a doença renal crônica progressiva, sendo

fator de risco para a doença renal crônica não diabética,73 a nefropatia do HIV58 e a

GESF idiopática.80

Ainda quanto aos nossos resultados em relação aos nossos pacientes

progressores observamos que na análise do desequilíbrio de ligação pelo modelo de

Hardy-Weiberg podemos afirmar que os 4 polimorfismos se segregam de forma

conjunta como um haplótipo e apresentam uma prevalência significativa nessa

população (28,5%), sendo ainda um fator de risco importante para o desfecho

DC/DRC, com um OR de 1,7 (IC95% 1,02 a 3,02).

Considerando-se agora o grupo de pacientes lúpicos que abriram a nefrite de

forma extremamente agressiva e chegaram a nós já em diálise, sem nunca recuperarem

função renal, observamos também uma associação desses pacientes com o

polimorfismo gênico rs3752462. Este achado associado ao de pacientes progressores

nos permite sugerir que na nossa população este polimorfismo gênico se associa a

duas características clínicas dos pacientes: abertura da doença mais grave e nos

pacientes com função renal preservada, maior índice de progressão.

Pesquisa na literatura mostrou que apenas um estudo avaliou pacientes

portadores de LES em relação ao gene MYH9 e conseguiu encontrar associação deste

gene apenas com pacientes com nefrite lúpica que já se encontravam em diálise, mas

 

Discussão 52

não em pacientes que estavam com nefrite lúpica em atividade.64 Os pacientes

analisados eram bastantes heterogêneos entre si, com variados graus de nefrite lúpica

entre os grupos. Em 318 pacientes foi feita uma análise transversal e apenas 39

pacientes apresentavam seguimento, permitindo análise por um período médio de 2

anos.

Ainda existem dúvidas na literatura se os polimorfismos do MYH9 possam ser

realmente os causadores da doença renal progressiva, isso porque os polimorfismos do

haplótipo E1 do MYH9 estão presentes apenas em íntrons, o quê não deve levar

alteração na proteína codificada pelo gene.

Para tentar explicar esse fato especula-se que possa ocorrer um splicing

alternativo, específico para podócitos; os RNA mensageiros apresentem meias-vidas

mais curtas, ou haja um micro-RNA localizado dentro de um íntron.81

Um estudo recente de Genovese82 avaliou uma maior extensão cromossômica

do cromossomo 22 e encontrou que uma região anterior a do gene do MYH9, distante

apenas 20 Kbases, apresentava uma associação 35 vezes mais forte (p=10-63) com a

doença renal crônica.

Nesta região descrita 2 polimorfismos o rs73885319 e o rs6090145 eram os

responsáveis pelo maior risco. Ambos polimorfismos levam a mutações missense do

gene da apolipoproteína L1 (APOL1).

Genovese et al82 demonstram que o gene APOL1 é predominante em relação

ao MYH9 em estudos de GESF/HAS, em negros americanos, já que tratamentos

estatísticos destes estudos demonstram que o MYH9 é uma variável de confusão.

 

Discussão 53

Estudos populacionais demonstram que esse gene passou por uma seleção

positiva relativamente recente (<10.000 anos), pela alta prevalência na população

africana (40%).

A APOL1 é um fator tripanolítico, conferindo resistência à infecção pelo

Trypanossoma brucei.83

Esta infecção ocorre na região subsaariana, e é transmitida pela mosca Tse Tse,

causando a doença do sono. As regiões de ocorrência do gene APOL1 e da doença são

totalmente superponíveis, estabelecendo um possível fator causal da maior prevalência

desse gene na população negra.80

A APOL1 também esta envolvida nas vias de autofagia sendo esse um dos

mecanismos sugeridos de estabilização podocitária, pois a perda de fatores autofágicos

leva em ratos ao acúmulo de proteínas de estresse oxidativo, que levam a perda

podocitária, proteinúria e glomerulosclerose.83

Contudo ainda faltam publicações que esclareçam melhor o papel da APOL1 em

doenças renais.

Nosso trabalho é o primeiro da literatura que estudou o polimorfismo gênico

do MYH9 em que todos os pacientes apresentavam nefrite lúpica confirmada por

biópsia renal, além de apresentarem uma atividade renal intensa (MDRD médio de 50

ml/min, com uma proteinúria de 24 horas média de 3,9g), e seguidos em média por

apresentando um tempo de seguimento médio de 73,2 meses, o quê permitiu

identificar fatores de progressão da doença renal. Foi assumido como desfecho

duplicação da creatinina ou necessidade de hemodiálise.

 

Discussão 54

No nosso estudo houve uma taxa de progressão, com duplicação da creatinina

ou necessidade de hemodiálise em 24% dos pacientes, com um tempo médio para a

progressão de 61,9 meses. Esse grupo apresentava maior cronicidade à biópsia renal (5

vs 2, p<0,0001), mais eventos de reatividade renal (63% vs 23%, p=0,002) e menor

taxa de remissões com o tratamento imunossupressor (p<0,0001). Tais características

clinícas são relatadas previamente em literatura como fatores de risco para uma pior

evolução da nefrite lúpica.84,85

As limitações a esse estudo referem-se à análise retrospectiva dos dados, a

difícil diferenciação entre a progressão renal causada pela atividade imunológica, ou

pela doença renal progressiva não imune.

Apesar da maior presença de flares renais no grupo progressor (82,9% vs

53,8%, p=0,002), quando estudamos os diversos polimorfismos gênicos a

característica flare renal se dissipa. Observando as tabelas 7, 8, 9 e 10 verificamos

que não houve associação entre os diferentes genótipos e o número de reatividades

renais, mesmo no polimorfismo rs3752462, onde o genótipo TT/CT se associa ao

desfecho primário.

Assim sendo acreditamos que indivíduos com polimorfismo do haplótipo E1,

do gene MYH9 tenham característica independente de outros fatores para desenvolver

doença renal progressiva.

 

7. CONCLUSÕES

 

Conclusões 56

7. CONCLUSÕES

1. Os polimorfismos gênicos rs4821480, rs2032487, rs4821481 do gene MYH9

não mostraram associação com parâmetros funcionais renais dos pacientes ao

início do estudo e nem com o desfecho renal (duplicação creatinina/ diálise).

2. A etnia não branca esteve associada aos genótipos GT/TT do gene rs4821480 e

CT/TT do gene rs4821481.

3. Os pacientes com genótipos TT/CT do gene rs3752462 mostraram associação

com desfecho renal ao longo do seguimento.

4. O haplótipo de risco GCCT dos 4 polimorfismos estudados esteve presente em

28,5% dos pacientes progressores e 18,5% dos não progressores, com OR 1,79

para progressão.

5. Houve associação dos genótipos TC/TT do rs3752462 com a gravidade da

apresentação clínica do pacientes (em hemodiálise) ao início do estudo.

 

8. ANEXOS

 

Anexos 58

Anexo1

CRITÉRIOS REVISADOS PARA A CLASSIFICAÇÃO DO LES (1982)

• Rash malar

• Rash discóide

• Fotossensibilidade

• Úlceras orais

• Artrite

• Serosite (Pleurite ou pericardite)

• Doença Renal (Proteinúria ou cilindruria)

• Doença Neurológica (Convulsão ou psicose)

• Doença Hematológica (Anemia hemolítica, leucopenia, linfopenia ou

trombocitopenia)

• Alteração Imunológica (anti-dsDNA ou anti-Sm positivo ou teste sorológico

para sífilis falso positivo, ouanticardiolipina IGM ou IgG, ou anticoagulante

lúpico positivo)

• Anticorpo Anti-nuclear

 

Anexos 59

Anexo 2

Systemic Lupus Erythematosus Disease Activity Index (SLEDAI)

Os itens constantes do SLEDAI com suas respectivas pontuações são os

seguintes: convulsões (8), psicose (8), síndrome cerebral orgânica (8), distúrbios

visuais (8), alterações dos nervos cranianos (8), cefaléia do LES (8), acidente

cerebrovascular (8), vasculite (8), artrite (4), miosite (4), cilindros urinários (4),

hematúria (4), proteinúria (4), piúria (4), novo “rash” (2), alopécia (2), úlceras de

mucosa (2), pleurite (2), pericardite (2), complemento baixo (2), positividade para

anticorpos anti-DNA ou aumento de título, de acordo com o método utilizado para sua

determinação) (2), febre (1), trombocitopenia (1), leucopenia (1).

 

9. REFERÊNCIAS

 

Referências 61

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