indução e caracterização molecular de mutantes pcr banco sementes detecção mutação ems x...
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Indução e caracterização molecular de mutantes
PCR
Banco sementes
Detecçãomutação
EMS
XSequenciam.
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Vantagens do TILLING• Produz grande especro de mutações
pontuais (alélicas)
• Eficiente para genes pequenos
• Pode focar em regiões de interesse
• Aplicável para qualquer organismo
• Não transgênico
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Detecção enzimática da mutação
CEL I
*
*
1 CA Oleykowski, CRB Mullins, AK Godwin & AT Yeung, ‘Mutation detectionusing a novel plant endonuclease’ Nucleic Acids Res. 26:4597 (1998)
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IRD 700 IRD 800
Mapeamento de final duplo
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TILLING com alta capacidade Banco de sementes
PCRDigestão com Cel I
**
**
**
**
Desnat.
-
+
gel, scan-
-
Primers gene específicos
Pool de DNA
EMS
X X
X X
**
**
**
**
-
+
-
-
Identificar mutantes
seleçãoindivíduos
PCR
Sequenciar
Desnat. eRenatur.
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A typical 8-fold pool TILLING gel
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GelBuddy calls the lanes
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GelBuddy calibrates the lanes
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Mark the bands
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Mark the bands
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GelBuddy reports fragment sizes
Zerr and Henikoff, NAR, 33;2806, 2005
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•384 well liquid handling
•8 Li-Cors
•8x pooling
•Production capacity = 12,000 samples/day
•With amplicons of 1500bp = ~ 16 Mb/day
Projeto TILLING Seattle
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PARSESNP*
(Project Aligned Related Sequences and Evaluate SNPs)
Taylor & Greene, NAR 31:3808, 2003
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Two-dimensional arraying
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EMS or MNUor MNU+NaN3
M3 seed
bank DNA and seed
M1
M2
flower seed
Mutagenesis
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Distribution of 1890 mutations in 192 TILLed fragments
number of sequenced mutations per fragment
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A:T<>G:C
GAA simple repeat:5 <> 6
<> indel 9 nt
Types of polymorphisms identified
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• >99% G:C to A:T transitions• 55 repeated mutations observed, ~56 expected
996bp
=repeated mutation
EMS mutagenesis results in:
C
Exp Exp Exp
• some local bias
G->A
A
T
G
-2 -1 +1 +2
ExpObs Obs ObsObs