indicadores microbiológicos da qualidade do solo · principais grupos microbianos do solo rupo...

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Indicadores Microbiológicos daIndicadores Microbiológicos daIndicadores Microbiológicos daIndicadores Microbiológicos da

Qualidade do SoloQualidade do Solo

Marco Antonio NogueiraMarco Antonio NogueiraMariangela HungriaMariangela Hungria

EMBRAPA EMBRAPA –– SojaSojaLaboratório de Biotecnologia do SoloLaboratório de Biotecnologia do Solo(tel. 43 3371 6081; [email protected])(tel. 43 3371 6081; [email protected])

Maio 2013Maio 2013

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O que veremos nesta manhã?O que veremos nesta manhã?

Solo e ambiente: sustentabilidade.Solo e ambiente: sustentabilidade.O ã bi i di d ?O ã bi i di d ?O que são bioindicadores?O que são bioindicadores?Para que servem?Para que servem?Indicadores físicos, químicos e microbiológicos.Indicadores físicos, químicos e microbiológicos.Relações entre os indicadoresRelações entre os indicadoresRelações entre os indicadores.Relações entre os indicadores.Bioindicadores baseados em métodos clássicos.Bioindicadores baseados em métodos clássicos.Bioindicadores baseados em técnicas moleculares: PCRBioindicadores baseados em técnicas moleculares: PCR--DGGE, metagenômica.DGGE, metagenômica.Como interpretar dados baseados em bioindicadores de Como interpretar dados baseados em bioindicadores de qualidade do solo de amostras ambientais?qualidade do solo de amostras ambientais?

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Origem dos metazoár ios

( + de 500 milhões de anos atrás)Pré Cambriano

Cambr ianoEvolução morfológica dos metazoár ios

Era dos dinossauros0

120 , %

MicrorgaMicrorga--nismos:nismos:D i m D i m

de a

nos

Or igem dos fototróficos

Ambiente oxigênico

Desenvolvimento da camada de ozônio

Endossimbiose

Or igem dos eucar iotosmodernos

Origem dos metazoár ios1

2

10

1

0,1 O2 n

a at

mos

fera

,Da origem Da origem da vida aos da vida aos dias atuaisdias atuais

Bilh

ões

Diversificaçãomicrobiana

Origem dos fototróficosoxigênicos (cianobactér ia)

Or igem da vida

Eubactér ia

Arqueobactér iaLinhanuclear3

,

g

Evolução química

Formação da ter ra(cerca de 4,5 bilhões de anos atrás)

Síntese fotoquímicade moléculas orgânicas4 Anóxica

Adaptado de Brock, 1997.

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OO solosolo nana visãovisão simplistasimplista“Parte“Parte superficial,superficial, nãonão consolidada,consolidada, dodomantomanto dodo intemperismo,intemperismo, aa qualqual encerraencerramatériamatéria orgânicaorgânica ee vidavida bacteriana,bacteriana, ee

ibilitibilit d l i td l i t dd l tl t ””possibilitapossibilita oo desenvolvimentodesenvolvimento dasdas plantasplantas..””

(Aurélio Buarque de Holanda Ferreira)(Aurélio Buarque de Holanda Ferreira)

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O solo na visão do microbiologistaO solo na visão do microbiologistaAmbiente microbiológico, um meio de Ambiente microbiológico, um meio de cultura complexo com as mais variadas cultura complexo com as mais variadas cultura complexo com as mais variadas cultura complexo com as mais variadas interações entre seus habitantes;interações entre seus habitantes;Cada organismo do solo funciona como um Cada organismo do solo funciona como um órgão em um animal, excretando, órgão em um animal, excretando, t f d d b tâ i d t f d d b tâ i d transformando e removendo substâncias do transformando e removendo substâncias do ambiente, modificandoambiente, modificando--o. A água faz o o. A água faz o papel do sangue. papel do sangue. (Quastel, 1946)(Quastel, 1946)

Local onde a biosfera interage com a Local onde a biosfera interage com a Local onde a biosfera interage com a Local onde a biosfera interage com a litosfera, hidrosfera, atmosfera e a litosfera, hidrosfera, atmosfera e a “detritosfera”“detritosfera”

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Funções do soloFunções do solo

Propiciar desenvolvimento Propiciar desenvolvimento vegetal e microbiano e vegetal e microbiano e animal;animal;Regulador do ciclo Regulador do ciclo Regulador do ciclo Regulador do ciclo hidrológico;hidrológico;Atuar como tampão e Atuar como tampão e depurador por imobilizar e depurador por imobilizar e degradar compostos degradar compostos

t i l t j di i i t i l t j di i i potencialmente prejudiciais potencialmente prejudiciais ao ambiente.ao ambiente.

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Solo: sistema deSolo: sistema detrês fasestrês fases

RecursoRecurso naturalnatural fundamentalfundamental;;S lS l s dá ls dá l xx s st nt bilid ds st nt bilid d ddSoloSolo saudávelsaudável xx sustentabilidadesustentabilidade dedeagroecossistemasagroecossistemas ee sistemassistemas naturaisnaturais;;VulnerávelVulnerável:: 100100--400400 anosanos parapara formarformar 11 cmcm;;“O“O solosolo éé umum sistemasistema vivo,vivo, dinâmicodinâmico ee complexo,complexo,vitalvital parapara oo funcionamentofuncionamento dosdos ecossistemasecossistemasvitalvital parapara oo funcionamentofuncionamento dosdos ecossistemasecossistemasterrestresterrestres..””

(Doran et al., 1996)(Doran et al., 1996)

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Microrganismos na formação do soloMicrorganismos na formação do solo

Mecanismos: Ácidos orgânicos; COMecanismos: Ácidos orgânicos; CO22..

Entrada de N e C (possibilita o estabelecimento de outras Entrada de N e C (possibilita o estabelecimento de outras formas de vida).formas de vida).

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Microrganismos na formação do soloMicrorganismos na formação do solo

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Solo: grande diversidade de habitatsSolo: grande diversidade de habitats

Prec

ipita

ção

(mm

)

Tem

pera

tura

(ºC

) Vegetação

Al2O3Fe2O3 + Al2O3

Ord

ens

de s

olo

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Solo: DiversidadeSolo: Diversidade

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Em 1 g de terra: número de microrganismos Em 1 g de terra: número de microrganismos equivalente à população do planeta: equivalente à população do planeta: atividade.atividade.

(D l 1996)(Doran et al., 1996)

http://picasaweb.google.com/lh/view?q=microorganism&psc=G&filter=1&hl=pt-BR#5748592490233185138

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A biota do soloA biota do solo

Representa o carbono “vivo” do solo, de 1 a 5% da matéria orgânica do Representa o carbono “vivo” do solo, de 1 a 5% da matéria orgânica do solo (coeficiente microbiano solo (coeficiente microbiano qqMic).Mic).

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A maior parte da biodiversidade não está ACIMA, A maior parte da biodiversidade não está ACIMA, mas DENTRO do solomas DENTRO do solo

arti

nês

Foto

: A.M

. Ma

O que os olhos não veem o coração não sente?O que os olhos não veem o coração não sente?

Nem a mente compreende? Nem a mente compreende? Elke J.B.N. CardosoElke J.B.N. Cardoso

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Só conhecemos a ponta do Iceberg…Só conhecemos a ponta do Iceberg…

CultiváveisCultiváveis

Não cultiváveisNão cultiváveis

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Um ecossistema sustentável depende do fluxo de Um ecossistema sustentável depende do fluxo de t i t l d í i t ófi di d t i t l d í i t ófi di d

Microrganismos e sustentabilidadeMicrorganismos e sustentabilidade

nutrientes ao longo dos níveis tróficos, mediado por nutrientes ao longo dos níveis tróficos, mediado por microrganismos que atuam na transformação e microrganismos que atuam na transformação e mineralização da matéria orgânica do solo.mineralização da matéria orgânica do solo.Chen et al. (2003) Chen et al. (2003)

maior flutuação da maior flutuação da

AutossustentávelAutossustentávelEquilíbrioEquilíbrio

maior flutuação da maior flutuação da temperatura e umidade temperatura e umidade

do solodo soloerosão eólica e hídricaerosão eólica e hídrica

compactaçãocompactação

teor de matéria teor de matéria

Vegetação Vegetação clímaxclímax

EquilíbrioEquilíbrio

DesmatamentoDesmatamento PerturbaçãoPerturbação

teor de matéria teor de matéria orgânica do solo orgânica do solo

atividade microbianaatividade microbiana

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Uso do solo e diminuição na diversidade e atividade Uso do solo e diminuição na diversidade e atividade microbianamicrobiana

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Microrganismos como patógenos...Microrganismos como patógenos...

MicrorganismoMicrorganismo DescriçãoDescrição EfeitoEfeito

Bacillus anthracisBacillus anthracis

Clostridium botulinumClostridium botulinum

Clostridium perfringensClostridium perfringens

G (+), aeróbico, bastonete esporulanteG (+), aeróbico, bastonete esporulante

G (+), anaeróbico, bastonete esporulanteG (+), anaeróbico, bastonete esporulante

G (+) anaeróbico bastonete esporulanteG (+) anaeróbico bastonete esporulante

AntrazAntraz

BotulismoBotulismo

GangrenaGangrena gasosagasosaClostridium perfringensClostridium perfringens

Clostridium tetaniClostridium tetani

Pseudomonas aeruginosaPseudomonas aeruginosa

Aspergillus fumigatusAspergillus fumigatus

Aspergillus flavusAspergillus flavus



G (G (--), aeróbico, bast. não), aeróbico, bast. não--esporulanteesporulante

Deuteromiceto, filamentoso, septadoDeuteromiceto, filamentoso, septado

Deuteromiceto filamentoso septadoDeuteromiceto filamentoso septado

GangrenaGangrena gasosagasosa

TétanoTétano

InfecçõesInfecções

Pulmões,Pulmões, micosesmicoses

AflatoxinaAflatoxinaAspergillus flavusAspergillus flavus Deuteromiceto, filamentoso, septadoDeuteromiceto, filamentoso, septado AflatoxinaAflatoxina

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... mas os efeitos benéficos são maiores!!... mas os efeitos benéficos são maiores!!

CiclosCiclos biogeoquímicosbiogeoquímicos (ciclagem(ciclagem dede CC ee nutrientesnutrientes::C closC clos b ogeoqu m cosb ogeoqu m cos (c clagem(c clagem dede CC ee nutr entesnutr entessustentabilidadesustentabilidade dada vidavida nana Terra)Terra);;SeqüestroSeqüestro dede carbonocarbono (imobilização(imobilização nono solo)solo);;DegradaçãoDegradação dede substânciassubstâncias xenobiontesxenobiontes;;ControleControle biológicobiológico;;ControleControle biológicobiológico;;FixaçãoFixação biológicabiológica dede nitrogênionitrogênio;;MicorrizasMicorrizas;;BiorremediaçãoBiorremediação;;F tF t dd h ih i étiétiFonteFonte dede recursosrecursos parapara aa engenhariaengenharia genéticagenética..

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GG E lE l NN 11 ll BiBi (k(k hh 11))

Principais grupos microbianos do soloPrincipais grupos microbianos do solo

GrupoGrupo ExemploExemplo NNoo gg--11 solosolo BiomassaBiomassa (kg(kg haha--11))

VírusVírus TMVTMV 10101010--10101111

BactériasBactérias PseudomonasPseudomonas 101088--101099 300300--30003000

A ti b té iA ti b té i St tSt t 101077 101088 300300 30003000ActinobactériasActinobactérias StreptomycesStreptomyces 101077--101088 300300--30003000

FungosFungos AspergillusAspergillus 101055--101066 500500--50005000

AlgasAlgas ChlorellaChlorella 101033--101066 1010--15001500

ProtozoáriosProtozoários EuglenaEuglena 101033 101055 55 200200ProtozoáriosProtozoários EuglenaEuglena 101033--101055 55--200200

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Indicadores microbiológicosIndicadores microbiológicos

Efeitos de práticas de uso e manejo do solo sobre a Efeitos de práticas de uso e manejo do solo sobre a comunidade microbiana: atividade e diversidade;comunidade microbiana: atividade e diversidade;Qualidade microbiológica do solo (“saúde” do solo);Qualidade microbiológica do solo (“saúde” do solo);Avaliações de impacto ambiental;Avaliações de impacto ambiental;Avaliação do sucesso da recuperação de áreas degradadas;Avaliação do sucesso da recuperação de áreas degradadas;Avaliação do sucesso da recuperação de áreas degradadas;Avaliação do sucesso da recuperação de áreas degradadas;Estabelecer Estabelecer relações entre as propriedadesrelações entre as propriedades químicas e químicas e físicas do solo;físicas do solo;São mais “sensíveis”.São mais “sensíveis”.

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Indicadores de qualidade do solo: por Indicadores de qualidade do solo: por quê?quê?

Potencial de uso;Potencial de uso;Produtividade;Produtividade;Sustentabilidade;Sustentabilidade;Orientar manejo;Orientar manejo;Melhor uso do solo.Melhor uso do solo.

(Turco & Blume, 1999)(Turco & Blume, 1999)

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Características de um indicador Características de um indicador biológico:biológico:

Simples de obter e fácil de interpretar;Simples de obter e fácil de interpretar;Sensível a alterações impostas a um ambiente;Sensível a alterações impostas a um ambiente;Procedimentos semelhantes a análise química de Procedimentos semelhantes a análise química de Procedimentos semelhantes a análise química de Procedimentos semelhantes a análise química de solo para fins de fertilidade;solo para fins de fertilidade;Interpretação da análise química de solo: Baseadas Interpretação da análise química de solo: Baseadas em correlações e calibrações. O mesmo deve ser em correlações e calibrações. O mesmo deve ser feito para os indicadores biológicos... Trabalho!feito para os indicadores biológicos... Trabalho!Comparação com áreasComparação com áreas--referência?referência?

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O que significa um valor obtido de um O que significa um valor obtido de um indicador microbiológico?indicador microbiológico?

Alto, médio, baixo?Alto, médio, baixo?Interpretação da análise química de solo: Interpretação da análise química de solo: Baseadas em correlações e calibrações. O Baseadas em correlações e calibrações. O mesmo poderia ser feito para os mesmo poderia ser feito para os mesmo poderia ser feito para os mesmo poderia ser feito para os indicadores microbiológicos...? Trabalho!indicadores microbiológicos...? Trabalho!Comparação com áreasComparação com áreas--referência?referência?

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ã

ÁreasÁreas--referência para estudos com indicadoresreferência para estudos com indicadores

020406080

100Feijão 1 agr

Feijão 2 agr

Feijão 3 agr

F ijã 5S j

Tabaco con

Flor. Sec.

Glu

Asp

Ure

(B)

020406080

100Feijão 1 agr

Feijão 2 agr

Feijão 3 agr

Feijão 5 agrS oja con

Tabaco con

.F lor. S ec

Cel

Ami

(A)

FiguraFigura.. AtividadeAtividade enzimáticaenzimática relativarelativa ((%%)) considerandoconsiderando umauma áreaárea sobsob florestaflorestasecundáriasecundária ((FlorFlor.. SecSec..)) comocomo referênciareferência ((100100%%)).. (A)(A) EnzimasEnzimas relacionadasrelacionadas aoaociclociclo dodo CC ((CelCel == celulasecelulase;; AmiAmi == amilaseamilase));; (B)(B) EnzimasEnzimas relacionadasrelacionadas aoao ciclociclo dodo

Feijão 5 agr

Milho 3 agrMilho con

Soja conMilho 3 agrMilho con

ciclociclo dodo CC ((CelCel == celulasecelulase;; AmiAmi == amilaseamilase));; (B)(B) EnzimasEnzimas relacionadasrelacionadas aoao ciclociclo dodoNN ((GluGlu == glutaminaseglutaminase;; AspAsp == asparaginaseasparaginase;; UreUre == ureaseurease)).. (Lima,(Lima, 20082008))

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ÁreasÁreas--referência para estudos com indicadoresreferência para estudos com indicadores

Figura. Propriedades do solo sob preparo convencional (PC) e aveia/milho (A/M) e plantiodireto (PD) e aveia+vica/milho+caupi (A+V/M+C), em comparação ao solo em campo nativo(referência=100%). C. org= C orgânico, NMP= N potencialmente mineralizável, C>53= C namatéria orgânica particulada, C-Bio= C na biomassa microbiana, Ntotal=nitrogênio total,C-CO2=atividade microbiana, N>53= N na matéria orgânica particulada, e Quoc. Met.=quociente metabólico. (Conceição, 2002; modificado por Bayer, 2004).

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Indicadores biológicos: Grupos funcionaisIndicadores biológicos: Grupos funcionais

(Matsumoto, 2004)(Fagotti, 2007)

(Saridakis, 2001)

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Protozoários Protozoários

Importantes integrantes da comunidade Importantes integrantes da comunidade Importantes integrantes da comunidade Importantes integrantes da comunidade microbiana;microbiana;Regula a população de bactérias;Regula a população de bactérias;Indicadores da “saúde” do solo.Indicadores da “saúde” do solo.

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Indicador biológico x químicoIndicador biológico x químicoQuímicoQuímico

ÁreaÁrea P resinaP resina M.O.M.O. pHpH KK CaCa MgMg H+AlH+Al SBSB CTCCTC VV

mg/dmmg/dm33 g/kgg/kg CaClCaCl22 ------------------ ------------------ ------mmolmmolcc /dm/dm33-------- ------------------ ------------------ %%MataMata

Past20Past20Past25Past25algodãoalgodão

6677552121

4040404039393232

5,75,75,85,85,85,86,46,4

4,94,95,55,57,57,59,59,5

838393936868190190

2626262628282020

2828222222221313

114114125125104104220220

142142147147126126233233

8080858582829494

ÁreaÁrea C microbianoC microbiano CelulaseCelulase AmilaseAmilase

mg/kgmg/kg μμg AR/g solo/hg AR/g solo/h μμg AR/g solo/hg AR/g solo/hMataMata

Past20Past20428 a428 a363 a363 a

2,64 bc2,64 bc3,47 ab3,47 ab

31,87 a31,87 a20,40 b20,40 b

BiológicoBiológico

Past25Past25algodãoalgodão

402 a402 a143 b143 b

,,3,87 a3,87 a1,58 c1,58 c

,,28,48 ab28,48 ab

5,91 c5,91 c

Fonte: MarchioriFonte: Marchiori--Júnior & Melo (1999)Júnior & Melo (1999)

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Interrelações entre indicadoresInterrelações entre indicadores

Propriedades físicas x microrganismos. Ex.: Propriedades físicas x microrganismos. Ex.: microagregados x fungos filamentosos + gomas microagregados x fungos filamentosos + gomas bacterianas;bacterianas;

P i d d í i i id d i bi E P i d d í i i id d i bi E Propriedades químicas x atividade microbiana. Ex.: Propriedades químicas x atividade microbiana. Ex.: pH, elementos tóxicos, nutrientes;pH, elementos tóxicos, nutrientes;

Carbono orgânico (química): efeitos na biologia e na Carbono orgânico (química): efeitos na biologia e na física do solo.física do solo.

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Indicador físico x biológicoIndicador físico x biológico

raízes

hifas fúngicas

areiasilteargila

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90

Indicador biológico x químicoIndicador biológico x químico

Hifa

s, m

/g

60

70

80

Y = 37,76 + (17,14/x)R2= 0,82**

P disponível mg/kg

0 10 20 30 4030

40

50

P disponível, mg/kg

Nogueira et al. (não publicado)

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Indicador biológico x químicoIndicador biológico x químico

360

atas

e al

calin

a,

NF/

g/h

a 37

oC

240

280

320 Y = 213 + (42/x)R2= 0,64*

0 10 20 30 40

Fosf

aμ g

PN

160

200

240

P disponível, mg/kg

Nogueira et al. (não publicado)

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Matéria orgânica: papel chave entre Matéria orgânica: papel chave entre os indicadoresos indicadores

Agregação: física;Agregação: física;

Capacidade de retenção de água: física;Capacidade de retenção de água: física;

Fonte de nutrientes: química;Fonte de nutrientes: química;

Efeito tampão e CTC: química;Efeito tampão e CTC: química;

Fonte de energia para crescimento e diversidade Fonte de energia para crescimento e diversidade microbiana: biológica;microbiana: biológica;

Supressão de agentes patogênicos por diversidade Supressão de agentes patogênicos por diversidade e competição: biológica.e competição: biológica.

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Matéria orgânica: papel chave entre Matéria orgânica: papel chave entre os indicadoresos indicadores

Ácidos HúmicosÁcidos Húmicos

Ácidos FúlvicosÁcidos Fúlvicos

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Matéria orgânica x água no soloMatéria orgânica x água no solo

34

onte

nt, g

/kg

28

30

32

o)

Wat

er c

o

22

24

26Y = 17.60 + 4.58Xr ²=0.85

ra e

t al.

(não

pub

licad

o

Total organic C, %

1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8 3.0 3.222

Nog

ueir

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Técnicas para estudos em Técnicas para estudos em microbiologia do solomicrobiologia do solo

A li ã d f it d áti d j d l b A li ã d f it d áti d j d l b Avaliação dos efeitos de práticas de uso e manejo do solo sobre a Avaliação dos efeitos de práticas de uso e manejo do solo sobre a comunidade microbiana;comunidade microbiana;Avaliação da qualidade microbiológica do solo (“saúde” do solo);Avaliação da qualidade microbiológica do solo (“saúde” do solo);Avaliações de impacto ambiental;Avaliações de impacto ambiental;Avaliação do sucesso da recuperação de áreas degradadas;Avaliação do sucesso da recuperação de áreas degradadas;Avaliação do sucesso da recuperação de áreas degradadas;Avaliação do sucesso da recuperação de áreas degradadas;Estabelecer relações entre as propriedades biológicas, químicas e Estabelecer relações entre as propriedades biológicas, químicas e físicas do solo. físicas do solo. Ex.: microagregados x fungos filamentosos + gomas bacterianas; pH, Ex.: microagregados x fungos filamentosos + gomas bacterianas; pH, elementos tóxicos, nutrientes.elementos tóxicos, nutrientes.

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Nível de Nível de

DesidrogenaseDesidrogenase

RespirometriaRespirometria

Técnicas baseadas no metabolismoTécnicas baseadas no metabolismo

atividade atividade biológica biológica no solono solo

pp

Quociente metabólico (Quociente metabólico (qqCOCO22))

Biomassa MicrobianaBiomassa Microbiana

Ocorrência e atividadeOcorrência e atividademelhor melhor entendimento dos entendimento dos efeitos das ações efeitos das ações efeitos das ações efeitos das ações antrópicas sobre a antrópicas sobre a sustentabilidade do sustentabilidade do ambiente.ambiente.

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RespirometriaHCl 0 25NHCl 0,25N

NaOH 0,25N

100g 20mL

INCUBAÇÃO

fenoftaleína

BaCl2

Na2CO3 + H2O

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Biomassa de C e NBiomassa de C e N

Fumigação e extraçãoFumigação e extração

25g25g

24 h (escuro)24 h (escuro)

AmostraAmostra++

Solução extratoraSolução extratora

DuplicataDuplicata+Clorofórmio+Clorofórmio

30 min30 min

--ClorofórmioClorofórmio

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Digestão e titulaçãoDigestão e titulação

8 mL extrato8 mL extrato2 mL dicromato de potássio2 mL dicromato de potássio15 mL H15 mL H22SOSO44/H/H33POPO44

Sulfato ferrosoSulfato ferroso

100 100 °°C, 30 C, 30 minmin

AmostraAmostra+ + ferroínaferroína

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qqCOCO22 e relação C/N da biomassae relação C/N da biomassa

Baseados em índicesBaseados em índices

C/N biom. =C/N biom. = Biomassa CBiomassa CBiomassa NBiomassa N

qqCOCO22 == RespirometriaRespirometriaBiomassa CBiomassa C

Biomassa CBiomassa CqqMic =Mic = Biomassa CBiomassa CCC--orgânicoorgânico

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Atividades enzimáticasAtividades enzimáticas

DesidrogenaseDesidrogenase

5g5g

MetanolMetanol

IncubaçãoIncubação

485 485 nmnm

Cloreto de Cloreto de trifeniltrifenil tetrazóliotetrazólio (1%)(1%)

IncubaçãoIncubação24 h24 h

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Amilase e celulaseAmilase e celulase

5g5g Reagentes para Reagentes para Determinação de Determinação de açúcares redutoresaçúcares redutoresaçúcares redutoresaçúcares redutores

690 690 nmnm

( ) ( )

IncubaçãoIncubação24 h24 h

Tampão (pH 5,5)Tampão (pH 5,5)++

Substrato (CMC/Amido)Substrato (CMC/Amido)++

ToluenoTolueno

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Carboidratos solúveis em água quente

5g

50 mL H2O

16 h80°C

Filtragem100°C35 min

490 nm

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Baseadas em cultivoBaseadas em cultivo

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Fungos e bactérias heterotróficasFungos e bactérias heterotróficas


1010--11

Fungos = MartinFungos = MartinBactérias = ANBactérias = AN

10 g solo em 10 g solo em Diluição em sérieDiluição em série90 mL salina90 mL salina

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Amilolíticos e celulolíticosAmilolíticos e celulolíticos


1010--11

AmilolíticosAmilolíticos50 50 µLµL

10 g solo em 10 g solo em Diluição em sérieDiluição em sérieaté 10até 10--44

CelulolíticosCelulolíticos

90 mL salina90 mL salina até 10até 10--44

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Solo

Genes ribossomais: 16S, 18S

Independentes de cultivo: PCRIndependentes de cultivo: PCR--DGGEDGGE

Sistema de eletroforesevertical Bio-Rad

M 3 4 5 6 71 2 8 9M 3 4 5 6 71 2 8 9

1. Tanque e tampa.2. Núcleo central de refrigeração. 3. Câmara de gel montada sobre suporte e carcaça 4. Braçadeiras5. Cartão de alinhamento6. Pentes G

radiente d

16S rRNA

Jaccard (Tol 1.0%-1.0%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%]DGGE DGGEde desnaturação

DGGE

100

8060

DGGE

02

04

06

01

08

05

07

03

09

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50

Independentes de cultivo: MetagenomaIndependentes de cultivo: Metagenoma

Oliveira et al. (2006)

+

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51

•• Etapas:Etapas:Fragmentação do DNAFragmentação do DNA


-- Preparação da BibliotecaPreparação da Biblioteca

-- PCR de EmulsãoPCR de Emulsão

S i tS i t-- SequenciamentoSequenciamento

Ligação dos AdaptadoresLigação dos Adaptadores

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52

•• Etapas:Etapas:




S i m tS i m t-- SequenciamentoSequenciamento

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53





SequenciamentoSequenciamento-- SequenciamentoSequenciamento

5/13/2013

54





SequenciamentoSequenciamento-- SequenciamentoSequenciamento

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MEGANMEGAN -- MEtaGenome AnalyzerMEtaGenome Analyzer


-- Baseado no resultado da comparação BLASTX Baseado no resultado da comparação BLASTX –– NRNR

-- Utiliza o algorítimo Utiliza o algorítimo Lowest Common Ancestor Lowest Common Ancestor (LCA) (LCA)

para atribuir táxons às sequências.para atribuir táxons às sequências.

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Como interpretar dados baseados em Como interpretar dados baseados em bioindicadores de qualidade do solo de bioindicadores de qualidade do solo de

amostras ambientais?amostras ambientais?amostras ambientais?amostras ambientais?

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57

Ferramentas para análise global dos dados: Ferramentas para análise global dos dados: visão sistêmicavisão sistêmica

•• Necessidade de validação estatística;Necessidade de validação estatística;•• Necessidade de validação estatística;Necessidade de validação estatística;•• Qual usar?Qual usar?

(Métodos univariados não são adequados);(Métodos univariados não são adequados);•• Métodos multivariados:Métodos multivariados:

Variáveis analisadas ao mesmo tempo;Variáveis analisadas ao mesmo tempo;Expressa um conjunto reduzido de 2 dimensões;Expressa um conjunto reduzido de 2 dimensões;Discrimina grupos de dados.Discrimina grupos de dados.

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Ferramentas para análise global Ferramentas para análise global dos dados: Análise multivariadados dados: Análise multivariada

PPPressupostos:Pressupostos:

Distribuição normal dos erros (DP +/Distribuição normal dos erros (DP +/--3);3);–– Linear <3, Unimodal >3Linear <3, Unimodal >3

Os erros devem ser independentes e ter a mesma Os erros devem ser independentes e ter a mesma variância, ou seja, homocedasticidade de variâncias;variância, ou seja, homocedasticidade de variâncias;–– Enviezamento de dados, reflexos na análise.Enviezamento de dados, reflexos na análise.

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As variáveis podem ser:As variáveis podem ser:

á R E ú d d íd á R E ú d d íd •• Variáveis Resposta. Ex.: número de indivíduos Variáveis Resposta. Ex.: número de indivíduos de diferentes espécies, parâmetros de diferentes espécies, parâmetros microbiológicos, bioquímicos, variáveis microbiológicos, bioquímicos, variáveis fisiológicas, presença/ausência de uma banda, fisiológicas, presença/ausência de uma banda, t S f f itt S f f itetc. Sofrem o efeito.etc. Sofrem o efeito.

•• VariáveisVariáveis explicativasexplicativas. Ex.: . Ex.: concentraçãoconcentração de de umaumasubstânciasubstância químicaquímica, , atributosatributos físicosfísicos//químicosquímicosdo solo. do solo. EstãoEstão relacionadosrelacionados à à causacausa. .

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Análise multivariada: métodos Análise multivariada: métodos disponíveisdisponíveis

R du m mpl xid d d s d d s s R du m mpl xid d d s d d s s •• Reduzem a complexidade dos dados e os Reduzem a complexidade dos dados e os representam em um sistema de novas variáveis representam em um sistema de novas variáveis ou novas dimensõesou novas dimensões––ordenação;ordenação;

•• Exemplos:Exemplos:pp• Análise discriminante (DA);• Análise discriminante (DA);• Análise de Componentes Principais (PCA);• Análise de Componentes Principais (PCA);• Análise de Coordenadas Principais (PCOA);• Análise de Coordenadas Principais (PCOA);• Análise de Correspondências (CA);• Análise de Correspondências (CA);• Ordenações Canônicas (CCA e RDA);• Ordenações Canônicas (CCA e RDA);• Multidimentional Scaling (MDS)• Multidimentional Scaling (MDS)

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Indicadores de qualidade em função do uso do solo Indicadores de qualidade em função do uso do solo em áreas de floresta nativa, reflorestamento e em áreas de floresta nativa, reflorestamento e agrícolas (Nogueira et al., 2006)agrícolas (Nogueira et al., 2006)

Variáveis físicas;Variáveis físicas;Variáveis químicas;Variáveis químicas;Variáveis microbiológicas;Variáveis microbiológicas;ggVariáveis bioquímicas;Variáveis bioquímicas;Diversidade genética de Diversidade genética de BacteriaBacteria (DGGE).(DGGE).

Total: 26 variáveis.Total: 26 variáveis.

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Bioindicadores e e análise de agrupamento Bioindicadores e e análise de agrupamento (todas as variáveis, exceto DGGE)(todas as variáveis, exceto DGGE)

Floresta NativaFloresta Nativa

3

8

4

6

2

1

Site

s

Reflorestamento IReflorestamento I

Reflorestamento IIReflorestamento IIReflorestamento IIIReflorestamento III

Floresta NativaFloresta Nativa

Regeneração 25 anosRegeneração 25 anosAgrícola Agrícola –– Trigo veg.Trigo veg.

2 3 4 5 6 7 8 9Linkage Distance

7

5

9

Agrícola Agrícola -- PousioPousioAgrícola Agrícola –– Trigo mat.Trigo mat.

Agrícola Agrícola Trigo veg.Trigo veg.EucaliptoEucalipto

Dendrograma baseado em análise de custer dos resultados das análises microbiológicas e químicas do solo das áreas em estudo. (Nogueira et al., 2006)

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63

100

8060

02

Diversidade genética e análise de Diversidade genética e análise de agrupamento com base no perfil de DGGEagrupamento com base no perfil de DGGE

Reflorestamento IReflorestamento I04060108

05

Reflorestamento IIReflorestamento IIReflorestamento IIIReflorestamento IIIFloresta NativaFloresta NativaRegeneração 25 anosRegeneração 25 anosAgrícola Agrícola -- PousioPousio05

070309

Dendrograma (esquerda) baseado em análise de Dendrograma (esquerda) baseado em análise de

Agrícola Agrícola -- PousioPousioAgrícola Agrícola –– Trigo mat.Trigo mat.Agrícola Agrícola –– Trigo veg.Trigo veg.EucaliptoEucalipto

custer dos produtos de PCRcuster dos produtos de PCR--DGGE de DNA de solo DGGE de DNA de solo após amplificação com primers para a região do após amplificação com primers para a região do rDNA 16S (Direita). (Nogueira et al., 2006)rDNA 16S (Direita). (Nogueira et al., 2006)

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Indicadores de qualidade em áreas sob área nativa, Indicadores de qualidade em áreas sob área nativa, reflorestamentos com Araucária e Pinus, e agrícola reflorestamentos com Araucária e Pinus, e agrícola (Miyauchi et al., submetido)(Miyauchi et al., submetido)

Nativa Reflorestamento Pinus

Reflorestamento Araucária Agrícola

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Estratégia de amostragemEstratégia de amostragem

25 x 5 m

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66

1.0

fung

C/N

PI13,6

%

PCA: relação entre áreas, variáveis resposta e PCA: relação entre áreas, variáveis resposta e explicativasexplicativas

amiloliceluloli

bact

fung

d-ase

celulaseamilase

BMC

ADA

UMI

PI

AGR

Revolvimento Revolvimento solosolo

Menor Menor cobertura cobertura vegetalvegetal

Aplicação de Aplicação de

Eixo

2: 1

-1.0 1.0

-1.0

d-ase

respqCO2

pHCOTNAT

AR

p çp çinsumosinsumos

Eixo1: 69 0%

Miyauchi (2007)

Eixo1: 69,0%

Figura. Plano fatorial da Análise de ComponentesPrincipais (ACP) baseada nas variáveis resposta evariáveis explicativas (COT, UMI e pH) nas áreas(NAT = floresta nativa; AR = A. angustifolia; PI =Pinus taeda; AGR = agrícola).

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67

1.0

fung

C/N

PI

PCA: relação entre áreas, variáveis resposta e PCA: relação entre áreas, variáveis resposta e explicativasexplicativas

Qualidade do Qualidade do resíduo vegetalresíduo vegetal

C/N solo C/N solo maior em PI, maior em PI, amiloli

celulolibact

f g

d-ase

celulaseamilase

BMC

ADA

UMI

AGR

o2: 1

3,6%

Limitação das Limitação das técnicas técnicas baseadas em baseadas em cultivocultivo

resinas resinas ligninalignina

Espécie exótica Espécie exótica altera propr. do altera propr. do -1.0 1.0

-1.0

respqCO2

pHCOTNAT

AR

Ei 1 69 0%

Eixo

Figura. Plano fatorial da Análise de ComponentesPrincipais (ACP) baseada nas variáveis resposta evariáveis explicativas (COT, UMI e pH) nas áreas(NAT = floresta nativa; AR = A. angustifolia; PI =Pinus taeda; AGR = agrícola).

altera propr. do altera propr. do solosolo

Eixo1: 69,0%

Miyauchi (2007)

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Variáveis do ciclo do NVariáveis do ciclo do N

agot

ti e

t al

. (20

12)

Fa

Figura. Plano fatorial da Análise de ComponentesPrincipais (ACP) baseada nas variáveis resposta do ciclodo N nas áreas (NAT = floresta nativa; AR = A.angustifolia; PI = Pinus taeda; AGR = agrícola).

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Conversão de cultivo convencional para Conversão de cultivo convencional para agroecológicoagroecológico

Lima (2008)

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PCA com atividade/biomassa microbianaPCA com atividade/biomassa microbiana

Figura. Plano Figura. Plano fatorial da Análise de Componentes Principais (ACP) baseada nas variáveis resposta e

Eixo

2: 1

3,2%

pváriaveis explicativas (pH, Ctot, umi) nas áreas.

Eixo1: 62,8%

Lima (2008)

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71

1.0

H

PCA com atividades enzimáticasPCA com atividades enzimáticas

Figura. Plano fatorial da

Glu

UreDesid

Falc

pH

Fj3 Fj1Fj5

fatorial da Análise de Componentes Principais (ACP) baseada nas variáveis resposta (enzimas) e

Asp

Umi

Ctot

Fj2

MilCSojC

TabC

Eixo

2: 2

4,1%

(enzimas) e váriaveis explicativas (pH, Ctot, umi) nas áreas.

-0.7 1.2

-0.8

CelAmil

FacidFloresta

MilA

Eixo1: 62,1% Lima (2008)

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Atividade e biomassa microbiana do solo podem Atividade e biomassa microbiana do solo podem explicar diferentes níveis de produtividade de explicar diferentes níveis de produtividade de grãos em áreas agrícolasgrãos em áreas agrícolas

rvan

tes

et a

l. (2

012)

Fazenda I Fazenda II

Cer

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Atividade e biomassa microbiana do solo podem Atividade e biomassa microbiana do solo podem explicar diferentes níveis de produtividade de grãos explicar diferentes níveis de produtividade de grãos em áreas agrícolasem áreas agrícolas

s et

al.

(201

2)Ce

rvan

tes

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Metagenômica de solo sob plantio direto e plantio Metagenômica de solo sob plantio direto e plantio convencional em rotação e sucessão de culturas no convencional em rotação e sucessão de culturas no norte do Paraná (Souza 2012)norte do Paraná (Souza 2012)

CurvaCurva de de RarefaçãoRarefaçãoSouza (2012)

5/13/2013

75

Souza (2012)

5/13/2013

76

•• DomínioDomínioBacteriaBacteria

Souza (2012)

5/13/2013

77

•• DomínioDomínio BacteriaBacteria

mbe

r of reads

Num

Taxon Souza (2012)

5/13/2013

78

•• DomínioDomínio Bacteria Bacteria FiloFilo ProteobacteriaProteobacteria

r of reads

Num

ber

TaxonSouza (2012)

5/13/2013

79

•• DomínioDomínio BacteriaBacteria•• FiloFilo ProteobacteriaProteobacteriaClasseClasse AlfaproteobacteriaAlfaproteobacteria

Souza (2012)

read

sNum

ber o

f

Taxon

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80

•• AnáliseAnálise estatísticaestatística

Souza (2012)

5/13/2013

81

•• DomínioDomínio BacteriaBacteriaFiloFilo ProteobacteriaProteobacteria

r of reads

Num

ber

TaxonSouza (2012)

5/13/2013

82

•• DomínioDomínio BacteriaBacteria•• FiloFilo ProteobacteriaProteobacteriaClasseClasse BetaproteobacteriaBetaproteobacteria

Souza (2012)

read

sNub

er o

f

Taxon

5/13/2013

83

• Análise estatística

Souza (2012)

5/13/2013

84

• Domínio ArchaeaSouza (2012)

• Domínio Archaea

5/13/2013

85

• Domínio Archaea

read

sNum

ber

of

Taxon Souza (2012)

5/13/2013

86

•• DomínioDomínioEukaryotaEukaryota

Souza (2012)

5/13/2013

87

•• DomínioDomínio EukaryotaEukaryotaSouza (2012)

er of reads

Num

be

Taxon

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AlimentosAlimentos (11%)(11%)

> > 1000 bilhões de U$1000 bilhões de U$CiclagemCiclagem do C (50%)do C (50%)

SaprofíticosSaprofíticos

Valor dos serviços ambientaisValor dos serviços ambientais

AlimentosAlimentos (11%)(11%)FungosFungosInvertebradosInvertebrados

Bi t lBi t l (10%)(10%)

PolinizaçãoPolinização(13%)(13%)InsetosInsetos

SaprofíticosSaprofíticosDecompositoresDecompositores

BiotecnologiaBiotecnologia (<1%)(<1%)

BiocontroleBiocontrole (10%)(10%)

PedogênesePedogênese (2%)(2%)BioturbaçãoBioturbaçãoAti id d Ati id d bi ló ibi ló i

Pimentel Pimentel et al.et al. (1997)(1997)

CiclagemCiclagem do N (6%)do N (6%)FixaçãoFixação do Ndo N22DenitrificaçãoDenitrificaçãoNitrificaçãoNitrificação

BioremediaçãoBioremediação (8%)(8%)DetoxificaçãoDetoxificação

Atividade Atividade biológicabiológica

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ConclusõesConclusõesBioindicadores baseados tanto em métodos Bioindicadores baseados tanto em métodos Bioindicadores baseados tanto em métodos Bioindicadores baseados tanto em métodos clássicos quanto em métodos mais avançados clássicos quanto em métodos mais avançados permitem distinguir efeitos do uso do solo;permitem distinguir efeitos do uso do solo;A comparação com áreas referência dá A comparação com áreas referência dá i di ã d s f it s d si ã i di ã d s f it s d si ã indicação dos efeitos da recomposição indicação dos efeitos da recomposição vegetal e do manejo em atributos biológicos vegetal e do manejo em atributos biológicos do solo;do solo;A análise deve ser global, interpretando o A análise deve ser global, interpretando o

l d d d d d d d l d d d d d d d papel de cada indicador nas propriedades do papel de cada indicador nas propriedades do solo.solo.

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90

@ b [email protected]@embrapa.br

Equipe:Adriana Pereira SilvaAndré S. NakataniBiana H KuwanoBiana H. KuwanoDáfila S. Lima FagottiLetícia C. BabujiaMarco A. NogueiraMariangela HungriaRafaela RuyR t C S

Ex-alunos:Cristiane A. SantosDaniel Bini

Renata C. SouzaVívian N. Marques Cervantes

Glaciela KaschuckMarina Yumi H. Miyauchi

indicadores microbiológicos da qualidade do solo · principais grupos microbianos do solo rupo...

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