IMUNOFENOTIPAGEM NAS LEUCEMIAS AGUDAS

Curso Pré-Congresso: IMUNOFENOTIPAGEM NAS

DOENÇAS HEMATOLÓGICAS

Mariester MalvezziHospital de Clínicas

Universidade Federal do Paraná

LEUCEMIA AGUDA

Definição

É uma neoplasia de células hematopoéticas precursoras que

apresentam proliferação anormal e parada de maturação

em diferentes estágios de sua diferenciação.

20% LMA

EPIDEMIOLOGIA

• 4/100.000/ano – em geral 13.000/ano/EUA• LLA: 3.200 casos/ano • LMA: 9.700/ano > 60 anos – 10/100.000/ano• Crianças: LLA-B : em 85%

85-90% LLA-B precursoras Linfoma linfoblástico B: < 10%

LLA-T : 15%, em adolescentes Linfoma linfoblástico T: >80% 40% dos linfomas

• Adultos: LMALLA: em 15%: B 75%

T 25%

CARACTERIZAÇÃO LABORATORIAL DE UMA NEOPLASIA HEMATOLÓGICA:

ABORDAGEM INTEGRADA

• Morfologia

• Citoquímica Citometria de fluxo

• Immunofenotipagem

• Citogenética Imunohistoquímica

• Biologia molecular

• Ciclo celular

IMUNOFENÓTIPO DAS NEOPLASIAS HEMATOLÓGICAS

UTILIDADE CLÍNICA DOS ESTUDOS FENOTÍPICOS

- Classificação Diagnóstica

- Avaliação Prognóstica

- Monitorização

Correlação fenótipo X citogenética X prognóstico

IMUNOFENÓTIPO DAS NEOPLASIAS HEMATOLÓGICAS

ESTRATÉGIA

• 1- Estudo do que é Normal

• 2- Estudo do Fenótipo das Doenças

IMUNOFENÓTIPO DAS CÉLULAS LEUCÊMICAS

Célula normal x Célula leucêmica

Identificação

Caracterização

Quantificação

CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA DAS CÉLULAS LEUCÊMICAS

1. Designação da Linhagem

2. Avaliação da Maturação Celular

3. Pesquisa de Aberrâncias Fenotípicas

1. Antígenos que definem linhagem:

* Mielóide: cyMPO

* Linfóide B: cyCD79a, cyCD22

* Linfóide T: cyCD3

2. Antígenos associados a imaturidade:

nTdT, CD34, CD117

CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA DAS CÉLULAS LEUCÊMICAS

2. Antígenos associados à maturação das linhagens:

Mielóide: CD11b, CD13, CD33, CD65Monocítica: CD11c, CD14, CD36, CD64, CD68, lactoferrLinfóide B: CD10, CD19, CD20, CD22, CD24, CyIgμ, K, LLinfóide T: CD1a, CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8Linfóide NK: CD2, CD11b, CD16, CD56, CD57Eritróide: CD36, CD71, CD105, Glicoforina APlaquetária: CD41a, CD42b, CD61Basofílica: CD9, CD13, CD33, CD123, CD203, HLA-DRDendrítica: CD16, CD33, CD117, CD123, HLA-DRMastocítica: CD2, CD25, CD33, CD68, CD117

CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA DAS CÉLULAS LEUCÊMICAS

3. Pesquisa de Aberrâncias Fenotípicas:• Expressão de antígenos de outra linhagem

* LLA – CD13, CD15, CD33

* LMA – CD2, CD5, CD7 e/ou CD19, CD22, CD56

• Assincronismo de expressão dos antígenos

* CD11b, CD15 ou CD16 em células CD34++

*Ausência de expressão de antígenos. CD13 neg em LMA,

CD5 neg em LLA-T

• Superexpressão de antígenos

* CD34, CD14 na LMA; CD10 na LLA

• Parâmetros de dispersão anormais

* FSC e SSC altos ou baixos

CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA DAS CÉLULAS LEUCÊMICAS

APLICAÇÃO DA CITOMETRIA DE FLUXOLEUCEMIAS AGUDAS

• Diagnóstico de linhagem linfóide vs mielóide.

• Subclassificação imunológica das leucemias agudas linfoblásticas precursoras B e T.

• Diagnóstico das leucemias agudas M0, M6, M7, dendríticas, mastócitos.

• Diagnóstico das leucemias de linhagem ambígua.

• Triagem diagnóstica de alterações cromossômico / genéticas. Ex: LMA-M3 c/ t(15;17); LLA-B c/ 11q23, t(9;22), t(1;19), t(12;21).

CLASSIFICAÇÕES

• FAB – French/American/British1976

• MIC – Morfológica/Imunológica/Citogenética

1986• REAL – Revised European-American

Classification of Lymphoid Neoplasms1994

• OMS – Organização Mundial da Saúde2001 E 2008

CLASSIFICAÇÃO 0MS

• Estratifica as linhagens linfóide, mielóide, histiocítica/dendrítica e mastocítica

• Postula a célula de origem para cada neoplasia

• Define entidades nosológicas

• Utiliza várias áreas do conhecimento: clínica, morfologia, citoquímica, imunofenótipo, biologia molecular

• É mutável

OMS-2008 CLASSIFICAÇÃO DAS LEUCEMIAS AGUDAS

LEUCEMIAS LINFOIDES AGUDAS

LEUCEMIAS MIELOIDES AGUDAS

LEUCEMIA AGUDA DE LINHAGEM AMBÍGUA

LEUCEMIAS AGUDAS DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL

MIELÓIDE??

LINFÓIDE??

LEUCEMIAS AGUDAS DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL

MIELÓIDE!!!

LINFÓIDE!!!

LLA-B

LLA-T

LMA-M0

OMS-2008 CLASSIFICAÇÃO DAS LEUCEMIAS LINFOIDES AGUDAS

1- Leucemia/Linfoma linfoblástico B

2- Leucemia/Linfoma linfoblástico B com

anormalidades genéticas: t(9;22), t(12;21),

t(v;11q23), t(1;19), t(5;14), hiper e

hipodiploide

3- Leucemia/Linfoma linfoblástico T

4- Leucemia/Linfoma linfoblástico NK

Leucemia / Linfoma Linfoblástico B

10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD10 FITC ->

CD

20

PE

10 10 10 10 100 1 2 3 4

TdT FITC ->

CD

10

PE

10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD34 FITC ->

CD

22

PE

10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD34 FITC ->

CD

38

PE

10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD34 PE ->

CD

45

Pe

rCP

Esquema de Diferenciação da Célula B Normal

Gate emCD19+

LLA – B

10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD34 FITC ->C

D38 P

E -

>

LLA-B Pré-B

• cyIgMμ(mu)+

• CD19+, CD10+, TdT+

CD20-/+d, CD45++,

CD34-/+, smIgM

• t(1;19)

20-25% em crianças

• Não específico

LLA-B 11q23

• CD19+, CD10-,

CD15+, CD20-,

CD34+, CD65+, 7.1+

• 11q23, rearranjo MLL

• Sensibilidade: 95%

• Especificidade: 85%

Khalidi, HS et al, Am J Clin Pathol, 111:467, 1999

LLA-B Comum

Ph+

• CD19+, CD10++,

CD20+, CD34++,

CD38-/+fr, CD13+fr

• t(9;22)

• Adultos

• Sensibilidade: 100%

• Especificidade: >90%

Leukemia, 15:406, 2001

LLA—PH+

CD10++

CD38-/+

CD34++

CD13+fr

LLA-L3 ou Linfoma de Burkitt

• FSC alto

• CD19+, CD20+,

CD22+, CD10+, TdT-

CD34-/+, mIgM+

Kappa ou Lambda+

• Neoplasia de célula B

madura

LLA-L3 ou Linfoma de Burkitt

FSC

CD19

CD79a IgM LAMBDA

CD

34

CD

10

CD45

Leucemia /Linfoma Linfoblástico T

cyCD3+, CD7++, TdT+,

CD1a-/+, mCD3-/+, CD4-/+,

CD5-/+, CD8-/+, CD10-/+,

CD34-/+

Leucemia/Linfoma de Células NK

• São raros tanto em adultos quanto em crianças

• Diagnóstico diferencial com Leucemias de células dendríticas

• Imunofenótipo: cyCD3-, CD2-/+, CD4-/+, CD5-, CD7-/+, CD8-/+, CD16-, CD56+, TdT-, CD11b-/+, CD13-/+, CD33-/+, HLA-DR-/+.

OMS-2008 CLASSIFICAÇÃO DAS LEUCEMIAS MIELOIDES AGUDAS

1- LMA – FAB ou não especificada

2- LMA com anormalidades genéticas: t(8;21), t(15;17), inv16 ou t(16;16), t(9;11), t(6;9), inv3 ou t(3;3), t(1;22).

3- LMA com alterações relacionadas com Mielodisplasia

4- Neoplasias mieloides relacionadas a terapia

5- Sarcoma mieloide

6- Proliferações mieloides associadas a S. Down

7- Neoplasia de célula dendrítica plasmocitoide

OMS-2008 CLASSIFICAÇÃO DAS LEUCEMIAS MIELOIDES AGUDAS

Classificação FAB ou Não especificada

LMA-M0 ou com diferenciação mínimaLMA-M1 ou sem maturaçãoLMA-M2 ou com maturaçãoLMA-M4 ou mielomonocíticaLMA-M5 ou monoblástica/monocíticaLMA-M6 ou eritroideLMA-M7 ou megacarioblásticaLMA-M8 ou basofílicaPanmielose aguda com mielofibrose

Leucemia Mieloide Aguda

cyMPO+, CD13+, CD33+,

CD34+, CD117+, HLA-DR+,

CD7-/+, CD11b-/+, CD15-/+

cyMPO negativa: M5,

M6, M7, basofílica,

dendrítica

CD45

CD34

CD

13

LMA com anormalidades

citogenéticas recorrentes

• t(15;17)

• inv(16) ou t(16;16)

• t(8;21)

• 11q23

• t(9;11)

• t(6;9)

• inv (3) ou t(3;3)

• t(1;22)

LMA com t(15;17)

• cyMPO+, CD15-

CD13 heterogêneo

CD33 homogêneo

CD34-/+, HLA-DR-SSC alto

• 5-8% dos casos

• Hipergranular/Típica

Hipo/Microgranular

Orfao, A et al, Haematologica, 84:405, 1999

LMA—M3 com t(15;17)

AUTOFLUORESCÊNCIA cyMPO++

DR negCD34 negCD33 homoCD13 het

SSC/CD45

LMA com inv(16) ou t(16;16)

• Mieloblastos:

cyMPO, CD13,CD33,

CD34, CD117

• Monoblastos: CD4,

CD14, CD15, CD36,

CD64, CD68

8-10% dos casos

LMMA c/ eosinofilia

Número variável

LMA—M4 com inv 16

Eosinófilos:12,4%

Mieloblastos:36,0% Monoblastos:

28,2%

NEOPLASIA DE CD PLASMOCITÓIDE

FSC alto

DR++CD123++CD4+

CD45++MPO neg

CD56+

OMS-2008 CLASSIFICAÇÃO DAS LEUCEMIAS AGUDAS AMBÍGUAS

1- Leucemia aguda indiferenciada

2- Leucemia aguda de fenótipo misto B/Mieloide

3- Leucemia aguda de fenótipo misto T/Mieloide

4- Leucemia aguda de fenótipo misto com t(9;22)

5- Leucemia aguda de fenótipo misto com t(v;11q23)

LA de Linhagem Ambígua

Escore Linfóide B Linfóide T Mielóide

2 CyCD79a CD3(cy/m) MPO

CD22,IgM TCR

1 CD19 CD2 CD117

CD20 CD5 CD13

CD10 CD8 CD33

CD10 CD65

0,5 TdT TdT CD14

CD24 CD7 CD15

CD1a CD64ESCORE > 2

Grupo EGIL, Leukemia, 12: 2038, 1998

LA de Linhagem Ambígua

MPO-, cyCD22+d, CD33+d

Doença Residual Mínima

LLA-T

CD7

CD7

CD3

CD3

CD34

CD34

BLASTO: 78,9%

LTN: 11,1%

BLASTO: 0,04%

LTN: 9,37%

A ACURÁCIA NA ESTRATIFICAÇÃO DIAGNÓSTICA DAS LEUCEMIAS AGUDAS LEVARÁ AO MELHOR

MANEJO TERAPÊUTICO

HOSPITAL DE CLÍNICAS DA UFPR

EQUIPE DE IMUNOFENOTIPAGEM

Ana Paula de AzambujaEdna MartinsEliana L LimaElisa NovelloJuli PimentelMaria Tadeu L RochaMiriam P Beltrame Noeli T SilvaSuély K WeissJuliana Y Suzuki

OBRIGADA