imunodifusão em gel de Ágar · 2013. 3. 1. · imunodifusão em gel de agarose (idga) paula...
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Imunodifusão em Gel de Agarose (IDGA)
Paula Finger
Fevereiro de 2013
Universidade Federal de Pelotas Graduação em Biotecnologia
Disciplina: Imunologia
- Prática -
Métodos de diagnóstico
ANTICORPOS
CHAVE PARA DIAGNÓSTICO
IDENTIFICAR ANTÍGENO
Combinação Ag-Ac
• Aglutinação
• Precipitação
• Ativação do Complemento
• Citólise
• Neutralização
Reação de precipitação
• Complexos moleculares gerados por Ag e Ac
• Formação de precipitados de acordo com os reagentes
▫ Efeito pré-zona
▫ Zona de equivalência
Curva de precipitação
Considerar concentração Ag x Ac
Reações de precipitação Ag com múltiplos
epitopos Ac bivalente
AG + EXCESSO DE AC
Reações de precipitação Ag com múltiplos
epitopos Ac bivalente
AG + AC EM
PROPORÇÕES ÓTIMAS
Reações de precipitação
Ag com múltiplos epitopos
Ac bivalente
AC + EXCESSO DE AG
IMUNODIFUSÃO - Tipos
• 2 Tipos:
DUPLA
RADIAL Permite determinar concentração de um
antígeno ou anticorpo
Permite determinar presença de anticorpos ou
antígeno
Técnica IDGA
• Placas de petry
• Tampão Tris HCl
• Agar noble
• Furador (roseta)
• Sugador
Material necessário:
- Realização da técnica -
Antígeno
Soro controle
Soros para testar
48-72 horas depois
Imunodifusão Dupla
Ag Ac
Linha de Precipitação
Difusão Radial
Imunodifusão Dupla
• O que determina a posição da linha de precipitação????
Ag Ac
Ag Ac
Imunodifusão Dupla
• Utilização
Diagnóstico
Leucose Bovina
Anemia Infecciosa Equina
Língua Azul
Distribuição dos reagentes
1 e 4: Ac padrão
7: Ag padrão
2, 3, 5 e 6 - soros de campo
2, 4 e 6: Ac padrão
7: Ag padrão
1, 3 e 5 - soros de campo
Reações observadas
Soros de campo 2 e 5 negativos;
Soros de campo 6 e 3 positivos,
Obs.: soro 3 positivo mais fraco
que soro 4.
Soros de campo 1 e 4 positivos;
Soro de campo 5 negativo.
Roseta A Roseta B SP
SP
SP
SP
SP
Possíveis reações
Anti -1
A: identidade
Ag
B: não identidade
C: identidade parcial
Anti –1, 2 e 4
Anti –1 e 3
esporão
1) Os arcos de precipitação formados
entre o Ac e os dois antígenos se
fundem, indicando que o Ac está
precipitando epitopos idênticos.
2) O Ac preparado distingue os três Ag
diferentes que formam arcos
independentes de precipitação.
3) Os antígenos compartilham o
epitopo 1, mas um deles também
possui um epitopo 3. A linha de
precipitação indica, então, uma
identidade parcial e não total, entre as
preparações de Ag.
Tipos de linhas:
Poços:
1 e 4: soros padrão
2,3,5 e 6: soros de
campo
7: antígeno
Linhas:
Vermelha: Identidade
Verde: Não identidade
Azul: Esporão
1
2
3 4
7 5
6
ANTÍGENO
LEUCOSE
SORO
PADRÃO
SORO
PADRÃO
SORO
PADRÃO
SORO de
CAMPO
(Pos)
SORO de
CAMPO
(Neg)
SORO de
CAMPO
(Neg)
Reações no teste de Leucose
• Vantagens
• Simplicidade e praticidade;
• Custo;
• Desvantagens
• Reações inespecíficas;
• Tempo
• Sensibilidade razoável.
Imunodifusão em gel de agarose - IDGA
Legenda da Placa 1 Roseta 1:
1. Bovino
2. Coelho
3. Bovino
4. Coelho
5. Bovino
6. Bovino
7. Anti-bovino
Roseta 2:
1. Equino
2. Bovino
3. Equino
4. Bovino
5. Equino
6. Bovino
7. Anti-bovino
Roseta 3:
1. Bovino
2. Bovino
3. Bovino
4. Bovino
5. Bovino
6. Bovino
7. Anti-bovino.
Roseta 4:
1. Bovino
2. Bovino
3. Bovino
4. Anti-Bovino
5. Anti-Bovino
6. Anti-Bovino
7. Equino/Anti-
bovino/Anti-caprino
Legenda da Placa 2 Roseta 1:
1. Bovino
2. Caprinp
3. Bovino
4. Caprino
5. Bovino
6. Caprino
7. Anti-bov e cap.
Roseta 2:
1. Coelho
2. Coelho
3. Coelho
4. Caprino
5. Caprino
6. Bovino
7. Anti-equino/Anti-
bovino
Roseta 4:
1. Equino/Anti-bovino
2. Equino/Anti-bovino/Anti-
cap
3. Equino/Anti-bovino
4. Equino/Anti-bovino/Anti-
cap
5. Equino/Anti-bovino
6. Equino/Anti-bovino
7. Anti-bov
Roseta 5:
1. Ceolho
2. Coelho
3. Equino/Anti-Bovino
4. Equino/Anti-Bovino
5. Anti-Bovino/Cap
6. Anti-Bovino/Cap
7. Bovino
Roseta 3:
1. Bovino
2. Bovino
3. Bovino
4. Bovino
5. Bovino
6. Bovino
7. Anti-bovino.