IMPACTO DE PAPAS GENÉTICAMENTE MODIFICADAS

SOBRE ORGANISMOS NO BLANCO DEL SUELO Y DEL FOLLAJE: Protocolos para la Evaluación

Javier Franco P., Jesús Arcos y Wilfredo Barreda

Proyecto LAC-BiosafetyAmérica Latina: Construcción de capacidad multi-país para el cumplimiento del Protocolo de Cartagena sobre Bioseguridad

(BRASIL, COLOMBIA, COSTA RICA, PERU)

Coleópteros Collembolas Actinomicetos

Bacillus Hongos micorrízicos Nematodos

UNALM IBT

IMPACTO DE

PAPAS GENÉTICAMENTE MODIFICADAS

SOBRE ORGANISMOS NO BLANCO DEL SUELO

Y DEL FOLLAJE : Protocolos para la Evaluación

Javier Franco P.1, Jesús Arcos2 y Wilfredo Barreda2

1 IBT, Universidad Nacional Agraria La Molina, Lima, Perú;2 Instituto Nacional de Innovación Agraria, Puno, Perú. Proyecto LAC-Biosafety, Perú.

© Proyecto LAC-Biosafety, Perú. IBT-UNALM Instituto de Biotecnología, Universidad Nacional Agraria La Molina, Lima, Perú. Av. La Molina s/n La Molina. Teléfono 614-7800 Anexo 436.http://www.lamolina.edu.pe/institutos/ibt/default.html

© Javier Franco P. (Ing. Agr., Ph.D.)IBT, Universidad Nacional Agraria La Molina, Lima, Perú. Proyecto LAC-Biosafety, Perú.

© Jesús Arcos (Ing. Agr. , Ms. Sc.)Instituto Nacional de Innovación Agraria, Puno, Perú. Proyecto LAC-Biosafety, Perú.

© Wilfredo Barreda (Ing. Agr.)Instituto Nacional de Innovación Agraria, Puno, Perú. Proyecto LAC-Biosafety, Perú.

Editor:Fundación para el Desarrollo AgrarioProyecto LAC-Biosafety, PerúEnrique N. Fernández-NorthcoteCoordinador Nacional C. Elec.: efernandeznorth@lamolina.edu.pehttp://www.lacbiosafety.org/

Primera ediciónMayo 2013500 ejemplares

Impresión: Jesús Bellido M. Los Zafiros, 244, Balconcillo. Lima 13. T. 470 2773

Hecho el Depósito Legal en la Biblioteca Nacional del Perú: 2013 – 07287

Citación:Javier Franco P., Jesús Arcos y Wilfredo Barreda. 2013. Impacto de papas genéticamente modificadas sobre organismos no blanco del suelo y del follaje: Protocolos para la evaluación. Boletín Técnico. Proyecto LAC-Biosafety, Perú. Instituto de Biotecnología, Universidad Nacional Agraria La Molina, Lima-Perú.

El IBT-UNALM, el Proyecto LAC-Biosafety, Perú y los autores autorizan la reproducción total o parcial de esta publicación, para fines educativos u otros no comerciales, sin necesidad de permiso escrito previo del IBT-UNALM y del Proyecto LAC-Biosafety, Perú, dando el crédito a la Institución, Proyecto y a los Autores e incluyendo la citación correcta de esta publicación.

ÍNDICE

Resumen 5

I. Antecedentes 5

I.1. Introducción 5

I.2. Grupos Funcionales 6

I.3. Cadenas Tróficas 6

I.4. Línea Base 9

I.5. Estudio de Caso: Papa GM con Resistencia a Globodera spp. 10

II. Muestreo para evaluación de Organismos y Micro-organismos 11No-Blanco en Papas Genéticamente Modificadas

II.1. Introducción 11

II.2. Caracterización de parcelas de estudio 13

II.3. Toma de muestras 14

a. De suelo 14b. De suelo rizosférico 15

II.4. Monitoreo de poblaciones de artrópodos y otros 16micro-organismos

III. Protocolos para estimar poblaciones de Organismos y Micro-organismos 17

III.1. Protocolos para la captura de artrópodos del suelo 17

a. Método de embudos de Berlesse 17b. Método de Trampas de Caída (Trampas Pitfall) 19

III.2. Protocolos para la captura de artrópodos de la parte aérea 20

a. Método de Trampas Amarillas Adhesivas 20b. Método de Jameo 20

III.3. Protocolos para el aislamiento de micro-organismos de la rizósfera 21del suelo (bacterias, hongos)

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a. Método para el recuento total de bacterias aerobias mesófilas o 22heterotróficas

b. Aislamiento de Bacillus spp. 23c. Aislamiento de Pseudomonas spp. 24d. Aislamiento de Actinomyces spp. 26e. Aislamiento de bacterias solubilizadoras de fósforo 27f. Aislamiento de bacterias endófitas 29g. Evaluación de hongos micorrícicos en raíces de plantas 29

III.4. Protocolos para el aislamiento de nematodos del suelo 31

a. Embudo de Baermann 32b. Método de la bandeja 33c. Método combinado de tamizado y centrifugación en 33

azúcar (Cuantitativo)d. Método de Fenwick para extraer nematodos 33

enquistados (Cuantitativo)e. Método de la botella (Cualitativo) 34f. Método del vaso (Cualitativo) 34

III.5. Diseños experimentales y análisis de datos 35

III.6. Comentarios Finales 35

IV. Literatura Citada 35

V. Agradecimientos 38

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ResumenLa liberación al medio ambiente de Organismos Vivos Genéticamente Modificados (OVM) u Organismos Genéticamente Modificados (OGM) con atributos de resistencia a plagas / enfermedades y/o nutricionales, incorporados en su genoma, requiere conforme a Normas de Bioseguridad establecidas, de una serie de evaluaciones de laboratorio y campo que garanticen la no existencia de riesgos para el ecosistema donde se pretenda liberar ypara la salud humana. En esta oportunidad, la presente publicación describe luego de una introducción al tema, los protocolos a aplicarse para evaluar los posibles riesgos de una “potencial” liberación de una variedad de papa genéticamente transformada en la región Altiplánica de Puno, centro de origen y diversificación de este cultivo, sobre los “Organismos No-Blanco” del suelo y del follaje.En primer lugar se caracteriza el agro-ecosistema de la región a realizarse la “liberación” y se selecciona el área donde se establecerán las parcelas de evaluación de riesgo de la “papa modificada” y otros cultivos locales tradicionales. Se establece un cronograma de muestreos de suelo y de trampeo para la captura y monitoreo de artrópodos y otros microorganismos que ocurran durante el ciclo de desarrollo de los cultivos. Los protocolos de evaluación de riesgo en campo y laboratorio describen los pasos a seguir para la toma de muestras de suelo y de follaje en las parcelas de cultivos y que luego permitan el aislamiento e identificación de artrópodos (insectos, ácaros, colémbolos, arácnidos) y otros microorganismos (hongos, bacterias, nematodos) extraídos en el laboratorio.Finalmente los datos colectados se sistematizan y comparan por pruebas estadísticas para determinar la diversidad y abundancia de los diversos especímenes capturados a lo largo dela evaluación de la “papa genéticamente Modificada” en relación a otra papa no modificada y los otros cultivos locales tradicionales.

I. ANTECEDENTES

I.1. Introducción

Se define como Organismos No-Blanco a todos aquellos que no son objetivo de las prácticas destinadas a la reducción o control de una plaga. En el caso de una papagenéticamente modificada (GM), se trata de cualquier organismo en el agro-ecosistema papa que pudiera ser negativamente afectado por el producto del gen introducido para controlar una plaga, entendiéndose ésta como cualquier factor biótico (insectos, hongos,bacterias, virus, fitoplasmas, nematodos, malezas, etc.) o abiótico (frío, calor, agua) que afecten el normal desarrollo del cultivo.

Esquemas regulatorios existentes reconocen el hecho de que el manejo agrícola involucra la protección de cultivos, y que estas prácticas involucran inevitablemente ciertos impactos ambientales. Las regulaciones están dirigidas a garantizar que los impactos que ocurran solo afecten a las plagas blanco, y en lo posible excluyan cualquier otro efecto no intencionado sobre organismos no-blanco. Tres tipos de efectos pueder ser diferenciados cuando comparamos los efectos de diferentes prácticas de protección de cultivos: (1)

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efectos intencionales en las plagas, (2) efectos tróficos inevitables debido a la ausencia de esas plagas y (3) efectos no intencionales sobre la fauna de artrópodos (artropofauna) yotros organismos en cultivos agrícolas y su medio ambiente.El conocimiento de la población de grupos de organismos, o grupos funcionales, en un sistema agrícola es muy importante, porque permite conocer si el ecosistema de un determinado lugar se encuentra en equilibrio; es decir, si los diferentes grupos funcionales están cumpliendo apropiada, equilibrada y armónicamente con su rol agroecológico. Elconocimiento de los grupos funcionales es crítico para las sociedades humanas ya que, por ejemplo, servicios de los agro ecosistemas como la provisión de agua dulce, la fertilidad de los suelos agrícolas, la regulación del clima, el control de plagas y enfermedades, la producción de alimentos, la prevención de desastres naturales y la regeneración de la vegetación, entre muchos otros, dependen de manera crítica de la actividad de diversos grupos funcionales de organismos y de la agro biodiversidad contenida en ellos (Westover, K.M. et al., 1997; Grayston, S.J., et al., 1998). .I.2. Grupos FuncionalesLas especies que habitan un agro ecosistema difieren en atributos fisiológicos, morfológicos, conductuales y de historia de vida, y con ello afectan de manera diferencial la estructura, dinámica o funcionamiento de las comunidades bióticas y de los agroecosistemas. Un agro ecosistema consiste de la comunidad biológica de un lugar y de los factores físicos y químicos que constituyen el ambiente abiótico. Además, las especies difieren en sus respuestas a cambios ambientales como los disturbios naturales o de origen humano. Las especies que son similares en sus atributos, en sus respuestas a cambios drásticos o que desempeñan un rol ecológico semejante conforman un grupo funcional. Cada grupo funcional es un grupo de organismos que caracterizan a una función química y/o biológica y que tienen propiedades características bien definidas. Los diversos organismos que se encuentran en un ecosistema cumplen un rol regulador de las diversas poblaciones existentes para que este funcione apropiada, equilibrada y armónicamente sin causar cambios drásticos que pongan en riesgo el eco-agro-sistema. Cada grupo de organismos cumple un rol específico en la cadena de eventos que se suceden en el ecosistema. La acción antropogénica que viene causando la degradación de los agroecosistemas ha llevado a la desaparición de grupos funcionales fundamentales, y con ello han emergido serios problemas ambientales con tremendas repercusiones sociales y económicas (Sujii, 2012).

I.3. Cadenas TróficasLa cadena trófica se describe como el proceso de transferencia de sustancias nutritivas a través de las diferentes especies de una comunidad biológica, en el que cada uno se alimenta del precedente y es alimento del siguiente. Cada cadena se inicia con un vegetal,productor u organismo autótrofo o sea un organismo que "fabrica su propio alimento" sintetizando sustancias orgánicas a partir de sustancias inorgánicas que toma del aire y del suelo, y energía solar (fotosíntesis), o mediante sustancias y reacciones químicas (quimiosíntesis). Los demás integrantes de la cadena se denominan “consumidores”. Aquel que se alimenta del productor será el consumidor primario; el que se alimenta de este último será el consumidor secundario que sería un carnívoro, y un terciario que sería un súper -carnívoro de algún otro ser. Existe un último nivel en la cadena alimentaria que corresponde a los descomponedores o degradadores, que son los microorganismos queactúan sobre los organismos muertos, degradan la materia orgánica. Una cadena alimentaria en caso de desaparecer un eslabón, tiene varias desventajas, pues

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desaparecerán con él todos los eslabones anteriores al quedarse sin alimento. Así se tienen algunos posibles efectos que afectarían el equilibrio del agroecosistema, sin embargo, en la realidad esto rara vez ocurre porque las cadenas alimentarias en sentido estricto no existen; cuando desaparece un eslabón otros consumidores ocupan su lugar.

Por lo indicado, en una comunidad biológica existen:Productores primarios (autótrofos), que utilizando la energía solar o reacciones químicas minerales obtienen la energía necesaria para fabricar materia orgánica a partir de nutrientes inorgánicos, tales como las plantas de los cultivos.Consumidores (heterótrofos), que producen sus componentes a partir de la materia orgánica procedente de otros seres vivos. A este grupo pertenecen todos los integrantes del reino animal, los hongos, gran parte de las bacterias y de las arqueas. A continuación sedescriben los diversos tipos de consumidores.

Consumidores primarios, los fitófagos o herbívoros. Devoran a los organismos autótrofos, principalmente plantas o algas, se alimentan de ellos de forma parásita, como hacen por ejemplo los pulgones, son comensales o simbiontes de plantas, como las abejas, o se especializan en devorar sus restos muertos, como los ácaros olos milpiés.Consumidores secundarios, los zoófagos o carnívoros, que se alimentan directamente de consumidores primarios, pero también los parásitos de los herbívoros, como por ejemplo el ácaro Varroa, que parasita a las abejas.Consumidores terciarios, los organismos que incluyen de forma habitual consumidores secundarios en su fuente de alimento.

En realidad, puede haber hasta seis o siete niveles tróficos de consumidores, rara vez más, formando no sólo cadenas basadas en la predación o captura directa, sino en el parasitismo,el mutualismo, el comensalismo o la descomposición.Las especies consumidoras pueden ser, clasificadas por la modalidad de explotación del recurso como:

Predadores: Organismos que ingieren el cuerpo de sus presas, entero o en parte. Esta actividad se llama predación.Descomponedores: son aquellos organismos saprótrofos (saprófitos), como bacterias y hongos, que aprovechan los residuos procedentes de otros organismos yque pueden ser obligados o facultativos.Detritívoros: son algunos protistas y pequeños animales, que devoran los residuos sólidos que encuentran en el suelo.Parásitos y comensales: los parásitos pueden ser depredados, como lo son los pulgones de las plantas por mariquitas. Los parásitos suelen a su vez tener sus propios parásitos, de manera que cada parásito primario puede ser la base de una cadena trófica especial de parásitos de distintos órdenes.

En cuanto a los grupos funcionales y cadenas tróficas en los diversos agroecosistemas que se encuentran influenciados por factores bióticos y abióticos, se tiene que básicamente son los mismos ya descritos, variando en las especies que conforman los niveles tróficos en las diversas cadenas o redes tróficas (Figura 1).

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I.4. Línea BaseEl desarrollo de una “línea base” de información es esencial para la interpretación de resultados de pruebas de laboratorio, o de campo, porque proporcionan “el contexto en el cual la significancia agroecológica de cambios en las poblaciones, observados algunas veces en plantas GM, debe ser estimada”. Sin el entendimiento de la variación “normal”, ciertos efectos significativos podrían pasar desapercibidos, o beneficios marginales sobre estimados. Los cambios poblacionales deben ser investigados usando tiempos reales de duración del estudio y en sitios múltiples con información de campo local. La ausencia de datos sobre la variación normal no debe de ser usada para establecer el riesgo de OGM,pero si podría ser utilizada por los tomadores de decisión como una razón para invocar el enfoque precautorio.

Los agroecosistemas pueden cubrir diferentes ambientes y el número de especies en el ecosistema puede ser muy amplio. Un inventario de las especies más importantes en base al criterio de “caso por caso” (para cada OGM y su ambiente receptor) debe establecerse.

Los estudios que se lleven a cabo no solo deben evaluar el efecto directo de la toxicidad de un OGM, o el de los factores agrícolas asociados (ej. Herbicidas), sobre ciertas especies blanco de los OGM o no, pero también de los efectos potenciales sobre comunidades más amplias. Existe el argumento de que la mayoría de resultados de ensayos de laboratorio y campo sugieren que los cultivos con el gen Bt y las pulverizaciones con Bt, generalmente no tienen efecto tóxico para los artrópodos benéficos y otros organismos no-blanco. Sin embargo el objetivo general de estos estudios fue el medir el impacto de los cultivos Bt GM sobre solo ciertas plagas, los insectos polinizadores y sus enemigos naturales. Es así que la información es limitada y no muestra si la tecnología Bt afecta a toda una comunidad de organismos (Hilbeck et al., 2006).

Por ejemplo (lista no completa):La reducción de una especie (ej. especie blanco de un OGM con propiedades insecticidas) podría ocasionar una reducción de predadores o parasitoides de esa especie;La reducción de una especie (ej. especie blanco de OGM) podría ocasionar la reducción de una o varias otras especies como predadores o parásitos que cambien a nuevas fuentes de alimentos.

La línea base para evaluar el impacto de cultivos GM sobre la agro biodiversidad debe considerar las prácticas agrícolas de manejo que se apliquen en el lugar donde se evalúe el impacto del sistema del cultivo GM con respecto al impacto causado por las prácticas de cultivo que son reemplazadas. Esto conduce a preguntarse cómo el impacto de diferentes practicas de manejo de cultivos podrían ser comparadas para determinar si el impacto de sistemas de cultivos GM son menores, iguales o mayores que aquellos de las prácticascomunes. Es por eso que los estudios de evaluación de impacto pueden ser unicamente efectuados en base a la situación de “caso por caso” , donde la naturaleza del cultivo, los aspectos specíficos de las prácticas de manejo de plagas aplicados y el ambiente receptor son considerados. Sin embargo, un punto importante a considerar en cada comparación se refiere al hecho que todos los esquemas regulatorios diferencian entre efectos “intencionales” de las prácticas de cultivo aplicadas y los efectos “no intencionales” que deben ser minimizados. Esta diferenciación permite diseñar un esquema que permita evaluar si los efectos de diferentes prácticas de manejo de plagas deben ser consideradas

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como efectos intencionales (que se consideran como aceptables) y efectos no intencionales que podrian representar daños ambientales.

I.5. Estudio de Caso: Papa GM con Resistencia a Globodera spp.Diferencias en la diversidad de microorganismos del suelo entre cultivos han sido registrados (Fang et al., 2001; Marschner et al., 2001; Miethling et al., 2000) y entre variedades de un cultivo (Carelli et al., 2000; Di Giovanni et al., 1999). Esto ha sido atribuido a diferencias en la composición de los exudados radiculares. Por lo tanto, cambios en mezclas de cultivos en una zona en particular influencian la composición y diversidad de las comunidades del suelo que afectarán posiblemente las funciones del suelo. En este estudio se espera que un suelo bien manejado sea capaz de recuperarse (resilientes) de efectos adversos y permanecer dentro de parámetros definidos y aceptables.

En la actualidad existen diversas técnicas para medir la diversidad microbiana en el suelo(Tunlid and White., 1992), tales como la extracción de ácidos nucleicos y la amplificación y análisis de la secuencia 16S rDNA (Ogram, 2000). Estas técnicas proporcionan información de la diversidad genética y taxonómica de las comunidades microbianas. En contraste, el sistema BIOLOG MicroPlate para la identificación de bacterias proporciona información sobre la función de la comunidad microbiana y la diversidad funcional (Preston-Mafham et al., 2002) y ha sido usado exitosamente para investigar el efecto de rotación de cultivos y enmiendas de suelo (Lupwayi et al., 1999; Schutter and Dick, 2001).

Kiezebrink y Atkinson (2004) compararon métodos que permitieran detectar el impacto directo e indirecto de plantas transgénicas sobre los organismos de suelo y comunidades a ser evaluadas. Uno de los fines fue el identificar procedimientos confiables y sensitivos para ser aplicados a cualquier planta transgénica que pueda ser desarrollada en el futuro. Se usó un prototipo de un cultivo GM resistente a nematodos que expresaba una proteinasa inhibidora de cisteína (obtenida de semillas de arroz). El principal riesgo de una planta GM se relaciona a la toxicidad de la nueva proteína que se exprese, y la posibilidad de exposición de cualquier organismo a niveles dañinos. Si una planta GM es desarrollada para el control de una plaga, el modo de acción de la nueva proteína a expresarse será conocido. Por lo tanto, será posible diseñar ensayos basados en el modo de acción de la nueva proteína para evaluar cual invertebrado no-blanco podría ser vulnerable (Figura 3).Estudios previos no mostraron efectos adversos de papa GMRN-cistatin sobre áfidos y saltahojas no blanco que se alimentaban de las hojas o sobre parasitoides de áfidos(Cowgill et al., 2002a, 2003, 2004). Ácaros y colémbolos fueron los micro artrópodos más abundantes y se estableció que la papa GMNR-cistatin no promovió ningún cambio en la abundancia de éstos (Cowgill et al., 2002b). Sin embargo, varios insecticidas, especialmente piretroides, organofosforados y carbamatos son bien conocidos de ser altamente tóxicos a un amplio rango de enemigos naturales (Devine and Furlong, 2007) ypor ende interfieren negativamente con el control natural.

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In vitro bioensayos paraSensibilidad a cystatins

en la dieta

Caso” y “Paso x Paso”. En este “caso” la papa GM deberá seguir un proceso de evaluación en pasos o etapas en “escalonamiento”, en el que en primer lugar se debe de conocer todo lo relativo al cultivo tal como su distribución, diversidad, fisiología, plagas, especies NB en la parte aérea y subterránea, etc. y luego, del gen para la modificación genética al cultivo (inserción, expresión, tipo de proteína, etc.). Este proceso de evaluación se basa en un análisis Ex-ante, sobre todo lo referente al cultivo (antecedentes) y un Ex-post referido al monitoreo a realizarse tanto por experimentos en el laboratorio y en el campo para contar con una caracterización precisa de los efectos potenciales sobre los organismos No-Blanco. La estrategia que se plantea para estos análisis se describe a continuación.

Ex - ante: se establece toda información relevante o antecedente con respecto a las especies a ser seleccionadas como indicadoras para evaluar el efecto del evento incorporado en la planta de papa.

Elección de especies indicadoras:Conocimiento de la artropofauna en el cultivo de papa que permita la selección de especies NB en la parte aérea y subterránea o de los grupos funcionales, tales como los artrópodos del suelo y follaje (insectos plaga, sus predadores, parásitos y detritívoros), nematodos, hongos, bacterias, etc.

• Cuantificación de dosis letales y sub-letales para las especies indicadoras, a partir de la toxina depurada incorporada en dietas artificiales.

• Cruzamiento de la información con la distribución espacial y la fenología de las especies indicadoras.

Planta GM: Caracterización de Evento• Efecto del gen: proteína pesticida u otro.• Lugar de expresión del gen: constitutivo o tejido/órgano específico.• Persistencia en el medio ambiente.• Exposición directa o indirecta a proteína.• Cruzamiento de la información con la distribución espacial y la fenología de las

especies indicadoras.

Ex - Post: Monitoreo en laboratorio y campo de insectos plaga, sus predadores, parásitos y detritívoros, nematodos, hongos, bacterias, etc. en la parte aérea y subterránea en el cultivo de papa y otros.

Registro de especies plaga (herbívoros) y No Plaga o NB (polinizadores, detritívoros, predadores, parasitoides y/o generalistas), asociadas con la región aérea y de la raíz del cultivo de papa bajo condiciones del agroecosistema p.ej.Andino, desde la siembra hasta la cosecha de las plantas de papa, así como de otros cultivos tradicionales como la oca, olluco, quinua y el haba.

• Evaluar los efectos sobre organismos NB por experimentos de laboratorio y campo diseñados para identificar el riesgo, determinar los niveles de exposición a la nueva proteína en la papa GM y estimar si la amenaza constituye un riesgo.

Como se ha indicado, diferencias en la diversidad de organismos y microorganismos del agroecosistema (suelo y parte aérea) se atribuyen a la diversidad de cultivos y a su manejo,ocasionando cambios positivos y/o negativos en la estructura comunitaria microbiana que tendrían implicancias en el funcionamiento del suelo y las respectivas cadenas tróficas. En el caso de Perú, la zona agroecológica alto-andina de Puno representa el centro de origen y diversidad de la papa Solanum tuberosum ssp. andigena y constituye una región importante para llevar a cabo estudios que permitan establecer una línea base de

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conocimiento sobre la abundancia y diversidad de los organismos asociados a este sistema de producción, y poder avanzar en la identificación de bio-indicadores o grupos funcionales que posteriormente puedan ser empleados como herramienta para la evaluación del riesgo por la introducción de papas GM en sistemas agrícolas andinos. Enlos acápites a continuación se provee información parcial de los trabajos realizados en el Subproyecto “Generación de información básica para el análisis del impacto de organismos genéticamente modificados (OGM) en organismos no-blanco del suelo y de las partes aéreas de la planta de papa” del proyecto LAC-Biosafety, Informe Final: www.lacbiosafety.org (Franco, 2012).

II.2. Caracterización de parcelas de estudioUbicación geo-referenciada, plano de ubicación y áreas de las parcelas en al menos dos (2) localidadesHistorial de parcelas con diversos cultivos ( papa, haba, oca, cereal) Características físico-químicas de los suelos en campos con diferentes cultivosMonitoreo de poblaciones de micro-organismosPuntos de muestreo en parcelas con los diversos cultivos Frecuencia / época de muestreos

Características de parcelas de agricultores en el Altiplano Peruano, sembradas con papa nativa (Solanum tuberosum ssp. andigena cv. Ccompis) como de los cultivos de haba(Vicia fabae) y oca (Oxalis tuberosa) en dos localidades (Ticuyo y Camata) ubicadas a 3825 msnm y 3820 msnm, respectivamente, se presentan en las Tablas 1y 2.

Tabla 1. Historial en los campos de Ticuyo y Camata, muestreos y otras características.

Campaña Agrícola-Otros Historial enTicuyo Historial en Camata2011-2012 Papa var. Ccompis Papa var. Ccompis2010-2011 Cebada Var. Doctorcito Avena var. Vilcanota2009-2010 Avena var. Vilcanota Avena var. Vilcanota 2008-2009 Oca Var. K’ene Haba Var. Gigante2007-2008 Papa PapaAltitud 3832 msnm 3831 msnmLatitud 16* 15’ 31” 15* 56’ 39”Longitud 69* 35’ 21” 69* 51’ 31”Abonamiento Estiércol de ovino: 10 t/ha Estiércol de ovino: 10 t/haSiembra 30 Noviembre, 2011 30 Noviembre, 2011

Tabla 2.Características físico-químicas de los suelos en campos con diferentes cultivos.

Muestras Análisis Mecánico CO3Ca M.O. N Total pH C.E.

Arena(%)

Arcilla(%)

Limo(%)

Textura % % % Mh/cm

Camacachi-Papa

54 11 35 FA 0 0.74 0.03 6.20 0.122

Camata-Haba

28 21 51 FL 0 1.52 0.06 6.05 0.206

Camata-Papa

24 23 53 FL 0 1.78 0.07 5.88 0.195

Camacachi-Oca

62 5 33 FA 0 0.56 0.02 5.50 0.141

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Muestras Nutrientes Disponibles

Cationes Cambiables CIC SumaCationes

P(ppm)

K(ppm)

Al me/100g

Ca me/100g

Mg me/100g

Name/100g

Kme/100g

Me /100g

Camacachi-Papa

3.10 286.44 0.00 6.50 1.50 0.40 1.80 11.00 10.20

Camata-Haba

6.84 356.00 0.00 10.80 3.40 0.56 1.96 16.90 16.72

Camata-Papa

6.60 322.08 T 6.80 7.00 0.58 1.99 18.00 16.37

Camacachi-Oca

3.40 194.47 T 0.30 0.70 0.36 1.78 6.02 3.14

II.3. Toma de muestrasa. De sueloLa distribución de microorganismos en el suelo es altamente variable; puede variar dependiendo de las características químicas y físicas de los suelos, y de las prácticas agrícolas que se realicen, provocando una distribución heterogénea. Debido a esta heterogeneidad, para poder obtener una muestra representativa de la comunidad microbiana, es necesario tomar diferentes sub-muestras. Sin embargo, dentro del análisis de las sub-muestras podemos encontrar variaciones, que son atribuidas al error de muestreo. Para reducir el error provocado por el muestreo y las variaciones intrínsecas de las sub-muestras, algunas metodologías pueden ser consideradas (Waver et al., 1994). Una de las más utilizadas en microbiología, es la conocida como obtención de muestras compuestas (Fig. 4).

Figura 4. Muestras individuales comparadas con muestra compuesta.

Es importante además definir la unidad de muestreo de suelo: esta puede ser desde 10 g hasta 1 kg, dependiendo de las necesidades. El muestreo por medio de muestras compuestas ayuda a reducir el costo total del muestreo y también del análisis, haciendo más eficiente el uso de todos los posibles recursos. Por otro lado, este tipo de muestreo puede mejorar la extensión de área muestreada sin incrementar necesariamente el número

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de muestras. Para esto se toman muestras individuales obtenidas en una misma área; estas muestras son recuperadas en un mismo recipiente y bien mezcladas (Figs. 4 y 5).

Figura 5. Obtención de muestras compuestas.

Las muestras compuestas deben ser mezcladas en un recipiente (limpio y desinfestado con alcohol 70%) o de preferencia en una bolsa estéril (tipo Whirl Pack), posteriormente esta debe ser cerrada e identificada con el nombre del área de muestreo, la persona que realizóel muestreo, la fecha y el tipo de muestreo. Transportar las muestras al laboratorio lo antes posible, evitar su exposición a la radiación directa del Sol y conservar las muestras a una temperatura de 4°C.Nota: El equipo que sirve para el muestreo se tiene que limpiar con cepillo y agua entre cada sub-muestreo, y desinfestar con hipoclorito de sodio (3-5 %) antes de colectar la muestra siguiente.

b. De suelo rizosférico

En el caso de tomar muestras de suelo asociado a raíces de plantas o suelo rizosférico (que por definición representa la porción del suelo de unos mm de espesor que es altamente influenciada por las raíces de las plantas), la zona de muestreo debe ser definida excavando un hoyo al pie de la planta en dirección hacia las raíces utilizando un tubo muestreador (Fig. 6), o una pala estéril. El suelo no asociado a las raíces es eliminado sacudiendo fuertemente las raíces, teniendo la precaución de dejar la mayor cantidad de suelo adherido a las raíces, posteriormente las raíces con el suelo rizosférico son recolectadas en bolsa de plástico estéril, y esta es cerrada.Tomar nota de toda la información que se puede en relación con el sitio de muestreo. Tal información debe comprender la localización (incluyendo las coordenadas geográficas en el caso de que se dispone de un GPS), la temperatura del aire y del suelo, la naturaleza dela cubierta vegetal y la historia de cultivo del suelo si se trata de un campo agrícola. También, si es posible se debe tomar fotografías del sitio de muestreo.Cada muestra se debe de identificar con el nombre del área de muestreo, la persona que realizó el muestreo, la fecha y el tipo de muestreo (Waver et al., 1994). Una vez tomadas las muestras estas deben ser transportadas al laboratorio en una hielera.

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Figura. 6. Muestreo de suelo rizosférico cerca de la planta con un tubo muestreador.

II.4. Monitoreo de poblaciones de artrópodos y otros microorganismosCon la finalidad de obtener un nivel de captura representativo de las poblaciones objeto del estudio en el agroecosistema papa (papa y otros cultivos tradicionales), se registra la población de artrópodos (invertebrados con un esqueleto externo y apéndices articulados, que incluye, entre otros, insectos, arácnidos, crustáceos y miriápodos) de la parte aérea de las plantas de papa y a nivel del suelo, y otros organismos del suelo rizosférico en las fechas y frecuencias que se indican a continuación.Para alcanzar este objetivo se emplean cuatro (4) tipos de muestreo de artrópodos acorde al hábitat de los mismos, uno (1) para el muestreo de nematodos, y uno (1) para hongos y bacterias (Tabla 3).Tabla 3. Descripción de métodos de muestreos para monitoreo de artrópodos y otrosmicro-organismos.Tipo y/o habitat

de microorganismos

Tipo de muestro

Aislamiento / Extracción

Frecuencia de muestreo

(días)

No de muestras / muestreo

Artrópodos del suelo

Trampas pitfall Directo 15 10*Barreno: suelo Embudos Berlesse 30 10

Artrópodos aéreos

Trampas adhesivas

Directo15 10

Redes Directo 15 10Nematodos del suelo Barreno: suelo

Embudo BaermannSiembra, floración, cosecha

10Hongos rizosféricos Suelo / Raíces

Tamizado10

Bacterias rizosféricas Suelo / Raíces

Cultivos en medios10

*: 6 muestras para cultivo principal y 4 muestras para cultivo secundario

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Para el conteo de artrópodos a nivel del suelo en la superficie de parcela considerada se instalan 06 trampas de caída (trampas pitfall) en el cultivo principal (papa) y 04 trampas de caída en el cultivo secundario. Estas deben de estar distribuidas de forma tal que cubran equidistantemente la superficie de la parcela. El conteo de los artrópodos capturados en las trampas de caída se realiza cada 15 días desde el momento de la siembra hasta la cosecha del cultivo de papa.

Para el registro de artrópodos de la parte aérea, se instalan 06 trampas amarillas adhesivas en cada parcela de papa (cultivo principal) y 04 trampas amarillas en cultivo alrededor del cultivo principal papa (cultivo secundario, oca, haba, etc.) en forma similar a lo indicado para las trampas de caída. En las trampas amarillas, cada 15 días, desde la siembra hasta la cosecha se realizan las evaluaciones de artrópodos, tanto en el cultivo principal como en los cultivos secundarios. Los artrópodos de la parte aérea de las plantas, también se registran por el método de jameo que consiste en realizar 10 pases dobles de la red entomológica sobre el cultivo a lo largo del recorrido de la parcela. El conteo de artrópodos mediante el método de jameo, también se realiza cada 15 días desde el momento de la siembra hasta la cosecha del cultivo de papa. Para la determinación de la densidad de población de organismos del suelo rizosférico en el cultivo principal (papa) se toman 6 muestras compuestas de suelo adherido a las raíces de 5 plantas de papa a una profundidad de 10 a 15 cm usando un barreno de 10 cm de diámetro para conformar muestrascompuestas de aproximadamente 500 gramos cada una. Para los cultivos secundarios se toman 4 muestras compuestas en forma similar a las de cultivo principal. La toma de muestras de suelo rizosférico se realiza a la siembra, floración y cosecha de los cultivos.

Los colémbolos son extraídos de las muestras de suelo a través del método de Berlesse, las micorrizas mediante el método de tamizado y centrífuga (Sieverding, 1991) y las rizobacterias se aíslan por el método de diluciones seriadas. Los insectos capturados, en lo posible se deben identificar inmediatamente por el empleo de claves, de lo contrario se conservan en frascos con alcohol al 70% para su posterior identificación por especialistas.

Obtenidas las muestras de artrópodos (plaga y benéficos) colectados tanto de la parte aérea como del nivel del suelo, en lo posible se identifican inmediatamente o son preservados en alcohol (75%) hasta su identificación por medio de claves de identificación o posteriormente por especialistas en cada materia.

III. PROTOCOLOS PARA ESTIMAR POBLACIONES DE

ORGANISMOS Y MICROORGANISMOS

Para estimar las poblaciones de las diversas poblaciones de artrópodos y otros microorganismos en el suelo y la parte aérea del cultivo de papa y otros en campo, se implementan los protocolos que se describen a continuación.

III.1. Protocolos para la captura de artrópodos del suelo

a. Método de embudos de BerlesseObjetivo: Extracción de artrópodos del suelo (meso fauna del suelo)Materiales: Barreno para muestras de suelo tipo “Cup Cutter” que extrae 1500 g de suelo (Figura 7), bolsas rotuladas y embudos Berlesse (Figura 8).

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Procedimiento:Para la extracción de colémbolos, en una superficie de 300 m2 de papa se recomienda tomar seis (06) muestras de suelo rizosférico de seis (06) plantas de igual manera en la que se describe a continuación.El muestreo se inicia en el momento de la siembra del cultivo de papa, después de la siembra se muestrearán cada 30 días hasta el momento de la cosecha.De los seis (06) puntos o plantas de papa determinadas se toman aproximadamente 500 g de suelo rizosférico a una profundidad de 10 a 15 cm, usando un barreno de 10 cm de diámetro.Las muestras de suelo rizosférico se depositan en bolsas de plástico debidamente identificadas (fecha, lugar, número de punto o planta, número de muestreo).A nivel de laboratorio, al día siguiente del muestreo, las muestras el suelo rizosférico se depositan en los Embudos de Berlesse (Figura 9), por un periodo de tiempo de 24 horas, conservando la identificación de las bolsas en los embudos.Debajo de los embudos se colocan vasitos con 100 ml de alcohol al 70% para la recepción de los artrópodos que bajan de los embudos por la acción de la intensidad luminosa sobre la muestra de suelo.Los artrópodos (colémbolos y ácaros) que cayeron en los vasitos son contabilizados debajo de un microscopio, igualmente son fotografiados y otros preservados para su identificación (Figura 10).

Figura 7. Barrreno de muestreo. Figura 8. Embudo de Berlesse.

Figura 9. Equipo de Berlesse. Figura 10. Observación de artrópodos.

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b. Método de Trampas de Caída (Trampas Pitfall)

Objetivo: Captura de artrópodos a nivel del sueloMateriales: El equipo de trampas de caída (Figura 11) consistente en vasos de plástico (de 12onzas), cajas Petri plásticas, embudo de caída y tapas para colocar encima del embudo.Procedimiento:

El conteo de los artrópodos capturados en las trampas de caída se realiza cada 15 días, desde del momento de la siembra hasta la cosecha del cultivo de papa.En una superficie de 300 m2 de papa se recomienda la instalación de seis (06) trampas de caída (Figura 12).El vaso de plástico de 12 onzas se entierra dentro del suelo con la boca al ras del suelo, el embudo se coloca encima del vaso, para luego colocar la tapa, dejando un espacio que permita la caída de los insectos lateralmente (Figura 13), los que una vez en el fondo del vaso no pueden salir porque el embudo lo impide. El conteo de los artrópodos capturados en las trampas de caída se realiza después de 24 horas de colocadas las trampas. Las muestras son rotuladas con la siguiente información: Fecha, No. de lectura, No. de lote y No. de muestra.En el momento de registro de los artrópodos (plagas y benéficos) se toman las fotos y algunos son preservados para su identificación (Figura 14).

Figura 11. Materiales de trampa de caída. Figura 12. Colocado de la trampa de caída.

Figura 13. Trampa de caída instalada. Figura 14. Registro de artrópodos.

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III.2. Protocolos para la captura de artrópodos de la parte aérea

a. Método de Trampas Amarillas AdhesivasObjetivo: Captura de artrópodos de la parte aérea de las plantas de papa (plagas y benéficos)Materiales: Planchas de plástico amarillas de dimensiones de 55 x 30 cm (Figura 15), marcos de madera para asegurar planchas, varas de maderas de 2.2 m de longitud, Pegante Temocid oGrasa.Procedimiento:

La colocación de las trampas pegantes amarillas (TPA) para la captura de artrópodos se realiza cada 15 días, desde el momento de la siembra hasta la cosecha del cultivo de papa.En una superficie de 300 m2 de papa se recomienda la instalación de seis (06) trampas pegantes de color amarillo (Figura 16).En el marco del tablero se colocan las trampas plásticas amarillas, sobre la superficie de los plásticos se distribuye uniformemente el pegamento Temocid o grasa.El conteo de los artrópodos capturados en las trampas adhesivas se realiza después de 24 horas de colocadas las trampas.En el momento de registro de los artrópodos (plagas y benéficos) se toman las fotos y algunos son preservados para su identificación y rotuladas con la siguiente información:Fecha; No. de lectura, No. de lote y No. de muestra.

Figura 15. Trampa Adhesiva Amarilla. Figura 16. Instalación de trampas.

b. Método de JameoObjetivo: Captura de artrópodos alrededor de la parte aérea de las plantas de papa.Materiales: Red entomológica de 25 cm de diámetro (Figura 17), frasco letal conteniendo pastillas de cianuro para matar los insectos capturados y viales para preservar especímenes colectados.Procedimiento:

La captura de artrópodos a través de la red entomológica se realiza cada 15 días, desde el momento de la siembra hasta la cosecha del cultivo de papa.En una superficie de 300 m2 de papa se recomienda diez (10) pases dobles de la red entomológica (Figura 18).Para la captura de artrópodos se realizan 10 pases dobles de la red entomológica sobre la superficie de las plantas de papa.En el momento de registro de los artrópodos en la red entomológica (plagas y benéficos) se toman las fotos y algunos son preservados para su identificación.

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Figura 17. Red entomológica. Figura 18. Jameo con redes.

III.3. Protocolos para el aislamiento de microorganismos de la rizósfera del suelo

(bacterias, hongos)

Los microorganismos del suelo, tienen un impacto muy importante en el suelo y procesos funcionales de las plantas. Son determinantes críticos del estado nutricional del suelo, salud del cultivo, una productividad de los cultivos en general. Por ejemplo, la prevalencia de patógenos de suelo y otros organismos deletéreos pueden causar enfermedades severas y/oreducir el vigor de la planta, crecimiento, y suelos cultivados.Por otro lado la abundancia de organismos benéficos en la raíz y el suelo pueden suprimir o inhibir algunas enfermedades y/o patógenos, mejorar la nutrición de la planta, promover el desarrollo e incrementar la productividad.

De acuerdo a Coyne (2004), se estima que menos del 1 % de las especies bacterianas son cultivables, por lo que la diversidad real de las bacterias del suelo es sin lugar a dudas mucho mayor. Por lo que desde el punto de vista de la microbiología aplicada, es necesario desarrollar nuevas tecnologías que nos permitan cultivar y aislar microorganismos no cultivables, que conduce a la explotación de sus nuevas funciones. Existen numerosos métodos para examinar el número de bacterias y la diversidad y ningún método proporcionará toda la información deseada por los investigadores. Los métodos que esencialmente se pueden dividir en dos categorías métodos cultivables y los métodos no cultivables. La principal ventaja de los métodos cultivables es la posibilidad de obtener cultivos puros que se pueden almacenar para su posterior análisis o evaluación, como la identificación taxonómica, genética o funcional.

Las raíces de las plantas son un hábitat propicio para el desarrollo de microorganismos. Son muchas y muy variadas las poblaciones microbianas que se encuentran asociadas a las raíces de las plantas. Las interacciones entre los microorganismos del suelo y las raíces de las plantas satisfacen requerimientos nutritivos básicos para la planta y las comunidades microbianas asociadas a ella (Atlas y Bartha, 2002).

Por otro lado los microorganismos de la rizósfera ejercen una marcada influencia en el crecimiento de las plantas; así, en ausencia de poblaciones microbianas rizosféricas apropiadas, el crecimiento de las plantas puede verse perjudicado. Las poblaciones microbianas de la rizósfera benefician a las plantas, ya que aumentan el reciclado y la solubilización de nutrientes minerales; sintetizan vitaminas, aminoácidos, auxinas,

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citoquininas, y giberelinas que estimulan el crecimiento; y muestran antagonismo hacia patógenos potenciales de la planta mediante la competencia y el desarrollo de la relaciones amensales (interacción entre dos especies o poblaciones en la que una de ellas: Amensal es perjudicada por la otra: Inhibidora) basadas en la producción de antibióticos (Atlas y Bartha,2002).

Las rizobacterias promotoras del crecimiento son un grupo de bacterias de vida libre que colonizan la rizósfera y favorecen el desarrollo radicular de la planta (Azospirillum, Bacillus, Burkholderia, Klesiella, Pseudomonas, etc.).

a. Método para el recuento total de bacterias aerobias mesófilas o de heterotróficas

Materiales:Suelo rizosféricoTubos Falcón de 50 ml Perlas de vidrio de 0.6 mm de diámetro Agar de tripticasa y soya 10 % Agar Plate countPlacas Petri10 tubos de dilución con tampón fosfato salino (PBS) Espátula estérilAsa de DrigalskyTips o puntillas de 1000 y 200 l estérilesVortexCampana de flujo laminarMecheroBalanzaTimerAlcohol 70 %

Procedimiento (Figuras 19 y 20):Agregar 1 g de rizósfera de suelo a tubos Falcón estériles que contienen 10 perlas de vidrio estériles, a dichos tubos añadir 5 ml de PBS pH 7, luego agitar vigorosamente la muestra por 2 min.Tomar 0.5 ml de dicho tubo y añadir a un tubo que contiene 4.5 ml de PBS y realizar diluciones decimales hasta la dilución 10-7.Sembrar 100 μl, de las diluciones 10-7 ,10-6, en Agar plate count, Agar de tripticaseina de soja 10 % y distribuir con la ayuda de un asa de Drigalsky para el recuento de heterótrofos totales. La siembra se realizará en triplicado.Incubar las placas sembradas a 28 ºC por 24-48 hrs Realizar el recuento al cumplir el periodo de incubación y expresar los resultados en UFC / g de rizósfera de suelo.Seleccionar colonias bacterianas de acuerdo a los siguientes criterios de selección (características morfológicas de la colonia, frecuencia, etc.).Repicar las colonias seleccionadas en agar nutritivo y/o agar TSA inclinado con un asa microbiológica, incubar por 24-48 hrs., si son bacterias.Conservar los cultivos a temperatura de refrigeración para su posterior estudio y caracterización.

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Figura 19 Figura 20

Figuras 19 y 20. Placas Petri con crecimiento bacteriano.

b. Aislamiento de Bacillus spp.

Los miembros del grupo Bacillus son habitantes comunes de la tierra, fango, vegetación en descomposición y sedimentos de lagos; se les conoce por que intervienen activamente en la descomposición de la materia orgánica. Son bacterias que tienen forma de bacilos grandes gram positivos que miden desde 0.3 a 2.3 micras de ancho y 1.2 a 7.0 micras de largo, la mayoría son móviles y poseen flagelos laterales, crecen en cadenas y forman colonias grandes e irregulares en los medios sólidos (agar nutritivo). Una característica importante que comparten es la capacidad de formar esporas resistentes al calor y a otros agentes destructivos, y ser metabólicamente muy diversos. Estos dos factores les permiten tener una colonización exitosa en diferentes ambientes. Algunas especies de este género tales como Bacillus subtilis, B. pumilus, B. licheniformes y B. cereus actúan como antagónicos frente a muchos microorganismos fitopatógenos (Agrios, 1995).

Materiales:Suelo rizosféricoTubos Falcón de 50 ml Perlas de vidrio de 0.6 mm de diámetro Agar de tripticasa y soya Placas Petri10 tubos de dilución con 4.5 ml de tampón fosfato salino (PBS) Espátula estérilAsa de DrigalskyTips o puntillas de 1000 y 200 l estérilesVortexCampana de flujo laminarMecheroBalanzaHorno seco TimerAlcohol 70 %

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Procedimiento (Método para el recuento total de Bacillus spp.):Agregar 1 g de rizósfera de suelo a tubos Falcón estériles que contienen 10 perlas de vidrio estériles, a dichos tubos añadir 5 ml de PBS pH 7, luego se procede a agitar vigorosamente la muestra por 2 min.Tomar 0.5 ml de dicho tubo y añadir a un tubo que contiene 4.5 ml de PBS y realizar diluciones decimales hasta la dilución 10-6. Llevar a horno seco a 80 ºC por 30 min. Sembrar 100 μl, de las diluciones 10-5 ,10-6, en Agar de tripticaseina de soja y distribuir con la ayuda de un asa de Drigalsky para el recuento de Bacillus spp. La siembra serealizará en triplicado.Incubar las placas sembradas a 28 ºC por 24-48 hrs.Realizar el recuento al cumplir el periodo de incubación y expresar los resultados en UFC / g de rizósfera de suelo.Seleccionar colonias bacterianas de acuerdo a ciertos criterios de selección tales como características morfológicas de la colonia, frecuencia, etc.Repicar las colonias seleccionadas en agar nutritivo y/o agar TSA inclinado con un asa microbiológica, incubar por 24-48 hrs., si son bacterias.Conservar los cultivos a temperatura de refrigeración para su posterior estudio y caracterización.

Nota: Las colonias del genero Bacillus sp. se caracterizan por ser blanquecinas mucosas o secas con bordes irregulares. Algunas colonias van a presentarse más compactas y otras más dispersas y asimismo pueden hallarse colonias invasivas (Figura 21).

Figura 21. Colonias de Bacillus sp.

c. Aislamiento de Pseudomonas spp.

Las bacterias del género Pseudomonas son bacterias gram-negativas, móviles, que generalmente producen un pigmento verde amarillento difusible, llamado pioverdina o pseudobactina, este pigmento tiene una alta afinidad por los iones de hierro. La pioverdina producida por especies de Pseudomonas funciona como un pigmento difusible bacteriostático o antibiótico fungistático bajo ciertas condiciones.

Por otra parte la deficiencia del fósforo es un problema importante en la agricultura, debido principalmente a que el fósforo se encuentra en forma insoluble. Algunos microorganismos tienen la capacidad de solubilizar las formas de fosfato insoluble y mantener la salud y calidad del suelo. Entre las bacterias solubilizadoras de fosfato se encuentra Pseudomonas fluorescens.

Materiales:Suelo rizosférico

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Tubos Falcón de 50 ml Perlas de vidrio de 0.6 de diámetro Agar King B o Agar Pseudomonas FAgar cetrimide Placas Petri10 tubos de dilución con 4.5 ml de tampón fosfato salino (PBS) Asa de DrigalskyTips o puntillas de 1000 y 200 l estérilesVortexCampana de flujo laminarMecheroBalanzaTimerAlcohol 70 %

Procedimiento (Método para el recuento de Pseudomonas spp.):Agregar 1 g de rizósfera de suelo a tubos Falcón estériles que contienen 10 perlas de vidrio estériles, a dichos tubos añadir 5 ml de PBS pH 7, luego se procede a agitar vigorosamente la muestra por 2 min.Tomar 0.5 ml de dicho tubo y añadir a un tubo que contiene 4.5 ml de PBS y realizar diluciones decimales hasta la dilución 10-6. Llevar a horno seco a 80 ºC por 30 min. Sembrar 100 μl, de las diluciones 10-5 ,10-6, en Agar King B/ Agar Pseudomonas F o Agar Cetrimide y sembrar en superficie con la ayuda de un asa de Drigalsky para el recuento. Lasiembra se realizará en triplicado.Incubar las placas sembradas a 28 ºC por 24-48 hrs.Realizar el recuento al cumplir el periodo de incubación y expresar los resultados en UFC / g de rizósfera de suelo.Seleccionar colonias bacterianas de acuerdo a los siguientes criterios de selección (producción de pigmento, características morfológicas de la colonia, frecuencia, etc.) Repicar las colonias seleccionadas en agar nutritivo y/o agar TSA inclinado con un asa microbiológica, incubar por 24-48 hrs., si son bacterias.Conservar los cultivos a temperatura de refrigeración para su posterior estudio y caracterización.

Nota: Visualizar los pigmentos producidos con la ayuda de luz UV (Figura 22) .

Figura 22. Iluminación con luz UV para observar pigmentos fluorescentes.

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d. Aislamiento de Actyinomyces spp.

Los actinomicetos representan a un grupo ubicuo de microorganismos ampliamente distribuidos en ecosistemas naturales y tienen gran importancia en la degradación de la materia orgánica además de ciertas propiedades fisiológicas que los hacen particulares dado su carácter procariótico. Estos microorganismos son abundantes en suelos, sin embargo también se encuentran en ambientes acuáticos dulces y marinos. Dentro de sus características presentan un olor típico a suelo húmedo debido a la producción de geosmina, adicionalmentepresentan una actividad metabólica alta, producen terpenoides, pigmentos y enzimas extracelulares con las que son capaces de degradar la materia orgánica de origen vegetal y animal.Se encuentran en casi todos los tipos de suelo y bajo condiciones extremas disminuyen levemente la concentración de la población, su número varía en gran proporción según el caso, pero es común encontrarlos en suelos fértiles con concentraciones de 106 UFC/g de suelo seco.

Materiales:Suelo rizosféricoTubos Falcón de 50 ml Perlas de vidrio de 0.6 mm de diámetro Agar avena Agar LMACicloheximida Placas Petri10 tubos de dilución con 4.5 ml de tampón fosfato salino (PBS) Espátula estérilAsa de DrigalskyTips o puntillas de 1000 y 200 l estérilesVortexCampana de flujo laminarMecheroBalanzaTimerAlcohol 70 %

Procedimiento (Método para el aislamiento de Actinomyces spp.):Agregar 1 g de rizósfera de suelo a tubos Falcón estériles que contienen 10 perlas de vidrio estériles, a dichos tubos añadir 5 ml de PBS pH 7, luego a agitar vigorosamente la muestra por 2 min.Tomar 0.5 ml de dicho tubo y añadir a un tubo que contiene 4.5 ml de PBS y realizar diluciones decimales hasta la dilución 10-6. Llevar a horno seco a 80 ºC por 30 min.Sembrar 100 μl, de las diluciones 10-5 ,10-6, en Agar- Avena y sembrar en superficie con la ayuda de un asa de Drigalsky, la siembra se realizará en triplicado.Incubar las placas sembradas a 28 ºC por 24-48 hrs.Seleccionar colonias bacterianas de acuerdo a los siguientes criterios de selección (producción de pigmento, características morfológicas de la colonia, frecuencia, etc.) Repicar las colonias seleccionadas en agar nutritivo y/o Agar-Avena inclinado con un asa microbiológica, incubar por 24-48 hrs, si son bacterias.

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Conservar los cultivos a temperatura de refrigeración para su posterior estudio y caracterización.

Nota: Una colonia típica de actinomicetos constituye una masa de filamentos ramificados que se originan en un propágulo o de un micelio, las colonias de algunos géneros que se desarrollan sobre la superficie del agar pueden tener una consistencia firme y se adhieren fuertemente al sustrato solidificado, con una superficie pulverulenta (Figura 23).

Figura 23. Actinomicetos aislados en agar avena.

e. Aislamiento de bacterias solubilizadoras de fósforo

La deficiencia del fósforo es un problema importante en la agricultura, la planta solo lo absorbe en la forma inorgánica y en esta forma se encuentra en bajas proporciones en el suelo, debido principalmente a que el fósforo se encuentra en forma insoluble. Suelos agrícolas poseen una considerable acumulación de fósforo debido a las regulares y excesivas aplicaciones de fertilizantes químicos.

Algunos microorganismos tienen la capacidad de solubilizar las formas de fosfato insoluble y mantener la salud y calidad del suelo. Entre las bacterias solubilizadoras de fosfato se encuentra las Pseudomonas fluorescentes que colonizan las raíces de las plantas.

Materiales:Suelo rizosféricoCaldo NBRIP pH 7.0 Erlenmeyer de 250 mlCicloheximidaEstreptomicina CloranfenicolPlacas Petri10 tubos de dilución con 4.5 de tampón fosfato salino (PBS) Espátula estérilAsa de DrigalskyTips o puntillas de 1000 y 200 l estérilesVortexCampana de flujo laminarMechero

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BalanzaTimerAlcohol 70 % Placas Petri con agar NBRIPTubos con 5 ml de caldo TSBTubos con 5 ml de caldo NBRIPAgitador (Shaker) a 28 °C y 100 rpmEstufa de incubación a 28 °CAsa microbiológica

Procedimiento:

Método I para el aislamiento de solubilizadores de fósforoPesar 2 gr se suelo húmedo en un matraz Erlenmeyer estéril de 250 ml.Agregar 48 ml de caldo NBRIP- FTC cubrir la boca del matraz con tapones de algodón estéril y una capucha de aluminio. Realizar el análisis en triplicado para cada muestra.Incubar a 28 ºC, 100 rpm por 7 días. Al cabo de este tiempo se procederá a realizar diluciones seriadas en solución salina o PBS desde 10-1 , 10-6.Sembrar 100 μl de las diluciones seleccionadas en placas de agar con NBRIP suplementado con ciclohexamida (Inhibidor fúngico), con la ayuda del asa de drigalsky.Incubar las placas sembradas a 28 ºC por 4 a 5 días.Repicar las colonias seleccionadas en agar nutritivo inclinado con un asa microbiológica, incubar por 24-48 hrs., y conservar los cultivos a temperatura de refrigeración para su posterior estudio y caracterización.Nota: Las colonias bacterianas que estén rodeadas por zonas de aclaramiento (zonas de solubilización de fósforo) deben ser transferidas a un nuevo medio sólido hasta ser purificadas (Figuras 24 y 25).

Método II para el aislamiento de solubilizadores de fósforoA partir de las colonias en agar TSA 10 %, repicar en placas que contienen agar NBRIP FTC. Paralelamente sembrar una bacteria conocida con capacidad solubilizadora de fosforo que hará de control positivo. Incubar las placas por 4-5 días a 28 °C.Medir los halos de solubilización diariamente.También se puede partir de colonias reactivadas en TSB de 18-24 Hrs.

placas de agar NBRIP secar e incubarlas por 5 días, diariamente medir los halos de inhibición en mm para un análisis cuantitativo. También se puede sembrar en estrías solo para un análisis cualitativo.

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Figura 24 Figura 25

Figuras 24 y 25. Siembra en estrías en placa con agar NBRIP para análisis cualitativo ysiembra líquida en agar NBRIP para el análisis cuantitativo de solubilizacion de fosfato inorgánico.

f. Aislamiento de bacterias endófitas

Objetivo: Aislar bacterias endófitas que existan en raíces, hojas y tallos de plantas de papa yotros cultivos.

Materiales:Hipoclorito de sodio (8.5%)6 g Na Cl 0.1 g CaCl20.1g KCl Placas PetriTriptona soya agar (40 g/1000 ml de agua destilada)Pinzas Bolsas de plástico

Procedimiento:Se procede a lavar las raíces u otra parte de la planta de papa Luego se desinfecta con hipoclorito de sodio al 8.5% durante tres minutos Luego se procede a lavar en agua esterilizada en dos oportunidades cada uno durante un minuto.Con la ayuda de pinzas estériles se coloca las raíces en bolsas de plástico y se añade un ml de la solución buffer (NaCl 6 g, CaCl2 0.1 g y KCl 0.1g en 1000 ml de agua destilada). Posteriormente se macera la muestra con la ayuda de un tubo y luego de esta solución macerada se toma 100 μl y se siembra en placas Petri con Triptona soya agar (40 g /1000 ml de agua destilada) previamente autoclavada durante 15 min a 121 ºC.Posteriormente se incuba a 28ºC durante 48 horas y se procede a observar y reaislar para ir purificando cada bacteria endófita.

g. Evaluación de hongos micorrícicos en raíces de plantas

Los hongos micorrizas aumentan significativamente la capacidad de absorción de fósforo (P) de las plantas inoculadas, ya que forman una cubierta sobre la raíz extendiendo su micelio a

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varios metros de la planta. Además de este efecto nutricional, las micorrizas arbusculares juegan un rol clave en la sostenibilidad del sistema suelo-planta, ya que incrementan el número de microorganismos benéficos en la rizósfera, creando una micorrizosfera favorable para el desarrollo de poblaciones nativas. Estas poblaciones están conformadas por bacterias simbiontes fijadoras de Nitrógeno, microorganismos que solubilizan el fósforo (P), bacterias promotoras de crecimiento tales como Pseudomonas y Bacillus, así como otros organismos de vida libre (Linderman, 1992). Estas poblaciones nativas, así como la red hifal de las micorrizas, mejoran la calidad de los suelos agrícolas al formar agregados estables que favorecen la aireación y la percolación del agua debido a la producción de glomalina (Rosier et al., 2006).

Objetivo: Evaluar el potencial de multiplicación del hongo micorricico en raíces

Materiales:KOH al 10%Tinta Pelikan Acido acéticoPortaobjetosMicroscopio

Procedimiento (frecuencia e intensidad de micorrización):El muestreo de suelo y raíces se realiza en plantas de las cuales se elimina la parte seca de suelo y se separan las raíces superficiales con un poco de suelo en bolsas de plástico previamente identificadas para observar en laboratorio la presencia de las micorrizas.La muestra de raíz se lava sobre un colador y se colocan en un tubo de ensayo, al que luego se añade una solución de KOH al 10% (100 g KOH por 1000 ml agua), posteriormente se calienta en estufa a 90ºC durante 15 min y posteriormente se lava con bastante agua (Figura 26).Luego se añade tinta acidificada con 5 % de tinta (Pelikan) y 5 % de acido acético (50 ml

Tinta, 50 ml de ácido acético por 1000 ml de agua) y se calienta en estufa a 90ºC durante 15 min, luego se lava y se deja en los tubos con agua (Vierheilig et. al., 1998).

Figura 26. Tinción de raíces de papa para observar micorrizas

Figura 27. Observación al microscopio de raíces

Figura 28. Hifas y esporas demicorrizas en raíces de papa

Las observaciones se realizan luego de cortar las raíces más finas en trozos de 1 cm de longitud aproximadamente, se colocan 10 cortes sobre un portaobjeto con una gota de agua

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y se cubre con otra placa de vidrio para proceder a observar al microscopio (Figuras 27 y 28) de acuerdo a la siguiente escala (Figura 29):

Figura 29. Escala de evaluación para determinar intensidad de micorrización (%) Donde: 0= sin infección; 1= infección entre 1-20%; 2= infección entre 21-40%; 3=infección entre 41-60%; 4=infección entre 61-80% y 5= infección entre 81%-100%

Las lecturas por muestra son de 30 unidades, las cuales se utilizan para determinar la frecuencia e intensidad de micorrizacion de acuerdo a la siguiente fórmula:

Frecuencia de micorrización (%) = (Nº de fragmentos con micorriza/total de fragmentos) x 100

Intensidad de micorrización (%) = (0.1v+0.3w+0.5x+0.7y+0.9z/v+w+x+y+z) x 100Dónde: v,w,x,y,z = Número de fragmentos de la clase 1, 2, 3, 4 y 5.

Procedimiento (Extracción de esporas de micorriza en suelo):Se colocan 100 g de cada una de las muestras colectadas en un recipiente y se añade agua para disgregarlo. Se pasa la suspensión por tamices de 400, 100 y 28 mesh; lo colectado sobre cada tamiz se recoge por separado sobre un papel filtro, y cada uno de éstos se coloca sobre un embudo conectado a una bomba al vacio. Posteriormente se deja secar y se pesa por separado.De lo colectado sobre el tamiz de 100 y de de 400 mesh (número de hilos por pulgada cuadrada) se pesa 10%, y el 5% respectivamente y se coloca en tubos de centrifuga con 20 ml de agua y 20 ml de azúcar al 2M. Se centrifuga a 2500 rpm durante 5 minutos, posteriormente la fase liquida se pasa sobre un tamiz de 400 mesh y lo colectado sobre éste se recoge en placas para efectuar el contaje de esporas.

III.4. Protocolos para el aislamiento de nematodos del suelo

Los nematodos del suelo, además de la clasificación taxonómica, son también agrupados de acuerdo al material o medio del que se alimentan. Así tenemos nematodos saprófagos, predadores y fitófagos o fitoparásitos. Los primeros se alimentan de materia orgánica en descomposición (hongo y bacterias). Los depredadores son aquellos que se alimentan de otros nematodos y pequeños animales. Los fitoparásitos son aquellos que interesan a la Fito-Nematología y comprenden a los que se alimentan de jugos celulares y tejidos de diversos órganos de las plantas superiores. Cada grupo indicado esta caracterizado por su estructura bucal, la misma que les permitirá alimentarse (Figura 30). En un inicio la identificación de nematodos parásitos de plantas es difícil como en cualquiera otro caso de identificación de otro grupo de animales o plantas. Lo indispensable es desarrollar suficiente práctica para reconocer y medir en primer lugar diversas estructuras del nematodo bajo un buen microscopio compuesto.

Empleando el objetivo de potencia media obsérvese el estilete. Los nematodos parásitos de plantas tienen en su mayoría estilete notorio. Si el nematodo no tiene estilete, o si el estilete no se parece a ninguno conocido, la especie que se estudia probablemente no es un parásito de plantas.

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b. Método de la bandejaSe utiliza para extraer nematodos vermiformes y es muy similar al anterior, aun cuando emplea materiales diferentes (Figura 31).

Colocar sobre un recipiente un colador con papel facialLuego colocar la muestra (100 cc)Posteriormente añadir agua al recipienteDejar reposar 24- 48 hrsLuego pasar la suspensión por un tamiz de 400 mesh con la ayuda de una pisetaPosteriormente se procede a observar los nematodos recuperados bajo un microscopio estereoscópico

Figura 31. Método de la bandeja.

Igualmente se utiliza para la extracción de nematodos vermiformes aun no activos. De la muestra de suelo se coloca 100 g de suelo en 2/3 partes de agua de un recipiente (baldes) de cinco litros de capacidad y se agita para homogeneizar la suspensión resultante, dejando reposar luego durante 30 seg con el objeto de que las partículas de suelo de la suspensión se sedimenten, posteriormente se decanta y se pasa a través de tamices de 80 y 400 mesh, recuperándose los nematodos del tamiz 400, los cuales se transfieren a los tubos de centrifugadora, los que se centrifugan a 3000 rpm por cinco minutos; el sobrenadante de cada tubo es eliminado y se agrega una solución de azúcar (50%) a cada tubo de centrifuga que es agitado hasta homogeneizar la suspensión de azúcar con los restos de suelo más los nematodos, posteriormente se centrifuga por tres minutos a 3000 rpm y el sobrenadante resultante se recupera y lava sobre un tamiz de 400 mesh para eliminar la solución de azúcar. El contenido del tamiz se lleva a placas Petri para su identificación por medio de claves y posterior cuantificación en el estereoscopio. Este método se usa para extraer nematodos vermiformes (Nacobbus aberrans, Ditylenchus dipsaci, Meloidogyne, etc.).

Es un método importante para la extracción de quistes de Globodera y Heterodera. Se basa en el principio de flotación del quiste en agua. El procedimiento es el siguiente:

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c. Método combinado de tamizado y centrifugación en azúcar (Cuantitativo)

d. Método de Fenwick para extraer nematodos enquistados (Cuantitativo)

Se coloca un tamiz 20 mesh sobre un recipiente o embudo Fenwick que recibe el agua y que retiene partículas grandes del suelo colocados sobre este tamiz. Al ser llenado el recipiente, este rebalsa y el contenido con quiste y otro material flotante se recoge en un tamiz 80 ó 100 mesh; luego este contenido se deja secar en un embudo para proceder a la separación del quiste.

Una purificación de la muestra anterior se logra mediante la limpieza con gasolina. Una vez secos los quiste y residuos de materia orgánica, se transfiere a un matraz de 250 ml de capacidad y se añade gasolina. Luego de agitar el contenido se rellena con gasolina hasta el ras. Después de medio minuto, se vierte parte del contenido del matraz sobre un embudo con un papel de filtro, rotando este mientras realiza la operación de vaciado. Luego estos quistes se transfieren a una placa para identificar de acuerdo a su forma y cortes perineales. El embudo debe estar colocado dentro de otro recipiente para recuperar la gasolina y darle nuevamente uso.

e. Método de la botella (Cualitativo)Aún cuando este método es bastante sencillo, hay que considerar las siguientes sugerencias: Utilizar una botella de refresco transparente en la que se introduce la muestra, se agrega un poco de agua, se agita vigorosamente, se añade agua hasta el borde de la botella y se deja reposar por un minuto. El contenido superior de la botella (cuello) se pasa sobre un papelfiltro, higiénico o sábana y se observa por la presencia de quistesEntre las ventajas de éste método se tiene que:

Es un método de diagnóstico rápido para la detección de quistes. Requiere de poco material para su ejecución.

Pero como desventajas se tiene que:Es menos preciso que otros métodos. Requiere de personal entrenado, para la observación de quistes.

f. Método del vaso (Cualitativo)Para observar nematodos enquistados en muestras de suelo (Figura 32)Colocar un pedazo de papel en el vaso Tomar unas dos cucharas de la muestra de suelo y un poco de aguaLuego mover la mezclaNuevamente llenar el vaso con aguaPosteriormente sacar el papel donde se verán los nematodos enquistados

Figura 32. Método del vaso.

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III.5. Diseños experimentales y análisis de resultados

Los diseños experimentales así como los análisis estadísticos empleados para la determinación de las poblaciones de artrópodos y y otros microorganismos en los ensayos de campo con diversos cultivos y muestreos en diferentes épocas de desarrollo de los mismos(ver acápite III.1.2.3.4 ) serán descritos en detalle en un artículo científico que se encuentra en preparación para su pronta publicación.

III.6. Comentarios Finales

Todos los protocolos descritos en la sección III han sido empleados para estimar las poblaciones de los diversos organismos y microorganismos que se encontraban en el suelo y la parte aérea del cultivo de papa y otros, en campos de agricultores ubicados a 3455 msnm en el Departamento de Puno, centro de origen y diversidad de este cultivo. Estos protocolos han permitido establecer, por los estudios de campo realizados, una línea base de abundancia y diversidad de los microorganismos presentes en cada cultivo, sea en el de papa y/o en los otros cultivos. Los resultados específicos obtenidos en estos estudios serán publicados en artículos científicos revisados por pares. Este conocimiento será de gran valor académico si en un futuro se introdujera el cultivo de una papa genéticamente modificada y es válido también para la evaluación de cualquier otra innovación tecnológica para el cultivo. Con las metodologías descritas será posible estudiar detalladamente si la papa GM en alguna forma estaría causando un efecto no deseable sobre las poblaciones deOrganismos No-Blanco, que es el objetivo final de este Boletín.

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V. AGRADECIMIENTOS

Deseo expresar mi agradecimiento a todas aquellas personas que además de los co-autores han colaborado en una u otra forma a la preparación de este Boletín. Mi especial agradecimiento al proyecto LAC-Biosafety (Brasil, Colombia, Costa Rica y Perú) y a mis colegas Gladis Main y Evelin Urquieta por su aporte en lo referente a métodos microbiológicos. Un especial agradecimiento al amigo y colega Dr. Enrique N. Fernandez-Northcote por su apoyo durante la duración del proyecto y la revisión de este Boletín, al Dr. William Roca por su contribución en la revisión final del documento. Dr. Javier Franco Ponce, Líder del Subproyecto.

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Proyecto LAC-Biosafety: http://www.lacbiosafety.org/

Instituto de Biotecnología (IBT), Universidad Nacional Agraria La Molina (UNALM), Lima, Perú:

http://www.lamolina.edu.pe/institutos/ibt/default.html