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JOSÉ AUGUSTO ZOREL

IDENTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS MICROBIANAS PRODUZIDAS DURANTE A

DIGESTÃO ANAERÓBIA DE MATÉRIA ORGÂNICA

Ouro Preto – MG, setembro de 2013

UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO

INSTITUTO DE CIÊNCIAS EXATAS E BIOLÓGICAS

DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA

IDENTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS MICROBIANAS PRODUZIDAS DURANTE A

DIGESTÃO ANAERÓBIA DE MATÉRIA ORGÂNICA

AUTOR: José Augusto Zorel

ORIENTADOR: Profa. Dra. Silvana de Queiroz Silva

CO-ORIENTADOR: Prof. Dr. William de Castro-Borges

Ouro Preto – MG, setembro de 2013

Dissertação submetida ao programa de Pós-

Graduação do Núcleo de Pesquisas em

Ciências Biológicas da Universidade

Federal de Ouro Preto, como parte

integrante dos requisitos para obtenção do

título de Mestre em Biotecnologia, área de

concentração: Genômica e Proteômica.

Zorel, J. A. Catalogação

ii

Zorel, J. A. Laboratório/Auxílio

ii

Este trabalho foi realizado no Laboratório de Biologia e Tecnologia de Micro-organismos – NUPEB/

ICEB/UFOP, com auxílio da Coordenadoria de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e

Universidade Federal de Ouro Preto (UFOP).

Zorel, J. A. Dedicatória

iii

À minha família, motivo e

razão para tudo.

Zorel, J. A. Epígrafe

iv

"Aprender é descobrir progressivamente sua própria ignorância."

Voltaire

Zorel, J. A. Agradecimentos

v

AGRADECIMENTOS

À minha esposa, Cyntia, a quem eu dedico essa e toda e qualquer realização, pelo amor e

pela ajuda em todos os momentos. E ao meu filho, João Renato, meu grilo falante. Duas

pessoas sem as quais eu não seria nada.

Ao meu pai, Edmilson, por tudo que fez por mim, por ser um pai de verdade.

À Profa. Dra. Silvana de Queiroz Silva, pela orientação, pela confiança depositada e por ter

literalmente me adotado durante o mestrado.

Ao Prof. Dr. William de Castro Borges, pela co-orientação, por todas as dúvidas sanadas e,

principalmente, pelo exemplo de comprometimento e dedicação ao ensino e a pesquisa.

Ao Prof. Sérgio Aquino, pelo auxílio na concepção do projeto, pelo apoio e colaboração.

Ao Prof. Leandro Moreira, pela orientação – não-acadêmica – indispensável à conclusão

desse trabalho.

Ao Prof. Robson José de Cássia Afonso, por ceder parte importante da estrutura necessária à

realização do trabalho e por toda a atenção prestada.

Ao casal Bruno e Ananda, por terem me ensinado muito e me ajudado ainda mais.

Aos amigos, por tudo.

Aos laboratórios do NUPEB e DEQUI, pela permissão e ajuda no uso de diversos

equipamentos.

À CAPES pelo auxílio financeiro.

A todos aqueles que, de alguma forma, auxiliaram no processo produtivo para o

desenvolvimento e conclusão da pesquisa.

Zorel, J. A. Índice

vi

ÍNDICE

Resumo......................................................................................................................................ix

Abstract......................................................................................................................................x

Lista de abreviaturas...............................................................................................................xi

Lista de figuras........................................................................................................................xii

Lista de tabelas.......................................................................................................................xiii

1. Introdução..............................................................................................................................2

1.1. Biotecnologia ambiental e tratamento biológico de resíduos..................................2

1.2. Bioquímica e microbiologia da digestão anaeróbia.................................................4

1.3. Substâncias poliméricas extracelulares (EPS) e produtos microbianos solúveis

(SMP)..........................................................................................................................................7

1.3.1. Substâncias poliméricas extracelulares........................................................7

1.3.2. Produtos microbianos solúveis (SMP).........................................................9

1.3.3. Fatores que afetam a produção de SMP.....................................................10

1.3.4. Funções dos SMP.......................................................................................12

1.3.5. Consequências da produção de SMP.........................................................14

1.3.6. Caracterização dos EPS e SMP..................................................................16

1.4. Caracterização molecular de comunidades naturais...............................................18

1.5. Metaproteômica......................................................................................................20

1.6. Proteômica do tratamento biológico de efluentes..................................................24

2. Justificativa..........................................................................................................................31

3. Objetivos..............................................................................................................................33

3.1. Objetivo geral.........................................................................................................33

3.2. Objetivos específicos..............................................................................................33

4. Materiais e métodos............................................................................................................35

4.1.Fluxograma de análises...........................................................................................35

4.2. Extração de substâncias poliméricas extracelulares (EPS) e precipitação da fração

proteica......................................................................................................................................35

4.2.1. Centrifugação (D´Abzac et al., 2010).....................................................36

4.2.2. Aquecimento (Li e Yang, 2007)..............................................................36


vii

4.2.3. Formaldeído (DÁbzac et al., 2010)........................................................36

4.2.4. Formaldeído e Aquecimento (DÁbzac et al., 2010)..............................37

4.2.5. EDTA (DÁbzac et al., 2010)………………………………………….37

4.2.6. Hidróxido de sódio (Park et al., 2008)....................................................37

4.2.7. Resina de troca catiônica (CER; Frolund et al., 1995)............................37

4.2.8. Sulfeto de sódio (Nielsen e Keidin, 1998)...............................................38

4.3. Quantificação de EPS.............................................................................................38

4.3.1. Quantificação de proteínas EPS..............................................................38

4.3.2. Quantificação de carboidratos EPS.........................................................39

4.3.3. Determinação de sólidos suspensos voláteis (SSV)..............................39

4.4. Cromatografia de exclusão molecular dos EPS....................................................40

4.5. Obtenção de SMP...................................................................................................40

4.5.1. Reator UASB...........................................................................................40

4.5.2. Coleta dos SMP do reator UASB............................................................42

4.5.3. Reatores em batelada alimentada..........................................................42

4.5.3.1. Determinação do consumo de glicose.................................................43

4.6. Extração de proteínas intracelulares (Hanreich et al., 2012).................................43

4.7. Eletroforese SDS-PAGE........................................................................................44

4.8. Coloração por Coomassie Coloidal G-250.............................................................44

4.9. Digestão das proteínas em gel para sequenciamento...........................................45

4.10. Digestão das proteínas em solução.......................................................................46

4.11. Espectrometria de massa por ionização do tipo Electrospray – LC-MS-IT-

TOF...............................................................................................................................46

5. Resultados e discussão........................................................................................................49

5.1. Extração de EPS.....................................................................................................49

5.1.1. Avaliação dos métodos de extração........................................................49

5.1.2. Caracterização dos extratos por cromatografia de exclusão molecular...52

5.1.3. Análise proteômica dos EPS...................................................................55

5.2. Proteínas SMP........................................................................................................60

5.2.1. Origem de proteínas SMP: comparação dos perfis proteicos de lise

celular, EPS e SMP.......................................................................................................60


viii

5.2.2. Variações no perfil proteico dos SMP relacionadas a alterações no

substrato........................................................................................................................63

5.3. Caracterização proteômica da comunidade microbiana do reator UASB tratando

glicerol...........................................................................................................................66

6. Conclusões...........................................................................................................................74

7. Perspectivas.........................................................................................................................76

8. Referências bibliográficas..................................................................................................78

Zorel, J. A. Resumo

ix

RESUMO

No decorrer do tratamento biológico de efluentes, junto à degradação de poluentes os micro-

organismos produzem diferentes biomacromoléculas (BMM) que diminuem a qualidade do

efluente. Dentre eles, destacam-se as substâncias poliméricas extracelulares (EPS) e os

produtos microbianos solúveis (SMP). Apesar da importância desses compostos no

desempenho do tratamento, sua caracterização molecular (origem e composição) é ainda

incipiente. Nesse sentido, esse trabalho tem como objetivo analisar proteínas envolvidas na

degradação anaeróbia de matéria orgânica. Para a análise de proteínas SMP produzidas

durante o crescimento microbiano (associadas à utilização do substrato - UAP), foram

testadas seis diferentes condições operacionais variando substrato, razão alimento/micro-

organismo e temperatura. Quanto à fração dos SMP associada à fase endógena (BAP), o

substrato foi omitido. O sobrenadante dos ensaios foi coletado e suas proteínas caracterizadas.

Com o intuito de identificar a origem das proteínas encontradas em solução (se provenientes

de lise celular ou hidrólise de EPS), foram extraídas proteínas intracelulares e da matriz

extracelular. Todas as amostras foram submetidas à separação por SDS-PAGE e/ou

identificação por LC-MS/MS. Os perfis de bandas apresentados pelas amostras de EPS

mostram que a grande maioria é comum a todos os extratos e que essas apresentam, em geral,

alta massa molecular. Entre as proteínas SMP, apesar de existirem proteínas comuns a todos

os ensaios, nota-se as proteínas liberadas parecem ser relacionadas com as condições externas.

A comparação das amostras supracitadas com proteínas oriundas de lise celular permitiu

sugerir que proteínas SMP de baixa massa molecular seriam possivelmente originadas da

hidrólise de EPS. Quanto às proteínas identificadas, entre os SMP, foram encontrados

indicativos da presença de proteínas originadas de lise celular (proteína de camada S,

proteíno-quinase e proteína ribossomal). Quanto às amostras de extratos celulares, foram

identificadas proteínas relacionadas à aderência celular (MrkA, OmpA), responsáveis pela

mobilidade celular (flagelina) e envolvidas na degradação de substratos (glicerol-

desidrogenase). Muitos dos espectros obtidos, apesar de apresentarem perfil típico de

fragmentação de peptídeos, não retornaram resultados positivos, evidenciando a necessidade

da construção de bancos de dados genômicos para amostras naturais. Dentro de nosso

conhecimento, esse é o primeiro trabalho a identificar proteínas SMP, mostrando

Zorel, J. A. Resumo

x

aplicabilidade de técnicas proteômicas para o entendimento da microbiologia de sistemas de

tratamento biológico.

Zorel, J. A. Abstract

xi

ABSTRACT

During wastewater biological treatment, in addition to degradation of pollutants,

microorganisms produce different biomacromolecules (BMM) which decrease effluent

quality. Among these polymers, there are extracellular polymeric substances (EPS) and the

soluble microbial products (SMP). Although the importance of these compounds to treatment

performance, their molecular characterization (origin and composition) is still incipient. The

goal of this work is to analyze proteins produced in anaerobic degradation of organic

compounds. To analyze the SMP proteins produced during the microbial growth (associated

with the substrate – UAP) six different operational conditions were tested, varying the

substrate, food/microorganism ratio and temperature. To obtain endogenous fase-associated

SMP (BAP), substrate was omitted. The supernatant was collected and the proteins

characterized. To identificate the source of solution proteins (whether from cellular lysis or

EPS hydrolysis), intracellular and extracellular matrix proteins were extracted. All samples

were submitted to SDS-PAGE separation and/or identification by LC-MS/MS. EPS band

pattern show that the great majority is common to all extracts and have, in general, high

molecular weight. To SMP proteins, despite the ocurrence of common proteins to all assays,

we can note that proteins released seen to be related with external conditions. The SMP, EPS

and cellular lysis protein comparison lead us to suppose that low molecular weight SMP

proteins were possible originated from EPS hydrolysis. Among identified proteins, were

found clues of presence of proteins from cellular lysis (S-layer protein, protein kinase, and

ribosomal protein). To cell extracts, proteins related with cellular adherence (MrkA, OmpA),

mobility (flagellin) and substrate degradation (glycerol-dehydrogenase) were identified.

Despite the identifiable peptide fragmentation patterns, several spectra did not return any

positive results, showing the necessity of construction of genomic data base to natural

samples. To our knowledge, this is the first work to identified SMP proteins, showing the

suitability of proteomics techniques to understanding biological treatment systems

microbiology.

Zorel, J. A. Lista de abreviaturas

xii

LISTA DE ABREVIATURAS

BAP - Biomass associated products

CSTR – Continuous Stirred Tank Reactor

DQO – Demanda química de oxigênio

DTT - Ditiotreitol

EBPR – Enhanced Biological Phosphorus

Removal

EDTA – Ácido di-aminotetra-acético

ESI – Electrospray Ionization

EPS – Extracellular polimeric substances

FISH – Fluorescence In Situ Hibridization

GC-MS – Cromatografia gasosa acoplada

a espectrometria de massas

HPLC - High Performance Liquid

Chromatography

HRT - Hydraulic Retention Time

kDa – quilo Daltons

LTAD – Low temperature anaerobic

digestion

LCMS-IT-TOF - Liquid Chromatography

Ion Trap Time Of Flight

MALDI – Matrix Assisted Laser

Desorption and Ionization

m/z – Razão massa/carga

MBR – Membrane bioreactors

PAN – poliacrilonitrila

PTFE – politetrafluoroeteno

PVDF – fluoreto de poilivinilideno

pI – Ponto isoelétrico

SAnMBR – Submerged Anaerobic

Membrane BioReactor

SDS - Dodecil sulfato de sódio

SDS-PAGE - Eletroforese em gel de

poliacrilamida na presença de SDS

SMP – Soluble microbial products

SRT – Solids Retention Time

THM – Trialometano

UAP – Substrate utilization associated

products

UASB – Upflow Anaerobic Sludge Blanket

UV – Ultravioleta

Zorel, J. A. Lista de figuras

xiii

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Balanço de carbono para a degradação aeróbia (esquerda) e anaeróbia (direita) de

compostos orgânicos...................................................................................................................3

Figura 2: Esquema do processo de digestão anaeróbia.............................................................4

Figura 3: Metabolismo da formação de EPS e SMP em sistemas microbiológicos................10

Figura 4: Diferenciação entre o potencial e a atividade de uma microbiota e abordagem

sistemática para a caracterização de ecossistemas microbianos...............................................19

Figura 5: Fluxograma de análises metaproteômicas................................................................21

Figura 6: Fluxograma das análises proteômicas......................................................................35

Figura 7: Diagrama esquemático do reator UASB em escala de

bancada......................................................................................................................................41

Figura 8: Concentração de proteínas e carboidratos para cada método de extração...............50

Figura 9: Cromatogramas dos extratos de EPS e dos padrões de massa molecular................53

Figura 10: SDS-PAGE dos extratos de EPS liofilizados.........................................................56

Figura 11: Separação por SDS-PAGE dos extratos de EPS precipitados com sulfato de

amônio.......................................................................................................................................57

Figura 12: Separação por SDS-PAGE dos extratos de EPS precipitados com sulfato de

amônio e centrifugados sem remoção da fração superior.........................................................59

Figura 13: SDS-PAGE das amostras de lise celular, BAP, EPS e

SMP...........................................................................................................................................61

Figura 14: SDS-PAGE dos SMP dos reatores em batelada.....................................................64

Figura 15: SDS dos extratos de proteínas celulares.................................................................66

Zorel, J. A. Lista de tabelas

xiv

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Micro-organismos representativos em reatores anaeróbios empregados na digestão

de lodo...........................................................................................................................................6

Tabela 2: Produção de SMP em função das condições ambientais.........................................13

Tabela 3: Resumo dos trabalhos de metaprotêomica do tratamento biológico de resíduos....29

Tabela 4: Solução nutricional utilizada para alimentação dos reatores e ensaios de degradação

anaeróbia...................................................................................................................................37

Tabela 5: Condições dos ensaios em reatores em batelada.....................................................42

Tabela 6: Parâmetros do equipamento LC-MS-IT-TOF.........................................................46

Tabela 7: Proteínas SMP identificadas por LC-MS/MS.........................................................62

Tabela 8: Proteínas identificadas para os extratos celulares separados por SDS-PAGE........67

Tabela 9: Proteínas identificadas para os extratos celulares submetidos à digestão em

solução......................................................................................................................................70

1. Introdução

Zorel, J. A. Introdução

2

1. INTRODUÇÃO

1.1. Biotecnologia ambiental e tratamento biológico de resíduos

Praticamente todo tipo de atividade humana está associado à produção de resíduos, no

entanto, o interesse pela diminuição dos níveis de poluentes e dos impactos causados por

esses é relativamente recente. Devido ao aumento gradativo de atividades industriais e à

diminuição de recursos naturais, é crescente a busca por tecnologias limpas e por técnicas que

reduzam a toxicidade de resíduos industriais ou domésticos. Nesse âmbito, a biotecnologia

ambiental – aplicação de micro-organismos para proteger, melhorar ou restaurar a qualidade

ambiental – visto a versatilidade do metabolismo microbiano, apresenta-se como uma

alternativa promissora para modificar esse quadro. Esse campo da biotecnologia abrange as

áreas de biorremediação, produção de compostos químicos biocompatíveis, prevenção do

espalhamento de patógenos, redução de resíduos industriais e tratamento biológico de águas

residuárias (EVANS e FURLONG, 2003; AGATHOS, 2011).

O tratamento biológico consiste na degradação dos poluentes presentes em águas

residuárias por meio da ação de micro-organismos que se utilizam da energia contida nos

contaminantes orgânicos ou inorgânicos para a manutenção dos processos celulares. Ao final

do tratamento, o substrato é convertido em biomassa e subprodutos que variam em

dependência do tipo de resíduo e do biorreator empregado, se aeróbio ou anaeróbio

(RITTMAN e MCCARTY, 2001).

A presença/ausência de oxigênio propicia o crescimento de grupos microbianos

distintos, os quais apresentam características próprias que favorecem seu uso em diferentes

situações. As diferenças no metabolismo dos dois grupos fazem com que a energia e os

elementos químicos (ex.: carbono) que compõem os substratos sejam direcionados

preferencialmente para a formação de novas células, no caso dos aeróbios, ou para os

produtos finais da degradação, no caso dos anaeróbios (Figura 1; AIVASIDIS e

DIAMANTIS, 2005).

Para os micro-organismos aeróbios, aproximadamente metade dos compostos

consumidos (sejam solúveis, coloidais ou em suspensão) é convertida em biomassa. Como a

biomassa produzida em excesso ao final do processo de tratamento acarreta em gastos e

etapas adicionais para seu descarte, considera-se que na degradação aeróbia ocorre a

transferência da matéria orgânica da fase líquida para a fase sólida (KHANAL, 2008). Por


3

outro lado, em ambientes anaeróbios, apenas uma pequena parte do carbono e da energia

contidos nos contaminantes é destinada à produção de células (Figura 1).

Figura 1: Balanço de carbono para a degradação aeróbia (esquerda) e anaeróbia (direita) de compostos

orgânicos. Adaptado de Aivasidis e Diamantis, 2005.

Desta forma, a baixa produção de biomassa dos micro-organismos anaeróbios mostra-

se como uma das vantagens frente ao tratamento aeróbio. Como o mínimo de energia é

empregado para o suporte do metabolismo microbiano, o biogás – principalmente o metano –

liberado ao final da digestão anaeróbia contém a maior parte da energia presente nos

substratos primários (MCCARTY e BAE, 2011).

A queima do biogás pode ser usada para a geração de energia elétrica e para o

aquecimento de água. Estima-se que sejam produzidos em média 0,5 m3 de biogás para cada

quilo de demanda química de oxigênio (DQO) removido e que a energia contida nesse

produto seja de 6,5 kWh/m3 – o equivalente a 0,6 litros de óleo (TEZEL et al., 2011). Entre

outras vantagens do tratamento anaeróbio podem ser citados o menor investimento para sua

implantação, visto o tamanho reduzido dos reatores e maiores taxas volumétricas de

conversão em comparação aos reatores aeróbios e o gasto operacional praticamente nulo, pois

não é necessário o uso de energia para a aeração do reator (SPEECE, 1983). Além disso, a

biotecnologia anaeróbia apresenta o potencial de produção de combustíveis renováveis

(metano, hidrogênio, butanol e biodiesel) e a recuperação de produtos com valor agregado

(ácido acético, ácido lático e enxofre; KHANAL, 2008).

Com vista nesses benefícios, os reatores anaeróbios são empregados para o tratamento

de águas residuárias de indústrias produtoras de alimentos, bebidas, açúcar, derivados do leite,

celulose, papel, petroquímicos, fármacos bem como efluentes domésticos (JANSSEN et al.,

2009; SINGH et al., 1998).


4

1.2. Bioquímica e microbiologia da digestão anaeróbia

Apesar de ainda pobremente caracterizada, sabe-se que a digestão anaeróbia de

efluentes complexos é realizada por um consórcio microbiano (bactérias fermentativas e

acetogênicas e arquéias metanogênicas), o qual converte moléculas orgânicas indesejáveis a

biogás, uma fonte renovável de energia (ABRAM et al., 2011). Na ausência de oxigênio e de

outros aceptores de elétrons inorgânicos tais como NO3-

, NO2-

, SO42-

), é realizada a

fermentação dos substratos orgânicos presentes nesses resíduos, os quais são utilizados tanto

como doadores quanto como aceptores de elétrons (WIESMANN et al., 2007). A figura 2

ilustra as etapas da bioconversão anaeróbia de substratos complexos.

Figura 2: Esquema do processo de digestão anaeróbia. Adaptado de Lin e Lay, 2011.

O processo de degradação do substrato é iniciado por bactérias fermentativas

(hidrolíticas acidogênicas) as quais, por meio da liberação de enzimas extracelulares,

hidrolisam polímeros complexos em açúcares, ácidos carbônicos de cadeia longa e

aminoácidos. Nesse grupo bacteriano são encontrados, entre outros, os gêneros Bacteroides,

Clostridium e Butyrivibrio. O mesmo grupo, durante o processo de acidogênese, converte


5

esses monômeros a H2, CO2 e ácidos graxos de cadeia curta, além de metanol e outros álcoois

simples, sendo que os produtos finais do metabolismo dependem do tipo de substrato e das

condições ambientais. Esses compostos mais simples são utilizados por bactérias acetogênicas

(Clostridium sp. e Acetobacterium sp.) para a produção de acetato, o qual pode ser obtido a

partir de H2 e CO2 ou pela oxidação de álcoois e ácidos orgânicos com mais de dois carbonos.

A última etapa da digestão anaeróbia – a produção de metano – é executada por arquéias

metanogênicas acetoclásticas (ex. gêneros Methanosaeta e Methanosarcina) e

hidrogenotróficas (ex. gênero Methanospirillum), de modo que o primeiro grupo produz CH4

e CO2 por meio da quebra da molécula de acetato, enquanto que os metanogênicos

hidrogenotróficos se utilizam da oxidação do H2 na respiração do CO2 (GUJER e ZEHNDER,

1983; EVANS e FURLONG, 2003).

Na tabela 1 são mostrados os principais filos e gêneros microbianos presentes em

reatores anaeróbios e sua contribuição para o processo de digestão. A microbiota responsável

pela bioconversão dos contaminantes pode sofrer mudanças relacionadas a alterações das

condições ambientais, no entanto, existe grande similaridade entre os grupos microbianos

predominantes em diferentes reatores (GUJER e ZEHNDER, 1983; TEZEL et al., 2011).


6

Tabela 1: Micro-organismos representativos em reatores anaeróbios empregados na digestão

de lodo. Adaptado de Tezel et al., 2011.

Microorganismos Processo metabólico

Domínio Bacteria

Firmicutes

Acetobacterium e Eubacterium Hidrólise, acidogênese e acetogênese

Lactobacillus,

Sporobacterium, Clostridium e

Ruminococcus

Hidrólise e acidogênese

Paenibacillus e Acidaminococcus Acidogênese

Syntrophomonas Acetogênese

Bacteroidetes

Bacteroides Hidrólise e acidogênese

Cytophaga e Flavobacterium Acidogênese

Proteobacteria

Desulfovibrio, Thauera e

Syntrophobacter

Acetogênese

Actinobacteria

Propionibacterium e

Bifidobacterium

Hidrólise e acidogênese

Synergistetes

Aminobacterium Acetogênese

Domínio Archaea

Methanomicrobia

Methanosarcinales Metanogênese acetoclástica e

hidrogenotrófica

Methanomicrobiales Metanogênese hidrogenotrófica

Methanobacteria

Methanobacteriales Metanogênese acetoclástica e

hidrogenotrófica


7

1.3. Substâncias poliméricas extracelulares (EPS) e produtos microbianos

solúveis (SMP)

No decorrer do tratamento biológico de efluentes, apesar do metabolismo microbiano

reduzir a concentração dos poluentes, durante as fases de crescimento e morte dos micro-

organismos ocorre a produção de biomacromoléculas (BMM) que podem comprometer o

desempenho do processo devido ao seu caráter recalcitrante. Dentre eles, destacam-se as

substâncias poliméricas extracelulares (EPS – extracellular polimeric substances) e os

produtos microbianos solúveis (SMP – soluble microbial products), sendo ambas as classes

compostas por uma mistura complexa de biopolímeros (NI et al., 2011, ZHOU et al., 2012).

Devido à influência desses compostos nos processos de tratamento biológico, é crescente o

número de trabalhos acerca de suas características. A atenção crescente dedicada ao estudo

desses produtos microbianos tem trazido avanços para a compreensão dos fenômenos

associados aos sistemas de tratamento biológico de resíduos, preenchendo lacunas de modelos

experimentais e matemáticos do processo (AZAMI et al., 2012; NG e KIM, 2007).

1.3.1. Substâncias poliméricas extracelulares (EPS)

Wingender e Neu (1999) definiram como EPS as diferentes classes de

macromoléculas presentes no interior de agregados microbianos. Tais substâncias podem ser

divididas em ligadas e solúveis, de modo que o primeiro grupo constitui a matriz responsável

pela formação dos agregados microbianos (SHENG et al., 2010). Essa matriz, além de

propiciar a união física e a cooperação entre os diferentes micro-organismos presentes em

biorreatores, exerce as funções de adesão a superfícies, acúmulo de água e nutrientes,

agregação de células bacterianas em flocos/grânulos ou biofilmes e adsorção de compostos

orgânicos exógenos (FLEMMING e WINGENDER, 2010; LASPIDOU e RITTMANN,

2002). Ao passo que as funções dessa matriz são bem estabelecidas, a caracterização de seus

componentes limita-se, na grande maioria dos trabalhos, à quantificação das classes químicas

desses. Entre esses, são encontrados lipídeos, ácidos nucléicos, ácidos húmicos, matéria

inorgânica, substâncias húmicas e – como polímeros principais – carboidratos e proteínas

(D’ABZAC et al., 2010). No entanto, mesmo para a simples quantificação dessas moléculas,

variações são encontradas na literatura quanto à composição dos EPS. Essas variações são

atribuídas a diversos fatores como tipo de cultura, fase de crescimento, parâmetros do


8

processo, tipo de biorreator, método analítico empregado e, sobretudo, ao método de extração

utilizado (NIELSEN e JAHN, 1999; PARK e NOVAK, 2007).

Enquanto existe um consenso sobre a classificação dos EPS ligados, as definições

sobre a parte solúvel mostram-se um tanto quanto controversas visto que, para alguns autores,

essa fração dos EPS compreende tanto os polímeros fracamente ligados às células quanto

aqueles que se encontram dissolvidos em solução, para os quais são encontradas na literatura

tanto a definição de EPS solúvel quanto de SMP (JANG et al., 2007; PARK e NOVAK,

2007; SHENG et al., 2010).

Como citado acima, o uso de diferentes métodos de extração seria a principal causa

dessas divergências, visto que vários são os tipos de interações físico-químicas que mantém

os EPS unidos (FLEMMING e WINGENDER, 2010). Como exemplo, Ramesh e

colaboradores (2006), analisando espectros de fluorescência de excitação/emissão e

infravermelho sugeriram que EPS solúveis (fracamente ligados) e SMP seriam misturas

diferentes, com base em suas propriedades físico-químicas distintas. Todavia, enquanto os

autores do trabalho consideram que a sonicação (método empregado na extração dos EPS)

liberaria apenas os EPS solúveis, outros autores empregam tal técnica para a extração dos EPS

de maneira geral, sem distinção entre fração ligada e solúvel (COMTE et al., 2006). Em

trabalho posterior, Ramesh e colaboradores (2007) mostraram que a extração sequencial de

EPS (por meio de sonicação e posterior aquecimento), solubiliza compostos diferentes da

matriz em cada etapa. Os autores classificaram os polímeros liberados na primeira etapa como

EPS fracamente ligados e os advindos da segunda como EPS fortemente ligados, e

ressaltaram as diferenças na composição química desses. Entretanto, os trabalhos de D´Abzac

e colaboradores (2010) e Park e Novak (2007) mostram a seletividade de diferentes métodos

de extração por diferentes frações de EPS e que extrações sequenciais por métodos distintos

podem aumentar a eficiência de extração da segunda etapa. Em resumo, diferentes métodos de

extração podem favorecer a solubilização de diferentes frações de EPS. Essa solubilização

seletiva estaria relacionada mais ao tipo de interação polímero-matriz que é desfeita do que à

magnitude dessa interação. Quanto ao rendimento dos métodos de extração, trabalhos

analíticos que comparam métodos físicos e químicos apontam um maior rendimento para os

métodos químicos, no entanto, alguns estudos revelam a interferência dos agentes de extração

na quantificação dos componentes do EPS, levando à superestimação desses (D’ABZAC et

al., 2010; SHENG et al., 2010).


9

A despeito das divergências na classificação e caracterização das substâncias

poliméricas extracelulares, os produtos da hidrólise dessa matriz representam uma das

principais fontes dos produtos microbianos solúveis presentes em efluentes do tratamento

biológico (AQUINO e STUCKEY, 2008; LASPIDOU e RITTMANN, 2002).

1.3.2. Produtos microbianos solúveis (SMP)

Na definição de Noguera e colaboradores (1994), os SMP são ‘a mistura de compostos

orgânicos resultantes do metabolismo do substrato e da morte das células, durante a

mineralização do substrato’. De acordo com essa definição, os componentes do afluente (água

residuária) ou os intermediários da degradação desses não podem ser incluídos entre os SMP.

Numa visão mais abrangente e simplificada, os SMP podem ser classificados como qualquer

tipo de matéria orgânica presente no efluente que não estava presente no afluente (AQUINO,

2004; AZAMI et al., 2012).

Laspidou e Rittman (2002), num trabalho de revisão e modelagem, desenvolveram

uma “teoria unificada” onde os processos de produção e degradação dos SMP e EPS estariam

acoplados. Não obstante a teoria ter sido baseada em resultados provenientes de sistemas

aeróbios, trabalhos posteriores mostraram sua aplicação também para sistemas anaeróbios.

Nessa teoria, os SMP são subdivididos de acordo com a fase de crescimento microbiano da

qual são derivados em: UAP (substrate utilization associated products) e BAP (biomass

associated products).

Os UAP são produtos associados diretamente ao crescimento e metabolismo

microbiano e sua taxa de produção é proporcional à taxa de utilização de substrato. Por outro

lado, a liberação dos BAP na solução ocorre durante a fase endógena dos microrganismos

(fase de decaimento), e sua origem é relacionada, no modelo de Laspidou e Rittman (2002),

estritamente à hidrólise dos EPS ligados ou, segundo Aquino e Stuckey (2008) também à

liberação de compostos intracelulares. A Figura 3 resume a dinâmica de produção dos SMP

durante o tratamento biológico.

As principais diferenças entre os UAP e os BAP estão relacionadas principalmente à

sua massa molecular e biodegradabilidade. Enquanto os UAP, de baixa massa molecular, são

consumidos logo após o término do substrato, a degradação dos BAP, polímeros maiores e

menos susceptíveis à degradação, ocorre de maneira lenta de modo que, muitas vezes, esses

permanecem ao final do processo (JARUSUTTHIRAK e AMY, 2007; NI et al., 2011).


10

Figura 3: Metabolismo da formação de EPS e SMP em sistemas microbiológicos de acordo com Laspidou e

Rittman, 2002 e Aquino e Stuckey, 2008. Adaptado de Ni et al., 2011.

1.3.3. Fatores que afetam a produção de SMP

A produção de SMP está diretamente relacionada com as condições operacionais dos

biorreatores. Além disso, dependendo do tipo de sistema empregado, as alterações de

parâmetros operacionais exercem efeitos distintos sobre a composição final dos produtos

microbianos solúveis (NI et al., 2011).

A composição do afluente – tipo e concentração do substrato, presença de cátions e

outros elementos traço – é um parâmetro que deve ser levado em consideração para o projeto

de biorreatores por influenciar o desempenho do tratamento, principalmente no que diz

respeito à produção de SMP (NI et al., 2011; SPEECE, 1983). Como exemplo, substratos que

apresentam altas razões proteína/carboidrato propiciam a liberação de maiores quantidades de

SMP bem como o aumento de sua massa molecular (ARABI e NAKHLA, 2008). Boero e

colaboradores (1991), ao compararem reatores CSTR (Continuous Stirred Tank Reactor)

aeróbios alimentados com fenol ou glicose, mostraram que o consumo de fenol acarretou na

maior produção de SMP e que esses teriam maior biodegradabilidade do que os originários da

degradação de glicose. Em trabalho similar, Magbanua e Bowers (2006) reportaram que


11

aproximadamente 15% do fenol consumido foram convertidos em polímeros solúveis,

enquanto que para a glicose esse valor foi de 3%. No entanto, ao final do processo, os autores

notaram o acúmulo de SMP derivados de glicose, ao passo que os polímeros derivados de

fenol, possivelmente por serem empregados como substratos secundários, foram reduzidos a

0,5%.

Em uma série de trabalhos com reatores de membrana (MBR), Arabi e Nakhla (2008,

2009, 2010) mostraram como diferentes razões entre íons metálicos e componentes orgânicos

do substrato podem influir na composição e no tamanho dos SMP. Os autores demonstraram

que íons monovalentes (sódio), quando em concentrações superiores aos divalentes (cálcio e

magnésio), podem diminuir a quantidade de EPS componentes do lodo e aumentar a liberação

de biopolímeros em solução. Essa solubilização de polímeros devido à presença de sódio

também foi notada por Murthy e colaboradores (1998) e é empregada em processos de

extração de EPS, nos quais o íon assume a posição ocupada por íons divalentes e desestabiliza

as cargas negativas da matriz extracelular (PARK e NOVAK, 2007).

Trussel e colaboradores (2006) mostraram que variações da carga orgânica afluente de

reatores aeróbios de membrana resultam no aumento da concentração de SMP totais,

influenciando principalmente a quantidade de carboidratos solúveis e o fluxo da membrana.

Por outro lado, o aumento da razão alimento/micro-organismo (F/M, Food/Microorganism)

aumenta a liberação de proteínas SMP em reatores anaeróbios de membrana e alteram

significativamente a quantidade de EPS como mostrado por Liu e colaboradores (2012).

Como discutido pelos autores, maiores cargas orgânicas podem estimular a excreção de SMP

empregados para a adaptação – como enzimas extracelulares – e posterior crescimento

microbiano. Apesar das divergências citadas, ambos os trabalhos relatam a correlação positiva

entre a quantidade de SMP produzidos e a colmatação da membrana.

Além de variações relacionadas ao substrato, a produção de SMP mostra-se

dependente do tempo que a biomassa permanece no processo de tratamento. O trabalho de

Malamis e Andreadakis (2009) indicou a maior ocorrência de SMP em sistemas que operam

com tempos de retenção de sólidos (SRT, Solids Retention Time) curtos. O aumento do SRT

pode diminuir a concentração de produtos microbianos solúveis até certo ponto, de modo que

tempos de retenção de sólidos muito elevados não reduzem significativamente – ou mesmo

aumentam – sua produção (HUANG et al., 2011). Esse fato pode estar correlacionado à

diferente resposta dos UAP e BAP às variações nesse parâmetro operacional. Ni e

colaboradores (2011) e Jarussuthirak e Amy (2006) mostraram que maiores SRT levam ao


12

acúmulo de biomassa no sistema com consequente aumento da produção de UAP e EPS. A

grande concentração de células acarreta em altas taxas de degradação dos UAP, enquanto que

o decaimento da biomassa leva à liberação de BAP (BARKER et al., 2000; NI et al., 2011).

Devido ao grande número de células com baixa atividade e à menor biodegradabilidade dos

BAP, esses tendem a se acumular no efluente do tratamento (AQUINO e STUCKEY, 2008;

HUANG et al., 2011).

Outro parâmetro que controla a geração de produtos microbianos é o tempo médio de

residência de líquidos no interior do reator (HRT, Hydraulic Retention Time; LIU et al.,

2012). Em reatores SAnMBR (Submerged Anaerobic Membrane BioReactor), tempos de

detenção hidráulica menores promovem a multiplicação da biomassa, com consequente

aumento da liberação de SMP, principalmente de proteínas solúveis (HUANG et al., 2011).

Segundo Mesquita e colaboradores (2010), ao trabalhar com reatores CSTR, as variações na

concentração de produtos microbianos solúveis decorrentes de alterações do HRT parecem ser

mais pronunciadas para sistemas aeróbios do que para anaeróbios.

Com vista no descrito acima, os SMP gerados durante o tratamento biológico parecem

ser produzidos em decorrência de adaptações metabólicas dos micro-organismos em resposta

às alterações ambientais. Em virtude desse comportamento, diversos são os estudos que

levantam hipóteses sobre as funções biológicas dos produtos microbianos.

1.3.4. Funções dos SMP

A formação dos SMP é fortemente relacionada aos mecanismos de defesa microbiana,

aclimatação e estratégias de sobrevivência (WANG e ZHANG, 2010). Algumas

circunstâncias em que os SMP são produzidos como resposta aos estímulos externos são

mostradas na Tabela 2.

Devido à complexidade da comunidade microbiana presente em estações de

tratamento, muitos dos dados sobre a produção de SMP encontrados na literatura foram

obtidos de estudos com culturas puras. No entanto, Wang e Zhang (2010), mostraram que

parte dos polímeros produzidos por três micro-organismos isolados de lodo ativado

apresentam diferenças de composição química quando comparados àqueles provenientes da

comunidade original e mesmo entre as próprias culturas. Essa liberação diferenciada de SMP

foi observada tanto durante o crescimento normal dos micro-organismos quanto após a

exposição à diferentes condições de estresse.


13

Tabela 2: Produção de SMP em função das condições ambientais.

Função Referência

Concentraçãode

equilíbrio

Liberação de SMP para estabelecer a concentração

de equilíbrio através da membrana

(PARKIN e

MCCARTY, 1981)

Deficiência Nutricional SMPs são produzidos para adsorver nutrientes

(principalmente metais) em baixas concentrações

RITTMAN e

MCCARTY, 2001

Toxicidade Mitigação da toxicidade causada por metais

pesados. Os SMP também podem ser liberados

devido à lise celular causada por substâncias

tóxicas.

AQUINO e

STUCKEY, 2004;

KUO e PARKIN,

1996

Crescimento Biomassa Enzimas extracelulares são produzidas para a

hidrólise de biopolímeros. Outros polímeros

extracelulares auxiliam na granulação/floculação

da biomassa e, quando hidrolisados, são liberados

como SMP. Além disso, algumas estruturas

celulares, ao serem renovadas, são excretadas em

solução.

HEJZLAR e

CHUDOBA, 1986;

LASPIDOU e

RITTMANN, 2002

Quorum Sensing A excreção de moléculas orgânicas pode servir

como mecanismo de comunicação celular.

HASTINGS e

GREENBERG,

1999

Decaimento Endógeno A lise celular acarreta na liberação de

macromoléculas intracelulares e componentes da

membrana celular.

BARKER e

STUCKEY, 1999


14

Os biopolímeros produzidos mostraram diferenças de hidrofobicidade, massa

molecular e grupos químicos predominantes, reforçando a hipótese da produção seletiva de

SMP para contornar situações desfavoráveis. Por exemplo, a exposição ao NaCl e ao pH

ácido levam ao acúmulo de proteínas, enquanto que altas temperaturas induzem a produção de

ácidos húmicos e carboidratos. Entre as condições estudadas, a ausência de substrato e a

adição de CrCl3 em baixas concentrações causaram os menores impactos sobre a

concentração e a composição dos SMP. No entanto, a concentração de produtos microbianos

liberados em solução parece ter correlação direta com a quantidade de agentes tóxicos

presentes e pode variar dependendo do tipo de substância que chega ao reator. Como

mostrado por Aquino e Stuckey (2004), a adição de metais pesados (cromo) e organoclorados

(clorofórmio) a reatores anaeróbios gera diferentes efeitos de inibição da atividade

microbiana, causando o acúmulo de ácidos graxos voláteis e SMP. Para ambos os compostos

foi notado o aumento da produção de EPS bem como a presença de polímeros derivados

desses em solução. No entanto, uma fração dos compostos solúveis de alta massa molecular

teria origem intracelular, devido à lise causada principalmente pelo cromo. Além de

compostos oriundos da morte celular, os autores reportam a produção de biomoléculas

capazes de mitigar a toxicidade de metais pesados por meio da ligação a esses.

1.3.5. Consequências da produção de SMP

Vários trabalhos mostram que os produtos microbianos solúveis (especialmente BAP)

constituem a maioria da matéria orgânica presente no efluente de sistemas de tratamento

biológico de modo que o substrato que chega aos biorreatores é completamente degradado e

não é detectado após o tratamento (AQUINO e STUCKEY, 2004; NI et al., 2010).

Jarussuthirak e Amy (2007), por meio de análises de cromatografia de exclusão molecular,

mostram a rápida degradação de glicose em um reator de bancada, com a produção simultânea

de compostos de baixa massa molecular – correspondentes aos UAP – e o aparecimento de

compostos maiores (BAP) após o consumo do substrato. A comparação dos efluentes do

reator estudado e de estações de tratamento reais indica que os BAP permanecem ao término

do processo, constituindo a maioria dos compostos presentes na matéria orgânica efluente.

Em reatores anaeróbios do tipo SAMBR e CSTR, os SMP representam mais de 80%

da demanda química de oxigênio residual, sendo que em outros sistemas esse valor pode

chegar aos 98% (AQUINO e STUCKEY, 2004; AQUINO et al., 2006). Jang e colaboradores


15

(2007), ao estudarem a conversão da demanda química de oxigênio em reatores de membrana

aeróbios, mostram que 91% da DQO do permeado é composta por proteínas e carboidratos

produzidos durante a operação do reator.

A alta concentração desses polímeros pode também influenciar as propriedades

reológicas do efluente, principalmente em reatores que operam com concentrações elevadas

de biomassa, como é o caso dos reatores de membrana. A maior liberação desses compostos

nesses sistemas eleva a viscosidade do efluente, aumentando a deposição de partículas e,

consequentemente, diminuindo o desempenho de reatores de membrana

(KORNBOONRAKSA e LEE, 2009).

Além disso, somados aos problemas causados em outros sistemas, nos biorreatores de

membrana (MBR, Membrane bioreactors) a produção de SMP e EPS causa a colmatação

(fouling) da membrana, problema que influencia o desempenho, a estabilidade e o custo desse

tipo de reator (ARABI e NAKHLA, 2010; HUANG et al., 2012). Entre os demais elementos

responsáveis pelo fouling, essas macromoléculas mostram-se como a principal causa da

diminuição do fluxo e consequente lavagem ou troca do módulo de membrana. Meng e

colaboradores (2009), em um trabalho de revisão, apresentaram um levantamento dos fatores

causadores da colmatação, entre os quais os que recebem maior destaque são os polímeros de

origem bacteriana. Além de estudos focados na relação direta biomacromoléculas/fouling,

alguns trabalhos relacionam parâmetros operacionais com a geração e/ou composição de

produtos microbianos e seu impacto no comportamento dos reatores de membrana. Como

exemplo, o trabalho de Liang e colaboradores (2007), mostra que tempos de retenção de

sólidos menores acarretam não só no aumento da concentração de SMP, mas também na

intensificação do seu potencial de colmatação. A despeito do fenômeno de fouling mostrar-se

altamente dependente das características dos biopolímeros e das propriedades da membrana, o

mesmo comportamento também foi encontrado em outros trabalhos analisando diferentes

SRT, independentemente do resíduo tratado ou do material do módulo de membrana

(AHMED et al., 2007; MALAMIS e ANDREADAKIS, 2009; TIAN e SU, 2012).

Os SMP também podem causar problemas nas etapas posteriores ao tratamento

biológico, tanto em sistemas de distribuição de água – onde podem servir como substrato para

o crescimento microbiano ou aumentar os níveis de toxicidade – quanto em processos de

desinfecção (FURUMAI e RITTMANN, 1992; MAGBANUA e BOWERS, 2006). Fort e

colaboradores (1983) reportaram o surgimento de substâncias mutagênicas após a cloração do

efluente de estações de tratamento. Como tais substâncias não estavam presentes no afluente


16

ou mesmo no interior dos reatores, Namkung e Rittman (1988) supuseram que compostos

como o trialometano (THM) seriam derivados da reação entre os SMP e o hipoclorito

empregado no tratamento. Uma evidência experimental para esta suposição foi apresentada

recentemente por Wei e colaboradores (2011) ao compararem cromatogramas dos produtos

resultantes da cloração de SMPs e de biopolímeros padrão (DNA, ácido húmico, carboidratos

e proteínas). Os resultados obtidos sugerem não apenas a formação de THM como também de

ácidos halo-acéticos (mono, di e tri-clorados) como subprodutos da desinfecção.

Visto sua importância biológica e sua influência no desempenho de estações de

tratamento biológico, a caracterização dos produtos microbianos é o primeiro passo para o

entendimento das razões pelas quais esses seriam produzidos e para o estabelecimento de

tecnologias para sua remoção do efluente final.

1.3.6. Caracterização dos EPS e SMP

Os EPS e SMP são encontrados em uma ampla faixa de massas moleculares, variando

desde os menores que 1 kDa até alguns com mais de 100 kDa. Esse parâmetro é estimado por

meio de ultrafiltração em membranas de diferentes porosidades ou por cromatografia de

exclusão (MAGBANUA e BOWERS, 2006; MALAMIS e ANDREADAKIS, 2009). O

estudo da massa molecular desses compostos pode servir como indicador da solubilidade,

biodegradabilidade e toxicidade dos produtos microbianos. O tamanho dessas

biomacromoléculas é influenciado por parâmetros operacionais como tempo de retenção de

sólidos e tempo de detenção hidráulica além de ser dependente do tipo de substrato, mas não

da concentração inicial desse (BARKER e STUCKEY, 1999; MAGBANUA e BOWERS,

2006).

Além da massa molecular, até o momento, a grande maioria dos trabalhos encontrados

na literatura classificam os produtos microbianos com base em análises de cromatografia de

exclusão molecular e espectroscopias de infravermelho e de excitação/emissão. Por meio do

uso dessas técnicas, Tian e colaboradores (2011) caracterizaram os SMP liberados durante o

consumo de substratos (UAP) tanto para micro-organismos autotróficos como para

heterotróficos bem como aqueles liberados na ausência de substrato (BAP). Os autores

reportaram maior diversidade de compostos solúveis – entre eles, proteínas, carboidratos,

substâncias húmicas e lipídeos – advindos da fase endógena quando comparados aos UAP,

representados principalmente por carboidratos e proteínas. Além disso, os SMP de maior


17

massa molecular encontrados foram os BAP, seguidos dos UAP produzidos por micro-

organismos heterotróficos e autotróficos. Ni e colaboradores (2010) reportam que substâncias

húmicas também estariam presentes entre os UAP, e que compostos de massa molecular

comparável ao dos BAP seriam produzidos durante a fase de crescimento microbiano.

Análises desse tipo também podem ser úteis na caracterização dos polímeros envolvidos na

colmatação de membranas. Zhou e colaboradores (2012), baseados em dados experimentais e

modelos matemáticos mostraram que, entre os produtos microbianos responsáveis pelo

fouling, os carboidratos e proteínas seriam oriundos dos SMP e EPS, respectivamente.

Wu e Zhou (2010) estudaram os SMP presentes em reatores anaeróbios de fluxo

ascendente utilizados no tratamento de três resíduos diferentes (águas residuárias de destilaria,

ácido tetrafitálico purificado e meio sintético suplementado com glicose). Além da

quantificação de polissacarídeos e proteínas, as amostras foram analisadas por meio de

cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas (GC-MS), para identificação de

compostos orgânicos voláteis. Com base na quantificação dos SMP e na predominância de

determinadas populações microbianas ao longo das diferentes alturas dos reatores, foi

levantada a hipótese de que os micro-organismos acidogênicos (encontrados em maior

número nas partes mais baixas do reator) seriam os maiores produtores de SMP, enquanto que

os metanogênicos (predominantes nas partes altas) contribuiriam para o consumo desses

compostos, visto que a concentração de SMP totais diminuiu nas regiões mais altas dos

biorreatores. Ao que tange à identificação dos compostos, foi observado que os principais

componentes dos SMP de baixa massa molecular foram alcanos de cadeia longa, ácidos e

ésteres, independentemente dos resíduos tratados.

Vários trabalhos sobre a composição química dos EPS e SMP mostram que esses são

formados principalmente por proteínas e carboidratos, sendo que a razão entre essas classes é,

geralmente, maior do que um. Frente a esses dados, nos últimos anos, muitos estudos têm se

voltado para a análise das principais proteínas que constituem a mistura complexa de produtos

microbianos de reatores, principalmente no que diz respeito à sua participação nos processos

de floculação da biomassa e colmatação de membranas, situações nas quais as proteínas

representam grande parte dos compostos encontrados (AQUINO et al., 2006; HUANG et al.,

2012; JI e ZHOU, 2006; PARK et al., 2008).

Como visto, a maioria dos trabalhos citados têm seu foco na caracterização química

dos produtos microbianos. No entanto, para a caracterização completa dos SMP é

imprescindível a combinação de dados químicos e biológicos, os quais podem fornecer


18

informações sobre seus mecanismos de produção, natureza e propriedades (AZAMI et al.,

2012).

A presença de proteínas entre os SMP levanta a possibilidade do uso de técnicas de

proteômica para a identificação desses compostos. Com base no que ocorre para demais

sistemas biológicos, informações advindas de análises desse tipo, unidas a outras técnicas de

caracterização molecular, podem indicar quais são as principais proteínas presentes no

efluente bem como os micro-organismos responsáveis por sua produção (SIGGINS et al.,

2012).

1.4. Caracterização molecular de comunidades naturais

Além da degradação de resíduos antropogênicos, os micro-organismos garantem as

condições habitáveis ao planeta, participando dos ciclos de nutrientes e da manutenção

biogeoquímica da biosfera. No entanto, apesar de sua importância, a contribuição da maioria

das espécies microbianas dentro de seus ambientes permanece desconhecida, principalmente

pelo fato de que grande parte dos micro-organismos não é cultivável (RODRÍGUEZ-

VALERA, 2004; KELLER e HETTICH, 2009). Essa limitação restringia, até as últimas

décadas, nosso conhecimento sobre capacidades metabólicas tais como redução de sulfato,

remoção de fosfato, desnitrificação, desalogenação e metanogênese, habilidades importantes

no âmbito da biotecnologia ambiental. Além das capacidades individuais, micro-organismos

em ambientes naturais ou em biorreatores existem, na maioria das vezes, em forma de

comunidades, situação onde são imprescindíveis à sobrevivência os fenômenos de

sintrofismo, transferência horizontal de genes e comunicação celular, para os quais as

informações ainda são escassas. Nesse sentido, como ferramentas para a prospecção de dados

relativos ao potencial das comunidades microbianas e à sua atividade em diferentes

ecossistemas foram desenvolvidas as áreas de metagenômica, metatranscriptômica,

metametabolômica e metaproteômica (MARON et al., 2007; LACERDA e REARDON,

2009). Siggins e colaboradores (2012) ressaltam a complementariedade dos dados obtidos

nesses quatro níveis de investigações biológicas e também que o entendimento da

funcionalidade de ecossistemas naturais pode ser obtido confrontando-se essas informações

(Figura 4).


19

Figura 4: Diferenciação entre o potencial e a atividade de uma microbiota e abordagem sistemática para a

caracterização de ecossistemas microbianos. Adaptado de Maron et al., 2007 e Siggins et al., 2012.

Das quatro áreas supracitadas, a metagenômica foi a primeira a ser desenvolvida e

pode ser definida como a análise cultura-independente do genoma de comunidades

microbianas, na qual grandes fragmentos de DNA são clonados de um determinado ambiente.

A nomenclatura une o termo ‘meta’ deriva do conceito estatístico de meta-análise, processo

de combinação de análises separadas, e ‘genômica’, análise do material genético de

determinado organismo. A análise de sequências gênicas conservadas (16S rRNA, nif e recA)

fornece informações sobre a diversidade, a filogenia e a evolução dos micro-organismos

dominantes em um ambiente, ao passo que a construção de bibliotecas genômicas possibilita a

captura de operons e grupos de genes que codificam para rotas metabólicas envolvidas na

síntese de moléculas de interesse comercial (SCHLOSS e HANDELSMAN, 2003). Além

disso, a abordagem shotgun acoplada ao piro-sequenciamento permite detectar procariotos

raros presentes em culturas mistas, independentemente de primers específicos (PETROSINO

et al., 2009). Em contraste à proficiência para a geração de dados sobre a potencialidade do

genoma, estratégias focadas apenas no sequenciamento do DNA não fornecem informações

sobre a funcionalidade desse. Como alternativa, a metatranscriptômica (análise do RNA de

todos os micro-organismos presentes em um ecossistema) possibilita inferir sobre o que, de

toda a carga genética microbiana, está sendo expresso. No entanto, a limitada meia-vida do

RNA, a dificuldade em eliminar contaminantes do processo de extração e a baixa correlação


20

entre os níveis de mRNA e a síntese das proteínas correspondentes estimulam a caracterização

metaproteômica de comunidades complexas (MARON et al., 2007).

1.5. Metaproteômica

O termo proteômica abrange estudos em larga escala das proteínas expressas por um

organismo. Já a área da metaproteômica (ou proteômica ambiental) é definida como a

“caracterização em larga-escala de todas as proteínas de uma microbiota ambiental em um

determinado ponto no tempo”, visto que leva em consideração as interações bióticas (entre os

micro-organismos) e abióticas (entre micro-organismos e seu ambiente natural), as quais

governam a ecologia das comunidades microbianas in situ (MARON et al., 2007; WILMES e

BOND, 2004). A complexidade dessas comunidades faz com que alguns autores as

classifiquem como um ‘metaorganismo’, pois a diversidade do seu proteoma se compara à de

um eucarioto pluricelular (LACERDA e REARDON, 2009). Além disso, devido à matriz da

qual as amostras são retiradas, um dos grandes desafios da proteômica ambiental é o

estabelecimento de protocolos efetivos de extração de proteínas que sejam compatíveis com

as técnicas de identificação empregadas atualmente (SCHULZE et al., 2005). Apesar dessa

dificuldade, nos últimos anos alguns trabalhos mostram o potencial da aplicação da

proteômica para o entendimento da funcionalidade e da dinâmica microbiana em diferentes

ambientes, como solo, sedimentos, ecossistemas aquáticos, trato intestinal humano e reatores

de tratamento biológico de efluentes (SIGGINS et al., 2012). Para isso, dentro das limitações

para cada ecossistema, o tratamento da amostra consiste das etapas de: coleta e separação da

fração de interesse, extração de proteínas, separação e fracionamento, análise por

espectrometria de massas e busca em bancos de dados ou síntese de novo de peptídeos (Figura

5; STEEN e MANN, 2004; SIGGINS et al., 2012).

O fluxograma e os protocolos escolhidos para cada fase são extremamente

dependentes do tipo de ionização empregada na fase de análise por espectrometria de massas.

Essa ionização pode ser conseguida pelas técnicas de MALDI (Matrix Assisted Laser

Desorption and Ionization) ou ESI (Electrospray Ionization), sendo que as fontes de

ionização ESI são amplamente empregadas devido à possibilidade de seu uso on-line com a

separação dos peptídeos por cromatografia, servindo de interface entre o cromatográfo e o

espectrômetro de massas (STEEN e MANN, 2004; KELLER e HETTICH, 2009). Desse

modo, as etapas do tratamento da amostra citadas abaixo são focadas nas análises proteômicas


21

realizadas por sistemas de cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (LC-

MS; Figura 5).

Figura 5: Fluxograma de análises metaproteômicas (A). Cromatograma de separação dos peptídeos, espectro de

massas de uma fração dos peptídeos e MS/MS de um determinado íon (B).

Amostras de proteínas microbianas coletadas em ambientes naturais, especialmente

em ecossistemas aquáticos, são encontradas em concentrações muito baixas, sendo necessário,

portanto, etapas de concentração – usualmente por filtração ou liofilização – mais severas do

que as empregadas para materiais obtidos de culturas em laboratório (SCHULZE et al., 2005;

MORRIS et al., 2010; WANG et al., 2011). Nos casos em que se deseja estudar uma parte

específica do proteoma (intra ou extracelular), simultaneamente à coleta é realizada a

separação da fração de interesse. Geralmente, antes da lise das células, a biomassa passa por

procedimentos de lavagem, para a remoção de polímeros e demais contaminantes da matriz

extracelular (WILMES e BOND, 2004). Por outro lado, quando o objeto de estudo são as

proteínas que compõem a matriz, diferentes métodos de extração são empregados, sendo que

cada um deles solubiliza preferencialmente uma fração do proteoma dos EPS (PARK et al.,

2008).


22

Após a obtenção das amostras, os métodos empregados para a extração proteica

variam de acordo com a complexidade da amostra. Em ambientes de composição conhecida, a

extração pode ser realizada por protocolos simples, que compreendem um menor número de

etapas e que consistem basicamente, no caso do proteoma intracelular, da lise (por french

press ou ultrassonicação), seguida da concentração do material desejado (WILMES e BOND,

2004; ABRAM et al., 2009). Para proteínas componentes dos EPS ou encontradas ligadas à

membrana de MBR, os polipeptídeos são separados de carboidratos e outros biopolímeros por

meio de sua precipitação com sulfato de amônio e posterior diálise, para a remoção do sal

(PARK et al., 2008; HUANG et al., 2012). Amostras mais complexas, tanto no que diz

respeito à variedade da microbiota quanto à composição do ambiente de origem, exigem

procedimentos com um maior número de passos para a obtenção de pools proteicos

representativos e passíveis de análise. Esses procedimentos são comumente encontrados em

estudos sobre o proteoma de solos ou biorreatores que tratam resíduos compostos

(BENNDORF et al., 2007; HANREICH et al., 2012). Mesmo para reatores de bancada

alimentados com água residuária sintética (de composição conhecida e com baixo número de

contaminantes), a presença de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas requer a

combinação de métodos físicos e químicos distintos para alcançar a lise completa dos micro-

organismos (LACERDA et al., 2007). Apesar das inúmeras fases de lavagem e precipitação

das amostras proteicas de comunidades naturais, ao final do processo de preparação ainda

existe a contaminação dessas por ácidos húmicos, como pode ser notado pela coloração

escura do extrato e pelo background elevado em géis SDS-PAGE (BASTIDA et al., 2009;

HANREICH et al., 2012). Além da co-purificação desse contaminante, sua presença em

grandes concentrações parece ser um problema específico da proteômica ambiental, visto a

ausência de protocolos específicos para a sua remoção (BODZON-KULAKOWSKA et al.,

2007; CAÑAS et al., 2007).

A separação e o fracionamento dos extratos proteicos são procedimentos úteis para

aumentar a resolução da identificação por espectrometria de massas e, para os protocolos que

fazem uso de géis 2D, servem também para verificar o nível de expressão de proteínas

específicas (KHALSA-MOYERS e MCDONALD, 2006). Essa etapa da análise mostra-se de

especial importância para a metaproteômica, visto o grande número de proteínas presentes em

amostras ambientais, e é realizada por métodos cromatográficos ou eletroforéticos

(SCHNEIDER e RIEDEL, 2010). O uso de géis SDS-PAGE diminui a concentração de

contaminantes que podem interferir nas etapas posteriores e, no caso dos géis 2-D, possibilita


23

a comparação dos perfis de expressão proteicos em diferentes situações. Apesar do alto poder

de resolução dos géis 2-D PAGE, proteínas que possuem valores extremos de ponto

isoelétrico (pI, muito básico ou muito ácido), alta hidrofobicidade (como proteínas de

membrana), baixa solubilidade, baixa massa molecular ou aquelas menos abundantes são sub-

representadas nos géis (WILKINS et al., 1998; GYGI et al., 2000; TOMANEK, 2011).

Como alternativa aos métodos eletroforéticos, é empregada a separação por colunas

cromatográficas, as quais podem ser utilizadas tanto para a separação das misturas proteicas

(previamente à proteólise enzimática) quanto para os peptídeos digeridos. O fracionamento da

amostra é realizado por HPLC (High Performance Liquid Chromathography), é baseado na

afinidade dos analitos pelas fases móvel e estacionária e depende, para cada tipo de coluna, de

características como tamanho, carga, especificidade e hidrofobicidade. A resolução das

amostras pode ser aumentada pela separação multi-dimensional das proteínas por meio da

combinação de colunas de diferentes tipos, como troca catiônica/fase reversa, troca

aniônica/fase reversa e interação hidrofílica/fase reversa (BODZON-KULAKOWSKA et al.,

2007; SCHNEIDER e RIEDEL, 2010). As amostras fracionadas são então submetidas à

análise em espectrômetro de massas para a identificação das proteínas. Para isso, as proteínas

são digeridas enzimaticamente, os peptídeos gerados são separados e ionizados e é realizada a

análise de suas relações massa/carga (m/z; KARPIEVITCH et al., 2010). O primeiro passo do

processo, a digestão proteica, gera uma mistura de peptídeos de manuseio e identificação mais

simples do que as proteínas de origem (RAPPSILBER e MANN, 2002). A digestão pode ser

realizada in-gel (para bandas ou spots advindos de géis) ou para amostras em solução (in-

solution digestion; CAÑAS et al., 2007). Na maioria dos trabalhos, a protease tripsina é

empregada para a conversão de proteínas em peptídeos. Devido sua alta estabilidade e

especificidade, a clivagem ocorre sempre nos resíduos de lisina e arginina, gerando peptídeos

dentro de uma faixa de massas adequada para seu sequenciamento (STEEN e MANN, 2004).

Para análises pela metodologia LC-MS, os peptídeos trípticos são então introduzidos no

cromatógrafo e separados em colunas C-18 (fase reversa) ou em combinações de colunas de

troca catiônica e fase reversa (AEBERSOLD e MANN, 2003).

Essa separação diminui o número de peptídeos que alcança a fonte de ionização ao

mesmo tempo, aumentando a sensibilidade da espectrometria. No caso da ionização por

fontes ESI, diferentes cargas são atribuídas aos peptídeos através da aplicação de uma

diferença de potencial elétrico entre a saída da coluna cromatográfica e a entrada do

analisador de massas (MANN et al., 2001). Atualmente, existem cerca de 20 tipos diferentes


24

de analisadores os quais, por meio de princípios distintos, realizam a análise das relações m/z

dos peptídeos. Por fim, o sequenciamento dos peptídeos é obtido por meio da fragmentação

dos íons analisados (denominados precursores) e nova obtenção das relações massa/carga,

metodologia denominada de espectrometria de massas em tandem ou MS/MS. Como cada

resíduo de aminoácido possui uma massa única, com exceção da leucina e da isoleucina, é

possível indicar qual a sequência dos peptídeos analisados (DOMON e AEBERSOLD, 2006;

KARPIEVITCH et al., 2010).

Os espectros obtidos são confrontados com bancos de dados através de softwares de

busca, como SEQUEST, X!TANDEM ou MASCOT. Tais programas identificam as proteínas

correspondentes aos peptídeos sequenciados por meio da comparação dos dados

experimentais com proteínas traduzidas in silico a partir de bancos de dados genômicos.

Desse modo, o rendimento dos trabalhos de proteômica ambiental depende fortemente de

estudos metagenômicos. Além da comparação dos espectros, a identificação dos peptídeos

pode ser feita por meio do sequenciamento de novo, que consiste na análise das diferenças das

massas entre o íons gerados à partir da fragmentação de um íon precursor. Ao final da

identificação proteômica, os resultados obtidos são confrontados com demais dados sobre a

microbiota estudada e fornecem informações relevantes quanto à comunidade presente bem

como quanto à funcionalidade dessa (Figura 5; KARPIEVITCH et al., 2010; MARON et al.,

2007).

1.6. Proteômica do tratamento biológico de efluentes

Wilmes e Bond (2004), visando à caracterização dos micro-organismos envolvidos na

remoção de fosfato inorgânico em reatores EBPR (Enhanced Biological Phosphorus

Removal), realizaram os primeiros trabalhos de proteômica em comunidades de reatores de

tratamento biológico. Devido aos problemas enfrentados com amostras desse tipo, o

mapeamento do proteoma dessas comunidades por 2D-PAGE foi conseguido por meio da

otimização de protocolos de extração e do fracionamento das proteínas com diferentes

tampões. Entre as proteínas identificadas por espectrometria de massas, algumas

corroboraram com os grupos microbianos encontrados no mesmo trabalho por FISH

(Fluorescence In Situ Hibridization), no entanto, devido à escassez de dados metagenômicos

para os micro-organismos em questão, essa identificação só foi conseguida através do


25

sequenciamento de novo dos espectros de massa encontrados, limitando o número de

identificações.

Trabalhos posteriores do mesmo grupo (WILMES et al., 2008a,b) evidenciaram a

interdependência das áreas de metagenômica e metaproteômica, de modo que após o

sequenciamento shotgun do genoma do lodo envolvido na remoção de fosfato (GARCÍA

MARTÍN et al., 2006), o número de proteínas identificadas e de suposições acerca de suas

funções aumentaram significativamente. A comparação dos dados proteogenômicos permitiu

inferências sobre a expressão de proteínas homólogas por diferentes linhagens e a construção

de novas rotas metabólicas relacionadas ao acúmulo de fosfato. Além disso, a quantificação

relativa de algumas dessas enzimas forneceu evidências de que essas exerceriam papéis

bifuncionais, atuando nas fases de consumo/acúmulo de fosfato, sendo reguladas pela

expressão ou modificação pós-traducional de enzimas-chave, a exemplo do que ocorre para

vias como a glicólise e a gliconeogênese.

Além das vias metabólicas ligadas à homeostase celular, mudanças rápidas na

fisiologia de comunidades mistas em resposta às perturbações ambientais podem ser

detectadas por análises proteômicas, como mostrado por Lacerda e colaboradores (2007).

Nesse trabalho, alterações do perfil de expressão de proteínas em decorrência da presença de

cádmio puderam ser reveladas – por meio de 2D-PAGE – após 15 minutos do estresse

causado pela adição do metal ao meio, um intervalo curto para ser detectado pela análise

filogenética comumente empregada para comunidades naturais. Em concordância com

trabalhos anteriores realizados com culturas puras, que mostram a ação do cádmio sobre

vários alvos celulares, foi observada a expressão diferencial de proteínas de diferentes

funções, entre as quais: metabolismo energético (gliceraldeído-3-fosfato desidrogenas e

enolase), transporte e secreção de íons (ATPases), síntese proteica (proteínas ribossomais) e

reparo do DNA (metilases). Através da análise temporal da expressão dessas proteínas após o

choque, os autores observaram a regulação proteica envolvida nas três etapas de resposta ao

estresse: resistência (expressão aumentada logo após o choque e diminuída ao final do

ensaio), adaptação (expressas ao final do ensaio) e tolerância (expressas após o choque e

mantidas até o final do ensaio).

Somadas às enzimas responsáveis pela conversão de poluentes ou manutenção dos

processos celulares, as proteínas que compõem a matriz extracelular (EPS) da biomassa

podem influenciar no desempenho de estações de tratamento biológico. As proteínas são os

componentes orgânicos predominantes entre os biopolímeros que constituem os EPS, sendo


26

importantes para a granulação/floculação e sedimentação do lodo (FROLUND et al., 1996;

PARK et al., 2008). Como essas proteínas se mantêm unidas aos demais compostos que

compõem a matriz através de interações distintas, diferentes frações proteicas podem ser

liberadas dependendo do protocolo empregado para sua extração. Como exemplo, Park e

colaboradores (2008), ao empregarem três métodos distintos de extração de EPS para lodo

ativado de estações de tratamento reais, mostraram que as proteínas obtidas por cada um dos

métodos apresentam diferenças de massa molecular e hidrofobicidade. Além disso, os perfis

de SDS-PAGE distintos para cada um dos extratos mostra a existência do que os autores

denominaram “subproteomas” do EPS. A posterior identificação de algumas das bandas por

LC-MS/MS indica que proteínas relacionadas à defesa bacteriana, apêndices celulares,

membrana externa, materiais intracelulares e até mesmo proteínas do afluente seriam

componentes importantes para a formação dos flocos e sedimentação da biomassa. Em um

trabalho paralelo, o mesmo grupo demonstrou que essas proteínas apresentam níveis de

digestibilidade variados e que diferentes frações proteicas são degradadas dependendo do tipo

de tratamento – se aeróbio ou anaeróbio – empregado para a digestão do lodo. Tais dados

mostram-se de grande importância em estações de escala industrial, visto que o conhecimento

dos fatores que levam a produção de proteínas com menor biodegradabilidade e o uso de

processos de digestão aeróbio-anaeróbio em série pode aumentar a eficiência da digestão da

biomassa previamente ao seu descarte (PARK e HELM, 2008).

Contribuições para o aperfeiçoamento de biorreatores de membrana também podem

ser obtidas através de análises proteômicas. Huang e colaboradores (2012), com o uso de

SDS-PAGE e LC-MS/MS, determinaram as principais proteínas responsáveis pelo fouling de

módulos de membrana compostos por três materiais diferentes (PAN, PVDF e PTFE)

inseridos no mesmo reator aeróbio. Foram identificadas proteínas ubíquas e também proteínas

aderidas especificamente a cada uma das três membranas. Essa seletividade de ligação estaria

relacionada principalmente com a similaridade de hidrofobicidade entre proteínas e

membranas. Em sua maioria, o material ligado aos módulos seria proveniente do decaimento

da biomassa, visto que foram encontradas diversas proteínas intracelulares como a malato

desidrogenase, a subunidade alfa da RNA polimerase e fatores de elongação. Além disso,

grande parte dos peptídeos identificados corresponderam à proteína groL, uma chaperonina

que tem como função a estabilização e a renaturação de proteínas danificadas e que serviria

também como indicador de condições de estresse no interior do reator. O estudo das

propriedades das proteínas encontradas em maior abundância pode auxiliar no projeto de


27

membranas que apresentem menor afinidade por esses biopolímeros e que sejam, portanto,

menos susceptíveis à colmatação.

Abram e colaboradores (2009 e 2011) realizaram os primeiros estudos de

metaproteômica em reatores anaeróbios tratando água residuária sintética com glicose. No

primeiro dos trabalhos, os autores mostram a necessidade do desenvolvimento de técnicas

específicas para a extração de proteínas de lodo anaeróbio, demonstrando que protocolos de

lise celular que fazem uso da sonicação apresentam qualidade superior àqueles baseados em

french press, comumente aplicados para lodo aeróbio. Posteriormente, a aplicação dessa

técnica de extração para células oriundas de reatores LTAD (low temperature anaerobic

digestion, operados a 15 °C) propiciou a identificação de vias metabólicas bem como dos

micro-organismos presentes. Curiosamente, diferenças foram encontradas quanto à filogenia

dos grupos microbianos predominantes quando comparados os dados de proteômica e de

sequenciamento do gene 16S rRNA, também realizado no trabalho. Como a metodologia

empregada baseou-se na seleção das proteínas mais abundantes, devido a separação e seleção

dessas por 2D-PAGE, as análises por proteômica identificaram a fração metabolicamente

ativa e mais abundante do genoma microbiano. Entre as proteínas identificadas, figuram

enzimas pertencentes à via das pentoses (transcetolase) e à glicólise (gliceraldeído-3-fosfato

desidrogenase e enolase), rotas metabólicas envolvidas na degradação do substrato usado na

alimentação do reator. Além disso, foram encontradas enzimas envolvidas na metanogênese

hidrogenotrófica (tetrahidrometanopterina-S-metiltransferase) e acetoclástica (acetil-CoA

descarbonilase), de modo que arquéias dos gêneros Methanothermobacter, Methanosaeta e

Methanosarcina, seriam suas principais produtoras. Interessantemente, o gênero

Methanosarcina também foi encontrado por Hanreich e colaboradores (2012) ao analisarem o

proteoma intracelular de um consórcio microbiano anaeróbio termofílico alimentado com

resíduos da produção de beterraba e arroz. Por outro lado, nenhum representante do gênero

Methanosaeta parece atuar em reatores operados a 55 °C. Esses dados mostram que a

proteômica é uma ferramenta útil para a análise da dinâmica microbiana em reatores

anaeróbios, visto que corroboram com resultados de estudos genômicos, os quais também

demonstraram a maior adaptabilidade térmica do gênero Methanosarcina em comparação ao

gênero Methanosaeta (KRAKAT et al., 2010). Além disso, a identificação e o monitoramento

dos níveis de expressão de enzimas chave para a produção de metano, como a metil-CoM

redutase, podem ser correlacionados à taxa de produção de biogás, servindo como um

indicador das condições operacionais (HANREICH et al., 2012).


28

A união de dados genômicos e proteômicos também possibilitou a identificação dos

micro-organismos responsáveis pela degradação anaeróbia de tolueno, revelando a

persistência de diferentes grupos microbianos, mesmo após a cultura ser alimentada com uma

única fonte de carbono por aproximadamente dez anos (JEHMLICH et al., 2010). A

homeostase do processo, ou seja, a completa mineralização do substrato – e sua consequente

oxidação a dióxido de carbono – seria mantida por meio de fenômenos de sintrofia e

mutualismo entre as bactérias que oxidam tolueno e bactérias fermentativas que fazem uso

dos metabólitos liberados durante a degradação desse. Por fim, debris celulares seriam

consumidos por bactérias predadoras. Um resumo dos trabalhos de metaproteômica do

tratamento anaeróbio pode ser encontrado na tabela 3.

Apesar do crescente número de trabalhos acerca do proteoma de comunidades naturais

presentes em biorreatores, os dados encontrados na literatura referem-se às proteínas

intracelulares ou àquelas presentes na matriz polimérica extracelular (ABRAM et al., 2011;

PARK et al., 2008; SIGGINS et al., 2012), de modo que as proteínas solúveis liberadas

durante o metabolismo microbiano permanecem desconhecidas.


29

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2. Justificativa

Zorel, J. A. Justificativa

Justificativa

31

2. JUSTIFICATIVA

A exploração de bens naturais e a geração de resíduos são fatores intrínsecos de

praticamente todas as atividades humanas. Nesse sentido, é crescente a busca de fontes

renováveis e de meios para diminuir a produção de poluentes. A digestão anaeróbia apresenta-

se como uma vertente biotecnológica que alia a degradação de subprodutos indesejáveis à

produção de bens com valor agregado, entre eles compostos químicos de interesse comercial e

produtos com alto conteúdo energético. Não obstante essa conversão ser realizada por micro-

organismos, o conhecimento e os avanços na área estão relacionados principalmente à

engenharia do processo, de modo que as informações sobre os componentes biológicos são

ainda incipientes.

A complexidade da comunidade microbiana e o fato de que muitos dos micro-

organismos que a compõem não são cultiváveis eram, até as últimas décadas, as razões para a

escassez de estudos sobre esses. Mudanças nesse quadro surgiram após o desenvolvimento de

análises cultivo-independentes e a adequação dessas aos ambientes naturais, oferecendo

oportunidades de investigação molecular de diferentes ecossistemas.

Nesse sentido, esse trabalho busca analisar o proteoma de processos de digestão

anaeróbia. Nesses sistemas, além de suas funções celulares, as proteínas exercem papéis que

influenciam no sucesso do tratamento tanto positivamente, como na formação do biofilme e

hidrólise extracelular de resíduos, quanto negativamente, como nos casos em que fazem parte

do material recalcitrante no efluente de reatores. Apesar dessa importância, informações

acerca de proteínas extracelulares – sejam componentes da matriz extracelular ou liberadas

em solução – ainda são escassas.

3. Objetivos

Zorel, J. A. Objetivos

33

3. OBJETIVOS

3.1. Objetivo geral

Identificar as proteínas produzidas por microrganismos durante a degradação

anaeróbia da matéria orgânica.

3.2. Objetivos específicos

1. Analisar a influência de métodos de extração distintos no estudo de proteínas EPS

presentes em lodo anaeróbio e caracterizar essas proteínas.

2. Identificar a origem de proteínas SMP, se provenientes de lise celular ou hidrólise

de EPS em reator UASB alimentado com glicose.

3. Caracterizar proteínas SMP em sistemas anaeróbios operados sob diferentes

condições de alimentação e temperatura.

4. Identificar, por meio de técnicas proteômicas, micro-organismos envolvidos na

degradação de glicerol em reator UASB.

4. Materiais e Métodos

Zorel, J. A. Materiais e Métodos

35

4. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1. Fluxograma de análises

As metodologias empregadas nesse trabalho visaram à extração de proteínas oriundas

de diferentes frações de lodo anaeróbio, envolvido na degradação de diferentes fontes de

matéria orgânica, com posterior tentativa de caracterização e identificação dessas proteínas.

Um resumo das amostras coletadas e da sequência de atividades pode ser visto na figura 6.

Figura 6: Fluxograma de análises das amostras proteicas.

4.2. Extração de substâncias poliméricas extracelulares (EPS) e precipitação da

fração proteica

A extração de EPS foi realizada empregando-se oito diferentes métodos encontrados

na literatura. Previamente a cada extração, 100 mL (2,2 gramas de sólidos suspensos voláteis)


36

de lodo foram centrifugados (5800 g por 25 minutos) e, com exceção das extrações por resina

de troca catiônica e sulfeto de sódio, foram ressuspendidos em 100 mL de solução de NaCl

0,05% (m/v) com auxílio de vórtex. Após a extração, as amostras foram novamente

centrifugadas e o sobrenadante coletado. Para a precipitação das proteínas, a 30 mL do

sobrenadante foram adicionados 18,04 g de sulfato de amônio (Sigma) (para uma saturação de

90% de sulfato de amônio) e os tubos foram incubados em gelo por 16 horas. A precipitação

foi completada pela centrifugação das amostras a 20.000 g por 30 minutos (centrífuga Sorvall

5C). Para a remoção do sal, as amostras foram ressupendidas e dializadas contra água

deionizada por 72 horas a 4 °C, em membranas de diálise de 3,5 kDa (Thermo). Para a

concentração das amostras, essas foram congeladas e liofilizadas.

4.2.1. Centrifugação (D’ABZAC et al., 2010)

A extração por centrifugação foi escolhida como um método controle, visto que é

comum a todos os métodos empregados e foi realizada como descrito acima, sendo coletado

apenas o sobrenadante resultante da segunda etapa de centrifugação.

4.2.2. Aquecimento (LI e YANG, 2007)

Aos tubos contendo o lodo foram adicionados 50 mL de solução de NaCl 0,05%

previamente aquecida a 70 °C. As amostras foram agitadas por 1 minuto em vórtex e

mantidas em banho-maria a 70 °C por 30 minutos.

4.2.3. Formaldeído (D´ABZAC et al., 2010)

Foi adicionado formaldeído (37%) às amostras na proporção de 60 µL para cada 10

mL de lodo. Para a extração, as amostras foram incubadas a 4 oC por 1 hora, com agitação

manual periódica a cada 30 minutos.

Apesar do emprego de formaldeído ser comum para protocolos de extração de EPS, é

importante ressaltar que esse composto pode realizar ligações cruzadas com biopolímeros

(FOX et al., 1985). Esse fato deve ser levado em consideração durante a análise de proteínas

por espectrometria de massas, pois pode alterar a massa de alguns peptídeos e, dessa forma,


37

impedir ou invalidar a identificação proteica. A despeito da baixa concentração empregada

nesse trabalho, a ocorrência de cross-linkinkg não pode ser descartada, visto que não foram

encontrados na literatura relatos sobre um valor de concentração mínimo de formaldeído que

não acarrete nesse fenômeno.

4.2.4. Formaldeído e Aquecimento (D´ABZAC et al., 2010)

Para essa extração, as duas metodologias descritas acima foram empregadas em

sequência, sendo primeiramente realizada a extração por formaldeído.

4.2.5. EDTA (D´ABZAC et al., 2010)

Ao lodo ressuspendido em solução salina, foram adicionados 100 mL de solução de

EDTA 2% (m/v) pH 7,5 e os frascos foram incubados à 4 °C por 3 horas, com agitação

manual periódica a cada 1 hora.

4.2.6. Hidróxido de sódio (PARK et al., 2008)

Com auxílio de uma solução de NaOH 1M, o pH da solução foi ajustado para 10. Em

seguida, o frasco de extração foi lacrado e purgado com nitrogênio gasoso por 15 minutos. A

extração foi realizada por meio de agitação em gelo, com uso de agitador magnético, por 1

hora.

4.2.7. Resina de troca catiônica (CER; FRØLUND et al., 1995)

A extração por meio de CER foi realizada de acordo com o proposto por Frolund e

colaboradores (1995) empregando-se a resina Dowex® Marathon® C, Na+-Form (Sigma-

Aldrich). Previamente à extração, a resina foi pesada na proporção de 65 g/g SSV e mantida

sob agitação, com auxílio de agitador magnético, por 1 hora, em gelo e ao abrigo da luz, em

solução salina tamponada (PBS) pH 7,8 (KH2PO4 2mM, Na2PO4 6 mM e NaCl 10mM ), para

remoção de impurezas. Após a lavagem, a resina foi adicionada ao lodo, também


38

ressuspendido em PBS, e os frascos de extração foram mantidos sob agitação por 1 hora, em

gelo ao abrigo da luz.

4.2.8. Sulfeto de sódio (NIELSEN e KEIDING, 1998)

O lodo foi ressuspendido em solução de Na2S 6 mM pH 7,5. Em seguida, o frasco de

extração foi lacrado e purgado com nitrogênio gasoso por 15 minutos. A extração foi

realizada por meio de agitação, com uso de agitador magnético, em gelo por 6 horas.

4.3. Quantificação de EPS

O rendimento das extrações de EPS foi verificado por meio da quantifcação de

proteínas e carboidratos. A concentração dos polímeros foi corrigida pela quantidade de

biomassa empregada e os resultados expressos na forma de mg/g sólidos suspensos voláteis

(SSV). A determinação de SSV foi realizada como descrito no item 4.3.3.

4.3.1. Quantificação de proteínas EPS

A quantificação de proteínas nos extratos de EPS foi realizada pelo método de Frolund

(FROLUND et al., 1995). Essa análise é derivada do método de Lowry (LOWRY et al., 1951)

com variações que levam em consideração a interferência de substâncias húmicas na

intensidade da cor apresentada pelas amostras ao final do ensaio. Para isso, a absorbância é

medida na presença e na ausência de sulfato de cobre, sendo que a coloração apresentada

pelas amostras na ausência de Cu2SO4 é devida principalmente as substâncias húmicas. Desse

modo, a absorbância relativa à quantidade de proteínas presente na amostra pode ser obtida

pela equação:

Aprot = 1,25 (A comCu2SO4 – A semCu2SO4)

Para a análise, a 500 µL de amostra foram adicionados 5 mL da solução de

complexação (98 mL de carbonato de sódio 2% (m/v) em NaOH 1M, 1 mL de tartarato de

sódio e potássio 2% (m/v) e, para uma das medidas, 1 mL de Cu2SO4 1% (m/v)). Após 10

minutos de incubação a temperatura ambiente, foram adicionados 500 µL do reagente de


39

Folin 1N, os tubos foram agitados e as amostras mantidas em repouso à temperatura ambiente

por 30 minutos. As leituras de absorbância foram realizadas a 575 nm e os valores de

concentração foram determinados com base em uma curva de calibração na faixa de 0 a 700

mg/L, tendo BSA como padrão. Todas as medidas foram realizadas em triplicata.

4.3.2. Quantificação de carboidratos EPS

O conteúdo de polissacarídeos das amostras de EPS foi aferido pelo método de Dubois

(DUBOIS et al., 1956). Para a quantificação, a 500 µL das amostras foram adicionados 500

µL de formol 5% (m/v) e 2,5 mL de H2SO4. Após 10 minutos de repouso a temperatura

ambiente, os tubos foram agitados e incubados em banho-maria a 30 °C por 15 minutos. A

absorbância foi lida a 488 nm e a concentração de carboidratos foi determinada pela

comparação com uma curva padrão de glicose, na faixa de 0 a 200 mg/L. Todas as medidas

foram realizadas em triplicata.

4.3.3. Determinação de sólidos suspensos voláteis (SSV)

A análise de SSV foi realizada para estimar a concentração de biomassa empregada

nos ensaios de digestão anaeróbia. Para isso, os cadinhos de porcelana empregados foram

previamente levados à mufla a 550 o

C por 1 hora e mantidos em estufa a 105 o

C por 15

minutos. Após intervalo de 15 minutos de resfriamento em dessecador, os cadinhos foram

pesados. Amostras em triplicata de lodo anaeróbio (20 mL) foram centrifugadas a 1850 g por

20 minutos, ressuspendidas em água destilada e adicionadas aos cadinhos. Os mesmos foram

incubados a 105 oC por 24 horas. Em seguida, os cadinhos contendo as amostras secas foram

novamente pesados e submetidos à combustão e evaporação da fração orgânica em mufla

(550 oC por 2 horas). Após incubação por 15 minutos a 105

oC e resfriamento em dessecador,

a massa dos cadinhos foi aferida. A diferença entre o peso seco e o peso após a etapa de

evaporação, corrigidos pelo volume, corresponde à concentração de sólidos suspensos

voláteis (APHA, 1998).


40

4.4. Cromatografia de exclusão molecular dos EPS

O tamanho dos compostos presentes nos EPS extraídos foi avaliado por meio de

cromatografia de exclusão (SEC – Size Exclusion Chromatography). Para isso, uma alíquota

de 100 µL dos extratos, previamente filtrados em membranas de 0,45 µm, foi injetada em um

sistema HPLC (Shimadzu 20 A) equipado com uma coluna Biosep SEC-S 2000 (300 mm x

7,8 mm). A separação foi realizada durante 20 minutos, na temperatura de 25 °C e

empregando-se como fase móvel tampão fosfato 0,1 M pH 6,8 na vazão de 1,0 mL/min. A

leitura das amostras foi realizada com auxílio de um detector UV/VIS SPD-20A (Shimadzu)

no comprimento de onda de 254 nm. Padrões de uridina (0,25 kDa), ovalbumina (44 kDa),

álcool-desidrogenase (150 kDa) e tiroglobulina (669 kDa) foram usados para calibrar o

sistema e a massa molecular dos compostos extraídos foi estimado por meio da relação com

esses padrões.

4.5. Obtenção de SMP

Para a análise de SMP foram estudadas soluções provenientes de diferentes sistemas

de digestão anaeróbia, os quais são detalhados nos itens 4.5.1, 4.5.2 e 4.5.3.

4.5.1. Reator UASB (Upflow Anaerobic Sludge Blanket)

Amostras de lodo e SMP foram coletadas de um reator UASB (Upflow Anaerobic

Sludge Blanket) construído em PVC, com volume de trabalho de 3,5 L (Figura 7). O reator foi

inoculado com 0,8 litros de lodo anaeróbio (10 g/L de SSV) coletado de um reator UASB

operado em escala de demonstração e alimentado com esgoto sanitário bruto, em operação no

Centro de Pesquisa e Treinamento em Saneamento (CePTS) UFMG/COPASA (Belo

Horizonte, Minas Gerais, Brasil).


41

Figura 7: Diagrama esquemático do reator UASB em escala de bancada.

O reator foi alimentado continuamente por meio de bomba peristáltica e a temperatura

mantida constante a 35 °C com auxílio de um termostato. O pH no interior do reator foi

mantido na faixa entre 6,8 a 7,2 pela adição de NaHCO3 na solução de alimentação. A tabela

4 mostra a composição nutricional do afluente do reator.

Tabela 4: Solução nutricional (5X) utilizada para alimentação dos reatores e ensaios de

degradação anaeróbia.

Macro

Nutrientes

Concentração

(mg/L)

Micro

Nutrientes

Concentração

(mg/L)

NH4Cl 1.112,00 FeCl3.6H2O 5,00

(NH4)H2PO4 132,50 ZnCl2 0,13

(NH4)2HPO4 44,50 MnCl2.4H2O 1,25

MgCl2 250,00 (NH4)6Mo7O24.4H2O 1,60

CaCl2.H2O 189,00 AlCl3.6H2O 0,13

NaHCO3 2.500,00 CoCl2.6H2O 5,00

- - NiCl2.6H2O 13,00

- - H3BO3 3,00

- - CuCl2.2H2O 8,00

- - HCl 1 mL/L

Em uma primeira fase, o reator foi empregado para o tratamento de água residuária

sintética contendo glicose. Após coleta de amostras de SMP, o reator foi re-inoculado e

direcionado para o tratamento de água residuária sintética contendo glicerol. Nesta segunda

fase, o reator foi alimentado primeiramente com glicerol puro e, num segundo momento,

alimentado com resíduo bruto da produção de biodiesel. É importante ressaltar que, nessa

fase, foram coletadas tanto amostras de SMP quanto amostras de lodo.


42

4.5.2. Coleta dos SMP do reator UASB

Aproximadamente 200 mL da solução do interior do reator alimentado com glicose e

300 mL do reator tratando glicerol foram filtrados em membranas de acetato de celulose com

poro de 0,45 µm (Sartorius-Stedim), congelados e liofilizados. Devido à alta concentração de

bicarbonato de sódio, as amostras dos reatores UASB tratando glicerol foram ressuspendidas

em 10 mL de água deionizada e submetidas à diálise contra água em membranas de 3,5 kDa

(Thermo). Após nova etapa de liofilização, as amostras foram ressuspendidas em 100 µL de

água deionizada e estocadas a -20 °C até o momento do uso.

4.5.3. Reatores em batelada alimentada

Os ensaios em batelada foram realizados com o intuito de verificar a produção

diferencial de proteínas SMP em função de alterações operacionais. Para a obtenção de SMP

relacionados à fase de consumo do substrato foram testadas seis diferentes condições (Tabela

5):

Tabela 5: Condições dos ensaios em reatores em batelada.

Substrato A/M Temperatura Carvão Ativado

Glicose 0,2 25 °C Não

Glicose 0,2 25 °C Sim



Glicose/Peptona 0,2 25 °C Não

Peptona 0,2 25 °C Não

O lodo anaeróbio foi inoculado na concentração final de sólidos voláteis de 5 g/L

(determinados como descrito no item 4.3.3) em um meio contendo solução nutriente 1X

(Tabela 4). Os frascos foram selados, purgados com nitrogênio gasoso por 3 minutos e

incubados por 108 horas a 120 rpm. Com o intuito de garantir a razão F/M constante, o

substrato de cada um dos ensaios foi adicionado a cada 8 horas, de acordo com a taxa de

consumo de glicose determinada por HPLC (item 4.5.3.1).

Para a obtenção de SMP correspondentes à fase endógena (BAP), outro conjunto de

frascos foi inoculado com a mesma concentração inicial de sólidos e mantido por 10 dias a 25


43

°C e 120 rpm sem a adição de substrato. Todas as amostras foram centrifugadas, filtradas e

liofilizadas. Ao final, as amostras foram submetidas a fracionamento em fenol e precipitação

como descrito no item 4.6.

4.5.3.1. Determinação do consumo de glicose

O tempo necessário para o consumo total de glicose nos reatores em batelada foi

determinado pelo acompanhamento da degradação do substrato por cromatografia líquida de

alta eficiência (HPLC – High Performance Liquid Chromatography, Shimadzu 20 A). As

cromatografias foram realizadas na coluna de troca catiônica HPX-87P (BioRad). Como fase

móvel, foi utilizada água deionizada na vazão de 0,6 mL por minuto, a temperatura da coluna

foi mantida a 80 o

C, o volume de injeção foi de 20 µL e foi empregado o detector por

espalhamento de luz ELSD-LT II (Shimadzu). Foram construídas duas curvas analíticas,

abrangendo a faixa de concentração de 0 a 500 mg/L. Com o intuito de simular os

interferentes presentes nos ensaios, o sobrenadante do reator UASB tratando glicerol foi

utilizado como matriz para a diluição dos padrões de glicose.

4.6. Extração de proteínas intracelulares (HANREICH et al., 2012)

Para a extração das proteínas intracelulares, 10 mL de lodo foram coletados e

congelados a -20 ºC até o momento do uso. Após descongelamento, as amostras foram

centrifugadas (20 min, 6300 g a 4 ºC), ressuspendidas em tampão fosfato e sonicadas duas

vezes em gelo por 2 minutos (50% duty cycle, 20% power, Sonifier Branson). Em seguida, os

tubos foram novamente centrifugados e ao sobrenadante foram adicionados 15 mL de fenol

líquido (10 g de fenol e 1 mL de água deionizada). Os tubos foram mantidos sob agitação

(300 rpm) por 90 minutos a 20 °C ao abrigo da luz. Após centrifugação, a fase orgânica foi

coletada e lavada pela adição de 5 mL de água deionizada e novamente mantida sob agitação

(300 rpm, 20 °C, 10 min) ao abrigo da luz. Os tubos foram mais uma vez centrifugados e à

fase orgânica foram adicionados 4 volumes de acetato de amônio 0,1 M em metanol gelado. A

precipitação das proteínas foi realizada a -20 ºC por 16 horas e completada por centrifugação

a 6300 g por 95 min. O precipitado foi ressuspendido, com auxílio de banho de ultrassom, em


44

2 mL da mesma solução, incubado a -20 ºC por 15 minutos e centrifugado a 12000 g por 10

minutos a 4 ºC. As amostras foram lavadas por duas vezes em acetona 80% e uma vez em

etanol 70%. Entre cada etapa de lavagem as amostras foram incubadas a -20 ºC por pelo

menos 15 minutos. Os extratos foram estocados em etanol 70% a -20 °C e, no momento das

análises, novamente centrifugados e ressuspendidos em 25 µL de água deionizada.

4.7. Eletroforese SDS-PAGE

As amostras proteicas foram analisadas por meio de eletroforese em gel de

poliacrilamida em presença de SDS. Para isso, 10 µL das amostras juntamente com 10 µL de

tampão de amostra (Tris-HCl 125 mM, SDS 4% (m/v), glicerol 20%, DTT 200 mM) foram

incubados por 5 minutos a 100 o

C e, em seguida, foram aplicados em gel de poliacrilamida

(gel de concentração 4% e gel de separação 12 %). As corridas foram realizadas a 200 V e 20

mA por aproximadamente 2 horas. Para posterior análise, os géis foram corados por Comassie

Brilliant Blue R-250 0,025% em solução de etanol 40% contendo 7% de Ácido Acético, por 2

horas. Após esse período, os géis foram descorados em solução de etanol 10% contendo 7%

de ácido acético, durante o tempo necessário para a resolução das bandas. Para melhorar a

visualização, alguns dos géis foram processados no programa BioNumerics (versão 6.6.8,

Applied Maths).

Para o gel mostrado na figura 13, adotou-se o método de coloração por Comassie

coloidal, como descrito no item seguinte.

4.8. Coloração por Coomassie Coloidal G-250

Após a eletroforese, o gel a ser corado com Coomassie Coloidal G-250 foi incubado,

sob agitação, overnight em 100 mL de solução de ácido ortofosfórico 2% (v/v) e etanol 30%

(v/v). Foram realizadas mais duas etapas de incubação, por 30 minutos, com a mesma

solução. Em seguida, o gel foi lavado por três vezes com 50 mL de ácido fosfórico 2% (v/v)

por 10 minutos. A coloração foi realizada pela adição de 100 mL de uma solução de ácido

ortofosfórico 2% (v/v), etanol 18% (v/v) e sulfato de amônio 15% (m/v) e 1 mL de


45

Coomassie Coloidal G-250 2% (m/v). Após 72 horas de coloração, o gel foi lavado por 5

minutos em etanol 20% para a retirada do excesso de Coomassie. O gel foi conservado até o

momento de excisão das bandas a 4 °C em solução de sulfato de amônio 25% (m/v).

4.9. Digestão das proteínas em gel para sequenciamento

As bandas foram excisadas e os fragmentos do gel depositados em tubos de

microcentrífuga com 1,3 mL de solução descorante (etanol 40%, 7% de Ácido Acético), os

quais foram incubados, sob agitação, a 37 oC por 24 horas, com sucessivas trocas do

descorante. Após esse período, os fragmentos do gel foram lavados duas vezes com 1 mL de

H2O deionizada. Para a redução das proteínas, 200 µL de ditiotreitol (DTT) 50 mM foram

adicionados às amostras e os tubos incubados por 30 minutos a 65 °C. A solução de redução

foi removida e, para a alquilação dos grupos sulfidrila, foram adicionados 200 µL de

iodoacetamida (IAA) 100 mM, seguida a incubação dos tubos por 45 minutos a temperatura

ambiente e ao abrigo da luz. Após a remoção da solução de IAA, os fragmentos do gel foram

lavados três vezes com 500 µL de solução de desidratação (bicarbonato de amônio 20

mM/acetonitrila 50%, pH 8,0), com incubação de 20 minutos a cada lavagem. Ao final da

etapa de desidratação, as amostras foram secas em Speed Vac por aproximadamente 3 horas.

A digestão das proteínas foi realizada, então, pela reidratação dos fragmentos do gel em 15

µL de solução de tripsina 30 ng/µL em bicarbonato de amônio 20 mM. Após 20 minutos de

incubação a temperatura ambiente, o excesso de tripsina foi removido e foram adicionados 35

µL de NH4HCO3 20 mM e os tubos foram incubados a 37 °C por 24 horas. Ao término da

digestão, o sobrenadante foi transferido para outro tubo de microcentrífuga. Para a

recuperação dos peptídeos presentes no gel, 50 µL de TFA 0,1%/ACN 50% foram

adicionados aos fragmentos restantes, os quais foram mantidos a temperatura ambiente por 30

minutos. O sobrenadante foi coletado, combinado com o anterior, seco em centrífuga de

vácuo (Speed Vac, ThermoSavant) e ressupenso em 15 µL de ácido fórmico.


46

4.10. Digestão das proteínas em solução

Para a digestão em solução, 75 µL de uma solução de bicarbonato de amônio 50 mM

foram adicionados à 25 µL das amostras. A redução das proteínas foi realizada pela adição de

5 µL de DTT 200 mM (em NH4HCO3 100 mM) e incubação a 100 °C por 10 minutos. As

amostras foram mantidas a temperatura ambiente por 1 hora e, em seguida, 4 µL de IAA 1M

(em NH4HCO3 100 mM) foram adicionados aos tubos e estes foram incubados ao abrigo da

luz por 1 hora. A alquilação foi interrompida pela adição de 20 µL da mesma solução de DTT

e as amostras foram novamente mantidas a temperatura ambiente por 60 minutos. Para a

digestão das proteínas, 10 µL de tripsina 0,1 µg/µL foram adicionados aos tubos e esses

foram incubados a 37 °C por 24 horas. A limpeza das amostras foi realizada em coluna de

fase reversa (Strata C18-E, Phenomenex).

4.11. Espectrometria de massa por ionização do tipo Electrospray – LC-MS-IT-

TOF

Uma alíquota de 5 µL dos peptídeos (acidificados com TFA na concentração final de

0,1%) foram injetados em sistema de cromatografia liquida acoplada a espectrômetro de

massas, em equipamento LC-MS-IT-TOF. Os detalhes da separação cromatográfica e da

configuração do espectrômetro de massas são dados na tabela 6:


47

Tabela 6: Parâmetros do equipamento LC-MS-IT-TOF.

Cromatografia

HPLC Shimadzu 20 A

Coluna Kinetex C18 (150 mm x 3 mm x 2,6 µm; Phenomenex)

Programação Fase A: 0,1% ácido fórmico em água deionizada

Fase B: 0,1% ácido fórmico em acetonitrila

0 min: 5% B, 30 µL/min

40 min: 20% B, 30 µL/min

150 min: 70% B, 30 µL/min

155 min: 100% B, 300 µL/min

158 min: 5% B, 30 µL/min

Espectrometria de Massas

Espectrômetro de Massas Shimadzu IT-TOF

Fonte de ionização Padrão ESI

Modo de ionização Positivo

Aquisição MS 100 – 2000 m/z

Aquisição MS/MS 50 – 2000 m/z

Tempo de acumulação 100 ms

Voltagem do capilar 4,5 kV

Nebulisador 150 kPa

Gás de secagem 1,5 L/min

Temperatura de secagem 200 °C

Isolamento de precursores Automático

Fragmentação CID – energia a 70%, gás de colisão a 80%

Os espectros MS e MS/MS foram submetidos à busca no programa Mascot (versão

2.1.1.0, MatrixScience). Os critérios de busca foram enzima: tripsina; modificações variáveis:

carbamidometilação de cisteínas e oxidação de metioninas; tolerância para íons precursores:


48

0,05 Da; tolerância para íons fragmentados: 0,05 Da; banco de dados: NCBInr; taxonomia

(quando requerida): eubactérias ou arqueias.

5. Resultados e Discussão

Zorel, J. A. Resultados e Discussão

50

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1. Extração de EPS

5.1.1. Avaliação dos métodos de extração

Os oito métodos empregados para a extração de EPS foram avaliados quanto a

diferenças na quantidade de polímeros extraídos. Para isso foram quantificados carboidratos e

proteínas, os quais constituem a grande maioria dos biopolímeros formadores da matriz

extracelular de biofilmes, tanto aeróbios quanto anaeróbios. Para a quantificação de

carboidratos foi empregado o método de Dubois (DUBOIS et al., 1956), o qual mostra-se

efetivo para a quantificação de EPS e SMP de reatores e amostras naturais (AQUINO e

STUCKEY, 2004; COMTE et al., 2007; D’ABZAC et al., 2010).

Por outro lado, para a quantificação de proteínas existem grandes divergências acerca

do uso de protocolos de quantificação de uso já consolidado em outras áreas, como o método

de Lowry (LOWRY et al., 1951; FRØLUND et al., 1995). A principal razão para isso é a

interação entre outros compostos e o reagente de Folin-Ciocalciteau, usado na reação de

Lowry. Entre os principais compostos interferentes, estão as substâncias húmicas presentes

em grandes quantidades em amostras de solo e grânulos anaeróbios (BASTIDA et al., 2009;

D’ABZAC et al., 2010). Frolund e colaboradores (1995) reportaram que a concentração

proteica em amostras desse tipo pode ser superestimada em até 40%, quando usado o método

de Lowry convencional. Para contornar o problema, os autores desenvolveram um método

baseado em duas medições, uma delas feita sem alterações e outra sem a adição de Cu2SO4.

Como o sulfato de cobre é o responsável por intensificar a coloração apresentada por

proteínas no método de Lowry, aferições feitas na ausência do sal servem como medida da

quantidade de ácidos húmicos presentes na amostra. Após correção matemática das

absorbâncias tomadas em ambas as medições, tem-se um valor mais aproximado da

concentração proteica das amostras. Desse modo, nesse trabalho adotou-se o método de

Frolund (FRØLUND et al., 1995) para a quantificação proteica.

Como pode ser visto na figura 8, cada método de extração solubilizou quantidades

distintas de polímeros. Apesar de alguns autores levarem em conta apenas variações

quantitativas para a escolha de um método de extração (FROLUND et al., 1996;


51

DOMÍNGUEZ et al., 2010), é importante ressaltar que a escolha de um único método não

fornece informações representativas de todo o complexo de polímeros que forma os EPS

(PARK e NOVAK, 2007).

Figura 8: Concentração de proteínas (barras pretas) e carboidratos (barras cinzas) para cada método de extração.

Os números acima das barras indicam a razão proteína/carboidratos.

No presente estudo, o método que solubilizou maiores quantidades de polímeros totais

foi o que fez uso de hidróxido de sódio (base e formol+base, figura 8). Segundo Sheng e

colaboradores (2010) a adição de NaOH causa o desprendimento dos EPS devido à remoção

dos hidrogênios ionizáveis de grupos carboxílicos, aumentando a força de repulsão entre

células e EPS. Somada a essa capacidade, a elevação do pH aumenta a solubilidade do

alumínio em água. Como mostrado por Park e Novak (2007), esse metal auxilia na

estruturação da matriz extracelular e, com sua solubilização ocorreria a simultânea liberação

de EPS. A união desses dois mecanismos resulta na alta eficiência apresentada pelo método.

De maneira interessante, o tratamento prévio das amostras com formaldeído reduziu o

rendimento das extrações por NaOH. Esse fenômeno foi observado também para a extração

por aquecimento. Liu e Fang (2002) supõem que o HCOH, devido sua capacidade de fixação

das células, tenha ação protetora sobre a membrana celular dos micro-organismos, diminuindo


52

a lise causada durante as extrações. Apesar de os métodos não causarem danos às células, pelo

menos nas condições em que foram realizados, a ocorrência de lise celular não pode ser

descartada (GARCÍA BECERRA et al., 2010; LI e YANG, 2007). Em contrapartida, alguns

trabalhos mostram que, por si só, a adição de formaldeído pode solubilizar exopolímeros

(ZHANG et al., 1999). Possivelmente, a complexação com formaldeído, tornou parte dos

carboidratos e proteínas menos susceptíveis a ação dos outros agentes de extração (FOX et

al., 1985).

Dois dos métodos, CER e EDTA, são baseados na desestabilização dos EPS por meio

da remoção de cátions estabilizadores da matriz. Enquanto a resina de troca catiônica

sequestra íons Mg2+

e Ca2+

, o EDTA, além desses, pode quelar também íons Fe2+/3+

(WU e

XI, 2009). A despeito dessa maior abrangência do EDTA, a resina de troca catiônica

apresentou melhores resultados, principalmente em relação à quantidade de proteínas

liberadas. Possivelmente, isso se deve ao fato de que a resina, além de suas propriedades

quelantes, substitui os cátions divalentes por íons Na+. Como mostrado por Arabi e Nakhla

(2009a), altas concentrações de sódio estão relacionadas à diminuição da quantidade total de

EPS com consequente aumento dos polímeros solúveis em reatores de membrana.

Outro método baseado na remoção de cátions estabilizadores é o que faz uso de Na2S.

Segundo Nielsen e Keiding (1998), em ensaios com lodo ativado, a adição de sulfeto de sódio

remove íons Fe2+/3+

pela formação de FeS, resultando na desintegração dos flocos. Em nosso

trabalho, a adição de Na2S solubilizou aproximadamente a mesma quantidade de polímeros

obtida com a CER. Segundo Park e Novak (2007), os polímeros extraídos por cada um desses

dois métodos podem ser considerados como diferentes frações de EPS. Portanto, levando em

conta a soma dessas frações, nossos dados indicam que grande parte dos EPS de grânulos

anaeróbios é estabilizada pela interação com cátions di e trivalentes. Visto que tanto a

concentração quanto a razão entre esses íons podem alterar características do lodo, como

tamanho e hidrofobicidade, o monitoramento desses em águas residuárias que chegam a

estações de tratamento pode auxiliar no desempenho de reatores anaeróbios (ARABI e

NAKHLA, 2009a,b).

Entre os métodos físicos de extração, o aquecimento foi mais eficiente do que a

centrifugação. Essa diferença era esperada, visto que o desprendimento de polímeros devido à

força centrífuga é pequeno, em razão da baixa agressividade da técnica (ADAV e LEE, 2011).

A aceleração do movimento das partículas gerada pelo aumento da temperatura (SHENG et


53

al., 2010), por outro lado, liberou uma quantidade de polímeros comparável ao método

químico mais eficiente (NaOH).

Nesse trabalho, a razão proteínas/carboidratos foi na maioria das vezes, exceto para os

métodos formaldeído + aquecimento e EDTA, maior do que um. A prevalência de proteínas e

peptídeos sobre demais polímeros dos EPS já foi demonstrada em outros trabalhos com

culturas mistas (SHENG et al., 2006). Por outro lado, em culturas microbianas puras o

biofilme seria formado quase que em sua totalidade por carboidratos (FLEMMING e

WINGENDER, 2010). Essas discrepâncias fizeram com que, nos primeiros trabalhos sobre a

composição dos EPS de comunidades mistas, a presença de proteínas em extratos fosse usada

como um indicador da lise de células durante o processo de extração. Posteriormente, análises

da atividade de enzimas intracelulares ou da quantidade de DNA liberado em solução

mostraram que extratos de EPS contendo grande quantidade de proteínas, não

necessariamente estão relacionados à lise celular, atribuindo um importante papel das

proteínas na composição de biofilmes naturais (NIELSEN e JAHN, 1999). Desta forma é

possível que, assim como em biofilmes naturais, as proteínas desempenhem papel importante

na agregação e formação de lodo anaeróbio aplicado ao tratamento de esgoto doméstico, tal

como o utilizado neste trabalho.

5.1.2. Caracterização dos extratos por cromatografia de exclusão molecular

Visto que os métodos de extração apresentaram diferenças na quantidade de polímeros

extraídos e que esses podem representar diferentes frações dos EPS, o tamanho dos

compostos de cada extrato foi analisado por meio de cromatografia de exclusão molecular.

Nesse tipo de separação, o tamanho das moléculas pode ser estimado pelo seu tempo de

eluição, sendo que quanto menor a molécula, maior o volume da coluna ao qual essa tem

acesso e, consequentemente, maior é o seu tempo de retenção.

Os cromatogramas referentes aos EPS e aos padrões são mostrados na figura 9. Como

visto, em comparação com os padrões, os compostos extraídos podem ser agrupados em duas

regiões principais: maiores que 669 kDa e menores que 44 kDa, sendo que os últimos

aproximam-se bastante do tempo de eluição do padrão de uridina (com 0,25 kDa). Essa

distribuição bimodal já havia sido demonstrada para os EPS de lodo ativado extraídos por

diferentes métodos (ADAV e LEE, 2011; MENNITI et al., 2009). Desse modo, nossos dados


54

sugerem que, também para o lodo anaeróbio, independentemente das interações que são

quebradas em cada método e dos respectivos polímeros liberados, os EPS são formados tanto

por complexos de alta massa molecular quanto por compostos menores e produtos de

degradação.

Figura 9: Cromatogramas dos extratos de EPS e dos padrões de massa molecular (669 kDa- tiroglobulina; 150

kDa- álcool-desidrogenase; 44 kDa- ovoalbumina; 0,25 kDa- uridina).


55

Figura 9: Continuação.

Na região do cromatograma que corresponde aos compostos menores (próximo ao

tempo de retenção de 10 min), todos os métodos, com exceção de formol + base e

centrifugação, apresentaram picos relativamente intensos. De maneira interessante, um pico

de grande intensidade nessa região foi obtido mesmo para os EPS extraídos com EDTA,

método de menor eficiência. Ao confrontar esses dados com os resultados de quantificação

para esse extrato, pode-se supor que ácidos húmicos sejam os responsáveis pela ocorrência

desse pico, visto que esses apresentam tamanho médio de até 10 kDa e absorvem luz UV no

comprimento de onda usado no ensaio (PEURAVUORI e PIHLAJA, 1997). Como discutido

acima, substâncias húmicas podem interagir com o reagente de Folin e, desse modo, a alta

concentração dessas resultou no valor praticamente nulo de proteínas encontrado para o

extrato. Além disso, complexos do tipo EDTA/Fe3+

podem ter contribuído para a

intensificação do pico encontrado, visto que apresentam absorção máxima no comprimento de

onda de 258 nm (BHATTACHARYA e KUNDU, 1971). Também pode ser notada a


56

ocorrência de um pico ainda mais intenso, com tempo de retenção próximo de 15 minutos,

somente para os compostos extraídos com EDTA, sugerindo que esse método libere grande

quantidade de monômeros dos EPS.

Quanto aos compostos maiores que 669 kDa, o método que apresentou o pico mais

intenso foi o que fez uso de hidróxido de sódio. Essa capacidade de extração de compostos de

alta massa molecular por NaOH havia sido demonstrada por García Becerra e colaboradores

(2010) e, segundo os autores, esses picos correspondem à moléculas que se encontram na

forma de aglomerados. A exemplo do ocorrido nos ensaios de quantificação, a adição de

formaldeído previamente às extrações por NaOH e aquecimento reduziu a intensidade dos

picos. Além disso, o pico correspondente aos compostos de baixa massa molecular (com

tempo de eluição em torno de 11 minutos), para a extração com aquecimento, foi o que teve a

diminuição mais expressiva. Esse fato corrobora a hipótese de que complexos formados entre

esses polímeros e o formaldeído sejam mais difíceis de serem extraídos e tenham diminuído o

rendimento das extrações em questão, principalmente para os compostos menores.

5.1.3. Análise proteômica dos EPS

Para analisar o perfil proteico dos extratos de EPS, esses, após concentração das

amostras, foram aplicados em géis SDS-PAGE. Como primeiro método de escolha para

diminuir o volume dos extratos, foi escolhida a técnica de liofilização. Como visto na figura

10, o procedimento não foi eficaz para a obtenção de amostras com a concentração necessária

para que as bandas pudessem ser visualizadas através do método de coloração por Coomassie.

Uma razão para esse fato pode ter sido a degradação das amostras durante o processo,

o que seria pouco provável, levando em consideração as características da técnica

(Ó´FÁGÁIN, 2011). Uma razão mais plausível seria que ao final da liofilização, o volume das

amostras pode não ter sido reduzido o bastante. Devido à grande quantidade de matéria

presente, o volume mínimo em que os extratos liofilizados puderam ser ressuspendidos variou

entre 0,5 mL e 1,5 mL. Levando em conta a concentração de proteínas encontrada e que

apenas uma pequena fração é aplicada no gel, a quantidade total de cada proteína não

alcançou o valor mínimo para detecção.


57

Figura 10: SDS-PAGE dos extratos de EPS liofilizados. 1- centrifugação; 2- CER; 3- NaOH; 4-

formaldeído+NaOH; 5- aquecimento; 6- formaldeído+aquecimento; 7- EDTA; 8- Na2S.

Sendo assim, as proteínas foram concentradas por meio de precipitação com sulfato de

amônio. A escolha desse método foi baseada nos resultados de Park e colaboradores (2008),

os quais, ao trabalharem com extração de EPS de lodo aeróbio, reportaram que entre outros

métodos de precipitação – incluindo, acetona ou ácido tricloroacético – o uso de (NH4)2SO2

mostrou os melhores resultados. Para o nosso propósito, uma vantagem desse método sobre o

de liofilização é que, ao mesmo tempo em que o volume das amostras é reduzido, ocorre um

processo de concentração mais seletivo para moléculas com características hidrofóbicas do

que para as demais – como carboidratos e ácidos húmicos, por exemplo. Esse procedimento,

seguido de diálise e liofilização, permitiu que as amostras fossem ressuspendidas em volumes

muito menores (em média 70 µL) e que bandas fossem visualizadas para todos os extratos

(Figura 11).


58

Figura 11: Separação por SDS-PAGE dos extratos de EPS precipitados com sulfato de amônio. M- marcador de

massa molecular; 1- centrifugação; 2- CER; 3- NaOH; 4- formaldeído+NaOH; 5- aquecimento; 6-

formaldeído+aquecimento; 7- EDTA; 8- Na2S. A seta indica a banda identificada por LC-MS/MS.

Não obstante as variações na eficiência de extração e no perfil dos cromatogramas

apresentados anteriormente, visualmente não são notadas diferenças significativas na

quantidade de proteínas entre os métodos. Além disso, muitas bandas são comuns a todos os

extratos, inclusive ao método de centrifugação empregado como controle, o qual, segundo

outros estudos é o método mais brando de extração de EPS e não ocasionaria o rompimento

das células durante o processo (SHENG et al., 2010). Portanto, as proteínas visualizadas na

figura 11 podem ser consideradas de fato como constituintes da matriz extracelular. Dessas

observações, pode-se supor que mesmo para métodos mais severos e eficientes de extração,

como os que fazem uso de NaOH ou aquecimento, os danos ocasionados às células foram

mínimos. Por outro lado, os dados indicam que, para estudos sobre o proteoma dos EPS de

lodo anaeróbio, métodos menos agressivos possam ser usados. Isso evitaria possíveis

modificações nas cadeias laterais de aminoácidos causadas por agentes químicos, como as que

ocorrem quando do uso do formaldeído (FOX et al., 1985). Tais modificações, por alterarem

a massa dos resíduos, podem dificultar a posterior identificação das proteínas por

espectrometria de massas.

Em sua maioria, as proteínas precipitadas apresentaram alta massa molecular e

encontram-se acima de 20 kDa, sendo muitas com aproximadamente 100 kDa. Curiosamente,

esses resultados diferem do encontrado nas separações por cromatografia de exclusão, nas


59

quais não são notados picos de alta intensidade nessa região. Essa discrepância pode ser

explicada pelo fato de que nas análises por SEC, os polímeros encontram-se em um estado

mais aproximado de seu estado natural. Por outro lado, o tratamento das amostras que precede

sua aplicação nos géis SDS-PAGE propicia o rompimento de interações e a completa

desnaturação proteica (RABILLOUD et al., 2009). Essa diferença também foi mostrada por

Park e colaboradores (2008), os quais, ao avaliarem o tamanho de moléculas EPS por meio de

fracionamento por ultrafiltração, encontraram alta porcentagem de proteínas maiores que 500

kDa e menores que 3 kDa, enquanto que as análises por SDS-PAGE revelaram a ocorrência

de proteínas com tamanhos intermediários.

A ausência de proteínas de baixa massa molecular pode ser explicada como um viés da

técnica de precipitação por sulfato de amônio, visto que o sucesso do método depende de

características das moléculas a serem precipitadas. Proteínas maiores ou mais hidrofóbicas

são desnaturadas mais facilmente quando da adição do sal, sendo mais propícias a interagirem

e tornarem-se insolúveis (BURGESS, 2009). Outra explicação seria a escolha da fração

encaminhada para centrifugação. Imediatamente após a adição do sal, parte dos compostos se

aglomerou na superfície da solução, o que pode ser notado pela formação de um halo de

coloração mais escura, diminuindo a turbidez do restante da solução. Visto que essa coloração

é uma característica de substâncias húmicas (HANREICH et al., 2012) e que essas interagem

com corantes usados em géis SDS-PAGE (AOYAMA, 2006), o halo em questão foi removido

antes da etapa de centrifugação, com o intuito de diminuir o background das amostras. Para

testar essa suposição, três dos protocolos de extração (aquecimento, EDTA e formaldeído +

aquecimento) foram repetidos e, dessa vez, todo o material presente nos tubos foi

centrifugado. Na figura 12, ao analisar as canaletas 1, 2 e 3, correspondentes aos extratos

submetidos a uma outra eletroforese em SDS-PAGE, nota-se a presença de um grupo de

proteínas de baixa massa molecular (menores que 29 kDa), indicando que essas também

fazem parte do aglomerado removido na precipitação anterior. Além disso, dessa vez podem

ser notadas diferenças maiores entre os extratos, como a ocorrência da banda ‘s1’, presente

em alta concentração apenas para o método de extração com EDTA.


60

Figura 12: Separação por SDS-PAGE dos extratos de EPS precipitados com sulfato de amônio e centrifugados

sem remoção da fração superior. M- marcador de massa molecular; 1- aquecimento; 2- EDTA; 3-

formaldeído+aquecimento.

Como visto acima, e de acordo com Bastida e colaboradores (2009) entre as

dificuldades encontradas para o estudo de proteínas oriundas de comunidades naturais a

principal delas seria o desenvolvimento de protocolos que conciliem a eliminação de

interferentes com a obtenção de amostras representativas do proteoma extracelular.

Das bandas submetidas à identificação, apenas a banda indicada pela seta (Figura 11)

retornou resultado positivo. Mesmo assim, essa foi identificada como uma proteína hipotética

de bactérias da família Acetobacteriaceae. A sequência fornecida pelo software MASCOT foi

submetida à busca de homologia pelo algoritmo BLAST. A única sequência não hipotética

encontrada apresentou apenas 34 % de identidade e refere-se à proteína CelD, uma das

constituintes do celulossomo – complexo bacteriano de degradação de material celulósico

(DOI et al., 2003) – e apesar de não apresentarem relação direta com a formação de biofilmes

podem ser importantes para a degradação extracelular de carboidratos complexos, ou mesmo

para a estruturação da matriz, sem função enzimática. Em um trabalho recente, Albertsen e

colaboradores (2013) reportaram que proteínas diretamente envolvidas no desenvolvimento

dos EPS, apesar de serem detectadas em culturas puras, não foram encontradas em EPS de

lodo ativado, principalmente devido ao baixo rendimento das extrações para esse tipo de


61

amostra. Por outro lado, os autores encontraram proteínas intracelulares, provavelmente

liberadas após morte celular, entre os componentes dos EPS.

5.2. Proteínas SMP

Proteínas e polipeptídeos constituem uma importante fração dos produtos microbianos

solúveis. Além de dados quantitativos, os estudos disponíveis sobre esses biopolímeros

fornecem dados sobre suas características físico-químicas (WANG e ZHANG, 2010). No

entanto, até o presente momento, não são encontradas na literatura informações sobre a

identidade dessas proteínas. Desse modo, nessa etapa do trabalho foram empregadas técnicas

para a análise mais aprofundada do conteúdo proteico dos SMP.

5.2.1. Origem de proteínas SMP: comparação dos perfis proteicos de lise celular,

EPS e SMP

Os SMP são liberados em solução como consequência do metabolismo microbiano e

podem ser produzidos tanto durante a fase de consumo de substrato (UAP) quanto na fase

endógena (BAP; NI et al., 2011). Nos modelos acerca da dinâmica dos SMP existem

divergências entre a origem dos BAP: se estritamente relacionada à hidrólise de EPS

(LASPIDOU e RITTMANN, 2002) ou também à lise celular (AQUINO e STUCKEY, 2008).

Com o intuito de encontrar relações entre SMP, EPS e células, foi proposta a comparação

entre seus proteomas, visto que proteínas são constituintes importantes às três partes. Sendo

assim, amostras de SMP (reator UASB), EPS, BAP (ensaio de decaimento) e lise celular

foram comparadas por meio de SDS-PAGE (Figura 13).

O interesse na caracterização dos BAP é devido principalmente à sua recalcitrância, a

qual afeta a qualidade de efluentes de reatore de tratamento biológico (JARUSUTTHIRAK e

AMY, 2007). Tian e colaboradores (2011), em ensaios de decaimento celular, observaram o

aumento da concentração de polímeros em função do tempo, entre eles carboidratos e

proteínas. Em nossas análises sobre a fração proteica dos BAP, foram encontradas proteínas

em uma ampla faixa de massa molecular (Figura 13, canaleta 2). Essas proteínas, não foram

degradadas após dez dias de incubação, representando, portanto, a parte recalcitrante das

proteínas BAP.


62

Figura 13: SDS-PAGE das amostras de lise celular, BAP, EPS e SMP. M- marcador de massa molecular; 1-

extrato celular; 2- BAP; 3- EPS extraídos por aquecimento; 4- EPS extraídos por EDTA; 5- EPS extraídos por

formaldeído+aquecimento; 6- SMP do reator UASB alimentado com glicose.

Entre essas proteínas, um grupo de baixa massa molecular aparece também nos

extratos de EPS (Figura 13, canaletas 3, 4 e 5). Interessantemente, o mesmo grupo de

proteínas não foi encontrado nos extratos celulares. Isso indica que, provavelmente, proteínas

de baixa massa molecular seriam liberadas em solução como consequência da hidrólise de

EPS durante a fase endógena dos micro-organismos. A solubilização de polímeros da matriz

extracelular em situações de limitação de substrato pode ser decorrente do consumo de outros

constituintes de maior biodegradabilidade. Como discutido por Wingender e Neu (1999), uma

das funções dos EPS é o acúmulo de nutrientes, os quais podem ser posteriormente usados em

condições de escassez. É importante ressaltar que essas proteínas de baixa massa molecular

estão presentes também no interior do reator UASB operando em sistema contínuo (Figura

13, canaleta 6), no qual o lodo é alimentado em fluxo constante e não há falta de substrato.

Desse modo, considerando que essas proteínas sejam mesmo constituintes dos EPS, o

processo de renovação da biomassa também resultaria na liberação dessas.

Além do grupo proteico discutido acima, muitas outras bandas correspondentes à

proteínas SMP (Figura 13, canaleta 6) podem ser visualizadas. Esperava-se que a

concentração encontrada fosse maior, levando em consideração o fator de concentração das

amostras. A diferença entre os valores de concentração encontrados em outros trabalhos e a


63

intensidade das bandas visualizadas no gel pode ser explicada por dois fatores.

Primeiramente, como discutido para os EPS, métodos de quantificação que não levam em

conta a interferência de substâncias húmicas podem superestimar o valor real de proteínas.

Em segundo lugar, alguns trabalhos mostram que a quantidade de proteínas SMP menores que

1 kDa pode totalizar até 50 % do conteúdo proteico em efluentes de reatores (MALAMIS e

ANDREADAKIS, 2009). Proteínas ou peptídeos desse tamanho podem ser quantificados por

métodos colorimétricos, visto que a maioria requer apenas a presença de tripeptídeos para a

geração de cor. No entanto, tais oligopeptídeos não são passíveis de serem encontrados na

técnica empregada em nosso trabalho, ao menos nas condições em que foi realizada

(RABILLOUD et al., 2009). Por outro lado, no presente estudo, bandas com alta intensidade

apareceram na região superior do gel, indicando que proteínas de alta massa molecular

também contribuem consideravelmente para a concentração final de SMP. Em seu estado

natural, a exemplo do que ocorre para os EPS, muitas dessas proteínas seriam encontradas na

forma de complexos.

As bandas ‘s1-5’ assim como a solução de SMP, foram submetidas ao processo de

identificação por LC-MS/MS, e as proteínas encontradas estão na tabela 7. É importante

ressaltar que, analisando os parâmetros fornecidos pelo software de identificação, os

resultados referentes a essas proteínas podem ser usados apenas como indicativos da presença

dessas.

Tabela 7: Proteínas SMP identificadas por LC-MS/MS.

Fonte Identidade Origem

Bandas s2, s4 e s5 Proteína de camada S Methanosaeta concilii

Banda s3 Proteíno-quinase Clostridium beijerinckii

SMP digeridos em solução Proteína ribossomal Halogranum salarium

Nossas análises sugerem a contribuição tanto de arqueias quanto de bactérias para as

proteínas liberadas em solução. Interessantemente, as bandas ‘s2’, ‘s4’ e ‘s5’ foram

identificadas como proteínas da camada S de Methanosaeta concilii. A presença do mesmo

tipo de proteína em três bandas diferentes pode ser explicada pela degradação durante o

processo de digestão anaeróbia ou pela ocorrência natural de proteínas da camada S dentro de


64

uma faixa ampla de massas moleculares. Segundo Sleytr e Beveridge (1999), essas proteínas

compõem a parede celular de arqueias e são expressas na faixa de 40 a 170 kDa.

A banda ‘s3’ foi identificada como uma proteíno-quinase de Clostridium beijerinckii.

Sendo uma proteína intracelular envolvida na transdução de sinal (LEONARD et al., 1998),

essa seria liberada em solução devido à lise celular.

O resultado da digestão em solução da amostra de SMP indica a presença de uma

proteína ribossomal de Halogranum salarium. Proteínas desse tipo estão envolvidas na síntese

proteica e são altamente conservadas entre arqueias (YUTIN et al., 2012). Levando em conta

as condições de baixa salinidade do reator, a presença de um micro-organismo halofílico

extremo no sistema é pouco provável. Como o número de sequências genômicas depositadas

para micro-organismos de reatores ainda é baixo (BARBER et al., 2011) e a busca é baseada

nesses dados, muito provavelmente o peptídeo encontrado corresponde a uma proteína

ribossomal de alguma arqueia metanogênica.

A presença de proteínas da parede celular de arqueias e do citoplasma de arqueias e

bactérias sugere que produtos oriundos de lise celular constituem uma porção importante dos

SMP, corroborando o modelo proposto por Aquino e Stuckey (2008).

5.2.2. Variações no perfil proteico dos SMP relacionadas a alterações no

substrato

A produção de SMP é fortemente modulada por condições ambientais. Os diferentes

SMP liberados exercem funções adaptativas, servem como resposta aos estímulos externos ou

podem ser resultado da morte celular em condições de estresse (BARKER e STUCKEY,

1999).

As informações supracitadas, somadas aos resultados obtidos com as amostras do

reator UASB, nos levaram a avaliar possíveis alterações nas proteínas liberadas pelos micro-

organismos quando da digestão anaeróbia de substratos simples em diferentes condições.

Assim, foram avaliadas as proteínas solúveis encontradas após a degradação de glicose e/ou

peptona em diferentes temperaturas e razões alimento/micro-organismo, totalizando seis

ensaios em reatores em batelada, como descrito no item 4.5.3.

Após filtração das amostras, essas foram submetidas à concentração por liofilização,

visto que a técnica mostrou-se eficaz para a solução do reator. No entanto, nenhuma banda


65

pôde ser visualizada. A exemplo do que ocorreu com os extratos de EPS, além da grande

quantidade de interferentes, o volume das amostras não foi reduzido o bastante. Dessa vez, as

proteínas foram separadas dos ácidos húmicos e demais interferentes pela adição de fenol e

precipitadas em múltiplas etapas com diferentes solventes orgânicos, seguindo o mesmo

protocolo empregado para a obtenção de proteínas intracelulares, com a diferença que ambas

as fases (orgânica e aquosa) foram submetidas às etapas de precipitação. O método foi

escolhido com base no trabalho de Benndorf e colaboradores (2007), os quais mostraram a

compatibilidade desse com amostras de volume reduzido.

Mesmo que ainda de baixa intensidade, bandas foram observadas em grande parte das

canaletas do gel na figura 14. Para algumas das amostras, é possível notar diferença entre suas

frações orgânica e aquosa, indicando que proteínas com diferentes graus de hidrofobicidade

foram encontradas entre os SMP.

Figura 14: SDS-PAGE dos SMP dos reatores em batelada. M- marcador de massa molecular; A- peptona, 25

°C; A/M=0,2; B- glicose-peptona, 25 °C, A/M=0,2; C- glicose, 25 °C, A/M=0,2; D- glicose, 35 °C, A/M=0,02;

E - glicose, 25 °C, A/M=0,2, com carvão ativado. 1- fração orgânica; 2- fração aquosa.

As bandas de maior intensidade são encontradas na parte superior do gel, acima de 20

kDa. Esse fato descarta a possibilidade de que traços da peptona usada como substrato em

dois dos ensaios seja responsável pelas proteínas encontradas nas canaletas referentes a esses,

visto que essa é composta principalmente por hidrolisados proteicos menores que 2 kDa.


66

Entre os ensaios realizados a 25 °C, nota-se que a adição de carvão ativado (canaleta

E1) reduziu o número de bandas, sendo visível apenas uma com tamanho aproximado de 70

kDa, comum a outros três ensaios (A, B, C). O menor número de bandas pode estar

relacionado à capacidade do carvão ativado de adsorver diferentes compostos, inclusive

proteínas, já demonstrada em outros trabalhos (AQUINO et al., 2006).

A mesma banda não foi notada em nenhuma das duas frações do ensaio realizado com

glicose, A/M = 0,02 e 35 °C. Essa proteína pode ter sido degradada mais facilmente nessas

condições em decorrência do aumento do metabolismo microbiano em função da maior

temperatura. Por outro lado, Barker e Stuckey (1999) ressaltam que a adição repentina de

altas quantidades de fontes de carbono pode acelerar a morte de algumas bactérias. Desse,

modo a adição de menores quantidades de substrato pode também ter contribuído para a

menor liberação de proteínas SMP. Para esclarecer qual dos dois fatores seria o responsável

pelo resultado encontrado, foi realizado um ensaio variando apenas a temperatura e mantendo

a razão A/M = 0,2. Todavia, o background intenso das amostras impossibilitou a análise das

bandas em SDS-PAGE (resultados não mostrados).

Com o intuito de identificar as proteínas liberadas em cada situação, 18 bandas

visualizadas na figura 14 foram conduzidas ao processo de identificação por LC-MS/MS.

Infelizmente, nenhuma retornou resultado positivo. Provavelmente, a baixa concentração das

amostras tenha sido a principal causa da ausência de identificações. Em algumas delas foram

encontrados peptídeos autolíticos de tripsina e a maioria das amostras não gerou espectros

com qualidade e intensidade suficientes para serem submetidos à busca em banco de dados.

A amostra referente ao ensaio glicose, A/M = 0,02 e 35 °C foi submetida também à

digestão enzimática em solução, para a qual foi encontrada a lipoproteína da membrana

externa de Tolumonas auensis. Dessa vez, os parâmetros da busca indicaram com

confiabilidade a presença dessa proteína e, novamente, os resultados sugerem a presença de

proteínas de membrana entre os SMP. As lipoproteínas são os principais constituintes da

membrana externa de bactérias gram-negativas (HUSSAIN e ICHIHARA, 1980) e sua

presença no meio, visto que essa não é uma proteína secretada, indica mais uma vez a

influência de produtos de lise celular no conteúdo final dos SMP. A bactéria T. auensis,

isolada de sedimentos, apresenta a capacidade de produzir tolueno em condições anóxicas e

possui seu genoma completamente sequenciado, justificando o resultado encontrado

(CHERTKOV et al., 2011).


67

5.3. Caracterização proteômica da comunidade microbiana do reator UASB

tratando glicerol

Após o redirecionamento do reator para o tratamento de glicerol, foi proposta a análise

dos SMP produzidos durante o consumo desse substrato, visando à comparação entre esses e

os liberados na degradação de glicose.

Para a análise de SMP, a solução do interior do reator UASB tratando glicerol puro foi

filtrada e concentrada por liofilização. No entanto, após a sublimação da água, a amostra

ainda apresentava grande quantidade de bicarbonato de sódio. Devido à acidificação do meio

durante a degradação de glicerol, o sal era adicionado como medida de controle do pH. Para a

eliminação do bicarbonato, foram testados dois protocolos: diálise ou precipitação seguida de

diálise. Todavia, nenhuma das alternativas mostrou-se efetiva para a recuperação de proteínas

passíveis de serem visualizadas com a coloração por Coomassie.

Desse modo, apenas amostras de proteínas celulares foram analisadas, com o intuito

de avaliar mudanças na comunidade microbiana relacionadas a alterações de substrato. Assim,

foram preparados extratos do lodo usado como inóculo, alimentado apenas com glicose, e do

lodo do reator em duas fases: uma tratando glicerol puro ou outra resíduo de biodiesel. Os

perfis proteicos das preparações podem ser vistos na figura 15 e as bandas identificadas são

mostradas na tabela 8. Infelizmente, nenhuma proteína foi identificada para o extrato do

inóculo.

Figura 15: SDS dos extratos de proteínas celulares. M- marcador de massa molecular; In- inóculo; RA- reator

tratando glicerol puro; RP- reator tratando resíduo de biodiesel.


68

Das 6 proteínas (Tabela 8) identificadas nessa etapa, 4 delas correspondem a proteínas

de membrana. Hanreich e colaboradores (2013), ao buscarem proteínas responsáveis pela

degradação de carboidratos em lodo anaeróbio, encontraram grande número de proteínas

membranares e periplasmáticas. Segundo os autores, a elevada taxa de identificação de

proteínas desse tipo deve-se ao fato de que essas compreendem aproximadamente 30% do

total de proteínas celulares. Além disso, o método de extração empregado – o qual foi usado

também em nosso trabalho – pode favorecer a presença de proteínas mais hidrofóbicas (como

as de membrana) em detrimento a proteínas citoplasmáticas, de maior hidrofilicidade.

Tabela 8: Proteínas identificadas para os extratos celulares separados por SDS-PAGE. RA-

reator tratando glicerol puro; RP- reator tratando resíduo de biodiesel.

Lodo Amostra Identificação Micro-organismo

RA r1 Proteína hipotética Clostridium sp.

Beta-glicosidase Aspergillus aculeatus

RP

r2 Flagelina Escherichia coli

r3 FlaB3 Treponema pallidum

r4 Proteína ligante de soluto extracelular Enterobacter sp.

r5 Proteína fimbrial MrKA Klebsiella oxytoca

O elevado número de proteínas, junto ao background intenso, torna difícil o

levantamento de suposições acerca de mudanças relacionadas às diferentes condições

ambientais a que o lodo foi exposto. Apenas na região inferior a 30 kDa nota-se com clareza

algumas bandas que apresentam maior intensidade para os extratos das células envolvidas no

tratamento de glicerol. Isso indica a expressão aumentada dessas proteínas ou o

enriquecimento de um determinado grupo de micro-organismos que teria o crescimento

favorecido nessas condições. Das bandas excisadas nessa região, as bandas ‘r5’ e ‘r4’, foram

classificadas como proteína fimbrial MrkA de Klebsiella oxytoca e proteína ligante de soluto

extracelular de Enterobacter sp., respectivamente.

A proteína MrkA é codificada por um dos cinco genes do cluster mrkABCDF, sendo a

principal componente estrutural da fimbria tipo 3 (STAHLHUT et al., 2012). Segundo

Schurtz e colaboradores (SCHURTZ et al., 1994), o gene mrkA, diferentemente de outros


69

componentes do cluster, é altamente conservado entre espécies do gênero Klebsiella. Além de

seu papel estrutural, a alta hidrofobicidade dessa proteína facilita interações bacterianas,

propiciando a formação do biofilme. Essa característica mostra-se fundamental para a adesão

e o crescimento de células de Klebsiella sp., visto que essas não possuem flagelos, outro

apêndice extracelular importante para o desenvolvimento de aglomerados bacterianos

(LANGSTRAAT et al., 2001). A ocorrência dessa proteína na microbiota do reator tratando

glicerol, principalmente naquele alimentado com glicerol bruto, indica que espécies de

Klebsiella podem ser importantes para a degradação desse resíduo. Esse achado corrobora

com os dados de Homann e colaboradores (1990), os quais, com uso de meios seletivos para

micro-organismos consumidores de glicerol, isolaram espécies dos gêneros Citrobacter e

Klebsiella, entre elas K. oxytoca. Os autores destacaram o rápido consumo de glicerol e a alta

taxa de crescimento dos isolados de Klebsiella nessa fonte de carbono. Somado a esse fato, o

metabolismo desses micro-organismos possibilita a conversão pH dependente de glicerol em

ácido acético e 2,3-butanodiol. A produção desses compostos serve como um sistema de

tamponamento do meio em uma faixa de pH em torno de 5,4 e pode ser considerada como

uma estratégia de sobrevivência microbiana (PETROV e PETROVA, 2009). Esse fato

explicaria tanto a vantagem desses micro-organismos em ambientes contendo glicerol quanto

a acidificação da solução no interior do reator UASB usado em nosso estudo.

De maneira similar, bactérias do gênero Enterobacter, usadas na produção de

hidrogênio a partir de glicerol, apresentam pH ótimo de crescimento entre 5,8 e 7,0. Essas

bactérias possuem diferentes rotas metabólicas que possibilitam o uso de glicerol como fonte

de energia bem como sua conversão em metabólitos de interesse comercial. Devido a essa

característica, muitas espécies de Enterobacter são isoladas em meios de cultura contendo

glicerol visando à conversão de resíduos de biodiesel em combustíveis renováveis como:

hidrogênio e etanol (REUNGSANG et al., 2013). A proteína encontrada, identificada como

uma transportadora ABC (ATP Binding Casset) de cisteína, apesar de não estar diretamente

relacionada à degradação de glicerol, pode ter relação com o aumento da população de

Enterobacter sp.no reator. Essa proteína pertence à família de ligantes de soluto extracelular a

qual, em bactérias gram-negativas, é composta de proteínas periplasmáticas envolvidas nos

fenômenos de quimiorrecepção e transporte transmembrana (TAM e SAIER, 1993). Em

condições de disponibilidade de nutrientes no meio, o uso de transportadores ABC mostra-se

energeticamente mais favorável do que a síntese desses nutrientes, acarretando no aumento da


70

taxa de crescimento microbiana. É importante ressaltar a grande similaridade entre

transportadores desse tipo, e que essa não significa necessariamente similaridade entre

substratos (HIGGINS, 1992). No reator em estudo, esses não estariam envolvidos no

transporte de glicerol, já que esse é o único carboidrato conhecido que é transportado via

difusão facilitada em bactérias (DILLS et al., 1980).

Para a banda ‘r1’ duas proteínas foram identificadas: uma delas como sendo uma

proteína hipotética de Clostridium sp. e outra como uma β-glicosidase de Aspergillus

aculeatus. A presença do gênero Clostridium é descrita não apenas para biorreatores tratando

glicerol como também para outros resíduos (YAZDANI e GONZALEZ, 2007). Por outro

lado, a ocorrência de fungos não é comum nesses ambientes e, portanto, esse resultado pode

ser explicado pela similaridade entre essa classe de enzimas microbianas. Gräbnitz e

colaboradores (1989) reportaram a alta homologia entre as sequências de nucleotídeos do

gene que codifica para β-glicosidase de Clostridium thermocellum e genes de leveduras e

fungos filamentosos. Por outro lado, no sistema em estudo, essa enzima não apresenta função

evidente, visto sua atividade sobre material celulósico de cadeia curta (BHATIA et al., 2002).

Proteínas atribuídas a micro-organismos potencialmente patogênicos foram

encontradas nas bandas ‘r2’ e ‘r3’. A primeira delas foi identificada como uma flagelina de

Escherichia coli. Como o lodo usado para inóculo do reator é originado de uma estação que

trata esgoto doméstico é provável que esse micro-organismo esteja presente. No entanto cabe

informar que membros da família Enterobacteriaceae, dentre eles a espécie Escherichia coli,

são membros freqüentes em processos de digestão anaeróbia e também foram relatados como

fermentadores de glicerol a diversos produtos orgânicos além de biogás (H2 e CO2;

ALMEIDA et al., 2012). Considerando tais informações, a identificação de uma proteína

específica de E. coli sugere seu envolvimento na biodegradação do glicerol. A outra proteína

referente a um patógeno foi identificada como a proteína FlaB3, uma das componentes do

flagelo, de Treponema pallidum. Não foram encontrados relatos sobre o monitoramento e a

sobrevivência desse micro-organismo em reatores anaeróbios, porém observações

microscópicas do lodo de inóculo frequentemente revelavam morfologia celular semelhante a

de Treponema (SILVA, comunicação pessoal) sugerindo sua presença nos reatores anaeróbios

aplicados ao tratamento de esgoto doméstico. Uma vez que, um dos parâmetros a serem

avaliados em estações de tratamento é a capacidade de eliminação de patógenos, inclusive

daqueles não cultiváveis (JIANG et al., 2012), encontrar proteínas referentes a esses micro-


71

organismos mostra a funcionalidade da técnica também no monitoramento de micro-

organismos indesejáveis.

Com o intuito de identificar um maior número de proteínas, as três preparações

(Inóculo, RA e RP) foram submetidas à digestão em solução. As proteínas identificadas são

mostradas na tabela 9.

Tabela 9: Proteínas identificadas para os extratos celulares submetidos à digestão em

solução. In- inóculo; RA- reator tratando glicerol puro; RP- reator tratando resíduo de

biodiesel.

Lodo Identificação Micro-organismo

In Elastase III A Homo sapiens

RA

Proteína putativa fimbrial-símile Klebsiella pneumoniae

Proteína fimbrial MrKA Klebsiella oxytoca

Proteína A de membrana externa Citrobacter freundii

RP

Proteína fimbrial MrKA Klebsiella oxytoca

Proteína putativa fimbrial-símile Klebsiella pneumoniae

Gliceraldeído-3-fosfato Desidrogenase Escherichia vulneris

Proteína hipotética Citrobacter koseri

Flagelina Clostridium trobutyricum

Mais uma vez, nenhuma proteína microbiana foi identificada para o extrato do

inóculo. Curiosamente, foi encontrada a enzima elastase III A de Homo sapiens, uma das

isoformas das elastases pancreáticas humanas responsáveis pela hidrólise de proteínas

fibrosas, como a elastina. Em um estudo sobre proteínas EPS de lodo ativado de estações de

tratamento reais, Park e colaboradores (2008) reportaram a ocorrência da elastase III A em

três bandas analisadas por LC-MS/MS. Os autores discutiram que a enzima não sofre

degradação no trato digestivo humano e que ficaria adsorvida na matriz extracelular dos

flocos. Em nosso trabalho, a identificação dessa enzima indica que essa é extremamente

resistente aos dois tipos de tratamento biológico (aeróbio e anaeróbio), pois o lodo analisado,

após sua coleta, foi alimentado por aproximadamente doze meses apenas com glicose. Além


72

disso, esse achado indica que o método escolhido para a análise de proteínas intracelulares

não é isento de contaminações por proteínas EPS.

Para o reator tratando glicerol, a proteína MrKA de K. oxytoca, já identificada na

banda ‘r5’, foi detectada em ambas as fases, assim como uma proteína putativa fimbrial-

símile de Klebsiella pneumoniae. A recorrência dessa identificação reforça a hipótese de

enriquecimento desse gênero no reator.

Citrobacter sp. também foram detectados nas duas fases, sendo que na primeira foi

identificada a proteína A da membrana externa (OmpA) de C. freundii. Representantes dessa

espécie também foram encontrados por Homman e colaboradores (1990) entre os isolados

obtidos em meio seletivo para micro-organismos consumidores de glicerol. Segundo os

mesmos autores, a espécie mostra-se atrativa para a bioconversão de glicerol em 1,3-

propanodiol (composto empregado industrialmente para a produção de polímeros), visto que a

geração de subprodutos é mínima. Quanto a OmpA, Torres e colaboradores (2006) reportam

seu alto nível de expressão em E. coli e sua ocorrência em outras bactérias gram-negativas.

Além de sua função estrutural, a OmpA exerce papel na aderência bacteriana. Outra proteína

de membrana externa encontrada, dessa vez na segunda fase do reator, foi uma flagelina de

Clostridium tyrobutyricum, micro-organismo também envolvido na degradação de glicerol

(YAZDANI e GONZALEZ, 2007).

Também na segunda fase, foi encontrada uma proteína hipotética de Citrobacter

koseri, espécie patogênica ainda não reportada para processos de tratamento de resíduos. A

busca de homologia pelo algoritmo BLAST, revelou identidade de 94% da sequência da

proteína detectada com a glicerol-desidrogenase de Citrobacter sp. Essa enzima é a primeira a

atuar na via oxidativa de degradação do glicerol, convertendo-o a di-hidroxiacetona, sendo de

extrema importância para a obtenção de energia pela comunidade microbiana do reator. Após

outras conversões, a di-hidroxiacetona é encaminhada à glicólise, via para a qual foi

encontrada a enzima gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase de Escherichia vulneris, outra

espécie não reportada para reatores anaeróbios. A sequência encontrada apresenta alta

similaridade com a sequência da mesma enzima de K. pneumoniae, espécie com maior

probabilidade de estar presente no reator.

A indicação da abundância de micro-organismos fermentativos condiz com a condição

do reator no momento da coleta. Dados de monitoramento indicam alta produção de ácidos

orgânicos com consequente queda do pH e diminuição da atividade dos micro-organismos


73

metanogênicos, verificada pela baixa produção de CH4. Tais condições também explicariam a

ausência de identificação de proteínas de arqueias metanogênicas, verificadas em grande

número em outros trabalhos (ABRAM et al., 2011; HANREICH et al., 2013).

A baixa porcentagem de identificação de proteínas em nosso trabalho pode estar

relacionada à escassez de sequências genômicas depositadas para micro-organismos de lodo

anaeróbio, visto que, através da análise manual de muitos espectros MS e MS2 o sucesso da

digestão enzimática e da fragmentação dos peptídeos pôde ser verificada. Em trabalhos

recentes é comum a aplicação de técnicas metagenômicas para a geração de banco de dados,

contra os quais os resultados de espectrometria de massas possam ser comparados

(ALBERTSEN et al., 2013; HANREICH et al., 2013). Outra alternativa para a identificação

de proteínas referentes a esses espectros é o sequenciamento de novo desses e posterior busca

em banco de dados.

6. Conclusões

Zorel, J. A. Conclusões

74

6. CONCLUSÕES

Os métodos de extração de EPS apresentaram grande variação na quantidade de

polímeros extraídos, sendo que aqueles que fizeram uso de NaOH e de aquecimento

mostraram-se mais eficientes. Além dessas diferenças quantitativas, os extratos de

EPS de lodo anaeróbio diferem nas proteínas solubilizadas, quando precipitado o

extrato completo.

Proteínas BAP de baixa massa molecular são, provavelmente, oriundas da hidrólise de

EPS, porém produtos de lise celular (como proteínas de membrana e intracelulares)

também foram identificadas entre os SMP.

A liberação/permanência de proteínas SMP em solução parece depender levemente

das condições ambientais investigadas (temperatura, substrato, razão alimento/micro-

organismo).

As técnicas proteômicas mostraram-se como uma ferramenta poderosa para a

investigação de comunidades microbianas envolvidas no tratamento anaeróbio de

resíduos, detectando gêneros bacterianos envolvidos na fermentação do glicerol.

7. Perspectivas

Zorel, J. A. Perspectivas

76

7. PERSPECTIVAS

Submeter os espectros não identificados à síntese de novo e posterior busca em banco

de dados.

Aperfeiçoar as técnicas de extração e concentração das amostras proteicas, com vista

ao aumento do número de espectros de qualidade.

Combinar o uso de proteômica com técnicas de biologia molecular para a

identificação de comunidades microbianas aplicadas ao tratamento de resíduos.

8. Referências Bibliográficas

Zorel, J. A. Referências

78

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ABRAM, F. et al. A metaproteomic approach gives functional insights into anaerobic

digestion. Journal of applied microbiology, v. 110, n. 6, p. 1550–60, jun. 2011.

ABRAM, F.; GUNNIGLE, E.; O’FLAHERTY, V. Optimisation of protein extraction and 2-

DE for metaproteomics of microbial communities from anaerobic wastewater treatment

biofilms. Electrophoresis, v. 30, n. 23, p. 4149–51, dez. 2009.

ADAV, S. S.; LEE, D.-J. Characterization of extracellular polymeric substances (EPS) from

phenol degrading aerobic granules. Journal of the Taiwan Institute of Chemical

Engineers, v. 42, n. 4, p. 645–651, jul. 2011.

AEBERSOLD, R.; MANN, M. Mass spectrometry-based proteomics. Nature, v. 422, n.

6928, p. 198–207, 13 mar. 2003.

AGATHOS, S. N. Introduction. In: Comprehensive Biotechnology. [s.l: s.n.]. p. 2011.

AHMED, Z. et al. Effects of sludge retention time on membrane fouling and microbial

community structure in a membrane bioreactor. Journal of Membrane Science, v. 287, n. 2,

p. 211–218, jan. 2007.

AIVASIDIS, A.; DIAMANTIS, V. I. Biochemical Reaction Engineering and Process

Development in Anaerobic Wastewater Treatment. p. 49–76, 2005.

ALBERTSEN, M. et al. Digging into the extracellular matrix of a complex microbial

community using a combined metagenomic and metaproteomic approach. Water Science

and Technology, v. 67, n. 7, p. 1650–1656, 2013.

ALMEIDA, J. R. M.; FÁVARO, L. C. L.; QUIRINO, B. F. Biodiesel biorefinery:

opportunities and challenges for microbial production of fuels and chemicals from glycerol

waste. Biotechnology for biofuels, v. 5, n. 1, p. 48, jan. 2012.

AOYAMA, M. Properties of neutral phosphate buffer extractable organic matter in soils

revealed using size exclusion chromatography and fractionation with polyvinylpyrrolidone.

Soil Science and Plant Nutrition, v. 52, p. 378–386, 2006.

APHA. Standard Methods for Examination of Water and Wastewater. Washington DC:

[s.n.].

AQUINO, S. F. Formation of Soluble Microbial Products (SMP) in Anaerobic Reactors

During Stress Conditions. [s.l.] Imperial Collegeof London, 2004.

AQUINO, S. F. et al. Characterization of dissolved compounds in submerged anaerobic

membrane bioreactors (SAMBRs). Journal of Chemical Technology and Biotechnology, v.

81, p. 1894–1904, 2006.

79

AQUINO, S. F.; STUCKEY, D. C. Soluble microbial products formation in anaerobic

chemostats in the presence of toxic compounds. Water research, v. 38, n. 2, p. 255–66, jan.

2004.

AQUINO, S. F.; STUCKEY, D. C. Integrated model of the production of soluble microbial

products (SMP) and extracellular polymeric substances (EPS) in anaerobic chemostats during

transient conditions. Biochemical Engineering Journal, v. 38, n. 2, p. 138–146, fev. 2008.

ARABI, S.; NAKHLA, G. Impact of protein/carbohydrate ratio in the feed wastewater on the

membrane fouling in membrane bioreactors. Journal of Membrane Science, v. 324, n. 1-2,

p. 142–150, 31 out. 2008.

ARABI, S.; NAKHLA, G. Impact of magnesium on membrane fouling in membrane

bioreactors. Separation and Purification Technology, v. 67, n. 3, p. 319–325, jun. 2009.

ARABI, S.; NAKHLA, G. Impact of cation concentrations on fouling in membrane

bioreactors. Journal of Membrane Science, v. 343, n. 1-2, p. 110–118, nov. 2009.

ARABI, S.; NAKHLA, G. Impact of molecular weight distribution of soluble microbial

products on fouling in membrane bioreactors. Separation and Purification Technology, v.

73, n. 3, p. 391–396, jul. 2010.

AZAMI, H.; SARRAFZADEH, M. H.; MEHRNIA, M. R. Soluble microbial products

(SMPs) release in activated sludge systems: a review. Iranian journal of environmental

health science & engineering, v. 9, n. 1, p. 30, jan. 2012.

BARBER, R. D. et al. Complete genome sequence of Methanosaeta concilii, a specialist in

aceticlastic methanogenesis. Journal of Bacteriology, v. 193, n. 14, p. 3668–9, jul. 2011.

BARKER, B. D. J. et al. Soluble Microbial Products in ABR Treating Low-Strength

Wastewater. Journal of Environmental engineering, n. March, p. 239–249, 2000.

BARKER, D. J.; STUCKEY, D. C. A Review of Soluble Microbial Products (SMP) in

Wastewater Treatment Systems. Water Research, v. 33, n. 14, p. 3063–3082, 1999.

BASTIDA, F. et al. Soil metaproteomics: a review of an emerging environmental science.

Significance, methodology and perspectives. European Journal of Soil Science, v. 60, n. 6,

p. 845–859, dez. 2009.

BENNDORF, D. et al. Functional metaproteome analysis of protein extracts from

contaminated soil and groundwater. The ISME journal, v. 1, n. 3, p. 224–34, jul. 2007.

BHATIA, Y.; MISHRA, S.; BISARIA, V. S. Microbial beta-glucosidases: cloning,

properties, and applications. Critical reviews in biotechnology, v. 22, n. 4, p. 375–407, jan.

2002.

BHATTACHARYA, S. N.; KUNDU, K. P. Spectrophotometric determination of EDTA.

Talanta, v. 18, p. 446–449, 1971.

79

BODZON-KULAKOWSKA, A. et al. Methods for samples preparation in proteomic

research. Journal of chromatography. B, v. 849, n. 1-2, p. 1–31, 15 abr. 2007.

BOERO, V. J.; ECKENFELDER, W. W.; BOWERS, A. R. Soluble Microbial Product

Formation in Biological Systems. Water Science and Technology, v. 23, p. 1067–1076,

1991.

BURGESS, R. R. Protein Purification Techniques. In: BURGESS, R. R.; DEUTSCHER, M.

P. (Eds.). Methods in Enzymology: Protein Purification Guide. 2. ed. [s.l.] Elsevier, 2009.

CAÑAS, B. et al. Trends in sample preparation for classical and second generation

proteomics. Journal of chromatography. A, v. 1153, n. 1-2, p. 235–58, 15 jun. 2007.

CHERTKOV, O. et al. Complete genome sequence of Tolumonas auensis type strain (TA 4).

Standards in genomic sciences, v. 5, n. 1, p. 112–20, 15 out. 2011.

COMTE, S.; GUIBAUD, G.; BAUDU, M. Relations between extraction protocols for

activated sludge extracellular polymeric substances (EPS) and EPS complexation properties.

Enzyme and Microbial Technology, v. 38, n. 1-2, p. 237–245, jan. 2006.

COMTE, S.; GUIBAUD, G.; BAUDU, M. Effect of extraction method on EPS from activated

sludge: an HPSEC investigation. Journal of Hazardous Materials, v. 140, n. 1-2, p. 129–37,

9 fev. 2007.

D’ABZAC, P. et al. Extraction of extracellular polymeric substances (EPS) from anaerobic

granular sludges: comparison of chemical and physical extraction protocols. Applied

microbiology and biotechnology, v. 85, n. 5, p. 1589–99, fev. 2010.

DILLS, S. S. et al. Carbohydrate transport in bacteria. Microbiological reviews, v. 44, n. 3, p.

385–418, set. 1980.

DOI, R. H. et al. Cellulosomes from Mesophilic Bacteria. Journal of Bacteriology, v. 185, n.

20, p. 5907–5914, 2003.

DOMÍNGUEZ, L.; RODRÍGUEZ, M.; PRATS, D. Effect of different extraction methods on

bound EPS from MBR sludges. Part I: Influence of extraction methods over three-

dimensional EEM fluorescence spectroscopy fingerprint. Desalination, v. 261, n. 1-2, p. 19–

26, out. 2010.

DOMON, B.; AEBERSOLD, R. Mass spectrometry and protein analysis. Science, v. 312, p.

212–7, 14 abr. 2006.

DUBOIS, M. et al. Colorimetric Method for Determination of Sugars and Related Substances.

Analytical Chemistry, v. 28, n. 3, p. 350–356, 1 mar. 1956.

EVANS, G. M.; FURLONG, J. C. Environmental Biotechnology: Theory and

Application. [s.l: s.n.].

FLEMMING, H.-C.; WINGENDER, J. The biofilm matrix. Nature reviews. Microbiology,

v. 8, n. 9, p. 623–33, set. 2010.

79

FORT, C. L. Evaluation of the qulaity of the wastewater treatment effluent following

chlorination or ozonation. In: JOLLEY, R. L. (Ed.). Water Chlorination: Environmental

Impact an Health Effects. [s.l.] Ann Arbor, 1983. p. 1261–1278.

FOX, C. H. et al. Formaldehyde fixation. Journal of Histochemistry & Cytochemistry, v.

33, n. 8, p. 845–853, 1 ago. 1985.

FROLUND, B. et al. Extraction of Extracellular Polymers from Activated Sludge using a

Cation Exchange Resin. Water Research, v. 30, n. 8, p. 1749–1758, 1996.

FROLUND, B.; GRIEBE, T.; NIELSEN, P. H. Enzymatic activity in the activated-sludge floc

matrix. Applied Microbiology and Biotechnology, v. 43, n. 4, p. 755–61, 1995.

FURUMAI, H.; RITTMANN, B. E. Advanced Modeling of Mixed Populations of

Heterotrophs and Nitrifiers Considering the Formation and Exchnage of Soluble Microbial

Products. Water Science and Technology, v. 26, n. 3-4, p. 493–502, 1992.

GARCÍA BECERRA, F. Y.; ACOSTA, E. J.; ALLEN, D. G. Alkaline extraction of

wastewater activated sludge biosolids. Bioresource technology, v. 101, n. 18, p. 6983–91,

set. 2010.

GARCÍA MARTÍN, H. et al. Metagenomic analysis of two enhanced biological phosphorus

removal (EBPR) sludge communities. Nature Biotechnology, v. 24, n. 10, p. 1263–9, out.

2006.

GUJER, W.; ZEHNDER, A. J. B. Conversions Processes in Anaerobic Digestion. Water

Science and Technology, v. 15, p. 127–167, 1983.

GYGI, S. P. et al. Evaluation of two-dimensional gel electrophoresis-based proteome analysis

technology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of

America, v. 97, n. 17, p. 9390–5, 15 ago. 2000.

HANREICH, A. et al. Metaproteome analysis to determine the metabolically active part of a

thermophilic microbial community producing biogas from agricultural biomass. Canadian

Journal of Microbiology, v. 58, n. 1, p. 917–922, 2012.

HANREICH, A. et al. Metagenome and metaproteome analyses of microbial communities in

mesophilic biogas-producing anaerobic batch fermentations indicate concerted plant

carbohydrate degradation. Systematic and Applied Microbiology, v. 36, n. 5, p. 330–338,

jul. 2013.

HASTINGS, J. W.; GREENBERG, E. P. Quorum Sensing : the Explanation of a Curious

Phenomenon Reveals a Common Characteristic of Bacteria. Journal of Bacteriology, v. 181,

n. 9, p. 2667–2668, 1999.

HEJZLAR, J.; CHUDOBA, J. Microbial Polymers in the Aquatic Environment - I: Production

by Activated Sludge Microorganisms Under Different Conditions. Water Research, v. 20, n.

10, p. 1209–1216, 1986.

79

HIGGINS, C. F. ABC transporters: from microorganisms to man. Annual review of cell

biology, v. 8, p. 67–113, jan. 1992.

HOMANN, T. et al. Fermentation of glycerol to 1,3-propanediol by Klebsiella and

Citrobacter strains. Applied microbiology and biotechnology, v. 33, n. 2, p. 121–126, 1990.

HUANG, Y.-T. et al. Identifications and characterizations of proteins from fouled membrane

surfaces of different materials. International Biodeterioration & Biodegradation, v. 66, n.

1, p. 47–52, jan. 2012.

HUANG, Z.; ONG, S. L.; NG, H. Y. Submerged anaerobic membrane bioreactor for low-

strength wastewater treatment: effect of HRT and SRT on treatment performance and

membrane fouling. Water research, v. 45, n. 2, p. 705–13, jan. 2011.

HUSSAIN, M.; ICHIHARA, S. Accumulation of Glyceride-containing Precursor of the Outer

Membrane Lipoprotein in the Cytoplasmic Membrane of Escherichia coli Treated with

Globomycin. The Journal of Biological Chemistry, v. 255, n. 8, p. 3708–3712, 1980.

JANG, N. et al. Characteristics of soluble microbial products and extracellular polymeric

substances in the membrane bioreactor for water reuse. Desalination, v. 202, p. 90–98, jan.

2007.

JANSSEN, A. J. H. et al. Application of bacteria involved in the biological sulfur cycle for

paper mill effluent purification. The Science of the total environment, v. 407, n. 4, p. 1333–

43, 1 fev. 2009.

JARUSUTTHIRAK, C.; AMY, G. Role of soluble microbial products (SMP) in membrane

fouling and flux decline. Environmental Science & Technology, v. 40, n. 3, p. 969–74, 1

fev. 2006.

JARUSUTTHIRAK, C.; AMY, G. Understanding soluble microbial products (SMP) as a

component of effluent organic matter (EfOM). Water research, v. 41, n. 12, p. 2787–93, jun.

2007.

JEHMLICH, N. et al. Phylogenetic and proteomic analysis of an anaerobic toluene-degrading

community. Journal of Applied Microbiology, v. 109, n. 6, p. 1937–45, dez. 2010.

JI, L.; ZHOU, J. Influence of aeration on microbial polymers and membrane fouling in

submerged membrane bioreactors. Journal of Membrane Science, v. 276, n. 1-2, p. 168–

177, 1 maio 2006.

KARPIEVITCH, Y. V et al. Liquid Chromatography Mass Spectrometry-Based Proteomics:

Biological and Technological Aspects. The Annals of Applied Statistics, v. 4, n. 4, p. 1797–

1823, jan. 2010.

KELLER, M.; HETTICH, R. Environmental proteomics: a paradigm shift in characterizing

microbial activities at the molecular level. Microbiology and Molecular Biology Reviews, v.

73, n. 1, p. 62–70, mar. 2009.

79

KHALSA-MOYERS, G.; MCDONALD, W. H. Developments in mass spectrometry for the

analysis of complex protein mixtures. Briefings in functional genomics & proteomics, v. 5,

n. 2, p. 98–111, jun. 2006.

KHANAL, S. K. Anaerobic Biotechnology for Bioenergy Production Principles and

Applications. [s.l: s.n.].

KORNBOONRAKSA, T.; LEE, S. H. Factors affecting the performance of membrane

bioreactor for piggery wastewater treatment. Bioresource technology, v. 100, n. 12, p. 2926–

32, jun. 2009.

KRAKAT, N. et al. The microcosm of a biogas fermenter: Comparison of moderate

hyperthermophilic (60°C) with thermophilic (55°C) conditions. Engineering in Life

Sciences, v. 10, n. 6, p. 520–527, 6 dez. 2010.

KUO, W.-C.; PARKIN, G. F. Characterization of Soluble Microbial Products from Anaerobic

Treatment by Molecular Weight Distribution and Nickel-Chelating Properties. Water

Research, v. 30, n. 4, p. 915–922, 1996.

LACERDA, C. M. R.; CHOE, L. H.; REARDON, K. F. Metaproteomic Analysis of a

Bacterial Community Response to Cadmium Exposure. Journal of Proteome Research, v. 6,

n. 1, p. 1145–1152, 2007.

LACERDA, C. M. R.; REARDON, K. F. Environmental proteomics: applications of

proteome profiling in environmental microbiology and biotechnology. Briefings in

functional genomics & proteomics, v. 8, n. 1, p. 75–87, jan. 2009.

LANGSTRAAT, J.; BOHSE, M.; CLEGG, S. Type 3 Fimbrial Shaft (MrkA) of Klebsiella

pneumoniae, but Not the Fimbrial Adhesin (MrkD), Facilitates Biofilm Formation. Infection

and Immunity, v. 69, n. 9, p. 5805–5812, 2001.

LASPIDOU, C. S.; RITTMANN, B. E. A unified theory for extracellular polymeric

substances, soluble microbial products, and active and inert biomass. Water research, v. 36,

n. 11, p. 2711–20, jun. 2002.

LEONARD, C. J.; ARAVIND, L.; KOONIN, E. V. Novel Families of Putative Protein

Kinases in Bacteria and Archaea: Evolution of the “Eucaryotic” Protein Kinase Superfamily.

Genome Research, v. 8, p. 1038–1047, 1998.

LI, X. Y.; YANG, S. F. Influence of loosely bound extracellular polymeric substances (EPS)

on the flocculation, sedimentation and dewaterability of activated sludge. Water research, v.

41, n. 5, p. 1022–30, mar. 2007.

LIANG, S.; LIU, C.; SONG, L. Soluble microbial products in membrane bioreactor

operation: Behaviors, characteristics, and fouling potential. Water research, v. 41, n. 1, p.

95–101, jan. 2007.

LIU, H.; FANG, H. H. P. Extraction of extracellular polymeric substances (EPS) of sludges.

Journal of Biotechnology, v. 95, n. 3, p. 249–56, 23 maio 2002.

79

LIU, Y. et al. The ratio of food-to-microorganism (F/M) on membrane fouling of anaerobic

membrane bioreactors treating low-strength wastewater. Desalination, v. 297, p. 97–103, jul.

2012.

LOWRY, O. H. et al. Protein Measurement with the Folin Phenol Reagent. The Journal of

Biological Chemistry, v. 193, p. 265–275, 1951.

MAGBANUA, B. S.; BOWERS, A. R. Characterization of soluble microbial products (SMP)

derived from glucose and phenol in dual substrate activated sludge bioreactors.

Biotechnology and Bioengineering, v. 93, n. 5, p. 862–70, 5 abr. 2006.

MALAMIS, S.; ANDREADAKIS, A. Fractionation of proteins and carbohydrates of

extracellular polymeric substances in a membrane bioreactor system. Bioresource

technology, v. 100, n. 13, p. 3350–7, jul. 2009.

MANN, M.; HENDRICKSON, R. C.; PANDEY, A. Analysis of proteins and proteomes by

mass spectrometry. Annual Review of Biochemistry, v. 70, p. 437–73, jan. 2001.

MARON, P.-A. et al. Metaproteomics: a new approach for studying functional microbial

ecology. Microbial Ecology, v. 53, n. 3, p. 486–93, abr. 2007.

MCCARTY, P. L.; BAE, J. Model to couple anaerobic process kinetics with biological

growth equilibrium thermodynamics. Environmental science & technology, v. 45, n. 16, p.

6838–44, 15 ago. 2011.

MENG, F. et al. Recent advances in membrane bioreactors (MBRs): membrane fouling and

membrane material. Water research, v. 43, n. 6, p. 1489–512, abr. 2009.

MENNITI, A. et al. Influence of shear on the production of extracellular polymeric

substances in membrane bioreactors. Water research, v. 43, n. 17, p. 4305–15, set. 2009.

MESQUITA, P. L. et al. Soluble Microbial Product (SMP) Characterization in Bench-Scale

Aerobic and Anaerobic CSTRs under Different Operational Conditions. Brazilian Journal of

Chemical Engineering, v. 27, n. 01, p. 101–111, 2010.

MORRIS, R. M. et al. Comparative metaproteomics reveals ocean-scale shifts in microbial

nutrient utilization and energy transduction. The ISME journal, v. 4, n. 5, p. 673–85, maio

2010.

MURTHY, S. N.; NOVAK, J. T.; HAAS, R. D. Monitoring Cations to Predict and Improve

Activated Sludge Settling and Dewatering Properties of Industrial Wastewaters. Water

Science and Technology, v. 38, n. 3, p. 119–126, 1998.

NAMKUNG, E.; RITTMAN, B. E. Effects of SMP on Biofilm-Reactor Performance.

Journal of Environmental Engineering, v. 114, n. 1, p. 199–210, 1988.

NG, A. N. L.; KIM, A. S. A mini-review of modeling studies on membrane bioreactor (MBR)

treatment for municipal wastewaters. Desalination, v. 212, n. 1-3, p. 261–281, jun. 2007.

79

NI, B.-J. et al. Fractionating soluble microbial products in the activated sludge process.

Water research, v. 44, n. 7, p. 2292–302, abr. 2010.

NI, B.-J.; RITTMANN, B. E.; YU, H.-Q. Soluble microbial products and their implications in

mixed culture biotechnology. Trends in biotechnology, v. 29, n. 9, p. 454–63, set. 2011.

NIELSEN, P. H.; JAHN, A. Extraction of EPS. In: WINGENDER, J. (Ed.). Microbial

Extracellular Polymeric Substances. Berlin: Springer-Verlag, 1999.

NIELSEN, P. H.; KEIDING, K. Disintegration of activated sludge flocs in presence of

sulfide. Water Research, v. 32, n. 2, p. 313–320, fev. 1998.

NOGUERA, D. R.; ARAKI, N.; RITTMANN, B. E. Soluble microbial products (SMP) in

anaerobic chemostats. Biotechnology and bioengineering, v. 44, n. 9, p. 1040–7, 5 nov.

1994.

Ó´FÁGÁIN, C. Storage and Lyophilisation of Pure Proteins. In: WALLS, D.; LOUGHRAN,

S. T. (Eds.). Protein CHromatography: Methods and Protocols. [s.l.] Springer, 2011. v.

681p. 179–202.

PARK, C. et al. Evaluation of the extracellular proteins in full-scale activated sludges. Water

research, v. 42, n. 14, p. 3879–89, ago. 2008.

PARK, C.; HELM, R. F. Application of metaproteomic analysis for studying extracellular

polymeric substances (EPS) in activated sludge flocs and their fate in sludge digestion. Water

Science and Technology, v. 57, n. 12, p. 2009–15, jan. 2008.

PARK, C.; NOVAK, J. T. Characterization of activated sludge exocellular polymers using

several cation-associated extraction methods. Water research, v. 41, n. 8, p. 1679–88, abr.

2007.

PARKIN, G. P.; MCCARTY, P. L. A Comparison of the Characteristics of Soluble Organic

Nitrogen in Untreated and Activated Sludge Treated Wastewaters. Water Research, v. 15, p.

139–149, 1981.

PETROSINO, J. F. et al. Metagenomic pyrosequencing and microbial identification. Clinical

Chemistry, v. 55, n. 5, p. 856–66, maio 2009.

PETROV, K.; PETROVA, P. High production of 2,3-butanediol from glycerol by Klebsiella

pneumoniae G31. Applied microbiology and biotechnology, v. 84, n. 4, p. 659–65, set.

2009.

PEURAVUORI, J.; PIHLAJA, K. Molecular size distribution and spectroscopic properties of

aquatic humic substances. Analytica Chimica Acta, v. 337, n. 2, p. 133–149, jan. 1997.

RABILLOUD, T. et al. Power and Limitations of Electrophoretic Separations in Proteomics

Strategies. Mass Spectrometry Reviews, v. 28, p. 816–843, 2009.

79

RAMESH, A; LEE, D. J.; LAI, J. Y. Membrane biofouling by extracellular polymeric

substances or soluble microbial products from membrane bioreactor sludge. Applied

microbiology and biotechnology, v. 74, n. 3, p. 699–707, mar. 2007.

RAMESH, A; LEE, D.-J.; HONG, S. G. Soluble microbial products (SMP) and soluble

extracellular polymeric substances (EPS) from wastewater sludge. Applied microbiology

and biotechnology, v. 73, n. 1, p. 219–25, nov. 2006.

RAPPSILBER, J.; MANN, M. What does it mean to identify a protein in proteomics? Trends

in Biochemical Sciences, v. 27, n. 2, p. 74–8, fev. 2002.

REUNGSANG, A.; SITTIJUNDA, S.; ANGELIDAKI, I. Simultaneous production of

hydrogen and ethanol from waste glycerol by Enterobacter aerogenes KKU-S1. International

Journal of Hydrogen Energy, v. 38, n. 4, p. 1813–1825, fev. 2013.

RODRÍ•GUEZ-VALERA, F. Environmental genomics, the big picture? FEMS

Microbiology Letters, v. 231, n. 2, p. 153–158, fev. 2004.

SCHLOSS, P. D.; HANDELSMAN, J. Biotechnological prospects from metagenomics.

Current Opinion in Biotechnology, v. 14, n. 3, p. 303–310, jun. 2003.

SCHNEIDER, T.; RIEDEL, K. Environmental proteomics: analysis of structure and function

of microbial communities. Proteomics, v. 10, n. 4, p. 785–98, fev. 2010.

SCHULZE, W. X. et al. A proteomic fingerprint of dissolved organic carbon and of soil

particles. Oecologia, v. 142, n. 3, p. 335–43, jan. 2005.

SCHURTZ, T. A et al. The type 3 fimbrial adhesin gene (mrkD) of Klebsiella species is not

conserved among all fimbriate strains. Infection and Immunity, v. 62, n. 10, p. 4186–91,

out. 1994.

SHENG, G.; YU, H.; LI, X. Stability of Sludge Flocs Under Shear Conditions : Roles of

Extracellular Polymeric Substances (EPS). Biotechnology and Bioengineering, v. 93, n. 6, p.

2–9, 2006.

SHENG, G.-P.; YU, H.-Q.; LI, X.-Y. Extracellular polymeric substances (EPS) of microbial

aggregates in biological wastewater treatment systems: a review. Biotechnology advances, v.

28, n. 6, p. 882–94, 2010.

SIGGINS, A.; GUNNIGLE, E.; ABRAM, F. Exploring mixed microbial community

functioning: recent advances in metaproteomics. FEMS Microbiology Ecology, v. 80, n. 2,

p. 265–80, maio 2012.

SINGH, R. P.; KUMAR, S.; OJHA, C. S. P. Biochemical Engineering A critique on

operational strategies for start-up of UASB reactors " effects of sludge loading rate and seed /

biomass concentration. v. 1, p. 107–119, 1998.

SLEYTR, U. B.; BEVERIDGE, T. J. Bacterial S-layers. Trends in Microbiology, v. 7, n. 6,

p. 253–60, jun. 1999.

79

SPEECE, R. E. Anaerobic biotechnology for industrial wastewater treatment. Environmental

science & technology, v. 17, n. 9, p. 416A–27A, 1 set. 1983.

STAHLHUT, S. G.; STRUVE, C.; KROGFELT, K. A. Klebsiella pneumoniae type 3

fimbriae agglutinate yeast in a mannose-resistant manner. Journal of Medical Microbiology,

v. 61, p. 317–22, mar. 2012.

STEEN, H.; MANN, M. The ABC’s (and XYZ's) of peptide sequencing. Nature Reviews.

Molecular cell biology, v. 5, n. 9, p. 699–711, set. 2004.

TAM, R.; SAIER, M. H. Structural, functional, and evolutionary relationships among

extracellular solute-binding receptors of bacteria. Microbiological reviews, v. 57, n. 2, p.

320–46, jun. 1993.

TEZEL, U.; TANDUKAR, M.; PAVLOSTATHIS, S. G. Anaerobic Biotreatment of

Municipal Sewage Sludge. In: Comprehensive Biotechnology. Second Edi ed. [s.l.] Elsevier

B.V., 2011. v. 1p. 447–461.

TIAN, Y.; CHEN, L.; JIANG, T. Characterization and modeling of the soluble microbial

products in membrane bioreactor. Separation and Purification Technology, v. 76, n. 3, p.

316–324, jan. 2011.

TIAN, Y.; SU, X. Relation between the stability of activated sludge flocs and membrane

fouling in MBR: under different SRTs. Bioresource technology, v. 118, p. 477–82, ago.

2012.

TOMANEK, L. Environmental Proteomics: Changes in the Proteome of Marine Organisms in

Response to Environmental Stress, Pollutants, Infection, Symbiosis, and Development.

Annual Review of Marine Science, v. 3, n. 1, p. 373–399, 15 jan. 2011.

TORRES, A. G. et al. Outer Membrane Protein A of Escherichia coli O157:H7 Stimulates

Dendritic Cell Activation. Infection and Immunity, v. 74, n. 5, p. 2676–2685, 2006.

TRUSSELL, R. S. et al. The effect of organic loading on process performance and membrane

fouling in a submerged membrane bioreactor treating municipal wastewater. Water research,

v. 40, n. 14, p. 2675–83, ago. 2006.

WANG, D.-Z. et al. Metaproteomic characterization of dissolved organic matter in the water

column of the South China Sea. Limnology and Oceanography, v. 56, n. 5, p. 1641–1652,

2011.

WANG, Z.-P.; ZHANG, T. Characterization of soluble microbial products (SMP) under

stressful conditions. Water research, v. 44, n. 18, p. 5499–509, out. 2010.

WEI, Y. et al. Influence of soluble microbial products (SMP) on wastewater disinfection

byproducts: trihalomethanes and haloacetic acid species from the chlorination of SMP.

Environmental Science and Pollution Research International, v. 18, n. 1, p. 46–50, jan.

2011.

79

WIESMANN, U.; CHOI, I. S.; DOMBROWSKI, E.-M. Fundamentals of Biological

Wastewater Treatment. [s.l: s.n.].

WILKINS, M. R. et al. Two-dimensional gel electrophoresis for proteome projects: the

effects of protein hydrophobicity and copy number. Electrophoresis, v. 19, n. 8-9, p. 1501–5,

jun. 1998.

WILMES, P. et al. Community proteogenomics highlights microbial strain-variant protein

expression within activated sludge performing enhanced biological phosphorus removal. The

ISME journal, v. 2, n. 8, p. 853–64, ago. 2008.

WILMES, P.; BOND, P. L. The application of two-dimensional polyacrylamide gel

electrophoresis and downstream analyses to a mixed community of prokaryotic

microorganisms. Environmental Microbiology, v. 6, n. 9, p. 911–20, set. 2004.

WILMES, P.; WEXLER, M.; BOND, P. L. Metaproteomics provides functional insight into

activated sludge wastewater treatment. PLoS One, v. 3, n. 3, p. e1778, jan. 2008.

WINGENDER, J.; NEU, T. R. What are Bacterial Extracellular Polymeric Substances ? In:

WINGENDER, J. (Ed.). Microbial Extracellular Polymeric Substances. Berlin: Springer-

Verlag, 1999.

WU, B.; ZHOU, W. Investigation of soluble microbial products in anaerobic wastewater

treatment effluents. Journal of Chemical Technology & Biotechnology, v. 85, n. 12, p.

1597–1603, 9 dez. 2010.

WU, J.; XI, C. Evaluation of different methods for extracting extracellular DNA from the

biofilm matrix. Applied and environmental microbiology, v. 75, n. 16, p. 5390–5, ago.

2009.

YAZDANI, S. S.; GONZALEZ, R. Anaerobic fermentation of glycerol: a path to economic

viability for the biofuels industry. Current opinion in biotechnology, v. 18, n. 3, p. 213–9,

jun. 2007.

YUTIN, N. et al. Phylogenomics of Prokaryotic Ribosomal Proteins. PLoS One, v. 7, n. 5, p.

e36972, 2012.

ZHANG, X.; BISHOP, P. L.; KINKLE, B. K. Comparison of Extraction Methods for

Quantifying Extracellular Polymers in Biofilms. Water Science and Technology, v. 39, n. 7,

p. 211–218, 1999.

ZHOU, Z. et al. Microbial transformation of biomacromolecules in a membrane bioreactor:

implications for membrane fouling investigation. PLoS One, v. 7, n. 8, p. e42270, jan. 2012.

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