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Gustavo Dix Junqueira Pinto

AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DO BIOMARCADOR PD-L1 EM TECIDO TUMORAL DE PACIENTES PORTADORES DE CARCINOMA DE PULMÃO E CORRELAÇÃO COM DADOS

CLÍNICOS E DEMOGRÁFICOS

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação da Fundação PIO XII – Hospital de Câncer de Barretos para obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde. Área de Concentração: Oncologia Orientador: Prof. Dr. Sérgio Vicente Serrano Co-orientador: Prof. Dr. Luciano de Souza Viana

Barretos, SP 2016

FICHA CATALOGRÁFICA Preparada por Martins Fideles dos Santos Neto CRB 8/9570

Biblioteca da Fundação Pio XII – Hospital de Câncer de Barretos

P659a Pinto, Gustavo Dix Junqueira. Avaliação da expressão do biomarcador PDL1 em tecido tumoral de

pacientes portadores de carcinoma de pulmão e correlação com dados clínicos e demográficos. / Gustavo Dix Junqueira Pinto. - Barretos, SP 2015.

78 f. : il. Orientador: Dr. Sérgio Vicente Serrano Co-Orientador: Dr. Luciano de Souza Viana Dissertação (Mestrado em Ciências da Saúde) – Fundação Pio XII –

Hospital de Câncer de Barretos, 2015. 1. Carcinoma Pulmonar. 2. PD-L1. 3. Microambiente tumoral. 4. Pontos

de checagem imunológico. 5. Biomarcadores. 6. Imuno-histoquímica . I. Autor. II. Serrano, Sérgio Vicente. III. Vianna, Luciano de Souza. IV. Título.

CDD 616.994

“

“Esta dissertação foi elaborada e está apresentada de acordo com as normas da Pós-

Graduação do Hospital de Câncer de Barretos – Fundação Pio XII, baseando-se no Regimento

do Programa de Pós-Graduação em Oncologia e no Manual de Apresentação de Dissertações

e teses do Hospital de Câncer de Barretos. Os pesquisadores declaram ainda que este

trabalho foi realizado em concordância com o Código de Boas Práticas Científicas (FAPESP),

não havendo nada em seu conteúdo que possa ser considerado como plágio, fabricação ou

falsificação de dados. As opiniões, hipóteses e conclusões ou recomendações expressas

neste material são de responsabilidade dos autores e não necessariamente refletem a visão

da Fundação Pio XII – Hospital de Câncer de Barretos.

Embora o Núcleo de apoio ao pesquisador do Hospital de Câncer de Barretos tenha

realizado as análises estatísticas e orientado sua interpretação, a descrição da metodologia

estatística, a apresentação dos resultados e suas conclusões são de inteira responsabilidade

dos pesquisadores envolvidos”

Agradecimentos

Orientadores Sérgio Vicente Serrano e Luciano de Souza Viana, pelas informações valiosas Registro Médico Allini Mafra Biblioteca Martins Fideles dos Santos Neto Mirlene Girio Marques SAME (Serviço de Arquivo Médico e Estatística) Dante Ribeiro da Silva Guilherme Aleixo dos Santos Kleber Henrique Carvalho Pires Leonardo de Almeida Lima Robson dos Santos Fermiano Anatomia Patológica Fabiana Aparecida Oliveira Buzon Guilherme Gomes Ribeiro Letícia do Nascimento Braga Pereira Patrícia Cristina Silva Marconi Telemedicina Luige Cesar Salvi NEB (Núcleo de Epidemiologia e Bioestatística)/NAP (Núcleo de Apoio ao Pesquisador) Cleyton Zanardo de Oliveira Jamile Carolina Zaneti Marco Antônio de Oliveira Marcos Alves de Lima Tamira Cláudia de Souza Thais Talarico Hosokawa Secretaria da pós-graduação do Hospital de Câncer de Barretos Brenda Honda Morais Silvana Rodrigues Guitarrari Simone Neves Nogueira CEP (Comitê de ética e pesquisa) Bruna Aline Roque Alves Daniela Ribeiro Girardi Talitha Jacqueline Marsola EPIT Daniela Donadon CEPOM Renato José da Silva Oliveira

Dedicatória

Dedico este trabalho aos meus pais, Abílio e Maria da Graça, que estão sempre ao meu lado;

à minha família e aos meus amigos, fontes de amor incondicional e eterno;

aos meus colegas de trabalho Pedro e Josiane que souberam me compreender e apoiar;

e aos meus pacientes, que enfrentam suas enfermidades com força e resignação.

“e parecia-lhe que entrava enfim numa existência superiormente interessante, onde

cada hora tinha o seu encanto diferente, cada passo condizia a um êxtase, e a alma se

cobria de um luxo radioso de sensações!”

Eça de Queirós

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO 1

1.1 Sinapse imunológica 4

1.2 “Checkpoints” imunes 6

1.3 Imunoterapia e mecanismos inibitórios de "checkpoint” 7

1.4 Expressão de PD-L1 e tipos de microambiente tumoral 10

2 OBJETIVOS 14

2.1 Objetivo geral 14

2.2 Objetivos específicos 14

3 MATERIAIS E MÉTODOS 15

3.1 Considerações éticas 15

3.2 Pacientes 15

3.2. 1 Critérios de inclusão 16

3.2.2 Critérios de exclusão 16

3.3 Variáveis analisadas 16

3.4 Construção dos blocos de TMA e lâminas 16

3.5 Técnica de imuno-histoquímica 17

3.5.1 Anticorpo primário 18

3.5.2 Análise da imuno-coloração 18

3.6 Análise mutacional dos genes EGFR e KRAS 19

3.7 Pesquisa do rearranjo do gene ALK 19

3.8 Análise estatística 20

4 RESULTADOS 22

4.1 Dados clínico-demográficos e moleculares 22

4.1.1 Dados demográficos 22

4.1.2 Dados Clínicos 22

4.1.3 Dados Moleculares 24

4.1.4 Correlação das informações clínico-demográficas e biomarcadores com sobrevida global 25

4.2 Expressão de PD-L1 28

4.2.1 Análise individual da expressão de PD-L1 em corte histológico convencional 29

4.2.2 Análise coletiva da expressão de PD-L1 em TMA ("Tissue microarray"). 32

4.3 Análise de concordância da expressão imuno-histoquímica de PD-L1 em análise individual versus análise coletiva (TMA) 33

4.4 Correlação da expressão de PD-L1 com outros biomarcadores (mutações nos genes KRAS, EGFR e rearranjo do gene ALK) - análise univariada 34

4.5 Correlação da expressão de PD-L1 com dados clínico-demográficos. (análise univariada) 35

4.5.1 Expressão de PD-L1 e dados demográficos 35

4.5.2 Expressão de PD-L1 e dados clínicos 37

4.5.3 Correlação da expressão de PD-L1 com dados clínico-demográficos - análise multivariada 38

4.6 Análise das curvas de sobrevida conforme a expressão de PD-L1 39

5 DISCUSSÃO 42

5.1 Achados clínico-demográficos e moleculares 42

5.2 Achados quanto a expressão de PD-L1 42

5.3 Análise de concordância entre a análise individual e a análise coletiva (TMA) da expressão imuno-histoquímica do marcador PD-L1 em tecido tumoral 44

5.4 Correlação da expressão de PD-L1 com outros biomarcadores (mutações nos genes KRAS, EGFR e rearranjo do gene ALK). 45

5.5 Correlação da expressão de PD-L1 com dados clínico-demográficos 45

5.6 Análise das curvas de sobrevida conforme a expressão de PD-L1 46

6 CONCLUSÃO 47

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 48

ANEXOS 55

Anexo A. Ficha de coleta 55

Anexo B. Carta de aprovação do CEP 61

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Formação da sinapse imunológica (Fonte: Piragyte et al, 2012) 5

Figura 2 - Checkpoints imunológicos: sinais estimulatórios (verde) e inibitórios (vermelho) (Fonte: Pardoll et al. 2012) 6

Figura 3 - Células constituintes do microambiente tumoral (Fonte: Sid P. Kerkar, Nicholas P. Restifo, 2012) 12

Figura 4 - Tipos de microambiente tumoral (Teng et al. 2015) 13

Figura 5 - Foto-micrografias das expressões imuno-histoquímicas do marcador PD-L1 na células tumoral no câncer de pulmão de células não pequenas (400x). A, Ausência de expressão do marcador PD-L1; B. Marcador PD-L1 negativo (<5% das células coradas); C. Marcador PD-L1

positivo (5% das células coradas); D. Controle positivo 30

Figura 6 - Foto-micrografias das expressões imuno-histoquímicas do marcador PD-L1 nas células apresentadoras de antígenos (APC) no câncer de pulmão de células não pequenas (400x). A. Ausência de expressão do marcador PD-L1; B. Marcador PD-L1 negativo (<5% das células

coradas); C. Marcador PD-L1 positivo (5% das células coradas); D. Controle positivo 31

Figura 7 - Sobrevida Global Geral 40

Figura 8 - Sobrevida Global Conforme Expressão de PD-L1 em Célula Tumoral 41

Figura 9 - Sobrevida Global Conforme Expressão de PD-L1 em Célula Apresentadora de Antígeno 41

LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Critérios de concordância definidos por Landis & Koch (1977) para interpretação do índice de Kappa 20

Tabela 2 - Dados demográficos 22

Tabela 3 - Dados clínicos 23

Tabela 4 – Biomarcadores 25

Tabela 5 - Estimativa do risco relativo de óbito pela regressão de Cox simplificada 26

Tabela 6 - Regressão de Cox 28

Tabela 7 - Expressão de PD-L1 em corte histológico convencional (análise individual) 29

Tabela 8 - Expressão de PD-L1 em TMA (análise coletiva) 32

Tabela 9 - Análise da concordância da expressão imuno-histoquímica do marcador PD-L1 conforme tipo celular considerando as técnicas de análise individual e coletiva (TMA) 33

Tabela 10 - Expressão de PD-L1 em células tumorais e biomarcadores 34

Tabela 11 - Expressão de PD-L1 em Células Apresentadoras de Antígenos e biomarcadores 34

Tabela 12 - Expressão de PD-L1 em células tumorais e dados demográficos 35

Tabela 13 - Expressão de PD-L1 em células apresentadoras de antígenos e dados demográficos 36

Tabela 14 - Expressão de PD-L1 em células tumorais e dados clínicos 37

Tabela 15 - Expressão de PD-L1 em células apresentadoras de antígenos e dados clínicos 38

Tabela 16 - Análise multivariada: expressão de PD-L1 em células tumorais 39

Tabela 17 - Análise multivariada: expressão de PD-L1 em células apresentadoras de antígenos 39

Tabela 18 - Agrupamento TNM versus história oncológica pregressa (HOP) 42

Tabela 19 - Imunohistoquímica para PD-L1 em estudos Clínicos 43

LISTA DE ABREVIATURAS

APC Células Apresentadora de Antígeno CCR Carcinoma de Células Renais CEP Comitê de Ética em Pesquisa CRC Câncer colorretal

CRPC Neoplasias de próstata resistentes à castração (Prostatic Neoplasms, castration-Resistant)

CTLA-4 Antígeno CTLA-4 (Cytotoxic T lymphocyte antigen 4) DNA Ácido Desoxirribonucleico

EGFR Receptor do fator de crescimento epiodérmico(Epidermal growth ator receptor EML4/ALK Echinoderm microtubule-associated protein-like 4 / anaplastic lymphoma kinase FISH Hibridização In Situ Fluorescente (Fluorescence in situ hybridization) INCA Instituto Nacional do Câncer KRAS Kirsten murine sarcoma vírus MHC Complexo Principal de Histocompatibilidade (Major histocompatibility complex) MM Melanoma Maligno CPCNP Carcinoma Pulmonar de Células não Pequenas (Non small cell lung câncer) NSCLC Carcinoma Pulmonar de Células Não Pequenas(Non small cell lung cancer) PCR Reação em Cadeia da Pilimerase (Polymerase chain reaction) PD-1 Receptor de Morte Celular Programada 1 (Programmed Cell Death 1 Receptor ) PD-L1 (Programmed death-ligand 1)

PD-L2 Programmed death-ligand 2) RCC Câncer Renal TCR Receptor de célula T (T cell receptor) TMA Análise Serial de tecidos (Tissue Microarray Assay)

RESUMO

Pinto GDJ. Avaliação da expressão do biomarcador PD-L1 em tecido tumoral de pacientes

portadores de carcinoma de pulmão e correlação com dados clínicos e demográficos.

Dissertação (Mestrado). Barretos: Hospital de Câncer de Barretos; 2015.

JUSTIFICATIVA: O câncer de pulmão é mundialmente a principal causa de morte relacionada

a câncer em ambos os gêneros e o tabagismo é o seu principal fator etiológico. A descoberta

dos checkpoints imunológicos corroboram com a hipótese de que ligantes presentes no

tumor modulam os mecanismos de carcinogênese e a atividade imunológica do

microambiente tumoral. Entre as moléculas corregulatórias mais estudadas destacam-se a

PD-1 (programmed cell death 1), e seu ligante PD-L1 (programmed cell death ligand 1). O

presente estudo busca aumentar o entendimento do microambiente tumoral de doentes

operados com câncer de pulmão através da análise da expressão do marcador PD-L1 nas

células tumorais e nas células apresentadoras de antígenos (APC). OBJETIVO: Avaliar a

expressão de PD-L1 em tecido tumoral de pacientes portadores de carcinoma pulmonar de

células não pequenas (CPCNP) e correlacionar as expressões com os dados clínicos e

demográficos. MATERIAIS E MÉTODOS: Foram selecionados 177 doentes com CPCNP

submetidos a ressecção cirúrgica da lesão primária no Hospital de Câncer de Barretos entre

2003 e 2014. A expressão de PD-L1 foi realizada por imuno-histoquímica tanto por análise

individual quanto por análise coletiva ou TMA (tissue microarray). Os tumores foram

classificados como PD-L1 positivo em células tumorais (≥5% de células coradas) ou PD-L1

negativo em células tumorais (<5% de células coradas) assim como as APC presentes no

microambiente tumoral (APC PD-L1 positivo se ≥5% de células coradas e APC PD-L1 negativo

se <5% de células coradas). RESULTADOS: Em cortes histológicos convencionais, houve

maior expressão de PD-L1 em células tumorais (37,9%) que em APC (24,3%). O mesmo

ocorreu no TMA (análise coletiva) com expressão de 32,8 % em células tumorais e 19,8% em

APC. Não foi possível estabelecer correlação entre expressão de PD-L1 e outros

biomarcadores conhecidos em função do número reduzido de pacientes avaliados. As

técnicas de análise coletiva (TMA) e análise individual apresentaram fraca concordância

durante a avaliação da imunoexpressão de PD-L1 tanto na célula tumoral (Kappa = 0,307 e p

< 0,001) quanto nas APC (Kappa = 0,328 e p < 0,001). Doentes com história passada de

tabagismo (passado versus ausência) e presença de história oncológica pregressa (presença

versus ausência) apresentaram maior chance de expressão de PD-L1 em células tumorais

(OR = 3,356 e p = 0,008; OR = 2,01 e p = 0,042, respectivamente). Doentes com história

passada de tabagismo (passado versus ausência) apresentaram menor chance de expressão

de PD-L1 em APC (OR = 0,383; p = 0,029). Doentes com expressão tumoral positiva de PD-L1

(células tumoral e APC) apresentaram mediana de sobrevida global semelhante aos doentes

cujos tumores não expressaram PD-L1 (p = 0,253 e p = 0,795; respectivamente para tumor e

APC). CONCLUSÃO: Houve maior frequência de expressão de PD-L1 em células tumorais que

em APC. Não foi possível estabelecer correlação entre expressão de PD-L1 e biomarcadores

por limitações no número de doentes da amostra. Não houve reprodutibilidade entre as

técnicas de análise coletiva (TMA) e análise individual para avaliação da expressão de PD-L1

em células tumorais e APC. Doentes com história passada de tabagismo e história oncológica

pregressa apresentaram maior chance de expressão de PD-L1 em células tumorais em

relação aos que nunca fumaram e aos que não apresentavam história oncológica pregressa.

Doentes com história passada de tabagismo apresentaram menor chance de expressão de

PD-L1 em células apresentadoras de antígeno em relação aos que nunca fumaram. A

expressão imuno-histoquímica de PD-L1 nas células tumorais e APC não se relacionou com a

curva de sobrevida.

PALAVRAS-CHAVE: 1. Carcinoma pulmonar; 2.PD-L1; 3.microambiente tumoral; 4.pontos de

checagem imunológico; 5. biomarcadores; 6.imunohistoquímica.

ABSTRACT

Pinto GDJ . Evaluation of PD -L1 Biomarker expression in tumor tissue of patients with lung

carcinoma and correlation with clinical and demographic data . Dissertation (Master`s

Degree) . Barretos : Barretos Cancer Hospital ; 2016 .

BACKGROUND: Lung cancer is the leading world cause of death regarding cancers, in both

sexes, and smoking is the main etiological factor. The discovery of immune check-points

corroborates the hypothesis that ligands present in the tumors modulate the mechanisms of

carcinogenesis and the immune activity of the tumor microenvironment. Among the most

studied co-regulatory molecules, PD-1 (programmed cell death 1), and its ligand PD-L1

(programmed cell death 1 ligand 1) are noteworthy. The present study aims to enhance the

understanding of the tumor microenvironment of lung cancer patients who underwent

surgery, by means of analysis of PD-L1 expression in tumor cells and antigen presenting cells

(APC). AIM: To evaluate PD-L1 expression in tumor tissue of non small cell lung cancer

patients and correlate it with clinical and demographic data. MATERIALS AND METHODS: A

hundred and seventy seven patients who had underwent surgical resection of primary non-

small cell lung cancer at Barretos Cancer Hospital between 2003 and 2014 were enrolled.

The PD-L1 expression was carried out by means of immunohistochemistry, using

conventional histological slides (individual analyses) and TMA (tissue microarray) for

collective analyses. Tumors were classified as PD-L1 positive tumor cells (≥5% of dyed cells)

or PD-L1 negative tumor cells (<5% of dyed cells) as well as APC present in the tumor

microenvironment (APC PD-L1 positive if ≥5% of dyed cells and APC PD-L1 negative if <5% of

dyed cells). RESULTS: In conventional histological individual analysis, there was a greater

proportion of PD-L1 expression seen in tumor cells (37,9%) than in APC (24,3%). The same

occurred in the collective analysis by TMA with a 32,8% expression in tumor cells and a

19,8% expression in APC. It was not possible to establish a correlation between PD-L1

expression and biomarkers due to the small number of patients evaluated. The techniques

for collective analysis (TMA ) and individual analysis showed poor agreement for PD-L1

immunoexpression both in tumor cells (Kappa = 0,307 e p < 0,001) as in APC (Kappa = 0,328

e p < 0,001). In this study, patients with past history of smoking (past versus absence) and

presence of previous cancer history (presence versus absence) were more likely to express

PD-L1 in tumor cells (OR = 3,356 e p = 0,008; OR = 2,01 e p = 0,042). Patients with past

history of smoking (past versus absence) were less likely to express PD-L1 in APC (OR =

0,383; p = 0,029). No difference was observed in overall survival between patients with

positive tumor expression of PD-L1 (in tumor cell and APC) and negative expression of PD-L1.

(p = 0,253 e p = 0,795; respectively for tumor cells and APC). CONCLUSIONS: Tumor cells

presented higher expression of PD-L1 than APCs. It was not possible to establish a

correlation between PD-L1 expression and other known biomarkers due to the small number

of patients tested. Collective analysis by TMA for PD-L1 expression in tumor cells and APC

did not reproduce the findings for separate individual analysis of tumor tissues.. Patients

with past history of smoking and previous cancer history were more likely to express PD-L1

in tumor cells than those who never smoked and who had no previous cancer history.

Patients with past history of smoking were less likely to express PD-L1 in APC compared to

those who never smoked. The immunohistochemical expression of PD-L1 in tumor cells and

APC did not correlate with survival.

KEYWORDS : 1. Lung carcinoma; 2. PD-L1; 3. Tumor microenvironment; 4. Immune checkpoints; 5. Biomarkers; 6.Immunohistochemistry

1

1 INTRODUÇÃO

De acordo com o GLOBOCAN (projeto instituído pela Agência Internacional para

Pesquisa em Câncer – IARC/Organização mundial de Saúde), no ano de 2012, a incidência de

câncer de pulmão no mundo foi de 1.82 milhão de novos casos com 1.6 milhão de mortes no

mesmo ano (a principal causa de morte por câncer)1.

Nos Estados Unidos da América, estima-se para o ano de 2015, 115.610 novos casos

(14%) de câncer de pulmão em homens e 105.590 novos casos (13%) em mulheres. Espera-

se inclusive que seja a principal causa de morte por câncer tanto em homens (86.380 casos

ou 28%) quanto em mulheres (71.660 casos ou 26%)2.

No Brasil, segundo estimativas do INCA (Instituto Nacional do Câncer) para 2016, a

taxa de incidência para tumores de traquéia, brônquio e pulmão é de 17.330 novos casos

(8,1%) para homens e 10.890 casos (5,3%) para mulheres. O câncer de pulmão em homens é

o segundo mais frequente nas regiões Sul e Centro-Oeste. Nas regiões Sudeste, Nordeste e

Norte é o terceiro mais frequente. Para as mulheres é o terceiro mais frequente nas regiões

Sul. Nas regiões Sudeste, Centro-Oeste e Nordeste ocupa a quarta posição. Já na região

Norte é o quinto mais frequente3.

O câncer de pulmão de células não pequenas geralmente é diagnosticado em estádio

avançado. Além da presença de uma variedade histológica bastante complexa, os

mecanismos de carcinogênese são heterogêneo e doentes mesmo com estádio inicial

apresentam altos índices de mortalidade. Fatores etiológicos conhecidos como tabagismo,

predisposição genética e exposição ambiental justificam majoritariamente a incidência desta

malignidade.

O insucesso diante de ações terapêuticas padronizadas por anos, tais como

quimioterapia, radioterapia e cirurgia levou a comunidade científica a investigar

biomarcadores ou alterações genéticas envolvidas também na gênese tumoral sobretudo

em sítios pulmonares. Foram detectadas mutações em genes como EGFR (receptor do fator

de crescimento epidérmico), ALK-EML4 (echinoderm microtubule-associated protein-like

4/anaplastic lymphoma kinase) e KRAS (Kirsten rat sarcoma vírus), que propiciaram a

descoberta de “drogas alvo” específicas para algumas dessas alterações.

A mutação do gene EGFR promove ativação de vias como MAPK (mitogen-activated

protein kinase) e PI3K (Fosfatidilinositol 3-quinase), através da auto-fosforilação dos

2

receptores de tirosina quinase responsáveis por proliferação celular, invasão e metástases.

As principais drogas inibidoras desses receptores são o Erlotinibe e Gefitinibe4.

O rearranjo do gene ALK (anaplastic lymphoma Kinase) com o EML4 (echinoderm

microtubule-associated protein-like 4/anaplastic lymphoma kinase) promove a ativação das

vias PI3K, STAT3/5, RAS e PLCy responsáveis pela sobrevivência e proliferação da célula

tumoral. A principal droga nesse caso é o crizotinibe5.

As mutações do gene KRAS regulam o crescimento celular, diferenciação e apoptose

através da interação com múltiplas vias de ativação incluindo MAPK (mitogen-activated

protein kinase), STAT (transdutor do sinal de ativação de transcrição) e PI3K

(Fosfatidilinositol 3-quinase)6. Ainda não há uma droga alvo efetiva para esta mutação.

Todavia, mesmo após a descoberta e aprovação de “drogas-alvo”, um número elevado

de pacientes continuou a falhar aos tratamentos disponíveis. Nos últimos anos cresceu o

entendimento do papel do sistema imunológico na carcinogênese de vários tumores,

incluindo o câncer de pulmão. Publicação recente na revista “Cell” incluiu conceitos de

evasão tumoral e vigilância imunológica como mecanismos principais de carcinogênese7, 8.

A capacidade do sistema imunológico em reconhecer e eliminar células tumorais é

denominada vigilância imunológica. A evasão ou escape tumoral ocorre em 3 fases. Na

primeira, também chamada de fase de eliminação, as células tumorais em potencial são

identificadas e eliminadas. Na fase seguinte, ou de equilíbrio, ocorre o surgimento de

algumas células tumorais variantes mais resistentes, as quais não são eliminadas com

sucesso e então sofrem mutações adaptativas. O sistema imune acaba selecionando estas

células resistentes através de um processo denominado “imunoedição” até que se inicie a

fase final de escape. Nessa fase, as células tumorais acumularam mutações suficientes para

escapar da vigilância imunológica. O tumor passa a crescer até tornar-se clinicamente

detectável9, 10.

Durante a fase de equilíbrio, existem diversos mecanismos tumorais de evasão imune.

Alguns tumores podem perder a expressão de determinadas moléculas do complexo

principal de histocompatibilidade (MHC) de classe I em decorrência de mutações ou

instabilidade genética e então não podem ser removidos por linfócitos T9, 10.

Outros tumores podem escapar da vigilância imunológica por meio do recrutamento

de células T reguladoras cuja função é imunossupressora. Há ainda tumores que produzem

citocinas imunossupressoras como o TGF-beta (que provoca inibição de linfócitos T e induz o

3

desenvolvimento de células T reguladoras) e a interleucina 10 (que diminui o

desenvolvimento de células dendríticas e a ativação de células T)9, 10.

Outros mecanismos de escape imune são a criação, por alguns tumores, de barreiras

físicas com colágeno e fibrina, ou ainda através do mascaramento antigênico, através do

qual os antígenos de superfície celular tumoral são escondidos do sistema imunológico por

moléculas do glicocálice, como mucopolissacarídeos contendo ácido siálico9, 10.

Os primeiros estudos de imunologia relacionados ao câncer ocorreram no final do

século XIX, quando o cirurgião americano William Coley relatou a diminuição de um sarcoma

após a injeção de resíduos bacterianos em alguns sítios tumorais11. Muitos anos depois, em

1976, Morales e colaboradores realizaram o primeiro grande ensaio clínico com BCG (Bacilo

Calmette-Guérin) intravesical em pacientes com câncer de bexiga em fase inicial, no qual

reações imunoinflamatórias eram bem sucedidas no controle da doença12.

Em 1983 foi publicado estudo com aplicação de interleucina-2 endovenosa em

pacientes com melanoma com o intuito de estimular a ativação e proliferação de linfócitos

in vivo13.Dois anos mais tarde, em 1985, ocorreu um estudo com interferon alfa endovenoso

e intramuscular para melanoma, com evidente atividade antitumoral14.

O primeiro estudo com fator de necrose tumoral alfa recombinante (rTNF-alfa) em

combinação com interferon recombinante gama (rIFN) e melfalan em pacientes com

sarcoma e melanoma ocorreu em 1992, com resultados eficientes e mínima toxicidade15.

Dez anos mais tarde, 2002, foi publicado estudo de transferência de células T reativas em

melanoma, que revelou a regressão tumoral e destruição autoimune dos melanócitos16.

Em 2008 foi utilizado imiquimode (modificador tópico da resposta imune) para

neoplasias intraepiteliais vulvares com respostas parciais em 81% dos pacientes tratados17

até que em 2009 surgiu a primeira vacina contra as onco-proteínas do HPV-16 também com

resultados satisfatórios para essa enfermidade18.

Em 2010, imunoterapia celular autóloga com sipuleucel T proporcionou aumento de

sobrevida global entre homens com câncer de próstata metastático resistente à castração19.

No mesmo ano, uma nova droga chamada ipilimumabe foi aprovada para doentes com

melanoma metastático também com benefício de sobrevida global. Tratava-se de um

anticorpo específico ao antígeno CTLA-4 (Cytotoxic T lymphocyte antigen 4), um receptor

proteico presente na superfície das células T, cuja interação com a proteína CD80 presente

na célula tumoral ou na célula apresentadora de antígeno inibe a resposta imunológica20.

4

Consequentemente, os estudos passaram a se direcionar para outras estruturas com

repercussão imunológica semelhante, como por exemplo a chamada PD-1 (Programmed Cell

Death 1 Receptor), cuja interação com sua proteína ligante, a PD-L1; também acarreta uma

diminuição da resposta imune.

A suspeita de que a hiperexpressão ou aumento de função de PD-L1 pudesse ser um

mecanismo da evasão do sistema imune do hospedeiro pelas células tumorais passou a ser

aventada em diversos estudos. Em um deles, foram analisadas 196 amostras tumorais de

pacientes com RCC, e observou-se que os pacientes cujos tumores tinham alta expressão de

PD-L1 apresentaram risco 4,5 vezes maior de óbito e tinham doença com comportamento

mais agressivo21. Em outro estudo semelhante observou-se que pacientes com câncer de

ovário com expressão elevada de PD-L1 tiveram sobrevida significativamente menor do que

aqueles com baixa expressão22. Além disso, observou-se redução da contagem de linfócitos

T-CD8 (+), sugerindo um papel supressor de células T-CD8 (+) exercido por PD-L1.

Em 2015 foi aprovada uma medicação chamada nivolumabe para tumores avançados

de pulmão com aumento de sobrevida global. A medicação é um anticorpo humanizado IG4

com ação na proteína PD-1 (Programmed Cell Death 1 Receptor). Consolidava-se então uma

nova etapa na imunoterapia relacionada ao câncer, cujo desenvolvimento tornou-se possível

através do estudo da sinapse imunológica. É inicialmente a formação da sinapse imunológica

que acarreta a resposta imune.

1.1 Sinapse imunológica

Denomina-se sinapse imunológica ou agregado de ativação supramolecular (SMAC) a

região de contato físico entre a célula T e a célula apresentadora de antígeno (APC),

semelhante a um alvo. Na região central (c-SMAC) encontram-se o complexo TCR (receptor

da célula T), co-receptores CD4 ou CD8, receptores para co-estimuladores (como o CD28),

enzimas e outras proteínas. Na região periférica (p-SMAC) encontram-se moléculas de

sinalização nas membranas plasmáticas com conteúdo lipídico, chamadas de rafts lipídicos

ou microdomínios ricos em glicolipídeos. A sinalização entre o TCR e co-receptor estimulador

é iniciada neste locais, quando os rafts induzem mudanças no citoesqueleto, coalescem e

formam a sinapse. Externamente à p-SMAC encontra-se uma região distal ou D-SMAC, rica

em actina e proteína CD45, responsáveis por finalizar alterações no citoesqueleto da célula

T9, 10, 23.

5

A formação da sinapse imunológica é o gatilho para a sinalização mediada pelo

receptor da célula T (TCR) acarretando estabilização de adesão, controle de endocitose e

exocitose e liberação de grânulos ou citocinas 9, 10, 23. Em outras palavras, após a formação da

sinapse imunológica originam-se sinais estimulatórios ou inibitórios do sistema imune

decorrentes de moléculas co-estimulatórias, os chamados “checkpoints” imunológicos. (Figura

1)

Figura 1 - Formação da sinapse imunológica (Fonte: Piragyte et al, 2012)

6

1.2 “Checkpoints” imunes

A especificidade das células T em relação aos seus alvos é mediada pela interação de

receptores em sua superfície (TCR) com complexos MHC associados a peptídeos antigênicos

presentes na superfície de células apresentadoras de antígeno (APC) ou células tumorais.

Porém, a resposta ao sinal de apresentação dos antígenos é regulada por uma série de

receptores co-regulatórios (co-receptores) expressos na célula T que reconhecem ligantes

adicionais presentes na superfície das APC ou células tumorais24. Estes co-receptores podem

tanto induzir cascatas de sinalização intracelular positivas (estimulatórias) quanto negativas

(inibitórias), assim modulando a atividade da célula T relacionada à proliferação, secreção de

citocinas e lise celular. Estas moléculas do sistema imune que podem tanto estimular quanto

inibir sinais são conhecidas por “check points imunológicos”. (Figura 2)

Figura 2 - Checkpoints imunológicos: sinais

estimulatórios (verde) e inibitórios (vermelho) (Fonte:

Pardoll et al. 2012)25

7

Dentre as moléculas co-regulatórias da família B7-CD28, estudos recentes demonstram

que as células tumorais e as células apresentadoras de antígenos modificam o

microambiente tumoral através das atividades do receptor PD1 e seus ligantes (ex.: PD-L1)26,

27. PD-1 é uma proteína de membrana tipo I, de 268 aminoácidos e pertence à família de

moléculas reguladoras de células T, chamada CD28/B728, sendo codificada pelo gene

PDCD129. Possui um domínio extracelular IgV, seguido de uma região transmembrana e uma

cauda intracelular, a qual contém dois sítios de fosforilação30, 31. Esta proteína é expressa na

superfície de células T ativadas, células B e macrófagos, o que sugere que ela é capaz de

inibir a resposta imune celular de maneira mais ampla31.

A função de PD-1 ocorre primariamente em tecidos periféricos, onde as células T

podem entrar em contato com os seus ligantes imunossupressores PD-L1 (B7-H1) e PD-L2

(B7-DC), os quais estão expressos por células tumorais, células do estroma, ou ambas32-35. Foi

demonstrado que a inibição da interação PD-1/ PD-L1 pode exacerbar a resposta de células T

in vitro e mediar atividade antitumoral em modelos pré-clínicos34, 36.

1.3 Imunoterapia e mecanismos inibitórios de "checkpoint”

Ao se constatar que o receptor das moléculas B7-1 e B7-2, denominado CTLA-4

(cytotoxic T lymphocyte antigen 4), possui atividade inibitória sobre a resposta imune (para

evitar dano colateral a tecidos normais), esta molécula passou a ser vista como um possível

alvo terapêutico37. Dessa forma, dois anticorpos monoclonais anti-CTLA-4, ipilimumabe

(Yervoy, Bristol-Myers Squibb, Princteon, NJ) e tremelimumabe (Pfizer, New York, NY),

demonstraram atividade antitumoral, com taxas de resposta objetiva de 10-15% em

pacientes com melanoma metastático (MM) e carcinoma de células renais (CCR)38-40. Em

março de 2011, o ipilimumabe foi aprovado para o tratamento de primeira linha de pacientes

portadores de melanoma metastático, baseado em estudo fase III, no qual esta droga

demonstrou aumento da sobrevida livre de progressão e global, comparado ao uso de vacina

com o peptídeo gp100 ou de dacarbazina41. Porém, foram observados eventos adversos grau

3-5, relacionados à resposta imune, em 10-35% dos pacientes recebendo tratamento com

bloqueio de CTLA-4, sendo os órgãos mais afetados: cólon, glândulas endócrinas e pele. A

possibilidade da ocorrência destes eventos já era esperada pelos resultados do bloqueio de

CTLA-4 em experimentos animais42.

8

Após a descoberta da PD-1 (programmed cell death 1) em 1992 por Ishida et al.28, e

cinco anos após a descoberta de seus ligantes, PD-L1 e PD-L2 (programmed cell death 1

ligand 1 e 2)32, 43, 44, tornou-se evidente que a PD-1 tem um papel crucial na regulação da

resposta imune. Ocorre uma menor ativação de linfócitos T, ou seja, uma diminuição da

resposta imune quando a PD-1 presente em sua membrana celular se une aos seus ligantes

PD-L1 e PD-L2, presentes nas membranas de células tumorais ou apresentadoras de

antígenos. O mesmo pode ser observado quando a CTLA-4 presentes nos linfócitos se liga às

proteínas B7-1 e B7-2 presentes nas células tumorais ou apresentadoras de antígenos.

Atualmente, vários grupos têm desenvolvido tratamentos antagonistas do complexo PD-1 e

seus ligantes para o tratamento de tumores30, 45-47 e doenças infecciosas e também agonistas

para o tratamento de doenças autoimunes, alergias e rejeição a transplantes48-50.

Em 2010, um estudo piloto com o uso de um anticorpo monoclonal anti-PD-1,

denominado BMS-936558 (Bristol-Myers Squibb, Princteon, NJ), também chamado MDX-

1106, ONO-4538 ou nivolumabe posteriormente, observou evidência de atividade

antitumoral, com perfil de segurança favorável dentre um total de 39 pacientes portadores

de diversos tumores sólidos avançados51.

Dois anos mais tarde, foram reportados os resultados de estudo fase I/II que analisou a

segurança e a atividade do uso de doses escalonadas do anticorpo BMS-936558 no

tratamento de 296 pacientes portadores de melanoma metastático (MM), câncer de pulmão

de células não pequenas (NSCLC), câncer de próstata avançado resistente à castração (CRPC),

câncer de células renais (RCC) e câncer colorretal (CRC)52. Dos 236 pacientes avaliáveis, foram

observadas respostas objetivas em 14 dos 76 pacientes com NSCLC (18%), 28 dos 94

portadores de MM (28%) e 9 dos 33 pacientes com RCC (27%).

Um dado interessante deste estudo foi obtido pela avaliação da imunoexpressão de

PD-L1 nas amostras de tumores obtidas de 42 pacientes, antes do início do tratamento.

Observou-se que dos 25 pacientes em cujas amostras foi constatada expressão positiva para

PD-L1, 9 apresentaram resposta antitumoral, ao passo que nenhum dos 17 pacientes

portadores de tumores com expressão negativa para PD-L1 tiveram resposta (P=0,006). Estes

dados sugeriam inicialmente uma correlação entre a expressão de PD-L1 em células tumorais

com resposta objetiva ao tratamento com bloqueio de PD-1.

Estas observações estimularam o uso de bloqueadores da PD-L1 como potenciais

agentes terapêuticos antitumorais. Assim, em 2012, foram publicados os resultados parciais

9

de um estudo para avaliação da segurança e atividade do anticorpo anti-PD-L1 denominado

BMS-936559 (Bristol-Myers Squibb, Princteon, NJ).53 Foram tratados 207 doentes, portadores

de NSCLC (75 doentes), MM (55 doentes), CRC (18 doentes), RCC (17 doentes), câncer de

ovário (17 doentes), câncer de pâncreas (14 doentes), câncer gástrico (7 doentes) e câncer de

mama (4 doentes). Respostas objetivas (regressão tumoral variando de 6% a 17%) foram

observadas em nove de 52 doentes portadores de MM, em dois de 17 casos de RCC, em

cinco de 49 doentes com NSCLC e em um de 17 casos de câncer de ovário. As respostas

tiveram duração de 1 ano ou mais em 8 dos 16 doentes tratados e que foram seguidos por

pelo menos um ano. Eventos adversos grau 3-4, considerados como sendo relacionados ao

tratamento, ocorreram em 9% dos pacientes. Os autores concluíram que o bloqueio de PD-L1

foi capaz de induzir regressão tumoral em 6-17% dos pacientes com MM, NSCLC e RCC.

Adicionalmente, foi observada estabilização da doença, entre 12% e 41% dos pacientes, após

24 semanas.

Em 2013, uma série de estudos analisaram a segurança e atividade de outro anticorpo

anti-PD-L1, denominado MPDL3280A ou atezolizumabe (F. Hoffmann-La Roche Ltd.), o qual

foi desenvolvido por engenharia genética54. Nestes estudos, observou-se uma taxa de

resposta global de 21% (29 de 140 pacientes avaliáveis), com a seguinte distribuição por sítio

tumoral primário: taxa de resposta de 22% em pacientes com NSCLC (09 em 41 pacientes),

29% em casos de MM (11/38 pacientes) e 13% nos pacientes com RCC (6/47), sendo que os

dados referentes aos pacientes com RCC são preliminares, devido ao curto seguimento. Nos

171 pacientes tratados até o momento foi observada uma incidência global de eventos

adversos grau 3/4 de 43% (73/171 pacientes). Os principais eventos relatados foram:

hiperglicemia (5%), fadiga (4%), elevação de ALT (3%), dispnéia (3%) e hipóxia (3%). Foi

possível ainda mensurar a expressão de PD-L1 em 103 dos 140 pacientes avaliados, sendo

observado aumento da expressão em 36 casos (35%) e baixa expressão em 67 casos (65%).

Dos 36 pacientes com expressão positiva de PD-L1, 13 apresentaram resposta objetiva

antitumoral (36%), ao passo que dos 67 casos PD-L1-negativos, houve resposta em somente

nove pacientes (13%). Em comunicado recente, a mesma substância tem mostrado

resultados promissores em câncer de pulmão55.

Em março de 2015, o FDA (Food and Drug Administration; órgão regulatório e

governamental americano para controle de medicamentos, alimentos, cosméticos, materiais

biológicos e produtos derivados do sangue humano) aprovou o nivolumabe para utilização

10

em carcinoma escamoso avançado de pulmão após falha à primeira linha de tratamento. A

aprovação foi decorrente de estudo que constatou melhores resultados de sobrevida global,

sobrevida livre de progressão e taxa de resposta aos doentes que utilizaram nivolumabe em

comparação ao docetaxel, independentemente do status de expressão de PD-L156.

Recentemente, a aprovação foi estendida para carcinomas não escamosos de pulmão após

um estudo ter também demonstrado melhora da sobrevida global57. Atualmente, ficou

evidente que a manipulação de vias co-reguladoras que reprimem a resposta imune

antitumoral é capaz de promover respostas antitumorais, numa variedade de neoplasias,

mesmo quando administradas de forma isolada. O futuro próximo deverá trazer novas

informações sobre a melhor forma de administrar esses novos agentes com menor

toxicidade e melhores resultados, incluindo a combinação com outras formas de terapia.

1.4 Expressão de PD-L1 e tipos de microambiente tumoral

Para o entendimento da expressão de PD-L1 no microambiente tumoral pulmonar, faz-

se necessária inicialmente uma breve descrição dos tipos celulares envolvidos. (Figura 3)

As células apresentadoras de antígenos (APC) capturam microrganismos e antígenos

estranhos ao organismo e os apresentam aos linfócitos estimulando sua proliferação e

diferenciação. As principais células apresentadoras de antígenos são os macrófagos, células

dendríticas e linfócitos B.

As células dendríticas originam-se na medula óssea e tem linhagem monocítica.

Situam-se em órgãos e tecidos de barreira. Capturam antígenos por pinocitose e fagocitose

através de longos prolongamentos citoplasmáticos. Ocorre ativação de sinais intracelulares e

as mesmas se deslocam para os órgãos linfóides periféricos. Nessas estruturas, apresentam

então os peptídeos derivados dos antígenos previamente fagocitados aos linfócitos9, 10.

Os macrófagos ou fagócitos mononucleares originam-se na medula óssea (progenitor

mielóide) e chegam ao sangue incompletamente diferenciados, quando são chamados de

monócitos. Ao atingirem os tecidos, maturam-se em macrófagos e sofrem diferenciação

originando a micróglia no sistema nervoso central, as células de Küpffer no fígado, os

osteoclastos nos ossos e os macrófagos alveolares no pulmão. Suas funções principais

consistem no recrutamento de células para os locais de infecção e no reconhecimento de

microrganismos, fagocitando-os e destruindo-os. Podem ainda produzir citocinas,

importantes em respostas imunes naturais ou adquiridas9, 10.

11

Os linfócitos B ou células B são um tipo de linfócito originados na medula óssea

(progenitor linfóide). Inicialmente, as células B progenitoras rearranjam seus genes de

imunoglobulinas e geram receptores. Trata-se de uma fase independente de antígenos, mas

dependente do contato com células do estroma medular. Ocorre então uma seleção

negativa na qual células B que se ligam aos próprios antígenos (auto-reativas) são

eliminadas. As células B já maduras que não reagem contra os próprios antígenos migram

para os órgãos linfóides periféricos e são ativadas após encontro com antígenos estranhos.

As células B ativadas então se proliferam e podem diferenciar-se em células plasmáticas

secretoras de anticorpo e células B de memória de vida longa9, 10.

Os linfócitos T originam-se na medula óssea (progenitor linfoide). São células da

imunidade celular e portanto não produzem anticorpos. Reconhecem antígenos de

microrganismos ou células infectadas, destruindo-os através de receptores de antígenos em

suas membranas com especificidade restrita. Esse reconhecimento antigênico aplica-se

apenas a peptídeos ligados a proteínas do hospedeiro que são codificadas pelos genes do

complexo principal de histocompatibilidade (MHC) e que se expressam nas superfícies de

outras células. Os principais tipos de linfócitos T são os auxiliares (T Helper ou CD4), os

citotóxicos (T citolíticos ou CD8) e os reguladores (Treg)9, 10.

Os linfócitos T auxiliares secretam citocinas (proteínas) que estimulam a proliferação e

diferenciação de células T, células B, macrófagos e outros leucócitos9, 10. Já os linfócitos T

citotóxicos destroem células com antígenos estranhos como células infectadas por exemplo

e microrganismos9, 10.

Os linfócitos T reguladores são células T auxiliares diferenciadas que estão aumentadas

no microambiente tumoral, inibem a função dos linfócitos T CD4, T CD8, e células

dendríticas. São responsáveis pela vigilância e tolerância imunológica (inibição de respostas

imunológicas a antígenos próprios)9, 10.

As células supressoras de origem mielóide ou MSDC (myeloid derived supressor cells)

originam-se na medula óssea (progenitor mielóide) e se expandem em infecções crônicas e

câncer. Inibem a resposta imune pelo uso competitivo de substratos necessários para a

ativação da célula T tais como: arginina, cisteína e óxido nítrico favorecendo então a

angiogênese, vasculogênese e metástase. Suas funções ainda não foram completamente

elucidadas pela comunidade científica58, 59.

12

Figura 3 - Células constituintes do microambiente tumoral (Fonte: Sid P. Kerkar,

Nicholas P. Restifo, 2012)60

O microambiente tumoral pode também ser classificado conforme o tipo de expressão

de PD-L1 e a presença dos linfócitos intra-tumorais (TIL) em quatro tipos. 61. (Figura 4). O

microambiente tipo I, denominado resistência imunológica adaptativa, ocorre quando existe

expressão tanto de PD-L1 quanto de linfócitos intra-tumorais. Há evidências de que estes

linfócitos sejam pré-existentes à expressão de PD-L1 e que foram desativados por ela. Esse

padrão de resistência imunológica adaptativa está presente em 38% dos casos de

melanoma avançado. .

O microambiente tipo II, denominado ignorância imunológica ou pouca resposta

imune detectável, ocorre quando há ausência de expressão de PD-L1 e de linfócitos intra-

tumorais . Quarenta e um por cento dos pacientes com melanoma apresentam esse padrão

de microambiente e esses tumores têm pior prognóstico.

O microambiente tipo III, denominado indução intrínseca, apresenta o biomarcador

PD-L1 constitutivamente expresso nas células tumorais apesar da sinalização oncogênica,

sem a presença de linfócitos intra-tumorais. Tal fato impede de se considerar a expressão de

13

PD-L1 como fator preditivo de resposta a terapias imunes. Este tipo de microambiente

tumoral está presente em apenas 1% dos casos de melanoma e em outros tumores como

carcinoma de pulmão não pequenas células.

O microambiente tipo IV, denominado tolerância imune, caracteriza-se pela presença

de linfócitos intra-tumorais sem expressão de PD-L1 pois apresenta outras vias supressoras

dominantes devido à heterogeneidade proporcional de células mielóides e linfóides.

Figura 4 - Tipos de microambiente tumoral (Teng et al. 2015)61

O presente estudo busca aumentar o entendimento do microambiente tumoral em

pacientes submetidos a ressecção pulmonar para o tratamento de câncer de pulmão de

células não pequenas através da análise da expressão do marcador PDL-1 nas células

tumorais e nas células apresentadoras de antígenos por imuno-histoquímica e da avaliação

da possível relação dessa expressão com dados clínicos e demográficos.

14

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo geral

Avaliar a expressão de PDL-1 em tecido tumoral de pacientes portadores de carcinoma

pulmonar de células não pequenas, submetidos a tratamento cirúrgico e correlacionar

os achados com dados clínicos, demográficos e moleculares.

2.2 Objetivos específicos

2.2.1. Analisar os dados clínicos, demográficos e moleculares de uma população de

pacientes brasileiros submetidos a ressecção pulmonar para o tratamento de câncer de

pulmão de células não pequenas.

2.2.2. Avaliar a expressão de PD-L1 nas células tumorais e nas células apresentadoras

de antígenos de doentes com câncer de pulmão de células não pequenas.

2.2.3. Avaliar o grau de concordância entre a expressão de PD-L1 na células tumorais e

nas células apresentadoras de antígenos de pacientes portadores de carcinoma

pulmonar de células não pequenas, através de imuno-histoquímica por TMA ("Tissue

microarray") ou análise coletiva e corte histológico convencional (análise individual).

2.2.4. Correlacionar a expressão de PD-L1 em tecido tumoral de pacientes portadores

de carcinoma pulmonar com outros biomarcadores (mutações nos genes KRAS, EGFR e

rearranjo do gene ALK), quando disponíveis nos arquivos médicos do hospital.

2.2.5. Correlacionar a expressão de PD-L1 em tecido tumoral de pacientes portadores

de carcinoma pulmonar de células não pequenas com dados clínico-demográficos.

2.2.6. Avaliar comparativamente as curvas de sobrevida conforme a expressão de PD-

L1 em tecido tumoral de pacientes portadores de carcinoma pulmonar de células não

pequenas.

15

3 MATERIAIS E MÉTODOS

Desenho do estudo: Estudo de coorte com coleta de dados retrospectivo.

Número total de centros: 1 (Hospital de Câncer de Barretos).

Cronologia:

- Consulta aos arquivos da cirurgia torácica, patologia e sistema de informática

do hospital para identificação dos pacientes submetidos a procedimentos

cirúrgicos pulmonares entre 2003 e 2014.

- Seleção dos casos com câncer primário de pulmão com histologia de células

não pequenas submetidos a ressecção cirúrgica da lesão primária.

- Seleção dos blocos adequados para confecção do TMA ("Tissue microarray") e

lâminas para reações de imuno-histoquímica.

- Leitura da lâmina de TMA (análise coletiva) e lâmina de corte histológico

convencional (análise individual) com posterior análise dos resultados e

correlações estatísticas.

3.1 Considerações éticas

O estudo foi aprovado Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) do Hospital de Câncer de

Barretos em 15/05/2014 sob o número 799/2014 (Anexo A). O delineamento deste estudo

seguiu os princípios da declaração de Helsinki e sua condução obedeceu aos princípios das

boas práticas clínicas.

3.2 Pacientes

Foram obtidos dados e amostras de tecido tumoral de 177 casos (total de doentes

maiores de 18 anos com câncer primário de pulmão de células não pequenas

submetidos a ressecção cirúrgica da lesão primária entre os anos 2003 e 2014, com

material disponível no arquivo do Departamento de Anatomia Patológica do Hospital de

Câncer de Barretos).

Entre 2003 e 2014 foram realizadas 1056 intervenções cirúrgicas. Foram excluídos da

amostra pacientes submetidos a metastasectomias, ressecção de tumores do mediastino

(timomas, teratomas e tumores germinativos por exemplo), ressecção de tumores de parede

16

torácica, ressecção de tumores pleurais (mesoteliomas), ressecção de tumores pulmonares

com tipo histológico neuroendócrino e pacientes com idade inferior a 18 anos.

3.2. 1 Critérios de inclusão

Foram incluídas amostras tumorais de doentes com idade igual ou superior a 18 anos,

e ambos os sexos, com carcinoma pulmonar de células não pequenas (adenocarcinoma,

carcinoma adenoescamoso, carcinoma epidermóide, carcinoma indiferenciado) submetidos

a pneumectomia, lobectomia, segmentectomia ou nodulectomia no Hospital do Câncer de

Barretos, no período de 2003 a 2014 com disponibilidade de lâminas e blocos de parafina

para análise histopatológica.

3.2.2 Critérios de exclusão

Foram excluídos os casos em que o material disponível (lâminas e blocos) não

apresentavam qualidade adequada para os testes propostos. Foram excluídos pacientes com

histologia de células pequenas ou componente neuroendócrino.

3.3 Variáveis analisadas

Foi utilizado um formulário para coleta de dados clínicos, demográficos e anatomo-

patológicos (Anexo A). Os dados de expressão imuno-histoquímica do marcador PD-L1 foram

transcritos diretamente pelo patologista envolvido com o estudo para uma planilha de Excel.

Foi criado um banco de dados em Software SPSS (v.21.0) com as características dos doentes,

incluindo-se os dados do formulário e planilha.

3.4 Construção dos blocos de TMA e lâminas

Os blocos de TMA foram confeccionados com uso de aparelho Beecher™ (Beecher

Instruments, Silver Spring, MD, USA), conforme especificações do fabricante, seguindo-se as

seguintes etapas:

marcação da área selecionada no respectivo bloco de parafina;

utilização do aparelho para criar espaço vazado (“casela”) no bloco receptor;

extração de dois cilindros ou “punchs” teciduais por bloco doador com 1mm

de diâmetro da respectiva área de interesse previamente selecionada;

17

transferência do cilindro tecidual obtido do bloco doador para a “casela”

previamente criada no bloco receptor;

progressão, em frações de milímetros, a novas posições dentro do bloco

receptor, de modo a criar coletânea de amostras teciduais seguindo disposição

matricial;

avaliação da qualidade do bloco final para armazenamento.

Para adesão dos cortes dos blocos de TMA nas lâminas foi utilizado sistema de fitas

adesivas (Instrumedics Inc, Hackensak, NJ, USA). As amostras foram cortadas com espessura

de 4 µm, sendo usado pequeno rolo para pressionar o corte na fita. A fita com o corte

histológico aderido foi então colocada sobre lâmina revestida por resina (parte do kit do

sistema de fita adesiva), e pressionada com o mesmo rolo, para melhor aderência do corte.

Em seguida, as lâminas com os cortes histológicos aderidos às fitas foram colocadas em luz

ultravioleta por 20 minutos, passando após por solução solvente TPC por mais 20 minutos.

As lâminas foram secadas e as fitas adesivas retiradas. As lâminas sofreram banho de

parafina, e então foram encaminhadas para estocagem em condições ideais de refrigeração.

Durante a construção do bloco de TMA foi preparado mapa em planilha Excel com a

localização e identificação das amostras de tecidos objetivando orientar a leitura posterior

das reações imuno-histoquímicas. Tais dados foram transcritos para o banco de dados.

Foram obtidas lâminas a partir de cortes dos blocos de parafina das amostras

histológicas originais (cortes histológicos convencionais) e do bloco de TMA confeccionado

acima com (tissue microarray) para que cada paciente pudesse ser avaliado imuno-

histoquimicamente pelas duas técnicas. Para a construção das lâminas , após separação dos

blocos e lâminas originais, foram obtidos cortes histológicos com 4 µm de espessura de cada

bloco. Estes cortes foram corados pela técnica da hematoxilina-eosina, revisados para a

confirmação do diagnóstico e os achados histopatológicos foram reavaliados por um

patologista do Hospital de Câncer de Barretos.

3.5 Técnica de imuno-histoquímica

Cortes dos blocos foram montados em lâminas de vidro revestidas com silano (3-

Aminopropiltrietoxisilano) e secados por 30 minutos a 37°C. O corte foi desparafinizado em

xilol e reidratado através de uma série de alcoóis graduados. A atividade da peroxidase

endógena foi bloqueada pela incubação dos cortes em banho de metanol contendo peróxido

18

de hidrogênio a 3% por 20 minutos, seguida de lavagem em água destilada. O corte foi

inicialmente submetido ao epítopo recuperado pelo calor induzido, usando tampão citrato

(pH 9,0) em panela de pressão (Eterna®, Nigro) destampada. As lâminas foram mergulhadas

e então lacrada a panela com a válvula de segurança aberta. Após a saída do vapor saturado,

a válvula de segurança foi abaixada e aguardou-se a pressurização total. Após 4 minutos

desse sinal, a panela ainda fechada foi deixada sob água corrente, destampada, e as lâminas

foram lavadas em água corrente e destilada.

Em seguida, foi realizado o bloqueio da peroxidase endógena com H2O2 3% (água

oxigenada 10 vol.) com 3 trocas de 10 minutos cada. As lâminas foram novamente lavadas

com água corrente e destilada, seguida de solução salina tamponada com fosfatos (PBS)

10mM ph 7,4 por 5 minutos.

Posteriormente, o anticorpo primário foi aplicado e as lâminas foram incubadas

durante a noite a 8°C.

3.5.1 Anticorpo primário

O anticorpo primário foi importado do fabricante ABCM INC (Cambridge, MA, USA):

anticorpo primário anti-PD-L1 (CD274), isotipo IgG de coelho, policlonal, 1:400 (referência:

ab58810).

3.5.2 Análise da imuno-coloração

Como ponto de partida, um teste preliminar foi realizado para identificar a melhor

concentração de anticorpos e para escolher os controles positivos utilizando os dados de

diluição fornecidos pelo fabricante. Depois de lavar o anticorpo primário com solução salina

tamponada com fosfatos (PBS), as lâminas serão incubadas com polímero livre de biotina em

sistema de visualização Advance™ (DAKO, Glostrup, Dinamarca) por 30 minutos. Uma

solução recém-preparada de 1 gota de 3,30-diaminobenzidina tetrahidrocloreto (DAB,

Sigma, D-5637, EUA) com 1 ml de substrato (DAKO™, Glostrup, Dinamarca) foi aplicada por 5

minutos em cada lâmina. A solução DAB foi removida por lavagem com água destilada. As

lâminas foram contra-coradas com hematoxilina, desidratadas em etanol, apuradas em xilol

e montadas usando Entelan ™.62, 63

A expressão tecidual do marcador PD-L1 foi categorizada dicotomicamente em

negativa (quando menos de 5% das células expressavam PD-L1) ou positiva (quando mais de

19

5% das células expressavam PD-L1)64 e também em grupos quanto à porcentagem de células

coradas e a intensidade dessa coloração, para melhor descrever a amostra.

3.6 Análise mutacional dos genes EGFR e KRAS

Os dados referentes a pesquisa de mutações nos genes de EGFR e KRAS foram

agrupados conforme presença e ausência de mutação quando disponíveis nos registros

hospitalares do Hospital de Câncer de Barretos. A técnica utilizada para realizar esses testes

no laboratório de diagnóstico molecular consistiu em extrair o DNA das amostras de tecido

parafinado utilizando lâminas com três cortes de 10 µm, com a área tumoral previamente

demarcada pelo patologista com o kit QIAmp DNA micro (Qiagen, Hilden, Germany)

seguindo o protocolo do fabricante65.

A análise das mutações foi feita usando primers específicos para as regiões dos éxons

18, 19, 20 e 21 do gene EGFR e éxon 2 (códons 12 e 13) do gene KRAS66, 67 com a reação em

cadeia da polimerase (PCR) realizada com os seguintes parâmetros de ciclagem: 96°C por 15

minutos, seguido de 40 ciclos de desnaturação de 96°C por 45 segundos, anelamento de

56,5°C por 45 segundos, extensão de 72°C por 45 segundos e extensão final de 72°C por 10

minutos realizados em termociclador Veriti (Applied Biosystems, Carlsbad, USA). Após a PCR

os produtos amplificados foram purificados com EXOSAP-IT (Affymetrix, USB) e submetidos a

sequenciamento direto com BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied

Biosystems)66. A reação de sequenciamento foi purificada com BigDye XTerminator

purification kit (Applied Biosystems) e aplicada no sequenciador ABI 3500 xL Genetic

Analyzer (Applied Biosystems) seguindo as orientações do fabricante. A análise foi efetuada

no software Genetic Analyzer ABI PRISM 3500 e SeqScape version 2.7 (Applied Biosystems).

3.7 Pesquisa do rearranjo do gene ALK

Os dados referentes à pesquisa de rearranjo do gene ALK (2p23) foram agrupados

conforme presença e ausência de rearranjo quando disponíveis nos registros hospitalares do

Hospital de Câncer de Barretos. A técnica utilizada para realizar esses testes no laboratório

de diagnóstico molecular foi a de hibridização in situ (FISH) a partir de material biopsiado ou

de ressecção cirúrgica (5µm), com região tumoral previamente marcada, seguida de fixação

em estufa a 60°C e posterior desparafinização a 80°C.

20

O protocolo de hibridização in situ fluorescente contou com uma etapa prévia à

hibridização, seguida da hibridização (18-24 horas) propriamente dita com Vysis ALK Break

Apart Fish Probe Kit, marcando-se em Spectrum Orange (LSI 3’) e Spectrum Green (LSI 5’)

seguida de uma pós-hibridização para remoção de marcações inespecíficas. Posteriormente,

realizou-se análise com software Apllied Spectral Imaging FISH View 7.0 em microscópio

Nikon ECLIPSE 50i. Foram elegíveis para análise núcleos interfásicos íntegros e livres de

sobreposição, sendo classificados como positivos para presença do rearranjo ALK os casos

com frequência (cutoff) ≥ 15%68, 69.

3.8 Análise estatística

Os dados foram descritos em função da média, desvio padrão, mínima, máxima e

quartis para as variáveis quantitativas e tabelas de frequência para as variáveis qualitativas.

A concordância entre a técnica de análise coletiva ou TMA (tissue microarray) e análise

individual foi feita utilizando-se o coeficiente Kappa para avaliar a reprodutibilidade e os

critérios de Landis & Koch para interpretação deste índice.(Tabela 1)

Tabela 1- Critérios de concordância definidos por Landis & Koch (1977) para interpretação do índice de Kappa

Índice de Kappa Grau de concordância

<0,00 Pobre

0,00 - 0,20 Muito leve

0,21 - 0,40 Leve

0,41 - 0,60 Moderado

0,61 - 0,80 Substancial

0,81 - 1,00 Quase perfeito

A correlação entre as características clínicas e demográficas e a expressão do

marcador PD-L1 na célula tumoral e nas APC foi determinada utilizando-se o teste de Qui-

Quadrado (ou Exato de Fisher) para as características qualitativas. Para verificar a associação

conjunta entre co-variáveis e o marcador PD-L1 foram selecionadas as que obtiveram p-valor

menor que 0,2 no teste anterior, e posteriormente, ajustadas no modelo de Regressão

Logística Múltiplo. Para modelagem, foi retirada uma característica (variável) por vez

priorizando a que possuía maior p-valor, até atingir um conjunto de variáveis significativas.

Para a sobrevida global, foi considerado o tempo entre a data de diagnóstico até a

data do óbito por qualquer motivo (sendo este o evento de interesse) ou a última

21

informação objetiva para indivíduos que não foram a óbito. Para comparar cada

característica e verificar a relação das características com a sobrevivência de forma simples

(apenas uma por vez), foi utilizada a regressão de Cox Simples. Para a relação conjunta entre

as variáveis, foram selecionadas as que que obtiveram p-valor menor que 0,2 na análise

simples, e ajustadas no modelo de Regressão de Cox Múltiplo. E prosseguiu-se com a

modelagem conforme a mesma descrição na regressão logística. Para se estimar a curva de

sobrevida global para a expressão de PD-L1, foi utilizada também a técnica de Kaplan-Meier.

Para análise de sobrevida foi considerada apenas a sobrevida global, por se tratar de

um estudo retrospectivo e de não ter havido uma padronização no tempo de seguimento

destes doentes no passado.

Neste estudo considerou-se a significância estatística de 0,05 e o software SPSS 21.0

foi utilizado para as análises estatísticas.

22

4 RESULTADOS

4.1 Dados clínico-demográficos e moleculares

4.1.1 Dados demográficos

Em relação às características demográficas, observa-se na Tabela 2, que a maior parte

dos doentes selecionados tinha mais de 60 anos (96 casos; 54,2%), era do sexo masculino

(111 casos; 62,7%), de raça branca (140 casos; 79,1%), com ECOG 0 (86 casos; 48,6%),

relatava passado de tabagismo (79 casos; 44,6%) e sem relato de etilismo (96 casos; 54,2%).

Tabela 2 - Dados demográficos

Variável Categoria N (%)

Idade < 60 anos 81 45,8

> 60 anos 96 54,2

Sexo Feminino 66 37,3

Masculino 111 62,7

Raça Branco 140 79,1

Não Branco 32 18,1

Ignorado 5 2,8

ECOG 0 86 48,6

1 46 26

Outros 6 3,38

Ignorado 45 25,4

Tabagismo Ausente 39 22

Ativo 57 32,2

Passado 79 44,6

Ignorado 2 1,1

Etilismo Ausente 96 54,2

Ativo 45 25,4

Passado 18 10,2

Ignorado 18 10,2

4.1.2 Dados Clínicos

O tipo histológico mais frequente foi o adenocarcinoma (115 casos; 65%) com grau

de diferenciação II (81 casos; 45,8%). Em sua maior parte, os tumores apresentaram

agrupamento TNM menor que III, sendo, respectivamente, estádio I e II observados em 62

23

doentes (35,0%) e 53 doentes (29,9%). O tipo de cirurgia mais realizada foi lobectomia (147

casos; 83,1%). Quimioterapia adjuvante foi realizada em 34 casos (19,2%). Quanto ao

seguimento, 56 casos (31,6%) apresentaram recidiva, 36 casos (20,3%) foram submetidos a

tratamento quimioterápico paliativo e 32 casos (18,1%) foram submetidos à radioterapia

paliativa. No momento da coleta dos dados, 77 doentes (43,5%) encontravam-se vivos sem

doença.

Tabela 3 - Dados clínicos

Variável Categoria n (%)

História oncológica pregressa Ausente 112 63,3

Presente 64 36,1

Mama e ginecologia 16 9

Urologia 10 5,6

Digestivo 16 9

Pulmão 4 2,3

Pele 9 5,1

Outros 16 9

Ignorado 1 0,6

Tipo histológico Adenocarcinoma 115 65

Carcinoma escamoso 57 32,2

Outros 5 2,8

Grau de diferenciação Grau I 5 2,8

Grau II 81 45,8

Grau III 50 28,2

Ignorado 41 23,2

Agrupamento TNM I 62 35

II 53 29.9

III 43 24,3

IV 19 10,7

Tipo de Cirurgia Nodulectomia 4 2,3

Segmentectomia 12 6,8

Lobectomia 147 83,1

Pneumectomia 14 7,9

Tratamento sistêmico Não 121 68,4

Sim 55 31

QT* neoadjuvante 21 11,9

QT* adjuvante 34 19,2

QT* + RxT** 3 1,7

Ignorado 1 0,6

Radioterapia adjuvante Sim 23 13

Nao 154 87

continua

24


continuação Recidiva Ausente 120 67,8

Presente 56 31,6

Local 18 14,1

Distância 38 20,9

Ignorado 1 0,6

Quimioterapia paliativa Não 134 75,7

Sim 36 20,3

Uma linha 16 9

Duas linhas 8 4,5

Três linhas 12 6,8

Ignorado 7 4

Radioterapia paliativa Sim 32 18,1

Não 138 77,9

Ignorado 7 3,9

Status Vivo sem doença 77 43,5

Vivo com doença 13 7,3

Óbito por câncer 39 22

Óbito por outras causas 36 20,3

Perda de seguimento 12 6,8

(*)Quimioterapia

(**)Radioterapia

4.1.3 Dados Moleculares

Três biomarcadores foram analisados de acordo com a disponibilidade dos resultados

no banco de dados da instituição. O biomarcador mais testado foi o gene EGFR (56 casos;

31,6%) e a sua forma selvagem (wild type) foi a mais comumente encontrada (45 casos;

25,4%). Sua mutação esteve presente em 11 casos (6,2%), em sua maior parte nos éxons 19

e 21 (4 casos; 2,3%). O rearranjo do gene ALK foi pesquisado em 9 doentes (5,1%) e foi

positivo em 4 casos (2,3%). A mutação do gene KRAS foi pesquisada 24 pacientes (13,5%) e

esteve presente em 11 casos (6,2%) exclusivamente no códon 12.(Tabela 4)

25

Tabela 4 - Biomarcadores


Rearranjo do gene ALK Ausente 5 2,8 Presente 4 2,3 Não realizado 168 94,9

Mutação do gene EGFR Ausente 45 25,4 Presente 11 6,2

Éxon 18 2 1,1 Éxon 19 4 2,3 Éxon 20 3 1,7 Éxon 21 4 2,3

Inconclusivo 5 2,8 Não realizado 116 65,5

Mutação do gene KRAS Ausente 13 7,3

Presente 11 6,2

Códon 12 11 6,2

Códon 13 0 0

Inconclusivo 3 1,7

Não realizado 150 84,7

4.1.4 Correlação das informações clínico-demográficas e biomarcadores com sobrevida global

As seguintes variáveis demonstraram diferenças de risco relativo de óbito, com

significância estatística: sexo (feminino versus masculino), p = 0,018 (HR = 1,877; IC 95%

1,113 a 3,166); história oncológica pregressa (não versus sim), p = 0,001 (HR = 0,379; IC 95%

0,212 a 0,679); agrupamento TNM (I/II/ III/IV), p = 0,004; quimioterapia adjuvante (não

versus sim), p = 0,046 (HR = 0,473; IC 95% 0,227 a 0,985); quimioterapia neoadjuvante (não

versus sim), p = 0,027 (HR = 1,868; IC 95% 1,074 a 3,248); radioterapia paliativa (não versus

sim), p = 0,011 (HR 1,806; IC 95% 1,143 – 2,852).(Tabela 5)

26

Tabela 5 - Estimativa do risco relativo de óbito pela regressão de Cox simplificada

Variáveis Categorias HR I.C. 95% Valor de P

Idade <60 anos 1 0,098

>60 anos 1,477 0,931 2,344


Masculino 1,877 1,113 3,166

Raça Não Branco 1 0,318

Branco 1,373 0,738 0,738

ECOG 0 1 0,997

1 1,001 0,575 1,744

Tabagismo Nunca 1

0,155

Ativo 1,954 0,984 3,878 0,056

Passado 1,674 0,869 3,228 0,124

Etilismo Nunca 1

0,906

Ativo 1,022 0,579 1,804 0,941

Passado 0,82 0,323 2,084 0,677

História oncológica prévia Não 1 0,001

Sim 0,379 0,212 0,679

Tipo Histológico Adenocarcinoma 1

0,299

Carcinoma Escamoso 1,031 0,634 1,679 0,901

Outros 2,54 0,782 8,25 0,121

Grau Histológico categorizado Grau I e II 1 0,26

Grau III 1,339 0,806 2,226

Agrupamento TNM Simplificado Categorizado I 1

0,004

II 1,489 0,797 2,779 0,212

III 2,517 1 4,753 0,004

IV 3,357 1,59 7,085 0,001

continua

27

Variáveis Categorias HR I.C. 95% Valor de P

continuação

Tratamento Sistêmico Adjuvante Não 1 0,046

Sim 0,473 0,227 0,985

Tratamento Sistêmico Neoadjuvante Não 1 0,027

Sim 1,868 1,074 3,248

Tratamento Sistêmico Concomitante à Radioterapia Não 1 0,451

Sim 1,575 0,483 5,138

Tratamento Sistêmico Paliativo 1ª Linha Não 1 0,269

Sim 1,317 0,808 2,146


Sim 0,753 0,394 1,441


Sim 0,638 0,275 1,477

Radioterapia Paliativa Não 1 0,011

Sim 1,806 1,143 2,852

Rearranjo do gene ALK Ausente 1 0,588

Presente 0,5 0,041 6,135

Mutação do gene EGFR Ausente 1 0,809

Presente 0,854 0,236 3,086

Mutação do gene KRAS Ausente 1 0,539

Presente 0,671 0,188 2,4

Após a regressão de Cox, finalizou-se com as seguintes variáveis: sexo, idade, história

oncológica pregressa, agrupamento TNM, quimioterapia adjuvante. (Tabela 6)

Doentes do sexo masculino têm 2,237 vezes a chance de óbito dos doentes do sexo

feminino (p=0,007). Doentes com mais de 60 anos têm 2,39 vezes a chance de óbito dos

doentes com menos de 60 anos (p=0,003). Doentes com história oncológica pregressa têm

0,352 vezes a chance de óbito dos doentes sem história oncológica pregressa (p=0,001).

Pacientes com estádio IV têm 4,355 vezes a chance de óbito dos pacientes com

agrupamento TNM I (p=0,001). Pacientes submetidos a quimioterapia adjuvante têm 0,351

vezes a chance de óbito dos pacientes que não receberam quimioterapia adjuvante

(p=0,014), ou seja, possuem menor risco de evento, com significância estatística.

28

Tabela 6 - Regressão de Cox

Variável Categoria HR I.C. 95% P


Masculino 2,237 1,252 3,996

Idade <60 anos 1 0,003

>60 anos 2,39 1,339 4,264

História oncológica pregressa Não 1 0,001

Sim 0,352 0,188 0,659

Agrupamento TNM I 1 0,922

II 1,035 0,519 2,066 III 3,898 1,941 7,828 <0,001 IV 4,355 1,866 10,166 0,001

Tratamento sistêmico adjuvante Não 1

0,014 Sim 0,351 0,153 0,807

4.2 Expressão de PD-L1

Após a confecção da lâmina de TMA (análise coletiva) e dos cortes histológicos

convencionais (análise individual), seguida das reações imuno-histoquímicas, constatou-se a

marcação de PD-L1 em dois tipos celulares principais, morfologicamente distintos: células

tumorais e células apresentadoras de antígeno. As células tumorais apresentavam cromatina

grosseira, núcleos aumentados com cariotecas irregulares e citoplasmas amplos com bordos

mal-definidos. Já as células apresentadoras de antígenos apresentavam cromatina frouxa,

núcleos menores com dobras; sem atipias e citoplasma com morfologias variadas por vezes

exibindo prolongamentos dendríticos. A expressão foi considerada positiva quando 5% ou

mais das células apresentavam cora e negativa quando menos de 5% das células

apresentavam cora, independente da intensidade64. Problemas na cora impedindo a

classificação com negativo ou positivo foram considerados inconclusivos.

29

4.2.1 Análise individual da expressão de PD-L1 em corte histológico convencional

A tabela 7 contém os resultados das expressões do marcador PD-L1 por imuno-

histoquímica, em corte histológico convencional (análise individual). Observa-se expressão

positiva em 67 casos (37,9%) nas células tumorais e em 43 casos (24,3%) nas células

apresentadoras de antígenos, ou seja, maior expressão em células tumorais.

Tabela 7 - Expressão de PD-L1 em corte histológico convencional (análise individual)

Tipo celular Tipo de avaliação Graduação n %

Célula tumoral

Intensidade Ausência de células coradas 97 54,8

Fraco 52 29,3

Moderado 16 9

Forte 1 0,6

Ignorado*** 11 6,2

Porcentagem (3 categorias)

Ausência de células coradas 97 54,8

Até 10% 6 3,4

Entre 11% e 50% 33 18,6

Mais de 50% 30 16,9

Ignorado*** 11 6,2


Positivo* 67 37,9

Negativo** 99 55,9

Ignorado*** 11 6,2

Célula apresentadora de antígeno


Fraco 25 14,1

Moderado 15 8,5

Forte 3 1,7

Ignorado*** 11 6,2



Até 10% 3 1,7

Entre 11% e 50% 15 8,5

Mais de 50% 25 14,1

Ignorado** 11 6,2


Positivo* 43 24,3

Negativo** 123 69,5

Ignorado*** 11 6,2

(*) Mais de 5% de células coradas

(**) Menos de 5% de células coradas

(***) Problemas na cora impedindo a classificação com negativo ou positivo

30

Nas figuras 5 e 6, observam-se fotomicrografias da expressão imunohistoquímica de

PD-L1 de cortes histológicos convencionais (individuais) em células tumorais e células

apresentadoras de antígenos respectivamente.

A

B

C

D

Figura 5 - Foto-micrografias das expressões imuno-histoquímicas do marcador PD-L1 na

células tumoral no câncer de pulmão de células não pequenas (400x). A, Ausência de

expressão do marcador PD-L1; B. Marcador PD-L1 negativo (<5% das células coradas); C.

Marcador PD-L1 positivo (5% das células coradas); D. Controle positivo.

31

A

B

C

D

Figura 6 - Foto-micrografias das expressões imuno-histoquímicas do marcador PD-L1 nas

células apresentadoras de antígenos (APC) no câncer de pulmão de células não pequenas

(400x). A. Ausência de expressão do marcador PD-L1; B. Marcador PD-L1 negativo (<5% das

células coradas); C. Marcador PD-L1 positivo (5% das células coradas); D. Controle positivo.

32

4.2.2 Análise coletiva da expressão de PD-L1 em TMA ("Tissue microarray").

A tabela 8 contém os resultados das expressões do marcador PD-L1 por imuno-

histoquímica, em TMA (análise coletiva). Observa-se expressão positiva em 58 casos (32,8%)

nas células tumorais e em 35 casos (19,8%) nas células apresentadoras de antígenos, ou seja,

maior expressão em células tumorais

Tabela 8 - Expressão de PD-L1 em TMA (análise coletiva)

Tipo celular Tipo de avaliação Graduação n %

Célula tumoral


Fraco 38 21,5

Moderado 16 9

Forte 4 2,3

Ignorado*** 20 11,3



Até 10% 0 0

Entre 11% e 50% 1 0,6

Mais de 50% 57 32,2

Ignorado*** 20 11,3


Positivo* 58 32,8

Negativo** 99 55,9

Ignorado*** 20 11,3

Célula apresentadora de antígeno


Fraco 24 13,6

Moderado 6 3,4

Forte 5 2,8

Ignorado*** 20 11,3



Até 10% 4 2,3

Entre 11% e 50% 5 2,8

Mais de 50% 26 14,7

Ignorado*** 20 11,3


Positivo* 35 19,8

Negativo** 122 68,9

Ignorado*** 20 11,3

(*) Mais de 5% de células coradas

(**) Menos de 5% de células coradas

(***) Problemas na cora impedindo a classificação com negativo ou positivo

33

4.3 Análise de concordância da expressão imuno-histoquímica de PD-L1 em análise individual versus análise coletiva (TMA)

A análise da concordância da expressão imuno-histoquímica do marcador PD-L1

considerando os dois métodos imuno-histoquímicos empregados (análise individual e

coletiva ou TMA) conforme o tipo celular está detalhada na Tabela 9.

Conforme observado, encontrou-se grau leve de concordância entre os métodos com

índice de Kappa de 0,307 (p < 0,001) quando se avaliou a expressão imuno-histoquímica de

PD-L1 em células tumorais em cortes histológicos convencionais (análise individual) e de

TMA (análise coletiva). Resultado semelhante foi observado durante a análise da

concordância da expressão de PD-L1 em células apresentadoras de antígenos (APC)

conforme os métodos de cortes histológicos convencionais (análise individual) e de TMA

(análise coletiva) com índice de Kappa de 0,328 (p < 0,001).

Tabela 9 - Análise da concordância da expressão imuno-histoquímica do marcador PD-L1 conforme tipo celular considerando as técnicas de análise individual e coletiva (TMA)

Tipo celular Kappa Erro padrão assintóticoa p valor Sig. Aprox.

Célula apresentadora de antígeno 0,328 0,089 <0,001

Célula tumoral 0,307 0,079 <0,001

Uma vez que os métodos de avaliação da expressão imuno-histoquímica de PD-L1

(análise individual versus coletiva ou TMA) não foram reprodutíveis, para todas as análises

(univariadas e multivariadas) adiante, para a correlação da expressão PD-L1 e co-variáveis

(dados clínicos, demográficos e com outros biomarcadores), utilizou-se a expressão do

biomarcador PD-L1 em corte histológico convencional separadmente (análise individual).

34

4.4 Correlação da expressão de PD-L1 com outros biomarcadores (mutações nos genes KRAS, EGFR e rearranjo do gene ALK) - análise univariada

Dos vinte e quatro doentes com tumores que expressaram positivamente o marcador

PD-L1 submetidos a pesquisa de mutação no gene do EGFR, 23 casos (95,8%) resultaram em

ausência de mutação e a mutação foi detectada em apenas um tumor classificado como PD-

L1 positivo (4,2%) (p = 0,014).

Tabela 10 - Expressão de PD-L1 em células tumorais e biomarcadores

Variável Categorias Negativo Positivo

P n (%) N (%)

Rearranjo do gene ALK Ausente 1 33,3 4 80 0,464

Presente 2 66,7 1 20

Mutação do gene EGFR Ausente 19 67,9 23 95,8 0,014

Presente 9 32,1 1 4,2

Mutação do gene KRAS Ausente 8 57,1 5 50 0,999

Presente 6 42,9 5 50

Conforme observado na tabela 11, a correlação entre a expressão de PD-L1 pela

célula apresentadora de antígeno e biomarcadores não foi estatisticamente significativa.

Tabela 11 - Expressão de PD-L1 em Células Apresentadoras de Antígenos e biomarcadores

Variável Categorias

Negativo Positivo P

n (%) n (%)

Rearranjo do gene ALK Ausente 4 80 1 33,3 0,464

Presente 1 20 2 66,7

Mutação do gene EGFR Ausente 32 84,2 10 71,4 0,428

Presente 6 15,8 4 28,6

Mutação do gene KRAS Ausente 11 50 2 100 0,482

Presente 11 50 0 0

35

4.5 Correlação da expressão de PD-L1 com dados clínico-demográficos. (análise

univariada)

4.5.1 Expressão de PD-L1 e dados demográficos

Conforme observado na tabela 12 , doentes cujos tumores apresentaram expressão

positiva de PD-L1 em células tumorais eram ex-tabagistas em sua maior parte (36 casos,

55,4%) ou tabagistas ativos (20 casos, 30,8%) com valor de p de 0,044.

Tabela 12 - Expressão de PD-L1 em células tumorais e dados demográficos


P n (%) n (%)

Idade < 60 43 43,4 30 44,8 0,864

> 60 56 56,6 37 55,2

Sexo Feminino 39 39,4 21 31,3 0,289

Masculino 60 60,6 46 68,7

Raça Não branco 18 18,8 11 16,7 0,734

Branco 78 81,2 55 83,3

ECOG 0 48 62,3 31 70,5 0,367

1 29 37,7 13 29,5

Tabagismo Nunca 29 29,3 9 13,8

0,044 Ativo 31 31,3 20 30,8

Passado 39 39,4 36 55,4

Etilismo Nunca 57 63,3 34 58,6

0,312 Ativo 25 27,8 14 24,1

Passado 8 8,9 10 17,2

36

Conforme observado na tabela 13, a correlação entre a expressão de PD-L1 pela célula

apresentadora de antígeno e dados demográficos não foi estatisticamente significativa.

Tabela 13 - Expressão de PD-L1 em células apresentadoras de antígenos e dados demográficos


Negativo Positivo P

n (%) n (%)

Idade < 60 50 40,7 23 53,5 0,144

> 60 73 59,3 20 46,5

Sexo Feminino 41 33,3 19 44,2 0,202

Masculino 82 66,7 24 55,8

Raça Não branco 21 17,6 8 18,6 0,888

Branco 98 82,4 35 81,4

ECOG 0 57 64,8 22 66,7 0,845

1 31 35,2 11 33,3

Tabagismo Nunca 23 19 15 34,9

0,084 Ativo 38 31,4 13 30,2

Passado 60 49,6 15 34,9

Etilismo Nunca 67 60,9 24 63,2

0,934 Ativo 29 26,4 10 26,3

Passado 14 12,7 4 10,5

37

4.5.2 Expressão de PD-L1 e dados clínicos

Conforme observado na tabela 14, a correlação entre a expressão de PD-L1 pela célula

tumoral e dados clínicos não foi estatisticamente significativa.

Tabela 14 - Expressão de PD-L1 em células tumorais e dados clínicos


P n (%) n (%)

História oncológica pregressa Não 68 68,7 36 54,5 0.065

Sim 31 31,3 30 45,5

Tipo histológico Adenocarcinoma 68 68,7 40 59,7

0,412 Carcinoma escamoso 28 28,3 25 37,3

Outros 3 3 2 3

Grau de diferenciação I e II 50 62,5 31 64,6 0,813

III 30 37,5 17 35,4

Agrupamento TNM I 36 36,4 23 34,3

0,756 II 27 27,3 23 34,3

III 26 26,3 14 20,9

IV 10 10,1 7 10,4

Tratamento sistêmico neoadjuvante Não 86 86,9 61 91 0,407

Sim 13 13,1 6 9

Recidiva Não 63 64,9 48 72,7 0,296

Sim 34 35,1 18 27,3

Status Vivo sem doença 39 39,4 34 50,7

0,567

Vivo com doença 8 8,1 3 4,5

Óbito por câncer 24 24,2 14 20,9

Óbito por outras causas 22 22,2 11 16,4

Perda de seguimento 6 6,1 5 7,5

Conforme a tabela 15, dentre os doentes cujos tumores tiveram expressão positiva de

PD-L1 pela célula apresentadora de antígeno, a maior parte apresentou adenocarcinoma

como tipo histológico (35 casos, 81,4%) com significância estatística (p=0,022)

38

Tabela 15 - Expressão de PD-L1 em células apresentadoras de antígenos e dados clínicos


Negativo Positivo P

n (%) n (%)

História oncológica pregressa Não 79 64,8 25 58,1 0,440

Sim 43 35,2 18 41,9

Tipo histológico Adenocarcinoma 73 59,3 35 81,4

0,022 Carcinoma escamoso 46 37,4 7 16,3

Outros 4 3,3 1 2,3

Grau de diferenciação I e II 61 59,8 20 76,9 0,106

III 41 40,2 6 23,1

Agrupamento TNM simplificado categorizado I 42 34,1 17 39,5

0,416 II 41 33,3 9 20,9

III 27 22 13 30,2

IV 13 10,6 4 9,3

Tratamento sistêmico neoadjuvante Não 111 90,2 36 83,7 0,270

Sim 12 9,8 7 16,3

Recidiva Não 80 66,1 31 73,8 0,357

Sim 41 33,9 11 26,2

Status Vivo sem doença 51 41,5 22 51,2

0,610

Vivo com doença 9 7,3 2 4,7

Óbito por câncer 28 22,8 10 23,3

Óbito SOE 25 20,3 8 18,6

Perda de seguimento 10 8,1 1 2,3

4.5.3 Correlação da expressão de PD-L1 com dados clínico-demográficos - análise multivariada

Doentes com passado de tabagismo tiveram maior chance de terem tumores com

expressão positiva do marcador PD-L1 nas células tumorais quando comparados com os

tumores dos doentes que nunca fumaram (OR = 3,356; IC 95% 1,368 a 8,230; p = 0,008).

A chance de expressão positiva de PD-L1 em células tumorais, de doentes com história

oncológica pregressa foi 2,01 vezes o valor da mesma que em doentes sem história

oncológica pregressa (OR = 2,01; IC 95% 1,025 a 3,944; p = 0,042).(Tabela 16)

39

Tabela 16 - Análise multivariada: expressão de PD-L1 em células tumorais

I.C. 95%

Variável Categoria OR LI LS P

Tabagismo Nunca 1

0,03

Ativo 2,236 0,864 5,79 0,097

Passado 3,356 1,368 8,23 0,008

História oncológica pregressa Não 1 0,042

Sim 2,01 1,025 3,944

Constante 0,22

<0,001

Após a regressão logística, a variável tabagismo foi a única variável que manteve

significância estatística quanto a diferença de expressão do marcador PD-L1 nas células

apresentadoras de antígeno.

Doentes com passado de tabagismo tiveram menor chance de terem tumores com

expressão positiva do marcador PD-L1 nas células apresentadoras de antígeno quando

comparados com os tumores dos doentes que nunca fumaram (OR = 0,383; IC 95% 0,162 a

0,908; p = 0,029). A chance de expressão positiva do marcador PD-L1 nas células

apresentadoras de antígeno também foi menor para os doentes com tabagismo ativo

comparativamente com doentes que nunca fumaram, mas sem significância estatística (OR =

0,525; IC 95% 0,212 a 1,297; p = 0,169). (Tabela 17)

Tabela 17 - Análise multivariada: expressão de PD-L1 em células apresentadoras de antígenos

Variável Categoria OR I.C. 95% P

Tabagismo Nunca 1 0,090

Ativo 0,525 0,212 - 1,297 0,162

Passado 0,383 0,162 - 0,908 0,029

Constante 0,652 0,198

4.6 Análise das curvas de sobrevida conforme a expressão de PD-L1

A mediana de sobrevida global dos doentes incluídos nesse estudo foi de 45,0 meses

(IC 95% 33,23 a 56,83). Considerando as expressões do marcador PD-L1 na célula tumoral,

em cortes histológicos convencionais (análise individual) observou-se maior mediana de

sobrevida global para os doentes com tumores positivos para PD-L1, entretanto essa

diferença não foi estatisticamente significante (98,75 meses versus 41,51 meses, com valor

40

de p de 0,254). Também não foi observado diferença estatisticamente significante entre as

medianas de sobrevida global quando se comparou a expressão do marcador PD-L1 nas

células apresentadoras de antígenos, cortes histológicos convencionais (análise individual)

(49,50 meses para os doentes com APC PD-L1 positivo versus 41,51 meses nos doentes com

APC PD-L1 negativo, valor de p de 0,795). (Figuras 7,8 e 9)

Figura 7 - Sobrevida Global Geral

41

Figura 8 - Sobrevida Global Conforme Expressão de PD-L1 em Célula Tumoral

Figura 9 - Sobrevida Global Conforme Expressão de PD-L1 em Célula

Apresentadora de Antígeno.

42

5 DISCUSSÃO

5.1 Achados clínico-demográficos e moleculares

Observou-se no estudo a presença de 64 pacientes (36,1%) com história oncológica

pregressa, número superior ao esperado. Foram excluídos inicialmente pacientes cujos

tumores torácicos se mostraram metastáticos por exames anátomo-patológicos. Quando

isso não era possível, considerou-se a evolução e o julgamento médico, que

inadvertidamente, pode ter considerado um tumor metastático como segundo primário de

pulmão.

Pela regressão de Cox, observou-se que doentes com história oncológica prévia

apresentavam menor chance de óbito em relação aos que não a apresentavam.

Possivelmente, esses doentes foram submetidos a exames de seguimento, o que aumentou

a chance de detecção de outros tumores primários em fase inicial e sua chance de cura.

Sessenta e quatro doentes (36,4%) incluídos nesse estudo apresentavam história oncológica

pregressa. Na Tabela observa-se que doentes com passado oncológico apresentaram uma

tendência para maior proporção de estadiamento mais precoce (agrupamento 0, I ou II)

quando comparado com doentes sem passado oncológico, mas sem significância estatística

(71,9% versus 60,7%, respectivamente; p = 0,144).(Tabela 18)

Tabela 18 - Agrupamento TNM versus história oncológica pregressa (HOP)

Agrupamento TNM Total

0-I-II III-IV

Outros Tumores Não

N 68 44 112 (%) 60,7% 39,3% 100,0%

Sim N 46 18 64

(%) 71,9% 28,1% 100,0%

Total N 114 62 176

(%) 64,8% 35,2% 100,0%

5.2 Achados quanto a expressão de PD-L1

De acordo com o presente estudo, a positividade na expressão de PD-L1 em células

tumorais foi de 37,9% dos casos, um pouco inferior a estudo publicado recentemente que

foi de 53,1% de positividade70. Há um viés ao se comparar positividades entre estudos

diferentes. Existem diferentes plataformas (DAKO, ROCHE, VENTANA) para avaliação da

expressão de PD-L1 com diferentes anticorpos (28-8, 22C3, SP263, SP142 e MIH1, dentre

outros).

43

Essa avaliação pode ocorrer de maneiras distintas: por distribuição e proporção contínua de

células PD-L1 positivas em qualquer intensidade71, por porcentagem de expressão

(immunohistochemistry score) de qualquer intensidade (mais de 1% de células coradas:

Score 1, mais de 5% de células coradas: Score 2, mais de 10% células coradas: score 3)56, por score combinado exibindo uma porcentagem para cada intensidade72, por graduação na

cora de membrana e/ou citoplasma (ex: Aqua Fluorescent Techniques) e concentração de

proteínas no TMA73.

Não há uma padronização quanto a um cutoff para positividade. Alguns estudos

utilizaram 1%, 5%, 50% ou mais para considerar a expressão de PD-L1 positiva74.

Percebe-se então a extrema dificuldade em se padronizar critérios de positividade para PD-

L1, o que envolve desde a maquinaria para as reações químicas até a diluição dos reagentes

bem como a interpretação das leituras o que dificulta o estabelecimento de qualquer

relação entre os estudos. Conforme a Tabela 19, podemos observar diferentes estudos com

diferentes cutoffs para positividade de PD-L1.

Tabela 19 - Imunohistoquímica para PD-L1 em estudos Clínicos

Anticorpo Anti-PD-L1 CUTOFF para positividade

de expressão em superfície tumoral

Porcentagem de amostras tumorais expressando PD-L1

Referência

28/ago 5% 49% Grosso et al. J.C.O., 2013

R&D B7-H1 NR 52% Gatalica et al. C.E.B.P.,

2014 MIH1 > 10% 50% Konish et al. C.C.R., 2014

5H1 > 1% vs > 5% vs High

Score 21% (somente CEC) Marti et al. C.C.R., 2014

SP142 5% 60% Gettinger et al.J.C.O.,

2014 NR 1% 50% Sun et al.J.C.O.,2014

22C3 ≥ 50% 25% Garon et al. N.E.J.M.,

2015

28/ago ≥ 1%, ≥5%, ≥10% 53%, 36%, 25% (somente

CEC) Brahmer et al. N.E.J.M.,

2015 SP142 ≥ 1%, ≥5%, ≥10% 68%, 37%, 16% Spira et al. J.C.O. , 2015

SP142 ≥ 1%, ≥5%, ≥10% 56%, 28%, 13% Herbest et al. Nature,

2014

Outra questão importante a ser discutida é a viabilidade do biomarcador para

mensuração e análise no tecido. Garon EB, et al, observaram que ocorre deterioração de

PD-L1 em amostras tumorais cortadas há mais de 6 meses antes da cora71. No presente

estudo, a cora foi feita menos de um mês depois dos cortes.

44

Estudo recente evidenciou que as células do microambiente tumoral, incluindo células do

tumor, linfócitos e células apresentadoras de antígeno expressam PD-L1 de forma não

uniforme.74 Smyth, et al. (2015) afirmam que um tratamento bem sucedido deve se

basear justamente na estratificação do microambiente tumoral na medida que não deve se

restringir unicamente aos checkpoints imunes mas também a abordagens adjuvantes

relacionadas a potenciais tipos celulares envolvidos84.

O microambiente tumoral apresenta uma gama variada de tipos celulares distintos

representados principalmente por células supressoras de origem mielóide, macrófagos,

células dendríticas, linfócitos T além das células cancerosas60. Há claramente um consenso

de que o microambiente tumoral é uma estrutura complexa e dinâmica na medida que sua

apresentação pode variar para um dado intervalo de tempo. O surgimento de células

tumorais acarreta mudanças imunológicas drásticas que se iniciam cronologicamente com

uma indução intrínseca à expressão de PD-L1 seguida de tolerância e resistência imune

adaptativa com variações quantitativas dos diversos tipos celulares anteriormente

descritos61.

5.3 Análise de concordância entre a análise individual e a análise coletiva (TMA) da expressão imuno-histoquímica do marcador PD-L1 em tecido tumoral

As análises do presente estudo mostraram uma concordância leve pobre entre as duas

metodologias de imuno-histoquímica (individual e coletiva), para a avaliação da expressão

de PD-L1 em tumores pulmonares. A literatura médica já apontou para a relevância que a

heterogeneidade tumoral pulmonar possa ter quanto à expressão do biomarcadores em

pequenas biópsias quando comparadas a peças cirúrgicas75.

Amostras pequenas e isoladas de uma determinada região tumoral, colhidas por biópsias ou

punchs para confecção de TMA por exemplo, podem não representar a expressão de PD-L1

para a totalidade de um tumor. Tal expressão não pode ser generalizada, em decorrência de

sua intrínseca variabilidade regional. A possibilidade de que essa avaliação seja feita através

de uma lâmina de imuno-histoquímica que englobe um tumor em sua maior área possível,

oriunda dos maiores diâmetros assim representados, parece nos fornecer uma descrição

mais representativa da real expressão de PD-L1 em tumores de pulmão.

45

5.4 Correlação da expressão de PD-L1 com outros biomarcadores (mutações nos genes KRAS, EGFR e rearranjo do gene ALK).

Há indícios de que mutações nos genes EGFR e rearranjo do gene ALK possam

influenciar a expressão de PD-L170, 76, 77.

DÌncecco et al. (2015), Ota et al. (2015), Azuka et al. (2014) e Abkay et al. (2013)

demonstraram correlação entre expressão de PD-L1 e a mutação do gene EGFR.

DÌncecco et al. (2015) e Ota et al. (2015) ainda identificaram correlação da expressão

de PD-L1 com rearranjo do gene ALK. Todavia, Zhang et al. (2014) não demonstraram

correlação entre expressão de PD-L1 e mutação de EGFR ou rearranjo do gene ALK.

Não foi demonstrada associação entre mutação do gene KRAS e expressão de PD-L1

nos estudos de Zhang et al. (2014) e DÌncecco et al. (2015).

No presente estudo, na análise univariada, dentre os doentes cujos tumores

apresentavam expressão positiva para PD-L1, a maior parte não apresenta a mutação do

gene EGFR, com significância estatística. Tal resultado não foi confirmado pela análise

multivariada.

Devido ao número reduzido de pacientes testados para mutação do genes KRAS e

rearranjo do gene ALK, não foi possível estabelecer uma relação entre estes genes e a

expressão de PD-L1.

A pesquisa de mutação do gene EGFR se iniciou em 2012 no Hospital de Câncer de

Barretos para casos isolados, passando a fazer parte da rotina no ano de 2013. Já a pesquisa

de mutação do gene KRAS foi realizada apenas para alguns casos no ano de 2012 e a partir

de então deixou de ser realizada. A pesquisa de rearranjo do gene ALK se iniciou no segundo

semestre de 2013 para casos isolados por FISH e passou a fazer parte da rotina para doentes

portadores de adenocarcinoma sem mutação de EGFR em 2015 por imuno-histoquímica.

5.5 Correlação da expressão de PD-L1 com dados clínico-demográficos

No presente estudo, tumores de doentes com passado de tabagismo apresentaram

maior chance de expressar positivamente o marcador PD-L1 nas células tumorais e maior

chance de expressar negativamente esse marcador nas células apresentadoras de antígenos.

Apesar de já ser descrito a influência do tabagismo na expressão de PD-L1 na célula

tumoral78. Essa é a primeira vez que se demonstra a possível influência do tabagismo na

expressão de PD-L1 na células apresentadora de antígeno. Foram comparados tabagistas

46

ativos e ex-tabagistas com não tabagistas (categoria de referência após a regressão

logística).

Observou-se na regressão logística que doentes com história oncológica pregressa

apresentaram maior expressão de PD-L1 em células tumorais. Não há relatos na literatura

associando expressão de PD-L1 e história oncológica pregressa.

Vale a pena ressaltar que alterações da expressão do marcador PD-L1 também podem

ocorrer relacionadas à exposição prévia a quimioterápicos, fato já demonstrado em

carcinomas uroteliais ou mesmo pulmonares.79, 80 O número restrito de doentes submetidos

à quimioterapia neoadjuvante impediu esse tipo de analise no presente estudo.

5.6 Análise das curvas de sobrevida conforme a expressão de PD-L1

Não foi verificada significância estatística quanto à expressão de PD-L1 e sobrevida

global conforme previamente descrita. Outros estudos revelam não haver aparentemente

um valor preditivo nem prognóstico quanto à expressão de PD-L171, 81, 82. Porém, em meta-

análise publicada recentemente, após analisarem 5 estudos com 877 pacientes

portadores de carcinoma de pulmão de células não pequenas, Zhou et al. (2015)

concluíram que a expressão de PD-L1 pode estar relacionada a um pior prognóstico83.

Primeiramente, apenas um dos estudos incluiu pacientes ocidentais sendo os demais de

origem chinesa. Variações quanto a escolha de cutoffs distintos para positividade de

expressão e o tipo de amostra tecidual podem ter contribuído para resultados

discrepantes.

47

6 CONCLUSÃO

Neste estudo observa-se que, numa população brasileira de pacientes portadores de

câncer de pulmão de células não pequenas, o padrão de expressão de PD-L1 foi

heterogêneo, representado por dois tipos celulares distintos: celula tumoral (maior

frequência) e célula apresentadora de antígenos (menor frequência).

Devido ao baixo número de casos para os quais a pesquisa de mutação dos genes do

EGFR, KRAS, e rearranjo do gene ALK havia sido realizada, a interpretação da correlação

entre a expressão desses biomarcadores e a expressão de PD-L1 foi prejudicada.

As técnicas de TMA (análise coletiva) e cortes histológicos convencionais (análise

individual) apresentaram baixo grau de concordância quando se avaliou a imuno-expressão

do marcador PD-L1 nas células tumorais e nas células apresentadoras de antígeno em

doentes com câncer de pulmão de células não pequenas.

Tumores de pacientes ex-tabagistas apresentaram maior expressão de PD-L1 nas

células tumorais quando comparados aos que nunca fumaram. Contrariamente, ex-

tabagistas apresentaram menor expressão de PD-L1 nas APC quando comparados aos que

nunca fumaram. Doentes com história oncológica pregressa apresentaram maior chance de

expressão de PD-L1 em relação aos que não apresentavam história oncológica pregressa.

Também não foi observada correlação entre o padrão de expressão de PD-L1 e a

sobrevida nesta população.

48

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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54

76. Azuma K, Ota K, Kawahara A, Hattori S, Iwama E, Harada T, et al. Association of PD-L1 overexpression with activating EGFR mutations in surgically resected nonsmall-cell lung cancer. Ann Oncol. 2014;25(10):1935-40. 77. Ota K, Azuma K, Kawahara A, Hattori S, Iwama E, Tanizaki J, et al. Induction of PD-L1 Expression by the EML4-ALK Oncoprotein and Downstream Signaling Pathways in Non-Small Cell Lung Cancer. Clin Cancer Res. 2015;21(17):4014-21. 78. Calles A, Liao X, Sholl LM, Rodig SJ, Freeman GJ, Butaney M, et al. Expression of PD-1 and its ligands, PD-L1 and PD-L2, in smokers and never smokers with KRAS mutant lung cancer. J Thorac Oncol. 2015. 79. Andrew S. McDaniel AA, Tianyu Zhan, Hong Xiao, Xuhong Cao, Amy Gursky, Javed Siddiqui, Arul M. Chinnaiyan, Hui Jiang, Cheryl T. Lee and Rohit Mehra. Expression of PDL1 (B7-H1) Before and After Neoadjuvant Chemotherapy in Urothelial Carcinoma. European Urology. 2015. 80. Lin K, Cheng J, Yang T, Li Y, Zhu B. EGFR-TKI down-regulates PD-L1 in EGFR mutant NSCLC through inhibiting NF-kappaB. Biochem Biophys Res Commun. 2015;463(1-2):95-101. 81. Brambilla E. The World Conference on Lung Cancer. In: PD1/PDL1 Biomarker Strategies; Denver, Colorado, USA; 2015. 82. Kim HS, Lee JY, Lim SH, Park K, Sun JM, Ko YH, et al. Association Between PD-L1 and HPV Status and the Prognostic Value of PD-L1 in Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma. Cancer Res Treat. 2015. 83. Zhou ZJ, Zhan P, Song Y. PD-L1 over-expression and survival in patients with non-small cell lung cancer: a meta-analysis. Transl Lung Cancer Res. 2015;4(2):203-8. 84. Smyth MJ, Ngiow SF, Ribas A, Teng MW. Combination cancer immunotherapies tailored to the tumour microenvironment. Nat Rev Clin Oncol. 2015.

55

ANEXOS

Anexo A. Ficha de coleta

Avaliação da expressão dos biomarcadores PD-1 e PDL-1 em tecido tumoral de pacientes portadores de carcinoma de pulmão e correlação com dados clínicos, demográficos e outros biomarcadores

Pesquisador: Gustavo Dix Junqueira Pinto

Ficha 1: Dados clínicos, demográficos e outros biomarcadores

DADOS PESSOAIS E HISTÓRIA MÉDICA

1 Nº de identificação

1

2 Registro hospitalar

2

3 Iniciais

3

4 Sexo

1- Feminino; 2- Masculino; 99- Ignorado 4

5 Data de nascimento

DD/MM/AAAA 5 ___/___/_____

6 Naturalidade

Cidade-Estado; 99- Ignorado 6

7 Procedência

Cidade-Estado; 99- Ignorado 7

8 Estado civil

1- Solteiro; 2- Casado; 3- Divorciado; 4- Viúvo; 5- Amasiado; 99- Ignorado 8

9 Raça

1- Branco; 2- Pardo;3- Negro; 4- Indígena; 5- Oriental; 99- Ignorado 9

10

Escolaridade 1- Analfabeto; 2- Fundamental incompleto; 3- Fundamental completo; 4-Ensino

médio incompleto; 5- Ensino médio completo; 6- Superior incompleto; 7- Superior completo; 8- Pós graduado; 99- Ignorado

10

11

Profissão

Descrever; 99-Ignorado

11

12 Comorbidades

0- Não; 1- Diabetes; 2- HAS; 3- Cardiopatia; 4- AVE; 5- Outra(s); 99- Ignorado 12

13 Se outra comorbidade, detalhar:

Descrever; 88- Não se aplica; 99- Ignorado 13

14 Outros tumores

0- Não; 1- Sim; 99- Ignorado 14

15 Se sim, sítio:

1- Mama e gineco; 2- SNC; 3- TGI; 4- Uro; 5- Pele; 6- Outros; 88- Não se aplica; 99- Ignorado

15

16 Se outra, qual?


56

HÁBITOS PESSOAIS

17 Tabagismo?

0- Não; 1- Presente; 2- Passado; 99- Ignorado 17

18 Se tabagismo (passado ou presente), qual a quantidade?

Em maços/ano; 88- Não se aplica; 99- Ignorado 18

19 Se ex-tabagista, quanto tempo abstinente?

Em anos; 88- Não se aplica; 99- Ignorado 19

20 Etilismo?

0- Não; 1- Presente; 2- Passado; 99- Ignorado 20

21 Se ex-etilista, quanto tempo abstinente?

Em anos; 88- Não se aplica; 99- Ignorado 21

DADOS CLÍNICOS

22 Data do diagnóstico

DD/MM/AAAA 22 ___/___/_____

23 ECOG

0 a 4; 99- Ignorado 23

24 Tipo histológico

0- Adenocarcinoma; 1- Carcinoma escamoso; 2- Carcinoma adenoescamoso; 99- Ignorado

24

25 Grau histológico

1- GI (diferenciado); 2- GII (moderadamente diferenciado); 3- GIII (pouco diferenciado);99- Ignorado

25

27 Estadiamento T (AJCC 2010)

0- Tx; 1- T0; 2- Tis; 3- T1a; 4- T1b; 5- T2a; 6- T2b; 7- T3; 8- T4; 99- Ignorado 27

28 Estadiamento N (AJCC 2010)

0- N0; 1- N1; 2- N2; 3- N3; 4- Nx; 99- Ignorado 28

29 Estadiamento M (AJCC 2010)

0- M0; 1- M1a; 2- M1b; 99- Ignorado 29

30 Agrupamento TNM simplificado 0- Carcinoma oculto; 1- TNM 0; 2- IA; 3- IB; 4- IIa; 5- IIB; 6- IIIA; 7- IIIB; 8- IV; 99-

Ignorado 30

31

Procedimento cirúrgico

0- Não; 1- Biópsia; 2- Nodulectomia; 3- Lobectomia; 4- Pneumectomia; 5- Segmentectomia; 99- Ignorado

31

32 Registro da peça cirúrgica

Número; 88- Não se aplica; 99- Ignorado 32

33 Data do procedimento cirúrgico

DD/MM/AAAA 33 ___/___/_____

MUTAÇÃO ENCONTRADA

34 ALK

0- Ausente; 1- Presente ; 3- Não realizado; 4- Inconclusivo; 99- Ignorado 34

35 EGFR EXON 18


36 EGFR EXON 19


57

37 EGFR EXON 20


38 EGFR EXON 21


39 KRAS CODON 12


40 KRAS CODON 13


TRATAMENTO SISTÊMICO ADJUVANTE

41

Tratamento sistêmico adjuvante 0- Não; 1- CDDP + Gencitabina; 2- Carboplatina + Paclitaxel; 3- Esquema SWOG (CDDP + Etoposídeo); 4- CDDP + Vinorelbina; 5- Carboplatina +Etoposídeo; 6 - Carboplatina + Gencitabina 7- Docetaxel; 8- Gencitabina; 9- Vinorelbina; 10- Paclitaxel; 11- CDDP;12- Carboplatina 13- Erlotinine 14- Gefitinibe; 15- Protocolo de pesquisa; 16- Outro; 99- Ignorado

41

42 Se outro esquema ou se for protocolo de pesquisa, detalhar:


43 Data de início

DD/MM/AAAA 43 ___/___/_____

44 Data de término

DD/MM/AAAA 44 ___/___/_____

TRATAMENTO SISTÊMICO NEOADJUVANTE

45

Tratamento sistêmico neoadjuvante 0- Não; 1- CDDP + Gencitabina; 2- Carboplatina + Paclitaxel; 3- Esquema SWOG (CDDP + Etoposídeo); 4- CDDP + Vinorelbina; 5- Carboplatina +Etoposídeo; 6 - Carboplatina + Gencitabina 7- Docetaxel; 8- Gencitabina; 9- Vinorelbina; 10- Paclitaxel; 11- CDDP;12- Carboplatina 13- Erlotinine 14- Gefitinibe; 15- Protocolo de pesquisa; 16- Outro; 99- Ignorado

45



47 Data de início

DD/MM/AAAA 47 ___/___/_____

48 Data de término

DD/MM/AAAA 48 ___/___/_____

TRATAMENTO SISTÊMICO CONCOMITANTE À RADIOTERAPIA

49

Tratamento sistêmico concomitante à radioterapia 0- Não; 1- CDDP + Gencitabina; 2- Carboplatina + Paclitaxel; 3- Esquema SWOG (CDDP + Etoposídeo); 4- CDDP + Vinorelbina; 5- Carboplatina +Etoposídeo; 6 - Carboplatina + Gencitabina 7- Docetaxel; 8- Gencitabina; 9- Vinorelbina; 10- Paclitaxel; 11- CDDP;12- Carboplatina 13- Erlotinine 14- Gefitinibe; 15- Protocolo de pesquisa; 16- Outro; 99- Ignorado

49

50 Se outro esquema ou se for protocolo de pesquisa, detalhar: 50

58

Descrever; 88- Não se aplica; 99- Ignorado

51 Data de início

DD/MM/AAAA 51 ___/___/_____

52 Data de término

DD/MM/AAAA 52 ___/___/_____

TRATAMENTO SISTÊMICO PALIATIVO DE PRIMEIRA LINHA

53

Tratamento sistêmico paliativo de 1ª linha 0- Não; 1- CDDP + Gencitabina; 2- Carboplatina + Paclitaxel; 3- Esquema SWOG (CDDP + Etoposídeo); 4- CDDP + Vinorelbina; 5- Carboplatina +Etoposídeo; 6 - Carboplatina + Gencitabina 7- Docetaxel; 8- Gencitabina; 9- Vinorelbina; 10- Paclitaxel; 11- CDDP;12- Carboplatina 13- Erlotinine 14- Gefitinibe; 15- Protocolo de pesquisa; 16- Outro; 99- Ignorado

53



55 Data de início

DD/MM/AAAA 55 ___/___/_____

56 Data de término

DD/MM/AAAA 56 ___/___/_____

TRATAMENTO SISTÊMICO PALIATIVO DE SEGUNDA LINHA

57


57

58

Se outro esquema ou se for protocolo de pesquisa, detalhar:


58

59 Data de início

DD/MM/AAAA 59 ___/___/_____

60 Data de término

DD/MM/AAAA 60 ___/___/_____

TRATAMENTO SISTÊMICO PALIATIVO DE TERCEIRA LINHA

61


61



59

63 Data de início

DD/MM/AAAA 63 ___/___/_____

64 Data de término

DD/MM/AAAA 64 ___/___/_____

RADIOTERAPIA DE 1ªSÉRIE

65 Radioterapia 1ª série

0- Não; 1- Tu primário+linfonodos; 2- Osso; 3- SNC; 4- Tórax (adjuvância); 5- Outro; 99- Ignorado

65

66 Radioterapia 1ª série - se outro


67 Data do início radioterapia 1ª série

DD/MM/AAAA 67 ___/___/_____

68 Data de término radioterapia 1ª série

DD/MM/AAAA 68 ___/___/_____



0- Não; 1- Tu primário+linfonodos; 2- Osso; 3- SNC; 4- Outro; 99- Ignorado 69




DD/MM/AAAA 71 ___/___/_____


DD/MM/AAAA 72 ___/___/_____



0- Não; 1- Tu primário+linfonodos; 2- Osso; 3- SNC; 4- Outro; 99- Ignorado 73




DD/MM/AAAA 75 ___/___/_____


DD/MM/AAAA 76 ___/___/_____

DADOS DO DESFECHO

1ª recidiva ou progressão

77 1ª recidiva

0- Não; 1- Local/regional; 2- Pulmão contra-lateral; 3- Osso; 4- SNC; 5- Fígado; 6- Outro; 99- Ignorado

77

78 Se outro local, detalhar:


79 Data da 1ª recidiva

DD/MM/AAAA 79 ___/___/_____


80 2ª recidiva


80

81 Se outro local, detalhar: 81

60



DD/MM/AAAA 82 ___/___/_____


83 3ª recidiva


83

84 Se outro local, detalhar:



DD/MM/AAAA 85 ___/___/_____

Status

86 Status

1- Vivo sem doença; 2- Vivo com doença; 3- Óbito por CA; 4- Óbito SOE; 5- Perda de seguimento 80

86

87 Data do último status

DD/MM/AAAA 87 ___/___/_____

88 Data do óbito

DD/MM/AAAA 88 ___/___/_____

61

Anexo B. Carta de aprovação do CEP

gustavo dix junqueira pinto avaliaÇÃo da … · gustavo dix junqueira pinto avaliaÇÃo da...

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