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Macapá, v. 7, n. 1, p. 38-44, 2017 Disponível em http://periodicos.unifap.br/index.php/biota Submetido em 14 de Julho de 2016 / Aceito em 16 de Fevereiro de 2017 ARTIGO Biota Amazônia ISSN 2179-5746 O uso de extratos vegetais tem sido amplamente estudado como controle biológico alternativo de doenças de plantas, especialmente aquelas causadas por fungos patogênicos. Nesse sentido, o objetivo do presente estudo foi avaliar a atividade antifúngica in vitro do extrato bruto etanólico obtido de folhas de algodão (Gossypium arboreum L., Malvaceae) em diferentes concentrações sob o desenvolvimento micelial do fungo fitopatogênico Lasiodiplodia theobromae. O ensaio foi conduzido nos Laboratórios de Microbiologia/Fitopatologia/Genética e de Cultivo/Isolamento da Universidade do Estado do Amapá/UEAP, em Macapá, Amapá. Em um Delineamento Inteiramente Casualizado (DIC), seis tratamentos e seis repetições foram organizados: T1 (controle negativo) – -1 -1 BDA (Batata-Dextrose-Ágar) + 0 mg.mL (extrato foliar); T2 - BDA + 5 mg.mL (extrato foliar); T3 - BDA + 10 -1 -1 mg.mL (extrato foliar); T4 - BDA + 20 mg.mL (extrato foliar); T5 - BDA + 2,5 mL de etanol e T6 (controle positivo) - BDA + 2,5 mL de fungicida comercial (Derosal®). As variáveis inibição do crescimento micelial (ICM), índice de velocidade de crescimento micelial (IVCM) e área abaixo da curva de cobertura de crescimento micelial (AACCM) foram calculadas ao final do experimento. Os resultados mostraram que o extrato bruto etanólico das folhas de G. arboreum não apresentou atividade antifúngica in vitro frente ao fungo L. theobromae nas concentrações testadas. O extrato induziu o crescimento micelial do fungo, especialmente na concentração -1 10 mg.mL , a qual apresentou condição ideal para o desenvolvimento das estruturas do fungo. Palavras-chave: Malvaceae, extrato vegetal, controle biológico, fitopatógeno. The use of plant extracts have been widely studied as an alternative biological control of plant diseases, especially those caused by phytopathogenic fungi. The aim of this study was to evaluate in vitro the antifungal activity of crude ethanolic extract obtained from tree cotton leaves (Gossypium arboreum L., Malvaceae) in different concentrations on mycelial development of the pathogenic fungi Lasiodiplodia theobromae. The experiment was conducted in the Microbiology/Plant pathology/Genetics and Cultivation/Isolation laboratories, the State University of Amapá/UEAP, in Macapá, Amapá. In a Completely Randomized Design (CRD), six treatments and six repetitions were organized: T1 (negative control) - PDA (Potato-Dextrose-Agar) -1 -1 -1 + 0 mg.mL (leaf extract); T2 - PDA + 5 mg.mL (leaf extract); T3 - PDA + 10 mg.mL (leaf extract); T4 - PDA + 20 -1 mg.mL (leaf extract); T5 - PDA + 2.5 mL of ethanol and T6 (positive control) - PDA + 2.5 ml of a commercial fungicide (Derosal®). The variables mycelial growth inhibition (MGI), mycelial growth velocity index (MGVI) and area under mycelial growth curve (AUMGC) were calculated at the end of the experiment. The results showed tthe crude ethanolic extract of G. arboreum leaves not presented antifungal activity in vitro against the fungus L. theobromae at the concentrations tested. The extract induced the mycelial growth, especially in a -1 concentration of 10 mg.mL , which exhibited ideal condition for the development of fungal structures. Keywords: Malvaceae; plant extract; biological control; phytopathogen. Effect of Gossypium arboreum L. (tree cotton) leaf extract against mycelial growth of Lasiodiplodia theobromae (Pat.) Griffon & Maubl. Efeito do extrato foliar de Gossypium arboreum L. (algodão) sob o crescimento micelial de Lasiodiplodia theobromae (Pat.) Griffon & Maubl. 1* 1 2 Caroline da Cruz Vasconcelos , Jaynna Gonar Lôbo Isacksson , Camila Brandão da Silva , Noelle Loyanna Lima 3 4 5 Almeida Cabral , Sheylla Susan Moreira da Silva de Almeida , Rosângela da Conceição Marques Pena 1. Engenheira Florestal (Universidade do Estado do Amapá). Mestranda em Botânica (Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, Brasil). 2. Engenheira Florestal (Universidade do Estado do Amapá). Mestranda em Biodiversidade Tropical (Universidade Federal do Amapá, Brasil). 3. Graduanda em Engenharia Florestal (Universidade do Estado do Amapá, Brasil). 4. Farmacêutica (Universidade Federal do Pará). Doutora em Química (Universidade Federal de São Carlos). Professora da Universidade Federal do Amapá, Brasil. 5. Engenheira Agrônoma (Universidade Federal Rural da Amazônia). Mestre em Agronomia (Universidade Federal de Lavras, Brasil). Professora da Universidade do Estado do Pará, Brasil. *Autor para correspondência: [email protected] Esta obra está licenciadasob uma Licença Creative Commons Attribution 4.0 Internacional DOI: http://dx.doi.org/10.18561/2179-5746/biotaamazonia.v7n1p38-44 RESUMO ABSTRACT Introdução Gossypium arboreum L. pertence à famıĺia Malvaceae sensu APG IV (BYND et al., 2016). No Brasil é uma planta exótica conhecida popularmente como algodão, bem como a maioria das espécies de Gossypium que formam o mais importante grupo de plantas de fibras no mundo (JOHN; THOMAS, 2012). Este gênero compreende 50 espécies descritas, distribuıd́ as principalmente na Africa, Austrália, Arábia, Peru, México e Brasil (FRYXELL, 1992). Dentre as espécies de algodão cultivadas e domesticadas de forma independente no mundo, quatro se destacam: Gossypium arboreum e Gossypium herbaceum representadas no Velho Mundo e Gossypium barbadense e Gossypium hirsustum no Novo Mundo (BRUBAKER et al., 1999). No Brasil, o cultivo de G. arboreum para uso interno, principalmente para fins medicinais é bastante relatado em comunidades tradicionais (BENTES-GAMA et al., 1999; COELHO-FERREIRA; JARDIM, 2005; LINHARES et al., 2015; SCOLES, 2006; SCUDELLER et al., 2009; SILVA, 2002). Diferentes partes da planta são utilizadas para o tratamento de diversas doenças e enfermidades: uso das folhas como antimalárico (ADEBAYO; KRETTLI, 2011; AJAIYEOBA et al., 2006), anti-hipertensivo, antirreumático, antidiabético (DHUNDI et al., 2012; KAZEEM et al., 2013), antitussıǵ eno, tonsilite, diurético, para queimaduras, hemorragias, gastrite, micoses e problemas respiratórios como asma; as flores são utilizadas como antitussı́geno, para combater anemia, disenteria, hemorragia (SILVA, 2002), além de hipocondria e

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Page 1: Gossypium arboreum L. (algodão) sob o crescimento micelial … · folhas coletadas da planta no entorno da Área de Proteção Ambiental do Rio Curiaú, a 8 km de Macapá. Uma amostra

Macapá,v.7,n.1,p.38-44,2017Disponívelemhttp://periodicos.unifap.br/index.php/biota

Submetidoem14deJulhode2016/Aceitoem16deFevereirode2017

ARTIGO

BiotaAmazôniaISSN2179-5746

Ousodeextratosvegetaistemsidoamplamenteestudadocomocontrolebiológicoalternativodedoençasdeplantas,especialmenteaquelascausadasporfungospatogênicos.Nessesentido,oobjetivodopresenteestudofoiavaliaraatividadeantifúngicainvitrodoextratobrutoetanólicoobtidodefolhasdealgodão(GossypiumarboreumL.,Malvaceae)emdiferentesconcentraçõessobodesenvolvimentomicelialdofungofitopatogênicoLasiodiplodiatheobromae.OensaiofoiconduzidonosLaboratóriosdeMicrobiologia/Fitopatologia/GenéticaedeCultivo/IsolamentodaUniversidadedoEstadodoAmapá/UEAP,emMacapá,Amapá.EmumDelineamentoInteiramenteCasualizado(DIC),seistratamentoseseisrepetiçõesforamorganizados:T1(controlenegativo)–

-1 -1BDA(Batata-Dextrose-Ágar)+0mg.mL (extratofoliar);T2-BDA+5mg.mL (extratofoliar);T3-BDA+10-1 -1mg.mL (extratofoliar);T4-BDA+20mg.mL (extratofoliar);T5-BDA+2,5mLdeetanoleT6(controle

positivo)-BDA+2,5mLdefungicidacomercial(Derosal®).Asvariáveisinibiçãodocrescimentomicelial(ICM),índicedevelocidadedecrescimentomicelial(IVCM)eáreaabaixodacurvadecoberturadecrescimentomicelial(AACCM)foramcalculadasaofinaldoexperimento.OsresultadosmostraramqueoextratobrutoetanólicodasfolhasdeG.arboreumnãoapresentouatividadeantifúngicainvitrofrenteaofungoL.theobromaenasconcentraçõestestadas.Oextratoinduziuocrescimentomicelialdofungo,especialmentenaconcentração

-110mg.mL ,aqualapresentoucondiçãoidealparaodesenvolvimentodasestruturasdofungo.

Palavras-chave:Malvaceae,extratovegetal,controlebiológico,fitopatógeno.

Theuseofplantextractshavebeenwidelystudiedasanalternativebiologicalcontrolofplantdiseases,especiallythosecausedbyphytopathogenicfungi.Theaimofthisstudywastoevaluateinvitrotheantifungalactivityofcrudeethanolicextractobtainedfromtreecottonleaves(GossypiumarboreumL.,Malvaceae)indifferent concentrationsonmycelialdevelopmentof thepathogenic fungiLasiodiplodia theobromae. Theexperiment was conducted in the Microbiology/Plant pathology/Genetics and Cultivation/Isolationlaboratories,theStateUniversityofAmapá/UEAP,inMacapá,Amapá.InaCompletelyRandomizedDesign(CRD),sixtreatmentsandsixrepetitionswereorganized:T1(negativecontrol)-PDA(Potato-Dextrose-Agar)

-1 -1 -1+0mg.mL (leafextract);T2-PDA+5mg.mL (leafextract);T3-PDA+10mg.mL (leafextract);T4-PDA+20-1mg.mL (leafextract);T5-PDA+2.5mLofethanolandT6(positivecontrol)-PDA+2.5mlofacommercial

fungicide(Derosal®).Thevariablesmycelialgrowthinhibition(MGI),mycelialgrowthvelocityindex(MGVI)andareaundermycelialgrowthcurve(AUMGC)werecalculatedattheendoftheexperiment.TheresultsshowedtthecrudeethanolicextractofG.arboreumleavesnotpresentedantifungalactivityinvitroagainstthefungusL.theobromaeattheconcentrationstested.Theextractinducedthemycelialgrowth,especiallyina

-1concentrationof10mg.mL ,whichexhibitedidealconditionforthedevelopmentoffungalstructures.

Keywords:Malvaceae;plantextract;biologicalcontrol;phytopathogen.

Effect of Gossypium arboreum L. (tree cotton) leaf extract against mycelialgrowthofLasiodiplodiatheobromae(Pat.)Griffon&Maubl.

EfeitodoextratofoliardeGossypiumarboreumL.(algodão)sobocrescimentomicelialdeLasiodiplodiatheobromae(Pat.)Griffon&Maubl.

1* 1 2CarolinedaCruzVasconcelos ,JaynnaGonarLôboIsacksson ,CamilaBrandãodaSilva ,NoelleLoyannaLima

3 4 5AlmeidaCabral ,SheyllaSusanMoreiradaSilvadeAlmeida ,RosângeladaConceiçãoMarquesPena

1.EngenheiraFlorestal(UniversidadedoEstadodoAmapá).MestrandaemBotânica(InstitutoNacionaldePesquisasdaAmazônia,Brasil).2.EngenheiraFlorestal(UniversidadedoEstadodoAmapá).MestrandaemBiodiversidadeTropical(UniversidadeFederaldoAmapá,Brasil).3.GraduandaemEngenhariaFlorestal(UniversidadedoEstadodoAmapá,Brasil).4.Farmacêutica(UniversidadeFederaldoPará).DoutoraemQuímica(UniversidadeFederaldeSãoCarlos).ProfessoradaUniversidadeFederaldoAmapá,Brasil.5.EngenheiraAgrônoma(UniversidadeFederalRuraldaAmazônia).MestreemAgronomia(UniversidadeFederaldeLavras,Brasil).ProfessoradaUniversidadedoEstadodoPará,Brasil.*Autorparacorrespondência:[email protected]

EstaobraestalicenciadasobumaLicençaCreative Commons Attribution 4.0 Internacional

DOI:http://dx.doi.org/10.18561/2179-5746/biotaamazonia.v7n1p38-44

RESUMO

ABSTRACT

IntroduçãoGossypium arboreum L. pertence a famılia Malvaceae

sensu APG IV (BYNDet al., 2016).NoBrasil e umaplantaexoticaconhecidapopularmentecomoalgodao,bemcomoamaioria das especies de Gossypium que formam o maisimportante grupo de plantas de fibras nomundo (JOHN;THOMAS, 2012). Este genero compreende 50 especiesdescritas, distribuıdas principalmente na A� frica, Australia,Arabia, Peru,Mexico e Brasil (FRYXELL, 1992). Dentre asespecies de algodao cultivadas e domesticadas de formaindependente no mundo, quatro se destacam: Gossypiumarboreum eGossypiumherbaceum representadasnoVelhoMundoeGossypiumbarbadense eGossypiumhirsustumnoNovoMundo(BRUBAKERetal.,1999).

No Brasil, o cultivo de G. arboreum para uso interno,principalmenteparafinsmedicinaisebastanterelatadoemcomunidades tradicionais (BENTES-GAMA et al., 1999;COELHO-FERREIRA;JARDIM,2005;LINHARESetal.,2015;SCOLES, 2006; SCUDELLER et al., 2009; SILVA, 2002).Diferentespartesdaplantasaoutilizadasparaotratamentodediversasdoenças e enfermidades:usodas folhas comoantimalarico(ADEBAYO;KRETTLI,2011;AJAIYEOBAetal.,2006), anti-hipertensivo, antirreumatico, antidiabetico(DHUNDIetal.,2012;KAZEEMetal.,2013),antitussıgeno,tonsilite,diuretico,paraqueimaduras,hemorragias,gastrite,micoseseproblemasrespiratorioscomoasma;asfloressaoutilizadas como antitussıgeno, para combater anemia,disenteria,hemorragia(SILVA,2002),alemdehipocondriae

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inflamaçõesbrônquicas(DHUNDIetal.,2012);folhas,floresecascasemconjuntosãoutilizadoscomodiuréticoecontraasma; sementes como antitussígeno (SILVA, 2002),antipirético e o óleode semente é utilizado externamenteparalimparmanchasesardasdapele(DHUNDIetal.,2012);ofrutoéusadonocombateàsmicoses(SILVA,2002),eainda,relatadopararetençãodeplacenta(WONDIMUetal.,2007).

A maioria dos estudos que buscaram investigar apresença de compostos químicos nas diferentes partes daplanta de G. arboreum obtiveram resultados satisfatórios,principalmente porque a maioria dos compostosencontradosestãobiologicamente relacionados comousopopularmedicinaldessaplanta(ANNAN;HOUGHTON,2008;HEDIN et al., 1992;MIRA-NETO; ALMEIDA, 2015; SAIDU;ABDULLAHI,2011;WAAGE;HEDIN,1984;WONDIMUetal.,2007). Vale ressaltar ainda que, as plantas de Gossypiumcontêm o gossipol, um aldeído triterpenoide que tempropriedades antitumorais (COYLE et al., 1994), além deinseticidaseantimicrobianas(WAAGE;HEDIN,1984),oqueconfere resistência da planta frente a estes organismos(BRINK;ACHIGAN-DAKO,2012).Inclusive,háregistrodequeoextratodafolha,bemcomodeoutraspartesdaplantadeG.arboreum, apresentam atividade antibacteriana (ANNAN;HOUGHTON, 2008; SAIDU; ABDULLAHI, 2011). Contudo,estudosacercadousodoextratofoliardeG.arboreumparaocontroledefungosfitopatogênicosaindasãoincipientes.

Naturalmente,muitasplantaspodemoferecerresistênciafrente aos diferentes patógenos associados (LEMOS et al.,1990). Essa resistência pode estar relacionada com apresençadesubstânciasinibitórias(compostossecundários)queagemdiretaouindiretamenteativandoosmecanismosdedefesadasplantas(STANGARLINetal.,2011).Alémdisso,apresençadessassubstânciaspodecontribuirparaousonocontrolededoençasfitopatogênicas,inclusiveemdiferentesplantas,umavezqueestassãoresponsáveisporcausarasmaioresperdasdeculturasnoBrasil,especialmenteàquelasdeimportânciaeconômica(RIBEIRO;BEDENDO,1999).

Parareduzirosdanoscausados,métodosfísicos,químicosebiológicosvêmsendoamplamenteempregados(ECKERT;OGAWA, 1985; SITTON; PATTERSON, 1992; WILSON;WISNIEWSKI,1994).Ousodeagroquímicos,porexemplo,contribui para o aumento da produtividade agrícola,entretantotemsidoresponsávelporcausarefeitosadversosao meio ambiente e à saúde humana (BASTOS;ALBUQUERQUE, 2004; STANGARLIN et al., 2011). Nessesentido,ousodeextratosvegetaisvisandoaexploraçãodepropriedades tóxicas aos diferentes patógenos vem semostrandoumaalternativadecontrole(ARAÚJOetal.,2013).Essemétodopodeserumaalternativaviável,sejadopontodevista econômico, seja do ponto de vista ambiental(RODRIGUESetal.,2006).

Éimportanteressaltarqueademandaporessesprodutosalternativosécrescenteediversosestudostêmregistradoaeficiência de extratos vegetais empromover a inibição dodesenvolvimentodeváriosfitopatógenosdenaturezafúngica(BARRERA-NECHA et al., 2009; BERNARDO et al., 2015;KURITAetal.,1981;PEREZ-SÁNCHESetal.,2007;RIBEIRO;BEDENDO, 1999; RODRIGUES et al., 2006; SCHWAN-ESTRADAetal.,2000;WILSONetal.,1997).Adeterminaçãodabioatividadedosextratosvegetaispodecontribuirparaaaquisição de maiores conhecimentos que reforcem sua

possívelutilizaçãocomoummétodoalternativodecontrolededoençadeplantas(SCHWAN-ESTRADAetal.,2000).

Lasiodiplodiatheobromae(Pat.)Griffon&Maubl.pertenceà Botryosphaeriaceae, sendo um fungo amplamentedistribuídoemregiõestropicaisetemperadas(CRUZ-AVILÉSet al., 2001). Botryosphaeriaceae possui distribuiçãocosmopolita,sendoumafamíliaricaemespéciesqueincluipatógenos de uma grande variedade de plantas deangiospermasegimnospermas(BARR,1987;BHADRAetal.,2014; CHEN et al., 2011). Os membros dessa família sãogeralmentetratadoscomopatógenosoportunistasdevidoasdoenças que eles causam, as quais são quase sempreassociadascomalgumtipodeestresseouferimento(CIESLAetal.,1996,SLIPPERS;WINGFIELD,2007).

Lasiodiplodia theobromae está associado a diferentesdoenças como podridão-seca; cancro em ramos, caules eraízes; lesões em estacas, folhas, frutos e sementes;resultandoinclusivenamortedaplanta(CIESLAetal.,1996;OLD; DAVISON, 2000; ROUX et al., 2001; SHEARER et al.,1987; SMITH et al., 1994). Além disso, este fungo podecolonizartecidossaudáveisdeplantassemexibirsintomas(MOHALI et al., 2005). L. theobromae pode ocorrerprincipalmenteemárvoresdeEucalyptusspp.,Pinusspp.eSyzigium spp. (PAVLIC et al., 2007; SLIPPERS et al., 2009;SMITHetal.,1996).Contudo,muitosBotryosphaeriaceaequeocorrem em Eucalyptus também já foram registrados emoutroshospedeiros.

No Brasil, por exemplo, em diversas culturas deimportância econômica L. theobromae já foi relatado, taiscomo:abacate(Perseaamericana,Lauraceae),banana(Musaspp.,Musaceae),acerola(Malpighiaglabra,Malpighiaceae),cajueiro (Anacardium occidentale, Anacardiaceae), citrus(Citrusspp.,Rutaceae),coqueiro(Cocosnucifera,Arecaceae),pinha (Annona squamosa, Annonaceae), vinha (Vitis sp.,Vitaceae), goiaba (Psidium guajava, Myrtaceae), manga(Mangifera indica, Anacardiaceae), melão (Cucumis melo,Cucurbitaceae),maracujá(Passifloraedulis,Passifloraceae),graviola (A. muricata, Annonaceae), melancia (Citrulluslanatus, Cucurbitaceae) (FREIRE et al., 2003; TAVARES,2002;)eatémesmoemespéciesflorestaisnativas,comooparicá(Schizolobiumparahybavar.amazonicum,Fabaceae)(TREMACOLDI et al., 2009). No caso dos eucaliptos(Eucalyptus spp., Myrtaceae), este fitopatógeno éconsiderado uma ameaça significativa para a produção esustentabilidade das plantações (MOHALI et al., 2009;RODASetal.,2009).

Diantedisso,oobjetivodopresenteestudofoiavaliaropotencialfungitóxico,invitro,doextratobrutoetanólicodeGossypium arboreum L. (algodão) em diferentesconcentraçõessobodesenvolvimentomicelialdopatógenoL.theobromae.

MaterialeMétodos

ObtençãodoextratoedofitopatógenoO estudo foi realizado em setembro de 2013 nos

Laboratórios de Microbiologia/Fitopatologia/Genética e deCultivo/IsolamentodocampusIdaUniversidadedoEstadodoAmapá/UEAP,localizadaemMacapá,Amapá.

Para a conduçãodo experimento foi utilizado o extratobrutoetanólicodeG.arboreum,oqualfoiobtidoapartirde

39BiotaAmazônia

EfeitodoextratofoliardeGossypiumarboreumL.(algodão)sobocrescimentomicelialdeLasiodiplodiatheobromae(Pat.)Griffon&Maubl.

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folhascoletadasdaplantanoentornodaÁreadeProteçãoAmbientaldoRioCuriaú,a8kmdeMacapá.Umaamostracoletada da planta foi herborizada, sendo devidamenteidentificada e depositada na coleção do Herbário daUniversidade Federal do Amapá/HUFAP, sob número deregistro 427. O extrato foi produzido e analisadofitoquimicamente no Laboratório de Farmacognosia eFitoquímicadaUniversidadeFederaldoAmapá/UNIFAP.

Amostras do material coletado foram colocadas emestufa a uma temperaturamédia de 45 ºC e, em seguida,moídas por rasuraçãomanual com auxílio de almofariz epistilo.Oextratofoiobtidoporextraçãoaquentesobrefluxocomousodeálcooletílico96%(EtOH)comosolvente.Emseguida, o extrato foi filtrado e concentrado em rotoevaporadorsobtemperaturade50ºCepressãoreduzida.

Para a triagem fitoquímica foram realizadas reaçõesanalítico-qualitativas para identificação de flavonoides,alcaloides, fenois e taninos, esteroides e triterpenoides,depsídeosedepsidonas,ácidosorgânicos,polissacarídeos,açúcaresredutores,saponinasespumídicas,antraquinonaseresinas(BARBOSAetal.,2004).

Para realizaçãodo ensaiomicrobiológico, utilizou-se opatógenoL.theobromaeobtidonacoleçãofitopatológicadaUEAP. Este fungo foi oriundodo caule deEucalyptus spp.(amostrascedidaspelaempresaAmapáFlorestaleCeluloseS/A–AMCEL).

DelineamentoexperimentalParaadeterminaçãoinvitrodaatividadeantifúngicado

extratofoliardeG.arboreum,preparou-seinicialmentetrês-1concentrações:5,10e20mg.mL .Asconcentraçõesforam

adicionadas em meio de cultura BDA (Batata-Dextrose-Ágar) sintético, suplementado com cinco gotas doantibióticocloranfenicolevertidoemplacasdePetride9cmdediâmetro.Apósasolidificaçãodomeiodecultura,discosdemicélio(cercade4mmdediâmetro)deL.theobromaecultivado em BDA foram transferidos para o centro dasplacasdecadatratamento,asquaisforamorganizadasemDelineamento Inteiramente Casualizado (DIC), com seistratamentoseseisrepetições:T1(controlenegativo)-BDA+

-1 -10mg.mL (extrato foliar); T2 - BDA + 5mg.mL (extrato-1foliar);T3-BDA+10mg.mL (extratofoliar);T4-BDA+20

-1mg.mL (extratofoliar);T5-BDA+2,5mLdeetanoleT6(controlepositivo)-BDA+2,5mLdefungicidacomercial

(Derosal®).Posteriormente,asplacasforamvedadascomfilme plástico e colocadas em incubadora do tipo B.O.D.(DemandaBioquímicadeOxigênio)sobtemperaturade25±2°Cemfotoperíodode12horas.

AvaliaçãodoexperimentoApós24horasda inoculação, iniciou-seaavaliaçãodo

crescimento micelial do patógeno L. theobromaediariamenteacada24horas,durantesetedias.Parareduçãodo efeito natural de deformação das colônias foramregistradasasmédiasdosdiâmetrosdascolôniasatravésdequatro medidas, em sentidos perpendiculares entre si. Apartir dos dados obtidos durante a avaliação diária, asseguintes variáveis foram calculadas: inibição docrescimentomicelialICM(%)=(D-d).100/D,emqueDéodiâmetro de crescimento do controle e d o diâmetro dasplacas com tratamento (BASTOS, 1997); índice develocidadedecrescimentomicelial IVCM=∑(D-D )/n,ema

queDéodiâmetroatualdacolônia,D édiâmetrodacolôniaa

do dia anterior e n a duração do período de avaliação(OLIVEIRA,1991);eáreaabaixodacurvadecrescimentomicelialAACCM=[∑(y+y )/2.d ]/n,emquey ey sãoosi i+1 ti i i+1

valores de crescimento da colônia observados em duasavaliaçõesconsecutivas,d ointervaloentreasavaliaçõesenti

aduraçãodoperíododeavaliação(CAMPBELL;MADDEN,1990).

AnálisedosdadosOsdadosforamsubmetidosaotestenão-paramétricode

Kruskal-Wallis(OneWayAnalysisofVarianceonRanks)aoníveldesignificânciaα>0,05,seguidopelotestedeDunncomcomparaçõesmúltiplasparadeterminarasignificânciadas diferenças entre os tratamentos. Para a análiseestatística, o programa Assistat 7.7 versão beta (ASSIS;SILVA,2014)foiutilizado.

ResultadosOs resultados obtidos quanto ao efeito fungitóxico do

extrato bruto etanólico de G. arboreum frente aofitopatógenoL.theobromaeestãorepresentadosnaTabela1.De acordo com as avaliações realizadas aos 7 dias deincubação,nenhumadasconcentraçõesdoextratotestadasforam eficientes na redução do crescimento micelial do

-1fungo,principalmenteaconcentraçãode10mg.mL (T3).

40BiotaAmazônia

CarolinedaCruzVasconcelos,JaynnaGonarLôboIsacksson,CamilaBrandãodaSilva,NoelleLoyannaLimaAlmeidaCabral,SheyllaSusanMoreiradaSilvadeAlmeida,RosângeladaConceiçãoMarquesPena

Tabela1.ResultadosobtidosparaoextratodeG.arboreumsobocrescimentomicelialdeL.theobromae.OsvaloresqueestaorepresentadospelasmesmasletrasnaodiferemestatisticamenteentresipelascomparaçoesmultiplasdotestedeKruskal-Wallis(α>0,05)./Table1.ResultsobtainedfortheextractofG.arboreumagainstmycelialgrowthofL.theobromae.ThevaluesrepresentedbythesamelettersnotdifferstatisticallyfromeachotherbymultiplecomparisonsoftheKruskal-Wallistest(α>0.05).

TratamentosD iametrofinal

(cm)*ICM(%) IVCM(cm.dia-1) AACCM

T1-0mg.mL-1(controlenegativo) 4,25 ab 0,00 ab 0,38 ab 3,41 ab

T2-5mg.mL-1(extrato) 4,30 ab -1,14 ab 0,43 abc 3,42 ab

T3-10mg.mL-1(extrato) 4,50 b -5,84 b 0,47 c 3,58 b

T4-20mg.mL-1(extrato) 4,30 ab -1,27 ab 0,44 bc 3,45 b

T5-2,5mLetanol(controlepositivo) 3,56 ab 16,49 ab 0,41 bc 2,82 ab

T6-2,5mLfungicida(controlepositivo) 0,00 a 100,0 a 0,00 a 0,00 a

*Diametrodacolonianosetimodiadeavaliaçao./Colonydiameterontheseventhdayofevaluation.

ParaasvariaveisdiametrofinaleICMnaohouvediferençaestatıstica significativa entre os tratamentos T2, T4 e T5quandocomparadosaocontrolenegativo(T1).Otratamento

T3apresentouamaiormediadecrescimentoemdiametroe,consequentemente, uma inibiçao de crescimento micelialnegativaparaL.theobromae.

Diâmetro�inal(cm)*

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Considerando a variável IVCM, o tratamento T3apresentou a maior média em velocidade de crescimento

-1micelial(0,47cm.dia ),seguidodostratamentosT5eT4,osquaisnãodiferiramestatisticamenteentresi.ÉinteressanteobservarquenotratamentoT1(controlenegativo),avariávelIVCMapresentouumvalormaisbaixoemcomparaçãocomostratamentosT2,T3eT4(concentraçõesdoextrato).

Com base na variável AACCM, os tratamentos T3 e T4apresentaram as maiores médias e não diferiramestatisticamente entre si. Para os tratamentos T1, T2 e T5também não houve diferença estatística significativa. Alémdisso,comoumresultadoesperado,paratodasasvariáveis,otratamento com fungicida (T6) foi 100% satisfatório naredução do crescimento micelial, demonstrando a altasensibilidadedeL.theobromaeaestequímico.

Vale ressaltar que, após os sete dias de avaliação foi-1possívelobservarqueasconcentraçõesde10mg.mL (T3)e

-1de 5 mg.mL (T2) do extrato foliar de G. arboreum semostraramideaisparaodesenvolvimentodeL.theobromae,isto porque as placas dos respectivos tratamentosapresentaram um desenvolvimento mais acelerado emrelaçãoasestruturasreprodutivasdofungo(Figura1A-B).

-1Naconcentraçãode20mg.mL (T4)épossívelobservarqueodesenvolvimentodasestruturasdeL.theobromae foisimilarà concentraçãodeetanol (T5) (Figura1A),oqueécorroboradotambémnaTabela1paraamaioriadasvariáveisem que não há diferença estatística entre estes doistratamentos.

DiscussãoO extrato foliar deG. arboreum teve um efeito inverso,

induzindoocrescimentomicelialdeL.theobromae(Tabela1eFigura1A).Naturalmente,areduçãodocrescimentomicelialéconsequentedaaçãofungitóxicadassubstânciaspresentesnacomposição das plantas bioativas. No entanto, Carvalho(2010)explicaque,casooextratovegetalnãomanifesteefeitofungitóxicooufungiestático,asuacomposiçãoemtermosde

substâncias importantes no metabolismo do fungoenriquecerá a composição nutritiva do meio de culturaproduzindo o efeito inverso. Possivelmente, isto explica oefeitoobservadocomoextratodeG.arboreumparaastrêsconcentraçõestestadasnesteestudo.

-1Embora as concentrações de 5 mg.mL (T2) e de 10-1mg.mL (T3)tenhamproporcionadoocrescimentomicelial

de L. theobromae e o desenvolvimento de suas estruturasreprodutivas (Figura 1B), a tendência deveria ser que na

-1concentração de 20 mg.mL (T4) o mesmo padrão semantivesse,conformeoaumentodadosedoextratofoliardeG.arboreum.Noentanto,apesardocrescimentomicelialdeL.theobromaeterocorridonoT4,estefungonãosedesenvolveuemumcurtoperíodosuaestruturavegetativa,bemcomonãoocorreu esporulação, assim como observado para ostratamentosT2eT3(Figura1A).Istosugerequetalvezemconcentraçõesmaioresdoextrato,oefeitofungitóxicopossasersatisfatóriofrenteaoL.theobromaeouatémesmoaoutrosfungosfitopatogênicos.

A exemplodisso, umestudo realizadoporOkafor et al.(2001) com o extrato bruto das folhas de quatro espéciesincluindo G. arboreum mostrou que esta espécie inibiu ocrescimentomicelialdetrêsespéciesfúngicas:Trichophytonrubrum, Basidiobolus haptosporus e Ephidermophyton

-1floccosumnasconcentraçõesentre25e100mg.mL ,concen-trações mais altas quando comparadas às concentraçõestestadasnestetrabalho.

Domesmomodo, Menegassi et al. (2008) trabalharamcom uréases (metaloenzimas) extraídas das sementes deGossypium hirsutum e verificaram que as mesmas podemdesempenharefeitotantoantifúngicoquantofungistático,ouatémesmomatarosesporosfúngicos,inibindoagerminaçãodosfungosfitopatogênicos:Colletotrichummusae,CurvularialunetaePenicilliumherguei.

Recentemente, Mira-Neto e Almeida (2015) testaram oefeito do extrato bruto das folhas deG. arboreum emdoisensaios:primeiro,frenteàsbactériasStaphylococcusaureus,EscherichiacolieKlebsiellapneumoniaenasconcentraçõesde25mg/mL, 50mg/mL e 100mg/mLdo extrato; segundo,frente às larvas de Artemia salina nas concentrações 50µg/mL,100µg/mL,250µg/mL,500µg/mL,750µg/mLe1000µg/mL.OsresultadosforamsatisfatóriosapenasparaoensaiodetoxicidadedeA.salina,emqueaconcentraçãoletalfoideCL50=238µg/mL,comtoxicidadeagudaparamaisde50%dapopulação.

Por outro lado, Aladesanmi et al. (2007) testaram aspropriedades de extratosmetanólicos de 10 espécies comusosetnomedicinaisnaNigéria,dentreelesodacascadeG.arboreum, contudo, estes autores não encontrarampropriedadesantibacterianase/ouantifúngicas, tal comooresultado encontradoneste estudopara como extratodasfolhasdestaespécie.

DiversosestudosbuscaramalternativasparaocontroledeL.theobromae,umproblemanotoriamentelimitanteparaafruticultura tropical, emespecialparaoNordestedoBrasil(OLIVEIRAetal.,2012)eumagentecausadordedoençasemplantios de Eucalyptus spp., inclusive já registrado para oestado do Amapá (PINTO, 2013). Lima et al. (2010), porexemplo,testaraminvitrooefeitofungitóxicodeseisextratosde plantas nativas da Caatinga frente ao L. theobromae econcluíram que o extrato de alecrim-do-campo (Lippia

41BiotaAmazônia

EfeitodoextratofoliardeGossypiumarboreumL.(algodão)sobocrescimentomicelialdeLasiodiplodiatheobromae(Pat.)Griffon&Maubl.

Controlenegativo

-15mg.mL(extrato)

-110mg.mL(extrato)

-120mg.mL(extrato)

2,5mLdeetanol

2,5mLdefungicida

A

B

12µm

FRENTE

VERSO

FRENTE

VERSO

Figura1.A-DesenvolvimentomicelialdeL.theobromaeemmeiodeculturaBDAassociadoaoextratobrutoetanolicodasfolhasdeG.arboreum,apossetediasdeinoculaçao.B-EsporosdeL.thebromae,isoladodeEucalyptusspp.ecultivadoemmeiodeculturaBDA./Figure1.A-MycelialdevelopmentofL.theobromaeinPDAculturemediaassociatedwiththecrudeethanolicextractofG.arboreumleaves,after seven days of inoculation. B - Spores of L. theobromae, isolated fromEucalyptusspp.andcultivatedinPDAculturemedia.

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microphylla,Verbenaceae)apresentouomaiorpercentualdeinibiçãodocrescimentomicelialdestefungo,oqueconsisteemumaalternativaviávelparaocontroledeL.theobromae.

Adeniyi e Joseph (2015) também avaliaram a açãofungitóxica in vitro de quatro extratos vegetais (Acalyphahispida, Euphorbiaceae; Chromolaena odorata, Compositae;Tetrapleura tetraptera, Fabaceae; e Azadirachta indica,Meliaceae) frente ao L. theobromae e também obtiveramresultados satisfatórios, uma vez que todos os extratosapresentaram efeito positivo em inibir o crescimento dofungo.

NoestudorealizadoporMotaetal.(2002),oextratofoliardeL.sidoides(Verbenaceae)eosóleosessenciaisdeL.sidoidesePiperaduncum(Piperaceae)foramosquecontrolarammaiseficientementeocrescimentomicelialdeL.theobromae.Comapenas12mLdoextrato foliardeL.sidoides,a inibição foisuperiora90%.Feitosa(2000)tambémobteveocontroledeL.theobromaeutilizandoextratosdeplantasmedicinais,comoarnica(Arnicamontana,Compositae),juá(Ziziphusjoazeiro,Rhamnaceae), manjericão-branco (Ocimum basilicum,Lamiaceae)ealfavaca(O.gratissimum,Lamiaceae),obtendoinibição de 60%, 62%, 91% e 100%, respectivamente, nocrescimentomicelialdessepatógeno.

Emcontrapartida,Bhadraetal.(2014)estudaramoefeitoantagônico de espécies de Trichoderma – agentes debiocontrole conhecidamentemuitoeficazescontradiversospatógenos–frenteaoL.theobromaeeverificaramqueT.virideapresentou inibição máxima, com melhor desempenhoinclusiveemcomparaçãoaosfungicidascomerciaistambémtestadosnoestudo.

Vale ressaltar que embora propriedades antitumorais,inseticidaseantimicrobianastenhamsidorelatadas(ANNAN;HOUGHTON, 2008; HEDIN et al., 1992; MIRA-NETO;ALMEIDA,2015;SAIDU;ABDULLAHI,2011;WAAGE;HEDIN,1984;WONDIMUetal.,2007),devidoaosdiversoscompostosquímicos presentes nas partes da planta deG. arboreum –justificados pelo uso na medicina popular – o seu efeitoantifúngicofrenteaoL.theobromaefoiineficaz.

Mira-NetoeAlmeida(2015),apósatriagemfitoquímicadoextrato foliar de G. arboreum, detectaram a presença dosseguintes compostos químicos: alcaloides, fenois e taninos,saponinas espumídicas, depsídeos e depsidonas, além deesteroides e triterpenoides. No entanto, com base nosresultadosobtidosnesseestudonãoépossívelinferirsobrequal substância presente no extrato foliar de G. arboreumpossa ter enriquecido o meio de cultura e favorecido odesenvolvimentodeL.theobromae.

ConclusãoOextratobrutoetanólicodasfolhasdeG.arboreumnão

apresentouatividadeantifúngica in vitro frenteao fungoL.theobromae nas concentrações testadas. Os resultadosmostraramque o extrato pode ter induzido o crescimento

-1micelialdofungo,especialmentenaconcentração10mg.mL ,a qual apresentou aparentemente condição ideal para odesenvolvimentodofungo.Emconcentraçõesmaiores,talvezoextratodeG.arboreumpossaterefeitopositivonareduçãodocrescimentomicelialdeL.theobromaeouatémesmodeoutrospatógenos.Paraisto,maisestudossãonecessários.

AgradecimentosOs autores agradecem à Universidade do Estado do

Amapá/UEAPe àUniversidadeFederal doAmapá/UNIFAPpelasinfraestruturascedidasparaaexecuçãodestetrabalho,alémdaempresaAmapáFlorestaleCeluloseS/A-AMCELporcederamostrasdofitopatógeno.

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42BiotaAmazônia

CarolinedaCruzVasconcelos,JaynnaGonarLôboIsacksson,CamilaBrandãodaSilva,NoelleLoyannaLimaAlmeidaCabral,SheyllaSusanMoreiradaSilvadeAlmeida,RosângeladaConceiçãoMarquesPena

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CarolinedaCruzVasconcelos,JaynnaGonarLôboIsacksson,CamilaBrandãodaSilva,NoelleLoyannaLimaAlmeidaCabral,SheyllaSusanMoreiradaSilvadeAlmeida,RosângeladaConceiçãoMarquesPena