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Gentica e Biologia Molecular

Genmica e principais tecnologias utilizadas na transferncia de DNA7

Roteiro da semana

Genmica Como o genoma humano foi sequenciado Tcnicas de Biologia Molecular Enzimas de restrio cortam o DNA em sequncias especficas Plasmdeos, Vrus e Cromossomos artificiais (YAC) so usados como vetores para

carregar sequncias de DNA RNAm convertido em DNAc por reaes enzimticas Bibliotecas de DNA genmico representam sequncias completas de organismos Mtodos de sequenciamento de DNA Genes podem ser sintetizados a partir de oligonucleotdeos A reao da Polimerase em cadeia amplifica regies especficas de um DNA-alvo

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77semana 7 Genmica e principais tecnologias utilizadas na transferncia de DNA

Incio de conversaO mundo da gentica vem sofrendo grandes transformaes com os avanos significati-

vos que esto ocorrendo, em velocidade surpreendente, nas tcnicas de biologia molecular.O novo campo da gentica molecular foi criado, levando clonagem de genes e

caracterizao de mutaes responsveis por diversas doenas genticas. Tcnicas de sequenciamento do DNA foram aprimoradas com a introduo de sequenciamento em larga escala, de anlises de bioinformtica das sequncias completas de genomas, de estratgias de anlise e ava-liao desse volume enorme de informaes geradas.

GenmicaA genmica teve incio com o desenvolvimento do sequenciamento em larga esca-

la, a partir de 1980, e a implantao de estratgias de anlise e avaliao desse volume enorme de informaes geradas. Tornou-se possvel, dessa forma, estabelecer estratgias de pesquisa envolvendo o conhecimento do genoma completo de um indivduo. O volume de informaes em larga escala levou ao desenvolvimento da bioinformtica, com o uso de computadores potentes para que pudesse integrar e analisar esse gigantesco volume de informaes simultaneamente.

Como o genoma humano foi sequenciadoO projeto Genoma Humano (PGH) foi iniciado oficialmente em outubro de 1990,

com previso de finalizao em 2005 e com um oramento estimado em 3 bilhes de dlares. O objetivo principal era o de determinar a sequncia dos 3 bilhes de pares de bases que compem os 24 cromossomos do genoma humano (22 autossomos e os cromossomos sexuais X e Y) , e identificar todos os genes que ele contm. O PGH, com fundos pblicos comeou sob a direo de James Watson, codescobridor da estrutura da dupla hlice do DNA, e resultou das iniciativas do DOE (Departamento de Energia) e NIH (Instituto Nacional da Sade) dos EUA, que estabeleceram vrios centros genmicos em universidades americanas com posterior alcance internacional. Grupos de pesquisadores de diversos pases como a Inglaterra, Frana, Alemanha, Japo e Brasil se juntaram e um fundo pblico internacional foi investido no projeto Genoma Humano. Surgiu ento um organismo de coordenao internacional chamado HUGO (Human Genome Organiza-tion), para sintonizar o trabalho e organizar o conhecimento adquirido em um banco de dados centralizado, o Genome Database. A misso do HUGO era facilitar e coordenar a iniciativa global de mapear, sequenciar e analisar funcionalmente o genoma humano, e promover a aplicao desses conhecimentos ao melhoramento da sade humana.

O Brasil tambm deu sua cota de contribuio ao projeto, com iniciativas de pesquisa-dores brasileiros da USP, que clonaram genes para vrias doenas genticas. Uma inicia-tiva conjunta da FAPESP e diversas universidades levou ao sequenciamento do genoma da bactria Xilela fastidiosa, que causa a doena dos laranjais, chamada amarelinho, e criao do Projeto Genoma Humano do Cncer.

Foi tambm foco do programa abordar os aspectos ticos, legais e sociais envolvidos, pois, alm da descoberta da posio de cada gene e sua composio, que seria valiosa

Assista ao vdeo sobre o Projeto Genoma.

http://www.odnavaiaescola.com.br/download/Filme_Projeto_Genoma_Humano.wmv

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Gentica e BioloGia Molecular78

para diagnstico e tratamento de muitas doenas, previa-se e temia-se o perigo do uso indevido das informaes genticas geradas.

Em meados da dcada de 1990, uma grande quantidade de dados de mapas fsicos e genticos humanos e murinos, bem como sequncias de DNAc humanas, de bactrias e levedura foram disponibilizadas para a comunidade cientfica, mostrando a importncia do projeto. Dessa forma, grande quantidade de dados de mapeamento fsico e gentico, bem como de sequncias de DNA, comeou a ser depositada nos bancos de dados e dis-ponibilizada imediatamente para uso dos pesquisadores. Isto mudou significativamente a forma de conduzir pesquisas em gentica.

Dois grupos independentes, um pblico e outro privado, competiram para sequenciar o genoma humano, e a sequncia rascunho foi anunciada em 2000, por ambos, atravs de publicaes nas revistas Nature (IHFSC) e Science (Celera). Apesar de ainda incompletos, estes continham a maior informao do genoma humano j noticiada. Um resultado sur-preendente foi o menor nmero de genes encontrado, cerca de 30.000 a 40.000, quando se acreditava que os seres humanos teriam ao redor de 100.000 genes. Isto significa que a complexidade de uma espcie no diretamente proporcional ao nmero de genes. A disponibilizao desses dados gerou um avano muito grande na localizao de novos genes ligados a doenas mendelianas, facilitando muito o acesso sequncia e mapas genticos.

Um grande problema que se imps ao sequenciamento do genoma humano estava relacionado com a enorme quantidade de sequncias repetitivas, que geraram um grande desafio tcnico, por causa da dificuldade de seu sequenciamento. A presena de sequ-ncias repetitivas curtas AT ou CG, presentes em centenas de milhares no genoma huma-no, longas, dispersas ao longo do genoma em todos os cromossomos, causou grandes dificuldades para a amplificao de sequncias ou montagem das leituras pelas tcnicas utilizadas na poca. Assim, decidiu-se concentrar esforos nas sequncias nicas, que so as que contm as informaes importantes. Grandes esforos foram ento concentrados para sequenciar o DNAc. Os DNAcs so produzidos por transcrio reversa dos RNAs mensageiros, no contendo ntrons, ou sequncias intergnicas no-codificantes. O seu uso para o sequenciamento levou reduo significativa na quantidade de sequencia-mento. O sequenciamento de fragmentos de DNAcs foi muito til na confirmao e validao na montagem da sequncia do genoma humano, e atualmente existem bancos de dados pblicos, que disponibilizam sequncias geradas a partir de RNAms de vrios tipos de tecidos e clulas humanas.

Posteriormente, retomou-se o sequenciamento do DNA total humano, visto que mui-tas regies no-codificantes do genoma tm funo importante, tais como as sequncias reguladoras da transcrio e os stios de processamento.

O fechamento final da sequncia do genoma exigiu ateno especial s regies- pro-blema; um grande trabalho adicional foi necessrio para preencher as falhas e corrigir os erros no rascunho da sequncia e finaliz-la. A sequncia final foi anunciada em julho de 2003 e cobriu mais de 99% das regies de eucromatina do genoma humano.

A empresa Celera fez o pedido da patente dos 6.500 genes que mapeou, o que gerou problemas de ordem tica, pois isso poderia inviabilizar a produo de medicamentos baseados nesse conhecimento. Portanto, o presidente americano declarou que o geno-ma humano no poderia ser patenteado.

O desenvolvimento de tecnologias de sequenciamento de alta resoluo, capazes de gerar leituras de sequncias mais longas, com maior rapidez e preciso, reduziu muito o

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custo do sequenciamento de DNA. A grande expectativa de contnuas redues de custo levou diversas companhias a propor o sequenciamento personalizado de cada indivduo, em busca do genoma de US$ 1.000,00.

Atualmente, j existem muitos genomas humanos personalizados decifrados no mundo e, em 2011, uma colaborao internacional pretende completar mais 1.000, com indiv-duos representativos de todos os continentes. Os resultados sugerem que a variabilidade entre as bases nitrogenadas dos seres humanos bem maior (estimada em 1%) do que se imaginava (a estimativa era de 0,1%). O pequeno nmero de genes encontrados sugere tambm que a complexidade humana provavelmente se deve maior complexidade no funcionamento desses genes, que poderiam se organizar para origi-nar um nmero maior de protenas (projeto genoma). Esses novos dados envolvem a reviso de muitos conceitos bsicos da biologia, incluindo o dogma central de um gene uma protena.

Caractersticas Importantes do Genoma Humano O genoma humano contm 3,1 bilhes de nucleotdeos, mas as sequncias codifi-

cadoras de protenas constituem apenas cerca de 3% do genoma. A sequncia genmica tem ~99,9% de semelhana em indivduos de todas as nacio-

nalidades. Os polimorfismos de nucleotdeos nicos (do ingls single-nucleotide poly-morphism - SNPs) e as variaes de nmero de cpias (do ingls form of structural variation - CNVs) compem a maior parte das diferenas de sequncias entre pessoas.

Pelo menos 50% do genoma deriva de elementos transponveis, como as sequn-cias LINE e Alu e outras sequncias de DNA repetitivo.

O genoma humano contm, aproximadamente, 20.000 genes codificadores de pro-tenas, muito menos do que os nmeros previstos de 80.000 a 100.000 genes.

Muitos genes humanos produzem mais de uma protena, atravs de encadeamentos alternativos, o que permite que as clulas humanas, com apenas ~20.000 genes, produzam um nmero muito maior de protenas (talvez at 200.000 protenas).

Mais de 50% dos genes humanos apresentam alto grau de similaridade de sequn-cias com genes de outros organismos; entretanto, mais de 40% dos genes identifica-dos no tm funo molecular conhecida.

Os genes no esto distribudos uniformemente pelos 24 cromossomos humanos. Agrupamentos ricos em genes esto separados por desertos pobres em genes, que respondem por 20% do genoma. Esses desertos esto correlacionados com as ban-das G, observadas em coloraes de cromossomos. O cromossomo 19 o que tem maior densidade gnica, e os cromossomos 13 e Y tm as menores densidades.

O cromossomo 1 o que contm o maior nmero de genes, e o Y o que tem o menor nmero.

Os genes humanos so maiores e tm mais e maiores ntrons do que os genes dos genomas de invertebrados como a Drosophila. O maior gene humano o gene da protena muscular distrofina, com 2,5 milhes de pares de bases e associado distrofia muscular.

O nmero de ntrons nos genes humanos varia de 0 (genes das histonas) a 234 (no gene da protena muscular titina).

Veja outro vdeo proposto, tambm do Projeto Genoma.

http://www.odnavaiaescola.com.br/download/ELSI.wmv

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A revoluo OMICAO Projeto Genoma Humano e o desenvolvimento das tcnicas de genmica abriram

uma nova era em pesquisas biolgicas, com novas reas biolgicas de investigao:Protemica: a anlise de todas as protenas de uma clula ou tecido. Metabolmica: a anlise das protenas e vias enzimticas envolvidas no metabo-

lismo celular. Glicmica: a anlise dos carboidratos de uma clula ou tecido. Toxicogenmica: a anlise dos efeitos de produtos qumicos txicos sobre os genes,

inclusive as mutaes criadas pelas toxinas e as mudanas de expresso gnica causadas pelas toxinas.

Metagenmica: a anlise dos genomas dos organismos coletados no ambiente. Farmacogenmica: o desenvolvimento de medicamentos individualizados, com

base no perfil gentico de uma pessoa, em uma condio especfica. Transcritmica: a anlise de todos os genes que se expressam em uma clula ou tecido.

Tcnicas de Biologia MolecularO reconhecimento de que o DNA codifica a informao gentica, a descoberta da

estrutura do DNA e a elucidao do mecanismo de expresso gnica constituem o funda-mento da biologia molecular.

A tecnologia do DNA recombinante, que possibilita aos cientistas o preparo de grandes quantidades de sequncias especficas de DNA, revolucionou a gentica, lanando a base para novos campos de estudos, que reforaram o avano do Projeto Genoma Humano, combinando a gentica com a tecnologia da informao.

Enzimas de restrio cortam o DNA em sequncias especficas

As enzimas de restrio so nucleases altamente especficas, produzidas por bactrias. Estas enzimas clivam o DNA que lhe estranho (restrio); portanto, este mecanismo pode ser definido como um sistema de defesa bacteriano. A bactria protege seu prprio DNA desta degradao, camuflando-o atravs da metilao de algumas bases especfi-cas (modificao).

As enzimas de restrio so agrupadas de acordo com a sua estrutura, a atividade dos stios de reconhecimento e a clivagem. Estas enzimas reconhecem sequncias especficas de 4 a 8 pares de base (pb) na molcula de DNA e fazem dois cortes, um em cada fita.

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Existem dois tipos distintos de clivagens: 1. Os dois cortes ocorrem no eixo de simetria da sequncia especfica, gerando extre-

midades abruptas.2. Os cortes so feitos simetricamente, porm, fora do eixo de simetria, gerando extre-

midades coesivas.

As mais importantes na Tecnologia do DNA Recombinante so as enzimas do Tipo II; o stio de reconhecimento deste grupo de enzima normalmente uma sequncia palindr-mica, isto , ela tem um eixo de simetria, e a sequncia de bases de uma fita a mesma da fita complementar quando lida na direo oposta.

Plasmdeos, Vrus e Cromossomos artificiais (YAC) so usados como vetores para carregar sequncias de DNA

Aps o isolamento de um gene, pode-se inseri-lo em outra molcula de DNA diferente, capaz de carreg-lo e amplific-lo em centenas de cpias. Este processo de amplificao obtido por meio do uso de molculas de DNA denominadas vetores de clonagem molecular. Existem tipos bsicos de vetores empregados nas tcnicas de biologia mole-cular. Entretanto, esses vetores para serem bons veculos de clonagem precisam apresen-tar caractersticas especiais em diferentes situaes.

Fig. 1.1 Processo de clivagem no eixo de simetria, gerando molculas com extremi-dades abruptas (clique na imagem para ver a animao).

Fig. 1.2 Processo de clivagem simetricamente situada ao redor do eixo de simetria, gerando molculas com extremidades coesivas, (clique na imagem para ver a animao).

Plasmdeo: Plasmdeos so pequenas molculas circulares de DNA dupla fita, presentes nas clulas procariticas, que contm os elementos necessrios para a

sua replicao e um gene de resistncia a antibitico. Os plasmdeos presentes num grande nmero de cpias so usados como veculos de clonagem desde que capacitem a amplificao do segmento do DNA neles clonado.

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O plasmdeo deve conter caractersticas especficas para ser um bom vetor (figura 7.3).1. Origem de replicao (O); sequncia de DNA que permita que o vetor seja repli-

cado na clula hospedeira.2. Mltiplos Stios de Clonagem (MSC); local onde o inserto incorporado ao vetor

de clonagem.3. Resistncia ampicilina (AmpR); as clulas que contm tais vetores so capazes

de crescer na presena de antibiticos, enquanto as clulas que no contm esses vetores acabam morrendo.

No processo de clonagem molecular, essencial que seja utilizada uma enzima de restrio capaz de produzir extremidades compatveis, durante a clivagem, entre o DNA a ser clonado (inserto) e o DNA receptor (vetor).

Aps a ligao do DNA ao vetor, esta molcula hbrida ser introduzida em uma bactria, por um processo chamado transformao. Este processo necessrio para que o vetor possa sofrer duplicaes e, consequentemente, possa amplificar o nmero de cpias do inserto.

O DNA do vrus SV40 possui 5.200 pares de bases e pode ser dividido em duas regies quanto expresso gnica viral. Essas regies so chamadas de regio precoce e regio tardia. O produto da expresso da regio precoce do genoma viral responsvel pelo incio da replicao viral em clulas permissveis. Os produtos de expresso codificados pela regio tardia correspondem s protenas que formam o capsdeo da partcula viral. A produo de DNA recombinante no vrus SV40 pode ser realizada atravs da substituio do segmento de expresso precoce ou do segmento de expresso tardia (Figura 7.4).

Vrus: Os vrus de DNA e RNA podem ser utilizados em tcnicas de biologia molecular. O genoma do vrus SV40 foi amplamente estudado, tendo sido isolado

de clulas tumorais de macacos; ele foi um dos primeiros sistemas virais utilizados para introduzir genes em clulas de mamferos.

Fig. 7.3 Estrutura molecular de um plasmdeo tpico usado em clonagem molecular. Esto representados o gene de resistncia (AmpR - vermelho), a regio de mltiplos stios de clonagem (MSC - amarelo) e a origem de replicao (O). / Fonte: CEPA

Fig. 7.4 Genoma do vrus SV40. O = origem de replicao, verde = expresso precoce e vermelho = expresso tardia. / Fonte: CEPA

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clonaGeM no SV40 pela SuBStituio da reGio tardia Quando a regio tardia do SV40 substituda com outro DNA, perde-se a expresso das

protenas do capsdeo (funes tardias). Para que o sistema de clonagem funcione ade-quadamente, pode-se realizar a infeco simultnea com outro vrus SV40, que tem uma deleo nos genes da regio precoce, mas a regio tardia intacta. Nas clulas coinfectadas, as protenas da regio precoce sero produzidas pelo vrus recombinante e as protenas do capsdeo pelo vrus deletado. Como resultado, teremos a produo de uma populao de partculas virais mistas, ou seja, vrus deletado e vrus recombinante (figura 7.5).

Fig. 7.5 Clonagem no SV40 pela substituio da regio tardia. / Fonte: CEPA

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clonaGeM no SV40 pela SuBStituio da reGio precoce Quando a clonagem no SV40 feita na regio precoce, a produo de partculas virais

depende do suprimento, por outra fonte, das protenas codificadas pela regio precoce. Portanto, a clonagem necessariamente dever ser realizada em linhagens de clulas espe-cializadas, as quais apresentam uma poro do genoma do SV40 integrado ao seu prprio genoma. Dessa forma, esta linhagem celular produzir as protenas virais responsveis pelo processo de duplicao do vrus, induzindo a sua duplicao. Entretanto, esta estra-tgia de clonagem apresenta desvantagens, pois o genoma da clula hospedeira pode sofrer rearranjos ou delees.

clonaGeM eM retroVruS Atualmente, um outro sistema de clonagem est sendo utilizado e apresenta muitas

vantagens quando comparado com os sistema descritos anteriormente. So os chamados retrovrus, que so vrus cujo material gentico composto somente por RNA e, portanto, apresentam um ciclo bastante diferente dos mencionados anteriormente.

Os retrovrus infectam uma grande variedade de clulas de mamferos e o seu RNA transcrito reversamente para DNA, o qual incorporado ao genoma da clula hospedeira. Neste estado, ele produz continuamente novas partculas virais, juntamente com o produ-to do gene nele clonado. Por causa da sua versatilidade, os retrovrus so atualmente os vetores eleitos para uso em terapia gnica.

VetoreS para leVeduraS O grande interesse existente no estudo das leveduras Saccharomyces cerevisiae e Schi-

zosacharomyces pombe se deve ao fato de que so organismos eucariotos inferiores e, assim sendo, possuem organizao celular similar de eucariotos superiores. Alm disso, muitas protenas de leveduras so similares, estrutural e funcionalmente, s suas homlo-gas em mamferos, permitindo tambm estudos ps-traducionais.

YAC (do ingls Yeast Artificial Chromosome, cromossomo artificial de levedura) con-siste em um tipo de vetor de cpia nica, que contm sequncias centromricas (CEN) e sequncias telomricas (sequncias das extremidades dos cromossomos). A presena de sequncias telomricas nestes vetores permite que sejam replicados como molculas lineares, com comportamento semelhante ao do DNA cromossomal. YACs no so uti-lizados rotineiramente em experimentos de clonagem; entretanto, tm-se mostrado uma ferramenta valiosa na caracterizao de grandes segmentos genmicos na medida em que possvel clonar em um YAC fragmentos que vo de 100 a 2.000 kb (Figura 7.6).

Fig. 7.6 YACs: Contm um cen-trmero, dois telmeros, gene(s) marcador(es) para seleo em levedura e uma sequncia tipo ARS. Devido presena destas sequn-cias, os YACs so duplicados como pequenos cromossomos lineares na levedura. / Fonte: CEPA

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RNAm convertido em DNAc por reaes enzimticas

A enzima transcriptase reversa um tipo de DNA polimerase dependente de RNA, ou seja, esta enzima capaz de sintetizar DNA in vitro, usando como molde RNAm. O pro-duto dessa reao o DNA complementar ou, de modo abreviado, o chamado DNAc.

A sntese e a clonagem de DNAcs contribuem para grandes avanos na anlise da estru-tura e expresso de genes de eucariotos, uma vez que o DNAc a cpia do RNAm e ele no contm ntrons. A ausncia dos ntrons permite que DNAcs de eucariotos sejam diretamente transcritos e traduzidos em bactrias e em outros microorganismos, possibi-litando assim a produo, em grande escala, de polipeptdeos importantes tanto na rea de pesquisa como na rea aplicada. Alm disso, a ausncia de ntrons tambm facilita a determinao da sequncia de aminocidos da protena por ela codificada. Esta metodo-logia permite a identificao e caracterizao da sequncia de uma enorme quantidade de protenas (figura 7.7).

Fig. 7.7 Sntese de DNAc fita dupla. / Fonte: CEPA

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Bibliotecas de DNA genmico so sequncias completas de organismos

Bibliotecas genmicas so colees de clones recombinantes, formadas de molculas correspondentes a todo o genoma do organismo. A construo de uma biblioteca gen-mica permite obter informaes sobre a estrutura molecular de um gene bem como o isolamento da poro do DNA genmico, que contenha toda a unidade de transcrio mais as regies flanqueadoras, onde se localizam os elementos controladores da expres-so desse gene.

Assim, um dos aspectos principais a serem considerados na construo de uma biblio-teca genmica a obteno de um nmero grande de clones portando fragmentos do genoma, obtidos aleatoriamente. Portanto, o tamanho de uma biblioteca genmica, para um dado gene de interesse, determinado pelo tamanho dos fragmentos clonados e pelo tamanho do genoma. Sendo assim, a construo de bibliotecas genmicas tem como objetivo minimizar o nmero de clones necessrios atravs da clonagem de fragmentos de DNA de maior tamanho possvel. Resumidamente, a construo da biblioteca genmi-ca envolve duas etapas (Figura 7.8).

1. Isolamento de DNA, que posteriormente clivado, produzindo diferentes fragmen-tos de tamanhos compatveis com o vetor de clonagem.

2. Ligao desses fragmentos no vetor e introduo dos vetores obtidos nas clulas hospedeiras.

Fig. 7.8 Sntese de DNAc fita dupla / Fonte: CEPA

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Mtodos de sequenciamento de DNAA partir do final da dcada de 70, foram desenvolvidos mtodos que possibilitaram a

determinao da sequncia nucleotdica de fragmentos de DNA. Esta metodologia per-mitiu a determinao de sequncias completas de DNA e milhares de genes. O princpio do mtodo baseia-se na sntese de DNA in vitro, realizada na presena de desoxirribonu-cleotdeos trifosfato sem um grupo OH na posio 3', que est presente em nucleotdeos normais.

A molcula de DNA sintetizada in vitro utilizando os desoxirribonucleotdeos trifos-fato e desoxirribonucleotdeos trifosfato sem um grupo OH na posio 3'. Portanto, o elongamento da cadeia de DNA bloqueado pela incorporao do nucleotdeo sem um grupo OH na posio 3'. Cada reao produz um conjunto de cpias do DNA inicial, que terminam em diferentes pontos da sua sequncia. Os desoxirribonucleotdeos trifosfato sem um grupo OH na posio 3' so marcados com diferentes corantes fluorescentes (fluorocromos).

Aps a reao de sequenciamento, os diferentes fragmentos de DNA so separados por eletroforese em gel ou em capilar. Os fluorocromos presentes nos fragmentos so exci-tados por um feixe laser, os sinais fluorescentes so amplificados e detectados por tubos fotomultiplicadores ou, nos modelos mais modernos, por cmaras CCD. A identificao de cada nucleotdeo realizada por anlises computacionais atravs do comprimento de onda de emisso especfica de cada fluorocromo (Figura 7.9).

Fig. 7.9 O produto da reao de sequenciamento submetido eletrofo-rese em uma raia de gel. medida que os fragmentos passam pelo feixe de laser, os fluorocromos so excitados e a luz emitida detectada por um fotomultiplicador. Esta informao traduzida em forma de sequncia atravs de um computador. / Fonte:CEPA

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Genes podem ser sintetizados a partir de oligonucleotdeos. A reao da Polimerase em cadeia amplifica regies especficas de um DNA-alvo.

Por meio da reao em cadeia da polimerase, denominado tambm PCR (do ingls - Polymerase Chain Reaction), possvel amplificar uma sequncia de DNA especfica, sem a utilizao da clonagem molecular. Anteriormente amplificao, necessria a construo, por sntese qumica, de dois oligonucleotdeos de DNA (iniciadores) comple-mentares s extremidades de cada fita de DNA de interesse, que flanquear uma regio especfica do DNA. Estes oligonucleotdeos servem como iniciadores da sntese de DNA in vitro, que catalisada pela DNA polimerase.

Um ciclo de PCR comea com a desnaturao por calor (95C), que promove a sepa-rao da fita dupla de DNA. A reao resfriada na presena de um excesso dos dois oligonucleotdeos, possibilitando a hibridizao dos dois iniciadores com a sequncia complementar presente no DNA-alvo. Em seguida, a reao incubada para atividade da DNA polimerase, produzindo novas fitas de DNAs a partir dos iniciadores e utilizando os quatro desoxirribonucleotdeos (dATP, dCTP, dGTP e dTTP).

Fig. 7.10 As trs etapas do ciclo de PCR (clique na imagem para ver a animao).

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Referncias BibliogrficasWILLIAM S. KLUG, MICHAEL R. CUMMINGS, CHARLOTTE A. SPENCER e MICHAEL A.

PALLADINO. Conceitos de Gentica. 9 ed. Editora: Artmed.WATSON J.D. RICHARD M. MYERS. CAUDY AMY A. WITKOWSKI, JAN A. DNA

Recombinante - Genes e Genomas. 3 ed. Editora: Artmed.STRACHAN T. e READ P.A. Gentica Molecular Humana. 2 ed. Editora: Artmed.TURNPENNY P. ELLARD S. Emery. Gentica Mdica. 13 ed. Editora: ElsevierBRUCE ALBERTS, ALEXANDER JOHNSON, JULIAN LEWIS, MARTIN RAFF, KEITH ROB-

ERTS e PETER WALTER. Biologia molecular da clula. 4 ed. Editora: Artmed. TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE: NASCIMENTO, Alexandra A. C.; ESPRE-

AFICO, Enilza Maria; LARSON, Maria Luisa Pa, MONESI, Ndia; ROSSI, Nilce Maria Martinez e RODRIGUES, Vanderlei. (Acesse o pdf pelo link no ambiente virtual)

Ampliando o conhecimentoPara saber mais sobre as tecnologias e tcnicas discutidas nesta semana, acesse os

seguintes links: animao Polymerase Chain Reaction (PCR) apostila Tecnologia do DNA Recombinante elaborada pela Faculdade de Medici-

na de Ribeiro Preto.

Questionrio

1. Correlacione: a. DNA e cromossomob. Gene e Genomac. Gene e RNAd. Transcriao e Traduo.

2. Discuta dois avanos importantes relacionados descoberta das enzimas de restrio.

Atividades
http://www.maxanim.com/genetics/PCR/pcr.swfhttp://www.fmrp.usp.br/rbp/graduacao/Tecnologia_do_DNA_recombinante.pdf

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