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GENÉTICA BACTERIANA VÂNIA GUIMARÃES

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Genes, resistência bacteriana

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Page 1: Genética bacteriana

GENÉTICA BACTERIANA

VÂNIA GUIMARÃES

Page 2: Genética bacteriana

GENÓTIPO E FENÓTIPO

• GENÓTIPO – corresponde ao conjunto de genes contidos em um organismo.

Em genética bacteriana o genótipo de um organismo é designado por três letras minúsculas, seguida por uma letra maiúscula (toda grafada em itálico), para indicar um gene em particular.

• Ex.: o gene hisC de Escherichia coli codifica uma proteína, conhecida como HisC

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• FENÓTIPO – conjunto de características observáveis de um organismo.

O fenótipo de um microorganimo normalmente é designado por uma letra maiúscula, seguida por duas letras minúsculas, adicionando-se um sinal de mais (+) ou de menos (-) sobrescrito para indicar a presença ou ausência daquela propriedade.

• Ex.: uma linhagem His+ de E. coli é capaz de sintetizar sua própria histidina, enquanto uma linhagem His- é desprovido dessa capacidade.

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Plasmídeo

• Pasmídeos são elementos genéticos que se replicam independentemente do cromossomo da célula hospedeira.

• Importância – Os podem conter uma grande variedade de genes que conferem propriedades que consideramos fundamentais para as bactérias em questão.

Um único plasmídeo pode conferir muitos fenótipos diferentes à sua célula hospedeira

Page 5: Genética bacteriana

• Dentre os grupos de plasmídeos mais estudados e amplamente distribuídos em células, temos os plamídeos de resistência (plasmídeos R) que conferem resistência aos antibióticos e vários outros inibidores do crescimento.

• A emergência de bactérias resistentes a vários antibióticos tem grande importância médica sendo correlacionada ao crescente uso de antibióticos no tratamento de doenças infecciosas.

Page 6: Genética bacteriana

• As técnicas de engenharia genética, tornaram possíveis a construção de um número ilimitado de plasmídeos novos, artificiais, em laboratório. A incorporação de genes das mais diversas fontes nesses plasmídeos possibilitou a transferência de material genético entre diversos organismos, vencendo assim a barreira entre as espécies.

Page 7: Genética bacteriana

MUTAÇÃO E ALTERAÇÃO NO GENOMA

• MUTAÇÃO – é uma alteração, transmitida geneticamente, na sequência de bases do genoma de ácidos nucléicos de um organismo.

• Uma linhagem com tal alteração é denominada mutante.

• Virtualmente, qualquer característica de um organismo pode ser modificada por meio de mutações. Algumas mutações podem ser selecionáveis, conferindo algum tipo de vantagem aos indivíduos que a possui. Outras não selecionáveis.

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Isolamento de mutantes

• Varredura – simples observação visual das várias colônias em busca daquelas com aspecto “diferente”.

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• Seleção – isolamento de um único mutante, em uma população de milhões ou até mesmo bilhões, de organismos parentais.

Podem ser feitos:• Plaqueamento de réplicas• Seleção pela penicilina

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Page 11: Genética bacteriana

As mutações gênicas podem ser de três tipos:

1º - Por substituição – substituição de bases nitrogenadas. Alteram apenas o códon ao qual ela pertence, acarretando apenas a alteração de um aminoácido. A atividade da proteína pode ser reduzida mas ela não é abolida.

Page 12: Genética bacteriana

Mutações génicas

• Inserção e delecção

acontece quando uma ou mais bases são adicionadas ou removidas, respectivamente, ao DNA, modificando a sequência de leitura da molécula durante a replicação ou a transcrição.

Page 13: Genética bacteriana

• Mutação com sentido trocado ou errado - quando a substituição de base ocasiona a troca de um aminoácido. Pode levar – proteína alterada (redução ou perda da sua atividade biológica) ou acarretar em uma proteína semelhante a normal.

• Mutação sem sentido – a mutação faz surgir um dos códons terminais – a proteína é encurtada e não conserva sua atividade biológica normal.

• As inserções ou deleções de bases alteram toda a leitura do código genético (mutações de mudanças na leitura do código genético) a proteína perde a sua função.

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Mutações génicas

• Substituição

ocorre a troca de um ou mais pares de bases.

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AGENTES MUTAGÊNICOS

AGENTES FÍSICOS• Radiações ionizantes → radiações de alta

energia e pequeno comprimento de onda. Ex: raios gama, raios cósmicos e partículas emitidas por elementos radioativos (alfa, beta e neutros).

• Ao passarem pelas células provocam a liberação de elétrons que deixam as moléculas instáveis e suscetíveis a reações químicas que ao reagirem com o DNA causam erros no pareamento das bases.

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• Radiações ultravioleta – são menos energéticos, têm maior comprimento de onda que as ionizante. Seu principal efeito mutagênico está na formação de ligações entre duas moléculas adjacentes de timina impedindo seu pareamento com a adenina. Causam mutações pontuais.

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• Substâncias químicas: a) análogos de bases – substâncias que

apresentam estruturas químicas semelhantes às das bases nitrogenadas que podem ser incorporadas ao DNA, substituindo-as.

b) Compostos com ação direta – não são incorporadas ao DNA, mas modificam diretamente a estrutura das bases. Ex. ácido nitroso, responsável pela desaminação da adenina (hipoxantina) e da citosina (uracil), fazendo a adenina parear com a citosina e não com a timina.

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• Agentes alquilantes – agem sobre a guanina, enfraquecendo sua ligação com a desoxirribose. A guanina é perdida e em seu lugar entra qualquer base.

• Corantes de acridina – ligam-se ao DNA, inserindo-se entre as bases adjentes, isso faz com que, durante a replicação do DNA, haja distorção na hélice de DNA e mudança na matriz de leitura, resultando adição ou deleção de nucleotídeos.

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TRANSFORMAÇÃO

• É definida como um processo de incorporação de DNA na forma livre, geralmente decorrente da lise celular.

• Várias bactérias Gram positivas e negativas são naturalmente transformáveis, entretanto, dentro de um gênero, nem todas as espécies o são. Na natureza, o processo ocorre quando uma célula sofre lise, liberando seu DNA.

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• Inicialmente, para que o processo ocorra, é necessário que a cél. encontre-se competente, isto é, deve apresentar sítios de superfície para a ligação do DNA da célula doadora e apresentar a membrana em uma condição que permita a passagem deste DNA. Esta propriedade é, provavelmente, uma característica inerente de certas linhagens e, ao que parece, envolve o mecanismo de quorum sensing. O estabelecimento da competência é um fenômeno controlado, envolvendo a participação de diferentes proteínas (proteína de ligação ao DNA, presente na membrana, autolisinas, nucleases), sendo um processo variável entre os microrganismos.

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• Aparentemente, o número de sítios disponíveis para a ligação do DNA é limitado. Esta captação parece estar relacionada a uma pequena sequência, de 10 a 12 pares de bases, presente no DNA exógeno. Em Haemophilus, foi demostrada a presença de uma proteína que reconhece e liga-se a uma sequência 5’ - AAGTGGGTCA - 3’, muito comum no genoma deste microrganismo, garantindo que somente ocorrerá a captação de DNA de espécies muito similares.

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• A competência é um processo que depende de várias condições distintas nos diferentes microrganismos. Sabe-se que a fase de crescimento e as condições ambientais desempenham um papel de extrema importância no processo. Além destes, a temperatura e a concentração de cátions também influenciam a eficiência do processo.

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• A captação do DNA também é diferente entre Gram positivos (G+) e Gram negativos (G-): Nas G+ o DNA é captado como dupla hélice e absorvido como fita simples, sendo uma das fitas degradadas. Nas G-, o DNA é absorvido como fita dupla, embora apenas uma das fitas participe do processo de recombinação. Independente do tipo celular, a ligação do DNA à célula é mais eficiente quando está como fita dupla.

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• Ligação do DNA: inicialmente é reversível, tornando-se irreversível depois. As células competententes ligam o DNA com muito mais eficiência que células não competentes (1000 vezes mais). Streptococcus pneumoniae é capaz de ligar apenas cerca de 10 moléculas de DNA de dupla fita, de 15 a 20 kb. Quando são absorvidas, como DNA de fita simples, estas passam para cerca de 8 kb.Em Haemophilus influenzae, é necessário que o DNA tenha uma sequência específica de 11 pb, para que haja a ligação irreversível e o DNA seja captado.

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• Integração do DNA: O DNA liga-se a proteínas na superfície celular, sendo em seguida absorvido ou tendo uma de suas fitas degradadas por nucleases antes da absorção. À medida que o DNA é absorvido no interior da célula, este se associa a proteínas de ligação ao DNA de fita simples, protegendo-o de degradação. A proteína RecA também participa deste processo, associando-se à fita e promovendo a recombinação. Há então a degradação do que resta da fita simples e formação de um DNA híbrido, que na replicação originará uma molécula parental e outra recombinante.

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Esquema dos eventos envolvidos na transformação em Streptococcus, um organismo Gram positivo. O autoindutor (1) ao encontrar o receptor (2) interage com este, promovendo a ativação de vários genes (3, 4 e 5) dentre eles as autolisinas, nucleases e proteína de ligação ao DNA. Uma das fitas do DNA passa a ser captada pela célula, enquanto a outra é degradada (6). Ao penetrar na célula a fita simples é protegida por proteínas. Caso este DNa encontre uma região complementar, a proteína RecA auxiliará sua recombinação com o DNA endógeno (7).

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CONJUGAÇÃO

• Processo de transferência de DNA de uma bactéria para outra, envolvendo o contato entre as duas células .

• A conjugação está associada à presença de plasmídeos de natureza F. Estes plasmídeos contêm genes que permitem a transferência do DNA plasmidial de uma célula para outra ou, em outras palavras, a capacidade conjugativa. Quando a célula porta um plasmídeo de natureza F é denominada F+, doadora, ou macho, enquanto células desprovidas de tais plasmídeos são denominadas F-, receptoras, ou fêmeas

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• A capacidade conjugativa está associada à presença de determinados genes localizados em um operon denominado tra. Estes genes conferem uma série de características envolvidas na conjugação tais como a síntese do pilus F, responsável pelo reconhecimento e contato entre as células, assim como a transferência do DNA plasmidial.

• Eventualmente, os plasmídeos podem ser integrados no cromossomo, sendo este processo mediado por pequenas seqüências de DNA denominadas IS (insertion sequences). As células apresentados tais plasmídeos integrados são denominadas Hfr (do inglês High Frequency of Recombination). Quando integrados, esses plasmídeos podem mobilizar a transferência de genes cromossomais também.

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Exemplo de um plasmídeo do tipo F

Em gram negativos, a conjugação pode ser de dois tipos: entre células F+ e F-, resultando em duas células F+ e entre células Hfr e F-, resultando em uma célula Hfr e outra F-

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• Nos dois processos, acredita-se que o mecanismo provável de transferência do DNA seja pelo círculo rolante, onde apenas uma das fitas é transferida, sendo a fita complementar sintetizada pela célula receptora. Provavelmente, o estímulo para o disparo do processo seja o contato das células. Assim, a conjugação envolve a passagem de DNA de uma célula F+ para outra F-, que torna-se então F+ também.

• Quando o plasmídeo encontra-se incorporado ao cromossomo, a conjugação passa a envolver a transferência de genes cromossomais, sendo que nestes casos, a célula receptora permanece F-, porque a região tra é a última a ser transferida, o que raramente ocorre na natureza. Nestes casos, passam grandes blocos de DNA da célula Hfr para a receptora, promovendo extensas recombinações.

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(c)

A

B

D

A

Esquema dos eventos associados à conjugação entre células F+ e F-.

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A

BB

Eventos associados à conjugação entre uma célula Hfr e outra F-. Observe que a célula F- permanece como receptora, uma vez que a região tra normalmente não é transferida.

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TRANSDUÇÃO

• (Lederberg & Zinder, 1952) transferência mediada por vírus, podendo ser generalizada (qualquer fragmento de DNA) ou especializada (determinados genes, passados por fagos temperados).

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• Transdução generalizada: Descoberta em Salmonella typhimurium com o fago P22, embora este processo também ocorra em outras bactérias, tais como E. coli. Este tipo de processo requer a ocorrência de um ciclo lítico, onde eventualmente pode haver o empacotamento de fragmentos de DNA da célula hospedeira, gerando partículas denominadas partículas transdutoras, que correspondem ao capsídeo viral contendo em seu interior DNA bacteriano. Embora não possam ser descritas como vírus, as partículas transdutoras exibem a capacidade de adsorção à superfície de outras células bacterianas. A frequência com que um determinado gene é transferido é baixa uma vez que cada partícula transdutora leva apenas um determinado fragmento de DNA (1 em 106 ou 108 cél. recebem um determinado gene).

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• Transdução generalizada: durante um ciclo lítico, pode haver a incorporação de DNA bacteriano no capsídeo viral. Este DNA poderá ser transferido para outra bactéria, pois os processos de adsorção e injeção de DNA dependem da estrutura do vírus, independente do tipo de DNA contido em seu interior.

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• Transdução especializada: Evento raro, embora bastante eficiente. O exemplo melhor conhecido e primeiramente descoberto foi a transferência de um genes que codificam produtos envolvidos na degradação de galactose pelo fago l de E. coli.A etapa inicial no processo corresponde à infecção e lisogenização do fago, que ocorre em sítios específicos do genoma. Neste caso, a integração do fago ocorre adjacente ao conjunto de genes envolvidos na utilização de galactose. Pela ação de algum indutor (ex: UV) há a separação do fago do genoma (integração reversa), que normalmente ocorre perfeitamente. Entretanto, em alguns casos, essa separação é defeituosa, promovendo a remoção de genes bacterianos e deixando parte do genoma viral na célula.

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• Essas partículas podem ser de dois tipos: aquelas que carregam genes gal e outras que carregam genes bio. Aquelas partículas levando genes gal são denominadas ldgal (defectivas, contendo o gene gal), porque são incapazes de formar partículas virais maduras (porque deixam no hospedeiro o gene que codifica a proteína integrase). Quando estas partículas infectam novas células, juntamente com fagos normais (helper), pode haver a transferência de genes gal, a partir da infecção e lisogenização dos dois fagos.

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• Transdução especializada: este processo é dependente da ocorrência de um ciclo lisogênico. O fago integra seu DNA ao DNA bacteriano e após um determinado período de tempo e de acordo com certos estímulos, este fago pode iniciar um ciclo lítico. Caso a excisão do DNA viral ocorra de maneira defeituosa, poderá haver a transferência de um pequeno fragmento de DNA bacteriano (porque parte do DNA viral ficará incorporado ao genoma bacteriano). Este vírus "defeituoso" poderá transferir o DNA bacteriano para outras células.

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RESISTÊNCIA MICROBIANA

• Este tema tornou-se um motivo de preocupação crescente entre os profissionais da área de saúde, pois a cada ano observamos o aumento de linhagens resistentes aos mais diversos agentes antimicrobianos.

• A resistência microbiana aos antimicrobianos pode ser de dois tipos: • Natural: ausência da estrutura, ou via metabólica alvo.• Adquirida: Através de mutações espontâneas e seleção, ou por recombinação após transferência de genes.

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Proporção de bactérias fecais, isoladas de indivíduos normais, resistentes aos diferentes antibióticos.

Aumento na proporção de linhagens de N. gonorrhoaea resistentes à penicilina.

(Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)

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• Dentre os principais mecanismos de resistência podemos citar:Impermeabilidade à droga: Muitas bactérias Gram negativas são resistentes à penicilina G por serem impermeáveis à droga, ou por apresentarem alterações em proteínas de ligação à penicilina. No caso das sulfonamidas, o microrganismo pode também apresentar uma menor permeabilidade à droga.

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• Inativação: muitas drogas são inativadas por enzimas codificadas pelos microrganismos. Por exemplo, a penicilinase (b-lactamase) é uma enzima que cliva o anel b-lactâmico inativando a droga. Outras drogas podem ser inativadas em decorrência de modificações introduzidas pelo microrganismo, tais como a adição de grupamentos químicos. Assim, muitos microrganismos são capazes de promover a fosforilação ou acetilação de antibióticos.

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• Modificação de enzima ou estrutura alvo: Por exemplo, alterações na molécula do rRNA 23S (no caso de resistência à eritromicina e cloranfenicol), alteração da enzima, no caso de drogas que atuam no metabolismo, ou uso de vias metabólicas alternativas.Bombeamento para o meio: Efluxo da droga - No caso da resistência às tetraciclinas, em bactérias entéricas.