Gama de hospedeiros de replicao de plasmdeos IncP1 intactos

Comparao da gama de hospedeiros de IncP-1g pKS208 e pMBUI1T17 e de IncP-1b pBP136 por ensaios conjugativos.

Ensaios de transformao: comparar isoladamente as funes replicativas e a gama de hospedeiros de replicao

Conjugao

Conjugao Materiais e mtodos1 ensaio: Pseudomonas putida como doadorahospedeiro permissivo de plasmdeos IncP-1g

2 ensaio: Escherichia coli como doadora

Cinco linhagens receptoras:E. coli e P. putida: classe GammaproteobacteriaCupriavidus pinatubonensis: BetaproteobacteriaAgrobacterium tumefaciens e Sphingobium japonicum: Alphaproteobacteria

Conjugao - ResultadospKS208 no se auto-transferiuNo possui gene traC completo

Plasmdeo auxiliar pRK2013Carrega genes para transferncia de IncP-1aReplicon ColE1 com genes RK2 conjugativos

Conjugao - Resultados Plasmdeos IncP-1g e IncP-1b :P. putida E. coliP. putida C. pinatobunensisE. coli C. pinatobunensisP, putida S. japonicum , A. tumfaciensIncP-1g XIncP-1b pB136KM E. coli A. tumefaciensIncP-1g: baixas frequnciasIncP-1b pB136KM: altas frequnciasE coli S. japonicumIncP-1g XIncP-ib PB136KM

Introduo

Conjugao - ConclusoIncP-1g e IncP-1b tm gamas de hospedeiros sobrepostas, mas diferentes;

A gama de hospedeiro aparente de IncP-1g limitadaFraca transferncia doador hospedeiroFraco estabelecimento no receptor

Transformao Materiais e mtodos

Plasmdeos purificados de P. putida KT2440quantificao do DNA feita por densitometria

Transformao por eletroporao

EletroporaoA clula exposta a um campo eltrico de alta intensidade, que desestabiliza a membrana;

Formam-se poros na membrana, permitindo a entrada do DNA exgeno de interesse;

Quando o campo eltrico desligado, a membrana se reestrutura, e o DNA fica mantido no interior da clula.

EletroporaoProcedimento no-qumicoNo altera a estrutura biolgica ou funo da clula;Performance rpida e simples;Grande eficincia;Pode ser aplicada a diferentes tipos celulares, desde que se ajuste os parmetros eltricos;

DNA doador: P. putida KT2440

Clulas transformadasPreparao de clulas eletrocompetentesMisturar com DNA plasmidial de interesseSubmeter mistura ao choqueTransformao Materiais e mtodos

Transformao Materiais e mtodosPlaqueamento ps-transformao:

gar sem antibitico: contagem das clulas viveis

gar com antibitico: contagem dos tranformantes

Transformao - Resultados

P. putida e C. pinatobunensis Todos os trs plasmdeos se estabeleceramEficincias indistinguveisAlphaproteobacteriapmBUIT17 XpK208: A. tumefaciens; X S. japonicumpBP136Km: A. tumefaciens; S. japonicumE. colipMBUI1T17: eficinciaPBP136KM e pKS208: eficincia

Transformao - ResultadosEficincias do estabelecimento dos plasmdeos IncP-1 intactos nos cinco hospedeiros.

Transformao - Concluso

Resultados consistentes com os obtidos no experimento de conjugaoAtividade replicativa baixa em AlphaproteobacteriaGama de hospedeiros dos plasmdeos IncP-1g se sobrepe apenas parcialmente com a de IncP-1b

Discusso GeralNo foi observada autotransferncia de IncP-1g pKS208 nos experimentos de conjugao

Delees no quadro de leitura em traC

pKS208 X IncP-1gSequncias dos produtos gnicosContedo G+C dos operons tra e trb

Discusso Geral

Isolamento e caracterizao de novos IncP-1gMais plasmdeos como pKS208Determinao da base gentica de sua deficincia conjugativa