fungos micorrÍzicos arbusculares,, muito mais diversos do que se imaginava

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Captulo 15FUNGOS MICORRZICOS ARBUSCULARES:M U I T O M A I S D I V E R S O S D O Q U E S E I M A G I N AVA

FRANCISCO ADRIANO DE SOUZA1, ISABEL CRISTINA LIMA DA SILVA1,3 E RICARDO LUS LOURO BERBARA21Laboratrio de Micologia, Embrapa Agrobiologia, Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuria, Rodovia Br 465 km 7, Caixa Postal 74505, Seropdica, RJ, CEP 23890-000, Brasil. Email: [email protected]; 2Departamento de Cincia do Solo, Instituto de Agronomia, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Rodovia BR 465 km 7, Seropdica, RJ, CEP 23890-000, Brasil. Email: [email protected]; 3Biloga, Bolsista CNPq, Embrapa Agrobiologia, Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuria, Rodovia BR 465 km 7, Seropdica, RJ, CEP 23890-000, Brasil. Email: [email protected]

1 . I N T RO D U OFungos Micorrzicos Arbusculares (FMA) Filo Glomeromycota, Classe Glomeromycetes (glomeromicetos) so membros importantes do sistema solo-planta, uma vez que a prpria diversidade desses fungos est intimamente ligada diversidade e produtividade de comunidades vegetais. Os FMA formam simbiose mutualstica, denominada micorriza arbuscular (MA), com espcies da maioria das famlias de plantas. Nessa simbiose, a planta supre o fungo com energia para crescimento e reproduo via fotossintatos, e o fungo prov a planta e o solo com uma gama de servios. O principal desses, ou pelo menos o mais evidente at o momento, realizado pelo miclio extra-radicular do fungo e consiste na absoro de nutrientes obtidos de reas localizadas alm da zona de depleo da raiz, em especial fsforo, e translocao e disponibilizao desses nutrientes para clulas do crtex de razes de plantas micotrficas (Bolan, 1991; Smith & Read, 1997; Miyasaka & Habte, 2001). Outros efeitos relevantes dos FMA so aumento na resistncia da planta ao ataque de patgenos do sistema radicular e na capacidade de absoro de gua (Smith & Read, 1997; Jeffries et al., 2003; Berbara, de Souza, & Fonseca, 2006; Moreira & Siqueira, 2006). Os FMA contribuem tambm para a acumula-

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o de estoques de carbono (Rillig et al., 2001) e biomassa microbiana em solos (Olsson & Wilhelmsson, 2000), favorecendo assim o seqestro de carbono da atmosfera. No solo, favorecem a formao e estabilidade de agregados, no s pela ao fsica do miclio fngico, mas tambm atravs da ao de uma glicoprotena denominada glomalina que produzida por esses fungos (Wright & Upadhyaya, 1996, 1998; Rillig & Mummey, 2006). A importncia econmica dos FMA para agricultura sustentvel (Jeffries, 1987; Jeffries et al., 2003), recuperao de reas degradadas (Jasper, 1994; de Souza & da Silva, 1996) e para uso eficiente de recursos no renovveis, como fsforo (Smith & Read 1997; Moreira & Siqueira 2006; Berbara et al. 2006) tem sido amplamente aceita pela comunidade cientfica. Alm disso, vrias espcies de plantas no conseguem sobreviver em solos de baixa fertilidade natural na ausncia da simbiose micorrzica. Entre essas espcies, esto culturas de grande importncia agronmica, como: caf, citrus, mandioca, batata doce, soja, e vrias espcies arbreas nativas do Brasil. No entanto, para que se possa tirar melhor proveito dessa simbiose em sistemas agroflorestais, bem como explorar a significncia dessa simbiose para a manuteno da diversidade nos ecossistemas naturais, necessrio acessar a diversidade e conhecer a ecologia dos FMA. Infelizmente, estudos sobre ecologia e diversidade de espcies nesse grupo de fungos ainda esto na sua infncia (Hart & Klironomos, 2002; Fitter, 2005). A magnitude dos benefcios da simbiose micorrzica depende da interao entre macro e micro simbiontes (Bever, 2002, 2003) e das caractersticas ambientais, como disponibilidade de fsforo e oferta de carbono ao simbionte (Moreira & Siqueira 2006; Berbara et al., 2006). Essas caractersticas sugerem que os FMA so funcionalmente diversos. Diferenas funcionais entre espcies e, at mesmo, isolados de uma mesma espcie tm se tornado cada vez mais evidentes graas ao grande progresso obtido com os estudos de filogenia, gentica e ecologia desses fungos. No entanto, vrias questes e paradoxos ainda continuam sem resposta. Por exemplo: existe especificidade hospedeira em FMA? Se existe, qual a sua extenso e conseqncias para a ecologia desses fungos e para as plantas micotrficas? A riqueza de espcies de FMA mesmo pobre ou sua determinao evidencia falhas no acesso e definio de espcies nesse grupo de fungos? So conhecidas pouco mais de 200 espcies de FMA; em contraste estima-se que a diversidade de plantas pode chegar a 400.000 espcies, dois teros das quais potencialmente formam simbiose MA.

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Na verdade, estudos recentes tm apontado que FMA formam um grupo diverso de fungos, questionando a contradio da baixa riqueza conhecida de FMA tanto em termos de nmero de espcies como em funo. Estudos dessa natureza so importantes pois se vinculam tanto evoluo da simbiose como a aspectos tecnolgicos, em especial os referentes ao desenvolvimento de biotecnologias ligadas ao emprego de micorrizas na produo agroflorestal, na recuperao de reas degradadas e restaurao ambiental, produo de inculo, entre outras aplicaes. Quando se busca associar diversidade de FMA em sua vertente aplicada, isto , com possveis tecnologias decorrentes de seu uso vinculado produo agroflorestal, deve-se recordar que timo ecolgico quase nunca se converte em timo tecnolgico. Nas relaes simbiticas que se estabelecem em ambientes naturais, entre FMA e razes de plantas, as estratgias dos simbiontes podem ser distintas da dos fungos utilizados em inoculantes comerciais. Nesses, espera-se facilidade de manejo, elevadas taxas de multiplicao e sobrevivncia e, principalmente, alta eficincia infectiva e simbintica. Similarmente a espcies vegetais, podem se encontrar espcies r e K em comunidades de FMA (de Souza et al., 2005a), e essas comunidades so naturalmente compostas por espcies dominantes, intermedirias e raras, uma vez que as prprias espcies vegetais se distribuem dessa maneira. Estudos consagrados confirmam que comunidades vegetais regulam e so reguladas por FMA (Grime et al., 1987; van der Heijden et al., 1998; van der Heijden et al., 2006). Essa ntima relao ecolgica se justifica pela idade ancestral e longo perodo de co-evoluo dessa simbiose. Durante a trajetria evolutiva, provvel que caractersticas que vinculam a performance de espcies e comunidades vegetais com a performance de espcies e comunidades de FMA tenham emergido e estejam contribuindo para conferir elevada diversidade, resilincia e estabilidade aos ecossistemas vegetais terrestres. Portanto, o mais provvel que a diversidade de FMA seja extremamente elevada e que determinaes que apontam o contrrio na verdade expressam muito mais as dificuldades em se determinar essa riqueza. Este captulo traz uma abordagem crtica sobre a diversidade conhecida de FMA e so apresentadas evidncias que do suporte hiptese de que os glomeromicetos formam um grupo diverso de fungos. So abordados tambm mtodos e estratgias para acessar, isolar, caracterizar e preservar a diversidade de FMA, alm de alguns fatores

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que favorecem o sucesso em projetos de caracterizao, preservao e uso tecnolgico da diversidade de FMA. A diversidade de FMA em ecossistemas brasileiros, sua relao com a diversidade de plantas e a produtividade de ecossistemas foi abordada no captulo 16 deste volume (Strmer & Siqueira), no sendo, portanto, tratados aqui.

ORIGEM

DOS FUNGOS MICORRZICOS ARBUSCULARES

E DA SIMBIOSE MICORRZICA

Registros fsseis indicam que os glomeromicetos e a simbiose que esses fungos formam com plantas j estavam presentes em espcies da flora terrestre primordial, indicando a origem ancestral tanto dos fungos quanto da simbiose. Porm, a origem evolutiva dos glomeromicetos e da simbiose micorrzica ainda no conhecida com preciso. O registro fssil mais antigo de esporos de fungos e hifas similares aos atuais glomeromicetos do segundo perodo da Era Paleozica, Ordoviciano, e data de 460 milhes de anos atrs (MAA), perodo no qual a flora possivelmente estava no nvel evolutivo das brifitas (Redecker, Kodner, & Graham, 2000a). Estimativas feitas com o relgio molecular (18S rRNA), calibrado com esse dado fssil e taxas de substituio de nucleotdeos dessa sub-unidade menor do gene ribossomal, apontam que a origem dos principais grupos de fungos terrestres (glomeromicetos, ascomicetos e basidiomicetos) ocorreu h mais de 600 milhes de anos (Redecker, Kodner, & Graham, 2000a), porm no foi encontrado sinal de simbiose. Alm disso, os esporos encontrados tinham a forma glomide que comum a vrias linhagens ancestrais (Archaeosporales e Paraglomerales) dos glomeromicetos, inclusive o Geosiphon pyriform. Esse glomeromiceto estabelece endocitosimbiose com cianobactrias e forma uma interface que se assemelha, em funo, ao arbsculo formado na simbiose micorrzica (Schler & Wolf, 2005), mas, pelo que se sabe, no forma simbiose com plantas. Assim, esse registro fssil s indica que a forma glomide possivelmente seja a mais ancestral, mas no pode ser ligada diretamente a nenhum grupo filogentico especfico atualmente conhecido. Recentemente, foram encontrados esporos fossilizados, no Rhynie chert na Esccia, datando de 400 MAA, que apresentavam escudos de germinao similares aos de esporos do gnero Scutellospora (Dotzler et al., 2006). Essa descoberta muito importante do ponto

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de vista filogentico por conectar o registro fssil a um gnero conhecido, e, principalmente, por indicar que as famlias mais recentes dos glomeromicetos j haviam sofrido diversificao antes do primeiro perodo do Devoniano. Esse dado tambm muito importante para se compreender a magnitude da diversidade desse grupo de fungos, e ser abordado no item 4. Fsseis, mostrando evidncias claras da presena da simbiose micorrzica arbuscular, foram obtidos de razes primitivas (protostlicas) de Aglaophyton major, uma espcie fssil encontrada na flora do Rhynie chert, Esccia, datando de 410-360 MAA. Nos tecidos colonizados dessa espcie foram encontrados arbsculos e vesculas, semelhantes aos encontrados nas espcies de plantas atuais (Remy et al., 1994; Taylor et al., 1995). Essa planta considerada uma das primeiras plantas vasculares terrestres, porm sua relao filogentica no conhecida. Esses registros no deixam dvidas sobre a presena da simbiose micorrzica na flora primordial e do suporte hiptese de que os glomeromicetos e a simbiose micorrzica foram fundamentais para a colonizao do ambiente terrestre pelas plantas (Pyrozynski & Malloch, 1975; Simon et al., 1993). Alm disso, a formao dos arbsculos requer uma intrincada relao gentica entre macro e micro simbiontes (Harrison, 1999, 2005; Lambais, 2006). Assim, a presena de arbsculos nas primeiras plantas terrestres indica que a simbiose per si deve ter evoludo a partir de outros sistemas mais primitivos. Desse modo, especula-se que a simbiose micorrzica evoluiu em ambientes midos a partir da relao entre fungos e algas e/ou cianobactrias (Brundrett, 2002; Schler & Wolf, 2005) semelhana do verificado em Geosyphon pyriforme. A partir dessas evidncias, uma estimativa menos conservadora feita a partir de seqncias que codificam para protenas, foi estimado que os glomeromicetos se separaram de outros grupos de fungos ao redor de 1200-1400 MAA (Heckman et al., 2001). Essa estimativa tambm sustentada pelas evidncias fsseis que indicam que os glomeromicetos j haviam diferenciado as suas principais famlias conhecidas atualmente no primeiro perodo do Devoniano. Embora no seja possvel confirmar a significncia funcional da associao glomeromicetos-plantas a partir dos registros fsseis, as caractersticas do ambiente no qual a flora terrestre primordial vivia e as caractersticas dos rgos absorventes dessas plantas, muito limitados, sugerem que elas seriam grandemente beneficiadas pela associao micorrzica para absoro de nutrientes minerais.

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O grupo de fungos que deu origem aos glomeromicetos ainda no conhecido. Anlises filogenticas baseadas nos genes ribossomais (18S rRNA) sugerem que os glomeromicetos divergiram do mesmo ancestral comum dos ascomicetos e basidiomicetos (Schler, Schwarzott, & Walker, 2001). Recentemente, foi publicado um artigo sobre a origem dos fungos baseado em anlise filogentica conjunta de regies/genes diferentes: 18S, 28S, ITS, EF1a, subunidade maior da RNA polimerase II e segunda maior subunidade do RNA polimerase II, que veio a confirmar o carter monofiltico do filo Glomeromycota e a relao desse filo com o dicria (Ascomycota e Basidiomycota, James et al., 2006). Este trabalho faz parte do projeto AFTOL assembling the fungal tree of life, que tem por objetivo esclarecer a evoluo dos fungos (http://aftol.org/about.php). Wang & Qiu (2006) publicaram um levantamento da ocorrncia da simbiose micorrzica em plantas terrestres, o qual indicou que, respectivamente 80% e 92% das plantas e famlias avaliadas formam micorrizas e que a simbiose micorrzica arbuscular a predominante e tambm a ancestral. A ocorrncia da simbiose micorrzica arbuscular na grande maioria das famlias de plantas terrestres e nas linhagens primordiais das hepticas (classe Hepaticae, diviso Briofita) tambm d suporte hiptese de que os glomeromicetos foram fundamentais para a colonizao inicial do ambiente terrestre por plantas. importante ressaltar que as plantas vasculares terrestres formam aparentemente um grupo monofiltico (Bateman et al., 1998). Esse carter possivelmente deve ter facilitado a ocorrncia generalizada da simbiose entre as famlias de plantas atuais, uma vez que a ausncia da simbiose s verificada em algumas famlias mais recentes (Smith & Read 1997; Moreira & Siqueira 2006). As evidncias aqui apresentadas no deixam dvidas sobre a diversificao e a origem ancestral dos glomeromicetos e da associao desses fungos com a flora terrestre inicial.

CARACTERSTICAS

BIOLGICAS E GENTICAS

D O S G LO M E RO M I C E TO S

Os glomeromicetos so biotrficos obrigatrios. Essa caracterstica esperada em simbioses altamente evoludas, em que o microsimbionte se torna totalmente dependente do macrosimbionte. Como conseqncia, esses fungos precisam esta-

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belecer simbiose com razes de plantas compatveis para que possam completar seu ciclo de vida. Eles possuem miclio asseptado (cenoctico) que permite rpida movimentao citoplasmtica, facilitando o transporte de nutrientes obtidos de regies localizadas alm da zona de depleo criada pelo sistema radicular. Comparados aos outros grupos de fungos conhecidos, os esporos formados pelos glomeromicetos so os maiores, variando de 22 a 1050 m em dimetro (Schenck & Perez, 1990; Schler et al., 1994). Os glomerosporos, denominao para esporos dos glomeromicetos proposta por Goto & Maia (2006), tipicamente contm, dependendo da espcie, centenas a milhares de ncleos (Cooke, Gemma, & Koske, 1987; Becard & Pfeffer, 1993; Pawlowska & Taylor, 2004). Hijri & Sanders (2004) caracterizaram o tamanho, a complexidade e a ploidia do genoma de uma estirpe de Glomus intraradices. Os resultados obtidos indicam que o G. intraradices haplide e possui um genoma pequeno (~16.54Mb), no limite inferior dos eucariotos. O genoma contm 88,36% de DNA de cpia nica, 1,59% de seqncias repetitivas e 10,05% de foldback (Sees de DNA de fita simples que tem seqncias que so palindrmicas) DNA. importante ressaltar que outros glomeromicetos apresentam genomas com tamanho muito maior do que o reportado para o G. intraradices. Hosny, Gianinazzi-Pearson & Dulieu (1998), por exemplo, verificaram que o tamanho do genoma de 11 espcies de glomeromicetos variou de ~127.4 Mb em Scutellospora pellucida a 1058.4 Mb em Scutellospora gregaria. Bianciotto & Bonfante (1992) verificaram que o contedo nuclear em Gigaspora margarita trs vezes maior do que em Glomus versiforme. Essas diferenas contrastantes no tamanho do genoma desses fungos, possivelmente refletem diferenas na ploidia e na quantidade de seqncias repetitivas no genoma dessas espcies. Atualmente, o genoma completo de uma estirpe de Glomus intraradices est sendo seqenciado. A publicao deste trabalho, sem dvida alguma, ir ajudar a esclarecer vrios aspectos da gentica e evoluo desse grupo de fungos. Os glomeromicetos se reproduzem assexuadamente (reproduo clonal) e so considerados organismos assexuais ancestrais (Judson & Normark, 1996; Normark, Judson, & Moran, 2003). Esses, por sua vez, so considerados escndalos evolutivos, pois contradizem a teoria da evoluo que prediz a extino acelerada de organismos que se reproduzem exclusivamente atravs de clonagem por longos perodos de tempo (Judson & Normark, 1996; Normark, Judson, & Moran,

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2003). Na reproduo assexual o organismo tende a acumular mutaes deletrias devido a falhas durante o crescimento somtico. A incapacidade de trocar material gentico com outros indivduos da populao impossibilita tanto a limpeza das mutaes deletrias do genoma, como tambm o ganho rpido de variabilidade gentica, que so fundamentais para que o organismo tenha maior capacidade de adaptao a mudanas no meio. Em Glomeromycota, existe apenas um relato de formao de estruturas sexuais em Gigaspora decipiens (Tommerup & Sivasithamparam, 1990), porm esse resultado nunca foi confirmado. Por outro lado, evidncias de recombinao (Gandolfi et al., 2003; Pawlowska & Taylor, 2004; de Souza, 2005) e da presena de elementos mveis, mas no sua atividade (Gollotte et al., 2006), tm sido relatadas em espcies de glomeromicetos. Atualmente, o estado homo ou heterocaritico da populao de ncleos nos glomeromicetos est sob intenso debate. Algumas evidncias apontam para o estado heterocaritico (Trouvelot et al., 1999; Kuhn, Hijri, & Sanders, 2001; Hijri & Sanders, 2005), enquanto que outras apontam para o estado homocaritico (Pawlowska & Taylor, 2004; Stukenbrock & Rosendahl, 2005). Pawlowska (2005) argumenta que se o sistema no Mendeliano, chamado de multigenmico, proposto com base no estado heterocaritico dos glomeromicetos (Sanders, 2002) estiver correto, esses devem ter desenvolvido um processo de recombinao de ncleos que se assemelha s primeiras etapas do ciclo parassexual (ver abaixo). Entretanto, ao invs de ocorrer fuso entre ncleos heterocariticos em um mesmo citoplasma, uma populao de ncleos heterocariticos permaneceria no citoplasma do fungo. Infelizmente, essas evidncias foram obtidas utilizando espcies de fungos, estirpes e tcnicas diferentes e nenhuma delas conclusiva. Fungos filamentosos, de uma forma geral, podem se recombinar atravs do ciclo parassexual, dando origem a fungos homo- ou heterocariticos. O ciclo parassexual se caracteriza pela fuso de hifas (anastomose) entre espcies ou indivduos geneticamente distintos, seguido de troca de material gentico - ncleos. Inicialmente o ciclo parassexual d origem a heterocariotos. Porm esse estado , em geral, instvel. Assim, normalmente, aps recombinao parassexual ocorre fuso de ncleos geneticamente distintos dando origem a diplides (2n), que podem sofrer perdas cromossomais para retornar ao estado haplide (Schardl & Craven, 2003) e a homocariose. importante mencionar que uma grande variabilidade intra-especfica nos genes ribossomais tem sido

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encontrada em esporos de todas as espcies de glomeromicetos avaliadas, e at agora nenhum mecanismo foi proposto para explicar essa variabilidade. Nesse sentido, de Souza et al., (2004) e de Souza (2005) caracterizaram o polimorfismo inter e intra-especfico em genes nucleares ribossomais em diversas espcies de Gigaspora. Os resultados obtidos indicaram a presena de mais de uma linhagem de genes ribossomais na maioria das espcies estudadas e que algumas das linhagens eram comuns a mais de uma espcie, sugerindo que algumas espcies foram formadas a partir do cruzamento de duas espcies distintas. Esses autores propuseram que o mecanismo responsvel pela gerao do polimorfismo intra-especfico dos glomeromicetos o ciclo parassexual, pois esse permite tanto a condio heterocaritica como a homocaritica reportadas para esses fungos. Esses resultados aliados s evidncias publicadas por (Raab, Brennwald, & Redecker, 2005) do suporte para a ocorrncia do ciclo parassexual nos glomeromicetos. Segundo esses autores, os genes ribossomais mitocondriais de trs isolados de Glomus (G. proliferum e dois de G. intraradices) no apresentavam variabilidade gentica intraespecfica, e isso se deve ao fato das mitocndrias serem, normalmente, herdadas de apenas um dos progenitores. Em contrapartida, as evidncias sobre a troca de material gentico entre isolados geogrficos de Glomus mosseae, obtidas por Giovannetti et al. (2003), no do suporte ocorrncia do ciclo parassexual em glomeromicetos. Esses autores avaliaram a formao de anastomose entre isolados geogrficos de Glomus mosseae e constataram que todas as estirpes testadas apresentaram autocompatibilidade. No entanto, quando estirpes diferentes foram combinadas, observou-se incompatibilidade vegetativa, com desenvolvimento de septos e morte no miclio ao invs de formao de anastomose. Convm salientar que esse trabalho foi conduzido com estirpes de Glomus mosseae que j apresentavam diferenas tanto no perfil de DNA como no de protenas. Assim, para esclarecer essas discrepncias faz-se necessrio estudar a compatibilidade vegetativa entre indivduos gentica e ecologicamente relacionados, como ser discutido na seo 6.

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C L A S S I F I C A O AT U A L D O F I L O G L O M E R O M Y C OTA , C L A S S E G LO M E RO M YC E T E SA sistemtica microbiana tem evoludo de forma espantosa nos ltimos anos. Essa evoluo vem sendo impulsionada pelos avanos no desenvolvimento de novas tcnicas nos campos da qumica, biologia molecular, genmica, protemica, microscopia e informtica, bem como pela implementao e/ou melhoria de bancos de germoplasma. A sistemtica dos glomeromicetos vem seguindo essa tendncia e vrios avanos tm sido obtidos nos ltimos anos. A tabela 15.1 traz a classificao filogentica atual do filo Glomeromycota e a distribuio das espcies segundo ordem, famlia e gnero. A classificao de um grupo de organismos deve expressar a evoluo das espcies de forma no s a revelar suas relaes filogenticas, mas tambm predizer atravs da classificao caractersticas morfolgicas, fisiolgicas e comportamentais (ecolgicas). Para que isso seja atingido, um conjunto de tcnicas deve ser aplicado. No caso dos glomeromicetos, a classificao tem sido baseada principalmente em caractersticas morfolgicas e ontogenticas, e mais recentemente na sistemtica molecular. A sistemtica baseada em caracteres morfolgicos foi abordada no captulo 16 deste volume. Aqui ser dada maior nfase classificao molecular dos glomeromicetos e sero discutidos alguns dos problemas e as perspectivas da sistemtica molecular para esse grupo de fungos. A sistemtica molecular baseada em um conjunto de mtodos objetivos (classificao fentica) que podem ser facilmente reproduzidos por outros cientistas. Essa objetividade advm da organizao e disponibilizao da informao em bancos de dados de livre acesso, tais como NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) e EMBL (http://www.ebi.ac.uk/embl/), e da utilizao de mtodos estatsticos e computacionais estabelecidos (http://evolution.genetics.washington.edu/phylip/software.html). Apresenta-se a seguir um breve histrico da evoluo da sistemtica molecular dos FMA. Os primeiros trabalhos de sistemtica molecular em Glomeromycota foram realizados por Simon e colaboradores, na dcada de 90 (Simon et al. 1993). Esses pesquisadores analisaram seqncias do 18S rDNA de doze espcies de FMA pertencentes s famlias Acaulosporaceae, Gigasporaceae e Glomeraceae (Simon et al, 1993,

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Simon 1996). Os resultados obtidos nesses trabalhos confirmaram o carter monofiltico das trs famlias avaliadas. Por outro lado, a relao filogentica estabelecida por cladstica proposta por Morton & Benny (1990), que relacionava Acaulosporaceae com Glomeraceae, no obteve suporte na anlise molecular. Essa evidenciou que Acaulosporaceae e Gigasporaceae derivaram do mesmo ancestral comum. Posteriormente, duas novas famlias (Paraglomeraceae e Archaeosporaceae) foram propostas com base na anlise de seqncias do 18S rDNA de cinco espcies inseridas inicialmente nos gneros Glomus e Acaulospora, ambas constituindo linhagens basais dos FMA. Alm da anlise molecular, foram obtidas tambm evidncias morfolgicas, tais como intensidade fraca da colorao do miclio intra-radicular, e no caso de duas (Archaeospora leptoticha e Ar. gerdemannii) das trs espcies reclassificadas para a famlia Archaeosporaceae, foi demonstrada a formao de esporos dimrficos (Redecker, Morton, & Bruns, 2000b). Em seguida, esses autores analisaram seqncias de 18S rDNA de Glomus sinuosum (includa inicialmente no gnero Sclerocystis) e Sclerocystis coremioides e constataram que esses fungos formam um grupo monofiltico com espcies do gnero Glomus, e que a formao de esporos em grupos no possua relevncia taxonmica suficiente para manter S. coremioides em um gnero separado. Baseada nessas evidncias, foi proposta a excluso do gnero Sclerocystis (Redecker, Morton, & Bruns, 2000c). Em seguida, Schwarzott e colaboradores analisaram seqncias do 18S rDNA de um grande nmero de espcies pertencentes ao gnero Glomus e demonstraram que esse gnero, que contm o maior nmero de espcies conhecidas, polifiltico e apresenta trs grupamentos monofilticos distintos, denominados como Glomus grupo A, B e C (Schwarzott, Walker, & Schler, 2001). No mesmo ano, foi publicada a nova classificao dos FMA com a proposio do Filo Glomeromycota (Schler, Schwarzott, & Walker, 2001). Esses autores demonstraram, por meio da anlise de seqncias do 18S rDNA de mais de 200 espcies de fungos, que os FMA constituem um grupo monofiltico claramente distinto de outros grupos de fungos conhecidos. Com base nesse dado, os FMA foram reclassificados, passando a representar no mais uma ordem (Glomerales) inserida no filo polifiltico, Zigomycota, sendo ascendidos a uma nova categoria taxonmica, o Filo Glomeromycota (Schler et al., 2001). Nesse trabalho, foram propostas tambm as ordens Archaeosporales, Diversisporales, Glomerales e Paraglomerales (ver tabela 15.1).

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Mais recentemente foi proposto o gnero Pacispora (Oehl & Sieverding, 2004) e a famlia Pacisporaceae (Walker & Schler, 2004), com base na anlise morfolgica de trs espcies classificadas no gnero Glomus (Glomus scintillans - espcie tipo, Glomus dominikii e Glomus chimonobambusae), quatro novos txons (P. franciscana, P. robigina, P. coralloidea e P. boliviana, Oehl & Sieverding, 2004) e na anlise molecular da espcies tipo Glomus scintillans (Walker & Schler, 2004). As espcies nesse gnero se caracterizam pela formao de esporos glomides com paredes internas e formao de escudo de germinao similar ao do gnero Scutellospora (Gigasporaceae) (Oehl & Sieverding, 2004; Walker et al., 2004). interessante mencionar que esse grupo de FMA tambm estava sendo individualizado em um novo gnero (Gerdemannia) e famlia (Gerdemanniaceae) por Walker et al. (2004), utilizando a mesma espcie-tipo. Como o artigo propondo o gnero Pacispora foi publicado algumas semanas antes, apesar de ter sido submetido para publicao aps o outro artigo, e prevalecendo o princpio da prioridade, o gnero Pacispora tornou-se o txon vlido. Convm ressaltar que Oehl & Sieverding (2004) inseriram o gnero Pacispora dentro da famlia Glomeraceae por terem inferido, a partir dos caracteres morfolgicos, tais como, formao de vesculas intra-radiculares e esporos glomides, que esse gnero pertenceria a essa famlia da Ordem Glomerales. Porm, a anlise de seqncias de DNA do gene que codifica para o 18S rRNA indicou que esse gnero se agrupa dentro da ordem Diversisporales (Figura 15.1) (Walker et al., 2004; Walker & Schler, 2004). Alm disso, nesse gnero o tubo de germinao emerge atravs da parede do esporo de forma similar s famlias Acaulosporaceae e Gigasporaceae, e, em culturas puras de Pacispora scintillans, o Dr. Janusz Blaszkowski observou a formao de clulas auxiliares (ver http://www.agro.ar.szczecin.pl/~jblaszkowski/Pacispora%20scintillans.html), que era uma caracterstica at ento encontrada apenas na famlia Gigasporaceae (Tabela 15.1, Figura 15.2 - ver encarte colorino). Essas evidncias morfolgicas e citolgicas esto em concordncia com a sistemtica molecular baseada no gene do 18S rRNA. A famlia Diversisporaceae foi proposta para acomodar espcies inseridas anteriormente no grupo Glomus C Diversispora spurca (Glomus spurcum, Walker et al., 2004; Walker & Schler, 2004). E est posicionada na base evolutiva da ordem Diversisporales (Figura 15.1). Recentemente, Redecker et al. (2007) carac-

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96/34/90/72 72/39/76/76 100/88/92/93 63/58/75/63 97/91/96/95 77/61/--/66 52/45/61/59 79/76/83/72

Gi. rosea DAOM194757 (X58726) Gi. candida BEG17, W3292 (AJ276091) Gi. albida FL927 (Z14009) Gi. aff. margarita W2992 (AJ276090) Gi. gigantea WV932 (Z14010) S. heterogama BEG35, W3214 (AJ306434) S. heterogama WV858B (Z14013) S. heterogama BR154-5 (U36593) S. cerradensis MAFF520056 (AB041344-45) S. spinosissima W3009 (AJ306436) S. gilmorei W3085 (AJ276094) S. pellucida WV873 (Z14012) S. weresubiae W2988 (AJ306444) S. castanea BEG1 (AF038590, U31997) S. fulgida W2993 (AJ306435) S. calospora BEG32 W3213 (AJ306445-46) S. nodosa W3485 (AJ306437) S. aurigloba WUM53, W3121 (AJ276092-93) S. projecturata W3254 (AJ242729)

92/63/65/81

87/78/82/68 80/69/62/63 85/90/86/85 98/91/87/96

Pa. scintillans W3849 ( AJ619944-47 ) Pa. scintillans W3793 ( AJ619940-43 ) Pa. scintillans W3862 ( AJ619948-51 ) Pa. scintillans W4545 ( AJ619952-55 )98/94/94/89 52/90/89/-68/75/78/89

A. foveata (?) BEG33, W3293 (AJ306442) A. laevis WUM46, W3107 (Y17633) A. undulata WUM18, W2941 (AJ306441) A. rugosa WV949 (Z14005) A. longula W3302 (AJ306439) A. spinosa WV860 (Z14004) E. sp. WV201 (Z14011) E. colombiana FL356 (Z14006) A. laevis AU211-3 (AJ250847) A. sp. W3424 (AJ306440)

99/--/50/95

68/54/47/100

D. spurca W3239 (AJ276077-78, Y17649-50) G. versiforme BEG47 (AJ132666, AJ276088, X86687, Y17651) G. sp. ' etunicatum-like' W2423 (AJ276076, AJ301860&63, Y17644)

94/82/72/100

G. proliferum DAOM226389 (AF213462) G. intraradices DAOM197198 (AJ301859, X58725) G. sinuosum MD126 (AJ133706) G. coronatum COG1, W3153 (AJ276086) G. mosseae BEG12 (U31995, U96139) G. geosporum BEG11, W992 (AJ132664, AJ245637, Y17643) G. claroideum BEG14 (AJ276075, AJ301851-52, Y17636) G. luteum SA101 (AJ276089, U36591, Y17645) G. etunicatum UT316, W3093 (Y17639, Z14008) 0.02

99/59/66/99

Figura 15.1. - rvore filogentica da Ordem Diversisporales com membros da ordem Glomerales (Glomus grupos Aa, Ab e B) como grupo externo. Distncias foram obtidas por Maximum Likelihood ML. Valores de bootstrap acima das ramificaes correspondem aos mtodos NJ, MP, ML, ML-QP. Linhas grossas e mdias indicam grupamentos com suporte de bootstrap igual ou superior a 95% e 85%, respectivamente. Topologias sem valor indicam que a ramificao no obteve suporte com a respectiva anlise. Topologias que no receberam suporte de pelo menos 50% em algum dos mtodos foram colapsadas para politomias. A., Acaulospora; K., Kuklospora (=Entrophospora); P. Pacispora; Gi., Gigaspora; G., Glomus; and S., Scutellospora. NJ - Neighbour Joining; MP - Maximum Parsimonia; ML Maximum Likelihood, ML-QP - Maximum Likelihood Quartet- Puzzling. Para maiores detalhes ver Walker et al. 2004.

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terizaram genes ribosomais de trs espcies inseridas no gnero Glomus (G.fulvum, G. pulvinatum e uma espcies descrita recentemente G. megalocarpum) que formam esporocarpos. Por meio de anlise filogentica molecular esses autores concluram que essas trs espcies formam um grupo monofiltico que irmo do gnero Diversispora, e possivelmente constituem um novo gnero. Segundo esses autores, essa descoberta ter conseqncias importantes para definio de txons na Ordem Diversisporales e facilitaro a identificao desses fungos pelo emprego de seqncias do rDNA obtidas de razes colonizadas, em amostras de campo. Sieverding & Oehl (2006) revisaram o gnero Entrophospora, com base na morfologia dos esporos e em evidncias moleculares obtidas por outros autores (Rodriguez et al., 2001) sobre a posio da espcie tipo Entrophospora infrequens. Das cinco espcies descritas no gnero Entrophospora, duas permaneceram nesse gnero (E. infrequens e E. baltica), porm o mesmo foi transferido para uma nova famlia, Entrophosporaceae (Tabela 15.1). O gnero Kuklospora foi criado, para acomodar as espcies K. colombiana e K. kentinensis (E. colombiana e E. kentinesis respectivamente). Esse gnero foi includo na famlia Acaulosporaceae, sendo sua afiliao sustentada tanto por caracteres morfolgicos quanto por informaes contidas nos genes ribossomais. Foi criado tambm o gnero Intraspora, que acomodou a espcie I. schenckii (E. schenckii). Esse gnero foi afiliado famlia Archaeosporaceae com base na morfologia dos esporos e nas caractersticas do miclio, que como a outra espcie dessa famlia (Archaeospora trappei), adquire colorao fraca quando corado em azul de tripano. O gnero Appendicispora foi proposto a partir da reavaliao de caracteres morfolgicos dos esporos, da colonizao radicular, da ontogenia dos esporos e da germinao da espcie Acaulospora appendicula e espcies relacionadas inseridas no gnero Archaeospora, e de informaes de seqncias de DNA do gene 18S rRNA de algumas espcies que se relacionavam com grupos basais dos glomeromicetos (Spain et al. 2006). Com base nessas evidncias, o gnero Appendicispora foi relacionado famlia Archaeosporaceae (Spain et al. 2006) e posteriormente reclassificado para a famlia Appendicisporaceae (Walker et al. 2007b). A famlia Appendicisporaceae foi proposta com base na anlise filogentica, de seqncias de DNA do gene 18S rRNA de algumas espcies que se relacionavam com grupos basais dos glomeromicetos. Os resultados obtidos com a sistemtica molecular despertaram o

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interesse por uma anlise mais detalhada na morfologia dos esporos das espcies classificadas na famlia Archaeosporaceae. Essa famlia apresentava-se parafiltica devido relao com a famlia Geosiphonaceae. Alm dessas evidncias, os autores verificaram que a espcie Glomus callosum agrupava-se junto com Archaeospora leptoticha e Ar. gerdermannii, bem como, com uma espcie no descrita. Para resolver estas inconsistncias, foi criado o gnero Ambispora tipificado pela espcie Ambispora fennica (sp. nova) que dimrfica, bem como Am. callosa (Glomus callosum) que aparentemente forma somente esporos glomides, Am. leptoticha (Ar. leptoticha) e Am. gerdermannii (Ar. gerdermannii) ambas dimrficas. O nome do gnero Ambispora no foi considerado como vlido devido a precedncia da publicao de Spain et al. 2006. Devido a isso, as espcies descritas foram reclassificadas para o gnero Appendicispora (Walker et al. 2007b, ver Tabela 15.1). Atualmente, tem ficado claro que a forma glomide dos glomeroesporos que at ento era uma caracterstica tpica de espcies do gnero Glomus, compartilhada por famlias e gneros que apresentam grande distncia evolutiva (http://www.AMF-phylogeny.com). Devido a isso, vrias espcies pertencentes ao gnero Glomus, que contm o maior nmero de espcies descritas, esto sendo reclassificadas para outras ordens, famlias ou gneros, com base em anlises mais detalhadas da morfologia dos esporos e, principalmente, por evidncias obtidas da filogenia molecular. At agora, a sistemtica molecular dos glomeromicetos tem sido baseada quase que exclusivamente na anlise de seqncias que codificam para a sub-unidade menor (18S rDNA) do gene ribossomal. Os resultados obtidos por meio dessas anlises tm indicado consistentemente que os glomeromicetos formam um grupo monofiltico e que as famlias Gigasporaceae e Acaulosporaceae tm um ancestral comum. Alis, esses so os principais conflitos entre a sistemtica molecular e a cladstica, proposta pelo Dr. Joseph Morton. Segundo esse pesquisador, Gigasporineae (Gigasporaceae) e Glomineae (Paraglomeraceae, Acaulosporaceae, Archaeosporaceae e Glomeraceae) surgiram independentemente, por evoluo em paralelo, e no por compartilharem um ancestral comum, ou seja, Glomeromycota seria polifiltico (Morton, 2000). A relao entre Acaulosporaceae e Gigasporaceae foi confirmada pela anlise parcial de genes que codificam para a ?-tubulina (Corradi et al., 2004) e 25S rDNA (da Silva et al., 2006), mas no pela anlise conjunta de

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fragmentos de genes que codificam para o Fator de Elongao 1 alfa e actin (Helgason, Watson, & Young, 2003). Porm, todos esses trabalhos confirmam a monofilia dos glomeromicetos. Recentemente, a monofilia e a relao do filo Glomeromycota com Ascomycota e Basidiomycota tambm foi confirmada atravs de anlise conjunta de seis genes/regies, em um trabalho assinado por Dr. Joseph Morton e Dr. Arthur Schler (James et al., 2006). A grande maioria das mudanas propostas pela sistemtica molecular, at o momento, tem sido respaldada por caractersticas morfolgicas (Redecker, Morton, & Bruns, 2000 a, b; Schler, Schwarzott, & Walker, 2001; Oehl & Sieverding, 2004; Walker et al., 2004; Walker & Schler, 2004; Sieverding & Oehl, 2006; Walker et al., 2007a). Dentre as mudanas propostas o nico gnero que no tem suporte morfolgico o Diversispora (Diversisporaceae), representado pela Diversispora spurca (Glomus spurcum). No entanto, aparentemente, essa espcie semelhante em morfologia s espcies do gnero Glomus, contudo no existe informao sobre o modo de germinao para essa espcie, nem para as espcies da famlia Entrophosporaceae (Tabela 15.1). O modo de germinao parece ser o carter primitivo que une todas as famlias da ordem Diversisporales (Tabela 15.1), enquanto a formao de vesculas pode ser um carter primitivo (presente no ancestral comum) ou derivado (modificao do carter primitivo, no est presente em todos os subgrupamentos); ou ainda pode ter surgido independentemente por convergncia ou evoluo em paralelo, uma vez que elas so ausentes ou raras em algumas linhagens basais (ver Tabela 15.1). As clulas auxiliares parecem ter surgido posteriormente na evoluo da ordem Diversisporales, e sua funo est ligada ao acmulo de reservas, que seriam utilizadas para o reparo do miclio e/ou formao de esporos (de Souza & Declerck, 2003; Declerck et al., 2004). A sistemtica molecular como qualquer outra sistemtica passvel de erros de interpretao, sendo comuns equvocos na identificao de caracteres homlogos e homoplsicos. Da mesma forma, genealogias feitas com genes nem sempre representam a genealogia de espcies. No entanto, na sistemtica molecular, esse problema pode ser contornado pela anlise de um nmero grande de caracteres informativos provenientes de um ou mais genes, aliados ao teste e ao uso adequado de modelos de substituio do DNA ou protenas. Outro ponto a ser considerado na sistemtica molecular o nvel de discriminao almejado pela anlise. Por exem-

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plo, os genes ribossomais so conservados entre todos os grupos de organismos conhecidos. Como conseqncia, esse gene permite a reconstruo da filogenia conjunta de procariotos e eucariotos. Alm disso, a taxa de substituio de nucleotdeos no 18S rDNA extremamente baixa, sendo estimada em 6,67.10-11 6,42.10-11 por ano para FMA (Simon et al., 1993). Por outro lado, essas caractersticas impedem muitas vezes a discriminao de espcies prximas. Assim, FMA que apresentam diferenas ao nvel dos genes ribossomais provavelmente j divergiram h pelo menos alguns milhes de anos. Para discriminao de espcies prximas, genes ou regies gnicas menos conservadas devem ser preferidas, por exemplo, as regies ITS que ocorrem entre as subunidades menor e maior dos genes ribossomais. Essas regies so to variveis que o alinhamento de seqncias s possvel entre organismos prximos. Como concluso, a classificao atual dos glomeromicetos aponta para um grupo diverso com grande distncia evolutiva entre as ordens e as famlias. Essa evidncia parece estar de acordo com a longa trajetria evolutiva desse grupo de fungos e sua diversificao, conforme discutido no item 2.

DIVERSIDADE

DE ESPCIES NO

F I L O G L O M E R O M Y C OTA

At o momento, so conhecidas cerca de 202 espcies de FMA (Tabela 15.1) sendo esse nmero de espcies inicialmente contabilizado com base na lista de espcies apresentada no site http://www.AMF-phylogeny.com, e posteriormente atualizada com descries publicadas recentemente. A pequena riqueza de espcies conhecidas dos glomeromicetos paradoxal, principalmente quando comparada origem ancestral (1200-1400 MAA) desse grupo de fungos, grande diversidade de plantas que esses fungos se associam, e ao longo perodo de co-evoluo da simbiose micorrzica e a ocorrncia quase que generalizada dos FMA nos ecossistemas terrestres. Alm disso, os microsimbiontes tendem a desenvolver especificidade hospedeira em simbioses altamente desenvolvidas, como o caso da simbiose micorrzica arbuscular. A baixa riqueza de espcies e a ausncia de especificidade hospedeira em FMA tm sido explicadas pelo modo de reproduo exclusivamente clonal dos glomeromicetos e pelo fato de se poder crescer diferentes espcies de

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FMA utilizando uma nica espcie de planta hospedeira (Smith & Read, 1997). No entanto, se esse dado estiver correto, a baixa diversidade e especificidade hospedeira dos FMA indicam que esse grupo de organismos apresenta grande redundncia funcional. Por outro lado, esse dado pode indicar que os critrios utilizados para definir espcies em glomeromicetos podem ser insuficientes para diferenciar espcies e suas funes ecolgicas, conforme discutido anteriormente. Alm disso, existe uma clara necessidade de se conduzirem inventrios de longa durao, para que se possa acessar com maior preciso a diversidade dos FMA. Por exemplo, Bever e colaboradores, em um trabalho intitulado Fungos micorrzicos arbusculares: mais diversos do que os olhos podem alcanar e a histria ecolgica do porqu, reportam o resultado de cinco anos de inventrio de uma comunidade de FMA proveniente de um campo agrcola abandonado na Carolina do Norte, Estados Unidos da Amrica. A rea experimental, com extenso de um hectare, foi abandonada h mais de 60 anos e desde ento foi mantida como pastagem. A comunidade de plantas nessa rea composta por aproximadamente 50 espcies. Em cinco anos de inventrio, por meio de amostragens em campo e cultivo-armadilha, os autores reportaram uma riqueza de 37 espcies de FMA, sendo que 1/3 dessas eram de espcies no conhecidas (Bever et al., 2001). Esses pesquisadores consideraram notvel a riqueza de FMA em um nico hectare, e ento concluram que uma das razes da suposta baixa riqueza de FMA que enquanto as plantas se apresentam para serem contadas e identificadas os FMA so muito mais difceis de serem acessados. Essa dificuldade advm do modo de crescimento subterrneo, da total dependncia do fungo pela planta para crescer e completar seu ciclo reprodutivo e principalmente da falta de conhecimento da biologia e da ecologia desse grupo de fungos. Alm disso, a riqueza encontrada foi baseada somente em critrios morfolgicos e em esporos obtidos por culturas-armadilha e extrao direta do solo. No entanto, algumas espcies de FMA no so detectadas por esses mtodos (Clapp et al., 2002). Alm do mais, Bever & Morton (1999) estudaram a hereditariedade do tamanho e formas (redonda ou alongada) de esporos de cinco isolados de Scutellospora pellucida obtidos de uma rea de 75 m2 localizada no mesmo campo experimental citado acima. Todos os cinco isolados foram obtidos inicialmente a partir de culturas-armadilha mono-especficas de trs espcies de plantas diferentes e multiplicados posteriormente a partir de um esporo em Sorghum. Qua-

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tro dos cinco isolados avaliados, apresentaram diferenas estatisticamente significativas quanto forma dos esporos, e esse carter apresentou alta hereditariedade. Esse resultado no condiz com o modo de reproduo exclusivamente clonal se esses isolados realmente pertencessem mesma espcie. Outro resultado, gerado pela anlise molecular de duas estirpes de Gigaspora gigantea (NC110A e NC150) isolados desse local, indicou diferenas claras no padro de bandas, obtidas por anlise do polimorfismo intraespecfico do 18S rDNA por meio da tcnica do PCR-DGGE (Figura 15.3), (de Souza et al., 2004). A aparente ausncia de especificidade hospedeira e o modo de reproduo clonal tm sido utilizados para explicar a baixa riqueza de espcies nesse grupo de fungos. No entanto, estudos de diversida- Figura 15.3. - Anlise do polimorfismo intra-especfico da de baseados em tcnicas de biologia molecular tm regio V9 da subunidade menor revelado grande riqueza de espcies baseadas em do gene ribosomal (18S rRNA) em dois isolados de Gigaspora seqncias de DNA (Unidades de Taxonomia Ope- gigante NC110A e NC150 por DGGE racional). Por exemplo, Wubet e colaboradores ava- (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) isolados do mesmo liaram a diversidade molecular de FMA colonizan- stio na Carolina do Norte, Estados do razes de Prunus africana, uma espcie arbrea Unidos da America. (fonte de Souza et al. 2004). com propriedades medicinais que est em risco de extino. Amostras de razes foram coletadas de duas localidades na Etipia, e a diversidade de FMA foi avaliada por meio da amplificao da regio ITS com iniciadores especficos para FMA, seguido de clonagem e seqenciamento. Foram encontradas 109 seqncias relacionadas ao filo Glomeromycota. Aps anlise filogentica conjunta do gene 5.8S rRNA e da regio ITS2, foram identificados vrios FMA, sendo que 20 UTO identificadas no apresentaram homologia com seqncias de espcies conhecidas nos bancos de dados (Wubet et al., 2003). Alm disso, um nmero crescente de evidncias aponta para a ocorrncia de comunidades distintas de FMA em plantas que coabitam o mesmo local (ver revises San-

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ders, 2003; Fitter, 2005; Fitter et al., 2005). O trabalho de Vandenkoornhuyse e colaboradores um timo exemplo disso. Esses autores analisaram a diversidade de FMA via T-RFLP (Terminal restriction fragment length polymorphism) em 89 amostras de razes de trs espcies de plantas que coabitavam em parcelas de um experimento de campo. As comunidades de FMA nas trs espcies de plantas apresentaram-se estatisticamente diferentes (Figura 15.4) (Vandenkoornhuyse et al., 2003), indicando a ocorrncia de associao preferncial entre os simbiontes. Os resultados obtidos tanto por meio de inventrios baseados na anlise morfolgica de esporos quanto via anlise de diversidade molecular corroboram a hiptese de que os FMA formam um grupo diverso de organismos. Conforme citado acima, Bever e colaboradores (2001) reportaram uma riqueza de 37 espcies de FMA sendo 1/3 de espcies no descritas em um hectare com uma riqueza de 50 espcies de plantas. A riqueza das plantas terrestres tem sido estimada entre 200.000 a 400.000 espcies, e estima-se que trs quartos dessas espcies so potencialmente micotrficas; se a mesma relao entre riqueza de plantas e de FMA encontrada por Bever e colaboradores (2001) se mantiver em outros ecossistemas, a riqueza de FMA que est espera de ser descrita imensa e deve estar na faixa de 37.000 a 78.000 mil espcies. O Brasil um pas megadiverso, e j foram reportadas mais de 82 espcies de FMA em seu territrio, o que representa aproximadamente 40% da diversidade total (202 espcies) conhecida de FMA. Na maioria dos inventrios feitos no Brasil existem citaes de espcies no conhecidas. No entanto, at o momento somente cinco espcies de FMA foram descritas com base em material coletado no Brasil, a saber: Gigaspora ramisporophora (Spain, Sieverding, & Schenck, 1989), Scutellospora cerradensis (Spain & de Miranda, 1996a), Scutellospora scutata (Walker & Diederich 1989), Paraglomus brasilianum (Glomus brasilianum, Spain & de Miranda, 1996b) e Scutellospora rubra (Strmer & Morton, 1999b). Algumas razes para essa aparente discrepncia sero discutidas adiante. O ponto-chave para se descrever uma nova espcie est na comprovao de que o organismo encontrado no foi descrito anteriormente. Nesse sentido necessrio apresentar evidncias que comprovem que a espcie a ser proposta como nova para a cincia tem caractersticas nicas em relao s espcies conhecidas. Infelizmente, no caso dos FMA o conceito de espcies ainda no esta estabelecido, con-

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A

B

Figura 15.4. - Similaridade entre comunidades de FMA, em razes de trs espcies de plantas (Agrostis capillaries ?, Poa pratensis e Festuca rubra ?) coabitando as mesmas parcelas. A. Apresentada como uma rvore parsimoniosa curta sem enraizamento, quanto maior a proximidade entre os trminos maior a semelhana entre os perfis de T-RFLP obtidos. B. Apresentada como uma anlise de PCA no-centrada, indicando diferenciao entre comunidades de FMA de acordo com a planta hospedeira. Para cada espcie de planta elipses de confidncia (P < 0,05) esto indicadas e os crculos mostram o centro gravitacional (valor mdio). Cada trmino corresponde a um perfil de T-RFLP da comunidade de FMA obtido de uma nica raiz. Modificado de Vandenkoornhuyse et al. (2003).

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forme ser discutido mais adiante no texto. Somado a isso, no existe nenhuma publicao ou base de dados completa que apresente caractersticas morfolgicas e moleculares de todas as espcies conhecidas. Para dificultar ainda mais, algumas descries, principalmente as mais antigas, foram feitas a partir de esporos coletados diretamente do campo, o que muitas vezes prejudica a qualidade da anlise morfolgica e conseqentemente a descrio da espcie, dificultando comparaes futuras. Alm do que as descries mais antigas no trazem uma riqueza de detalhes sobre a morfologia dos esporos, a germinao, as estruturas intra-radiculares, etc, devido falta de critrios para descrio. Descries com dados morfolgicos e moleculares s foram publicadas a partir do ano 2000, com as descries do Glomus proliferum (Declerck et al., 2000) e da Scutellospora projecturata (Kramadibrata et al., 2000). No entanto, a incluso de dados moleculares (seqncias de DNA) ainda no obrigatria segundo o Cdigo Internacional de Nomenclatura Botnica. E vrias descries taxonmicas ainda esto sendo publicadas sem essa informao. Com o intuito de facilitar a comparao entre espcies de glomeromicetos, alguns pesquisadores vm construindo e mantendo timas pginas na web. Aqui chama-se a ateno para trs websites que trazem timas informaes sobre taxonomia e filogenia dos glomeromicetos. A pgina da Coleo Internacional de Fungos Micorrzicos (Vesculo) Arbusculares (http://invam.caf.wvu.edu/), mantida pelo Dr. Joseph Morton e a pgina do Departamento de Patologia de Plantas da Universidade de Agricultura Szczecin da Polnia, mantida pelo Dr. Janusz Blaszkowski (http://www.agro.ar.szczecin.pl/~jblaszkowski/index.html) trazem vrias descries ilustradas com timas fotomicrografias de isolados mantidos nesses bancos. O nmero de espcies descritas nessas duas pginas corresponde a aproximadamente 54% do nmero total de espcies conhecidas, sendo que seis dos treze gneros reconhecidos atualmente no filo Glomeromycota tm 100% de representatividade em relao ao nmero total de espcies conhecidas (Tabela 15.2). Por outro lado, os gneros Acaulospora, Appendicispora, Gigaspora, Glomus, Pacispora e Scutellospora, tm vrias espcies descritas que no esto representadas nesses bancos (Tabela 15.2). J a pgina organizada e mantida pelo Dr. Arthur Schler (http://www.AMF-phylogeny.com) enfatiza a sistemtica molecular, e traz a atual classificao filogentica dos glomeromicetos, disponibilizando tambm uma gama de informaes teis tais como: arqui-

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vos com alinhamentos de seqncias do gene 18S rRNA; acesso ao index fungorum species fungorum; lista com o nome das espcies descritas; acesso ao texto completo de publicaes originais contendo descries de espcies de glomeromicetos; entre outras informaes. Esse pesquisador tambm mantm atualizadas as informaes taxonmicas do filo Glomeromycota no site do NCBI. O nmero de espcies descritas com seqncias depositadas no NCBI menor do que o nmero de espcies presentes nas duas colees citadas acima (Tabela 15.2), indicando a necessidade de um esforo por parte da comunidade de micorrizologistas para aumentar a representatividade de seqncias de DNA de espcies de FMA nos bancos de dados de seqncias de cidos nuclicos de livre acesso. Para ilustrar algumas dificuldades e avanos em tcnicas de identificao e caracterizao de espcies de FMA, so apresentados a seguir exemplos de duas espcies no descritas de FMA

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ESTUDOS

DE CASO

N O D E S C R I TA D O

I. IDENTIFICAO DE UMA ESPCIE G N E RO G I G A S P O R A : C A R AC T E R I Z A O

MORFOLGICA VERSUS MOLECULAR

As espcies conhecidas de Gigaspora apresentam grande semelhana morfolgica. Nesse gnero, a nica espcie que apresenta um carter que a diferencia claramente das outras a Gigaspora gigantea. Essa espcie apresenta esporos com colorao amarelo-esverdeada. Porm, a colorao no est somente na parede do esporo, como comum para outras espcies. Nessa espcie o citoplasma do esporo apresenta colorao. Alm de autofluorescncia, com colorao amarelo-esverdeada brilhante, quando exposto luz com comprimento de onda na faixa de 450490 nm (Sejalon-Delmas et al., 1998). A colorao no citoplasma dessa espcie pode ser facilmente identificada no sobrenadante, obtido de 50 esporos macerados em 40 L de soluo tampo TRIS-EDTA (10:1 mM pH 7,5) durante processo de extrao de DNA. Enquanto que para outras espcies desse gnero, o extrato obtido aps centrifugao apresenta-se incolor. De Souza et al., (2004) desenvolveram um mtodo para identificar espcies do gnero Gigaspora, baseado na discriminao do polimorfismo inter e intra- especfico da regio V9 do 18S rDNA tcnica do PCR-DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis). A tcnica foi testada em 48 estirpes de Gigaspora, representando 7 das 8 espcies descritas inclusive estirpes de Gigaspora ramisporophora e Gigaspora candida, consideradas pela anlise morfolgica como sinnimas, respectivamente, de Gigaspora margarita e Gigaspora rosea (Bentivenga & Morton, 1995). Com este mtodo foi possvel diferenciar e identificar todas as espcies testadas. Alm disso, os perfis de PCR-DGGE forneceram subsdio para identificao de possveis erros de identificao feitos com base na morfologia dos esporos. E tambm para diferenciar alguns isolados geogrficos das espcies G. albida, G. gigantea e G. margarita, mas no para G. rosea. Dentre as estirpes avaliadas, 8 eram de G. gigantea, e todas correspondiam s caractersticas morfolgicas dessa espcie, inclusive quanto cor do citoplasma. Porm, a estirpe G. gigantea UFLA872 isolada e mantida pelo Dr. J.O. Siqueira na UFLA, Lavras, MG, apresentou um padro de bandas que permitiu a diferenciao dessa estirpe, no s das outras estirpes de G. gigantea, mas de todas as estirpes testadas (de Souza et al., 2004). Sugerindo que essa es-

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tirpe constitui uma espcie no descrita. Na figura 15.5, pode-se ter uma idia do polimorfismo encontrado (a publicao completa desse trabalho esta disponvel on line no stio da revista). Por meio da anlise filogentica do 18S rDNA, foi possvel confirmar que essa espcie difere das outras espcies descritas (Figura 15.6). Essa anlise coloca essa espcie como basal em relao s outras espcies de Gigaspora conhecidas. Essa informao importante para determinar o centro de origem desse grupo de fungos. As espcies G. ramisporophora e G. candida apresentam polimorfismo que as diferencia claramente daquelas com as quais foram sinonimizadas (Figura 15.5). A G. ramisporophora apresenta maior semelhana com G. albida do que com a G. margarita, apesar da morfologia no indicar isso. G. candida tambm apresentou um polimosfismo que a diferencia claramente da G. rosea, espcie com a qual foi sinominizada. A estirpe Gi. albida INVAM 927 100% idntica ao perfil de G. rosea FL105 (Figura 15.5) e de outras estirpes de G. rosea (de Souza et al., 2004), indicando um erro de identificao. A G. albida UFLA24 similar G. ramisporophora CNPAB22. Essas duas estirpes diferem pela posio de uma nica banda, mas ambas so distintas das estirpes de G. albida, confirmando que G. ramisporophora uma espcie distinta das outras (Firura 5).Figura 15.5. - Perfil de DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) de estirpes de Gigaspora obtidos pela anlise da regio V9 do 18S rDNA. Colunas: 1. G. albida*BR607A; 2. G. albida BR601; 3. G. albida UFLA24; 4. G. albida CL151; 5. G. albida FL713; 6. G. albida INVAM927; 7. G. candida* BEG17; 8. G. rosea* FL105; 9. G. ramisporophora* CNPAB22; 10. G. margarita CNPAB1; 11. G. gigantea VA105C; 12. G.gigantea UFLA872; 13. G. gigantea* MN453A-7; 14. G. gigantea MA453A; 15. G. gigantea MN414D; 16. G. gigantea MN922A; 17. G. gigantea NC110A; 18. G. gigantea NC150; 19. G. gigantea CUT-Douds; 20. G. gigantea CUTBecard. (*) Estirpes consideradas como tipo ou ex-tipo. ?Diferenas entre perfis das estirpes G. ramisporophora (coluna 9) e G. albida UFLA24 (coluna 3). Note similaridade entre perfil coluna 6 e 8 indicando que a estirpe G. albida INVAM927 = G. rosea FL105.

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Figura 15.6. - rvore filogentica do gnero Gigaspora mostrando posio da estirpe Gigaspora UFLA872 em relao a outras espcies de Gigaspora. Como grupo externo foram utilizados seqenciais do gnero irmo Scutellospora. Anlise filogentica foi inferida por anlise Baysiana, utilizando seqncias de 2300 pb, cobrindo os genes ribossomais 18S e 5.8S e as regies intergnicas ITS1 e ITS2, sendo utilizados dois modelos de substituio, um para os genes ribossomais e outro para a regio intergnica, com oito correntes, 50.000 geraes e burnin 5001. Valores de suporte para bifurcaes da rvore representam probabilidade posterior. Note-se a posio basal da estirpe Gigaspora UFLA 872 em relao a outras espcies de Gigaspora e em relao posio da Gigaspora girantea (linhas tracejadas ).

S. reticulata 10 A1UFLA872 B1UFLA872 G. decipiens 2W3516 98 G. decipiens 4 W3516 100 100 100 S. reticulata 9 100 100 100 100 S. reticulata 8

G. decipiens 9W3516

100

73

100

100 68 99

99

G. rosea R16BEG9

100 51 99 67 100 99

G. gigantea 10VA105C 100 G. gigantea 3VA105C

99

0.1

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Esse exemplo demonstra o potencial de tcnicas moleculares para a discriminao de espcies nesse gnero e assinala que a anlise morfolgica pode ser insuficiente para discriminar espcies desse gnero. Nesse caso, a anlise molecular facilita a discriminao entre as espcies e pode ser utilizada para acessar a diversidade desse grupo de fungos em amostras obtidas diretamente de ambientes naturais, pela amplificao do DNA com iniciadores especficos para a famlia Gigasporaceae (de Souza et al., 2004; de Souza et al., 2005b).

ESTUDO

DE CASO

N O D E S C R I TA

II. IDENTIFICAO DE UMA ESPCIE D O G N E RO G LO M U S : C O M B A S E N A

O N TO G E N I A D O S E S P O RO S

Estudos de ontogenia da formao de esporos tm sido utilizados, pela taxonomia clssica, para definir famlias, gneros e espcies em FMA (Morton & Benny, 1990; Franke & Morton, 1994; Strmer & Morton, 1997, 1999a). Aqui so apresentados dados sobre uma espcie de FMA (estirpe Glomus sp. CNPAB12), que dimorfica, ou seja, forma dois tipos de esporos. Porm, um dos padres ontogenticos dessa espcie nunca foi reportado anteriormente. A estirpe Glomus sp. CNPAB12 foi isolada, aps cultivo-armadilha, de amostras de solo coletadas de uma praa de sedimentos formada pela eroso intensa de um corte de estrada, localizado no Municpio de Barra do Pira, RJ. Esse stio fazia parte do Bioma Mata Atlntica. Porm, a vegetao acima do corte de estrada era de pastagem degradada. A descrio do local de coleta e das caractersticas fsico-qumicas do solo pode ser encontrada em (Santos et al., 2000). Na ocasio da coleta, a rea apresentava uma vegetao esparsa composta por sap (Imperata brasiliensis Trin) e capim gordura (Melinis minutiflora Pal. De Beauv.), e continha 466 esporos de FMA por 100 cm-3 de solo, entre os quais predominava Acaulospora rugosa, 238, seguida de Kuklospora colombiana (CNPAB15), 164, Glomus macrocarpum, 46 e Gigaspora ramisporophora (CNPAB22), 18 (Santos et al., 2000). Nomes seguidos do cdigo CNPAB indicam que as espcies foram incorporadas no Banco de Germoplasma da Embrapa Agrobiologia. Posteriormente, foi encontrada a espcie Scutellopora reticulata (CNPAB11), porm ocorrendo numa densidade baixa de 1 esporo.kg-1 de

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solo. Aps cultivo-armadilha, foram encontradas mais trs espcies, a estirpe Glomus sp. CNPAB12, Appendicispora leptoticha e Scutellospora gilmorei-like (CNPAB13). A estirpe Glomus sp. CNPAB12 foi estabelecida in vitro, em cultivo monoxnico com razes Ri T-DNA transformadas de trevo e/ou cenoura, segundo metodologia descrita em (de Souza & Berbara, 1999). A dinmica de desenvolvimento das colnias estabelecidas em cultivo monoxnico e da esporulao foram acompanhadas por quatro meses. Em todas as colnias estabelecidas, o fungo apresentou dimorfismo com formao de dois tipos diferentes de esporos. O primeiro tipo se caracteriza por esporos glomides que seguem o padro de diferenciao descrito para o Glomus clarum CNPAB5 (de Souza & Berbara, 1999) em que o desenvolvimento do esporo em tamanho e a diferenciao das paredes do esporo ocorrem gradativamente. No segundo tipo, a gnese dos esporos inicia-se com a formao de uma bolsa que se desenvolve at atingir o tamanho final do esporo (Figura 15.7A e 7C - ver encarte colorido), e simultaneamente ocorre grande acumulao de citoplasma, fazendo com que a bolsa adquira colorao branca opaca. Posteriormente, ocorre a diferenciao das paredes e gradativamente o citoplasma vai clarificando exibindo o esporo maduro (Figura 15.7B e 7D). Apesar da formao da bolsa se assemelhar ao saco esporfero formado durante a gnese de esporos na famlia Acaulosporaceae, nessa espcie, os esporos so formados no interior da bolsa. A bolsa formada pela hifa esporognica e, aps formao completa do esporo, apresenta-se como uma parede evanescente. No h formao de septo na base da hifa de sustentao como ocorre na famlia Acaulosporaceae. A hifa de sustentao permanece nos esporos e o tubo germinativo surge do interior da hifa de sustentao como no gnero Glomus. Aps a gnese completa, no h vestgios na morfologia desses esporos que possam ser utilizados para diferenci-los de outras espcies do gnero Glomus. Os esporos do tipo 1 so menores e podem ser vistos na Figura 15.7C e 7D. Essa espcie forma vesculas e arbsculos que adquirem colorao azul intensa quando corados com azul de metila (Figura 15.7E e 7F). A anlise de seqncias do gene 18S rRNA indicou que essa espcie pertence famlia Glomeraceae. A ontogenia dos esporos nessa espcie indica a existncia de variao no modo de formao de esporos dentro do gnero Glomus, mas no no modo de germinao dos esporos, sugerindo que o modo de germinao seja um carter primitivo nesse gnero.

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A descoberta de uma espcie no conhecida em uma rea intensamente erodida faz pensar na diversidade de FMA que possivelmente existia na Mata Atlntica que originalmente ocorria nessa rea. As evidncias apresentadas sugerem que os glomeromicetos, ao contrrio de serem um grupo de fungos com baixa riqueza de espcies e ausncia de especificidade hospedeira, apresentam na verdade caractersticas bem distintas (Fitter, 2005). Estudos recentes, como os acima indicados, sugerem a urgncia em se desenvolverem pesquisas sobre ecologia e diversidade desses fungos em biomas ameaados, como o caso da Mata Atlntica que apresenta apenas 7% da sua cobertura original. Infelizmente, conforme apontado pelo Dr. A. Fitter da Universidade de York, Inglaterra, a falta de conhecimento sobre algumas questes fundamentais da ecologia desses fungos ainda no nos permite avaliar a extenso do dano, causado pela perda da vegetao sobre a diversidade de FMA. Segundo esse cientista trs questes fundamentais devem e podem ser respondidas, atualmente, com o emprego de novas tcnicas (Fitter, 2005). Estas questes so: 1. Quo biodiversos so os solos naturais? 2. Micrbios tm biogeografia? 3. Existem micrbios raros ou at em risco de extino?

C O N C E I TO

D E E S P C I E E E V I D N C I A S D E A D A P TA O

E E S PE C I A O E M G LO M E RO M I C E TO S

Espcies so as unidades bsicas em estudos de ecologia e evoluo. E, atualmente tem ficado evidente a importncia de se refinar o conceito de espcie em fungos filamentosos. Por exemplo, Pringle & Taylor (2002) destacam a importncia da definio e diferenciao de espcies em fungos filamentosos para que se possa avaliar a performance desses organismos em condies naturais. Eles argumentam que na ausncia de dados sobre performance, hipteses sobre o significado de adaptaes fenotpicas ou mecanismos bsicos de evoluo, como a seleo natural, permanecem especulativas. Nesse contexto, sero discutidos abaixo resultados de pesquisa de dois projetos relevantes, porm de concluses questionveis, devido falta de definio de esp-

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cie. O trabalho de Koch et al., (2004) , sem dvida alguma, um marco importante na pesquisa sobre ecologia e gentica com FMA, por dois motivos: a metodologia empregada e a relevncia ecolgica das estirpes utilizadas. Alm disso, esse trabalho pioneiro na avaliao de caractersticas genticas quantitativas em estirpes de FMA. Esses pesquisadores comparam a performance e a variabilidade gentica entre estirpes de Glomus intraradices isolados de reas agrcolas contguas na Sua. Os fungos foram obtidos, primeiro, em culturas-armadilha e posteriormente multiplicados a partir de um esporo. A partir das culturas monospricas foram estabelecidas culturas in vitro em sistema monoxnico com razes transformadas. Essas culturas foram multiplicadas por trs geraes sucessivas in vitro, antes de iniciar o experimento. Esse procedimento necessrio para permitir que as variaes fenotpicas avaliadas possam ser relacionadas diretamente com a variao nas caractersticas genticas quantitativas. O crescimento do fungo in vitro facilitou tambm o isolamento de DNA fngico livre de contaminantes o que essencial para a aplicao da tcnica do AFLP? (Amplified Fragment Length Polymorfism). Eles encontraram diferenas na performance (produo de esporos e comprimento de hifas) e na variabilidade gentica medida por meio do polimorfismo obtido por AFLP??entre as estirpes avaliadas. Por outro lado, a diversidade gentica relativa total entre os isolados avaliados foi baixa, mesmo quando uma estirpe obtida do Canad foi includa na anlise. Posteriormente, esses autores verificaram que esses isolados contribuem de forma diferenciada para a performance de plantas (Koch, Croll, & Sanders, 2006), indicando que estirpes classificadas dentro de mesma espcie so funcionalmente diversas. Outro exemplo importante vem dos trabalhos de Weissenhorn, Leyval, & Berthelin, (1993) e Weissenhorn et al., (1994). Eles avaliaram a tolerncia de isolados de Glomus mosseae obtidos de reas adjacentes, poludas ou no com metais pesados (Cd e Zn), e tambm em relao a uma estirpe referncia mantida no laboratrio. Testes de germinao demonstraram que os isolados obtidos de reas contaminadas apresentaram maior tolerncia presena de metais pesados do que os isolados obtidos de reas contguas no contaminadas. Esses dois projetos demonstram que diferentes isolados de uma mesma espcie so funcionalmente distintos. E sugerem que os glomeromicetos apresentam capacidade de adaptao a mudanas antrpicas. Porm, eles no so conclusivos por falta de uma caracterizao mais adequada das estirpes avaliadas, ou seja, a di-

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ferena em performance encontrada meramente especulativa devido falta de definio de espcie nesses trabalhos. Espcies, em organismos superiores, tm sido definidas com base na capacidade de troca de material gentico. Nesse sentido, uma maneira de avanar o conceito de espcie em FMA foi publicado por Giovannetti et al., (2003). Esses pesquisadores avaliaram a capacidade de formao de anastomose e troca de material gentico (ncleos) entre estirpes de Glomus mosseae de origens geogrficas diferentes. A formao de anastomose ocorreu somente entre hifas originadas de esporos de mesma estirpe enquanto que hifas originrias de estirpes diferentes no formaram anastomose e apresentaram incompatibilidade vegetativa, com morte do miclio na regio de encontro de hifas de origens diferentes. Apesar da morfologia e da caracterizao molecular baseada em genes ribossomais indicar que esses isolados pertencem ao grupo do Glomus mosseae, o perfil de protenas solveis totais e de restrio da regio ITS dos isolados testados, nesse trabalho j apresentava diferenas, sugerindo a ocorrncia de barreiras genticas contra a troca de material gentico. A metodologia empregada nesse trabalho permite avaliar a troca de material gentico entre espcies/estirpes de FMA que formam anastomose espontnea, por meio de testes de compatibilidade vegetativa. Para espcies que no formam anastomose espontnea, como o caso da famlia Gigasporaceae, foi desenvolvido um mtodo pela Dra. N. Sejalon-Delmas baseado no mecanismo de reparo de hifas (de Souza et al., 2005 a). Esse mtodo tambm permite avaliar a compatibilidade entre estirpes. No entanto, o potencial dessas metodologias ainda no foi explorado o suficiente para avanar no conceito de espcie em FMA. Esses resultados fortalecem a idia de que uma mesma espcie definida com base na morfologia dos esporos pode representar uma variedade de unidades ecolgicas funcionalmente distintas. Atualmente vrios laboratrios dedicados ao estudo dos FMA esto desenvolvendo experimentos de evoluo. Nesses experimentos, linhagens originrias de mesma cultura-me so multiplicadas por um nmero de geraes em cultivo com culturas de razes in vitro, em meio com ou sem adio de um fator de seleo, por exemplo, presena de fungicida. Posteriormente, as linhagens obtidas so testadas quanto performance, mudanas genticas e compatibilidade vegetativa com a estirpe-me. Com esse tipo de experimento, espera-se elucidar mecanismos de adaptao e especiao nesse grupo importante de fungos.

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Entre os passos envolvidos na especiao (formao de uma nova espcie) esto o isolamento de indivduos da populao original, seguido de mudanas genticas e posteriormente a formao de barreiras genticas que impedem a troca de material gentico. Os trabalhos discutidos acima sugerem a ocorrncia desses passos em FMA. Alm disso, os dados apresentados evidenciam a necessidade de se aprimorar o conceito de espcie em FMA.

E S T R AT G I A S

PA R A A C E S S A R A D I V E R S I D A D E

DE ESPCIES DE

FMA

Comunidades de FMA tm sido analisadas, basicamente, por trs mtodos, (1) extrao direta de esporos, (2) cultivo-armadilha, ambos seguidos de identificao morfolgica de esporos (Douds & Millner, 1999; Bever, Pringle, & Schultz, 2002; Oehl et al., 2005) e (3) mtodos moleculares baseados na extrao, amplificao e caracterizao de cidos nuclicos (Clapp et al., 2002). O grupo de pesquisa da Universidade de York na Inglaterra traz um timo exemplo da necessidade de integrao dos mtodos de avaliao da diversidade e dinmica de comunidades de FMA. Os dados foram obtidos aps vrios anos de anlise de uma comunidade de FMA de um stio denominado Pretty Wood na Inglaterra. A diversidade de FMA foi avaliada por trs mtodos distintos: (a) caracterizao do DNA em razes de plantas; (b) extrao direta de esporos; e (c) cultivo-armadilha. Utilizando esses mtodos os pesquisadores identificaram espcies com 5 comportamentos distintos que demonstram que nenhum desses mtodos capaz de revelar toda a diversidade de FMA presente na rea. (1) Espcies abundantes em razes, com esporos raros ou ausentes; (2) Espcies raras em razes e esporos ausentes, mas facilmente obtidas em cultivo-armadilha; (3) Espcies abundantes em razes e esporos encontrados no solo e em cultivo-armadilha, mas no cultivveis isoladamente; (4) Espcies obtidas em cultivo-armadilha, mas no encontradas em razes ou como esporos no solo; (5) Espcies encontradas como esporos no solo, mas ausentes em razes e em cultivo armadilha (Clapp et al., 2002). Esse exemplo deixa claro que esses mtodos devem ser utilizados em conjunto de forma a se obter uma viso mais completa da biologia, ecologia, diversidade, estrutura de comunidades desses fungos e da inte-

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rao deles com plantas. Aqui so apresentados pontos fortes e fracos de cada um desses mtodos e formas de superar alguns deles. Esporos so o resultado de uma colonizao bem sucedida, sendo assim bons indicadores de processos ecolgicos e aes antrpicas que influenciam a comunidade de FMA. No entanto, os esporos no podem ser diretamente ligados a uma espcie de planta em particular, a no ser que a comunidade de plantas seja monoespecfica. Alem disso, esporos no esto presentes durante todo o ciclo de vida do fungo. Apesar dessas limitaes, esse mtodo tem sido utilizado, com bastante sucesso, para avaliar o efeito de culturas e prticas agrcolas sobre a estrutura de comunidades de FMA em reas agrcolas (Siqueira et al., 1987; Siqueira, Colozzifilho, & de oliveira, 1989; Cuenca & Meneses, 1996; de Souza et al., 1999; Boddington & Dodd, 2000; Carrenho et al., 2001; Franke-Snyder et al., 2001; de Miranda, Vilela, & de Miranda, 2005; Purin, Klauberg, & Strmer, 2006) e em processo de revegetao (Santos et al., 2000; Caproni et al., 2003; da Silva et al., 2005). O livro publicado pelo Dr. Edward Sieverding traz timos exemplos da aplicao dessa tcnica na avaliao do efeito de prticas agrcolas sobre comunidades de FMA (Sieverding, 1991). Outro trabalho excelente foi publicado pela Dra. Nancy C. Johnson e colaboradores. Eles utilizaram a avaliao da diversidade de esporos presentes no solo para demonstrar que monoculturas de milho e soja selecionam populaes diferentes de FMA e que essas populaes contribuam negativamente para o crescimento das plantas quando cultivadas em monocultura. Por outro lado, em rotao, a populao selecionada pelo milho promovia o crescimento da soja e vice-versa (Johnson et al., 1992). Esse estudo sugere assim a existncia de um efeito benfico da rotao sobre a manuteno de populaes efetivas de FMA. Apesar da qualidade desses trabalhos, o sucesso desse mtodo est diretamente ligado ao nvel de conhecimento taxonmico dos pesquisadores que conduzem a anlise, ao conhecimento prvio da diversidade da rea em estudo e do uso de culturas-armadilha. Culturas-armadilha podem ser utilizadas para superar alguns dos problemas da extrao direta de esporos, por exemplo, a baixa qualidade dos esporos obtidos para fins taxonmicos. Alm disso, culturas-armadilha facilitam o isolamento de FMA. Para aqueles interessados em utilizar essa tcnica recomenda-se a leitura de trabalhos j publicados (de Souza & Guerra, 1998; Brundrett, Abbott, & Jasper, 1999a; Brun-

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drett, Jasper, & Ashwath, 1999b). Esses trabalhos trazem diferentes tcnicas de cultura-armadilha e parmetros que influenciam o seu resultado. Segundo Brundrett e colaboradores mtodos de cultivo em potes fornecem informaes adicionais sobre a diversidade de FMA e complementam os dados obtidos pela anlise da ocorrncia direta de esporos obtidos das mesmas amostras, fornecendo assim informaes valiosas sobre a biologia desses fungos (Brundrett, Abbott, & Jasper, 1999a). Em cultivos em vasos, basicamente trs tipos de amostras tm sido utilizadas como fonte de inculo: esporos, razes colonizadas e solos (contendo esporos, hifas e razes colonizadas). A eficincia dessas trs fontes de propgulos varia grandemente entre as famlias de FMA (Brundrett, Abbott, & Jasper, 1999 a; Klironomos & Hart, 2002; de Souza et al., 2005 a). Devido a isso, elas devem ser utilizadas em conjunto para obter a mxima diversidade de FMA possvel, por exemplo, uso de razes como fonte de inculo para identificar fungos associados a uma planta em particular. Porm razes apresentam baixa eficincia na propagao de espcies da famlia Gigasporaceae (Brundrett, Abbott, & Jasper, 1999 a; Klironomos & Hart, 2002; de Souza et al., 2005 a). Como conseqncia, o emprego de razes como nica fonte de inculo para culturas-armadilha ir subestimar a diversidade de espcies da famlia Gigasporaceae. Os mtodos de cultivo-armadilha partem do princpio que FMA no apresentam especificidade hospedeira ou preferncia na multiplicao de uma determinada espcie de FMA. No entanto, os resultados obtidos por Brundrett e colaboradores mostram que o resultado do cultivo-armadilha influenciado pela espcie de planta utilizada, fonte de propgulo, regime de fertilizao e irrigao e durao do perodo de cultivo (Brundrett, Abbott, & Jasper, 1999 a; Brundrett, Jasper, & Ashwath, 1999 b). Assim, resultados obtidos pelo cultivo em vasos no refletem necessariamente a estrutura da comunidade de FMA presente em dado momento e devem ser interpretados com cautela. Para minimizar esse problema, tm sido utilizados vasos-armadilha estabelecidos com mais de uma espcies de planta, de preferncia de grupos funcionais (exemplo - gramneas, leguminosas, etc) e hbitos de crescimento (anuais, e perenes) distintos. Sempre que possvel recomendado o uso de plantas nativas e substrato preparado com o solo da rea em estudo. Segundo experincia pessoal, o melhor mtodo de cultivo-armadilha foi implementado por An et al. (1990) e An, Guo, & Hendrix (1993). Eles desenvolveram

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um bioensaio que combina o cultivo armadilha com a tcnica tradicional de microbiologia denominada Nmero Mais Provvel (NMP). A tcnica do NMP ou mtodo da diluio permite estimar a densidade de um microrganismo, sem necessidade de contagem direta, e consiste das seguintes etapas: diluies sucessivas, amostragens de cada diluio, incubao em meios apropriados e avaliao quanto ao crescimento do organismo desejado. A estimativa da densidade baseada na aplicao da teoria da probabilidade com algumas premissas (para uma descrio detalhada do mtodo ver de Souza & Guerra, 1998). O procedimento utilizado por An et al. (1990) permite estimar, de forma individualizada, a densidade da comunidade de FMA da amostra. Nesse caso, cada vaso contendo determinada diluio funciona como cultura-armadilha. Os propgulos infectivos presentes, ao colonizarem a raiz da planta hospedeira, produziro esporos, sendo que a identificao desses fornecer uma estimativa da densidade de propgulos infectivos de cada espcie fngica presente. Essa tcnica tem como premissa que todo propgulo infectivo de FMA da amostra tem capacidade para colonizar as razes da planta hospedeira e produzir esporos tpicos. Ela fornece dados sobre riqueza e abundncia permitindo assim estimar a diversidade de propgulos infectivos de uma comunidade de FMA. Outra vantagem desse mtodo advm da alta qualidade dos esporos obtidos para identificao taxonmica e da alterao da riqueza de espcies em funo da diluio seriada. Isso facilita o isolamento posterior dos fungos em cultura pura. No entanto, essa tcnica laboriosa, centenas de vasos por ensaio, e demorada, 3 a 6 meses de cultivo-armadilha mais o tempo necessrio para extrair e analisar os esporos de cada vaso (de Souza & Guerra, 1998). Mtodos moleculares baseados na extrao, amplificao por PCR e anlise de cidos nuclicos possibilitam a anlise da diversidade de microrganismos nos mais diversos ambientes e em todos os estdios de desenvolvimento. No caso dos FMA, inventrios moleculares tm sido direcionados, quase que exclusivamente, para a avaliao da diversidade de FMA em razes de plantas. Nesses inventrios tm sido demonstrado que espcies de plantas distintas coabitando em um ecossistema podem apresentar comunidades de FMA claramente distintas em suas razes, indicando a ocorrncia de preferncia da comunidade de FMA por hospedeiros especficos (Vandenkoornhuyse et al., 2002; Vandenkoornhuyse et al., 2003; Gollotte, van Tuinen, & Atkinson, 2004). At ento no havia evidncias de especificidade

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hospedeira em FMA. No entanto, comunidades similares de FMA coabitando espcies de plantas distintas tambm tm sido encontradas (Santos, Finlay, & Tehler, 2006), indicando que ausncia de especificidade hospedeira tambm ocorre em ambientes naturais. Foi demonstrada tambm a ocorrncia de mudanas temporais na comunidade de FMA colonizando razes de duas espcies arbreas tropicais no Panam, o que sugere que fungos que colonizam plantas nos estdios iniciais de crescimento podem no ser os mesmos que colonizam as mesmas espcies no estdio adulto (Husband, Herre, & Young, 2002 a). Atravs de inventrios moleculares detectaram-se tambm mudanas na estrutura de comunidades de FMA em estandes de plantas sadias e degeneradas em dunas costeiras (Kowalchuk, de Souza, & Van Veen, 2002), sugerindo que fatores que afetam a performance das plantas nesse ambiente podem estar ligados ou afetando a comunidade de FMA. Tem sido demonstrado tambm o efeito de prticas agrcolas sobre a diversidade de FMA (Helgason et al., 1998; Daniell et al., 2001; Hijri et al., 2006). Tcnicas moleculares permitem acessar a diversidade de FMA em plantas, de uma forma direta. Essa informao fundamental para se desenvolverem tecnologias baseadas nesses fungos, por exemplo, auxiliar na seleo de fungos eficientes e competitivos e posteriormente estudar a persistncia de estirpes introduzidas em inoculantes comerciais. Outra grande vantagem advm do enorme potencial que essas tcnicas tm para estudos da ecologia da simbiose micorrzica. Por exemplo, pode-se citar a caracterizao direta de FMA colonizando plantas arbreas nativas em risco de extino (Wubet et al., 2003). Os principais problemas dos mtodos moleculares so: (1) cobertura inadequada dos iniciadores (primers) utilizados no PCR, (2) amostragem no representativa e (3) mtodos inadequados de extrao de cidos nuclicos. Iniciadores utilizados em trabalhos de ecologia molecular microbiana so desenvolvidos a partir das informaes disponveis nos bancos de dados sobre seqncias de nucleotdeos (ex. NCBI) e da anlise filogentica dos grupos-alvo e no-alvo. No entanto, essas informaes so incompletas. E esto sendo atualizadas em uma velocidade muito grande, devido facilidade de se obterem seqncias de DNA e ao grande nmero de laboratrios dedicados pesquisa em ecologia e filogenia molecular. Por exemplo, o primeiro iniciador especfico para FMA, VAMS1, foi desenvolvido, basicamente, a partir de seqncias do gene 18S rRNA de trs espcies de fungos,

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Glomus intraradices, Gigaspora rosea e um fungo no micorrzico (Simon, Lalonde, & Bruns, 1992). Logo em seguida foi demonstrado que a regio 3 do iniciador no apresentava homologia com vrios FMA, falhando assim na amplificao desses fungos (para um histrico completo ver Clapp et al., 2002). O mesmo ocorreu com o iniciador AM1 designado por Helgason et al. (1998). Esse iniciador no amplifica fungos pertencentes s linhagens basais dos FMA (Redecker, Morton, & Bruns, 2000 b) e no apresenta homologia completa com alguns outros FMA, resultando em uma cobertura incompleta ou diferencial; amplificando tambm alguns fungos no micorrzicos (Basdio e Ascomicetos) (Helgason et al., 1998; Clapp et al., 2002; Husband et al., 2002 b). No entanto, apesar das limitaes, esse ainda um bom iniciador para avaliar a comunidade de FMA colonizando plantas, pois uma de suas qualidades se mantm: esse iniciador no amplifica DNA de plantas. Devido dificuldade de se obter um nico conjunto de iniciadores que tenha especificidade e homologia a todos os FMA, tem sido proposto o uso de iniciadores especficos ao nvel de famlia, gneros ou sub-gneros (Redecker, 2000). Essa pesquisa desenvolveu iniciadores para cobrir total ou parcialmente 5 famlias de FMA. No entanto, atualmente so conhecidas 10 famlias e para algumas delas ainda no existem seqncias de DNA disponveis, ou existe pouca informao. Por exemplo, das 7 espcies do gnero Pacispora existem seqncias disponveis de somente uma espcie P. scintillans. Apesar dessas limitaes esses iniciadores tm sido empregados com sucesso na avaliao da diversidade de FMA, como nos trabalhos de Wubet et al., (2003) e Hijri et al., (2006) citados acima. Amostragem um ponto crtico em inventrios de diversidade, tanto para coleta de solo, destinada avaliao de esporos, como para coleta de razes para avaliao de taxas de colonizao e diversidade de FMA. O sistema radicular de uma mesma planta pode conter dezenas de espcies de FMA, e j foram detectados at 4 espcies FMA de gneros diferentes em um nico centmetro de raiz (Van Tuinen et al., 1998). Devido ao custo mais elevado da anlise molecular, o planejamento da amostragem deve ser muito bem feito. A suficincia amostral deve ser determinada por meio de curva do coletor, como tambm para determinar o nmero de clones a serem analisados de uma biblioteca construda a partir da clonagem de produtos de PCR. Essas medidas so importantes para que se possam avaliar espcies abundantes, comuns e raras.

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Renker et al., (2006) avaliaram trs procedimentos para se trabalhar com DNA extrado de razes de plantas. Eles extraram DNA de 50 amostras de razes de Pl