fundamentos do diagnóstico laboratorial de doenças ... · infectados e de novo isolado em ......

Leonardo J. RichtzenhainProfessor Titular – FMVZ/USP

Fundamentos doDiagnóstico Laboratorial

deDoenças Transmissíveis


EPIDEMIOLOGIA

DiagnósticoLaboratorial

Epid. Analítica

Epid. Descritiva

GeoreferenciamentoSensoriamento

Remoto

Modelagem Matemática

Vacinologia


CONTROLE OU ERRADICAÇÃO DE DOENÇAS

ObjetividadeDiagnósticoLaboratorial

Medidas de DSA•Sacrifício•Interdição•Restrições Importação / Exportação•Indenizações•etc

$ $Sensível

EspecíficoSubjetividadeDiagnóstico Clínico


•Rede de Laboratórios de Diagnóstico de Referência

•Recomenda Técnicas

•Estabelece “Padrões Ouro”

World Organizationfor Animal Health

Comércio Internacionalde Animais e Produtos de Origem

Animal


Ectoparasitas

Endoparasitas

Fungos

Protozoários

Bactérias

Rickettsias

Vírus

Prions

Diversidade de Agentes


PrejuízosBarreirasSanitárias


Complexidadede

Diagnóstico


Abrangênciade

diagnósticodos

Laboratórios

D. Parasitárias

D. Fúngicas

D. Protozoários

D. Bacterianas

D. Virais

D. Priônicas


INFECÇÃO DOENÇA?

(Infectividade) (Patogenicidade)

D. Grave

D. Branda

(Virulência)


INFECÇÃO

EXUBERÂNCIA CLÍNICAQUEDA PRODUÇÃO

QUEDA PRODUÇÃO

DOENÇA

SUB-CLÍNICA


O BINÔMIO

INFECÇÃO X DOENÇA


Robert KochLouis Pasteur

•Carbunculo hemático

•Tuberculose

•Cólera

•Cólera Aviária

•Carbúnculo hemático

FinalSéculo

XIX


X

Binômio Infecção x Doença

TuberculoseRobert Koch

M. bovis

Postulados de Koch, 1877


POSTULADOS DE KOCH, 1877

1. A presença do agente deve ser sempre comprovada em todos os indivíduos que sofram da doença em questão e, a partir daí, isolada em cultura pura.

2. O agente não poderá ser encontrado em casos de outras doenças.

3. Uma vez isolado, o agente deve ser capaz de reproduzir a doença em questão, após a sua inoculação em animais experimentais.

4. O mesmo agente deve poder ser recuperado desses animais experimentalmente infectados e de novo isolado em cultura pura.

Agente X Doença Y


Sífilis LepraIsolamento “Cultura pura”

?


POSTULADOS DE EVANS

1976

ALFRED S. EVANS M.D., M.P.H.YALE UNIVERSITY SCHOOL OF MEDICINE


1- a prevalência da doença deve ser significativamente mais alta entre os expostos à causa suspeita do que entre os controles não expostos.

2- a exposição à causa suspeita deve ser mais frequente entre os atingidos pela doença do queo grupo de controle que não a apresenta, mantendo constante os demais fatores de risco.

3- a incidência da doença deve ser significantemente mais elevada entre os expostos à causa suspeita do que entre aqueles não expostos.

4- a exposição ao agente causal suspeito deve ser seguida de doença, enquanto que a distribuição do período de incubação deve apresentar uma curva normal.

5- um espectro da resposta do hospedeiro deve seguir a exposição ao provável agente, num gradiente biológico que vai do benigno ao grave.

6- uma resposta mensurável do hospedeiro, até então inexistente, tem alta probabilidade de aparecer após a exposição ao provável agente, ou aumentar em magnitude se presente anteriormente.

7- a reprodução experimental da doença deve ocorrer mais frequentemente em animais ou humanos adequadamenteexpostos à provável causa do que naqueles não expostos.

8- a eliminação ou modificação da causa provável deve diminuir a incidência da doença.

9- a prevenção ou modificação da resposta do hospedeiro face a exposição à causa provável deve diminuir a incidência ou eliminar a doença.

10- todas as associações ou achados devem apresentar consistência com os conhecimentos no campo da biologiae da epidemiologia.

POSTULADOS DE EVANS, 1976


Doenças Multifatoriais

Doenças Associadas ao Manejo

Doenças Geneticamente Transmitidas

Compreensão Atual daMaior Complexidade do Binômio

Infecção x Doença


Métodos de

Diagnóstico Laboratorial


Fenotípicas•Morfologia•Efeito biológico•Atividade enzimática

•Estrutura antigênica

Genotípicas•Estrutura Ácido Nucléico

S. Imune

Imunodiagnóstico

Sorodiagnóstico

R. Humoral

R. Celular

Alergodiagnóstico

Padrão

Padrão

+

+

MÉTODOS DIRETOS

MÉTODOS INDIRETOS

+

Padrão

Ident. Sorológica

Ident. Genotípica

Padrão

Fenotípicas•Estrutura antigênica

do Agente


Fenotípicas (proteínas)

•Morfologia •Atividade biológica•Atividade enzimática•Estrutura antigênica (Identific. Sorológica)

Genotípicas (ácido nucléico)

•PCR•PCR+RFLP•Seqüenciamento

MÉTODOS DIRETOS

E

ERegiões

Codificadorasou não


Fenotípicas (proteínas)Estrutura antigênica •Identificação Sorológica

Genotípicas (ácido nucléico)Estrutura Ácido Nucléico•PCR•PCR+RFLP•Seqüenciamento

BASES DA ESPECIFICIDADE ANTIGÊNICA E GENOTÍPICA

DOS MÉTODOS DIRETOS

Proteína x Proteína

DNA x Proteína

Complementariedade

Complementariedade


•Concentração

•Distribuição

Tempo da infecção

Amostra do agente

Grau de imunidade do Hospedeiro

Tropismo

População

VARIÁVEL


Fenotípicas (proteínas)

Estrutura antigênica

SI

Y

Linf. T


Complementariedade


BASES DA ESPECIFICIDADE ANTIGÊNICA

DOS MÉTODOS INDIRETOS

Sorodiagnóstico

Imunodiagnóstico


•Concentração

•Distribuição

Tempo da infecção

Amostra do agente

Grau de imunidade do Hospedeiro

Tropismo

População

VARIÁVEL

SI


FILOGENIA

E

REATIVIDADE CRUZADA

Fenotípica e Genotípica


Charles Darwin

•Conservação de Estruturas Fenotípicas (Antigênicas)

•Conservação de Estrutura Genotípica

AgentesPróximos


EHV-1

EHV-4


Cinomose

Sarampo


Peste Suína Clássica

Diarréia Viral Bovina


Panleucopenia Felina

Parvovirose Canina


Recursos para aumentar

da Especificidade da

Identificação Genotípica


A B

RFLP genômicoPCRPCR + RFLPSequenciamento

Regiões•Codificadoras•Não Codificadoras

Escolhade Regiões

Alvo


Recursos para aumentar

da Especificidade da

Resposta Imune Humoral

•Identificação Sorológica (produção de soros padrão)Diagnóstico Direto

•Sorodiagnóstico (pesquisa de anticorpos no soro de animais)Diagnóstico Indireto

SI

+Anticorpo Monoclonal

Resposta Policlonal

Aumento da Especificidade de soros para Identificação Sorológica de Agentes

?

Antígeno usado na imunizaçãoA B

A e B

A e B

A e B

B

SIPurificação

Ag Recombinante ?

Anticorpo obtido

CromatografiaAfinidade

+Anticorpo Monoclonal

Resposta Policlonal

?

Antígeno usado no TesteA B

A e B

A e B

A e B

B

Purificação

Ag Recombinante?

Anticorpos produzidos na infecção natural

SI

Infecção NaturalSI

Competição com Anticorpos Monoclonais

Y

Y Y Y YY Y Y

Aumento da Especificidade no Sorodiagnóstico de Agentes

X


OS CONTEXTOS

ANALÍTICOE

DIAGNÓSTICO DE

TESTES DIAGNÓSTICOS

DE DOENÇAS TRANSMISSÍVEIS


Teste CONTEXTO

ANALÍTICO

Teste CONTEXTO

DIAGNÓSTICO

GeraçãoDo

Analito

DetecçãoQuantificação

doAnalito Conservação

do Analito


O CONTEXTO

ANALÍTICODE


DE DOENÇAS

TRANSMISSÍVEIS

Detecção do Analito


Procedimento realizado para adetecção e / ou quantificação

de um

Analito

Conceito de Teste no contexto analítico:


Natureza bilógica do Analito:

•Substâncias ex: colesterol , glicose, anticorpos etc.

•Microorganismosex: prions, vírus, bactérias, fungos etc


Exemplos de ANALITOSNo Diagnóstico de Doenças Transmissíveis

•Vírus •Rickettsias•Bactérias•Protozoários•Fungos•Parasitas

•Resposta Celular•Anticorpos

Diag. Direto

Diag. Indireto

Fenotípicas•Morfologia•Efeito biológico•Atividade enzimática

•Estrutura antigênica

Genotípicas•Estrutura Ácido Nucléico

Fenotípicas•Estrutura antigênica


TESTEAnalítico

Geração de SINAL

NATUREZA VARIÁVEL EMENSURÁVEL

SINALCLÍNICO

ISOLAMENTO VIRAL

QUALITATIVO QUANTITATIVO

+ ou -

CONTÍNUOS DESCONTÍNUOS

•Absorb. ELISA•Radiação RIA

•Títulos de anticorpos•2 , 4, 8, 16 etc

Prenhêz


Sensibilidade Analítica = Quanto do Analito?

Especificidade Analítica = Quais Analitos?

Características Analíticasdo Teste


Avaliação da Sensibilidade Analítica de Testes

[Analito]

+ + + + + + --SINAL

Mensuração Objetiva

Unidades:•UFC/mL•DICT50%•µg Ag/mL•µg Ac/mL•µg DNA/mL


+ + --SINAL

Mensuração Subjetiva

A B C D

Arbitrariedade da escolha agentescom estrutura antigênica ou genotípica

presumivelmente semelhantes

Avaliação da Especificidade Analítica de Testes


SENSIBILIDADE ANALÍTICA

•Menor quantidade de elemento em análise que o teste écapaz de detectar (capaz de gerar um sinal).

Exemplo: ELISA 0,005 µg/ µL de anticorpos.IDGA = 30 µg/ µL de anticorpos

ESPECIFICIDADE ANALÍTICA

•Capacidade do teste tem de detectar só o elemento de análisee não detectar elementos de análise semelhantes.

Difícil mensuração. Exemplo:

RFC diferencia tipos A O e C VFA (+ esp. analítica)IDGA c/ VIA não diferencia A O e C (- esp. analítica)

Definições


O CONTEXTO

DIAGNÓSTICODE


DE DOENÇAS

TRANSMISSÍVEISGeração do Analito

Resultado do

Teste

Qualitativo + ou -•Presença ou não do Analito

Quantitativo •[Analito]

Diagnostica condiçãodo Hospedeiro

•Infectado x Não infectado

•Doente x SadioGeração

do Analito

Conservação do Analito

Detecção do Analito


SENSIBILIDADE DIAGNÓSTICA

•Capacidade do teste fornecer um resultado + quando oindivíduo realmente tem o parâmetro em diagnóstico (%).

ESPECIFICIDADE DIAGNÓSTICA

•Capacidade do teste fornecer um resultado - quando oindivíduo realmente não tem o parâmetro em diagnóstico (%).

Definições

+ -

Condição do Hospedeiro

Resultadodo

Teste

+

-

VP FP

FN VN

VP+FN VN+FP

VP+FP

VN+FN

SENS.diagn.= VP+FN

VP x 100 VN+FPVN x 100ESPEC.

diagn.=

+ -+ +

- + - -

Infectado/Doente Não Infect./ Sadio

Avaliação da Sensibilidade e Especificidade Diagnóstica de Testes


Formas de Avaliação da

Sensibilidade e Especificidade Diagnóstica de Testes

Infecção Experimental Referência (Gold Standard )

Infectado Controle

TesteTeste Referência

x Teste Avaliado

População



Sensibilidade e Especificidade Diagnóstica de Testes

Infecção Experimental

Infectado Controle

Teste

Críticas:

•Qual amostra do agente?

•Qual a dose?

•Qual a via?

•Quanto tempo para testar?

•Como estabelecer o controle?



Sensibilidade e Especificidade Diagnóstica

Referência (Gold Standard )

Teste Referênciax

Teste Avaliado

Crítica:

•O teste em avaliação pode termaiores Sensibilidade e Especificidade

Diagnósticas que o de Referência

Ex: IBR em sêmenIsolamento x PCR


CONTEXTOANALÍTICO

CONTEXTODIAGNÓSTICO

Diagnostica Parâmetro:Infectado, Doente

•Sen.Diag.= Infectado / Doente e o teste foi + (%)

•Esp.Diag = N.Infectado/Sadio e o teste foi - (%)

•Sen.Anal.= Quanto de Analito detecta?

•Esp.Anal.= Detecta Analitos semelhantes?

ReagentesImunoreagentesAnimaisCélulas


CONTEXTOANALÍTICO

CONTEXTODIAGNÓSTICO

Diversos FatoresInterferem naGeração da

[Analito]

Diversos FatoresInterferem naDetecção da

[Analito]

SENSIBILIDADE DIAGNÓSTICAESPECIFICIDADE DIAGNÓSTICA

FP

FN •Sensibilidade analítica insuficiente

• Especificidade analítica insuficiente(reações cruzadas)

ANALÍTICO (detecção) DIAGNÓSTICO (geração)

•Reagentes e equipam. c/ problemas

•Conservação inadequada do analito

•Tempo da infec.(antígeno / resposta imune)

•Imunodepressão / Imunotolerância

•Gama de agentes com Reação Cruzadana região


Testes de Alta Especificidade Analítica

Tendem a apresentar

Alta Especificidade Diagnóstica

Testes de Baixa Especificidade Analítica

Tendem a apresentar

Baixa Especificidade Diagnóstica

Testes de Alta Sensibilidade Analítica

Tendem a apresentar

Alta Sensibilidade Diagnóstica

Maior risco de amplificar reações cruzadas e ruídos

Testes de Baixa Sensibilidade Analítica

Tendem a apresentar

Baixa Sensibilidade Diagnóstica


Reflexos da

Sensibilidade e Especificidade Diagnóstica

dos Testes

nos diferentes momentos do

Controle de Doenças


+ -

Resultadodo

Teste

+

-

VP FP

FN VN

VP+FN VN+FP

VP+FP

VN+FN

SENS.diagn.= VP+FN

VP x 100 VN+FPVN x 100ESPEC.

diagn.=

Sem título mínCom título mín



+ -

+

-

VP FP

FN VN

VP+FN VN+FP

VP+FP

VN+FN

Valor Preditivo + =VP + FP

VPx 100

Sem título mínCom título mín

Melhora-se o VP+Diminuindo FP

Com o aumento da Espeficidade.

Resultadodo

Teste


VP + = 47/142 x 100= 33,1% VP+ = 190/270 x 100= 70,37%

INFLUÊNCIA DA PREVALÊNCIA NO VALOR PREDITIVO +

100050 950

473

95855

142858

Condição

++

--

RES.TESTE

TOTAL

TOTAL

P= 5% S= 95% E= 90%

1000

++

--

TOTAL

TOTAL

P= 20% S= 95% E= 90%

190 2708010 720 730200 800

RES.TESTE

Condição

+ -Situação real

Resultadodo

Teste

+-

VP FP

FN VN

VP+FN VN+FP

VP+FP

VN+FN

FN

VP

VP VN

FN

FP

FP

VP+ =

AltaPrevalência

BaixaPrevalência

VP

VP + FP

Saída Menor Prevalência =Teste mais Específico

Mesmo TesteSens.Diag.Esp. Diag.

VN


OBRIGADO PELA ATENÇÃO!

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