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FUNDAÇÃO OSWALDO CRUZ
CENTRO DE PESQUISAS AGGEU MAGALHÃES
DOUTORADO EM SAÚDE PÚBLICA
LÍLIAN MARIA LAPA MONTENEGRO
AVALIAÇÃO DA ASSOCIAÇÃO DE POLIMORFISMOS DE BASE ÚNICA EM
REGIÃO PROMOTORA DE GENES DAS CITOCINAS FATOR DE NECROSE
TUMORAL (TNF) E INTERLEUCINA-10 (IL-10) COM A SUSCEPTIBILIDADE OU
RESISTÊNCIA A TUBERCULOSE PULMONAR
Recife
2013
LÍLIAN MARIA LAPA MONTENEGRO
AVALIAÇÃO DA ASSOCIAÇÃO DE POLIMORFISMOS DE BASE ÚNICA EM
REGIÃO PROMOTORA DE GENES DAS CITOCINAS FATOR DE NECROSE
TUMORAL (TNF) E INTERLEUCINA-10 (IL-10) COM A SUSCEPTIBILIDADE OU
RESISTÊNCIA A TUBERCULOSE PULMONAR
Tese apresentada ao curso de doutorado em Saúde
Pública do Centro de Pesquisa Aggeu
Magalhães/Fiocruz, para obtenção do Título de
Doutor em Ciências.
Orientadores:
Dra. Haiana Charifker Schindler
Dra. Clarice Neuenschwander Lins de Morais
Recife
2013
Catalogação na fonte: Biblioteca do Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães
M777a
Montenegro, Lílian Maria Lapa.
Avaliação da associação de polimorfismos de base
única em região promotora de genes das citocinas fator
de necrose tumoral alpha (TNF-alfa) e Interleucina-10
(IL-10) com a susceptibilidade ou resistência a
tuberculose pulmonar / Lílian Maria Lapa Montenegro.
- Recife: s.n, 2013.
110 p. : ilus., tab., graf.
Tese (Doutorado em Saúde Pública) - Centro de
Pesquisas Aggeu Magalhães, Fundação Oswaldo Cruz,
Recife, 2013.
Orientadores: Haiana Charifker Schindler, Clarice
Neuenschwander Lins de Morais.
1. Tuberculose Pulmonar – imunologia. 2. Fator de
Necrose Tumoral alfa. 3. Polimorfismo de Nucleotídeo
Único. 4. Interleucina-10. I. Schindler, Haiana
Charifker. ths. II. Morais, Clarice Neuenschwander Lins
de. ths. III. Título.
CDU 616-002.5
LÍLIAN MARIA LAPA MONTENEGRO
AVALIAÇÃO DA ASSOCIAÇÃO DE POLIMORFISMOS DE BASE ÚNICA EM
REGIÃO PROMOTORA DE GENES DAS CITOCINAS FATOR DE NECROSE
TUMORAL (TNFα) E INTERLEUCINA-10 (IL-10) COM A SUSCEPTIBILIDADE OU
RESISTÊNCIA A TUBERCULOSE PULMONAR
Aprovado em: 07/07/2013
Tese apresentada ao Curso de Doutorado em
Saúde Pública do Centro de Pesquisas Aggeu
Magalhães, Fundação Oswaldo Cruz para a
obtenção do Título de Doutor em Ciências.
BANCA EXAMINADORA
____________________________________
Dra. Haiana Charifker Schindler, PhD
Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães – Fiocruz, PE
(Membro Titular Interno - Orientadora)
____________________________________
Dr. Valdir de Queiroz Balbino, PhD
Universidade Federal de Pernambuco, PE
(Membro Titular Externo)
____________________________________
Dr. Sérgio Crovella, PhD
Universidade Federal de Pernambuco, PE
(Membro Titular Externo)
____________________________________
Dr. Fábio Lopes de Melo, PhD
Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães – Fiocruz, PE
(Membro Titular Interno)
____________________________________
Dra. Valéria Rêgo Alves Pereira, PhD
Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães – Fiocruz, PE
(Membro Titular Interno)
Dedico este trabalho
aos meus pais
Lourdes e Montenegro,
meu marido Fernando e
minha filha Gabriela
que são minha eterna
fonte de inspiração.
AGRADECIMENTOS
A Deus, pela dádiva da vida, da esperança e do amor, por estar sempre presente em
minha vida e por acreditar que através da fé, tudo é possível acontecer. A sua providência
estende-se a tudo e todos.
Aos meus pais, Montenegro e Lourdes, pelo amor e dedicação, ensinando sempre o
caminho da integridade e perseverança, estando presentes nos momentos bons e difíceis de
minha vida, mas principalmente demonstrando que a educação é a maior herança que os pais
transmitem aos filhos. O meu eterno agradecimento e amor!
Aos grandes amores da minha vida, meu marido Fernandinho e minha filha Gabriela,
por me fazerem extremamente feliz, por mostrarem que o amor incondicional existe, por
estarem sempre presentes, proporcionando-me extenso carinho e amor. Com vocês sempre ao
meu lado, eu consigo superar qualquer obstáculo. Para vocês eu entrego o meu mais sublime
amor!
À minha orientadora, Dra. Haiana Charifker Schindler, que me deu a oportunidade de
iniciar na vida acadêmica e por me orientar em todas as etapas da minha formação acadêmica.
Agradeço também pela amizade, dedicação, confiança e respeito que se formou e construiu
durante todos esses anos de convivência e pelo grande apoio no desenvolvimento deste
trabalho. Saiba que a admiro pela sua competência profissional. Meus sinceros
agradecimentos!
À minha orientadora, Dra. Clarice Neuenschwander Lins de Morais, pela orientação
em todas as etapas no desenvolvimento deste trabalho, pela amizade que se formou ao longo
destes anos e que apesar de ser uma pesquisadora nova, sempre demonstrou dedicação ao
trabalho acadêmico.
A toda minha família, pelo amor, apoio e incentivo nas minhas decisões pessoais e
profissionais e pela demonstração de união familiar, vencendo juntos todos os obstáculos.
Aos meus colegas, André e Romero, que me ajudaram a executar todas as etapas de
desenvolvimento desta pesquisa, sejam nas atividades de campo, laboratorial e de análise dos
resultados. Agradeço também pela grande amizade, dedicação e respeito que se formou nesse
período e que levarei por toda a minha vida.
À minha amiga e companheira Rosana Montenegro, pela colaboração no
desenvolvimento deste trabalho, pela antiga e eterna amizade, pelo convívio diário de alegria
e acima de tudo pelo profissionalismo. Meus sinceros agradecimentos!
A brilhante “Equipe das Tuberculetes” que compõe o Laboratório de
Imunoepidemiologia: Andrea Santos Lima, Fabiana Fulco, Gabriela Guedes, Heidi Lacerda,
Juliana Figueirêdo, Klarissa Guarines, Laís Lira, Márcia Schneider, Aline e Marcela Salazar
na execução das técnicas laboratoriais, bem como as amigas Kaly e Bruna. Saibam que o
apoio, o carinho, a amizade e os momentos de descontração que todas vocês me transmitiram
foram fundamentais para a finalização desta pesquisa e que carregarei vocês para sempre no
meu coração. Minha eterna gratidão!
A minha amiga Edeneide Xavier, inicialmente pela formatação da tese. Mas,
principalmente por estar sempre presente em todas as fases da minha vida, me dando apoio,
carinho, atenção e sempre me fazendo refletir nas grandes questões relacionadas à vida.
Aos médicos pneumologistas das unidades de saúde participantes do estudo, mas
principalmente aos médicos Dr. Gaspar, Dr. Amaro, Dr. Gildo, a auxiliar de enfermagem
Anatália e ao enfermeiro Ricardo, pela colaboração na seleção dos pacientes, por terem
disponibilizado toda a infra-estrutura dos seus ambulatórios e pela amizade que se construiu.
Agradeço ainda, a toda a equipe de agente de saúde da família, principalmente à Cristina,
fundamental na busca ativa dos pacientes;
A todos os pacientes que voluntariamente contribuíram para a realização desta tese,
em busca de uma melhoria da qualidade de vida e no avanço da ciência;
Agradeço em especial aos membros da banca examinadora, Valdir Balbino, Sérgio
Crovella, Valéria Pereira, Fábio Melo, Virgínia Lorena e Rosana Montenegro, pela disposição
em contribuir para a melhoria do trabalho.
A Marcus Cardoso e George Tadeu, pela assistência na área estatística e por
disponibilizar o tempo para atender com atenção e profissionalismo.
À amiga e secretária do Departamento de Imunologia Simone Santos pela sua ajuda
em todos os momentos que precisei com os procedimentos burocráticos do CPqAM.
A todos os colegas do Departamento de Imunologia do CPqAM/FIOCRUZ, Sinval,
Eduardo Henrique, Filipe, Dra. Yara, Edileuza, Milena, Carlos Gustavo, Roberto, Sheila,
Fred, Silvia, Neidinha, Rone, Mineo, Leonardo, Vladimir pelo apoio profissional, força e
amizade.
A todos os colegas da turma do doutorado em Saúde Pública do CPqAM/Fiocruz
(2009-2013), principalmente a Andréia, Daniele, Marcelinho, Ana Maria, Paul, Aletéia, Luiz
Griz.
À coordenadora do curso de doutorado em Saúde Pública do CPqAM, Eduarda Cesse,
pelas resoluções burocráticas.
A todos que compõe a Secretaria Acadêmica do CPqAM/Fiocruz, principalmente
Rivaldete, Adriana e Vângela.
Aos funcionários da Biblioteca do CPqAM, em especial Mégine, Adagilson e Márcia
pelo apoio e colaboração.
Ao Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães (CPqAM), pela infra-estrutura e pelo
suporte financeiro indispensáveis para realização deste pesquisa.
Às pessoas que me apoiaram direta ou indiretamente na realização deste trabalho.
Tuberculose.
Doença ou Praga?
Morte ou Vida?
Não sei bem o que é!
Só sei que devasta e dizima populações a milhões de anos.
Sim! Seres, Seres Humanos.
Seres com sonhos, sentimentos e esperanças!
Muitas vezes...
Sonhos sem esperança,
Sentimentos de tristeza,
Esperança...
Que esperança?
Pode ser considerada sinômino do preconceito, discriminação de muitos, muitos e muitos.
Muito mais do que podemos imaginar.
Doença negligenciada?
Sim! Doença muito antiga!
Patrocinada por representantes poderosos e gananciosos do Brasil!
Que melhores condições de vida não oferecem ou proporcionam!
Foi uma doença de boêmios e artistas.
É uma doença dos esquecidos!
Mas, muitas vezes a força da vida consegue ser vitoriosa!
E com muito amor, fé, união e esperança se consegue superar qualquer desafio.
Até esse!
Lílian Maria Lapa Montenegro
MONTENEGRO, L. M. L. Avaliação da associação de polimorfismos de base única em
região promotora de genes das citocinas fator de necrose tumoral alpha (TNF) e
Interleucina-10 (IL-10) com a susceptibilidade ou resistência a tuberculose pulmonar.
2013. Tese (Doutorado em Saúde Publica) – Centro de pesquisa Aggeu Magalhães, Fundação
Oswaldo Cruz, Recife, 2013.
RESUMO
Polimorfismos de base única (SNPs) em regiões promotoras de genes das citocinas TNF-α e
IL-10 influenciam a resposta imunológica e podem estar envolvidos na resistência ou
susceptibilidade a tuberculose. Este trabalho objetivou avaliar a associação entre os SNPs
funcionais dos genes das citocinas TNF-α (-308G/A) e IL-10 (-1082A/G) com a resistência ou
susceptibilidade a tuberculose pulmonar ativa em pacientes oriundos do estado de
Pernambuco. Participaram 282 indivíduos, distribuídos em grupos de estudo de acordo com
achados clínicos, radiológicos e exames laboratoriais. O grupo caso foi formado por 71
pacientes com tuberculose pulmonar ativa; controle 1: 53 pacientes sintomáticos respiratórios
com tuberculose latente; controle 2: 57 pacientes sintomáticos respiratórios portadores de
infecções pulmonares inespecíficas e o controle 3 por 101 indivíduos clinicamente saudáveis,
de serviços públicos de saúde. Foram coletados 5-10mL de escarro e 4,5mL de sangue
periférico, realizada extração de DNA genômico e determinação do polimorfismo genético
através de qPCR. A análise polimórfica comparativa entre os grupos de estudo demonstrou
que o alelo mutante -1082G [p<0.0001; OR=3.90 [2.45- 6.59] e os genótipos -1082GA
[p<0.0001; OR=2.90 [1.42- 5.95] e -1082GG [p<0.0001; OR=15.50 [5.18- 1.62] estava
associado com o risco de desenvolvimento da tuberculose pulmonar quando o grupo caso foi
comparado com o controle 3. O genótipo heterozigoto -308AG [p=0.005; OR=0.374 [0.17–
0.76] apresentou associação estatística significante entre o grupo caso e o controle 3. Não
houve diferença estatística significante na análise de associação dos SNP´s -308G/A e -
1082A/G na comparação entre o grupo caso e os controles 1 e 2. Portanto, portadores do alelo
mutante -1082G, equivalente a níveis protéicos aumentados de IL-10 podem estar
influenciando a resposta imune contra o M. tuberculosis. Entretanto, portadores do genótipo
heterozigoto -308GA, demonstrou um fator de proteção ao desenvolvimento da doença. O
estudo demonstrou que os SNPs apresentaram um importante papel na susceptibilidade ou
resistência a tuberculose pulmonar na população pernambucana estudada.
Palavras Chaves: Tuberculose pulmonar, Polimorfismo de base única, TNF-α (-308G/A), IL-
10 (-1082A/G)
MONTENEGRO, L. M. L. Evaluation of the association of single nucleotide
polymorphisms in the promoter region of genes of cytokines tumor necrosis factor alpha
(TNF) and interleukin-10 (IL-10) with susceptibility or resistance to pulmonary
tuberculosis. 2013. Thesis (Doctorate in Public Health) –Aggeu Magalhães Research Center,
Fundação Oswaldo Cruz, Recife, 2013.
ABSTRACT
Single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the genes promoter regions of the cytokines
TNF-α and IL-10 influence of the immune response and may be involved in resistance or
susceptibility to tuberculosis. This study aimed to evaluate the association between SNPs of
genes functional cytokine TNF-α (-308G/A) and IL-10 (-1082A/G) with resistance or
susceptibility to active pulmonary tuberculosis in patients from the state of Pernambuco.
Participated 282 individuals, divided into study groups according to clinical, radiological and
laboratory tests. The case group consisted of 71 patients with active pulmonary tuberculosis,
control 1: 53 patients with respiratory symptoms and latent tuberculosis, control 2: 57 patients
with respiratory symptoms bearers of nonspecific lung infections and control 3 of 101
clinically healthy individuals, from of public health services. Were collected 5-10mL of
sputum and 4.5 mL of peripheral blood, performed genomic DNA extraction and
determination of genetic polymorphism using Real-time PCR. Analysis polymorphic
comparative study groups showed that the mutant allele-1082G [p <0.0001, OR = 3.90 [2:45-
6:59] and genotypes-1082GA [p <0.0001, OR = 2.90 [1:42-5.95] e-1082GG [p <0.0001, OR
= 15:50 [5:18-1.62] was associated with the risk of developing pulmonary tuberculosis when
the case group was compared with control 3. The genotype -308AG [p = 0.005, OR = 0.374
[0.17-0.76] showed a statistically significant association between the case group and control
3. There was no statistically significant difference in the association analysis of SNPs-308G/A
and-1082A/G in the comparison between the case group and controls 1 and 2. Thus, mutant
allele-1082G carriers, equivalent to increased protein levels of IL-10 may influence the
immune response against M. tuberculosis. However, carriers of the-308GA genotype showed
a protective factor for disease development. The study demonstrated that the SNPs has an
important role in susceptibility or resistance to pulmonary tuberculosis in the Pernambuco
population studied.
Keywords: Pulmonary tuberculosis, Single nucleotide polymorphisms, TNF-α (-308G/A), IL-
10 (-1082A/G)
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Incidência global de tuberculose. 21
Figura 2 - Percentual de casos bacíliferos notificados por região. 23
Figura 3 - Microscopia eletrônica do bacilo Mycobacterium tuberculosis. 25
Figura 4 - A transmissão aerógena da tuberculose pulmonar. 27
Figura 5 - A resposta imune celular na tuberculose. 39
Figura 6 - Localização do gene do TNF no complexo principal de
histocompatibilidade de classe III.
43
Figura 7 - Estrutura e localização de SNPs funcionais (-1082G/A; -819C/T; -592C/A)
do gene da IL-10.
44
Figura 8 - Fluxograma de investigação de infecção respiratória aguda e crônica, a
partir de casos sintomáticos respiratórios.
52
Figura 9 - Curva de amplificação de DNA para o SNP -1082A/G do gene da IL-10. 58
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Características clínicas e demográficas dos pacientes sintomáticos
respiratórios provenientes de unidades de saúde da cidade do Recife-PE.
60
Tabela 2 - Características laboratoriais dos pacientes sintomáticos respiratórios
participantes do estudo.
61
Tabela 3 - Análise das frequências alélicas e genotípicas de SNPs dos genes da IL-10 (-
1082) and TNF (-308) dos pacientes e indivíduos participantes do estudo e associação
com a tuberculose pulmonar ativa.
66
Tabela 4 - Análise da freqüência do SNP -1082A/G referência do gene da IL-10 na
população mundial.
67
Tabela 5 - Análise da freqüência do SNP referência -308G/A do gene do TNF-α na
população mundial.
68
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
A Adenina
a.C. Antes de Cristo
AIDS Síndrome da Imunodeficiência Adquirida
ATA Associação Torácica Americana
B7-1 e B7-2 Molécula glicoprotéica
BACTEC Sistema Automatizado de Hemocultura
BAAR Bacilos álcool-ácido resistentes
BCG Bacilo Calmette-Guérin
C Citosina
CBA/J Linhagem de camundongo
CCL2 Quimiocina
CD Receptores de superfície celular
CDC Centro de Controlde de Doenças
CPqAM Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães
Ct Ciclo “threshold”
DM Diabetes mellitus
DOTS Tratamento Diretamente Observado
DNA Ácido desoxirribonucléico
DPOC Doença pulmonar obstrutiva crônica
EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético
FcRs Receptores para a porção Fc de anticorpos
Fiocruz Fundação Oswaldo Cruz
FoxP3 Fator de transcrição FoxP3
G Guanina
HAS Hipertensão Arterial Sistêmica
HC Hospital das Clínicas
HIV Vírus da Imunodeficiência Humana
HLA Antígenos de Leucócitos Humanos
H37Rv Cepa de referência virulenta de M. tuberculosis
IL Interleucina
INF-γ Interferon gama
IUATLD União Internacional contra a tuberculose e Doenças do Pulmão
kDa kilodalton
LIE Laboratório de Imunoepidemiologia
Log Logarítmo
MBL Lectina ligadora de manose
MGB Minor groove binder
MGIT Tubo indicador de crescimento de Micobactéria
MHC Molécula de histocompatibilidade principal
Mtb Mycobacterium tuberculosis
MS Ministério da Saúde
NaOH Hidróxido de sódio
NCBI National Center for Biotechnology Information
NK Célula natural killer
NOS2A Síntase do óxido nítrico
NPT Núcleo de Plataforma Tecnológica
NRAMP1 Resistência natural associada à proteína 1 do macrófago
OMS Organização Mundial da Saúde
OPAS Organização Pan-americana de Saúde
OR Odds Ratio
PAL Abordagem Sistematizada do Sintomático Respiratório
PBMC Células mononucleares do sangue periférico
PBS Tampão fosfato-salino
PCR Reação em cadeia da polimerase
PE Pernambuco
pH Potencial hidrogeniônico
PNB Ácido para-nitrobenzóico
PPD Derivado Protéico Purificado
PT Prova tuberculínica
PSF Postos de Saúde da Família
qPCR PCR em Tempo Real
Raio-X Radiografia do tórax
Ref Referência
RNA Àcido Ribonucléico
RNTA Associação Real Holandesa de Tuberculose
rpm Rotação por minuto
SNP Polimorfismo de base única
SR Sintomático respiratório
SUS Sistema Único de Saúde
T Timina
TB Tuberculose
TCH Hidrazida do ácido 2 carboxílico
TLR Receptor do tipo Toll
Th1 Célula T helper 1
Th2 Célula T helper 2
TNF-α Fator de necrose tumoral alfa
Treg Célula T regulatória
TT Teste tuberculínico
UFPE Universidade Federal de Pernambuco
UT Unidade de tuberculina
VDR Receptor de vitamina D
WHO Organização Mundial de Saúde
ZN Ziehl-Nielsen
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 17
2 REFERENCIAL TEÓRICO 19
2.1 Visão Histórica da tuberculose 19
2.2 Epidemiologia da tuberculose 20
2.2.1 A Tuberculose no mundo 20
2.2.2 A tuberculose no Brasil 22
2.2.3 A Tuberculose em Pernambuco 23
2.3 O Agente etiológico – M. tuberculosis 24
2.4 Mecanismos de transmissão 25
2.5 Métodos diagnósticos e tratamento 27
2.5.1 Exame Radiológico 28
2.5.2 Prova Tuberculínica 29
2.5.3 Exame microscópico direto – Baciloscopia Direta 30
2.5.4 Cultura microbiológica para Micobactéria 30
2.5.5 Métodos Moleculares 31
2.5.6 Tratamento da tuberculose 32
2.6 Mecanismos de proteção imunológica e imunopatogênese da tuberculose 32
2.6.1 Fator de Necrose Tumoral alfa (TNF-α) na tuberculose 39
2.6.2 Interleucina 10 (IL-10) na tuberculose 40
2.7 Polimorfismos Genéticos 41
2.7.1 SNPs na tuberculose 42
2.7.2 Genotipagem por PCR em tempo real (qPCR) 45
3 JUSTIFICATIVA 47
4 PERGUNTA CONDUTORA 48
5 HIPÓTESE 49
6 OBJETIVOS 50
6.1 Objetivo Geral 50
6.2 Objetivos Específicos 50
7 PROCEDIMENTOS METODÓLÓGICOS 51
7.1 População da pesquisa 51
7.2 Local do estudo 52
7.3 Desenho do estudo 53
7.4 Tipo e tamanho da amostragem 53
7.5 Critérios de Inclusão 53
7.6 Critérios de Exclusão 54
7.7 Critérios de definição de co-morbidades e covariáveis utilizados no estudo 54
7.8 Aspectos Éticos 54
7.9 Técnicas laboratoriais 55
7.9.1 Teste Tuberculínico 55
7.9.2 Teste rápido para a detecção do HIV 1 e 2 55
7.9.3 Método de coleta de sangue periférico e obtenção de células mononucleares do
sangue periférico (PBMC)
55
7.9.4 Método de coleta e descontaminação do escarro 56
7.9.5 Baciloscopia do escarro 56
7.9.6 Cultura por Löwestein-Jensen e Identificação de micobactérias em amostra de
escarro
56
7.9.7 Extração e purificação de DNA genômico de PBMC 57
7.9.8 Determinação do Polimorfismo Genético 57
7.10 Análise comparativa das freqüências dos SNPs -308G/A e -1082A/G 58
7.11 Análise Estatística 59
8 RESULTADOS 60
8.1 Características clínicas, demográficas e laboratoriais dos pacientes
participantes do estudo
60
8.2 Distribuição da freqüência alélica e genotípica do SNP na posição -1082A/G
do gene da IL-10 na população estudada e sua associação com o
desenvolvimento da tuberculose pulmonar ativa
64
8.3 Distribuição da freqüência alélica e genotípica do SNP na posição -308G/A
do gene do TNF-α na população estudada e sua associação com o
desenvolvimento da tuberculose pulmonar ativa
66
8.4 Análise comparativa das frequências alélicas e genotípicas dos SNPs
estudados na população mundial
67
9 DISCUSSÃO 68
10 CONCLUSÕES 79
11 PERSPECTIVAS 80
REFERÊNCIAS 81
APÊNDICE A - TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO 95
APÊNDICE B - PROTOCOLO DE PESQUISA DE TUBERCULOSE 97
ANEXO A - PARECER DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISAS 104
17
1 INTRODUÇÃO
A tuberculose (TB) continua a ser uma das principais causas de morbidade e
mortalidade em países em desenvolvimento. No entanto, a incidência da doença tem aumentado
nos países desenvolvidos. Um terço da população mundial está infectada pelo Mycobacterium
tuberculosis, mas apenas cerca de 5% dos indivíduos desenvolvem a doença ativa no primeiro
ano de infecção (TB primária) e outros 5% em alguma fase de sua vida (TB reativação) (ORAL
et al., 2006). Nesses indivíduos, o risco de adoecimento dependerá da capacidade do seu
sistema imunológico em controlar a multiplicação do bacilo. A principal forma clínica da
tuberculose é caracterizada pelo comprometimento pulmonar, acometendo 80-85% dos casos
(PANDOLFI et al., 2007).
A tuberculose é uma doença granulomatosa crônica, causada pelo M. tuberculosis
(Mtb). Vários fatores estão envolvidos na sua patogênese, tais como, ambientais, sociais e os
componentes genéticos dos indivíduos (CORREA et al., 2004). A transmissão da tuberculose
ocorre por via aérea e logo após o estabelecimento da infecção, os macrófagos alveolares do
hospedeiro fagocitam as micobactérias, onde citocinas pró-inflamatórias são sintetizadas, como
o fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), desempenhando um papel fundamental na resposta
imune de resistência contra o bacilo (HENAO et al., 2006).
Citocinas produzidas no pulmão, principalmente do tipo 1, após interações entre
linfócitos T e macrófagos infectados são essenciais no controle da tuberculose. Estudos
demonstraram que fatores genéticos do hospedeiro desempenham um importante papel na
susceptibilidade/resistência à tuberculose pulmonar (BELLAMY, 2005; MERZA et al., 2009).
Portanto, a identificação de genes do hospedeiro responsáveis pela suscetibilidade e resistência
a TB deverá fornecer uma contribuição significativa para o entendimento da imunopatogênese,
podendo levar ao desenvolvimento de medidas profiláticas e estratégias de tratamento
(LEANDRO et al., 2009; ORAL et al., 2006).
O curso da infecção pelo M. tuberculosis é regulado por dois distintos padrões de
citocinas produzidas e secretadas por células T. As células T helper 1 (Th1), produtoras das
citocinas INF-γ , IL-12, IL-6, IL-1, TNF-α estão associadas à resistência à infecção. Estas
citocinas desempenham um papel importante da resposta inflamatória contra o Mtb, ativando os
mecanismos microbicidas do macrófago e participando da formação do granuloma tuberculoso.
O TNF-α está envolvido na organização e controle do granuloma e em sinergismo com o IFN-
γ, induz a expressão de uma enzima que estimula a produção de óxido nítrico, um potente
agente antimicobacteriano. Além disso, o TNF- pode estimular a migração celular, a
18
expressão de moléculas de adesão e quimiocinas (DLUGOVITZKY et al., 1997). Por sua vez,
as citocinas produzidas por células Th2, IL-4, IL-10 e IL-13, inibem a produção de citocinas
pró-inflamatórias através da sua ação sobre as células Th1 e macrófagos (HASAN et al., 2008).
É importante que respostas pro-inflamatórias sejam controladas ou reprimidas para minimizar o
dano tecidual na TB (OH et al., 2007). A Interleucina 10 (IL-10) é uma citocina reguladora, que
atua inibindo as respostas inflamatórias tipo 1. Esta citocina desempenha um papel central
durante a fase latente/crônica da tuberculose pulmonar , e o seu aumento, tem sido associado
com a promoção da reativação da tuberculose (TSO et al., 2005).
Diferenças na produção de citocinas durante a resposta imune do hospedeiro contra o
Mtb podem exercer um desequilíbrio no balanço Th1/Th2, associado com o desenvolvimento
da doença ativa (TRAJKOV et al., 2009). Diversos trabalhos têm indicado o importante papel
das citocinas TNF-α e IL-10 na imunopatogênese da tuberculose (ATES et al., 2008; OH et al.,
2007). Esses estudos tem demonstrado que polimorfismos de base única (SNPs) em regiões
promotoras de genes de citocinas influenciam a natureza da resposta imunológica, com
variações interindividuais e que podem estar envolvidos na susceptibilidade, gravidade e
evolução clínica da tuberculose em diferentes grupos étnicos. Diversos SNPs localizados em
regiões promotoras de genes que codificam diferentes proteínas, em particular os genes do
TNF-α e IL-10, têm sido descritos (DELGADO et al., 2002; LARCOMBE et al., 2008;
MERZA et al., 2009). Estudos genéticos demonstraram uma significativa variação do
componente genético na resposta imunológica contra o Mtb, onde há evidências conflitantes da
associação de polimorfismos para TNF-α e IL-10 com tuberculose pulmonar ativa em pacientes
de diferentes grupos étnicos (HENAO et al., 2006; BEN-SELMA et al., 2011).
O presente trabalho visa determinar uma possível associação entre os polimorfismos
funcionais dos genes de citocinas TNF-α (-308G/A) e IL-10 (-1082A/G) com a suscetibilidade
ou resistência a tuberculose pulmonar ativa em pacientes oriundos do estado de Pernambuco. A
resposta imune, protetora ou não, ao desenvolvimento da tuberculose está ligada a uma rede de
citocinas que são produzidas durante o curso da infecção. Desta forma, reconhecer os
mecanismos moleculares que antecedem a produção destas citocinas, além de fornecer um
maior conhecimento da relação entre o bacilo e o hospedeiro, representa um poderoso campo a
ser explorado para investimentos em pesquisas de novas vacinas, imunoterapia e tratamento
medicamentoso.
19
2 REFERENCIAL TEÓRICO
2.1 Visão Histórica da tuberculose
A tuberculose (TB) é uma doença infecciosa crônica que possui como agente
etiológico o Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis). Acredita-se que esta
micobactéria, também conhecida como bacilo de Koch, seja anterior ao próprio homem,
sucedendo formas mais elementares da vida microscópica (BERTOLLI-FILHO, 2001). Os
primeiros registros a cerca de casos da doença remetem ao período neolítico (7.000-3.000
a.C.) no Egito, Índia e China, respectivamente (DANIEL, 1997), incluindo casos de
tuberculose vertebral, intestinal e pulmonar (HASS; HASS, 1996).
Apesar de ter sido descrita, pela primeira vez, em textos indianos, a TB pulmonar é
conhecida no antigo Egito desde o tempo de Hipócrates, que impressionado pelo
emagrecimento progressivo e debilitação do doente, designava a moléstia por tísica (phtisis,
em grego) que significa consumpção (BERTOLLI-FILHO, 2001). Os egípcios, considerados
um dos povos mais sadios da Antiguidade, já nesta época, percebendo a progressão em cadeia
da tuberculose, mantinham seus doentes em isolamento e acreditavam que a possibilidade de
cura da doença era através do repouso e de lugares de montanhas (DANIEL, 1997).
Nos pulmões do ser humano, o M. tuberculosis encontrou um micro-ecossistema
favorável à sua sobrevivência, favorecido pela possibilidade de reprodução em um ambiente
ao mesmo tempo quente e úmido, arejado e sombrio. Com a proliferação bacilar em forma de
colônias, usualmente há migração dos bacilos para outras regiões do aparelho respiratório, por
meio das vias broncogênica, linfática e hematogênica, disseminando-se por todo o organismo,
enquanto que outra parte é expelida pelas vias aéreas, permanecendo em suspensão no ar
(BERTOLLI-FILHO, 2001).
Um dos grandes trabalhos sobre TB foi realizado em 1882, por Robert Koch, um
renomado cientista da época, que conseguiu isolar e cultivar o M. tuberculosis de tubérculos
macerados. Seus experimentos identificaram a micobactéria como o agente etiológico da
doença, (BLOOM; MURRAY, 1992; DANIEL, 1997). Posteriormente, em 1890, Koch
anunciou a descoberta de um líquido específico, nomeado tuberculina, que poderia ser
utilizado como uma ferramenta de diagnóstico para detectar a doença, devido à intensidade da
reação em animais doentes quando inoculados com esta substância. Este conceito perpetuou-
se por vários anos até descobrirem que animais saudáveis também poderiam reagir à
tuberculina. Como resultado, ficou estabelecido que animais infectados pelo M. tuberculosis
20
reagiriam à tuberculina, enquanto que os não-infectados não reagiriam. Dessa forma, a prova
tuberculínica tornou-se a principal ferramenta para diagnosticar casos de infecção pelo M.
tuberculosis (DUCATI, 2006). No mesmo período, Koch desenvolveu outros métodos para
coloração do bacilo, sendo estas técnicas, posteriormente melhoradas pelo médico e
bacteriologista alemão, Paul Ehrlich. Desta forma, o método de detecção desenvolvido
específico para o bacilo proporcionou a base para a coloração de Ziel-Nielsen, a qual, ainda
hoje, é uma importante ferramenta no diagnóstico da TB pulmonar (DUCATI, 2006).
No Brasil, acredita-se que a doença foi introduzida pelos portugueses e missionários
jesuítas desde 1500. A vacina BCG (Bacilo Calmette-Guérin) foi implantada em 1973, logo
se tornando obrigatória para os menores de um ano. A mortalidade por tuberculose, que
secularmente vinha diminuindo, sofreu importante impacto positivo com a introdução da
quimioterapia de curta duração, chegando a diminuir 50%, da década de 70 para a de 80
(DUCATI, 2006; RUFFINO-NETO, 2002).
2.2 Epidemiologia da tuberculose
2.2.1 A Tuberculose no mundo
Em virtude das taxas de incidência e mortalidade ocasionadas pela tuberculose no
mundo, a Organização Mundial da Saúde (OMS) declarou, em 1993, a situação da TB como
estado de emergência global. Esta própria instituição se deu conta de que, sozinha, não
conseguiria controlar a doença. Criou-se, então, o programa "STOP TB" que reúne
instituições de alto nível científico e/ou poder econômico, tais como: a própria Organização
Mundial da Saúde, o Banco Mundial, o Centers for Disease Control (CDC), a International
Union Against Tuberculosis and Lung Disease (IUATLD), a Royal Netherlands Tuberculosis
Association (RNTA) e a American Thoracic Association (ATA) (RUFFINO-NETO, 2002).
O ressurgimento da TB pode ser atribuído a vários fatores, tais como: o aumento na
resistência às drogas tuberculostáticas; pandemia do Vírus da Imunodeficiência
Humana/Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (HIV/AIDS) no início dos anos 80; a
elevada taxa de abandono de tratamento; o aumento do uso de drogas injetáveis; a
desigualdade social; o aumento do número de imigrantes de altas taxas de prevalência para
países desenvolvidos, o envelhecimento da população mundial; a transmissão ativa nos
ambientes de aglomeração humana (prisões, hospitais, abrigos de moradores de rua) e a
21
degradação dos sistemas públicos de saúde (BLOOM; MURRAY, 1992; FATKENHEUER et
al., 1999).
A maioria dos casos de TB ocorridos em 2010 está em países localizados na Ásia
(59%) e África (26%); menores proporções de casos ocorreram na região leste do
mediterrâneo (7%), Europa (5%) e na América Latina (3%) (ORGANIZAÇÃO MUNDIAL
DE SAÚDE, 2012). Desde o ano de 2000, 22 nações têm recebido uma atenção especial, pois,
estas, respondem por 81% dos casos estimados no mundo inteiro. Índia, China, África do Sul,
Indonésia e Paquistão ocupam, respectivamente, as primeiras posições em números de casos
da doença (ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DE SAÚDE, 2012) (Figura 1).
A TB permanece ainda neste milênio, como a doença infecciosa que mais mata no
mundo. Segundo a Organização Mundial de Saúde (2012), cerca de um terço da população
mundial estava infectada pelo M. tuberculosis no ano de 2011. Nesse mesmo ano, ocorreram
cerca de 8,7 milhões de casos em todo o mundo (125/100.000 habitantes), resultando em 1,1
milhões de mortes (ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DE SAÚDE, 2012).
Figura 1- Incidência global de tuberculose.
Fonte: Organização Mundial de Saúde (2012)
Nota: Número de novos casos da doença por 100.000 habitantes em 2011
22
2.2.2. A tuberculose no Brasil
A tuberculose é uma doença que está intimamente ligada com a miséria e com a
exclusão social. No Brasil, é uma doença que afeta, principalmente, as periferias urbanas ou
aglomerados urbanos denominados de favelas e, geralmente, está associada às más condições
de moradia e alimentação, à falta de saneamento básico, ao abuso do álcool, tabaco e de
outras drogas (BRASIL, 2012a).
O Brasil é um dos 22 países priorizados pela OMS que abrangem 82% dos casos de
tuberculose no mundo. Atualmente, o país está em 17° lugar, já tendo ocupado o 14º em 2004
(ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DE SAÚDE, 2011). Contudo, ainda é o único país da
América Latina entre as 22 nações com o maior percentual de indivíduos tuberculosos. Desde
1990, se observou que a taxa de incidência de TB no Brasil vem apresentando uma queda de
1,4% ao ano, resultando em uma diminuição de 26% nessas duas últimas décadas. Estima-se,
porém, que em 2011, ocorreram cerca de 90.000 casos novos da doença, entretanto devido às
falhas nos serviços de saúde só foram notificados 78% destes, revelando um número de,
aproximadamente, 71.000 casos novos da doença, (85% da forma pulmonar) apresentando
uma taxa de incidência de 37 para cada grupo de 100.000 habitantes. Além disso, a TB tem
sido relacionada como a 4ª causa de morte por doenças infecciosas, sendo a 1ª causa entre os
indivíduos portadores de AIDS (BRASIL, 2012a).
Apesar dos esforços que tem sido empregado para o controle, sobretudo, da TB
pulmonar no Brasil, os números de casos da doença, ainda, são extremamente preocupantes,
seja considerando a situação do país como um todo ou apenas por regiões. Em 2011, do total
de casos bacilíferos notificados, 44,6% concentraram-se na região Sudeste, 27,9% no
Nordeste, 12,1% no Sul, 11% no Norte e 4,3% na região Centro-Oeste (Figura 2). Os estados
responsáveis pelas maiores taxas de incidência da doença foram: Rio de Janeiro (62,7%)
Amazonas (61%), Pará (48%) e Pernambuco (47%) (BRASIL, 2012b).
O Ministério da Saúde (MS) define a tuberculose como prioridade entre as políticas
governamentais de saúde, estabelecendo diretrizes para as ações e fixando metas para o
alcance de seus objetivos. As ações para o controle da tuberculose no Brasil têm como meta
diagnosticar pelo menos 90% dos casos esperados e curar pelo menos 85% dos casos
diagnosticados. A expansão das ações de controle para 100% dos municípios complementa o
conjunto de metas a serem alcançadas (BRASIL, 2002).
23
Figura 2 - Percentual de casos novos bacíliferos de TB notificados por região.
2.2.3. A Tuberculose em Pernambuco
A Região Nordeste, segundo o Ministério da Saúde, apresenta a terceira maior taxa de
incidência de tuberculose, com 36,3 casos por 100.000 habitantes (BRASIL, 2012a). No
estado de Pernambuco foram notificados, no ano de 2011, 4.096 casos da doença, sendo cerca
de 3910 casos de TB pulmonar (86% dos casos) (BRASIL, 2012). Atualmente, o estado
ocupa a 4ª posição em incidência e o 2º em mortalidade entre os estados brasileiros (BRASIL,
2012a).
Os esforços para o combate à tuberculose datam de 1849, quando o médico Joaquim
de Aquino Fonseca, dirigente do Conselho Geral de Salubridade da Província de Pernambuco,
alertou o governo sobre o aumento dos casos de tuberculose. Neste mesmo ano, o médico
Octávio de Freitas voltou-se inteiramente para o enfrentamento dessa doença, do qual resultou
a criação da Liga Pernambucana contra a Tuberculose, inaugurada em julho de 1900 no
Teatro Santa Isabel (BRASIL, 2012b).
Atualmente, o governo brasileiro considera Recife uma das cidades brasileiras com
maior prioridade para a execução de medidas de controle para a TB. Além disso, a população
carcerária pernambucana é uma das mais afetadas pela doença, tendo sido registrados em
2010, 1.517 casos nos presídios do Estado (BRASIL, 2012b).
Fonte: Brasil (2011)
24
2.3 O Agente etiológico – M. tuberculosis
Atualmente, são reconhecidas 120 diferentes espécies de micobactérias. Estas espécies
estão incluídas no gênero Mycobacterium, no qual pertence à família Mycobacteriaceae que
juntamente com as famílias Actinomicetaceae, Nocardiaceae, Streptomycetaceae e outras
famílias bacterianas compõem a ordem Actinomycetales (TORTORA, 2005).
Foram identificadas 60 espécies do gênero Mycobacterium, sendo a maioria bactérias
saprófitas do solo e a minoria patogênica ao ser humano, causando a tuberculose (M.
tuberculosis. M. bovis e M. africannun) e hanseníase (M. leprae) (DUCATI et al., 2006).
O M. tuberculosis é o principal agente etiológico da tuberculose em humanos. É um
bacilo imóvel, ligeiramente encurvado de 1,0 a 4,0 µm de comprimento e 0,3 a 0,6 µm de
diâmetro, não esporulado e que não produz toxinas (Figura 3). É uma espécie aeróbica estrita,
cujo único reservatório é o ser humano, necessitando de oxigênio para crescer e se multiplicar
(KRITSKI et al., 2000). É um parasita intracelular facultativo, podendo viver no interior de
células fagocitárias, estabelecendo sua infecção, preferencialmente, no sistema pulmonar,
onde normalmente acondiciona-se em um estado de latência enquanto o sistema imunológico
do hospedeiro prevalece e mantém a infecção sob controle (DUCATI et al., 2006).
É considerada, também, uma micobactéria do tipo álcool-ácido resistente, de
crescimento lento, com tempo de geração de, aproximadamente, 24 horas, tanto em meio
artificial quanto em organismos animais, dependendo da oferta de oxigênio, de nutrientes e do
pH do meio, sendo necessárias várias semanas para que as colônias tornem-se visíveis no
meio de cultura (DUCATI et al., 2006; KRITSKI et al., 2000;). Muitas das características
dessas micobactérias, como sua coloração álcool-ácido resistente, a resistência a drogas, sua
patogenicidade e a taxa de crescimento lento, estão relacionadas à estrutura lipídica, distinta,
de sua parede celular. Essa parede é formada, em sua porção externa, por ácido micólico, que
forma uma camada cérea, resistente à água. Devido às características de sua parede celular, as
micobactérias conseguem resistir a situações adversas como ao ressecamento e algumas
drogas antimicrobianas (TORTORA et al., 2005). O crescimento lento desse gênero de
bactérias deve-se à dificuldade em que os nutrientes têm de atravessar sua parede celular.
Normalmente, levam-se de 4 a 8 semanas para que se consiga visualizar uma colônia crescida
em meio de cultura específico para as micobactérias (TORTORA et al., 2005).
25
Figura 3 - Microscopia eletrônica do bacilo Mycobacterium tuberculosis.
Fonte: Elawad (2013)
2.4 Mecanismos de transmissão
Apesar de um terço da população mundial está infectada com o Mtb, nem todos os
indivíduos infectados desenvolvem a doença ativa. Observa-se uma grande variabilidade nas
taxas de infecção entre os indivíduos expostos a diferentes fontes de infecção, entre 10-30% se
tornam infectadas, e entre os infectados, cerca de 90% nunca irão desenvolver a doença. A
probabilidade de um indivíduo imunocompetente infectado desenvolver a forma ativa da
tuberculose é de cerca de 5% no primeiro ano e de 10% durante toda a vida e está associada a
fatores ambientais, do hospedeiro e do próprio microorganismo como a concentração de bacilos
eliminados no ambiente, período de tempo de exposição, virulência da cepa e a imunidade do
indivíduo exposto (DUCATI et al., 2006; JABADO; GROS, 2005; ORGANIZAÇÃO
MUNDIAL DE SAÚDE, 2011).
A infecção pelo bacilo da tuberculose pode ocorrer em qualquer idade, mas
geralmente acontece na infância. As vias respiratórias são a principal porta de entrada do M.
tuberculosis, onde uma vez inalados, os bacilos fixam-se na árvore traqueobrônquica, sendo
eliminados, na maioria das vezes, pelo sistema de defesa mucociliar. A infecção se estabelece
comumente nos pulmões, ocasionando a forma pulmonar da doença, mas o bacilo é capaz de
acometer diferentes sítios do organismo humano, desenvolvendo a forma extrapulmonar
(DUCATI et al., 2006).
Em circunstâncias naturais, o M. tuberculosis é transmitido de indivíduo infectado
para um não infectado através da fala, tosse ou espirro (KRITSKI et al., 2000). Os bacilos
presentes na secreção pulmonar são atomizados em gotículas microscópicas (gotículas de
Pflugge) e após sofrerem evaporação, permanecem em suspensão no ar, na forma de um
26
núcleo infeccioso composto de um a dois bacilos (núcleos de Wells). Estes núcleos, com
diâmetro de até 5 µm, podem ser inalados por um indivíduo sadio e, posteriormente, atingir os
bronquíolos e alvéolos, iniciando-se, dessa forma, a multiplicação bacilar no interior do
pulmão do novo hospedeiro (BLOOM; MURRAY, 1992; CLARK-CURTISS; HAYDEL,
2003). As gotículas, contendo o bacilo, quando inaladas podem ficar no trato respiratório
superior (nariz e/ou garganta), onde a infecção é improvável de acontecer, contudo, quando os
bacilos atingem os alvéolos a infecção pode se iniciar (BRASIL, 2002) (Figura 4).
A tuberculose inicia como um processo inflamatório do tipo exsudativo
com característica pneumônica. Com a progressão, os sintomas clássicos, como expectoração,
tosse, febre, sudorese noturna, anorexia e perda de peso corporal podem aparecer. Caseificação
e cavitação podem estar presentes, principalmente nos lobos superiores. Por outro lado, se a
infiltração inicial progride para a cronicidade, o processo pode estabilizar com o
desenvolvimento de fibrose (SMALL; FUJIWARA, 2001).
A possibilidade de instalação de uma lesão progressiva é diretamente proporcional ao
número de bacilos inalados e à virulência destes é inversamente proporcional à resistência
natural e adquirida do hospedeiro. Macrófagos alveolares, responsáveis pela defesa da mucosa
alveolar, englobam os bacilos, e caso esses macrófagos sejam ativados, transformam-se em
fagossomos que se fusionam com os lisossomos para matar as micobactérias. Contudo, se o
macrófago não for ativado, dá-se início a um processo de coexistência pacífica entre o bacilo
e o hospedeiro humano, como uma forma latente de infecção. O bacilo, então, sobreviverá
dentro do fagossomo, alterando este compartimento intracelular de maneira a evitar sua fusão
com o lisossomo. Em casos de imunossupressão, o bacilo dará início ao processo de
multiplicação que se estenderá até a lise do macrófago, liberação dos bacilos no tecido
pulmonar e subseqüente englobamento por novos macrófagos (CLARK-CURTISS;
HAYDEL, 2003).
Em indivíduos imunocompetentes suscetíveis, a doença envolve exclusivamente o
pulmão em 85% dos casos. Nos indivíduos imunocomprometidos, como aqueles infectados
com HIV, a TB pode, freqüentemente, tornar-se uma doença disseminada, havendo maior
freqüência de localizações extra-pulmonares (TEIXEIRA et al., 2007).
Os doentes bacilíferos, aqueles cuja baciloscopia de escarro é positiva, são a principal
fonte de infecção. Pacientes com tuberculose pulmonar cuja baciloscopia seja negativa,
mesmo que tenham resultado positivo na cultura, são muito menos eficientes como fontes de
transmissão, embora possa ocorrer. As formas exclusivamente extrapulmonares não
transmitem a doença (BRASIL, 2011).
27
Mesmo sendo a TB uma doença contagiosa, não é fácil para o bacilo encontrar
condições favoráveis (intrínsecas ao hospedeiro ou ao ambiente) para invadir o organismo e
estabelecer a doença ativa (STEIN, 2011). É importante enfatizar que a prevenção contra
tuberculose através da vacinação com a BCG só é eficaz para proteger os indivíduos das
formas mais graves da doença, evitando a sua disseminação e evolução para as formas
extrapulmonares (PALOMINO, 2007).
Figura 4 - A transmissão aerógena da tuberculose pulmonar.
2.5 Métodos diagnósticos e tratamento
Diagnosticar e tratar corretamente os casos de TB pulmonar são as principais medidas
para o controle da doença. Neste contexto, esforços devem ser realizados no sentido de
identificar precocemente a doença para oferecer tratamento adequado e, sobretudo
interromper a cadeia de transmissão. A TB na forma pulmonar, por ser bacilífera além de ser
mais freqüente, é também a mais relevante para a saúde pública, sendo responsável pela
transmissão da doença (BRASIL, 2011).
Sendo assim, a busca ativa de pessoas com tosse prolongada deve ser uma estratégia
priorizada nos serviços de saúde, visto que, cerca de 90% dos casos de TB são da forma
pulmonar e, destes, 60% são bacilíferos (BRASIL, 2011).
A tuberculose pode ter várias formas de apresentação clínica, de acordo com o órgão
acometido. Desta forma, outros sinais e sintomas, além da tosse prolongada, podem ocorrer e
devem ser valorizados na investigação individualizada, sobretudo em regiões onde a doença é
endêmica (CONDE; SOUZA, 2009; BRASIL 2011). Os sintomas clássicos da tuberculose
Fonte: Veronesi (2005)
28
pulmonar são tosse persistente, produtiva ou não (com muco e eventualmente sangue), febre
vespertina, sudorese noturna e emagrecimento (BRASIL, 2011).
Os métodos de diagnóstico, atualmente usados, como a baciloscopia, a cultura
microbiológica, a radiografia de tórax, e o teste intradérmico realizado com o PPD (purified
protein derivative) ou teste tuberculínico, não têm tido o sucesso desejado para diminuir a
incidência da TB de forma significativa (FRIEDEN et al., 2003).
A pesquisa bacteriológica é o método prioritário para o diagnóstico e o controle do
tratamento da tuberculose, uma vez que permite a identificação da fonte de transmissão da
infecção (indivíduo bacilífero). Neste contexto, a descoberta precoce dos casos, o diagnóstico
correto e o tratamento completo dos doentes com baciloscopia positiva constituem uma das
principais medidas de controle da TB (BRASIL, 2012b).
2.5.1 Exame Radiológico
A radiografia de tórax é um método diagnóstico de grande importância na investigação
da tuberculose (BURRIL, 2007; DALEY et al., 2009). Baseia-se na presença de opacidades
radiológicas características, tendo utilidade no diagnóstico da tuberculose pulmonar primária
(opacidade mais homogênea e aumento no volume dos linfonodos regionais) e secundária
(opacidade heterogênea, presença de cavidades e nódulos. Diferentes achados radiológicos
apontam para a suspeita de doença em atividade ou doença no passado, além do tipo e
extensão do comprometimento pulmonar (SOCIEDADE BRASILEIRA DE
PNEUMOLOGIA E TISIOLOGIA, 2004).
Deve ser solicitada para todo o paciente com suspeita clínica de TB pulmonar. No
entanto, até 15% dos casos de TB pulmonar não apresentam alterações radiológicas,
principalmente nos pacientes imunodeprimidos. Nos pacientes com suspeita clinica, o exame
radiológico permite a diferenciação de imagens sugestivas de tuberculose ou de outra doença,
sendo indispensável submetê-los a exame bacteriológico. Em suspeitos radiológicos de
tuberculose pulmonar com baciloscopia direta negativa, deve-se afastar a possibilidade de
outras doenças, recomendando-se a cultura para micobactéria (BRASIL, 2011).
O estudo radiológico tem, ainda, importante papel na diferenciação de formas de
tuberculose de apresentação atípica e no diagnostico de outras pneumopatias no paciente
portador de HIV/AIDS ou de outras situações de imunodepressão. Em pacientes com
baciloscopia positiva, o exame radiológico tem como função principal a exclusão de doença
pulmonar associada (por exemplo, câncer de pulmão em fumantes com alta carga de
29
tabagismo com idade superior a 40 anos) que necessite de tratamento concomitante, além de
permitir avaliação da evolução radiológica dos pacientes, sobretudo naqueles que não
respondem ao tratamento anti-TB (BRASIL, 2011).
A tomografia computadorizada do tórax é um método radiológico de alta resolução e
mais sensível do que a radiografia de tórax, mas apresenta alto custo, só estando disponível
em centros de referência (SOCIEDADE BRASILEIRA DE PNEUMOLOGIA E
TISIOLOGIA, 2004).
2.5.2 Prova tuberculínica
A prova tuberculínica (PT) existe a mais de cem anos e permanece inalterada por mais
de sessenta anos. A PT tem sido utilizada como ferramenta auxiliar no diagnóstico da TB,
pois apresenta uma alta positividade em indivíduos com a doença. Todavia, uma reação
positiva não é suficiente para diagnosticar a TB como doença. Todas as pessoas com infecção
anterior pelo M. tuberculosis podem apresentar uma resposta imune às proteínas contidas no
bacilo (BRASIL, 2011).
No Brasil, a tuberculina utilizada é o Derivado Protéico Purificado (PPD RT-23),
aplicada por via intradérmica no terço médio da face anterior do braço esquerdo do paciente,
na dose de 0,1 mL, equivalente a 2UT (unidades de tuberculina). Quando conservada em
temperatura entre 4ºC e 8ºC, a tuberculina mantém-se viva por seis meses. Não se deve,
entretanto, ser congelada, nem exposta à luz solar direta. Esse método é caracterizado por uma
reação celular desenvolvida na pele 24 a 72 horas após a inoculação intradérmica de um
derivado protéico do M. tuberculosis (PPD) (BRASIL, 2011).
A técnica de aplicação e o material utilizado são padronizados pela Organização
Mundial de Saúde e têm especificações semelhantes às usadas para a vacinação BCG. A
injeção do líquido faz parecer uma área de limites precisos, pálida e de aspecto pontilhado
como casca de laranja (BRASIL, 2011).
A resposta ao teste é classificada segundo o tamanho do nódulo e a graduação da
reação cutânea é utilizada para aumentar a especificidade do resultado, sendo os valores:
reator forte (≥ 10 mm de enduração) - indicativos de infecção prévia pelo bacilo; reator fraco
(5 a 9 mm de enduração) - decorrentes geralmente de infecções pelo M tuberculosis ou por
micobactérias não tuberculosas, como também pela vacinação prévia pelo BCG; e não reator
(0 a 4 mm) - indicativo de indivíduos não infectados pelo bacilo. Cerca 70 a 80% dos
30
portadores de TB pulmonar em atividade apresentam a prova tuberculínica ≥ 10 mm de
enduração (BETHLEM et al., 2000).
2.5.3 Exame microscópico direto – Baciloscopia Direta
A baciloscopia direta do escarro é o principal método no diagnóstico da TB pulmonar.
Trata-se de um método rápido, de simples execução e de baixo custo que permite a
visualização microscópica do bacilo através da coloração específica pelo Ziehl-Nielsen (ZN)
(CAMPOS, 2006). No entanto só é positiva quando há grande concentração de bacilos no
material examinado (5.000 – 10.000/mL de amostra). Dessa forma, apenas cerca de 60 a 80%
dos doentes são positivos à baciloscopia (BRASIL, 2011).
O método Ziehl-Nielsen se baseia na coloração a quente com fucsina fenicada, seguida
de descoloração com álcool-ácido, fazendo com que somente as micobactérias mantenham a
coloração vermelha, por serem ácido-resistentes. Outra técnica utilizada é a fluorescência com
auramina, apresenta a mesma acurácia do Ziehl-Nielsen, com tempo de leitura menor, mas é
pouco empregada, pois exige pessoal treinado e tem custo mais elevado. Além disso, as
lâminas positivas pela técnica de fluorescência precisam ser confirmadas pelo Ziehl-Nielsen
(SOCIEDADE BRASILEIRA DE PNEUMOLOGIA E TISIOLOGIA, 2004).
2.5.4 Cultura microbiológica para Micobactéria
O isolamento e a identificação do M. tuberculosis através da cultura é a metodologia
que permite a confirmação da TB, sendo considerada, atualmente o padrão-ouro para o
diagnóstico da doença, responsável pela identificação do bacilo em mais de 80% dos
pacientes doentes e com especificidade acima de 98% (ARNOLD, 2007; ORGANIZAÇÃO
MUNDIAL DE SAÚDE, 2011). É o método de referência (padrão-ouro) para avaliar um novo
método diagnóstico (BRASIL, 2008).
Apesar de ser um método mais caro que a baciloscopia, a cultura apresenta inúmeras
vantagens como maior sensibilidade, necessitando de uma carga bacilífera menor (10-100
bacilos/mL no espécime clínico) quando comparada a baciloscopia direta. Ao mesmo tempo,
permite a identificação das espécies que estão envolvidas na infecção e promoção da TB,
além de caracterizar a susceptibilidade das cepas aos medicamentos antituberculínicos
(CAMPOS, 2006). Contudo, devido ao crescimento lento, peculiar das micobactérias, a
obtenção dos resultados por meio da cultura pode levar cerca de 4 a 8 semanas, retardando a
31
confirmação diagnóstica. Nos casos pulmonares com baciloscopia negativa, a cultura pode
aumentar em até 30% o diagnóstico bacteriológico da doença (BRASIL, 2011).
Desde a década de 50, os métodos clássicos de cultura de micobactérias utilizados no
laboratório são manuais. Os métodos clássicos utilizam a semeadura da amostra em meios de
cultura sólidos. Os meios mais comumente utilizados são os sólidos à base de ovo, Lowestein-
Jensen e Ogawa-Kudoh. Têm a vantagem de serem os de menor custo e de apresentarem um
índice de contaminação menor. A desvantagem do meio sólido é o tempo de detecção do
crescimento bacteriano que varia de 14 a 30 dias, podendo se estender até oito semanas
(BRASIL, 2011).
A partir de 1980, os métodos de cultura tiveram avanços tecnológicos com o
desenvolvimento de sistemas comerciais. Os sistemas automatizados para detecção de
micobactérias como o BACTEC 460 TB®, BACTEC 9000® e o MGIT® são promissores,
utilizam meios enriquecidos que promovem a aceleração do crescimento bacteriano, mas
podem também indicar resultados falso-positivos devido à contaminação por outras bactérias
(SOCIEDADE BRASILEIRA DE PNEUMOLOGIA E TISIOLOGIA, 2004). Esses sistemas
utilizam um método de processamento e semeadura de amostras muito similar aos clássicos,
de maneira que não diminui o trabalho prévio, assim o que acelera é a leitura, pois a
incubação é monitorada por sistema informatizado (BRASIL, 2008).
2.5.5 Métodos moleculares
A partir de 1950, com a descoberta da estrutura do DNA, a biologia molecular se
revelou uma ferramenta útil no diagnóstico de doenças infecciosas, através da identificação de
seqüências gênicas específicas de um agente causador de doença. A partir do seqüenciamento
do genoma do M. tuberculosis, foram identificadas várias regiões, como o elemento de
inserção IS6110, permitindo a identificação específica do bacilo (COLE et al.,1998).
A reação em cadeia da polimerase (PCR) é atualmente considerada um método rápido
e sensível para a detecção do M. tuberculosis, sendo capaz de detectar menos que 10 bacilos
por mL em diferentes espécimes biológicos (ASSIS et al., 2007). Esta técnica vem sendo
utilizada como uma alternativa de alta sensibilidade e especificidade para o diagnóstico rápido
de doenças infecciosas. Entretanto, a sua aplicação na detecção do M. tuberculosis tem
apresentado resultados variáveis, principalmente em relação à sensibilidade do teste. Por essa
razão, alguns autores têm buscado avaliar o desempenho de várias seqüências-alvo e o seu
potencial diagnóstico (LEMAÎTRE et al., 2004).
32
2.5.6 Tratamento da tuberculose
Apesar de ser uma doença grave e contagiosa, a TB é altamente curável em
praticamente 100% dos casos novos, sensíveis aos medicamentos anti-TB, desde que
obedecidos os princípios básicos da terapia medicamentosa e a adequada operacionalização
do tratamento (BRASIL, 2011).
O tratamento preconizado, atualmente pela OMS consiste na administração de drogas
como a isoniazida, rifampicina, pirazinamida e etambutol nos dois primeiros meses (fase de
ataque) seguido pela combinação de rifampicina e isoniazida nos quatro meses seguintes (fase
de manutenção) (BRASIL, 2011). Contudo, o longo tratamento promove reações adversas
indesejáveis levando o paciente ao abandono da quimioterapia e ao possível surgimento de
cepas resistentes ao tuberculostáticos. A não adesão ao tratamento tem levado a OMS a
investir em uma estratégia global, conhecida como Tratamento Diretamente Observado
(DOTS), no qual Agentes Comunitários de Saúde aconselham os doentes, realizam a
vigilância progressiva e certificam que cada medicamento seja tomado na dose correta
(DUCATI et al., 2006).
2.6 Mecanismos de proteção imunológica e imunopatogênese da tuberculose
A história natural da TB mostra que a maioria dos indivíduos é resistente à infecção,
provavelmente, devido à capacidade de gerarem uma eficiente resposta imune contra o M.
tuberculosis (NORTH; JUNG, 2004). A infecção pelo M. tuberculosis pode estar relacionada a
três mecanismos fisiopatológicos: controle na porta de entrada (imunidade inata), tuberculose
latente ou doença ativa. A evolução da doença depende também do indivíduo estar sendo
infectado pela primeira vez (primo-infecção) ou re-infectado (LAPA E SILVA; BOÉCHAT,
2004).
A resposta imune inata precoce contra o M. tuberculosis é caracterizada pelo
progressivo acúmulo de neutrófilos, monócitos, macrófagos inflamatórios intersticiais e células
dendríticas nos pulmões. Como essas células são recrutadas, se tornam infectadas pela
população de micobactérias em expansão, estabelecendo o granuloma inicial (KHADER,
2011).
Em indivíduos com o sistema imunológico eficiente, o bacilo aprisionado dentro do
macrófago, pode permanecer latente por toda a vida, sem manifestar a doença. A disseminação
linfática e hematogênica ocorre antes do desenvolvimento de uma resposta imune efetiva,
33
constituindo novos focos no organismo. Esta infecção denomina-se tuberculose primária e é,
geralmente, assintomática. Nos casos em que a resposta imune é inadequada, a doença se
desenvolve acompanhada de sintomas pulmonares. Nas infecções primárias, encontram-se
lesões mínimas dos tecidos pulmonares (granulomas) associadas a uma adenopatia hilar,
constituindo o Complexo de Gohn (ANDREOLI et al., 1997). A tuberculose pós-primária
ocorre quando os mecanismos de defesa do organismo tornam-se comprometidos, reativando os
sítios com bacilos viáveis que estavam em latência. Quando o indivíduo sofre a segunda
infecção, a partir do contato com pessoas doentes, desenvolve a doença, com reativação
endógena (CAMPOS; PIANTA, 2001). Em muitos casos de tuberculose ativa, uma
imunodeficiência não foi encontrada. No entanto, a infecção com o vírus da imunodeficiência
humana, o tratamento com corticosteróides, envelhecimento e abuso de álcool ou de drogas
aumentam o potencial de reativação da tuberculose latente (FRIEDEN et al., 2003).
Logo após a infecção primária, os macrófagos alveolares e as células dendríticas que
fagocitaram o M. tuberculosis migram através do sistema linfático em direção ao linfonodo
regional e formam o complexo de Ghon. Ao mesmo tempo as células fagocíticas podem
penetrar no parênquima pulmonar, iniciando um foco inflamatório ao redor do
microorganismo, levando à formação do granuloma num processo coordenado por linfócitos T
(TEIXEIRA et al., 2007).
Estudos envolvendo a análise da interação entre M. tuberculosis e células
apresentadoras de antígeno demonstrou que as células dendríticas não permitem o crescimento
intracelular de M. tuberculosis, ao contrário do que é observado em macrófagos (HERMANN
et al., 2006). Nos macrófagos, a micobactéria reside nos fagossomas iniciais e escapa do
sistema imune por inibir a maturação dos fagossomas e a fusão com os lisossomas (RUSSELL,
2007). O M. tuberculosis produz lipídios que mimetizam os fosfatidilinositóis de mamíferos e
com isso inibe as vias dependentes de fosfatidilinositol 3-fosfato em macrófagos infectados
(VERGNE et al., 2004).
Além dos macrófagos alveolares, as células epiteliais das vias aéreas são outra
população celular que interage muito precocemente com o M. tuberculosis. De fato, o número
de células epiteliais nos alvéolos é 30 vezes maior do que o número de macrófagos e, portanto,
com maior probabilidade de serem as primeiras células expostas ao bacilo infeccioso. A
primeira indicação do envolvimento das células epiteliais foi derivada a partir de um estudo em
que a presença do DNA micobacteriano foi detectada em amostras de necropsia de indivíduos
que tinham morrido de outras doenças que não a tuberculose (HERNANDEZ−PANDO et al.,
2009).
34
O granuloma tuberculoso tem sido classicamente considerado como um mecanismo
que limita a difusão micobacteriana. É caracterizado pela presença de necrose caseosa central,
com infiltrado periférico de macrófagos modificados (células epitelióides e gigantes), células
T, células B e fibroblastos. A célula gigante tipo Langhans, formada pela fusão de
macrófagos, apresenta citoplasma amplo e núcleos distribuídos na periferia celular em forma
de ferradura (FERRAZ, et al., 2006). Em infecções latentes, o estado das bactérias dentro do
granuloma ou tubérculo, não é conhecido. A infecção primária é frequentemente abortada,
nesta fase, ainda que alguns bacilos persistam nos tecidos por meses ou décadas, sem
crescimento, mas ainda viáveis, uma característica chamada "persistência não-replicativa".
Em casos de tuberculose latente, o hospedeiro monta uma forte resposta imunológica, que
contém, mas não elimina a infecção. O dano decorrente dessas infecções deve-se em menor
proporção, aos efeitos diretos da bactéria nos tecidos do hospedeiro e em grande parte às
reações de hipersensibilidade do hospedeiro agora sensível aos produtos da bactéria. Falha do
mecanismo de resistência imunológica pode levar a reativação da doença (FERRAZ et al.,
2006; FLYNN, 2004; OTTENHOFF et al., 2005).
Com relação à resposta imune inata, os neutrófilos são as primeiras células
inflamatórias a localizar-se no sítio de multiplicação do bacilo, seguidas das células natural
killer (NK) e macrófagos (Figura 5). As células NK podem destruir os patógenos diretamente,
ou os monócitos infectados, e ativar células fagocíticas no sítio da infecção. O
reconhecimento e a fagocitose de bactérias por células da imunidade inata (neutrófilos,
macrófagos e células dendríticas) se dão via receptores de reconhecimento, como o receptor
para manose, receptores para a porção Fc de anticorpos (FcRs), e receptores para produtos de
ativação do sistema complemento, entre outros (NORTH & JUNG, 2004). A ativação de
receptores do tipo Toll (Toll-like Receptors, TLRs), conduz a uma importante ligação entre a
resposta imune inata e a adquirida (HERNANDEZ−PANDO et al., 2009; TEIXEIRA et al.,
2007).
O reconhecimento de micobactérias através de receptores Fc de macrófagos permite a
fusão dos fagossomas contendo as bactérias com os lisossomas, aumentando a produção de
intermediários reativos de oxigênio, ocasionando assim a morte bacteriana pela ação do óxido
nítrico e enzimas lisossômicas. Ocorre também o recrutamento de células do sistema
imunológico para a resposta inflamatória local e a apresentação de antígenos por moléculas de
histocompatibilidade principal (MHC) de classe II aos linfócitos T CD4+, para o
desenvolvimento da imunidade adquirida. Estas células desempenham um papel importante
35
na resposta protetora contra a M. tuberculosis, e quando eles estão ausentes, o crescimento do
bacilo não pode ser controlado (RAJA, 2004).
A ativação dos linfócitos CD4+ envolve o reconhecimento do peptídeo ligado ao MHC
de classe II e a interação entre moléculas co-estimuladoras, como a interação CD80/CD86-
CD28. Além disso, citocinas produzidas pelas células apresentadoras de antígenos, como a
interleucina (IL)-12, e citocinas produzidas pelos linfócitos T ativados, como a IL-2, estão
envolvidas na ativação e proliferação dos linfócitos T. Desta forma, antígenos específicos das
micobactérias interagem com TLRs e outros receptores presentes na superfície de macrófagos
e células dendríticas, induzindo, assim, uma resposta imune celular predominantemente pró-
inflamatória (HERNANDEZ−PANDO et al., 2009; TEIXEIRA et al., 2007).
O reconhecimento da micobactéria e posterior secreção de IL-12 por macrófagos são
processos iniciados antes da apresentação de antígenos do M. tuberculosis aos linfócitos T. A
IL-12 induz a produção de interferon-gama (IFN-γ) em células NK, na fase inicial da resposta
imune, e também induz a ativação, diferenciação, produção de IFN-γ e expansão de células
Th1 antígeno-específicas (OTTENHOFF et al., 2005).
Além da importante função de células T CD4+ na produção de citocinas, como o IFN-γ,
que ativa macrófagos e promove a destruição de bacilos, podem também participar na indução
de apoptose de células infectadas (ODDO et al., 1998). Outra função tem sido atribuída a essas
células, ou seja, ajudar a desenvolver uma resposta mediada por células T CD8+ (SERBINA et
al., 2001). Os mecanismos utilizados pelas células T CD8+ para o controle da TB parecem ser
principalmente a produção de citocinas e a função citolítica. Células T CD8+ são capazes de
secretar IFN-γ através da ativação do receptor de células T ou através da interação com as
células dendríticas infectadas (SERBINA; FLYNN, 1999).
Estudos indicam que o M. tuberculosis desenvolveu vários mecanismos para
manipular seus habitats celulares em seu próprio benefício, como por exemplo modulando o
tráfico e maturação dos fagossomos, permitindo-lhes fugir de mecanismos lisossomais de
morte, restrição e degradação, o uso de mecanismos de virulência para otimizar a sua
propagação de célula a célula, promovendo a morte necrótica de células infectadas e o
recrutamento de macrófagos, além de possuir múltiplos mecanismos para inibir a célula
hospedeira a apoptose, tal inibição permite a sobrevivência prolongada de células infectadas
com um maior número de bactérias acumuladas, ou também podem escapar dos fagossomos e
entram no citoplasma das células infectadas. Embora o M. tuberculosis possui claramente
distintos mecanismos para regular a morte celular por apoptose e necrose, permanece a ser
36
determinada como esses mecanismos são regulados e como se manifestam durante várias
fases da infecção (BLOMGRAN et al., 2012; ERNST, 2012).
Logo quando as bactérias são depositadas nos pulmões, passam por um período de 3
dias sem crescimento. Posteriormente, crescem com uma média de tempo de duplicação de
28h e atingem cerca de 5 logs em 20 dias. A interrupção do crescimento bacteriano está
relacionada com a produção do IFN-γ produzida por células T. Uma vez que o crescimento
bacteriano parou, a resposta imune mantém as bactérias em estado de latência por um período
de tempo prolongado; o recrescimento bacteriano pode ocorrer se os inibidores de imunidade
são ativados. Estes inibidores incluem anticorpo anti-CD4 de células T, anticorpo anti-fator de
necrose tumoral alpha (TNF-α) e os inibidores da síntese do óxido nítrico (COOPER;
KHADER, 2008)
A resposta imune de resistência contra a TB pode ser definida como do tipo 1 (Figura
5), com a produção de IFN-γ e TNF-α por linfócitos CD4+ e CD8
+, presentes e importantes no
controle da doença em animais e humanos (AMIM et al., 2008; AMIRZARGAR et al., 2006;
FLYNN & CHAN, 2001;). A capacidade dos macrófagos alveolares em destruir o Mtb ou inibir
o seu crescimento depende de sua ativação pelo IFN-γ e abrange mecanismos moleculares
complexos, tais como a produção das citocinas IL-1, IL-6, IL-12, TNF-α, óxido nítrico e
quimiocinas. Além disso, dependendo também do número e da virulência do bacilo fagocitado
(ATES et al., 2008; VALLINOTO et al., 2010).
A capacidade bactericida do macrófago frente ao M. tuberculosis necessita ser
previamente ativada. O IFN-γ é o principal e mais potente mediador desse processo, produzida
por célula Th1, durante sua interação com o macrófago através da interação CD40 expresso
pela célula Th1 com o CD40L no macrófago (SALGAME, 2005; TEIXEIRA et al., 2007). O
IFN-γ é capaz de incrementar a expressão de diversos genes nos macrófagos, induzir um
aumento na expressão do MHC (aumento na apresentação de antígenos) e de receptores para
imunoglobulinas (FcRs; maior capacidade de fagocitose), recrutar linfócitos T que participam
da destruição bacteriana e participar da produção de óxido nítrico. Embora a produção de IFN-γ
isolada seja insuficiente para o controle do bacilo, é um dos componentes cruciais para a
resposta protetora contra o patógeno. O IFN-γ, em sinergia com o fator de necrose tumoral alfa
(TNF-α) ativa macrófagos infectados, iniciando um importante mecanismo efetor da imunidade
mediada por células (O´GARRA et al., 2013).
Após três semanas de infecção, a resposta imune Th1 desenvolvida frente aos
componentes antigênicos do Mtb é responsável pela destruição e inibição da multiplicação dos
bacilos no interior dos macrófagos ativados via estresse oxidativo, exercendo e promovendo
37
uma ação antimicobacteriana, através do desenvolvimento do granuloma (COLLIN;
KAUFMANN, 2001). As citocinas Th2, principalmente a IL-4 e a IL-10, atuam como
reguladoras da resposta macrofágica através da modulação negativa da resposta Th1 e da
produção de mediadores da resposta inflamatória (ATES et al., 2008; SELVARAJ et al., 2008).
As diferentes manifestações clínicas que ocorrem na tuberculose refletem o desequilíbrio entre
a capacidade de virulência do bacilo e os mecanismos de defesa do hospedeiro, relacionados ao
desequilíbrio do balanço Th1/Th2 (HERNANDEZ-PANDO et al., 2009; VAN CREVEL et al.,
2000).
Sendo assim, o subtipo Th2 de células T CD4+ pode inibir os mecanismos microbicidas
dos macrófagos, neutralizar as citocinas do subtipo Th1 e dissolver o granuloma tuberculoso,
sendo então responsável pelo escape e disseminação do Mtb, contribuindo com o
desenvolvimento da doença ativa (ATES et al., 2008; MOSSAD et al., 2010). Este perfil de
citocinas tem sido relacionado por vários autores com a tuberculose ativa (AMIM et al., 2008;
MOSSAD et al., 2010; VALLINOTO et al., 2010).
Diversos estudos têm indicado o importante papel das citocinas TNF-α e IL-10 na
patogênese da tuberculose (ATES et al., 2008; BEN-SELMA et al., 2011; MOSSAD et al.,
2010; VALLINOTO et al., 2010). O TNF-α é uma potente citocina pró-inflamatória que
desempenha um papel fundamental na iniciação, regulação e perpetuação da resposta
inflamatória. A IL-10 inibe a produção de citocinas pró-inflamatórias através da sua ação sobre
as células Th1 e macrófagos (ATES et al., 2008; TRAJKOV et al., 2009), sendo importante no
controle da exacerbação das respostas pro-inflamatórias, minimizando o dano tecidual na TB
(OH et al., 2007).
Um subtipo de células T CD4+ que co-expressam CD25 e fator de transcrição Foxp3,
conhecidas como células T regulatórias (Treg), com propriedades imunomoduladoras, tem sido
descrita. Estas células ocorrem naturalmente em ratos e humanos, em torno de 5-10% de
células T CD4+ circulantes em indivíduos saudáveis (O'GARRA; VIEIRA, 2004). O equilíbrio
entre os diferentes tipos de resposta de células T é controlado, em parte, pela ação das células
Treg e estão envolvidos na regulação da Th1 e Th2 e de ambos os mecanismos de proteção e
imunopatológicos. Pacientes com tuberculose ativa tem uma população expandida de células
Treg no sangue e no local da infecção, e parece que estas células ativamente suprimem as
células Th1 e na produção de IFN-γ (RIBEIRO-RODRIGUEZ et al., 2006). Assim, células
Treg podem também participar na supressão de células Th1, favorecendo a progressão da
doença. (HERNANDEZ−PANDO et al., 2009).
38
A contribuição do componente genético do hospedeiro na resistência e susceptibilidade
à infecção inicial e progressão do estado latente para a doença ativa tem sido demonstrado tanto
em modelo animal (FLYNN et al., 1995) como em humanos (BELLAMY, 2005; STEAD,
2001). Estudos têm demonstrado que a infecção tuberculosa está relacionada com deficiências
imunológicas de origem genética, diminuindo a atividade de células T e macrófagos, e gerando
falhas na produção de citocinas (HENAO et al., 2006; SELVARAJ et al., 2008; TRAJKOV et
al., 2009; VALLINOTO et al., 2010).
Sabe-se que a resposta imune protetora do hospedeiro contra este microorganismo é
mediada pela imunidade celular, em que determinadas citocinas e células T tem uma
importante função (CAVALCANTI et al., 2012). Fatores genéticos, principalmente
polimorfismos de base única em diferentes genes da imunidade, têm sido descritos e
associados com a tuberculose, podendo desempenhar um importante papel na susceptibilidade
à doença (OLIVEIRA et al., 2004). Assim, a compreensão e o entendimento dos mecanismos
envolvidos nessa resposta e, em particular a participação das citocinas envolvidas é de
importância significativa para o desenvolvimento de um controle eficaz e preventivo da
doença.
39
Figura 5 - A resposta imune celular na tuberculose.
Fonte: O’garra et al. (2013)
Nota: Infecção por aerosol com o Mycobacterium tuberculosis, onde macrófagos alveolares localizados no
pulmão, neutrófilos e células dentríticas tornam-se infectadas.
Legenda: Macrófagos alveolares (1a), neutrófilos (1b), células dentríticas DC (1c). Migração de DC infectadas
para linfonodos através de citocinas e quimiocinas (2). Diferenciação de células T para tipo Th1 (3). Células Th1
antígeno-específica retornam ao pulmão após a infecção inicial (4). Produção de IFN-γ por Th1 para ativação de
macrófagos, produção de citocinas, indução de fatores microbicidas incluindo ócido nítrico induzível (iNOS) (5)
para o controle micobacteriano.
2.6.1 Fator de Necrose Tumoral alfa (TNF-α) na tuberculose
O TNF-α é uma proteína não glicosilada de 17 kD, apresentando uma cadeia
polipeptídica de 157 aminoácidos. O gene que codifica o TNF- está localizado no braço curto
do cromossomo 6 (6p21.31) imerso no complexo principal de histocompatibilidade de classe
III (Figura 6). Este gene é regulado a nível transcricional e pós transcricional (MERZA et al.,
2009).
O TNF-α é uma citocina pró-inflamatória pleiotrópica que exerce múltiplos efeitos
biológicos. A sua expressão é rigorosamente controlada, e a superprodução pode causar efeitos
prejudiciais encontrados no choque séptico, tais como hipotensão arterial, coagulação vascular
disseminada e hipoglicemia letal. No processo de controle de infecção por micobactérias, o
TNF-α parece ter um papel primordial, atuando sobre uma grande variedade de células
(CAVALCANTI et al., 2012).
40
É secretada por monócitos, macrófagos, neutrófilos, linfócitos T, principalmente CD4+,
e também células natural killer (NK). Atua recrutando neutrófilos e monócitos aos locais de
inflamação para eliminar agentes microbianos através da estimulação das células endoteliais a
expressarem moléculas de adesão, facilitando o tráfico dessas células, também estimula a
secreção de quimiocinas e induz apoptose na célula-alvo. Esta citocina intervem na formação,
organização e controle do granuloma tuberculoso e em sinergismo com o IFN-γ induz a
produção de óxido nítrico, um dos principais agentes microbicidas para as micobactérias
(CORREA et al., 2004; OLIVEIRA et al., 2004).
Estudos demonstram que o bloqueio do TNF-α tem grandes efeitos na progressão da
tuberculose em modelos experimentais. A neutralização do TNF-α em modelos murino resulta
no agravamento da tuberculose ou reativação (FLYNN et al., 1995). Estudo também tem
revelado que o TNF-α é expresso em tecidos infectados com MTB durante a fase latente da
infecção, o que sugere uma contribuição com outras citocinas, como o IFN-γ, no controle da
multiplicação do bacilo (CAVALCANTI et al., 2012; SCANGA et al., 2000).
Por outro lado, existem também evidências demonstrando que o TNF-α pode estar
associado com respostas imunopatológicas na tuberculose, atuando como mediador na
destruição do tecido pulmonar. Os níveis elevados de TNF-α estão relacionados com uma
excessiva inflamação com necrose e caquexia (CAVALCANTI et al., 2012).
A importância do TNF-α na formação do granuloma micobacteriano é explicada, em
parte, pela reativação da tuberculose em pacientes com artrite reumatóide e doença de Crohn,
tratados com agentes biológicos, inibidores do TNF-α (GÓMEZ-REINO et al., 2003). A
expressão do TNF-α na tuberculose, assim como em outras patologias infecciosas pode variar
de um indivíduo a outro e entre populações. Certas mutações pontuais na região promotora do
gene pode promover uma alteração na síntese protéica (diminuição ou aumento de produção),
um fenômeno que tem sido associado à várias doenças infecciosas, inclusive a tuberculose
(CORREA et al., 2004; OLIVEIRA et al., 2004).
2.6.2 Interleucina 10 (IL-10) na tuberculose
Dentre as várias citocinas envolvidas na imunopatogenia da tuberculose, a interleucina
10 (IL-10) tem apresentado uma importância relevante. O gene da IL-10 está localizado no
cromossomo 1q31-32 (SHIN et al., 2005).
Estudos têm demonstrado a presença de níveis elevados desta citocina em pacientes
com TB pulmonar ativa (ANSARI et al., 2009; SELVARAJ et al., 2008). Macrófagos de
41
pacientes com tuberculose encontram-se suprimidos in vitro, e a inibição de IL-10 reverte
parcialmente esta supressão (FLYNN, CHAN, 2001). Em outro estudo, a IL-10 foi capaz de
inibir diretamente as respostas de linfócitos T CD4+ de doadores com tuberculose latente e
também reduziu a expressão de MHC de classe I e II, CD40, B7-1 e B7-2 de monócitos
infectados com Mycobacterium tuberculosis (ROJAS et al., 1999). A diminuição na resposta
imune celular protetora é o objetivo do M. tuberculosis para a sobrevivência no hospedeiro,
induzindo a produção de IL-10 e outros mediadores inibitórios da resposta inflamatória, sendo
detectados em amostras de escarro de pacientes com tuberculose (CAVALCANTI et al., 2012).
Polimorfismos na região promotora do gene da IL-10 estão associados com várias
doenças, autoimunes e infecciosas (TURNER et al., 1997). Sabe-se que polimosfismo na
posição -1082, dentro da região promotora do gene da IL-10 apresenta alteração nos níveis
plasmáticos. Estes achados quanto à expressão diferencial desta citocina nos pacientes com TB
pulmonar ativa a tornaram alvo de estudos de polimorfismo genético (LÓPEZ-MADERELO et
al., 2003; CHIACCHIO et al., 2009).
2.7 Polimorfismos Genéticos
Um polimorfismo genético é definido quando existe a ocorrência de mais de um alelo
em um gene, no qual pelo menos dois alelos aparecem com freqüências superiores a 1% na
população. A presença de polimorfismos em um determinado gene pode ou não acarretar
alterações fenotípicas (NUSSBAUM et al., 2002).
Os estudos de polimorfismos genéticos mais freqüentemente realizados envolvem a
análise da freqüência de polimorfismos de um único nucleotídeo (Single Nucleotide
Polymorphism – SNP), onde uma única base nitrogenada do DNA é substituída por outra
(NUSSBAUM et al., 2002). Estas variações estão normalmente associadas à diversidade
populacional, individualidade, susceptibilidade a doenças e resposta individual a
medicamentos. Dentro de uma população, a freqüência de um alelo pode ser atribuída à
relação entre os SNPs que a população carrega, sendo a variante mais comum presente em
maior freqüência do que as variantes raras. É importante notar que existem diferenças
acentuadas entre as populações humanas em termos de distribuição das variantes. Por esta
razão, um alelo comum em um grupo geográfico ou étnico pode ser raro em outros grupos
(KUBISTOVA et al., 2009).
SNPs encontrados em regiões gênicas não-codificantes (íntrons) ou em regiões
reguladoras/promotoras de um gene não acarretam mudanças na sequência de aminoácidos da
42
proteína, no entanto, podem alterar a capacidade de transcrição gênica e, consequentemente
sua produção local ou sistêmica. Este tipo de polimorfismo é denominado funcional por
conferir diferenças inter-individuais na síntese e secreção de proteínas e são os mais utilizados
em estudos de associação de doenças, por evidenciarem geneticamente a produção diferencial
de certas moléculas entre os indivíduos afetados (OLLIER, 2004).
O envolvimento dos SNPs nas infecções por patógenos vem sendo amplamente
analisado nos últimos anos. Nesses estudos, os genes relacionados à codificação de proteínas
do sistema imune inato e adaptativo ganharam posição de destaque por apresentarem
importante papel na proteção contra diversas enfermidades virais, fúngicas e bacterianas. Os
experimentos que analisam e comparam o perfil genético de uma população saudável com
outra doente são realizados no intuito de revelar os principais marcadores genéticos
associados à susceptibilidade (KLOTMAN; CHANG, 2006).
No caso dos estudos de associação, a freqüência de um alelo específico é comparada
entre a população de indivíduos afetados (casos) e a de não-afetados (controle), quando estas
populações encontram-se em equilíbrio de Hardy-Weinberg (LANDER; SCHORK, 1994).
Estudos de associação baseados em populações caso-controle podem detectar pequenos
efeitos de determinados genes e muitos destes estudos foram capazes de validar a associação
entre genes com padrões de susceptibilidade/resistência ou de detectar caminhos novos,
envolvidos na patogênese de inúmeras doenças (MAARTENS; WILKINSON, 2007).
Os resultados encontrados na investigação de susceptibilidade do organismo à
tuberculose têm sido obtidos através de estudos de associação, devido ao poder de detecção de
pequenos efeitos gênicos quando comparado aos estudos de ligação, desde que o tamanho da
amostra analisada seja adequado (RISCH; MERIKANGAS, 1996).
2.7.1 SNPs na tuberculose
Os componentes genéticos de susceptibilidade a tuberculose encontram-se distribuídos
entre inúmeros genes, tendo sido estudados extensivamente nos últimos anos, resultando em
uma grande quantidade de informação. Vários genes, como o HLA (Antígenos de Leucócitos
Humanos), NRAMP1 (2q35), IFN-γ (12q14), NOS2A (17q11.2-12), CCL2 (17q11.2-q12),
MBL2 (10q11.2-q21), CD209 (19q13), VDR (12q13.11) e TLR (Receptores de homologia-
Toll), têm sido associados com a tuberculose, alguns repetidamente, enquanto outros
apresentam padrões de susceptibilidade diferenciada de acordo com a população étnica
43
examinada (BURGNER et al., 2006), enfatizando a complexidade que caracteriza a
susceptibilidade do hospedeiro segundo a origem da população (ARDLIE et al.,2002).
Polimorfismos em genes de citocinas, que podem confirmar diferenças interindividuais
na síntese e secreção destas, têm sido associados a doenças que têm uma patogênese
inflamatória (SANTOS et al., 2002; SELVARAJ et al., 2008). SNPs localizados em regiões
promotoras de genes que codificam diferentes proteínas, em particular os genes do TNF-α e IL-
10, têm sido associados com a susceptibilidade e/ou resistência à tuberculose em diferentes
grupos étnicos (LARCOMBE et al., 2008; MERZA et al., 2009).
Estudos têm investigado o efeito de SNPs de região promotora do gene do TNF-α
(AMIRZAGAR et al., 2006; DESHPANDE et al., 2005; SANTOS et al., 2002). O gene do
TNF- contém vários SNPs, dos quais dois são os mais estudados (Figura 6). O primeiro está
localizado na posição -238 e o segundo na posição -308, ambos em relação ao sítio de início
da transcrição, onde a presença de guanina (G) define o alelo de tipo selvagem (isto é, o alelo
mais comum). Tem sido demonstrado para ambas as posições que a presença de adenina (A)
resulta em uma transcrição duas vezes maior, com implicações funcionais (KUMAR et al.,
2008; MERZA et al., 2009; WILSON et al., 1997). Níveis alterados de TNF- α podem estar
influenciando a resposta imune contra o M. tuberculosis e contribuindo para uma
suscetibilidade individual a tuberculose (DESHPANDE et al., 2005).
Figura 6 - Localização do gene do TNF no complexo principal de histocompatibilidade de classe III.
Fonte: Verweij (1999)
Legenda: A posição dos SNPs está indicada por setas localizadas na última linha
44
Polimorfismos no gene do TNF-α na posição -308 foram investigados por Bikmaeva et
al. (2002) na população da Bashkorstan na Rússia, em um grupo de pacientes com tuberculose
e encontraram uma freqüência significantemente maior (p=0,001) do alelo A (alto produtor)
nos pacientes doentes em comparação com os controles saudáveis. A freqüência de
polimorfismos funcionais no gene do TNF-α na posição -308 em um grupo de pacientes da
Sicília com tuberculose pulmonar crônica também foi investigada por Scola et al. (2003), que
demonstraram uma redução do genótipo homozigótico G/G (baixo produtor) nos indivíduos
com tuberculose. Em outro estudo, realizado por Correa et al. (2004) verificou o referido
polimorfismo em diferentes grupos de pacientes da Colômbia com doença autoimune e
tuberculose. Concluíram que o alelo A é um fator de risco para doença auto-imune, mas possui
um efeito protetor para a tuberculose, enquanto que o alelo G se mostrou um fator de risco para
a doença.
Na região promotora do gene da IL-10 podem ser encontrados três polimorfismos de
base única (SNP), localizados nas posições -1082 (G/A), -819 (C/T) e -592 (A/C) (TURNER et
al., 1997) (Figura 7). Os genótipos -1082: GG, GA e AA, correspondem aos fenótipos alto,
intermediário e baixo produtor desta citocina, respectivamente, independente das variações
nucleotídicas presentes nas posições -819 e -592 do gene da IL-10 (TAMBUR et al., 2001).
Delgado et al. (2002) avaliou a freqüência dos genótipos da região promotora do gene
da IL-10 na posição -1082 em pacientes do Camboja, tendo encontrado uma maior freqüência
de indivíduos heterozigotos entre os pacientes com TB pulmonar ativa. Estudando pacientes
italianos, Scola et al. (2003) observaram uma tendência de diminuição do alelo A nos pacientes
com TB pulmonar ativa. Um estudo mais recente, realizado na Turquia por Ates et al. (2008)
demonstrou uma maior freqüência do alelo G na posição -1082 nos pacientes com TB
pulmonar ativa, em relação a indivíduos sem histórico ou evidência radiológica de TB.
Figura 7 - Estrutura e localização de SNPs funcionais (-1082G/A; -819C/T; -592C/A) do gene da IL-10.
Fonte: Tso et al. (1999)
45
2.7.2 Genotipagem por PCR em tempo real (qPCR)
A quantidade de métodos para genotipagem de SNPs tem crescido nos últimos anos e
muitos destes já se encontram atualmente disponíveis, revolucionando a área da genética
molecular humana e contribuindo nos estudos de investigação de fenótipos complexos,
medicina legal e testes diagnósticos (TWYMANT; PRIMROSE, 2003).
Com o aparecimento da PCR em Tempo Real (qPCR), em 1992, por Higuchi e
colaboradores, o monitoramento da amplificação de fragmentos de DNA e RNA em tempo
real foi possível (DUSSAULT et al., 2006; KUBISTA et al., 2006). De fato, a qPCR realiza a
quantificação dos ácidos nucléicos de maneira precisa e altamente reproduzível, pois
determina seus valores durante a fase exponencial da reação (NOVAIS et al., 2005). A técnica
da qPCR baseia-se na detecção de moléculas fluorescentes que aumentam a emissão da
fluorescência quando o produto de amplificação acumula-se em cada ciclo da reação
(DUSSAULT et al., 2006), de forma que tal emissão é gravada durante cada ciclo e representa
a quantidade do produto amplificado. A plataforma da qPCR requer um sistema óptico para
excitação da fluorescência e outro para a captação da emissão. As informações adquiridas são
transmitidas para softwares que analisam e calculam os dados finais da reação (NOVAIS et
al., 2005).
Existem dois tipos principais de químicas fluorescentes utilizados na PCR em tempo
real: o TaqMan® e o SYBR® Green. O SYBR® Green, com excitação e emissão máxima de
494nm e 521nm (DUSSAULT et al., 2006), se intercala na dupla fita de DNA e após a
excitação pela luz emite uma florescência verde que é detectada pelo sistema de recepção do
equipamento (NOVAIS et al., 2005). Outra forma de gerar fluorescência é através do uso de
uma sonda, dirigida especificamente a uma região interna da sequência que se deseja
amplificar, sendo um exemplo destas a TaqMan®. Esta possui um marcador fluorescente
reporter na extremidade 5’, capaz de absorver a energia luminosa emitida pelo equipamento e
dissipá-la na forma de luz e calor, em comprimento de onda diferente do original. Entretanto,
na sua posição nativa, toda a luz emitida por esse fluoróforo é absorvida por outro marcador,
o quencher, presente na extremidade 3' da sonda (NOVAIS et al., 2005).
Dessa forma, o sistema óptico do equipamento não é capaz de detectar fluorescência
no tubo de reação, mas, durante a amplificação, a sonda que se hibridizou ao produto-alvo
será clivada pela atividade da exonuclease da enzima Taq DNA polimerase. Como
conseqüência, essa sonda será degradada e o fluoróforo ficará distante do quencher que agora
46
não mais será capaz de absorver a luz emitida. Assim, ocorrerá um aumento na intensidade de
fluorescência, permitindo a quantificação do alvo (NATIONAL COMMITTEE FOR
CLINICAL LABORATORY STANDARDS, 2001).
A curva de quantificação de DNA através da PCR em tempo real é um dos dados
gerados durante a amplificação do material genético, e consiste de três fases distintas: uma
fase log inicial, no qual os produtos ainda não podem ser mensurados, uma fase exponencial,
onde a detecção da fluorescência é alcançada e uma fase platô (DUSSAULT et al., 2006). O
ponto na curva, dentro da fase exponencial, no qual a quantidade de fluorescência ultrapassa o
sinal da linha basal é chamado de valor do ciclo “threshold” (Ct). Este ponto é de crucial
importância, pois, determina o sucesso da amplificação, permite quantificar a concentração de
DNA com maior acurácia e pode ser utilizado para a genotipagem de diferentes alelos
(GRAY et al., 2000; WILHELM et al., 2003).
47
3 JUSTIFICATIVA
Diante da magnitude da TB no Brasil e no mundo, que apresenta elevadas taxas de
morbidade e mortalidade, é de grande importância do ponto de vista clínico, epidemiológico e
de saúde pública, a execução de estudos que visem compreender melhor os fatores
responsáveis pelo desenvolvimento da tuberculose pulmonar (LEANDRO et al., 2009).
Na imunologia, um destes fatores são as citocinas anti-inflamatórias que são
provavelmente produzidas em maior quantidade, com o intuito de proteger contra danos
teciduais, mas a conseqüência desta resposta é um declínio na imunidade protetora, o que
facilita o crescimento do bacilo e a progressão da doença (HERNANDEZ−PANDO;
AGUILAR, 2009).
Avanços recentes na genética molecular abrem novas perspectivas no estudo da
patogênese da tuberculose. Estudos apontam para a importância da constituição genética do
indivíduo no desenvolvimento da TB pulmonar ativa (BIRD, 2010; PACHECO et al., 2008).
Diversos trabalhos descrevem genes cuja expressão de proteínas estão provavelmente
envolvidos com o processo de susceptibilidade e/ou resistência a tuberculose em diferentes
populações mundiais (MOSSAD et al., 2010; VALLINOTO et al., 2010). Polimorfismos
genéticos associados à susceptibilidade têm sido propostos para explicar diferenças no
processo de desenvolvimento da tuberculose pulmonar ativa em diferentes populações
(LARCOMBE et al., 2008; MERZA et al., 2009; STEIN; BAKER, 2011).
Assim, o presente trabalho propôs investigar uma provável associação dos SNPs
funcionais localizados em regiões promotoras dos genes das citocinas TNF-α (-308G/A) e IL-
10 (-1082A/G) com a susceptibilidade ou resistência a tuberculose pulmonar ativa em
pacientes oriundos do estado de Pernambuco, Brasil.
O desafio real da pesquisa é tentar associar os polimorfismos de um único nucleotídeo
de região promotora de genes de citocinas com os dados epidemiológicos da tuberculose, em
que apenas 10% dos indivíduos infectados desenvolvem a forma ativa da doença. Até o
presente momento, nenhum estudo com o objetivo de relacionar polimorfismos genéticos do
TNF-α e IL-10 com a susceptibilidade ou resistência à TB pulmonar foi realizado no Nordeste
do Brasil. Assim, o interesse em compreender melhor o papel que os fatores genéticos
desempenham na resposta imune contra a tuberculose, com a definição de perfis gênicos de
susceptibilidade ou resistência é de fundamental importância para a geração de conhecimentos
para futuros estudos de imunoprofilaxias ou imunoterapias.
48
4 PERGUNTA CONDUTORA
Existe uma associação entre polimorfismos de base única localizados em regiões
promotoras dos genes das citocinas TNF-α (-308G/A) e IL-10 (-1082A/G) com o risco de
desenvolvimento da tuberculose pulmonar ativa na população do estado de Pernambuco?
49
5 HIPÓTESE
Variações genéticas específicas em regiões promotoras dos genes das citocinas TNF-α
(-308G/A) e IL-10 (-1082A/G) influenciam a imunidade do hospedeiro na tuberculose
pulmonar ativa.
50
6 OBJETIVOS
6.1 Objetivo Geral
Analisar a associação entre polimorfismos de base única de regiões promotoras dos
genes das citocinas TNF-α (SNP -308G/A – rs1800629) e IL-10 (SNP -1082A/G - rs1800896)
com a resistência ou susceptibilidade a tuberculose pulmonar ativa em pacientes oriundos do
estado de Pernambuco.
6.2 Objetivos Específicos
a) Caracterizar o perfil clínico, epidemiológico e laboratorial dos pacientes sintomáticos
respiratórios participantes do estudo;
b) Determinar a frequência alélica e genotípica dos SNPs da posição -308G/A do gene do
TNF-α e -1082A/G do gene da IL-10 dos pacientes com tuberculose pulmonar ativa,
tuberculose latente, pacientes portadores de outras patologias respiratórias e
indivíduos clinicamente saudáveis;
c) Avaliar o risco e/ou proteção de desenvolvimento da tuberculose pulmonar ativa nos
pacientes participantes do estudo em relação ao perfil alélico e genotípico dos SNPs
dos genes TNF-α (-308 G/A) e IL-10 (-1082A/G);
d) Avaliar o risco de desenvolvimento da tuberculose pulmonar ativa com as co-
morbidades (hipertensão e diabetes) e co-variáveis (idade, sexo, etilismo e tabagismo)
em relação ao perfil alélico e genotípico dos SNPs dos genes TNF-α (-308 G/A) e IL-
10 (-1082A/G).
51
7 PROCEDIMENTOS METODOLÓGICOS
7.1 População da pesquisa
Inicialmente foram incluídos pacientes sintomáticos respiratórios, ou seja, com tosse
por mais de três semanas (BRASIL, 2011), suspeitos de tuberculose pulmonar, de idades
variadas, ambos os sexos, que produzissem escarro, provenientes de unidades públicas de
saúde do estado de Pernambuco, no período de fevereiro a dezembro de 2012 (Figura 8).
Posteriormente, os pacientes foram caracterizados de acordo com a definição
diagnóstica feita pelo médico pneumologista acompanhante do serviço de saúde, baseados nos
sintomas clínicos, achados radiológicos e exames laboratoriais:
Grupo Caso: pacientes sintomáticos respiratórios com diagnóstico de tuberculose
pulmonar ativa, comprovado através de achados clínicos e exames laboratoriais, tais como
exame radiológico (raio-x alterado), resultado de baciloscopia e/ou cultura positivos na
detecção do M. tuberculosis e resposta terapêutica anti-TB (BRASIL, 2011).
O grupo “controle” foi formado por dois subgrupos de sintomáticos respiratórios:
1) Sintomático respiratório/TB latente (controle 1): indivíduos sintomáticos
respiratórios que apresentaram teste tuberculínico (TT) reator (>10mm), com achados
radiológicos normais, com contato domiciliar com indivíduos com TB pulmonar ativa,
com exames laboratoriais de baciloscopia e cultura negativos na detecção do M.
tuberculosis e com diagnóstico final de TB latente (BRASIL, 2011).
2) Sintomático respiratório/Não TB (controle 2): indivíduos sintomáticos respiratórios
com TT não-reator (<10mm), com achados radiológicos normais, com exames
laboratoriais de baciloscopia e cultura negativos para a detecção do M. tuberculosis e
portador de outra patologia respiratória.
Além dos dois grupos controles formados por sintomáticos respiratórios sem TB
pulmonar, também foi incluído um terceiro formado por:
3) Indivíduos clinicamente saudáveis (controle 3): sem história prévia de clínica e
tratamento para tuberculose, que procuraram espontaneamente os serviços de saúde
para realização de exames de rotina e que realizaram o teste tuberculínico para
triagem.
52
Figura 8. Fluxograma de investigação de infecção respiratória aguda e crônica, a partir de casos sintomáticos
respiratórios.
7.2 Local do estudo
O estudo foi realizado na cidade do Recife, Pernambuco, com seleção dos pacientes
nos seguintes serviços de saúde: Hospital das Clínicas (HC/UFPE) e Hospital Otávio de
Freitas (HGOF/SUS), referências no diagnóstico e tratamento da tuberculose em Pernambuco;
e nos Postos de Saúde da Família (PSF) Joaquim Cavalcanti, Policlínica Lessa de Andrade,
ambos do Distrito Sanitário IV, e a Policlínica Albert Sabin, do Distrito Sanitário II.
Nos Laboratórios de Imunoepidemiologia (LIE) e Núcleo de Plataforma Tecnológica
(NPT) do Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães da Fundação Oswaldo Cruz
(CPqAM/Fiocruz) foram realizados os exames laboratoriais de cultura em meio específico e
os testes de genotipagem por PCR em tempo real. Os exames de imagem solicitados pelo
médico e teste tuberculínico foram realizados na rede pública de saúde e o exame de
baciloscopia no Laboratório Municipal do Recife.
Fonte: Sociedade Brasileira de Pneumologia e Tisiologia (2009)
53
7.3 Desenho do estudo
O desenho do estudo foi do tipo caso-controle que visou avaliar a associação entre
polimorfismos de base única (SNP) localizados em regiões promotoras dos genes das
citocinas TNF-α (-308G/A) e IL-10 (-1082A/G) entre os pacientes com tuberculose pulmonar
ativa, pacientes infectados com TB latente, pacientes portadores de infecções pulmonares
inespecíficas e indivíduos clinicamente saudáveis.
7.4 Tipo e tamanho da amostragem
Foram adotados os seguintes parâmetros para o cálculo amostral realizado no
programa STATCALC do software Epi-Info 6.04:
- Erro: α = 5% e Poder do teste = 80%
- Freqüência esperada de 50% (estimativa)
- Odds Ratio = 3 – Baseado no estudo de ATES et al., 2008, BEN-SELMA et al., 2011 e
AFZAL et al., 2011.
Dado que é interesse no estudo comparar as frequências de polimorfismo entre os
casos de tuberculose pulmonar ativa com os casos sintomáticos respiratórios com (controle 1)
e sem infecção (controle 2) pelo M. tuberculosis e com os indivíduos saudáveis, foram
portanto, adotados três grupos controles (vide item 7.1). Dessa forma, foi calculada uma
amostragem total de 260 indivíduos para serem distribuídos 65 em cada grupo. Porém, nos
grupos controles formados por indivíduos sintomáticos respiratórios com e sem infecção pelo
M. tuberculosis, só foram possíveis serem alocados 53 e 57, respectivamente. Por outro lado,
os grupos formados por pacientes com tuberculose ativa e por indivíduos clinicamente
saudáveis conseguiu-se 71 e 101, respectivamente, sendo, portanto selecionados um total de
282 participantes.
7.5 Critérios de Inclusão
Pacientes que chegaram aos serviços públicos de saúde de Pernambuco, com sintomas
respiratórios, suspeitos ou não de TB e indivíduos sem sintomas respiratórios, considerados
clinicamente saudáveis, de faixa etária variada, de ambos os sexos e não portadores do vírus
HIV.
54
7.6 Critérios de Exclusão
Como o estudo visa avaliar fatores de risco ou de proteção imunogenéticos no
desenvolvimento da tuberculose pulmonar, sendo a infecção pelo vírus HIV considerada um
importante fator de risco para a doença, com alta taxa de prevalência, foram excluídos os
pacientes sabidamente soropositivos.
7.7 Critérios de definição de co-morbidades e co-variáveis utilizados no estudo
a) Diabetes mellitus e hipertensão arterial: confirmação da presença através de
diagnóstico feito pelo médico acompanhante e que estavam em uso de tratamento
específico;
b) Fumante: indivíduo que fumou mais de 100 cigarros ou 5 maços de cigarros, em toda
a sua vida e/ou fuma atualmente (ORGANIZAÇÃO PANAMERICANA DE SAÚDE,
1995);
c) Alcoolista: indivíduos que apresentaram pelo menos algum dos seguintes critérios:
Compulsão: uma necessidade forte ou desejo incontrolável de beber;
Perda de controle: a inabilidade freqüente de parar de beber uma vez que a pessoa já
começou;
Dependência física: a ocorrência de sintomas de abstinência, como náusea, suor,
tremores e ansiedade, quando se pára de beber após um período contínuo de uso de
bebida. Tais sintomas são aliviados bebendo álcool ou tomando outra droga sedativa;
Tolerância: a necessidade de aumentar as quantidades de álcool (BRASIL, 2013).
7.8 Aspectos Éticos
Os participantes da pesquisa ou os responsáveis foram informados verbalmente do
projeto e após a concordância, assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido
(Apêndice A). Em seguida, foi preenchido um questionário clínico-epidemiológico
padronizado, onde constou: identificação e procedência do paciente, principais queixas
clínicas e tempo de duração, história de tratamento prévio de tuberculose, histórico de doença
pré-existente, exames físicos e laboratoriais e posteriormente o diagnóstico clínico (Apêndice
55
B). As entrevistas foram realizadas pela pesquisadora principal do projeto com auxílio do
médico assistente do serviço de saúde.
O presente projeto foi submetido à apreciação do Comitê de Ética em Pesquisas do
CPqAM/Fiocruz, onde recebeu o parecer favorável ao seu desenvolvimento (Registro CAAE:
0056.0.095.000-11) (Anexo A). Seguiu o descrito pela Resolução 196/96, que apresenta as
diretrizes e normas regulamentadores de pesquisas envolvendo seres humanos.
7.9 Técnicas laboratoriais
7.9.1 Teste Tuberculínico
Para classificação dos grupos de estudo, os pacientes participantes realizaram o teste
tuberculínico, de acordo com as recomendações do Ministério da Saúde (BRASIL, 2011).
Para triagem, 0,1 mL (duas unidades de tuberculina) de derivado protéico purificado (PPD-Rt
23) foi injetado intradermicamente no antebraço esquerdo e após 72h avaliado endurecimento
através do método de Mantoux (BRASIL, 2001). A leitura do teste foi realizada por
profissionais treinados e experientes dos serviços públicos de saúde. Os pacientes foram
classificados como reatores, ou seja, teste tuberculínico positivo, quando apresentavam a
região de endurecimento com a medida >10mm (BRASIL, 2011).
7.9.2 Teste rápido para a detecção do HIV 1 e 2
Foi utilizado kit comercial (BioPix – HIV 1 & 2) para determinação qualitativa de
anticorpos anti-HIV1 e anti-HIV2 por método imunocromatográfico, de acordo com protocolo
indicado pelo fabricante em todos os indivíduos participantes da pesquisa (protocolo de rotina
para os pacientes com suspeita de tuberculose, realizado por profissional capacitado do
serviço de saúde).
7.9.3 Método de coleta de sangue periférico e obtenção de células mononucleares do sangue
periférico (PBMC)
Foram coletados 4,5mL de sangue periférico do paciente em um tubo (Vacutainer®,
Becton and Dickson, England) contendo EDTA, mantido à temperatura ambiente (25 a 30°C)
por até 4h até o seu processamento. Após a coleta, o sangue foi diluído em 4mL de solução
56
PBS pH 7,2 em um tubo Falcon de 15mL, previamente identificado com os dados do
paciente. Foi colocado em outro tubo Falcon, 3mL de Ficoll Histopaque gelado. Após essa
etapa, o sangue homogeneizado com solução PBS foi adicionado ao tubo com Ficoll-
Histopaque, lentamente pela parede do tubo, tendo o cuidado para não misturar. O tubo foi
centrifugado por 30 minutos a 2000 rpm. Após a centrifugação, foram retiradas as células
PBMC e armazenadas em tubo rosqueado, devidamente identificado e mantido a -70ºC.
As células PBMC foram utilizadas para extração do DNA genômico e amplificação
por PCR em tempo real para determinação dos polimorfismos genéticos.
7.9.4 Método de coleta e descontaminação do escarro
De cada paciente foi coletado de 5 a 10 mL de escarro por eliminação espontânea, em
tubo seco rosqueado e estéril, com o paciente em jejum, ao acordar. As amostras coletadas
foram estocadas entre 4 a 8º C por até 4 horas e transportadas para o CPqAM para serem
processadas. A descontaminação foi realizada seguindo o protocolo do Método de Petroff
(NaOH 4%) (BARRETO, 1994; BRASIL, 2008).
7.9.5 Baciloscopia do escarro
O protocolo de coloração pelo método de Ziehl-Neelsen para a identificação e
quantificação dos bacilos álcool-ácido resistentes (BAAR) foi realizado pelos técnicos do
Laboratório Municipal do Recife, de acordo com as normas técnicas do Manual Nacional de
Vigilância da Tuberculose e outras Micobactérias (BRASIL, 2008).
7.9.6 Cultura por Löwestein-Jensen e Identificação de micobactérias em amostra de escarro
Após descontaminação, 0,2mL do sedimento de escarro foi semeado em três tubos, um
contendo apenas o meio Löwenstein-Jensen (simples), um tubo com o meio Löwenstein-
Jensen e o ácido para-nitrobenzóico (PNB) e mais outro tubo com o meio Löwenstein-Jensen
e a Hidrazida do ácido 2 carboxílico (TCH). Os tubos foram colocados em estufa a 37ºC onde
foram lidos uma vez por semana até a 8ª semana, ou antes, assim que foi observado o
crescimento de colônias. Todos os meios preparados passaram por testes de esterilidade
(estufa a 37ºC sem inoculação de amostra) e controle de qualidade do meio (inoculação de
cepa de referência H37Rv de M. tuberculosis), seguindo o Manual Nacional de Vigilância da
57
Tuberculose e outras Micobactérias (BRASIL, 2008). Todos os testes de cultura e
identificação foram realizados pelo Laboratório de Imunoepidemiologia do
CPqAM/FIOCRUZ.
7.9.7 Extração e purificação de DNA genômico de PBMC
A extração de DNA foi efetuada com o kit QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen), de
acordo com as recomendações do fabricante. Inicialmente, foram adicionados 20µL de
proteinase K a uma alíquota de 200µL de PBMC e em seguida 200 µL do Buffer AL à
amostra e homogeneizada no vórtex por 15 segundos, sendo então incubada em banho-maria
a 56ºC por 10 minutos. Posteriormente, foi submetida à centrifugação a 13.000 rpm por 1
minuto. Após a centrifugação, adicionou-se 200µl de etanol a 100% à amostra e mixada no
vórtex por 15 segundos, sendo novamente centrifugada a 13.000 rpm por 1 minuto. A amostra
foi transferida para a coluna específica do kit, e centrifugada a 8.000 rpm por 1 minuto. A
coluna foi colocada em um novo tubo coletor e o tubo descartado contendo o filtrado.
Adicionou-se à coluna 500 µL do Buffer AW1. Realizou-se a centrifugação a 8.000 rpm por 1
minuto. Posteriormente, a coluna foi colocada em um novo tubo coletor e foi descartado o
tubo contendo o filtrado da centrifugação. Adicionou-se o Buffer AW2 e a amostra foi
centrifugada a 14.000 rpm por 3 minutos. Em seguida, a coluna foi colocada em um novo
tubo coletor e descartado o tubo anterior contendo o filtrado. Novamente centrifugou-se a
amostra a 14.000 rpm por 1 minuto. A coluna foi colocada em um tubo cônico de
polipropileno (1,5mL) previamente identificado. Adicionou-se 200 µL do Buffer AE na
coluna contendo a amostra. Após esta etapa, a amostra foi deixada em repouso por 5 minutos
à temperatura ambiente para melhor concentração do DNA. Por último, foi centrifugada a
8.000 rpm por 1 minuto, sendo descartada a coluna e acondicionado o tubo contendo o DNA
genômico.
7.9.8 Determinação do Polimorfismo Genético
Foi utilizada a técnica de discriminação alélica pelo sistema TaqMan com sondas
MGB através de PCR em tempo real. Foram utilizados os ensaios comerciais da Applied
Biosystems, que emprega um conjunto de primers e sondas específicas para o SNP da posição
-1082(A/G) da IL-10 (rs1800896) (C_1747360_10) e para a posição -308(G/A) do TNF-α
(rs1800629) (C_7514879_10), utilizando condições universais de reação de amplificação. A
58
amplificação foi realizada no equipamento de PCR em tempo real ABI PRISM 7500 (Applied
Biosystems) a 95ºC por 10 minutos, seguida de 40 repetições de 92ºC por 15 segundos e 60ºC
por um minuto. A reação de PCR foi realizada com um volume total de 12,5 µL contendo
6,25 µL de master mix universal para o sistema TaqMan (contendo tampão, referência passiva
dye ROX, deoxinucleotídeos, uridina, uracil-N-glicosilase e DNA polimerase ampliTaq Gold
– Applied Biosystems), 0,625 µL do conjunto primer/sonda (TaqMan SNP Genotyping Assay
Mix) a 1X e 5,625 µL da amostra de DNA diluída em água.
A técnica de discriminação alélica consistiu na utilização de um conjunto combinado
de duas sondas TaqMan® alelo-específicas, marcadas com diferentes fluoróforos, uma
complementar para cada um dos alelos (selvagem e mutante) e um par de primers. A sonda se
ligou ao seu alelo específico e a fluorescência foi lida para o alelo presente na amostra. Caso
os dois alelos estejam presentes, foram lidos os dois tipos de fluorescência (Figura 9).
Figura 9 - Curva de amplificação de DNA para o SNP -1082A/G do gene da IL-10.
Fonte: Elaborada pela autora
Legenda: A figura 1A representa a amplificação de um indivíduo heterozigoto, 1B homozigoto AA e 1C,
homozigoto GG
7.10 Análise comparativa das freqüências dos SNPs -308G/A e -1082A/G
Foi realizada uma análise comparativa das frequências alélicas e genotípicas dos SNPs
-308G/A do gene do TNF-α e -1082A/G do gene da IL-10 da população mundial (europeus,
africanos, caucasianos, entre outros), a partir do banco genético “National Center for
Biotechnology Information” (NCBI), com as freqüências de estudos científicos da população
brasileira (MORAES et al., 2003; OLIVEIRA et al., 2004) e resultados do presente estudo.
1A 1B 1C
59
7.11 Análise Estatística
A análise estatística dos dados clínicos, epidemiológicos e laboratoriais foi realizada
utilizando-se os programas (Epi-Info 6.04 e SPSS). As tabelas foram construídas utilizando-se
o programa Microsoft Word. A análise da freqüência genética e de associação na comparação
entre os grupos de estudo foi realizada através do programa UNPHASED v.3.121
(DUDBRIDGE, 2008) e a análise de associação entre esses grupos e os fatores de risco foi
realizada através do SNPStats (SOLE et al., 2006). Este programa implementa um teste de
probabilidade retrospectivo (a probabilidade de observar genótipos dados fenótipos),
utilizando um modelo de regressão logística multinomial. As associações foram estimadas em
risco relativo (RR) e odds ratio (OR), usando 95% de intervalo de confiança (CIs). O teste X2
foi utilizado para comparar as freqüências entre os grupos estudados. A diferença entre os
resultados obtidos foi considerada significativa quando p<0,05. Foi testado se a população
estudada estava em equilíbrio de Hardy-Weinberg.
60
8 RESULTADOS
8.1 Características clínicas, demográficas e laboratoriais dos pacientes participantes do
estudo
Os dados clínicos, demográficos e laboratoriais dos pacientes sintomáticos
respiratórios participantes do estudo estão demonstrados na Tabela 1.
No estudo foi incluído um total de 282 indivíduos, sendo 181 pacientes sintomáticos
respiratórios, classificados nos seguintes grupos de estudo de acordo com o diagnóstico
médico final: 71 pacientes com tuberculose pulmonar ativa, 53 pacientes com tuberculose
latente e 57 portadores de patologias pulmonares inespecíficas, além de 101 indivíduos
clinicamente saudáveis.
Nos grupos de pacientes sintomáticos respiratórios participantes dos grupos controles
1 e 2, o diagnóstico final estabelecido foi asma brônquica (12%), bronquiectasia (3%),
bronquite (3%), doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) (7%), pneumonia(3%), virose
(4%) e outros (3%). Apesar de terem a hipótese diagnóstica de TB pulmonar descartada pelo
médico do serviço de saúde, 65% dos pacientes permaneceu ainda sem definição diagnóstica,
ou seja, como sintomáticos respiratórios sem etiologia definida.
Na análise da variável idade, a média dos pacientes com TB pulmonar foi 43 ±15.2
anos e nos controles 1 e 2 foi 48 ± 20.2 e 51 ±16.8 anos, respectivamente. Entre os pacientes
com TB pulmonar ativa e tuberculose latente (controle 1), 64,8% e 51% eram do sexo
masculino, respectivamente e 78,8% e 62,2% tinham faixa etária entre 20-59 anos,
respectivamente. Quanto ao perfil dos pacientes classificados no grupo controle 2, 59,7%
eram do sexo feminino e 61,4% pertencia à faixa etária entre 20-59 anos (Tabela 1). No grupo
controle 3, a média de idade foi 37 ±16.3 anos, onde prevaleceu o sexo feminino (82%) e a
maioria dos indivíduos mostraram-se reatores ao teste tuberculínico (63%). Os valores de p e
x2 foram calculados para as variáveis: gênero (p=0,021 e x
2=7,713), idade (p=0,11 e x
2=7,4),
obtendo significância estatística na variável gênero.
No presente estudo, ao analisar as variáveis relacionadas ao hábito de fumar, uso
excessivo de álcool e presença de comorbidades, verificou-se que dos 181 pacientes
sintomáticos respiratórios: 66,2% não possuíam o hábito de fumar, porém o grupo com
tuberculose latente (controle 1) apresentou o maior número de fumantes (30%), seguido do
grupo controle 2 (21%) e do grupo com tuberculose pulmonar (17%). Em relação ao uso
excessivo de álcool, a maioria dos pacientes (76,2%) declarou não ser alcoolista, porém em
61
14% dos casos de tuberculose pulmonar e 19% dos pacientes com TB infecção latente
declararam possuir o hábito. Podemos observar que 19 pacientes do total de 71 do grupo caso,
não responderam as variáveis, hábito de fumar e uso excessivo de álcool (Tabela 1).
Quanto à análise da variável portadores de comorbidades, 11,1% e 8,3% dos pacientes
sintomáticos respiratórios eram portadores de Hipertensão Arterial Sistêmica (HAS) e
Diabetes Mellitus (DM), respectivamente (Tabela 1). Os valores de p e x2 foram calculados
no grupo de sintomático respiratório, para as variáveis: tabagismo (p=0,43; x2=1,7),
alcoolismo (p=0,026; x2=7,3) e comorbidades (p=0,97; x
2=0,055 para DM e p=0,77; x
2=0,52
para HAS), obtendo significância estatística apenas na variável relacionada com o uso
excessivo de álcool.
Analisando os dados referentes aos tipos de exames laboratoriais realizados pelos
pacientes, verificou-se que, apenas, 34,8% dos pacientes realizaram a sorologia para a
detecção do vírus HIV pelo serviço de saúde. Também se pode observar uma baixa frequência
de solicitação do teste rápido entre os pacientes portadores de TB pulmonar (33,8%). Os
métodos de diagnóstico utilizados foram, o exame de Raio-X, realizado em 73% dos pacientes
sintomáticos respiratórios, onde 37% apresentaram algum tipo de alteração na imagem
radiográfica, sendo 64,8% específica para tuberculose e 31,3% inespecífica, não sendo
compatível com tuberculose (controles 1 e 2). A baciloscopia foi realizada em 84,5% (32% de
positividade) e a cultura para o Mycobacterium tuberculosis em 87% dos pacientes
sintomáticos respiratórios, com 26% de positividade, utilizados como critério de definição de
caso de tuberculose pulmonar ativa (Tabela 2).
62
Tabela 1 - Características clínicas e demográficas dos pacientes sintomáticos respiratórios provenientes de
unidades de saúde da cidade do Recife-PE.
TB pulmonar n (%)
Controle 1 n (%)
Controle 2 n (%)
Total n (%)
Sexo Masculino 46 (64,8) 27 (51) 23 (40,3) 96 (53) Feminino 25 (35,2) 26 (49) 34 (59,7) 85 (47)
Total 71 (100) 53 (100) 57 (100) 181 (100)
Idade (em anos) ≤ 19 anos 20-59 anos ≥ 60 anos
05 (7) 56 (78,8) 10 (14,2)
03 (5,6) 33 (62,2) 17 (32,2)
04 (7) 35 (61,4) 18 (31,6)
12 (6,6) 124 (68,4)
45 (25)
Total 71 (100) 53 (100) 57 (100) 181 (100)
Hábito de fumar Sim 12 (17) 16 (30) 12 (21) 40 (12,2) Não 40 (56,3) 35 (66) 45 (79) 120 (66,2) Ignorado 19 (26,7) 02 (4) 0 (0) 21 (21,6) Total 71 (100) 53 (100) 57 (100) 181 (100) Uso excessivo de álcool Sim 10 (14) 10 (19) 2 (3,5) 22 (12,2) Não 42 (59,2) 41 (77,3) 55 (96,5) 138 (76,2) Ignorado 19 (26,8) 02 (3,7) 0 (0) 21 (11,6) Total 71 (100) 53 (100) 57 (100) 181 (100)
Portador de HAS* Sim 5 (7,5) 7 (13,2) 8 (14) 20 (11,1) Não 45 (63) 43 (81,1) 48 (84,2) 136 (75,1) Ignorado 21 (29,5) 3 (5,7) 1 (1,8) 25 (13,8) Total 71 (100) 53 (100) 57 (100) 181 (100)
Portador de DM** Sim 05 (7,2) 05 (9,4) 05 (9) 15 (8,3) Não 45 (63,3) 46 (87) 52 (91) 143 (79) Ignorado 21 (29,5) 2 (3,6) 0 (0) 23 (12,7) Total 71 (100) 53 (100) 57 (100) 181 (100)
Fonte: Elaborada pela autora
Legenda: HAS*: Hipertensão Arterial Sistêmica; DM**: Diabetes Mellitus
63
Tabela 2 - Características laboratoriais dos pacientes sintomáticos respiratórios participantes do estudo.
Exames laboratoriais
TB pulmonar n (%)
Controle 1 n (%)
Controle 2 n (%)
Total n (%)
Realização da sorologia para o
vírus HIV pelo serviço de saúde
Sim 24 (33,8) 18 (34) 21 (37) 63 (34,8)
Não 28 (39,5) 35 (66) 36 (63) 99 (54,7)
Ignorado 19 (26,7) 0 (0) 0 (0) 19 (10,5)
Total 71 (100) 53 (100) 57 (100) 181 (100)
Teste Tuberculínico
Não reator 8 (11) 0 (0) 57 (100) 65 (36)
Reator 49 (69) 53 (100) 0 (0) 102 (56,3)
Ignorado 14 (20) 0 (0) 0 (0) 14 (7,7)
Total 71 (100) 53 (100) 57 (100) 181 (100)
Raio-X
Normal 2 (2,8) 32 (60,4) 31 (54,4) 65 (36)
Alterado 46 (64,8) 11 (20,8) 10 (17,5) 67 (37)
Ignorado 23 (32,4) 10 (18,8) 16 (28,1) 39 (27)
Total 71 (100) 53 (100) 57 (100) 181 (100)
Baciloscopia
Positiva 58 (82) 0 (0) 0 (0) 58 (32)
Negativa 10 (14) 40 (75,5) 45 (79) 95 (52,5)
Ignorado 3 (4) 13 (24,5) 12 (21) 28 (15,5)
Total 71 (100) 53 (100) 57 (100) 181 (100)
Cultura para o M. tuberculosis Positiva 47 (66,2) 0 (0) 0 (0) 47 (26)
Negativa 0 (0) 53 (100) 57 (100) 110 (61)
Ignorado 24 (33,8) 0 (0) 0 (0) 24 (13)
Total 71 (100) 53 (100) 57 (100) 181 (100)
Fonte: Elaborada pela autora
64
8.2 Distribuição da freqüência alélica e genotípica do SNP na posição -1082A/G do gene
da IL-10 na população estudada e sua associação com o desenvolvimento da
tuberculose pulmonar ativa
O presente estudo realizou a determinação da frequência alélica e genotípica do SNP
na posição -1082A/G do gene da IL-10 em 277 indivíduos distribuídos nos quatro grupos de
estudos (Tabela 3).
Foram encontrados três genótipos na posição -1082: G/G, G/A e A/A. O alelo A e o
genótipo AA foram considerados de referência na análise de associação relativa da doença no
modelo codominante, expressa pelo cálculo do odds ratio (OR) e seu IC (95%). As
freqüências do polimorfismo -1082A/G do gene da IL-10 nos grupos estudados encontram-se
em equilíbrio Hardy-Weinberg (p<0.05).
Nos 277 indivíduos participantes do estudo, a freqüência do alelo selvagem -1082A
(58,5%) foi significativamente maior (p<0,0001) quando comparado ao -1082G (41,5%) e as
freqüências genotípicas encontradas foram 40% e 23% para os homozigotos -1082AA e -
1082GG, respectivamente e 37% para o heterozigoto -1082GA, com significância estatística
(p<0.0001). Podemos observar uma maior freqüência tanto do alelo selvagem -1082A quanto
do genótipo -1082AA na população geral estudada.
Ao avaliar os resultados através da estratificação dos pacientes nos grupos de estudo,
observou-se que no grupo com tuberculose pulmonar comparado com os controles 1 e 2, a
freqüência do alelo mutante -1082G não apresentou diferença estatística significante (p=0,70;
p=1, respectivamente). Por sua vez, nos pacientes do grupo controle 3, a frequência do alelo
mutante -1082G (22%) foi significativamente menor (p<0.0001), quando comparado com o
grupo caso (54%) (Tabela 3).
A análise da frequência genotípica -1082GA e -1082GG entre os grupos de estudo,
não encontrou diferença estatística significante entre o grupo de pacientes com tuberculose
pulmonar e os pacientes dos grupos controle 1 (p=0,65; p=0.81) e 2 (p=0,64; p=1),
respectivamente. O genótipo -1082GG (32%) apresentou uma freqüência significativamente
maior (p<0.0001) no grupo caso quando comparado ao grupo controle 3 (5%). Na análise do
genótipo heterozigoto -1082GA, foi observada uma freqüência significativamente maior
(p<0.0001) no grupo caso (42%) quando se comparou com o grupo controle 3 (35%) (Tabela
3). Entre os grupos de estudo, o genótipo selvagem -1082AA (60%) apresentou maior
freqüência apenas no grupo controle 3.
65
O estudo avaliou o SNP -1082A/G do gene da IL-10 com o risco de desenvolvimento
da tuberculose pulmonar nos diferentes grupos de estudo no modelo codominante. O grupo
caso formado por pacientes com tuberculose pulmonar foi avaliado comparando-se com os
grupos controles 1 (p=0,65; p=0.81) e 2 (p=0,64; p=1), não encontrando resultado de
associação através da análise alélica e genotípica. Quando o grupo caso foi comparado com o
grupo controle 3, observou-se uma diferença estatística significante, tanto da presença do
alelo mutante -1082G [p=<0.0001; 3.90 [2.45- 6.59], quanto dos genótipos -1082AG
[p=<0.0001; 2.90 [1.42- 5.95] e -1082GG [p<0.0001; 15.50 [5.18- 1.62], com uma associação
de risco ao desenvolvimento da forma pulmonar da doença, demonstrando que os indivíduos
portadores do alelo G mostraram ter um grande efeito de risco para a tuberculose, pois
estavam em maior freqüência nos indivíduos do grupo com tuberculose pulmonar. Um
resultado de associação com significância estatística da presença do alelo mutante -1082G
[p=0.001; 1.92 [1.28 – 2.90] e dos genótipos -1082AG [p=0.03; 2.06 [1.02 - 4.29] e -1082GG
[p=0.004; 2.92 [1.34 – 6.44] também foi encontrado entre o grupo caso e todos os indivíduos
dos grupos controles (1, 2 e 3) analisados conjuntamente (Tabela 3).
Foi também realizada uma análise de associação relativa do SNP -1082A/G com a
tuberculose nos seguintes modelos genéticos: dominante, -1082G/A-GG [p<0.0001; OR=
4.49 (2.30-8.75)] e no recessivo -1082GG [p<0.0001; OR= 9.20 (3.29-25.70)], encontrando
também efeito de risco para a tuberculose pulmonar. O modelo sobredominante não
apresentou significância estatística (p=0.31).
A análise de regressão logística multivariada não demonstrou diferença estatística
significante das freqüências alélicas e genotípicas para o SNP -1082G/A, utilizando as co-
variáveis: sexo, idade, hábito de fumar e beber e portadores de diabetes mellitus e hipertensão
arterial sistêmica (p=0.3; p=0.47; p=0.67; p=0.56; p=0.42; p=0.38, respectivamente)
66
8.3 Distribuição da freqüência alélica e genotípica do SNP na posição -308G/A do gene
do TNF-α na população estudada e sua associação com o desenvolvimento da
tuberculose pulmonar ativa
Foram encontrados três genótipos na posição -308: G/G, G/A e A/A. O alelo G e o
genótipo GG foram considerados de referência na análise de associação relativa da doença no
modelo codominante, expressa pelo cálculo do odds ratio (OR) e seu IC (95%). As
freqüências do polimorfismo -308G/A do gene do TNF-α nos grupos estudados encontram-se
em equilíbrio Hardy-Weinberg (p<0.05).
A freqüência do alelo selvagem -308G (72%) foi significativamente maior (p<0,0001)
em todos os 282 indivíduos participantes do estudo quando comparado com o alelo -308A
(28%). Quanto à distribuição da freqüência genotípica, o homozigoto -308GG (53,5%) foi
significativamente (p<0,0001) mais freqüente na população geral estudada, quando
comparado com o -308AA (9,5%) e o heterozigoto -308GA (37%).
A frequência alélica e genotípica do SNP -308G/A foi avaliada entre os grupos de
estudo. Não houve diferença estatística significante da freqüência do alelo mutante -308A
entre o grupo caso e os controles 1 (p=0.75), 2 (p=0.53) e 3 (p=0.18). Quanto à análise da
freqüência do genótipo homozigoto mutante -308AA (alto produtor de TNF-α) também não
foi observada diferença estatística significante entre o grupo caso e os controles 1, 2 e 3 (p=1;
p=78; p=0.77, respectivamente). Por sua vez, o genótipo heterozigoto -308GA (50%) foi
significativamente maior (p=0.005) no grupo de indivíduos saudáveis (controle 3) quando
comparado com os pacientes com tuberculose pulmonar (27%). Nos demais controles 1
(p=0.68) e 2 (p=0.54) não foi observada diferença significante para o genótipo heterozigoto -
308GA. Foi observada baixa freqüência do genótipo -308AA em todos os grupos estudados
comparado com os genótipos -308AG e -308GG (Tabela 3).
O estudo avaliou o SNP -308G/A do gene do TNF-α com o risco de desenvolvimento
da tuberculose pulmonar entre os diferentes grupos de estudo. O grupo caso formado por
pacientes com tuberculose pulmonar foi avaliado comparando-se com os grupos controles: 1
(p=0.751; p=0.684; p=1) e 2 (p=0.535; p=0.549; p=0.781), não encontrando diferença
estatística significante entre os alelos e genótipos. Como pode ser observado, o grupo caso
quando comparado com o grupo controle 3 apresentou associação estatística significante
[p=0.005; OR=0.374 (0.17–0.76)] para o genótipo heterozigoto -308GA, demonstrando uma
associação de proteção ao desenvolvimento da tuberculose pulmonar, pois apresentou maior
frequência no grupo clinicamente saudável (Tabela 3). No modelo genético dominante -
67
308G/A-AA foram encontrados os seguintes resultados: [p=0.017; OR= 0.47 (0.25-0.88)], no
sobredominante -308GA [p=0.0016; OR= 0.36 (0.19-0.69)]. O modelo recessivo não
apresentou significância estatística (p=0.21) (Tabela 3).
A análise de regressão logística multivariada não demonstrou diferença estatística
significante das freqüências alélicas e genotípicas para o SNP -308G/A, utilizando as co-
variáveis: sexo, hábito de fumar e beber e portadores de diabetes mellitus e hipertensão
arterial sistêmica (p=0.7; p=0.06; p=0.04; p=0.16; p=0.15, respectivamente). Na análise entre
os grupos caso e controle 2, utilizando a co-variável idade, foi detectado sinal de associação,
com significância estatística, com o genótipo -308GG, no grupo menores de 50 anos e a
doença em estudo comparado aos maiores de 50 anos [p = 0,034; OR= 3.64 (1.36-9.73)].
66
Tabela 3 - Análise das frequências alélicas e genotípicas de SNPs dos genes da IL-10 (-1082) e TNF-α (-308) dos pacientes e indivíduos participantes do estudo e associação com
a tuberculose pulmonar ativa.
TB pulmonar Controles p-value; OR* [95% C.I.**]
Polimorfismo
Total (n=71) Controle 1
(n=53)
Controle 2
(n=52)
Controle 3
(n=101) TB vs. Controle 1 TB vs. Controle 2 TB vs. Controle 3 TB vs. Controles
IL10 (-1082)
Alelos
A 66 (0.46) 52 (0.49) 49 (0.47) 157 (0.78) Ref Ref Ref Ref
G 76 (0.54) 54 (0.51) 55 (0.53) 45 (0.22) 0.707; 1.10
[0.64 – 1.89]
1; 1.02
[0.59 – 1.75]
<0.0001; 3.90
[2.45- 6.59]
0.001; 1.92
[1.28 – 2.90]
Genótipos
AA 18 (0.25) 16 (0.30) 15 (0.28) 61 (0.60) Ref Ref Ref Ref
AG 30 (0.42) 20 (0.38) 19 (0.37) 35 (0.35) 0.653; 1.32
[0.50 - 3.51]
0.648; 1.31
[0.48 - 3.52] <0.0001; 2.90
[1.42- 5.95]
0.03; 2.06
[1.02 - 4.29]
GG 23 (0.32) 17 (0.32) 18 (0.35) 5 (0.05) 0.81; 1.19
[0.43 - 3.33]
1; 1.06
[0.38 – 2.95] <0.0001; 15.50
[5.18- 1.62]
0.004; 2.92
[1.34 – 6.44]
TNF (-308)
Alelos Total (n=71) Controle 1
(n=53)
Controle 2
(n=57)
Controle 3
(n=101) TB vs. Controle 1 TB vs. Controle 2 TB vs. Controle 3 TB vs. Controles
G 107 (0.75) 78 (0.74) 82 (0.72) 139 (0.75) Ref Ref Ref Ref
A 35 (0.25) 28 (0.26) 32 (0.28) 63 (0.25) 0.751; 0.911
[0.51- 1.62]
0.535; 0.838
[047 - 1.46]
0.186; 0.721
[0.44-1.71]
0.331; 0.795
[0.49 – 1.24]
Genótipos
GG 44 (0.62) 31 (0.58) 32 (0.56) 44 (0.44) Ref Ref Ref Ref
AG 19 (0.27) 16 (0.3) 18 (0.32) 51 (0.5) 0.684; 0.838
[0.34-2.04]
0.549; 0.769
[0.32-1.82]
0.005; 0.374
[0.17-0.76]
0.06; 0.544
[0.27-1.03]
AA 8 (0.11) 6 (0.11) 7 (0.12) 6 (0.06) 1; 0.940
[0.25-3.64]
0.781; 0.832
[0.23-3.00]
0.775; 1.32
[0.34-5.06]
1; 0.102
[0.35 – 2.67]
Fonte: Elaborada pela autora
Legenda: OR*: Odds Ratio; C.I.**: Intervalo de confiança
67
8.4 Análise comparativa das frequências alélicas e genotípicas dos SNPs estudados na
população mundial
A análise da distribuição das frequências alélicas e genotípicas dos SNPs dos genes da
IL-10 (-1082A/G) e TNF-α (-308G/A) da população mundial (Referência: Homo sapiens) foi
comparada com estudos científicos publicados na população brasileira e na população do
estudo, demonstrada nas tabelas 4 e 5.
Tabela 4 - Análise da freqüência do SNP -1082A/G referência do gene da IL-10 na população mundial.
Amostragem Genótipo Alelo
População Grupo Individual A/A A/G GG A G
CEU Europeu ------ ------ 1.000 ------ 1.000
HapMap-CEU Europeu 0.212 0.513 0.274 0.469 0.531
HapMap-YRI Sub-Sahara Africano 0.531 0.389 0.080 0.726 0.274
D-0 Africano Americano 0.333 0.524 0.143 0.595 0.405
CABG_Northamerican Norte americano 0.294 0.502 0.204 0.545 0.455
CAUC1 Caucasiano 0.387 0.419 0.194 0.597 0.403
HAPMAP-MEX Mexicano 0.440 0.480 0.080 0.680 0.320
Brasil Rio de Janeiro 0.433 0.509 0.058 0.680 0.320
Pernambucana População geral do
estudo
0.40 0.37 0.23 0.585 0.415
Pernambucana TB pulmonar do estudo 0.253 0.423 0.324 0.46 0.54
Pernambucana Indivíduos clinicamente
saudáveis do estudo
0.60 0.35 0.05 0.78 0.22
Fonte: National Center for Biotechnology Information, 2013b
Legenda: SNP referência: Homo sapiens; Cluster Report: rs1800896; Tipo molecular: genômico
67
Tabela 5 - Análise da freqüência do SNP referência -308G/A do gene do TNF-α na população mundial.
Amostragem Genótipo Alelo
População Grupo Individual A/A A/G GG A G
HapMap-CEU Europeu 0.018 0.31 0.673 0.173 0.827
CEU Europeu ------ 0.433 0.567 0.217 0.783
HapMap-YRI Sub-Sahara Africano 0.009 0.159 0.832 0.088 0.912
YRI Sub- Sahara Africano ------ 0.123 0.877 0.061 0.939
PGA-African-Panel Africano Americano 0.045 0.318 0.636 0.205 0.795
AAM-Geno-Panel Africano Americano 0.018 0.211 0.772 0.123 0.877
PDR90 Global 0.023 0.126 0.851 0.086 0.914
PDR90 Global 0.025 0.100 0.875 0.075 0.925
CAUC1 Caucasiano ------ 0.333 0.667 0.167 0.833
Brasil Rio de Janeiro 0.053 0.440 0.903 0.084 0.916
Pernambucana População geral do
estudo
0.095 0.37 0.535 0.28 0.72
Pernambucana TB pulmonar do estudo 0.11 0.27 0.62 0.25 0.75
Pernambuco Indivíduos clinicamente
saudáveis do estudo
0.06 0.50 0.44 0.25 0.75
Fonte: National Center for Biotechnology Information, 2013a
Legenda: SNP referência: Homo sapiens; Cluster Report: rs1800629; Tipo molecular: genômico
68
9 DISCUSSÃO
A tuberculose, embora seja uma doença curável, ainda permanece como a principal
causa de morbimortalidade em todo o mundo (O’GARRA et al., 2013; ZEMBRZUSKI et al.,
2010). O controle dessa epidemia global tem sido prejudicado, principalmente, pela falta de
uma vacina eficaz e de métodos diagnósticos sensíveis e rápidos, como também pelo
surgimento de formas resistentes de M. tuberculosis as drogas específicas. Além disso, a
resposta imune contra o M. tuberculosis é complexa e não completamente bem caracterizada,
o que dificulta as tentativas de desenvolver novos testes, vacinas e tratamentos (O’GARRA et
al., 2013) .
O desenvolvimento da tuberculose ativa resulta de interações entre o ambiente, o
hospedeiro, o patógeno e os fatores de risco conhecidos tais como a co-infecção pelo vírus
HIV, a imunodeficiência em geral, diabetes mellitus, a superlotação em ambientes pequenos e
mal arejados, a desnutrição bem como a pobreza. Embora seja evidente que células T CD4+ e
citocinas sejam fundamentais no controle da infecção pelo M. tuberculosis, ainda não estão
claros quais os fatores do hospedeiro que determinam por que alguns indivíduos são
protegidos da infecção pelo M. tuberculosis, enquanto outros passam a desenvolver a doença
(YOUNG et al., 2002).
Diferentes taxas de incidência da tuberculose pulmonar ocorrem entre as raças, etnias,
países e famílias, indicando uma predisposição genética na susceptibilidade a doença. Os
fatores genéticos do hospedeiro podem, em parte, explicar porque algumas pessoas são mais
ou menos susceptíveis à infecção. Diversas linhas de evidência, incluindo os estudos com
gêmeos e estudos de associação do genoma completo, têm demonstrado que a genética do
hospedeiro influencia fortemente a susceptibilidade à TB. No entanto, o real entendimento das
variações genéticas específicas (polimorfismos) do genoma humano na susceptibilidade ou
resistência a tuberculose continua a ser um desafio (AZAD et al., 2012; MOLLER; HOAL,
2010).
A infecção pelo M. tuberculosis por períodos prolongados sugere a existência de uma
pressão de seleção evolutiva nas interações entre os genomas do patógeno e do hospedeiro
(AZAD et al., 2012; GAGNEUX et al., 2012). Estudos epidemiológicos incluindo, estudos
genéticos do tipo caso-controle têm sido realizados com várias famílias de genes humanos
para avaliar os seus envolvimentos na patogenia da tuberculose (TRAJKOV et al., 2009;
VAN DE VEERDONK et al., 2010; ZHANG et al., 2011). Sendo assim, o presente estudo
propôs investigar uma provável associação dos polimorfismos de um único nucleotídeo (SNP)
funcionais localizados em regiões promotoras dos genes das citocinas TNF-α e IL-10 com a
69
susceptibilidade ou resistência a tuberculose pulmonar ativa em pacientes procedentes do
estado de Pernambuco.
Como o principal objetivo da pesquisa foi avaliar o risco de desenvolvimento da
tuberculose pulmonar em uma população procedente do nordeste do Brasil, a partir da análise
de SNPs funcionais, foi realizado um estudo genético-epidemiológico do tipo caso-controle
em uma região endêmica de tuberculose. Sendo assim, os controles selecionados foram
compostos por pacientes sintomáticos respiratórios com suspeita clínica inicial de tuberculose,
tendo sido posteriormente descartada, e diagnosticados como portadores de outra patologia
pulmonar, além do grupo composto por indivíduos clinicamente saudáveis. Portanto, tanto os
pacientes com tuberculose pulmonar como dois dos grupos controles apresentaram o mesmo
critério clínico de inclusão na pesquisa, fazendo com que a população estudada de doentes
apresentasse uma uniformidade maior na seleção.
A OMS sugere que a abordagem dos casos sintomáticos respiratórios (SR) seja
sistematizada e inclua a investigação de outras doenças, como infecção respiratória aguda,
asma e DPOC, além da tuberculose. Essa estratégia, conhecida como estratégia PAL, visa
fortalecer o sistema de saúde através da conexão entre as atividades de controle da
tuberculose e os serviços de saúde. Como o sintoma mais comum na tuberculose pulmonar é a
tosse, para fins de busca de casos, foram considerados casos sintomáticos respiratórios os
indivíduos com tosse por mais de 3 semanas (ZHANG, 2009).
Os controles referentes aos sintomáticos respiratórios foram ainda avaliados quanto à
exposição ao bacilo através dos achados clínico, epidemiológico e laboratorial, sendo
classificados entre infectados (controle 1) e não infectados (controle 2) pelo Mycobacterium
tuberculosis, além do grupo de indivíduos saudáveis. Além dos critérios acima descritos para
seleção dos controles, todos os indivíduos participantes foram provenientes do estado de
Pernambuco, uma região considerada com altos índices da doença. O estudo pode ser
considerado pioneiro na análise de polimorfismos genéticos na tuberculose pulmonar com a
população do nordeste do país, como também na seleção de três diferentes grupos controles.
A população de estudo foi selecionada, levando em consideração as observações feitas
por Pacheco e Moraes (2009) que avaliam e discutem os principais problemas na realização
de estudos clássicos do tipo caso-controle, sobretudo com relação à hanseníase e tuberculose.
Os autores apontam que a correta seleção de controles é uma questão raramente discutida na
literatura, em que é muito comum os trabalhos selecionarem controles entre doadores de
bancos de sangue ou outros voluntários saudáveis, onde os indivíduos não são avaliados
quanto à exposição à infecção. Outro problema assinalado pelos autores seria o cálculo do
70
tamanho adequado da amostra para detectar diferenças clínicas ou biológicas significativas
entre os casos e controles.
Inicialmente a pesquisa realizou uma análise de múltiplos fatores desta população de
importância clínica, epidemiológica e laboratorial. Os resultados do estudo apontaram uma
diferença significativa para o maior número de casos de tuberculose ocorrer no gênero
masculino (p=0.021), o que concorda com a maioria dos trabalhos. Possível explicação pode
está relacionada a fatores biológicos intrínsecos ao gênero, como hábitos e estilo de vida,
favorecendo uma maior exposição ao bacilo, elevando, portanto, os dados de incidência da
doença nos homens (COUTINHO et al., 2012; VENDRAMINI et al., 2005). Quanto à faixa
etária, observou-se uma maior freqüência dos pacientes do grupo caso na faixa entre 20-59
anos, bem como nos controles 1 e 2, apesar de não apresentar diferença estatística entre os
grupos. Os dados obtidos corroboram com a literatura nacional, no qual demonstra que nos
países em desenvolvimento, como no caso do Brasil, 80% dos indivíduos com tuberculose
ativa encontram-se na faixa etária entre 15-59 anos, ou seja, na faixa de maior produtividade
social, causando um grande prejuízo sócio-econômico ao país (COÊLHO et al., 2010;
VENDRAMINI et al., 2005).
A tuberculose pulmonar apresenta vários fatores de risco para o seu desenvolvimento,
como os relacionados ao aspecto sócio-econômico, comportamental e biológico. No estudo
foram avaliadas as co-variáveis como: hábito de fumar, uso excessivo de álcool e a presença
de co-morbidades como diabetes melittus e hipertensão arterial sistêmica entre os pacientes
sintomáticos respiratórios. O estudo verificou que a maioria dos pacientes sintomáticos
respiratórios declarou não possuir o hábito de fumar (66,2%), nem fazia uso excessivo de
bebida alcoólica (76,2%), não encontrando associação com a tuberculose, apesar da literatura
apontar como importantes fatores de risco para o desenvolvimento da doença
(NARASIMHAN et al., 2013). No entanto, foi observado que o grupo de pacientes infectados
pelo Mtb (controle 1) apresentou o maior percentual de fumantes (30%) e que faziam uso
abusivo do álcool (19%), sendo esta com significância estatística (p=0,026). Lin et al. (2007)
realizaram uma revisão sistemática e meta-análise, onde examinaram a reatividade a
tuberculínica entre os fumantes e concluíram uma ligação causal entre exposição ao fumo,
bem como para o álcool e o aumento do risco para a tuberculose latente, doença e risco de
morte. Outra revisão sistemática concluiu que o risco de tuberculose é substancialmente
elevado entre os indivíduos que bebem mais do que 40g de álcool por dia e/ou tem o uso do
álcool desordenado (LONNROTH et al., 2008). O consumo excessivo de álcool leva à queda
da imunidade, desnutrição e fragilidade social, além da exposição a situações de risco
(CALIARI et al., 2007). Razões para o aumento do risco incluem alteração do sistema imune,
71
especificamente modificando as moléculas de sinalização responsável pela produção de
citocinas (NARASIMHAN et al., 2013).
A análise dos dados relacionados à presença de comorbidades não demonstrou
diferença estatística significante entre pacientes sintomáticos respiratórios participantes do
estudo. Dentre as comorbidades identificadas no estudo, chamamos a atenção para a diabetes
e a hipertensão arterial sistêmica, presentes em 11,1% e 8,3% da população estudada,
respectivamente. Vários estudos de caso-controle demonstram o risco aumentado em cerca de
3 vezes de pacientes diabéticos em desenvolver a tuberculose, comparados sem a doença, bem
como risco de morte (NARASIMHAN et al., 2013). Quanto à análise da hipertensão arterial
sistêmica como fator de risco para a tuberculose, nenhum trabalho relacionado com esta
associação foi encontrado na literatura.
Quanto aos métodos diagnósticos para tuberculose pulmonar realizados, verificou-se
que foram utilizados os tradicionais, ou seja, as técnicas de baciloscopia, cultura e raio-X em
84,5%, 87% e 73% dos indivíduos sintomáticos respiratórios, respectivamente. Neste
contexto, a pesquisa bacteriológica apresenta-se como método importante, tanto para a
elucidação diagnóstica, tratamento, quanto para o controle da doença em adultos (MS, 2011).
O teste tuberculínico é o método rotineiramente utilizado para identificar indivíduos
infectados pelo M. tuberculosis através da resposta imune celular, sendo utilizado no presente
estudo na detecção da forma latente nos indivíduos participantes, segundo normas do
Ministério da Saúde (2011). No grupo com TB ativa, pode-se observar que 11% não reagiram
ao teste tuberculínico. Alguns indivíduos podem ser anérgicos ao teste (ausência de
endurecimento após injeção do PPD), devido a estado imunológico que interfere na resposta
celular de hipersensibilidade do tipo tardia (ZEMBRZUSKI et al., 2010).
A radiografia do tórax é o método diagnóstico auxiliar na investigação da TB. Sua
solicitação deve ser realizada para todo indivíduo com suspeita clínica da doença para que
possa diferenciar imagens sugestivas de TB pulmonar de outras doenças respiratórias
(BRASIL, 2011). No estudo verificou-se que 73% dos indivíduos investigados apresentaram
resultados da radiografia pulmonar em seus prontuários, onde a maioria dos pacientes com
tuberculose pulmonar (64,8%) apresentou o resultado alterado, demonstrando ser um bom
método utilizado na definição diagnóstica.
Diversos estudos têm sido realizados com o objetivo de avaliar a associação entre
genes relacionados à resposta imunológica do hospedeiro com a susceptibilidade ou
resistência a tuberculose latente ou doença ativa, incluindo a análise de polimorfismos de base
única de regiões promotoras de genes de citocinas (BEM-SELMA et al., 2011; MORRIS et
al., 2011; STEIN et al., 2007). O TNF-α é uma importante citocina que atua na defesa contra
72
o M. tuberculosis. Níveis alterados de TNF-α podem estar influenciando a resposta imune
contra o M. tuberculosis e contribuindo para a susceptibilidade a tuberculose (OLIVEIRA et
al., 2004). A IL-10 é uma citocina imunorregulatória que tem papel crucial durante a fase
latente/crônica da TB (ZHANG et al., 2011). A alta produção de IL-10 pode estar relacionada
com a susceptibilidade e reativação da doença (TURNER et al., 1997). A associação de SNPs
de regiões promotoras dos genes TNF-α (-308G/A) e IL-10 (-1082A/G) com a
susceptibilidade e/ou resistência à tuberculose têm sido investigada em diferentes populações
mundiais, porém os resultados ainda continuam controversos (ATES et al., 2008; BEM-
SELMA et al., 2011; OH et al., 2007; SCOLA et al., 2003)
O Brasil possui um território de tamanho continental, o quinto maior do mundo,
dividido em cinco regiões geográficas, apresentando diversas histórias de colonização da
população. Neste contexto, o Norte teve um grande influência da raíz indígena, o Nordeste
teve uma história de forte presença africana devido à escravidão e o Sul foi principalmente
colonizada por imigrantes europeus. Portanto, a população brasileira foi formada por uma
extensa mistura a partir de três diferentes raízes ancestrais: ameríndios, europeus e africanos,
resultando em uma grande variabilidade genética (PENA et al., 2011).
A origem étnica é um importante componente para várias doenças mediadas pelo
sistema imunológico, inclusive a tuberculose, e essas informações na população brasileira são
muito restritas (MORAES et al., 2003), sobretudo no nordeste do país. O presente estudo
investigou a freqüência de SNPs localizados em regiões promotoras dos genes do TNF-α (-
308G/A) e IL-10 (-1082A/G) e sua associação com a susceptibilidade ou resistência à TB
pulmonar em uma população do nordeste do Brasil. O estudo das freqüências alélicas e
genotípicas de regiões promotoras dos genes do TNF-α e IL-10 em diferentes populações tem
demonstrado que esses polimorfismos exibem um diferente perfil de distribuição de acordo
com etnia (AMIRZARGAR et al., 2006; DELGADO et al., 2002; KUMAR et al., 2008
ZHANG et al., 2011).
O estudo realizou uma análise comparativa das frequências alélicas e genotípicas dos
referidos SNPs na população mundial e observou como era esperado, que se tratando de
populações geneticamente heterogêneas, foram encontrados resultados concordantes e
discordantes. Estes dados provavelmente servirão para futuras comparações de freqüências
alélicas e genotípicas, assim como para o estudo da genética de populações (BAENA et al.,
2007).
O estudo também realizou uma análise comparativa da freqüência dos SNPs estudados
com outros trabalhos cintíficos realizados na população brasileira. Na análise da freqüência do
SNP -1082A/G, no presente estudo, encontrou que o alelo selvagem -1082A foi predominante
73
tanto na população geral (58,5%) como no grupo controle 3 (78%), formados por indivíduos
clinicamente saudáveis, procedentes do estado de Pernambuco. O trabalho de Moraes et al.
(2003), também demonstraram a alta representação do alelo A do mesmo SNP (68%) em 293
indivíduos saudáveis procedentes da cidade do Rio de Janeiro/RJ, concordando com os nossos
resultados. Quanto à análise dos genótipos -1082AA e -1082GA, o estudo encontrou
frequências discordantes, de 60% e 35% no grupo controle 3, respectivamente, quando
comparado com os achados de Moraes et al. (2003) (43,3% e 50,9%, respectivamente) entre
as populações da cidade do Recife/PE e Rio de Janeiro/RJ.
Quanto à análise do SNP -308G/A do gene do TNF-α, o presente trabalho encontrou
uma predominância da presença do alelo selvagem -308G (74% e 72%) nos grupos controles
1 e 2, respectivamente. O trabalho realizado por Oliveira et al. (2004), avaliou o mesmo SNP
em pacientes portadores de outras pneumopatias, procedentes da cidade do Rio de Janeiro,
encontrando também uma alta freqüência do alelo selvagem -308G (91%). Em relação ao
genótipo selvagem -308GG, observou-se resultados discordantes, com frequência de 58% e
56% nos controles 1 e 2 no presente estudo, respectivamente, e 90% no trabalho de Oliveira et
al. (2004). O estudo de Angelo et al. (2012) avaliaram o SNP (-308G/A) de pacientes com
Lupus eritematoso sistêmico e indivíduos saudáveis provenientes do hospital das clínicas de
Pernambuco. Verificaram no grupo de indivíduos saudáveis, uma maior frequência do alelo -
308G (90,1%), bem como do genótipo -308GG (80,2%). Na literatura, há poucos trabalhos
realizados com a população brasileira que avaliem a freqüência do SNP -308G/A, não
possibilitando uma melhor análise comparativa.
No estudo, não foi encontrada diferença estatística significante nas freqüências
alélicas e genotípicas dos SNPs estudados entre os pacientes com tuberculose pulmonar ativa
e os grupos controles 1 e 2. Oliveira et al. (2004), estudando a relação entre a freqüência do
SNP -308G/A e o risco de desenvolvimento da tuberculose pulmonar e extrapulmonar na
população da cidade do Rio de Janeiro comparado com controles doentes também não
encontrou diferença significativa nas diferentes formas de apresentação clínica da tuberculose.
Entretanto, quando foi avaliada a distribuição da freqüência genotípica do SNP -
308G/A do gene do TNF-α, observou-se um aumento significativo do genótipo heterozigoto -
308GA no grupo controle 3 comparado com o grupo caso (p=0.005), demonstrando um fator
de proteção ao desenvolvimento da tuberculose nesse grupo (OR=0.374 [0.17-0.76]). Scola et
al. (2003) discutem que o efeito do alelo é largamente dependente do status do genótipo,
podendo ser composto por homozigose ou heterozigose. Não foi observada diferença
significante na análise das freqüências alélica e genotípica do mutante -308AA, entre os
grupos caso e controle 3, bem como nos três grupos de controles analisados conjuntamente.
74
Porém, observou-se uma leve tendência do aumento do genótipo -308AA no grupo caso
(11%) em relação ao controle 3 (6%), sem significância estatística, provavelmente pelo baixo
número amostral utilizado no estudo.
O TNF-α possui um papel importante na defesa e resposta imune da tuberculose,
agindo sinergicamente com o interferon-gamma na ativação de macrófagos e na formação do
granuloma em indivíduos infectados. A falha na organização do granuloma resulta na
disseminação do M. tuberculosis e se não controlada poderá causar a morte do hospedeiro
(SCOLA et al., 2003). Polimorfismos dentro de regiões regulatórias do gene têm um efeito
significativo na transcrição, onde a presença do alelo mutante -308A resulta no aumento da
produção do TNF-α (WILSON et al., 1997). A sua produção, regulada por um circuito
complexo de interações moleculares, deverá ser equilibrada, pois o seu excesso leva a um
acúmulo celular, comprometendo a função do órgão e exarcebando o dano tecidual. In vivo ou
in vitro, a expressão de TNF-α ativa a produção de IL-10 e a interação entre os níveis de IL-
10 e TNF-α pode influenciar o desenvolvimento da tuberculose (ORAL et al., 2006; SCOLA
et al., 2003).
Estudos indicam que polimorfismos em regiões promotoras do gene da IL-10
influenciam a síntese protéica (TURNER et al., 1997), podendo estar envolvidos na
progressão da tuberculose pulmonar. O alelo -1082G e haplótipos tem sido associados com
alta produção, enquanto que o alelo -1082A e haplótipos com a baixa produção da IL-10
(ATES et al., 2008). Beamer et al. (2008) demonstraram que o bloqueio da ação da IL-10 in
vivo durante a infecção crônica, estabilizou a carga bacteriana pulmonar, levando a
sobrevivência dos camundongos CBA/J. Além disso, os resultados também indicaram o
recrutamento de células T para os pulmões, bem como a produção de IFN-γ, concluindo que a
IL-10 promoveu a progressão da tuberculose.
Na análise dos resultados do SNP -1082A/G do gene da IL-10, observou-se um
aumento significativo do alelo mutante -1082G [p=<0.0001; OR=3.90 [2.45- 6.59] e dos
genótipos -1082AG [p=<0.0001; OR=2.90 [1.42- 5.95] e -1082GG [p<0.0001; OR=15.50
[5.18- 1.62], no grupo caso comparado com o controle 3, demonstrando uma associação de
risco ao desenvolvimento da tuberculose pulmonar. O estudo também encontrou uma
associação estatística significante do alelo mutante -1082G [p=0.001; OR=1.92 [1.28 – 2.90]
e dos genótipos -1082AG [p=0.03; OR=2.06 [1.02 - 4.29] e -1082GG [p=0.004; OR=2.92
[1.34 – 6.44] quando o grupo caso foi comparado com os todos os controles (analisados
conjuntamente). Os resultados destas análises indicaram um risco aumentado (cerca de 3.9
vezes para portadores do alelo mutante -1082G) ao desenvolvimento da forma pulmonar no
grupo caso comparado ao controle 3, o qual foi observada uma predominância do alelo
75
mutante -1082G, que de acordo com a literatura está relacionado com alta produção da
citocina (TURNER et al., 1997).
Quanto a análise da frequência alélica e genotípica do SNP -1082A/G entre os grupos
caso e controles 1 e 2, não foi encontrada associação estatística significante, observando uma
distribuição similar das freqüências alélicas e genotípicas entre esses grupos. Uma possível
explicação seria a definição do critério clínico para inclusão de doentes no estudo, ou seja,
pacientes sintomáticos respiratórios, portadores de enfermidades pulmonares inespecíficas
crônicas, que também podem estar com a produção alterada da citocina. Posteriormente, o
estudo realizará uma análise estatística com este grupo de doentes sintomáticos respiratórios
comparados com os controles saudáveis, para verificar se o SNP investigado também possui
uma possível associação com o desenvolvimento de doenças crônicas pulmonares.
O estudo não encontrou diferença estatística significante na análise de possível
associação de risco da tuberculose pulmonar com os SNPs -308G/A e -1082A/G relacionados
com às co-variáveis clínicas e demográficas dos pacientes sintomáticos respiratórios. Isto
ocorreu provavelmente por causa do número insuficiente de pacientes quando se estratificou
nos subgrupos de estudo para a realização da análise de regressão logística multivariada.
Porém, foi encontrada uma associação significante do genótipo -308GG e a doença em estudo
na co-variável idade, demonstrando que os pacientes com TB pulmonar na faixa etária
produtiva (<50 anos) quando comparado ao controle 2, apresentaram maior risco de
exposição ao bacilo, tornando-os mais susceptíveis a doença, quando se comparou ao grupo
de >50 anos.
Os resultados do estudo demonstraram a análise das frequências alélicas e genotípicas
dos SNPs e sua associação com a tuberculose pulmonar. Observou-se que o SNP -1082A/G
mostrou ser bom marcador para a tuberculose, considerando que para existir uma associação
do SNP com a doença em estudo, o nível de significância deve ser de 5%, ou seja, o valor
de p<0,05.
Vários estudos realizados em populações mundiais avaliaram a frequência de SNPs
funcionais dos genes do TNF-α (-308G/A) e IL-10 (-1082A/G) e sua associação com a
tuberculose. O trabalho de Scola et al. (2003), realizado na cidade da Sicília/Itália,
demonstraram um aumento significativo da freqüência do alelo -308A do TNF-α nos
pacientes com tuberculose pulmonar comparado com controles saudáveis e não encontrou
diferença significativa na análise do SNP -1082G/A. Na análise dos genótipos, ambos -
308GG e carreadores do IL-10A/* foram significantemente diminuídos nos pacientes com
tuberculose pulmonar.
76
Oh et al. (2007), também investigaram os mesmos SNPs na população da Korea, não
encontrando diferença estatística na frequência alélica e genotípica do SNP -308G/A entre os
casos pulmonares e os controles saudáveis. Porém foi verificada uma associação significante
do alelo -1082A da IL-10 e do genótipo -1082AA no grupo com tuberculose comparados aos
controles, onde concluíram que a presença do alelo -1082A homozigoto demonstrou risco
aumentado comparado com o -1082G.
O estudo realizado por Henao et al. (2006) utilizou além dos pacientes doentes com
várias formas clínicas (pulmonar, pleural e miliar), indivíduos reatores e não reatores ao teste
tuberculínico e indicou o papel do polimorfismo referente ao baixo produtor de IL-10 (-
1082A) na tuberculose, porém não encontraram associação significativa com o TNF-α.
Amirzargar et al. (2006) estudaram a possível associação de polimorfismos funcionais com a
tuberculose em pacientes iranianos e não encontraram diferença significante entre pacientes
pulmonares e controles para os SNPs -308G/A e -1082A/G.
O resultado do presente trabalho discorda com os estudos de Scola et al. (2003), Oh et
al. (2007), Henao et al. (2006) e Amirzargar et al. (2006) na análise da associação dos
referidos SNPs com o desenvolvimento da tuberculose. Embora seja difícil detectar as
discrepâncias entre os estudos, possíveis explicações podem estar relacionadas aos diferentes
tamanhos amostrais (estudos de caso e controle) utilizado em cada população ou ainda
variações genéticas éticas específicas entre as diferentes populações investigadas.
Oral et al. (2006), na população da Turquia, avaliaram as freqüências dos SNPs em
diferentes formas clínicas da doença da população da Turquia, demonstrando que o alelo -
1082G foi significativamente mais freqüente nos pacientes do que nos controles saudáveis,
porém não encontrou para o SNP -308G/A do TNF-α. Ates et al. (2008), também na Turquia,
em seu trabalho demonstraram uma associação significante entre TB e a frequência
aumentada do alelo -1082G comparado aos controles, mas sem associação significante com o
SNP -308G/A, como também nas diferentes formas clínicas da tuberculose. Trajkov et al.
(2009) estudaram a possível associação de polimorfismos com a tuberculose na Macedônia e
demonstraram que os pacientes com genótipo -1082GG tiveram 2.5 vezes mais risco de
desenvolver a tuberculose, enquanto que para o SNP -308 TNF-α não acharam associação.
O presente estudo concorda com os trabalhos de Oral et al. (2006), Ates et al. (2008) e
Trajkov et al. (2009), onde encontrou uma frequência significantemente aumentada do alelo
mutante -1082G nos pacientes do grupo com tuberculose pulmonar (54%) comparado com o
grupo controle 3 (22%), relacionado com o alelo de alta produção da IL-10, ocasionando um
desequilíbrio na resposta imune celular do tipo Th1/Th2, resultando no desenvolvimento da
forma ativa da doença (KIDD et al., 2003).
77
Ben-Selma et al. (2011) também estudaram os SNPs TNF- α (-308G/A) e IL-10 (-
1082A/G) na população da Tunísia e observaram que o alelo -308A bem como o genótipo -
1082 AG estavam associado com o risco para TB extrapulmonar. No trabalho, indicaram a
associação do genótipo -1082AA com resistência a TB pulmonar, concordando com os nossos
achados. Sugeriram que a combinação de genótipos TNF-α/IL-10 de baixa produção pareceu
ter efeito protetor na TB pulmonar.
Polimorfismo no gene da IL-10 (-1082) e a associação com a tuberculose foram
investigados por Tso et al. (2005), Shim et al. (2005), Anand et al. (2007) e Selvaraj et al.
(2008) e não encontraram resultados de associação, discordando dos nossos resultados.
Delgado et al. (2002) realizaram o estudo em 358 pacientes soro-negativos com tuberculose
pulmonar e controles saudáveis procedentes do Camboja com diferentes polimorfismos e
encontraram uma associação significante do genótipo heterozigoto SNP -1082G/A com a
tuberculose doença.
Polimorfismo no gene do TNF-α (-308) e a associação com a tuberculose também
foram investigados por Kumar et al. (2008) e Vejbaesya et al. (2007) e não encontraram
resultados de associação com a susceptibilidade ou resistência a tuberculose, discordando dos
nossos achados.
Oliveira et al. (2004) estudaram pacientes da cidade do Rio de Janeiro e encontraram
que a frequência do homozigoto mutante -308A e AA foi significativamente maior no grupo
de pacientes com TB (OR= 1,94 [IC=1,07-3,58] e OR=2,48 [IC=0,93-0,97]. Explicaram que
possivelmente este grupo de pacientes sejam funcionalmente mais hábeis em produzir TNF-α,
mas também carreassem mutações em outros genes regulatórios da imunidade a tuberculose
(IFN-γ), não permitindo que esta citocina exerça seu papel inflamatório, favorecendo o
desenvolvimento da doença.
Resultado contrário foi obtido no estudo de Correa et al. (2004) na população da
Colômbia, onde encontraram uma associação de risco da presença do alelo -308G com a
tuberculose e indicaram que a presença do alelo -308A resulta no efeito protetor. Ainda
demonstraram a presença do genótipo heterozigoto (-308GA) como fator de proteção para a
tuberculose, concordando com os resultados obtidos do presente estudo. Os dados sugerem a
presença de uma seleção genética na população estudada. Correa et al. (2004) discutem ainda
que possivelmente exista uma dominância na seleção, ou seja, vantagem de heterozigose, na
qual os heterozigotos para uma determinado alelo são resistentes a uma enfermidade
(tuberculose), mas susceptíveis a outras (autoimunidade).
A grande diversidade genética, assim como a distribuição de freqüências alélicas
observadas na maioria dos genes polimórficos, é influenciada e gerada por forças seletivas
78
próprias do ambiente em que se desenvolvem as espécies, tais como agentes infecciosos,
sobrevivência e dominância genética, entre outros. Neste contexto, se tem postulado a teoria
da “vantagem de heterozigose” em humanos e “vigor híbrido” em plantas e algumas espécies
animais (HEDRICK et al., 1990). Esta teoria propõe que os indivíduos heterozigotos são
capazes de responder de maneira mais eficiente as exigências do meio, já que possuem uma
maior variedade genética que lhes permite se adaptar as condições adversas, em particular, ao
ataque de diversos microorganismos (COOKE; HILL, 2001). Esta teoria parece estar
sustentada pela co-evolução entre patógenos e hospedeiros, na qual existe uma seleção
positiva para aqueles genes envolvidos na interação hospedeiro-parasita (HEDRICK et al.,
1990; SCHLIEKELMAN et al., 2001).
Embora mecanismos associados com polimorfismos que levam a alterações na
expressão gênica sejam ainda pouco compreendidos, é bem conhecido que a tuberculose é
parcialmente dependente de um controle poligênico (SHAW et al., 1997). Os componentes
genéticos que participam da defesa do hospedeiro contra a tuberculose, não deverão ser os
únicos fatores, mas também deve ser considerada a interação gene-ambiente. Também não é
muito conhecido se o polimorfismo por si só contribui para a susceptibilidade e/ou proteção
para a TB ou devido a existência de um desequilíbrio entre alelos susceptíveis a uma doença.
Muitos desses polimorfismos ocorrem em padrões étnicos específicos. Portanto, a
identificação desses genes e de suas interações é de grande importância no entendimento do
papel dos fatores genéticos na patogênese da tuberculose, podendo levar a novos caminhos de
tratamento ou profilaxia.
79
10 CONCLUSÕES
- O genótipo heterozigoto -308GA demonstrou ser um fator de proteção ao desenvolvimento
da tuberculose pulmonar;
- O alelo mutante -1082G demonstrou associação de risco ao desenvolvimento da tuberculose
pulmonar;
- O SNP -1082A/G mostrou ser bom marcador para a tuberculose pulmonar;
- O grupo caso e os controles doentes apresentaram distribuição similar das freqüências
alélicas e genotípicas dos SNPs -308G/A e -1082A/G;
- Os SNPs -308G/A e -1082A/G não demostraram associação com o desenvolvimento da
tuberculose pulmonar na população estudada com às covariáveis sexo, hábito de fumar e
beber e portadores de diabetes mellitus e hipertensão arterial sistêmica;
- O genótipo -308GG no grupo com <50 anos demonstrou ser um fator de risco ao
desenvolvimento da tuberculose pulmonar;
80
11 PERSPECTIVAS
- Estudos futuros deverão ser realizados com uma maior casuística de indivíduos do nordeste
do Brasil para uma melhor caracterização alélica e genotípica dos alvos moleculares
investigados;
- Correlacionar os SNPs estudados com os níveis de citocinas expressos, para o real
entendimento do papel dos fatores genéticos na patogênese da tuberculose em populações
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95
APÊNDICE A - TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE)
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE)
PACIENTE:__________________________________________________IDADE:_______
HOSPITAL:____________________________________________Prontuário: __________
ENDEREÇO DO PACIENTE:___________________________________________ Nº:___
BAIRRO:________________CIDADE:___________________________ ESTADO:______
O Sr(a) está sendo convidado(a) a participar como voluntário(a), da pesquisa - “Avaliação da associação entre
polimorfismos genéticos e níveis séricos das citocinas TNF-α e IL-10 com a susceptibilidade a tuberculose
pulmonar.”, após ser esclarecido(a) sobre as informações a seguir, no caso de aceitar fazer parte do estudo, assine ao
final deste documento, que está em duas vias. Uma delas é sua e a outra é do pesquisador responsável. Em caso de recusa
você não será penalizado(a) de nenhuma forma.
INFORMAÇÕES SOBRE A PESQUISA
TÍTULO DO PROJETO DE PESQUISA: Avaliação da associação entre polimorfismos genéticos e níveis séricos das
citocinas TNF-α e IL-10 com a susceptibilidade a tuberculose pulmonar.
Pesquisador (a) Responsável: Lílian Maria Lapa Montenegro
Telefones para contato: (81) 2101-2560 ou 2101-2569
Pesquisadores Participantes: Dra. Haiana Charifker Schindler; Drª Clarice Neuenschwander Lins de Morais; André
Luiz Alves do Nascimento.
Objetivos: Avaliar a associação de polimorfismos genéticos dos genes da Interleucina-10 e TNF-α com o
desenvolvimento da tuberculose pulmonar ativa.
Procedimentos do estudo: Quando o Sr(a) for atendido pelo médico(a) assistente do hospital, Sr(a) responderá a um
questionário onde irão constar: nome, endereço, telefone para contato, característica do domicílio, escolaridade, queixas
principais e tempo de duração, se está tomando algum remédio, exames físico, laboratoriais e tratamento atual. O
preenchimento do questionário será feito por um dos integrantes da pesquisa. O Sr(a) será acompanhado por uma equipe
multidisciplinar envolvendo os médicos responsáveis do serviço de saúde com experiência reconhecida no manejo da
tuberculose, enfermeiras e técnicos que realizarão outros exames necessários e seguirão os procedimentos adequados e de
rotina do hospital. O acompanhamento e tratamento serão feitos pelo médico assistente do serviço que é responsável por
todos os leitos, cujos pacientes estão sendo investigados quanto à existência ou não de Tuberculose pulmonar. Caso for
diagnosticada a doença será utilizado como terapia de primeira escolha o esquema com rifampicina, isonizida,
pirazinamida e etambutol e se necessário, um esquema de segunda escolha será oferecido em casos selecionados. Todo o
medicamento será fornecido pela rede SUS (fornecido pelo Hospital ou pelo Posto de Saúde).
Para a nossa pesquisa será realizado o teste tuberculínico e em 72 horas (3 dias) será realizada a leitura do teste e também
será coletado 4ml de sangue (menos de uma colher de sopa) e 5 a 10 ml (uma colher de sopa) de escarro. Além disso, será
realizado o teste rápido para detectar o Vírus da Imunodeficiência Adquirida (HIV) em todos os indivíduos selecionados
para a pesquisa. As amostras de sangue e escarro serão encaminhadas ao laboratório de Imunoepidemiologia do
departamento de Imunologia do CPqAM para serem analisadas por profissionais capacitados. Os resultados de todos os
exames serão encaminhados ao médico responsável pelo atendimento. Todas as amostras biológicas (sangue e escarro)
serão congeladas e armazenadas a -20ºC, caso seja necessário a repetição do exame.
Riscos e Benefícios: O Sr (a) não será submetido a qualquer risco ou desconforto adicional e seguiremos a rotina
estabelecida pelo profissional de saúde, seja a nível ambulatorial ou enfermaria. O abandono da pesquisa não trará
prejuízo ao seu tratamento ou ao acompanhamento clínico. Todo o conhecimento gerado com a realização deste estudo
será de fundamental importância para o entendimento das possíveis alterações no sistema de defesa do corpo humano que
podem estar influenciando no desenvolvimento da tuberculose pulmonar.
Custo/Reembolso para o paciente: Não haverá nenhum gasto com sua participação. As consultas, exames, tratamentos
serão totalmente gratuitos, não recebendo nenhuma cobrança com o que será realizado. O (a) Sr(a) também não receberá
nenhum pagamento com a sua participação.
96
Garantia de Sigilo: Os dados do (a) Sr. (a) serão preservados em sigilo absoluto quando da publicação do resultado da
pesquisa.
Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães/FIOCRUZ
Laboratório de Imunoepidemiologia, Departamento de Imunologia
Avenida Moraes Rego, s/n, Cidade Universitária.
Campus da UFPE.
Fone: (81) 2101-2569
Contato: Lílian Maria Lapa Montenegro e André Luiz Alves do Nascimento.
CONSENTIMENTO
Eu,_________________________________________________________________________________,
RG/CPF________________________ declaro que entendi os objetivos da pesquisa e sem ter sido pressionado ou
constrangido concordo participar da pesquisa. Tenho consciência do meu direito de abandonar a pesquisa a qualquer
momento e de que as informações colhidas serão mantidas em sigilo. Os resultados da pesquisa podem ser apresentados
em congressos ou publicados em revistas de cunho técnico, sem que seja divulgado o nome do paciente.
Nome do Paciente: _______________________________________________________________
________________________________________
Assinatura do paciente ou responsável
Nome do Pesquisador: ____________________________________________________________
_________________________________________
Assinatura do pesquisador
__________________, ____/____/____.
Local
97
APÊNDICE B - PROTOCOLO DE PESQUISA DE TUBERCULOSE
PROTOCOLO DE PESQUISA DE TUBERCULOSE
IDENTIFICAÇÃO
1. Número da ficha na pesquisa
2. Data da entrevista
_______/______/_________
3. Procedência:
1. Ambulatório
2. Enfermaria
4. Número do Prontuário do Hospital
5. Hospital de origem:
1. Hospital das Clínicas
2. Hospital Otávio de Freitas
3. IMIP
4. Pol. Lessa de Andrade
5. PSF Joaquim Cavalcanti
6. Número do SAME
DADOS DO PACIENTE
7. Nome Completo do Paciente
_____________________________________________________________________________________________
8. Nome da Mãe ou Responsável
_____________________________________________________________________________________________
9. Data de nascimento
______/_______/________
10. Idade do paciente
11. Sexo
1. Feminino
2. Masculino
12. Endereço
_____________________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________________
Ponto de referência
_____________________________________________________________________________________________
13. Bairro
_________________________________
14. Cidade
_________________________________
15. UF
16. Telefone Res. e Celular
(_____) _______ - ___________
(_____) _______ - ___________
17. CEP
___________________________________
18. Zona de localização da moradia
1. Urbana
2. Rural
DADOS SÓCIO-ECONÔMICOS
19. Grau de instrução do paciente
1. Analfabeto
2. Iniciou alfabetização
3. 1º grau
4. 2º grau
5. 3º grau
6. Outro
20. Renda familiar mensal
1. Menor ou igual a 1 salário mínimo 4. Biscate
2. De 2 a 4 salários mínimos 8. Não sabe
informar
3. Mais que 5 salários mínimos
anos meses
98
21. Quantas pessoas
moram na casa do
paciente?
1. Até 3
2. De 4 a 6
3. Mais de 6
8. Não sabe informar
22. Quantos adultos?
1. Até 2
2. De 3 a 5
3. Mais que 5
23. Quantas crianças?
1. Até 2
2. De 3 a 5
3. Mais que 5
24. Quantos cômodos (locais de
dormir) têm na casa?
1. Um
2. De 2 a 4
3. Mais de 4
8. Não sabe informar
25. O senhor(a) ou algum adulto na
casa fuma?
1. Sim
2. Não
8. Não sabe informar
26. O senhor(a) ou alguém na casa
bebe?
1. Sim
2. Não
8. Não sabe informar
27. Existe algum caso de HIV na
família?
1. Sim
2. Não
8. Não sabe informar
28. Existe algum caso de alcoolismo
na família?
1. Sim
2. Não
8. Não sabe informar
29. Uso de drogas na família
1. Sim
2. Não
8. Não sabe informar
30. Existe alguém da família ou do
convívio que faz tratamento
prolongado para TB?
1. Sim______________
2. Não
3. Sim -não sabe informar a
doença
8. Não sabe informar
31. Raça/Cor
1. Branca
2. Preta
3. Parda
4. Amarela
5. Indígena
DADOS EPIDEMIOLÓGICOS
32. Existe algum caso de tuberculose na família ou
em pessoa de convívio?
1. Sim
2. Não
8. Não sabe informar
31. Caso sim, há quanto tempo?
____________________
Caso a resposta seja Não, seguir para 39
33. Qual o grau de parentesco?
1. Mãe 5. Tio (a)
2. Pai 6. Primo (a)
3. Irmã (o) 7. Outro
4. Avô (ó) 8. Não sabe informar
9. Inaplicável
Outro:________________________________
34. Período de duração do contato:
1. < 3 meses 8. Não sabe informar
2. 3 meses a 2 anos 9. Inaplicável
3. + que 2 anos
35. Qual o tipo de contato?
1. Intradomiciliar contínuo (5 a 7 dias/semana, > 6h/dia)
2. Intradomiciliar intermitente (5 a 7 dias/semana, < 6h/dia)
3. Esporádico (entre 2 a 4 dias/semana)
8. Não sabe informar
9. Inaplicável
36. Em relação ao tratamento para TB o contato:
1. Foi tratado totalmente
2. Está em tratamento
3. Não tratado
4. Interrompeu o tratamento
8. Não sabe informar
9. Inaplicável
Caso não tenha havido interrupção, seguir para 39.
37. Qual o motivo da interrupção:
1. Intolerância ao medicamento
2. Falta de medicamento
3. Abandono do tratamento
4. Outro motivo
8. Não sabe informar
9. Inaplicável
99
ANTECEDENTES DO PACIENTE
38. Já teve alguma doença?
1. Sim
2. Não
8. Não sabe informar
Caso a resposta seja Não, seguir para 41
39. Qual doença?
1. Asma 6. Fibrose Cística
2. Pneumonia 7. HIV/AIDS
3. Bronquite 8. Câncer
4. Tuberculose 9. Não sabe
5. Diabetes 10. Outro:
__________________________
40. Tem cicatriz de BCG? (vista pelo entrevistador
no braço direito ou através de cartão)
1. Sim
2. Não
8. Não verificado
41. Fez PPD anterior?
1. Sim
2. Não
8. Não sabe
Data de realização: ____/____/_____(Vê no cartão)
Caso não tenha feito, seguir para 45.
42. Resultado do PPD:
1. Não reator (0-4mm) 4. Reator muito forte (>15mm)
2. Reator fraco (5-9mm) 8. Não sabe informar
3. Reator forte (10-14mm) 9. Inaplicável
43. Toma algum medicamento atualmente?
1. Sim
2. Não
Qual: ______________________________________
44. Já fez TTO para tuberculose?
1. Sim
2. Não
Qual: ______________________________________
Caso sim, quanto tempo? _________________________
Caso sim, número de TTO anteriores: ________________
45. Há quanto tempo o paciente está
doente?
meses dias
46. Tem febre?
1. Sim
2. Não
8. Não sabe
Caso sim, há quanto tempo: ___________
47. Perda de peso?
1. Sim
2. Não
8. Não sabe
48. Tem tosse há mais de 15 dias?
1. Sim
2. Não
8. Não sabe
Caso sim, há quanto tempo: ___________
49. Tipo de tosse:
1. Seca
2. Produtiva
3. Hemoptise
9. Inaplicável
50. Tem falta de apetite?
1. Sim
2. Não
8. Não sabe
51. Tem fraqueza muscular?
1. Sim
2. Não
8. Não sabe
52. Apresenta falta de ar desde que
ficou doente?
1. Sim
2. Não
8. Não sabe
53. Tem dor nas juntas?
1. Sim
2. Não
8. Não sabe
Caso não, seguir para 60.
54. Qual o local?
1. Joelho
2. Cotovelo
3. Punho
4. Coluna
55. Apresenta dor na barriga?
1. Sim
2. Não
8. Não sabe
56. Notou aumento da barriga?
1. Sim
2. Não
8. Não sabe
57. Notou linfonodo (lândria ou
íngua) aumentado?
1. Sim
2. Não
8. Não sabe
58. Local do linfonodo:
1. Pescoço
2. Axila
3. Região inguinal (virilha)
Outros _______________
59. Apresenta suor noturno?
1. Sim
2. Não
8. Não sabe
CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS (referidos pelo Informante)
100
EXAMES LABORATORIAIS (preenchido pelo médico pesquisador)
60. Realizou Raio X de Tórax na admissão?
1. Sim
2. Não
8. Não sabe informar
Data:____/_____/______
Caso a resposta seja Não, seguir para 112
61. Resultado do Raio X de
admissão:
1. Normal 2. Alterado
- Se alterado:
1. Padrão não sugestivo de TB
2. Forma Pneumônica
3. Forma Pneumoganglionar
4. Forma Pleuropulmonar
5. Forma Miliar
6. Forma Ganglionar
7. Inaplicável
8. Não sabe informar
62. Realizou Raio X de tórax de controle?
1. Sim
2. Não
8. Não sabe informar
Data:____/_____/______
Caso a resposta seja Não, seguir para 114
63. Resultado do Raio X de controle:
1. Normalizou
2. Houve melhora
3. Houve piora
8. Não sabe informar
9. Inaplicável
66. Realizou Tomografia de tórax?
1. Sim
2. Não
8. Não sabe informar
Data:____/_____/______
Caso a resposta seja Não, seguir para 116
67. Resultado da Tomografia de tórax:
1. Normal
2. Alterado sugestivo
3. Alterado inespecífico
8. Não sabe informar
9. Inaplicável
68. Realizou PPD para pesquisa? 1. Sim
2. Não
8. Não sabe informar
Data:____/_____/______
Caso a resposta seja Não, seguir para 118
69. Resultado do PPD:
1. Não reator (0-4mm) 4. Reator muito forte (>15mm)
2. Reator fraco (5-9mm) 8. Não sabe informar
3. Reator forte (10-14mm) 9. Inaplicável
70. Realizou Baciloscopia?
1. Sim
2. Não
Data:____/_____/______
Caso a resposta seja Não, seguir para
124
71. Resultado da baciloscopia:
1. Positiva
2. Negativa
9. Inaplicável
_________ Cruzes
72. Material da baciloscopia:
1. Escarro
2. Lavado gástrico
3. Líquor
4. Biópsia
5. Outro material
9. Inaplicável
Outro ______________________
73. Realizou Cultura em meio
Lowestein-Jensen?
1. Sim
2. Não
Data:____/_____/______
Caso a resposta seja Não, seguir para
130.
74. Resultado da Cultura:
1. Positiva
2. Negativa
9. Inaplicável
75. Material da Cultura:
1. Escarro
2. Sangue
3. Urina
4. Lavado gástrico
5. Líquor
6. Biópsia
7. Outro material
9. Inaplicável
Outro ______________________
101
76. Diagnóstico inicial
1. TB infecção
2. TB doença
3. TB suspeita
4. Não é TB
77. Data da notificação:
Data: ____/_____/______
Profissional que notificou:
--------------------------------------------
Se Extra pulmonar:
1. Ganglionar Periférica
2. Ganglionar Pulmonar
3. Meningoencefálica
4. Miliar
5. Óssea
6. Pleural
7. Outra
8. Inaplicável
78. Diagnóstico Final
1. TB infecção
2. TB doença
3. TB suspeita
4. Não é TB
79. Forma de TB
1. Pulmonar 2. Extra pulmonar
80. Tratamento realizado:
1. Profilaxia primária (INH por 3 meses)
2. Profilaxia secundária (INH por 6 meses)
3. Esquema I (INH + RMP por 6 meses e PZA por 2 meses) -
Tradicional
4. Esquema IR (INH + RMP + BEM por 6 meses e PZA por 2
meses)
5. Esquema II (INH + RMP por 9 meses e PZA por 2 meses)
6. Esquema III (SM + PZA por 3 meses e ETH + EM por 12
meses)
9. Inaplicável
81. Data do início do tratamento:
______/______/_________
82. Tempo entre o início dos sintomas e o diagnóstico de
TB:
1. ≤ 1 mês
2. 1 – 3 meses
3. ≥ 3 meses
4. Não investigado
83. Tempo entre o diagnóstico de TB e início do
tratamento específico:
1. ≤ 1 mês
2. 1 – 3 meses
3. ≥ 3 meses
4. Não investigado
84- Resposta ao tratamento específico (feita pelo médico acompanhante)
1. Melhora clínica evidente após 30 dias de início do tratamento (Resposta ao tratamento)
2. Não houve melhora clínica evidente após 30 dias de início do tratamento (Não houve resposta ao tratamento)
3. TB resistente
4. Não sabe informar
9. Inaplicável
Entrevistador:
_____________________________________
Assinatura:
________________________________________
85. Realizou Baciloscopia?
1. Sim
2. Não
Data:____/_____/______
86. Resultado
1. Positivo
2. Negativo
9. Não se aplica
Cruzes: __________
87. Realizou cultura?
1. Sim
2. Não
Data:____/_____/______
EVOLUÇÃO
DIAGNÓSTICO PELO LABORATÓRIO DE IMUNOEPIDEMIOLOGIA
102
88. Resultado
3. Positivo
4. Negativo
10. Não se aplica
89. Tipo de micobactéria:
1. M. tuberculosis
2. Atípica
Qual? __________________
90. Amostra biológica:
1. Sangue total 6. Líq.
Pleural
2. Soro 7. Biópsia de
gânglio
3. Células brancas 8. Urina
4. Escarro 9. Outros
5. Lav. Gástrico 99. Não se
aplica
91. Realizou Nested-PCR Único
Tubo pré-tratamento?
1. Sim
2. Não
Data:____/_____/______
92. Resultado
1. Positivo
2. Negativo
9. Não se aplica
93. Amostra biológica:
1. Sangue total 6. Líq.
Pleural
2. Soro 7. Biópsia de
gânglio
3. Células brancas 8. Urina
4. Escarro 9. Outros
5. Lav. Gástrico 99. Não se
aplica
94. Realizou PCR em tempo
real pré-tratamento?
1. Sim
2. Não
Data:____/_____/______
95. Resultado
1. Positivo
2. Negativo
9. Não se aplica
96. Amostra biológica:
1. Sangue total 6. Líq.
Pleural
2. Soro 7. Biópsia de
gânglio
3. Células brancas 8. Urina
4. Escarro 9. Outros
5. Lav. Gástrico 99. Não se
aplica
97. Realizou PCR colorimétrica
pré-tratamento?
1. Sim
2. Não
Data:____/_____/______
98. Resultado
1. Positivo
2. Negativo
9. Não se aplica
99. Amostra biológica:
1. Sangue total 6. Líq.
Pleural
2. Soro 7. Biópsia de
gânglio
3. Células brancas 8. Urina
4. Escarro 9. Outros
5. Lav. Gástrico 99. Não se
aplica
100. Realizou RT-qPCR pré-
tratamento?
1. Sim
2. Não
Data:____/_____/______
101. Resultado
1. Positivo
2. Negativo
9. Não se aplica
102. Amostra biológica:
1. Sangue total 6. Líq.
Pleural
2. Soro 7. Biópsia de
gânglio
3. Células brancas 8. Urina
4. Escarro 9. Outros
5. Lav. Gástrico 99. Não se
aplica
103. Realizou RT-qPCR pós-
tratamento?
1. Sim
2. Não
Data:____/_____/______
104. Época
1. 1ª semana
2. 2ª – 4ª semana
3. 1º - 3º mês
4. 3º - 6º mês
5. Após término do tto
105. Resultado
1. Positivo
2. Negativo
9. Não se aplica
103
PERFIL GENÉTICO E IMUNOLÓGICO DAS CITOCINAS IL-10 E TNF-α
106. Realizou PCR multiplex
pré-tratamento?
1. Sim
2. Não
Data:____/_____/______
107. Resultado
1. Positivo
2. Negativo
9. Não se aplica
108. Amostra biológica:
1. Sangue total 6. Líq.
Pleural
2. Soro 7. Biópsia de
gânglio
3. Células brancas 8. Urina
4. Escarro 9. Outros
5. Lav. Gástrico 99. Não se
aplica
115. Categorização do
Genótipo da IL-10:
1. GG
2. GA
3. AA
116. Alelo presente:
1. Alelo G
2. Alelo A
117. Níveis séricos da Citocina IL-10:
1. Alto
2. Moderado
3. Alto
Resultado em pg/ml: ________
118. Categorização do Genótipo
do TNF-α:
1. GG
2. GA
3. AA
119. Alelo presente:
1. Alelo G
2. Alelo A
120. Níveis Séricos da Citocina TNF-α:
1. Alto
2. Moderado
3. Baixo
Resultado em pg/ml: ________
Responsável pelo preenchimento da ficha:_______________________________________
Responsável pelos exames moleculares:_________________________________________
104
ANEXO A - PARECER DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISAS