frequÊncia de escherichia coli … · escherichia coli enteropatogênica (epec) e escherichia coli...

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FREQUÊNCIA DE ESCHERICHIA COLI SHIGATOXIGÊNICA (STEC) E ENTEROPATOGÊNICA (EPEC) EM PROPRIEDADES DE BÚFALOS NA REGIÃO DE RIBEIRÃO PRETO, SP. FREQUENCY OF ESCHERICHIA COLI SHIGATOXIGENIC (STEC) AND ENTEROPATOGENIC (EPEC) IN PROPERTIES OF BUFFALOS IN THE REGION OF RIBEIRÃO PRETO, SP. Lívia Gerbasi Beraldo 1** , Clarissa Araújo Borges 1* , Marita Vedovelli Cardozo 1* , Renato Pariz Maluta 1* , Everlon Cid Rigobelo 2 , Fernando Antônio de Ávila 3 RESUMO Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) e Escherichia coli shigatoxigênica (STEC) estão implicadas em causar diarréia em humanos e ruminantes, podendo até causar doenças mais sérias no homem, como a Síndrome Hemolítico Urêmico (SUH) STEC são definidas pela produção de um ou mais tipos de toxina shiga (Stx1, Stx2 ou variantes de Stx2) através dos genes stx1 e stx2. EPEC são definidas pela presença do gene eae, o qual codifica a intimina requerida para o ataque a mucosa intestinal produzindo uma lesão do tipo “attaching and effacing” que indica um íntimo ataque ao enterócito com desaparecimento das microvilosidades do epitélio intestinal. Este trabalho tem como objetivo determinar a freqüência de STEC e EPEC de amostras de origem bubalina através da pesquisa dos genes stx1, stx2 e eae e outros genes de virulência. Foram colhidas 194 amostras de fezes retais, 62 de leite e quatro de água, totalizando 260 amostras, de propriedades leiteiras da região de Ribeirão Preto-SP. Essas amostras foram submetidas a teste da PCR para detecção dos genes stx1, stx2, eae, ehxA, efa1, saa, lpfA O113 , lpfA O157/OI-141 , lpfA O157/OI-154 , toxB, iha e bfp nos isolados, testes bioquímicos para identificação e teste de resistência a antibióticos. Foram isoladas 33 estirpes de Escherichia coli das quais 21 (63,6%) STEC e 12 (36,4%) EPEC, que apresentaram 23 perfis genéticos diferentes. Os isolados apresentaram sensibilidade a quase todas as drogas testadas, sendo resistente apenas a cefalotina. Pelos resultados pode-se dizer que búfalos são importantes reservatórios de STEC e EPEC e a presença desses isolados com esses genes de virulência devem ser melhor estudados. Palavras-chave: Búfalo, genes de virulência, STEC, EPEC. SUMMARY Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) and Shigatoxigenic Escherichia coli (STEC) are implicated in diarrhea both in humans and ruminants, and can cause more serious diseases in man, such as Hemolytic Uremic Syndrome (HUS). STEC are defined by the production of an or more types of shigatoxin (Stx1 and Stx2) through the genes stx1 and stx2. EPEC are defined by the presence of the gene eae, which encodes the intimin necessary for the attack to the intestinal mucous membrane producing a lesion of the type "attaching and effacing ". This work had an objective of determining the frequency of STEC and EPEC of bubaline origin through the detection of genes stx1, stx2 and eae and other virulence genes. 194 fecal samples, 62 of milk and four of water were tested, totaling 260 samples. All dairy farms were located in the region of Ribeirão Preto-SP. After a screening by PCR aiming stx1, stx2 and eae, isolates from positive samples were submitted to a PCR for detection of the genes stx1, stx2, eae, ehxA, efa1, saa, lpfA O113 , lpfAO157/OI-141 , lpfA O157/OI-154 , toxB, iha and bfp, biochemical 1 Doutorandos PPGM da FCAV-UNESP, bolsista da *FAPESP, **CAPES 2 Professor Assist. Doutor da UNESP – Campus de Dracena 3 Professor Titular da FCAV-UNESP, Rod. Paulo Donato Castelane, Km 5, CEP14884-900, JABOTICABAL/SP, [email protected] bolsista de produtividade CNPq. Apoio Financeiro da FAPESP

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Page 1: FREQUÊNCIA DE ESCHERICHIA COLI … · Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) e Escherichia coli shigatoxigênica (STEC) estão implicadas em causar diarréia em humanos e ruminantes,

FREQUÊNCIA DE ESCHERICHIA COLI SHIGATOXIGÊNICA (STEC) E ENTEROPATOGÊNICA (EPEC) EM PROPRIEDADES DE BÚFALOS NA REGIÃO

DE RIBEIRÃO PRETO, SP.

FREQUENCY OF ESCHERICHIA COLI SHIGATOXIGENIC (STEC) AND ENTEROPATOGENIC (EPEC) IN PROPERTIES OF BUFFALOS IN THE REGION

OF RIBEIRÃO PRETO, SP.

Lívia Gerbasi Beraldo1**, Clarissa Araújo Borges1*, Marita Vedovelli Cardozo1*, Renato Pariz Maluta1*, Everlon Cid Rigobelo2, Fernando Antônio de Ávila3

RESUMO Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) e Escherichia coli shigatoxigênica (STEC) estão implicadas em causar diarréia em humanos e ruminantes, podendo até causar doenças mais sérias no homem, como a Síndrome Hemolítico Urêmico (SUH) STEC são definidas pela produção de um ou mais tipos de toxina shiga (Stx1, Stx2 ou variantes de Stx2) através dos genes stx1 e stx2. EPEC são definidas pela presença do gene eae, o qual codifica a intimina requerida para o ataque a mucosa intestinal produzindo uma lesão do tipo “attaching and effacing” que indica um íntimo ataque ao enterócito com desaparecimento das microvilosidades do epitélio intestinal. Este trabalho tem como objetivo determinar a freqüência de STEC e EPEC de amostras de origem bubalina através da pesquisa dos genes stx1, stx2 e eae e outros genes de virulência. Foram colhidas 194 amostras de fezes retais, 62 de leite e quatro de água, totalizando 260 amostras, de propriedades leiteiras da região de Ribeirão Preto-SP. Essas amostras foram submetidas a teste da PCR para detecção dos genes stx1, stx2, eae, ehxA, efa1, saa, lpfAO113, lpfAO157/OI-141, lpfAO157/OI-154, toxB, iha e bfp nos isolados, testes bioquímicos para identificação e teste de resistência a antibióticos. Foram isoladas 33 estirpes de Escherichia coli das quais 21 (63,6%) STEC e 12 (36,4%) EPEC, que apresentaram 23 perfis genéticos diferentes. Os isolados apresentaram sensibilidade a quase todas as drogas testadas, sendo resistente apenas a cefalotina. Pelos resultados pode-se dizer que búfalos são importantes reservatórios de STEC e EPEC e a presença desses isolados com esses genes de virulência devem ser melhor estudados. Palavras-chave: Búfalo, genes de virulência, STEC, EPEC. SUMMARY Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) and Shigatoxigenic Escherichia coli (STEC) are implicated in diarrhea both in humans and ruminants, and can cause more serious diseases in man, such as Hemolytic Uremic Syndrome (HUS). STEC are defined by the production of an or more types of shigatoxin (Stx1 and Stx2) through the genes stx1 and stx2. EPEC are defined by the presence of the gene eae, which encodes the intimin necessary for the attack to the intestinal mucous membrane producing a lesion of the type "attaching and effacing ". This work had an objective of determining the frequency of STEC and EPEC of bubaline origin through the detection of genes stx1, stx2 and eae and other virulence genes. 194 fecal samples, 62 of milk and four of water were tested, totaling 260 samples. All dairy farms were located in the region of Ribeirão Preto-SP. After a screening by PCR aiming stx1, stx2 and eae, isolates from positive samples were submitted to a PCR for detection of the genes stx1, stx2, eae, ehxA, efa1, saa, lpfAO113, lpfAO157/OI-141, lpfAO157/OI-154, toxB, iha and bfp, biochemical 1 Doutorandos PPGM da FCAV-UNESP, bolsista da *FAPESP, **CAPES 2 Professor Assist. Doutor da UNESP – Campus de Dracena 3 Professor Titular da FCAV-UNESP, Rod. Paulo Donato Castelane, Km 5, CEP14884-900, JABOTICABAL/SP, [email protected] bolsista de produtividade CNPq. Apoio Financeiro da FAPESP

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tests and resistance to antimicrobials. There were isolated 33 isolates of Escherichia coli in which 21 (63,6%) were STEC and 12 (36,4%) were EPEC. It was found 23 different genetic profiles. The isolates presented sensitivity to almost all tested drugs, being resistant only to cephalothin. The results showed that buffalos are important reservoirs of STEC and EPEC and the presence of isolates containing virulence genes should be more studied. Key-words: Buffalo, virulence genes, STEC, EPEC.

Estudos epidemiológicos revelam que, independentemente do sorogrupo, é a presença dos genes que codificam para a toxina Shiga-like 2 (stx2) e intimina (eae) que está associada a doença severa (WERBER et al., 2003). Outra importante categoria de E. coli é a enteropatogênica (EPEC), que pode causar diarréia severa, principalmente em crianças e neonatos em países em desenvolvimento (STELLA et al., 2008). Em STEC, assim como em EPEC, outros fatores de virulência estão localizados cromossomalmente em uma ilha de patogenicidade denominada locus of enterocyte effacement (LEE), cujos genes codificam os elementos responsáveis pela lesão intestinal A/E (attaching and effacing). Essa lesão é caracterizada pela degeneração localizada nas microvilosidades epiteliais intestinais e a montagem de estruturas semelhantes a pedestais, constituídas de filamentos de actina, formadas nos locais onde há bactérias aderidas (Nataro, Kaper, 1998). Além desses genes de virulência STEC e EPEC podem possuir outros, como o gene ehxA, que codifica uma hemolisina responsável pela formação de poros, os genes iha, efa1, toxB, lpfAO157/OI-141, lpfAO157/OI-154, lpfAO113 e saa que codificam adesinas (TOMA et al., 2004).

Os objetivos desse trabalho foram: determinar a frequência de STEC e EPEC de amostras de fezes retal, leite e água de bebedouros em fazendas de búfalos leiteiros na região de Ribeirão Preto-SP, através da pesquisa dos genes stx1, stx2, eae iha, efa1, toxB, lpfAO157/OI-

141, lpfAO157/OI-154, lpfAO113, saa, ehxA e bfp; caracterização bioquímica e determinar o perfil de resistência das estirpes de STEC e EPEC isoladas frente a diferentes drogas antimicrobianas.

Foram utilizadas 194 amostras de fezes, 62 amostras de leite, e 4 amostras de água de bebedouros colhidas de três diferentes fazendas de búfalos leiteiros do Estado de São Paulo,no ano de 2010. As amostras de leite foram colhidas em tubos Falcon estéreis com capacidade para 50 mL. As fezes foram colhidas diretamente do reto dos animais adultos e jovens utilizando suabe estéril que foi colocado em tubo de ensaio contendo 5 mL de água peptonada. As amostras de água foram colhidas em frascos estéreis de 500 mL. As amostras de água foram filtradas em membranas millipori (0,65 mµ), sendo filtrado 100 mL de cada amostra. Essas membranas foram depositadas sobre uma placa contendo ágar MacConkey e foram incubadas a 35°C por 24h. As amostras de leite foram semeadas em ágar MacConkey e incubadas por 24h a 35º C e as de fezes foram transportadas em frascos contendo água peptonada e depositadas em tubos contendo caldo verde-brilhante (VB), incubadas a 35°C por 24h. Cada tubo com caldo VB foi semeado em placas contendo ágar MacConkey, incubando-as a 35°C por 24h. O DNA template foi preparado a partir do crescimento confluente no ágar MacConkey e submetidas primeiramente a uma triagem por PCR (KESKIMAKI et al., 2001) para a determinação dos genes stx1, stx2 e eae. As amostras positivas nesta PCR foram isoladas e testadas novamente por PCR para confirmar a presença dos genes stx1, stx2 e eae. As amostras positivas na PCR confirmatória foram semeadas em placas contendo ágar infusão de cérebro coração (BHI) incubadas a 35o C por 24 horas para obtenção de colônias isoladas e e analisadas novamente por PCR para se encontrar os genes efa1, saa, ehxA, bfp, lpfAO113, lpfAO157/OI-141, lpfAO157/OI-154, iha e toxB e depois submetidas a testes de sensibilidade a antimicrobianos pelo método de difusão em disco Kirby-Bauer segundo recomendação do National Committee For Clinical Laboratory Standards (2003). Os antimicrobianos testados foram: ampicilina (10µg), cefalotina (30µg), ácido nalidíxico (30µg), ciprofloxacina (5µg),

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cloranfenicol (30µg), tetraciclina (30µg), estreptomicina (10µg), gentamicina, (10µg), nitrofurantoína (300µg) e sulfametoxazol+trimetoprim (25µg).

Os resultados demonstraram a presença de 76 (29,2%) amostras positivas do total de 260 amostras na PCR de triagem das quais 1 (1,3%) para stx1, 47 (61,8%) para stx2, 11 (14,5%) para eae, 1 (1,3%) para stx1 e eae, 4 (5,3%) para stx2 e eae, 7 (9,2%) para stx1 e stx2, 5 (6,6%) para stx1, stx2 e eae. A partir das 76 amostras positivas na PCR de triagem foram isoladas 33 (43,4%) estirpes, todas isoladas de fezes. Nenhum dos isolados continha os 12 genes pesquisados, porém todas apresentaram mais de um gene de virulência. Foram encontrados 23 perfis genéticos diferentes. A maior resistência foi observada para a cefalotina 51,5%. As amostras analisadas apresentaram genes de virulência que estão relacionados à graves doenças transmitidas ao homem, evidenciando que búfalos podem ser considerados como reservatórios de STEC e EPEC. Referências Bibliográficas

KESKIMAKI, M.; EKLUND, M.; PERSONEN, H. et al. EPEC, EAEC and STEC in stool specimens: Prevalence and molecular epidemiology of isolates. Diagnostic microbiology and infectious disease, New York, v. 40, n. 4, 2001. NATARO, J. P.; KAPER, J. B. Diarrheagenic Escherichia coli. Clin Microbiol Vet. Washington, v.11, n.1, p. 142-201, 1998. NATIONAL COMMITTEE FOR CLINICAL LABORATORY STANDARDS. Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests. Approved standards. Document M2-A8. Wayne: NCCLS, 2003. 58 p. STELLA, A.E.; RIGOBELO, E.C.; OLIVEIRA, A.C. et al. Ocorrência e sensibilidade microbiana de linhagens de Escherichia coli, Brasil. Veterinária e Zootecnia, v. 15, n.1, p. 66-74, 2008. WERBER, D.; FRUTH, A.; BUCHHOLZ, U. et al. Strong Association Between Shiga Toxin-Producing Escherichia coli O157 and Virulence Genes stx2 and eae as Possible Explanation for Predominance of Serogroup O157 in Patients with Haemolytic Uraemic Syndrome. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis., v. 22, p. 726–730, 2003.