IV Mostra de Pesquisa da Pós-Graduação – PUCRS, 2009

IV Mostra de Pesquisa da

Pós-Graduação PUCRS

Freqüência de alelos HLA A, B e DRB1 em uma amostra de doadores

voluntários de medula óssea do estado do Rio Grande do Sul

Andréa Silveira Bortolotto, Márcia Fernanda Petry, Eduardo André Gomes Krieger, Fábio Bondar,

Sandra Regina Fernandes, Jorge Neumann, Cristina Bonorino

Programa de Pós Graduação em Biologia Celular e Molecular, Faculdade de Biociências, PUCRS,

Resumo

As moléculas HLA (Human Leucocyte Antigens) são proteínas presentes na membrana

da maioria das células nucleadas e estão envolvidas em processos de resposta imunológica. A

determinação das freqüências alélicas para esse locus é importante para a compreensão de

mecanismos associados à suscetibilidade ou resistência a determinadas doenças. Essas

moléculas também estão fortemente associadas ao alorreconhecimento de antígenos em

transplantes de órgãos que desencadeiam a ativação de linfócitos e o processo de rejeição do

enxerto. Existem estudos prévios de freqüência HLA na população brasileira, porém no Rio

Grande do Sul essa determinação só foi realizada utilizando métodos sorológicos de tipagem.

No Brasil, cada indivíduo candidato à doação voluntária de medula óssea passa por um

processo de cadastro e coleta de sangue para análise da tipagem genética de proteínas HLA. O

Laboratório de Imunologia de Transplantes da Santa Casa de Porto Alegre é um dos

laboratórios do Brasil credenciados para a realização desse processo. Esses dados são

registrados no REDOME (Registro Brasileiro de Doadores de Medula Óssea) para buscas por

doadores compatíveis com receptores em espera por um transplante de medula. O presente

trabalho utiliza os dados obtidos junto a esse banco. O objetivo deste projeto é identificar as

freqüências de alelos HLA no Rio Grande do Sul.

Introdução

As moléculas HLA (Human Leucocyte Antigens) são proteínas presentes na membrana

da maioria das células nucleadas e estão envolvidas em processos de resposta imunológica.

Elas são codificadas por genes localizados no braço curto do cromossomo 6, na região do

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MHC (major histocompatibility complex). Os dois tipos de genes MHC polimórficos

chamados genes MHC de classe I e II (Figura 1), codificam dois tipos de proteínas

responsáveis pela apresentação de peptídeos processados às células T. As moléculas HLA de

classe I (HLA A, B e C) são reconhecidas por células TCD8+, e as moléculas de classe II

(HLA DR, DQ, DP) por células TCD4+. (Abbas, 2005). O sistema HLA é altamente

informativo em estudos de genética de populações, devido ao seu elevado polimorfismo e ao

forte desequilíbrio de ligação entre locus próximos. (Bordner, 199). A última estatística

indica que estão descritos 767 alelos para HLA-A, 1178 para HLA-B e 618 para DRB1. (EBI,

2009)

Além disso, sua determinação é importante para a compreensão de mecanismos

associados à suscetibilidade ou resistência a determinadas doenças. (Caillat-Zucman, 2008).

Essas moléculas também estão fortemente associadas ao alorreconhecimento de antígenos em

transplantes de órgãos. No Brasil, existem estudos prévios de freqüência HLA, porém no Rio

Grande do Sul essa determinação só foi realizada utilizando métodos sorológicos de tipagem

(Trachtenberg, 1986.).

O estado do Rio Grande do Sul é formado por uma população de aproximadamente 10

milhões de habitantes, dos quais mais de 1,4 milhões vivem em Porto Alegre. A distribuição

racial no Rio Grande do Sul é caracterizada por 82.3% de brancos, 5.9% de negros, 11.4%

de pardos e 0.4% amarelos ou ameríndios.(IBGE, 2008)

O objetivo do presente estudo é determinar a freqüência alélica de HLA A, B e DRB1

na população do Rio Grande do Sul utilizando métodos moleculares de tipagem, gerando

assim, dados para estudos de genética de populações, imunogenética de doenças autoimunes e

transplante.

Figura 1 Estrutura das moléculas HLA de classe I e II

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Metodologia

Estudo transversal realizado em uma amostra de doadores voluntários de medula óssea

cadastrados no REDOME. Os dados de raça foram informados pelos doadores e todos

possuem consentimento informado.

A coleta das amostras de sangue, o cadastro dos doadores e a tipagem HLA foram

realizados no Laboratório de Imunologia de Transplantes da Santa Casa de Porto Alegre. A

purificação de DNA foi realizada utilizando o kit comercial QIAamp Mini Qiagen, conforme

instruções do fabricante. Para a tipificação HLA foi utilizado o kit LABType® SSO One

Lambda aliado à tecnologia Luminex. Esse método de PCR utiliza primers biotinilados. O

material amplificado passa por um processo de desnaturação e posterior hibridização com

sondas ligadas a microesferas (beads) que fazem parte do sistema multianalítico Luminex.

Cada bead é marcada com uma determinada fluorescência e possui uma sonda de

oligonucleotídeo correspondente a um alelo HLA ou a um grupo de alelos HLA. Após a etapa

de hibridização as sondas que hibridizaram com o DNA são marcadas com uma solução

SAPE (estreptavidina conjugada com ficoeritrina). O citômetro de fluxo LABScan 100 é

capaz de reconhecer a fluorescência da bead e da SAPE ligada à sonda. Os dados gerados pelo

aparelho foram analisados no software HLA Fusion para a determinação da tipagem HLA.

A análise de freqüência alélica será calculada por contagem direta através do software

ARLEQUIN 3.1 (Excoffier, 2005).

Referências ABBAS, A; LICHTMANN, A., Cellular and Molecular Immunology. Local de Edição: Editora. 2008. BORDNER, J., HLA and anthropology. In: Terasaki P, Gjertson DW. HLA1997. Los Angeles: UCLA Tisuue Typing Laboratory, 1997. P 45-59 CAILLAT-ZUCMAN, S., Molecular mechanisms of HLA association with autoimmune diseases. Tissue Antigens. Vol 73, (2008) pp. 1-8 EBI; European Bioinformatics Institute. 2009 Disponível em: http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/stats.html . Acesso em 06 de junho de 2009 EXCOFFIER, L. G. Laval, and S. Schneider (2005) Arlequin ver. 3.0: An integrated software package for population genetics data analysis. Evolutionary Bioinformatics Online 1:47-50 IBGE – Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística. Contagem da população 2007 e Síntese dos Indicadores Sociais 2008. http://www.ibge.gov.br TRACHTENBERG, A., O polimorfismo HLA no Rio Grande do Sul – Freqüências em normais e doentes, sobrevida de transplantes. Porto Alegre: UFRGS, 1986. Tese (Doutorado em Genética), Faculdade de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, 1986.

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