UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARAN SETOR DE TECNOLOGIA DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUMICA

FRASCOS AGITADOS E PREPARO DE INCULO

Trabalho acadmico apresentado disciplina Processos Fermentativos Industriais da Universidade Federal do Paran.

CURITIBA 2008

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SUMRIO

1.

CULTIVO EM FRASCOS AGITADOS ................................................................. 2 1.1. 1.2. 1.3. SOLUBILIDADE DO OXIGNIO GASOSO ................................................... 4 DEMANDA DE OXIGNIO PELOS MICRORGANISMOS ............................. 8 EQUIPAMENTOS NECESSRIOS ............................................................. 11 Frascos ................................................................................................ 11 Tampas ................................................................................................ 14 Agitadores ............................................................................................ 16

1.3.1. 1.3.2. 1.3.3. 2.

PREPARO DE INCULO .................................................................................. 18 2.1. 2.2. 2.3. 2.4. CONDIES DO INCULO ....................................................................... 22 INCULO DE LEVEDURAS........................................................................ 23 INCULO DE BACTRIAS ......................................................................... 24 INCULO DE FUNGOS FILAMENTOSOS ................................................. 26

3. 4.

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS .................................................................. 29 ANEXOS ............................................................................................................ 31

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1. CULTIVO EM FRASCOS AGITADOS

Os frascos agitados so freqentemente usados na biotecnologia. Apesar de sua grande importncia prtica, muito pouco tem se estudado sobre as propriedades e caractersticas de uma cultura agitada. Eles podem variar em volume de 25 mL at 6 L (em alguns casos podendo chegar at 60 L). Pode-se tambm designar como frascos agitados tubos de ensaio de cerca de 10-25 mL e as microplacas de 120L a 3 mL. Esses frascos podem ou no ser equipados com chicanas (tambm chamados de septos ou baffles), as quais so feitas de vidro ou de plstico. A cultura em frascos imveis til para a produo de pequenas quantidades de cultivos de fungos para serem inoculados em substratos slidos. A vantagem desse mtodo frente ao cultivo slido a fcil deteco de contaminao por outros microrganismos e a facilidade de determinao da biomassa. O problema desse tipo de cultura esttica a transferncia de oxignio, pois h uma dependncia na superfcie de transferncia entre a fase lquida e gasosa, e por isso frascos de Erlenmeyer de 500mL podem conter somente 100mL de meio de cultura. Uma nova era na fermentao iniciou-se com a introduo em 1933 da tcnica de agitao de frascos por Kluyver e Perquin. Essa tcnica de agitao (chamada pelos autores de Schttelkultur) foi desenvolvida inicialmente para cultivo em escala laboratorial, mas logo passou tambm a ser utilizada em algumas fbricas, como na fabricao de antibiticos. Na indstria, o cultivo em frascos possibilita realizar inmeras fermentaes de uma s vez, enquanto o cultivo em vrios biorreatores ao mesmo tempo economicamente invivel devido aos custos do equipamento. Kennedy et al.(1994), citado por BCHS (2001), argumentou que "no existe nenhuma outra forma de se fazer a otimizao do meio seno em frascos agitados simplesmente porque o nmero de experimentos a serem conduzidos muito grande. O efeito das diferentes componentes do meio relativo, e por isso o melhor meio obtido em frasco agitado tambm ser o melhor meio tanque.". Esta ltima afirmao tem de ser considerada com cautela, pois no se pode pressupor que os microrganismos iro agir de uma maneira equivalentes nos dois tipos de cultivo. Frascos agitados so freqentemente utilizados para a cultura de bactrias, fungos, leveduras, e algumas clulas animais e vegetais. Dependendo do microrganismo estudado, os parmetros operacionais de um cultivo agitado podem

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influenciar significativamente os resultados. Estes tipos de interaes so muitas vezes esquecidos ou ignorados pelos pesquisadores. preciso ter conhecimento e controle dos fenmenos hidrodinmicos, da transferncia de gases e dos parmetros fsicos que influenciam as culturas durante o processo de agitao. Isso ir garantir uma reprodutibilidade e confiabilidade nos resultados obtidos na fermentao. Vrias etapas de um processo biotecnolgico podem empregar frascos agitados, como a seleo de um tipo selvagem com uma caracterstica especfica, melhoramento gentico e mutao, desenvolvimento de cepas recombinantes, elucidao de vias metablicas, optimizao de meios de cultivo, estabelecimento de protocolos analticos, e investigao das condies bsicas do processo como a estabilidade, a taxa inoculao, o pH e a temperatura ideal, o tempo de cultivo e a avaliao dos dados cinticos. Os frascos agitados utilizados na etapa de screening e melhoramento do processo geralmente contm meios lquidos complexos baseados em fontes de carboidratos e nitrognio (como bagao, milhocina, melao de soja, entre outros). Esses substratos so consumidos em diferentes velocidades, e esse tempo de consumo ir influenciar a manuteno das condies timas para o crescimento. Materiais slidos como cal podem ser adicionados para manter o controle do pH e a formao de agregados celulares (como pellets). Quando utilizados meios quimicamente definidos deve-se monitorar com mais cuidado as variaes de pH e falta de substrato. Segundo BCHS (2001), pode-se supor que provavelmente mais de 90% de todas as experincias em biotecnologia envolvem um cultivo em frascos agitados. No entanto, o estudo da cultura nesses frascos geralmente subestimado pelos profissionais da rea por se tratar de um experimento com equipamentos muito simples e ser utilizado principalmente na primeira etapa de um bioprocesso. Algumas variveis importantes no processo de agitao so: o tipo de frasco, a sua geometria e dimenso (volume nominal), o tamanho e o nmero de chicanas (se houver), as propriedades da superfcie da parede interior do frasco, o dimetro da rbita de agitao, volume preenchido pelo meio de cultura e a freqncia de agitao. Os experimentos em frascos agitados muitas vezes so realizados de forma imprecisa e sem a determinao desses parmetros, inviabilizando a reprodutibilidade em outros laboratrios. A determinao incorreta e o

desconhecimento dos parmetros ideais para uma cultura em frascos agitados

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podem gerar perdas de produtividade, inculos mal desenvolvidos, seleo de microrganismos no-desejados, meios de cultivo inadequados, e gastos econmicos desnecessrios. Apesar dos frascos agitados apresentarem problemas como o pequeno controle nas transferncias gasosas, na eficincia da mistura e no monitoramento contnuo das condies, eles so valiosos para o desenvolvimento de processos.

1.1.

SOLUBILIDADE DO OXIGNIO GASOSO

A taxa de transferncia de oxignio de extrema importncia no desenvolvimento de um processo fermentativo industrial. Vrios microrganismos necessitam da presena de oxignio para poder sintetizar seus produtos, e por isso cada vez mais necessrio conhecer a respirao celular e a demanda de oxignio de cada espcie. As enzimas respiratrias esto todas presentes na fase aquosa, portanto, os microrganismos podem utilizar apenas o oxignio dissolvido, mesmo quando eles crescem na interface ar-gua. Alm disso, o oxignio to insolvel que existem somente pequenas quantidades disponveis para as clulas. Como mostra a Figura 1, o transporte da molcula de O 2 precisa passar por uma srie de barreiras, formando gargalos (ou estrangulamentos) que diminuem a transferncia de oxignio para a clula. Aquele que for o mais difcil de se transpor ser o fator que controla esse transporte. Se, por exemplo, houver uma etapa limitante na transferncia de oxignio na interface gs-lquido, como mostra a exclamao na figura, ento o melhoramento gentico do microrganismo no teria muito efeito na produo, a no ser que o melhoramento seja com relao via respiratria. O papel do oxignio dissolvido no meio de cultivo bastante importante no metabolismo celular e na sntese de compostos, e isso j bem conhecido desde a poca de Pasteur. No entanto, publicaes recentes s vezes do pouca ateno para a questo do abastecimento de oxignio, talvez devido incerteza quanto sua classificao como um fator fsico ou qumico que afeta o crescimento.

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Figura 1- Barreiras no transporte de substncias.

Fonte: BCHS, 2001.

O oxignio um gs pouco solvel em gua a 20 C e 1 atm. Nestas condies, somente 9 ppm de oxignio se dissolvem em gua. medida que a temperatura levantada, oxignio, como qualquer outro gs, torna-se insolvel. Por exemplo, 37 C, menos de 7 ppm de oxignio so solveis em gua. A solubilidade de oxignio substancialmente independente da presso total e da presena de outros gases. Ela , no entanto, diretamente proporcional presso parcial de oxignio na fase gasosa. Este fato conhecido como a lei de Henry, a qual pode ser escrita como: (1) onde H' uma constante da lei de Henry baseada na concentrao molar e a presso parcial expressa em atmosferas. O asterisco em C denota concentrao no lquido em equilbrio. A solubilidade deve ser expressa como uma frao molar, mas para gases pouco solveis, o erro pequeno ao se utilizar a molaridade como proporcional frao molar. A Lei de Henry prev que, em uma atmosfera de oxignio puro, gua ir dissolver cerca de cinco vezes mais que o oxignio no ar, onde a presso parcial apenas 0,21 atm. Umbreit, Burnis, e Stauffer, citado por FINN (1954), apresentaram dados sobre o efeito de sais dissolvidos na solubilidade de oxignio. Estes e outros dados

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na literatura so muitas vezes expressos em termos de um coeficiente de Bunsen, denominado de . O coeficiente de Bunsen deve ser multiplicado

por 1.000 / 22,4 para se obter H', que mais conveniente na anlise dos estudos. Em caldos nutrientes saturados com ar a 25 C, o valor de C* aproximadamente 0,20 mM por litro, e o valor de H' prximo unidade. A quantidade de compostos dissolvidos no meio de cultivo pode influenciar a solubilidade de oxignio e o coeficiente de difuso KL. Geralmente em grandes quantidades de compostos dissolvidos h uma menor solubilidade do oxignio. Isso afetar o crescimento celular e a formao de produtos metablicos. A taxa de transporte de oxignio pelo meio lquido proporcional rea de interface, e pode ser tambm expressa de acordo com a seguinte frmula: (2) onde a a rea de interface, C* a concentrao na interface lquido-gs obtido pela lei de Henry, C a concentrao real do oxignio no lquido e K L o coeficiente global de transferncia de massa. O recproco 1/K L igual soma das resistncias presentes (no filme de gs, na interface, e no filme do lquido). Quando estas resistncias so grandes, KL pequeno e vice-versa. O artigo em ANEXO 1 mostra em alguns detalhes a transferncia de oxignio nas culturas em frascos agitados, a anlise de alguns parmetros fsicos e a construo de alguns modelos matemticos. Um fato cotidiano em uma pesquisa a interrupo da agitao para o recolhimento de amostras. Isso um fator que pode afetar a taxa de transferncia de oxignio. Como mostra a Figura 2, durante o cultivo de Bauveria densa, em frascos de 250mL com volume de meio de 40mL agitados 200 rpm, quando se faz uma pausa na agitao (indicada pela seta), h uma queda do oxignio disponvel e conseqentemente na atividade respiratria. O fato de durante a amostragem h uma interrupo do fornecimento de oxignio muitas vezes esquecido pelos pesquisadores. A questo da disponibilidade de oxignio muitas vezes ignorada por microbiologistas, sendo considerada como um problema insolvel. No entanto, uma forma de tentar resolv-lo atravs da utilizao de frascos com chicanas (ou baffles). Quando elevadas quantidades de oxignio so necessrias, a utilizao de chicanas ir proporcionar uma maior transferncia de oxignio em freqncias de

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agitao no to altas. As chicanas tambm proporcionam um maior estresse hidromecnico, o qual pode ser vantajoso dependendo do caso, com, por exemplo, no impedimento da formao de pellets muito grandes.

Figura 2- Transferncia de oxignio ao se parar o agitador.

Fonte: BCHS, 2001.

O volume de meio presente no frasco tambm influencia bastante a transferncia de oxignio. Quanto menor o volume de meio no frasco, melhor ser a taxa de transferncia de oxignio (OTR). A melhor transferncia de oxignio ocorre, por exemplo, quando o volume de meio em um Erlenmeyer de 250mL de 50 mL. Isso um problema, pois volumes muito pequenos de meio fermentado podem gerar pouca produtividade. Volumes pequenos tambm s podem ser utilizados em fermentaes de pouca durao, pois, caso contrrio, ir acontecer evaporao do meio de cultivo e os nutrientes ficaro muito concentrados. Fungos so microrganismos que necessitam de grandes quantidades de oxignio para se desenvolverem. Portanto, ideal utilizar pequenos volumes de meio, chegando no mximo at 15% do volume total do frasco. J bactrias so microrganismos que necessitam de menores quantidades de O 2 para se desenvolverem, logo, possvel utilizar frascos contendo um volume de meio de cultivo maior. No trabalho de JNICKE et al. (2007), observou-se que o aumento no volume de meio do frasco e o aumento do dimetro do frasco tiveram efeito negativo na taxa

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de transferncia de oxignio, enquanto o aumento da freqncia de agitao e no dimetro da rbita aumentou essa taxa (Figura 3).

Figura 3- Variao da OTR com relao ao dimetro do frasco e volume do meio

Fonte: JNICKE et al., 2007.

1.2.

DEMANDA DE OXIGNIO PELOS MICRORGANISMOS

A demanda de oxignio pelos cultivos microbianos elevada, e a taxa de abastecimento deve ser no mnimo igual essa taxa de demanda em cada poro do meio lquido. Caso contrrio, aparecero locais em que h uma depleo temporria ou contnua no fornecimento de oxignio para as clulas executarem a respirao. Tais danos foram demonstrados por Hromatka, Ebner e Csoklich, citado por FINN (1954), que observaram que a interrupo do fluxo de ar no cultivo de Acetobacter por 15 segundo e causou morte celular e perturbou o metabolismo. Uma cultura lquida deve ser mantida com o ar saturado em todos os momentos. Essa condio dificilmente mantida em culturas aerbias, mas, felizmente para microbiologistas, no h necessidade de manter culturas saturadas com ar. A

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respirao celular acontece a uma taxa que independente da concentrao de oxignio dissolvido desde que este ltimo se mantenha acima de um valor crtico. Para os organismos unicelulares esse valor crtico extremamente baixo, como mostra a Tabela 1.

Tabela 1- Valores tpicos de C crtico na presena de substrato.

Fonte: FINN, 1954.

Abaixo do nvel crtico de oxignio, a taxa de respirao cai de maneira hiperblica. Em uma srie de experimentos com clulas de levedura, Winsler, citado por FINN (1954), demonstrou que, em baixa tenso de oxignio, a respirao limitada pela insaturao das enzimas e no devido difuso lenta de oxignio pelo citoplasma. Ele utilizou o fato de que o monxido de carbono funciona como um inibidor competitivo, deslocando o oxignio da citocromo oxidase da levedura. Com misturas de CO - O2, uma queda da taxa de respirao foi observada em condies em que a tenso de oxignio era to elevada que a difuso de O 2 no poderia ser considerada como um fator limitante. Longmuir (1954) realizou estudos de C crtico para bactrias. Ele observou que essencialmente o C crtico variado com relao forma e o tamanho do organismo: quanto maior as bactrias, maior nvel crtico de oxignio. A difuso de oxignio mais difcil para organismos multicelulares ou aglomerados de clulas unicelulares.

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A indisponibilidade de oxignio no meio de cultivo um dos problemas mais freqentes associados com a aplicao de frascos agitados, e pode causar uma srie de efeitos no microrganismo, como: Todo o metabolismo dos microorganismos desacelerado estabelece com nenhuma outra conseqncia bioqumica. Neste caso, experincias em que o mesmo nvel de oxignio o fator limitante, pequenas diferenas na geometria do frasco e nas condies de agitao daro resultados semelhantes e no podero ser observadas diferenas de atividade microbiana. Mudana para um metabolismo parcialmente anaerbico, excretado

subprodutos como cidos e lcool. Isso ir alterar o valor do pH e inibir o crescimento das clulas. O produto de formao tem significativas implicaes sobre a atividade metablica e a cintica de crescimento. Reao ao oxignio fornecido com relao a formao do produto metablico desejado. Futatsugi et al., citado por BCHS (2001), publicaram que a produo de glucoamilase extracelular por Saccharomycopsis fibuligera em diferentes tipos de biorreatores (incluindo frascos agitados) est

correlacionada a taxa de transferncia de oxignio. O crescimento desse microrganismo no era afetado pela limitao de oxignio, mas a produo da enzima sim. Mudana completa do metabolismo. Produtos secundrios que so sintetizados somente em condies especficas podem desaparecer do meio de cultivo na limitao de oxignio. Por exemplo, Heinemann et al., citado por BCHS (2001), compararam dois experimentos com cultura de Serratia marcescens, sendo que a nica diferena entre os dois conjuntos experimentais foi que um apresentava frascos com chicanas e outro sem chicanas. Em frascos com chicanas, houve a produo de um composto de ao antibitica e quase nenhuma formao da enzima asparaginase. J em frascos sem chicanas, ocorreu uma mudana da via metablica e encontrouse grandes quantidades da enzima e nenhuma quantidade do composto antibitico. Isso ocorreu devido ao nvel de oxignio dissolvido no meio. Em alguns processos de fermentao, h a presena ou formao de compostos qumicos txicos para os microrganismos. Nesses sistemas, os

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compostos txicos podem ser continuamente difundidos para o interior da clula. O organismo pode reagir produzir energia suficiente para excretar a substncia txica ou contrabalanar o efeito nocivo de um composto txico convertendo-o em um composto menos txico. Se nesses casos, o fornecimento de oxignio esteja comprometido, os microorganismos sero incapazes de obter energia suficiente para metabolizar esses compostos e morrero rapidamente.

1.3.

EQUIPAMENTOS NECESSRIOS

1.3.1. Frascos

Os frascos utilizados no cultivo de organismos variam em forma, tamanho e tipo de material (Figura 4) de acordo com a finalidade do processo. Como j foi dito anteriormente, eles podem variar em tamanho indo de microplacas at Erlenmeyers. Atualmente, as bandejas dos equipamentos de agitao j possuem estruturas de adaptao para os variados tamanho, fixando-o na base atravs de garras, fitas adesivas, ou estantes de tubos, como mostra a Figura 5.

Figura 4- Alguns tipos de frascos.

Fonte: TABORSKY, 1992. Figura 5- Formas de fixao dos frascos no shaker.

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Fonte: < http://www.nbsc.com > Frascos normais sem chicanas apresentam um movimento de rotao bem definido e uniforme e uma rea de transferncia gs-lquido bem definida. Isso proporciona uma modelagem matemtica do modelo e clculo da rea de transferncia. O clculo de fatores em um frasco agitado muito mais simples do que em um cultivo em biorreatores devido menor quantidade de variveis, como mostra a Figura 6. Em biorreatores, os fenmenos fsicos como a formao de bolhas, a disperso dessas bolhas, a separao gs lquido no topo, a gerao de espuma, entre outros fatores devem ser levados em considerao. J em frascos agitados, muitos desses fatores no esto presentes, facilitando a determinao da transferncia de gases. Isso de extrema importncia no processo de seleo de microrganismos, e por isso so utilizados geralmente frascos nessa etapa do trabalho. Figura 6- Comparao de fatores no cultivo em frascos e em fermentador.

Fonte: BCHS, 2001.

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Alguns frascos podem conter estruturas chamadas de chicanas (ou baffles), que so geralmente invaginaes na parede do vidro. Elas promovem um fluxo do lquido em regime totalmente catico, com condies de escoamento bastante diversificadas. A maior agitao do meio lquido devido presena desses septos pode gerar a formao de espirros de meio lquido na tampa do frasco. No caso de tampas de algodo, que so as mais utilizadas, se ela estiver molhada devido a esses respingos, haver uma reduo na permeabilidade de gs pelo tampo e poder ocorrer uma contaminao do meio. Se a velocidade de rotao em frascos com chicanas gerar um valor de KLa antes da tampa fique molhada menor que o encontrado frascos sem chicanas, mas com velocidades mais altas, ento recomendvel trabalhar com o frasco normal. A aplicao de chicanas no sempre recomendvel. Elas so geralmente feitas mo em uma vidraria e, portanto, no so reprodutveis com relao geometria e ao tamanho, gerando diferenas significativas em termos de transferncia de oxignio entre os frascos. Dados provenientes de culturas em frascos com chicanas apresentam um desvio padro muito grande, pois pequenas diferenas na profundidade das projees do vidro ou no posicionamento delas causam diferenas significativas. Quando se deseja obter resultados uniformes em um grande nmero de frascos, necessrio utilizar frascos padronizados. Septos muito grandes tambm podem perturbar completamente a circulao do meio no interior do frasco deixando o sistema fora de fase e propiciando o crescimento nas laterais do frasco. As chicanas tambm tm influenciam a morfologia de fungos, como mostra o trabalho de GERLACH et al. (1998), pois aumentam a tenso de cisalhamento. Comparou-se frascos com dois e quatro septos com frascos normais sem septos, sendo todos cultivados com Aspergillus awamori em mesmas condies. Sem os septos e com dois septos observou-se um aumento da frao do volume celular com o tempo e depois foi atingido um valor constante de volume. No entanto, com quatro septos, aps um certo tempo, o valor da frao cai drasticamente. Com relao formao de pellets, observou-se que nos frascos com chicana no houve formao significativa de pellets, ao contrrio do frasco normal. Isso fica evidenciado na Figura 7 presente abaixo.

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Figura 7- Influncia de chicanas na morfologia do fungo.

Fonte: GERLACH et al., 1998.

1.3.2. Tampas

Diferentes tipos de tampas (ou tampes) podem ser utilizados para fechar a entrada do frasco. No entanto, no se deseja lacrar completamente o frasco, pois assim no haveria entrada do oxignio necessrio em fermentao aerbicas. Portanto, um bom tampo aquele que permite a entrada e sada de gases, mas evita a entrada de microrganismos contaminantes, mantendo a cultura axnica. Ele tambm serve para evitar partculas de aerossol proveniente da cultura escapem para fora do frasco e no ocorra grande evaporao do meio durante a autoclavagem e o cultivo. Para manter essas condies, o tampo no deve estar molhado, pois isso dificulta a passagem de gases e propicia a contaminao. A transferncia de gases pelo tampo no depende somente do material do qual ele feito, mas tambm do dimetro da abertura do frasco, do tamanho da profundidade do tampo, e da diferena de concentrao do gs dentro e fora do frasco. A transferncia de gs atravs do tampo estril descrita atravs do modelo de Henzler e Schedel, citado por MROTZEK et al. (2001), no qual a troca de gases no apenas descrita pela lei de Fick da difuso. Devem ser considerados novos aspectos como: a transferncia de gs por ao combinada de difuso e de conveco devido troca de massa (formando um fluxo descrito por Stefan); os coeficientes de difuso no so considerados como constantes, mas sim calculados em funo da concentrao de gs no local; e a considerao de um fluxo de vapor de gua, o qual um gs como oxignio, nitrognio ou dixido de carbono e, por isso, o coeficiente de difuso de vapor de gua em nitrognio proporcional ao coeficiente de difuso oxignio em nitrognio (D H2O-N2 DO2-N2).

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O tipo de tampo utilizado uma das resistncias transferncia de massa para a troca de gases em frascos agitados. A maior parte da literatura se preocupa com a resistncia transferncia de gs atravs da interface gs-lquido, sendo uma minoria aquelas que analisam a resistncia do tipo de fechamento do frasco. A resistncia transferncia de gases do tampo pode ser quantificada com relao resistncia de trocas de oxignio (KO2):

Vrios materiais (Figura 8) podem ser utilizados na fabricao de tampes, como algodo, gaze, espuma de poliuretano, material fibroso sinttico, filtros, entre outros. Os tampes de algodo so os mais utilizados, mas apresentam grande limitao na transferncia de gases. Essa transferncia ser facilitada medida que o tamanho da abertura do frasco aumenta e a grossura do tampo diminui.

Figura 8- Alguns tipos de tampo (algodo, papel, espuma, fibra de vidro, alumnio e silicone).

Fonte: MROTZEK et al., 2001.

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Segundo MROTZEK et al. (2001), a densidade do algodo e tamanho do tampo pouco influenciou a transferncia de gases. Algodo com uma densidade entre 0,06 e 0,25 g/cm3 reduz a troca de gases em relao a atmosfera entre 25 e 38%. Tampes de papel com uma densidade de 0,19 g/cm 3 reduz a troca de dixido de carbono em cerca de 37%. A fibra de vidro com densidade de 0,19 g/cm 3 reduz a troca gasosa de dixido de carbono em cerca de 25%, sendo essa resistncia menor do que no caso do algodo da mesma densidade. No entanto, fibra tem um maior peso especfico do que algodo. Por conseguinte, a resistncia provavelmente comparvel a uma porosidade semelhante. J a espuma de uretano reduz consideravelmente as trocas gasosas, pois os poros so provavelmente achatados e resultam em uma troca de gases mais baixa. Com relao s tampas de alumnio, seu resultado no foi reprodutvel devido no aderncia da tampa ao frasco e seu deslocamento durante a agitao. As tampas de silicone reduzem

consideravelmente a transferncia de gases. O artigo em ANEXO 2 mostra tambm o efeito de alguns tipos de tampes. Os pesquisadores tentaram ainda determinar se havia um aumento na transferncia de oxignio ao aumentar a rotao da cultura durante a utilizao do tampo que limita a transferncia.

1.3.3. Agitadores

Os agitadores, ou shakers (Figura 9), servem para auxiliar na transferncia do oxignio e na mistura da soluo. Esses equipamentos tm funcionamento continuo, e uma das razes para se ter um fornecimento de energia emergencial em um laboratrio para que os shakers estejam sempre funcionando. A bandeja onde so fixados os frascos livre de agitao externa e movimentada atravs de um motor que exerce movimentos contnuos de forma a agitar os frascos. Os equipamentos mais modernos possuem uma cabine e um sistema de controle de temperatura, proporcionando uma incubao do caldo a ser fermentado em condies timas mais controladas. Alguns shakers possuem tambm controle de iluminao (importante no cultivo de algas), de nvel de umidade e disponibilidade de gases.

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Figura 9- Exemplos de shakers.

Fonte: < http://www.nbsc.com >

Os frascos podem ser agitados em dois tipos de equipamentos, sendo que a diferenciao est no padro do caminho de agitao, como mostra a Figura 10. Um deles chamado de rotativo, orbital ou girotrnico, o qual realiza rbitas circulares de 50mm em mdia, movimentando a cultura suavemente e uniformemente dentro do frasco. A velocidade de agitao varia entre 100 e 500 rpm geralmente, mas em laboratrios usual no passar de 250 rpm. O outro tipo de agitador o de movimento recproco ou de movimento alternativo. Ele realiza o deslocamento do lquido em um padro diferenciado, com uma rbita alternativa. Esse tipo de agitao foi comumente utilizado no passado, mas tem perdido importncia nos ltimos anos. Ele utilizado geralmente para culturas de clulas animais e meios de cultivo viscosos.

Figura 10- Caminho do fluido em shaker rotativo (esquerda) e recproco (dieita).

Fonte: Adaptado de < http://www.biosan.lv/eng/index.php?page=multi-bio-3d >.

O aumento da rotao do shaker pode aumentar a taxa de transferncia de oxignio. Tambm pode ocorrer um aumento de danificao das clulas devido a

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essa agitao, sendo que necessrio encontrar a velocidade de agitao mais adequada para o processo. Freedman, citado por BCHS (2001), concluiu ao comparar os dois tipos de shakers que o padro de turbulncia criado no agitador rotativo no to afetado pelo meio, pela viscosidade, pelo incio da agitao, ou pelo volume do frasco. Este , segundo o pesquisador, o motivo pelo qual o agitador rotativo usado com maior freqncia no cultivo de microrganismos. Um fator importante na boa utilizao do equipamento para aumentar a sua vida til a distribuio adequada dos frascos. Isso importante para no desnivelar a bandeja devido ao peso excessivo em um dos lados e causar desgaste do motor. A manuteno ou a compra de equipamentos novos no muitas vezes economicamente vivel.

2. PREPARO DE INCULO

A realizao de uma fermentao em larga escala necessita do preparo de um inculo em menor escala. Inculo toda suspenso de clulas em concentraes adequadas capazes de conduzir economicamente um processo fermentativo de um dado volume de meio. A importncia desse inculo para o processo inteiro pode ser observada numa citao de Hockenhull: Uma vez que a fermentao iniciada, ela pode se tornar pior, mas nunca melhor.. Portanto, utilizar uma cultura de inculo de boa qualidade essencial. Um bom inculo dever: conter clulas saudveis e ativas, minimizando, assim, o perodo de adaptao das clulas ao meio de cultivo na fermentao seguinte; estar em volume suficiente para fornecer clulas na devida quantidade; estar em uma forma morfolgica adequada; estar livre de contaminaes; e manter as caractersticas de produo do produto desejado. Um dos fatores crticos na obteno de um inculo adequado a escolha do meio de cultura. Tal como no meio utilizado para a produo, o meio de inculo deve conter no apenas as necessidades de nutrio

do microrganismo, mas tambm os requisitos para a formao do produto. No entanto, como o inculo no tem como objeto produzir o produto, mas sim biomassa, a sua formulao pode ser diferente do meio de produo, possibilitando assim uma forma de reduzir alguns gastos.

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Geralmente utilizam-se meios para inculo suficientemente semelhantes ao da produo para diminuir a fase lag de crescimento, ou seja, o perodo de adaptao das clulas ao novo meio. A Tabela 2 mostra uma comparao entre alguns meios de inculo utilizados e os meios de produo. Pode-se notar que os meios para inculo so geralmente menos nutritivos do que os meios de produo e que contm nveis mais baixos de carbono.

Tabela 2- Meios de inculo e de produo utilizados para alguns processos.

Fonte: STANBURY, 1995.

Hockenhull, citado por STANBURY (1995), alerta para os perigos da utilizao de um meio muito diferente do usado em etapas posteriores. Grandes diferenas de pH, presso osmtica composio de nions pode resultar em mudanas bruscas nas taxas de consumo do substrato, que, por sua vez, vai afetar a viabilidade celular. Ele tambm enfatiza que nas culturas de produo de antibiticos, o meio utilizado no inculo deve fornecer uma quantidade suficiente de

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carbono e nitrognio para propiciar um grande crescimento at e transferncia, de modo que o metabolismo secundrio fique reprimido durante o crescimento do inculo. Se no ocorrer a represso do metabolismo secundrio, iro se desenvolver no inculo as variantes que produzem menos e crescem mais rpido, superando em nmero a quantidade de clulas que produzem mais metablitos e por isso crescem de maneira mais lenta. Hockenhull mostrou um exemplo como o trabalho de Righelato (1976) no qual foi trabalhada uma cultura quimioesttica de Penicillium chrysogenum sob condies limitadas de carboidratos, o que levou perda da capacidade de sntese da penicilina. No entanto, isso no ocorreu em condies em que a fonte limitada era de nitrognio, sulfato ou fosfato. Hockenhull tirou dessa informao que os inculos desse fungo produzidos sob condies no-limitantes so livres de variantes, enquanto que as variantes podem surgir freqentemente durante situaes de limite de carbono. O volume de inculo normalmente utilizado entre 3 e 10% do volume mdio da prxima fermentao. Os microrganismos de uma cultura provm inicialmente de um estoque, o qual deve passar por uma srie de cultivos at se chegar ao volume adequado para ser inoculado no fermentador de produo. Isso pode envolver algumas etapas de fermentao em frascos agitados e biorreatores de bancada, at se chegar a quantidade ideal, como mostra a Tabela 3. Em cada um desses processos h um risco grande de contaminao da cultura e degenerao do microrganismo devido a mutaes naturais, sendo que quanto maior o nmero de transferncias maior o risco. O desenvolvimento de um inculo geralmente passa pelas etapas descritas a seguir. A cultura principal conservada em meio slido, e aproximadamente 10 colnias que apresentam caractersticas de alta produtividade e morfologia adequada so inoculadas em meio inclinado para fazer um sub-cultivo. Esses subcultivos podem ser transferidos para frascos agitados de forma a testar a sua viabilidade e produtividade. So inoculados geralmente frascos de 250 a 500 mL contendo de 50 a 100 mL de meio de cultivo lquido. Aps o crescimento nesse frasco e verificao da produtividade, ele pode ser inoculado em um frasco maior, em um fermentador de escala laboratorial. Este, por sua vez, pode ento servir de inculo para um biorreator de escala industrial. s vezes, os testes de anlise

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podem no estar prontos antes da inoculao, mas, pelo menos, se houver algum problema, poder ser detectado depois em qual etapa ele estava. Um fator a ser considerado no nmero de etapas e tamanho do inculo a economia do processo. Por exemplo, um inculo de 10% do tamanho de um biorreator de fermentao em escala industrial representa um grande investimento financeiro, o qual s justificado se houverem vantagem com relao produtividade.

Tabela 3- Nveis de cultivo de um microrganismo.

Fonte: RUTTLOFF, PROLL & LEUCHTENBERGER, 1996.

O momento da transferncia do inculo de extrema importncia, pois a fermentao no pode ser contaminada durante esse processo. Nas indstrias, o processo de passagem do inculo de biorreatores de escala laboratorial para um de

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escala industrial envolve um sistema de vlvulas e canais de forma que todo o cultivo prossiga sem contaminaes indesejadas.

2.1.

CONDIES DO INCULO

A condio fisiolgica do inculo no momento da transferncia da cultura de extrema importncia no desenvolvimento da prxima fase do processo e se ter um grande efeito sobre o desempenho da fermentao. O melhor momento para a transferncia da cultura deve ser determinado experimentalmente e, em seguida, deve-se estabelecer procedimentos de modo a que inoculao ideal poa ser alcanada rotineiramente. Para garantir-se isso so realizadas padronizaes das condies de cultura e acompanhamentos do estado do inculo, de modo que a transferncia ocorra no tempo timo e estado fisiolgico correto. O critrio mais utilizado para a transferncia das estruturas vegetativas dos inculos

determinao da biomassa, a qual pode ser determinada atravs de parmetros como peso seco, peso mido, turbidez, respirao, concentrao residual de nutrientes, morfologia, entre outros. Ettler (1992), citado por STANBURY (1995), demonstrou que a anlise reolgica do meio de cultivo de Streptomyces noursei poderia ser usada como critrio na determinao do crescimento celular. A reologia do meio lquido mudava de newtoniana para no-newtoniana, e o momento em que ocorria essa mudana correspondia ao tempo ideal de crescimento do inculo. Mtodos de monitoramento on-line (como a quantidade do oxignio, do dixido de carbono, de algum gs efluente ou verificao do pH) so mais convenientes para usar como indicadores da qualidade do inculo. Parton e Willis (1990) defenderam a utilizao da taxa de produo de dixido de carbono (CPR) como um critrio de anlise de efluentes gasosos para a transferncia de inculo. Esta abordagem indicada apenas quando a transferncia est sendo feita a partir de um fermentador, pois mais difcil controlar a atmosfera gasosa de um frasco agitado. Nos ltimos anos, foram desenvolvidas novas sondas para anlise on-line da biomassa, as quais so inestimveis para determinar o tempo de transferncia ideal. Boulton et al. (1989) relataram a utilizao de um sensor de biomassa para controlar a adio de levedura (taxa de inculo) na produo da cerveja. A sonda mede a

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permissividade dieltrica de clulas viveis e no afetada pela presena de clulas mortas, bolhas ou detritos, tornando-a ideal para este caso. O artigo em ANEXO 3 mostra a influncia das condies do inculo no crescimento do fungo Penicillium chrysogenum. Foram analisados fatores como a soluo de diluio do inculo, a idade da cultura esporulante, a cepa utilizada e o tamanho do inculo. Cada microrganismo necessita de um preparo do inculo diferente, e isso levado em conta separadamente. A seguir sero discutidos os preparos de inculos de leveduras, bactrias, e fungos.

2.2.

INCULO DE LEVEDURAS

A maioria das fermentaes industriais que utilizam leveduras visa a produo de cerveja ou de biomassa. No entanto alguns processos recentes de produo de produtos recombinantes tambm necessitam do cultivo de leveduras. Na fabricao da cerveja, muitas vezes utilizada uma parcela da fermentao anterior como inculo para a prxima fermentao. No entanto, a realizao desse tipo de prtica pode resultar na introduo de contaminantes e na degenerao da cepa com relao eficincia de produo e capacidade de floculao. Muitas vezes para evitar esse dois problemas so utilizadas leveduras do meio (middle skimmings). Durante a fermentao, as clulas de levedura floculam e flutuam at superfcie. As primeiras clulas que fazem isso so mais floculantes e, quando a fermentao realizada em tambor aberto, so mais susceptveis contaminao. Clulas que ficam mais em baixo so aquelas com pouca capacidade de floculao. Portanto, ao pegar as leveduras que esto na camada do meio, estarse-ia pegando leveduras com boa capacidade de floculao e livres de contaminantes. Essas leveduras recolhidas podem tambm receber um tratamento antes de serem inoculadas na prxima fermentao para remover leveduras mortas e bactrias contaminantes atravs da reduo do pH para 2,5-3, lavagem com gua, lavagem com persulfato de amnio e tratamento com antibiticos como polimixina, penicilina e neomicina. A indstria cervejeira tambm utiliza fermentadores do tipo cilindro-cnico. Nestes sistemas a coleta de leveduras floculantes feita no cone no fundo do

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fermentador, o qual est sujeito a falta de nutrientes, altas concentraes de etanol, baixa atividade da gua, elevada concentrao de dixido de carbono

e de alta presso. Portanto, a viabilidade das clulas coletadas nesse local no seria o ideal para um inculo. Uma das principais caractersticas fisiolgicas de um bom inculo de levedura o nvel de esterol nas clulas. Esteris esto presentes na membrana celular e so necessrios para a sua sntese, mas eles so apenas produzidos na presena de oxignio. Como a produo de etanol realizada em condies anaerbicas, ao se injetar oxignio no inculo antes da inoculao, tem-se um aumento da quantidade de esterol para promover o crescimento celular inicial. A produo de leveduras para fermento de po envolve o desenvolvimento de um inculo atravs de um grande nmero de estgios aerbicos. Devido ao fato de que as fases da produo no poderem ser realizadas em condies totalmente asspticas, o uso de uma cultura pura como inculo de extrema importncia para manter o nvel de contaminao no incio o mais baixo possvel. Reed e Nagodawithana (1991), citado por STANBURY (1995), discutiram o desenvolvimento do inculo para a produo de fermento de panificao, a partir de um processo envolvendo oito fases, sendo as trs primeiras assptica enquanto que as restantes eram realizadas em tanque aberto. O fungo poderia ser bombeado diretamente de um frasco para o outro ou o inculo poderia ser centrifugado e lavado antes de transferncia, reduzindo assim o nvel de contaminao. O artigo em ANEXO 4 mostra a importncia da determinao adequada da concentrao celular da suspenso de leveduras. Na determinao do efeito de substncias antifngicas, necessria uma padronizao da quantidade de inculo utilizada. Esse artigo visava comparar quatro mtodos de determinao adequada da concentrao celular do inculo.

2.3.

INCULO DE BACTRIAS

O principal objetivo do inculo para o desenvolvimento fermentaes bacterianas produzir clulas ativas, as quais tero uma fase lag curta e ser possvel dar continuidade cultura. Fases lag longas no so vantajosas porque no s tempo perdido, mas tambm o meio de cultivo consumido durante a manuteno da viabilidade da cultura antes do crescimento.

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A durao da fase lag afetada pelo tamanho do inculo e a sua condio fisiolgica. Como j foi dito, o tamanho do inculo normalmente varia entre 3 e 10% o volume da cultura de produo. Lincoln (1960), citado por STANBURY (1995), salientou que inculos bacterianos devem ser transferidos na fase logartmica de crescimento, enquanto as clulas esto ainda metabolicamente ativas. A idade do inculo importante no crescimento das bactrias esporulantes, pois a esporulao feita no final da fase logartmica e a utilizao de um inculo contendo uma elevada quantidade de esporos resultaria numa fase lag longa, atrasando a prxima fermentao. Underkofler (1976), citado por STANBURY (1995), enfatizou que, na produo bacteriana de enzimas, o a fase lag poderia ser quase totalmente eliminada atravs da utilizao de um meio no inculo praticamente idntico ao meio de produo. A necessidade de utilizar um inculo em um estado fisiolgico ativo realmente seguida na produo de vinagre. As bactrias acticas utilizadas na produo do vinagre so extremamente sensveis falta de oxignio. Por isso, para evitar a perturbao do sistema, as clulas no final de uma fermentao so utilizados como inculo para o prximo lote atravs da remoo de cerca de 60% da cultura e restaurando os nveis iniciais com meio fresco. No entanto, um inculo de alta atividade aumenta da probabilidade de degenerao da cepa. Por exemplo, Sabatie (1991), citado por STANBURY (1995), demonstrou que a estabilidade do plasmdeo e produtividade em E. coli para a produo de biotina so melhores quando o inculo utilizado est na fase lag, e no na exponencial. Ele afirmou que a cpia dos plasmdeos maior em estacionrio do que em exponencial do que em outros, resultando em uma menor perda dos plasmdeos durante a fermentao. Na fermentao do cido ltico deve-se preparar um inculo livre dessa substncia, pois as bactrias podem ter seu crescimento inibido por ela. Assim, a produo cido lctico no inculo pode resultar em inculos de m qualidade. Yamamoto et al. (1993) gerou grande qualidade de inculo de bactrias lcticas utilizando eletrodilise, removendo assim o lactato do meio de inculo e reduzindo a durao da fase lag durante a produo.

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2.4.

INCULO DE FUNGOS FILAMENTOSOS

A preparao de inculos para fermentaes que promovem o crescimento micelial de fungos filamentosos empregada para a maioria dos fungos importantes industrialmente, onde se utiliza uma suspenso de esporos durante o

desenvolvimento do inculo. A grande vantagem de se utilizar inculos contendo esporos que se contm muito mais estruturas propagativas do que em uma cultura de clulas vegetativa. Trs tcnicas bsicas tm sido desenvolvidas para produzir uma alta concentrao de esporos para utilizao como inculo. A primeira a esporulao em meio solidificado. A maioria dos fungos e estreptomicetos esporulam em meio com gar adequado, mas uma grande rea de superfcie desse gar deve ser utilizada para se produzir uma quantidade de esporos suficiente. Outros organismos filamentosos iro esporular naturalmente na superfcie de cereais e gro, a partir dos quais os esporos podem ser recolhidos. Substratos como a cevada, o farelo de trigo, o milho e o arroz so superfcies adequadas para a esporulao de uma vasta gama de fungos. A esporulao de um determinado fungo particularmente afetada pela quantidade de gua adicionada ao cereal antes da esterilizao e a umidade relativa da atmosfera, a qual deve estar a mais alta possvel durante esporulao. O ltimo mtodo seria a esporulao em cultura submersa. Alguns fungos sofrem esporulao em meio lquido desde que um suporte adequado seja empregado. Esta tcnica mais conveniente do que o uso de meios slidos, porque mais fcil de trabalhar assepticamente e de ser aplicado em grande escala. A tcnica foi aprovada pela primeira Foster et al. (1945) que induziu esporulao de Penicillium notatum em cultivo submerso atravs da adio de 2,5% de cloreto de clcio em um meio definido. A maior parte dos actinomicetos no esporulam em condies submersas, e, portanto, as outras tcnicas descritas anteriormente devem ser utilizadas. Rhodes et al. (1957), citado por STAMBURY (1995), descreveram as condies necessrias para a esporulao em meio lquido de Penicillium patulum. Observou-se que para ocorrer a esporulao o nvel de nitrognio tinha de ser limitados a entre 0,05 e 0,1% p/v e que uma boa aerao deveria ser mantida. Eles tambm observaram que quanto menor for a aerao, menor a concentrao de nitrognio necessria para induzir a esporulao.

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Alguns fungos no so capazes de produzir esporos assexuados, e, portanto, necessrio preparam inculos partir das estruturas vegetativas. O grande problema em usar o miclio vegetativo como inculo a padronizao da quantidade de inculo e dificuldade da obteno de um inculo uniforme. Pode-se evitar isso tentado fragmentar o miclio em peneiras ou num liquidificador de Waring antes de utiliz-lo como inculo. Este mtodo proporciona um grande nmero de partculas miceliais e, portanto, um grande nmero de partculas de propagao. Quando fungos filamentosos so cultivados em fermentao submersa, o crescimento varia entre a forma de "pellet", a qual uma massa de hifas compactas, e uma forma filamentosa forma por hifas uma forma homognea. O tipo de filamentoso dar origem a um caldo viscoso que poder ser de difcil areao, ao passo que o crescimento em pellets dar origem a um meio menos viscoso, mas tambm menos homogneo. Na estrutura do pellet ocorre o problema do miclio que se encontra no centro no receber grandes quantidades de nutrientes devido s dificuldades de difuso. A forma morfolgica do fungo pode influenciar a produtividade da cultura, pois algumas fermentaes so eficientes com o fungo na forma filamentosa e outras na forma de pellets. Por exemplo, o crescimento filamentoso tem sido reivindicado como uma condio tima para a produo penicilina por P. chrysogenum, enquanto que o crescimento em pellets foi reivindicado como sendo timo para a produo e de cido ctrico por Aspergillus niger e de lovastatina por Aspergillus telreus. A morfologia do miclio influenciada pela concentrao de esporos no inculo e os o meio de cultivo no qual esse inculo foi desenvolvido. Normalmente, inculos com grande quantidade de esporos produzem um miclio disperso na forma de filamentos, enquanto que um inculo com baixa concentrao de esporos ir favorecer a formao de pellets. A partir da Tabela 4 possvel observar a influncia da concentrao de esporos na forma de crescimento de Penicillium chrysogenum.

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Tabela 4- Efeito da concentrao de esporos na morfologia e produtividade de penicilina por Penicillium chrysogenum.

Fonte: STANBURY, 1995.

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3. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS BCHS, J. Introduction to advantages and problems of shaken cultures. Biochemical Engineering Journal, v.7, p.91-98, 2001. DEMAIN, A.L.; DAVIES, J. E. Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology. Second Edition, ASM Press, Washington, D.C.,1999, 830p. FINN, R. K. Agitation-Aeration in the Laboratory and in Industry (1954). Disponvel em: < www.mmbr.asm.org >. Acesso em: 17 de maio de 2008. GERLACH, S. R.; SIEDENBERG, D.; GERLACH, D.; SCHGERL, K.; GIUSEPPIN, M. L. F.; HUNIK, J. Influence of reactor systems on the morphology of Aspergillus awamori. Application of neural network and cluster analysis for characterization of fungal morphology. Process Biochemistry, vol. 33, n 6, p. 601-615, 1998. JNICKE, G.; SAUTER, C.; BUX, R.; HAAS, J. Characterisation of shake flasks for cultivation of animal cell cultures. R. Smith (ed.), Cell Technology for Cell Products, Springer, p. 727-731, 2007. MAIER, U.; BCHS, J. Characterisation of the gas-liquid mass transfer in shaking bioreactors. Biochemical Engineering Journal, 7, p. 99-106, 2001. McDANIEL, L. E.; BAILEY, E. G. Effect of Shaking Speed and Type of Closure on Shake Flask Cultures. Applied microbiology, vol. 17, n2, p. 286-290, 1969. MOO-YOUNG, M. Comprehensive Biotechnology: The Principles, Applications and Regulations of Biotechnology in Industry, Agriculture and Medicine. Volume 1 The Principles of Biotechnology: Scientific Fundamentals, Pergamon Press, Oxford, 1985. New Brunswick Scientific. Disponvel em: < http://www.nbsc.com >. Acesso em 17 de maio de 2008. PFALLER, M. A.; BURMEISTER, L.; BARTLETT, M. S.; RINALDI, M. G. Multicenter Evaluation of Four Methods of Yeast Inoculum Preparation. Journal of Clinical Microbiology, vol. 26, n8, p. 1437-1441, 1988. RUTTLOFF, H.; PROLL, J.; LEUCHTENBERGER, A. Lebensmittel-Biotechnologie und Ernhrung: Probleme und Lsungsanstze. Springer,1996, 326 p. SAUTOUR, M.; DANTIGNY, P.; GUILHEM, M.-C.; BENSOUSSAN, M. Influence of inoculum preparation on the growth of Penicillium chrysogenum. Journal of Applied Microbiology, 95, p. 1034-1038, 2003. STANBURY, P. F.; WHITAKER, A.; HALL, S. J. Principles of Fermentation Technology. Second Edition. Butterworth Heinemann, Elsevier Science, 1995, 357 p.

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4. ANEXOS

ANEXO 1 CHARACTERISATION OF THE GAS-LIQUID MASS TRANSFER IN SHAKING BIOREACTORS ULRIKE MAIER & JOCHEN BCHS

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ANEXO 2 EFFECT OF SHAKING SPEED AND TYPE OF CLOSURE ON SHAKE FLASK CULTURES L. E. McDANIEL & E. G. BAILEY

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ANEXO 3 INFLUENCE OF INOCULUM PREPARATION ON THE GROWTH OF Penicillium chrysogenum M. SAUTOUR, P. DANTIGNY, M.-C. GUILHEM & M. BENSOUSSAN

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ANEXO 4 MULTICENTER EVALUATION OF FOUR METHODS OF YEAST INOCULUM PREPARATION M. A. PFALLER, L. BURMEISTER, M. S. BARTLETT & M. G. RINALDI