fotossÍntese e metabolismo de … aos colegas da fisiologia: josé r. magalhães filho, paulo e. r....

INSTITUTO AGRONÔMICO

CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRICULTURA TROPICAL E

SUBTROPICAL

FOTOSSÍNTESE E METABOLISMO DE

CARBOIDRATOS EM PLANTAS JOVENS DE

CANA-DE-AÇÚCAR SOB BAIXA TEMPERATURA E

DEFICIÊNCIA HÍDRICA

DANIELA FAVERO SÃO PEDRO MACHADO

Orientadora: Ana Maria Magalhães Andrade Lagôa

Tese submetida como requisito parcial para

obtenção do grau de Doutor em Agricultura

Tropical e Subtropical, Área de Concentração

em Tecnologia da Produção Agrícola.

Campinas, SP

Fevereiro 2014

Ficha elaborada pela bibliotecária do Núcleo de Informação e Documentação do Instituto Agronômico

M149f Machado, Daniela Favero São Pedro Fotossíntese e metabolismo de carboidratos em plantas jovens de cana-de-açúcar sob baixa temperatura e deficiência hídrica / Daniela Favero São Pedro Machado. Campinas, 2013. 75 fls.

Orientadora: Ana Maria Magalhães Andrade Lagôa Tese (Doutorado) Agricultura Tropical e Subtropical – Instituto Agronômico

1 Plantas jovens de cana-de-açúcar 2. Trocas gasosas 3. Fluorescência da clorofila 3. Síntese de sacarose fosfato I. Lagoa, Ana Maria Magalhães Andrade III. Título

CDD. 633.61

iv

Aos meus pais

Nelva e Abílio (in memorian),

por todo amor.

DEDICO

Ao meu marido Ricardo e à minha filha

Carolina por todo amor, paciência,

auxílio e apoio durante a execução deste

trabalho,

OFEREÇO

v

AGRADECIMENTOS

- A Deus.

- À Pós-Graduação e ao Instituto Agronômico pela oportunidade.

- À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela bolsa de

estudos concedida.

- À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (Fapesp) pelo financiamento do

projeto.

- À Dra. Ana Maria M. A. Lagôa pela oportunidade, orientação e ensinamentos.

- Ao Dr. Eduardo Caruso Machado por todo apoio, paciência e ensinamentos.

- Ao Severino Nogueira por todo auxílio e ideias na montagem dos experimentos.

- À minha sogra Celina, por todo amor, carinho, paciência e dedicação nestes anos cuidando

da Carolina.

- Ao meu marido Ricardo S. Machado por todo auxílio na execução dos experimentos e acima

de tudo paciência e compreensão nos momentos de ausência.

- Aos colegas da Fisiologia: José R. Magalhães Filho, Paulo E. R. Marchiori, Fernanda

Castro, Verònica L. Dovis, Guilherme G. Roberto, Cristina R. G. Sales e Karina I. Silva por

todo auxílio durante os experimentos e análises bioquímicas.

- À Dra. Norma de M. Erismann e Dra. Rose M. A. G. Tomaz pelo auxílio e sugestões nas

análises bioquímicas.

- Aos professores da área de concentração Tecnologia da Produção Agrícola da PG-IAC,

pelos ensinamentos transmitidos.

- Ao Prof. Dr. Joaquim Albenísio G. Silveira e aos alunos da Universidade Federal do Ceará,

Ana Karla M. Lobo, Márcio O. Martins e Adilton de V. Fontenele por todo auxílio nas

determinações das atividades enzimáticas.

- Ao Prof. Dr. Joaquim Albenísio G. Silveira, Prof. Dr. Marcelo de A. Silva e Dra. Norma de

M. Erismann pelas sugestões na pré-banca.

- Enfim, a todos aqueles que de uma forma direta ou indireta contribuíram para a realização

deste trabalho.

vi

"Desistir... eu sempre pensei seriamente nisso, mas nunca me

levei realmente a sério; é que tem mais chão nos meus olhos

do que o cansaço nas minhas pernas, mais esperança nos

meus passos do que tristeza nos meus ombros, mais estrada

no meu coração do que medo na minha cabeça."

(Cora Coralina)

vii

SUMÁRIO

LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIATURAS............................................................... ix

ÍNDICE DE FIGURAS.................................................................................................. xii

ÍNDICE DE TABELAS.................................................................................................. xvi

Resumo............................................................................................................................. xvii

Abstract............................................................................................................................ xix

CAPÍTULO I

1 INTRODUÇÃO............................................................................................................ 2

2 REVISÃO DE LITERATURA.................................................................................... 3

3 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................................ 13

CAPÍTULO II - Baixa temperatura noturna e deficiência hídrica na fotossíntese de

cana-de-açúcar

RESUMO......................................................................................................................... 20

ABSTRACT..................................................................................................................... 21

1 INTRODUÇÃO............................................................................................................ 22

2 MATERIAL E MÉTODOS.......................................................................................... 23

2.1 Variáveis medidas e calculadas.................................................................................. 25

Assimilação de CO2 e fluorescência da clorofila a.......................................................... 25

Teor de carboidratos solúveis.......................................................................................... 27

Teor de amido.................................................................................................................. 28

Potencial da água na folha............................................................................................... 28

Delineamento experimental............................................................................................. 28

3 RESULTADOS E DISCUSSÃO................................................................................ 29

4 CONCLUSÕES........................................................................................................... 38

5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS....................................................................... 39

CAPÍTULO III - Metabolismo de carboidratos em duas cultivares de cana-de-açúcar

sob baixa temperatura e deficiência hídrica

RESUMO........................................................................................................................ 44

ABSTRACT.................................................................................................................... 45

1 INTRODUÇÃO........................................................................................................... 46

2 MATERIAL E MÉTODOS......................................................................................... 48

2.1 Variáveis medidas e calculadas................................................................................. 49

Assimilação de CO2 e fluorescência da clorofila a......................................................... 49

Potencial da água na folha............................................................................................... 50

Teor de carboidratos........................................................................................................ 50

Atividade de enzimas do metabolismo de carboidratos.................................................. 51

Proteína solúvel total....................................................................................................... 51

Atividade da sintase de sacarose fosfato........................................................................ 51

Atividade da sintase de sacarose.................................................................................... 52

Atividade das invertases ácidas...................................................................................... 52

Atividade das invertases neutras.................................................................................... 53

Delineamento experimental............................................................................................. 53

3 RESULTADOS............................................................................................................ 53

4 DISCUSSÃO................................................................................................................ 63

Período de baixa temperatura e deficiência hídrica......................................................... 63

viii

Período de recuperação.................................................................................................... 69

5 CONCLUSÕES........................................................................................................... 70

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.......................................................................... 72

ix

LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIATURAS

A Assimilação de CO2, μmol m-2

s-1

Ai Assimilação diária de CO2, mmol m-2

d-1

AMI Amido

Apot Assimilação máxima de CO2 em concentração saturante de CO2, μmol m-2

s-1

AS Açúcares solúveis

ATP Adenosina trifosfato

A/Ci Eficiência aparente de carboxilação, μmol m-2

s-1

Pa-1

BFV Bainha do feixe vascular

BSA Albumina sérica bovina

cc-ec Células companheiras - elementos crivados

Ci Concentração intercelular de CO2, μmol mol-1

DAP Dias após plantio

DH Deficiência hídrica

E Transpiração, mmol m-2

s-1

EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético

ETR Transporte aparente de elétrons, μmol m-2

s-1

EUAi Eficiência intrínseca do uso da água, μmol mol-1

Fo Fluorescência mínima em tecidos adaptados ao escuro

Fo' Fluorescência mínima em tecidos iluminados

Fm Fluorescência máxima em tecidos adaptados ao escuro

Fm' Fluorescência máxima em tecidos iluminados

Fq' Extinção fotoquímica da fluorescência pelos centros oxidados do

fotossistema II

Fq'/Fm' Eficiência operacional do fotossistema II

Fq'/Fv' Fator de eficiência do fotossistema II

FRU Frutose

Fru-6-P Frutose-6-fosfato

FSII Fotossistema II

Fv Fluorescência variável em tecidos adaptados ao escuro

Fv' Fluorescência variável em tecidos iluminados

Fv/Fm Eficiência quântica máxima do fotossistema II em tecidos adaptados ao

x

escuro

Fv'/Fm' Eficiência quântica máxima do fotossistema II em tecidos iluminados

GLU Glicose

Glu-6-P Glicose-6-fosfato

gs Condutância estomática, mol m-2

s-1

H2SO4 Ácido sulfúrico

IVA Invertase ácida solúvel (EC 3.2.1.25)

IVN Invertase neutra (EC 3.2.1.26)

KOH Hidróxido de potássio

LM Limitação metabólica, %

MF Massa fresca

MgCl2 Cloreto de magnésio

MOPS Ácido 3-(N-morfolino)-propanossulfônico

MS Massa seca

NADPH Nicotinamida adenina dinucleotídeo de piridina fosfato reduzida

NPQ Coeficiente de extinção não-fotoquímico da fluorescência

OAA Ácido oxaloacético

PEP Fosfoenolpiruvato

PEPcase Fosfoenolpiruvato carboxilase

Pi Fosfato inorgânico

PPDK Piruvato ortofosfato diquinase

PVPP Polivinilpolipirrolidona

Q Radiação fotossinteticamente ativa

QA Quinona A

Rubisco Ribulose-1,5-bisfosfato carboxilase/ oxigenase

RuBP Ribulose-1,5-bisfosfato

SAC Sacarose

SPP Fosfatase de sacarose fosfato (EC 3.1.3.24)

SPS Sintase de sacarose fosfato (EC 2.4.1.14)

SuSy Sintase de sacarose (EC 2.4.1.13)

TN Temperatura noturna

UDP-glicose Uridina-5'-difosfoglicose

Vmax Eficiência máxima de carboxilação, μmol m-2

s-1

xi

Vpmax Eficiência aparente de carboxilação da fosfoenolpiruvato carboxilase, mol m-

2 s

-1

Ψw6h Potencial da água na folha medido antes do amanhecer, MPa

Ψw14h Potencial da água na folha medido às 14:00 h, MPa

CO2 Eficiência quântica da fotossíntese, μmol CO2 (μmol fótons)-1

xii

ÍNDICE DE FIGURAS

CAPÍTULO I

Figura 1- Produção, transporte e acúmulo de sacarose em cana-de-açúcar.

Adaptado de GROF e CAMPBELL (2001)................................................

4

CAPÍTULO II

Figura 1- Fotografias ilustrando (A) bandeja para germinação contendo substrato

comercial e mini-toletes de cana-de-açúcar, (B) detalhe do mini-tolete

contendo gema, e (C) visão geral das plantas em casa de vegetação aos

56 dias após o plantio..................................................................................

24

Figura 2- Variação da radiação solar (A) e da temperatura (B) durante o período

experimental. Setas indicam os dias de medidas de trocas gasosas e

fluorescência da clorofila a em cana-de-açúcar..........................................

29

Figura 3- Variação da assimilação diária de CO2 (Ai) de cana-de-açúcar, cv.

IACSP94-2094 aos seguintes tratamentos: TN20, temperatura noturna de

20 °C - irrigada; DH/TN20, temperatura noturna de 20 °C - não irrigada;

TN12, temperatura noturna de 12 °C - irrigada e DH/TN12, temperatura

noturna de 12 °C - não irrigada. As colunas indicam média de três

repetições (± erro padrão)...........................................................................

30

Figura 4- A, Resposta da assimilação de CO2 (A) e B, condutância estomática (gs)

em cana-de-açúcar cv. IACSP94-2094. Tratamentos: TN20, temperatura

noturna de 20 °C - irrigada (■); DH/TN20, temperatura noturna de 20 °C

- não irrigada (○); TN12, temperatura noturna de 12 °C - irrigada (∆) e

DH/TN12, temperatura noturna de 12 °C - não irrigada (▼). Dados

retirados da curva A vs. Ci, sob saturação de luz e 400 μmol mol-1

de

CO2. Período de aplicação dos tratamentos, dias 1 a 5; período de

recuperação com retorno da irrigação das plantas e temperatura noturna

de 20 °C, dias 5 a 9.....................................................................................

31

Figura 5- A, Variação de potencial da água na folha (W14) e B, transpiração (E)

em cana-de-açúcar cv. IACSP94-2094 submetida aos tratamentos: TN20,

temperatura noturna de 20 °C - irrigada; DH/TN20, temperatura noturna

de 20 °C - não irrigada; TN12, temperatura noturna de 12 °C - irrigada e

DH/TN12, temperatura noturna de 12 °C - não irrigada. As colunas

indicam média de três repetições (± erro padrão). Período de aplicação

dos tratamentos, dias 1 a 5; período de recuperação com retorno da

irrigação das plantas e temperatura noturna de 20 °C, dias 5 a 9...............

32

Figura 6- A,Variação de assimilação máxima em CO2 saturante (Apot); B,

limitação metabólica (LM); C, eficiência de carboxilação da PEPcase

(Vpmax) e D, eficiência máxima da Rubisco (Vmax) em cana-de-açúcar cv.

IACSP94-2094 submetida aos tratamentos: TN20, temperatura noturna

de 20 °C - irrigada (■); DH/TN20, temperatura noturna de 20 °C - não

xiii

irrigada (○);TN12, temperatura noturna de 12 °C - irrigada (∆) e

DH/TN12, temperatura noturna de 12 °C - não irrigada (▼). Os símbolos



irrigação das plantas e temperatura noturna de 20 °C, dias 5 a 9...............

33

Figura 7- A, Resposta de eficiência quântica máxima do fotossistema II (Fv/Fm);

B, eficiência operacional do FSII (Fq'/Fm'); C, transporte aparente de

elétrons (ETR) e D, fator de eficiência do FSII (Fq'/Fv') em cana-de-

açúcar cv. IACSP94-2094 submetida aos tratamentos: TN20, temperatura

noturna de 20 °C - irrigada (■); DH/TN20, temperatura noturna de 20 °C

- não irrigada (○);TN12, temperatura noturna de 12 °C - irrigada (∆) e

DH/TN12, temperatura noturna de 12 °C - não irrigada (▼). Os símbolos



irrigação das plantas e temperatura noturna de 20 °C, dias 5 a

9...................................................................................................................

35

Figura 8- Relação entre eficiência quântica de CO2 (CO2) e eficiência

operacional do fotossistema II (Fq’/Fm’) em cana-de-açúcar cv.

IACSP94-2094 submetida aos tratamentos: TN20 (), temperatura

noturna de 20 °C - irrigada; DH/TN20 (), temperatura noturna de 20

°C - não irrigada; TN12 (), temperatura noturna de 12 °C - irrigada e

DH/TN12 (), temperatura noturna de 12 °C - não irrigada, um

(símbolos cheios e linha, CO2=-0,003+0,132*Fq´/Fm´, R2=0,93,

p<0,01) e quatro dias após os tratamentos (símbolos vazios e linha

tracejada, CO2=-0,005+0,136*Fq´/Fm´, R2=0,87, p<0,01).......................

36

CAPÍTULO III

Figura 1- (A, B) Resposta da assimilação de CO2 (A) e (C, D) assimilação diária

de CO2 (Ai) de cana-de-açúcar, cultivares IACSP94-2094 e IACSP95-

5000, sendo o dia 0 (testemunha) medida feita após 18 dias de

aclimatação a 32/20 °C (dia/ noite) com plantas irrigadas; dia 2 medida

feita após 34 horas a 22/12 °C (dia/ noite) com plantas irrigadas (I) e não

irrigadas (NI); dia 13 medida feita após 13 dias de baixa temperatura em

plantas irrigadas e não irrigadas (estresse intermediário); dia 20 medida

após 20 dias de baixa temperatura em plantas irrigadas e não irrigadas

(estresse máximo); dia 22 medida após 2 dias de retorno à temperatura

de 32/20 °C e reidratação e dia 28 medida após 8 dias de recuperação

das plantas. Símbolos indicam média de 20 repetições ± erro padrão para

A e 4 repetições ± erro padrão para Ai........................................................

55

Figura 2- (A, B) Resposta da condutância estomática (gs), (C, D) transpiração (E)

e (E, F) eficiência intrínseca do uso da água (EUAi) de cana-de-açúcar,

cultivares IACSP94-2094 e IACSP95-5000, sendo o dia 0 (testemunha)

medida feita após 18 dias de aclimatação a 32/20 °C (dia/ noite) com

plantas irrigadas; dia 2 medida feita após 34 horas a 22/12 °C (dia/

noite) com plantas irrigadas (I) e não irrigadas (NI); dia 13 medida feita

após 13 dias (estresse intermediário); de baixa temperatura em plantas

xiv

irrigadas e não irrigadas; dia 20 medida após 20 dias de baixa

temperatura em plantas irrigadas e não irrigadas (estresse máximo); dia

22 medida após 2 dias de retorno à temperatura de 32/20 °C e

reidratação e dia 28 medida após 8 dias de recuperação das plantas.

Símbolos indicam média de 20 repetições ± erro padrão...........................

56

Figura 3- (A, B) Variação da concentração intercelular de CO2 (Ci) e da (C, D)

eficiência aparente de carboxilação (A/Ci) de cana-de-açúcar, cultivares

IACSP94-2094 e IACSP95-5000, sendo: dia 0 (testemunha) medida

feita após 18 dias de aclimatação a 32/20 °C (dia/ noite) com plantas

irrigadas; dia 2 medida feita após 34 horas a 22/12 °C (dia/ noite) com

plantas irrigadas e não irrigadas; dia 13 medida feita após 13 dias

(estresse intermediário) de baixa temperatura em plantas irrigadas (I) e

não irrigadas (NI); dia 20 medida após 20 dias de baixa temperatura em

plantas irrigadas e não irrigadas (estresse máximo); dia 22 medida após

2 dias de retorno à temperatura de 32/20 °C e reidratação e dia 28

medida após 8 dias de recuperação das plantas. Símbolos indicam média

de 20 repetições ± erro padrão....................................................................

57

Figura 4- (A, B) Resposta da eficiência operacional do FSII (Fq'/Fm') de cana-de-

açúcar, cultivares IACSP94-2094 e IACSP95-5000, sendo o dia 0

(testemunha) medida feita após 18 dias de aclimatação a 32/20 °C (dia/

noite) com plantas irrigadas; dia 2 medida feita após 34 horas a 22/12 °C

(dia/ noite) com plantas irrigadas (I) e não irrigadas (NI); dia 13 medida

feita após 13 dias (estresse intermediário); de baixa temperatura em

plantas irrigadas e não irrigadas; dia 20 medida após 20 dias de baixa

temperatura em plantas irrigadas e não irrigadas (estresse máximo); dia

22 medida após 2 dias de retorno à temperatura de 32/20 °C e

reidratação e dia 28 medida após 8 dias de recuperação das plantas.

Símbolos indicam média de 20 repetições ± erro padrão...........................

58

Figura 5- (A, B) Variação do coeficiente de extinção não fotoquímico (NPQ) e da

(C, D) eficiência quântica máxima do FSII (Fv/Fm) e eficiência quântica

máxima do FSII sob Q (Fv'/Fm') de cana-de-açúcar, cultivares IACSP94-

2094 e IACSP95-5000, sendo o dia 0 (testemunha) medida feita após 18

dias de aclimatação a 32/20 °C (dia/ noite) com plantas irrigadas; dia 2

medida feita após 34 horas a 22/12 °C (dia/ noite) com plantas irrigadas

(I) e não irrigadas (NI); dia 13 medida feita após 13 dias de baixa

temperatura em plantas irrigadas e não irrigadas; dia 20 medida após 20

dias de baixa temperatura em plantas irrigadas e não irrigadas (máximo

estresse); dia 22 medida após 2 dias de retorno à temperatura de 32/20

°C e reidratação e dia 28 medida após 8 dias de recuperação das plantas.

Símbolos indicam média de 20 repetições ± erro

padrão..........................................................................................................

59

Figura 6- (A, B) Variação do fator de eficiência do FSII (Fq'/Fv') e do (C, D)

transporte aparente de elétrons (ETR) de cana-de-açúcar, cultivares

IACSP94-2094 e IACSP95-5000, sendo o dia 0 (testemunha) medida



xv

plantas irrigadas (I) e não irrigadas (NI); dia 13 medida feita após 13

dias de baixa temperatura em plantas irrigadas e não irrigadas; dia 20

medida após 20 dias de baixa temperatura em plantas irrigadas e não

irrigadas (máximo estresse); dia 22 medida após 2 dias de retorno à

temperatura de 32/20 °C e reidratação e dia 28 medida após 8 dias de

recuperação das plantas. Símbolos indicam média de 20 repetições ±

erro padrão..................................................................................................

60

Figura 7- (A, B) Variação no teor dos açúcares solúveis (AS), da (C, D) sacarose

(SAC) e do amido (AMI) em folhas de cana-de-açúcar, cultivares




plantas irrigadas (I) e não irrigadas (NI); dia 13 medida feita após 13





recuperação das plantas. Símbolos indicam média de quatro repetições ±

erro padrão..................................................................................................

61

Figura 8- Variação da atividade das enzimas (A, B) sintase de sacarose (SuSy) e da

(C, D) sintase de sacarose fosfato (SPS) em folhas de cana-de-açúcar,

cultivares IACSP94-2094 e IACSP95-5000, sendo o dia 0 (testemunha)

medida feita após 18 dias de aclimatação a 32/20 °C (dia/ noite) com

plantas irrigadas; dia 2 medida feita após 34 horas a 22/12 °C (dia/

noite) com plantas irrigadas e não irrigadas; dia 13 medida feita após 13





recuperação das plantas. Símbolos indicam média de quatro repetições ±

erro padrão..................................................................................................

62

Figura 9- Variação da atividade das (A, B) invertases ácidas (IVA) e das (C, D)

invertases neutras (IVN) em folhas de cana-de-açúcar, cultivares




plantas irrigadas e não irrigadas; dia 13 medida feita após 13 dias de

baixa temperatura em plantas irrigadas e não irrigadas; dia 20 medida

após 20 dias de baixa temperatura em plantas irrigadas e não irrigadas

(máximo estresse); dia 22 medida após 2 dias de retorno à temperatura

de 32/20 °C e reidratação e dia 28 medida após 8 dias de recuperação

das plantas. Símbolos indicam média de quatro repetições ± erro padrão.

63

xvi

ÍNDICE DE TABELAS

CAPÍTULO II

Tabela 1- Teor de açúcares solúveis totais (μmol g-1

MS) em folhas de cana-de-

açúcar cv. IACSP94-2094 submetida aos tratamentos: TN20, temperatura

noturna de 20 °C - irrigada; DH/TN20, temperatura noturna de 20 °C -

não irrigada; TN12, temperatura noturna de 12 °C - irrigada e DH/TN12,

temperatura noturna de 12 °C - não irrigada, no 5º dia de tratamento e 4º

dia de recuperação. Período de aplicação dos tratamentos, dias 1 a 5;

período de recuperação com retorno da irrigação das plantas e

temperatura noturna de 20 °C, dias 5 a 9....................................................

36

Tabela 2- Teor de sacarose (μmol g-1

MS) em folhas de cana-de-açúcar cv.


de 20 °C - irrigada; DH/TN20, temperatura noturna de 20 °C - não

irrigada; TN12, temperatura noturna de 12 °C - irrigada e DH/TN12,

temperatura noturna de 12 °C - não irrigada, no 5º dia de tratamento e 4º




37

Tabela 3- Teor de amido (μmol de Glu g-1



de 20 °C - irrigada; DH/TN20, temperatura noturna de 20 °C - não

irrigada; TN12, temperatura noturna de 12 °C - irrigada e DH/TN12,

temperatura noturna de 12 °C - não irrigada. No 5º dia de tratamento e 4º




38

CAPÍTULO III

Tabela 1- Resposta do potencial hídrico foliar (Ψw6h) de cana-de-açúcar cv.

IACSP94-2094 e cv. IACSP95-5000 submetida aos tratamentos de baixa

temperatura e deficiência hídrica. Médias de quatro repetições (± desvio

padrão).........................................................................................................

54

xvii

Fotossíntese e metabolismo de carboidratos em plantas jovens de cana-de-açúcar sob

baixa temperatura e deficiência hídrica

RESUMO

O produto mais importante da cana-de-açúcar é a sacarose acumulada nos colmos. A

diferença na capacidade de armazenar sacarose entre genótipos de cana-de-açúcar está

relacionada com fatores fisiológicos, bioquímicos e ambientais. A ocorrência de temperaturas

baixas e deficiência hídrica afetam a fisiologia da cana-de-açúcar. O objetivo deste trabalho

foi estudar a influência da baixa temperatura e da deficiência hídrica sobre a fotossíntese,

atividade das enzimas do metabolismo de carboidratos e conteúdo de carboidratos foliares.

Foram realizados dois estudos, o primeiro utilizando a cultivar IACSP94-2094 e o segundo

experimento utilizando duas cultivares de cana-de-açúcar, IACSP94-2094 e IACSP95-5000

que exibem diferenças em sua rusticidade. No primeiro estudo, verificaram-se as respostas

fotossintéticas da cana-de-açúcar aos efeitos simultâneos e isolados da baixa temperatura

noturna (TN) e da deficiência hídrica (DH). Após 128 dias do plantio, as plantas da cultivar

IACSP94-2094 foram submetidas aos seguintes tratamentos: 1) testemunha, com temperatura

noturna (TN) de 20 °C irrigada (TN20); 2) TN de 20 °C com deficiência hídrica (TN20/DH); 3)

TN de 12 °C irrigada (TN12) e 4) TN de 12 °C com deficiência hídrica (TN12/DH) por cinco

dias. Após o período de tratamento, as plantas foram irrigadas e retornaram à temperatura

noturna de 20 °C por mais quatro dias, para recuperação. Houve decréscimos na assimilação

de CO2 nos tratamentos TN20/DH, TN12 e TN12/DH. A recuperação total da assimilação de

CO2 foi observada apenas nas plantas do tratamento de baixa temperatura noturna. Com a

ocorrência simultânea da baixa temperatura noturna e da deficiência hídrica foram observados

efeitos negativos na condutância estomática, na eficiência máxima da ribulose-1,5-bisfosfato

carboxilase, no transporte aparente de elétrons, no fator de eficiência e na eficiência

operacional do fotossistema II, causando limitações difusivas, bioquímicas e fotoquímicas da

fotossíntese. A ocorrência de baixa temperatura noturna e déficit hídrico causou queda no teor

de amido foliar, favorecendo o aumento do teor de sacarose foliar. No segundo estudo

verificou-se as respostas da fotossíntese e do metabolismo de carboidratos de cana-de-açúcar

sob baixa temperatura e deficiência hídrica. Para tanto foram utilizadas duas cultivares de

cana-de-açúcar, IACSP94-2094 e IACSP95-5000. Aos 87 dias após o plantio, as plantas

foram submetidas aos tratamentos de baixa temperatura (22±1/12±1 °C) e deficiência hídrica,

por 22 dias, em câmara de crescimento. Após este período, as plantas foram reidratadas e a

temperatura retornou a 32±1/20±1 °C, por 9 dias. Sob condições ambientais ideais, a cultivar

xviii

IACSP95-5000 tem maior capacidade fotossintética que a cultivar IACSP94-2094. Após

imposição dos tratamentos, em ambas as cultivares, foram observados decréscimos da

assimilação de CO2 devido a fatores difusivos, metabólicos e fotoquímicos. Entretanto, a

cultivar IACSP95-5000 foi mais tolerante ao frio devido à menor redução da assimilação de

CO2 e melhor recuperação. No entanto, sob frio e deficiência hídrica, a cultivar IACSP94-

2094 foi mais tolerante. Com a imposição dos tratamentos, foi observado aumento no teor de

açúcares solúveis e amido foliar em ambas cultivares. Entretanto, na cultivar IACSP94-2094

sob baixa temperatura e deficiência hídrica o aumento dos açúcares solúveis totais foi devido

ao aumento da sacarose, quando há também aumento da atividade da sintase de sacarose

fosfato.

Palavras-Chave: Saccharum spp., trocas gasosas, fluorescência da clorofila, resfriamento,

sintase de sacarose fosfato

xix

Sugarcane photosynthesis and carbohydrate metabolism in young sugarcane at low

temperature and water deficit

ABSTRACT

Sucrose accumulated in stems is the most important product of sugarcane. The ability

difference to store sucrose among genotypes of sugarcane is related to physiological,

biochemical and environmental factors. The occurrence of low temperatures and water deficit

are common factors affecting the physiology of sugarcane. The aim of this work was to study

the influence of low temperature and water deficit on photosynthesis, carbohydrate

metabolism enzymes activity and leaf carbohydrate profile. Two studies were conducted, first

using IACSP94-2094 cultivar and in the second study we using two sugarcane cultivars,

IACSP94-2094 and IACSP95-5000 which have differences in their hardiness. In the first, it

was verified the photosynthetic responses of sugarcane at low night temperature (TN) and

water deficit (DH) applied isolated and combined. After 128 planting days, IACSP94-2094

plants were treated for five days with the following treatment: 1) control, with night

temperature (TN) 20 °C and watered (TN20); 2) TN 20 °C and water deficit (TN20/DH); 3) TN

12 °C and watered (TN12) and 4) TN 12 °C and water deficit (TN12/DH). After the treatment

period, plants were watered and returned to the nighttime temperature of 20 °C for four days

for recovery. There was a decrease in the CO2 assimilation in treatments TN20/DH, TN12 e

TN12/DH. The total CO2 assimilation recovery was observed only in low night temperature.

The combined low night temperature and water deficit caused a negative effect on stomatal

conductance, maximum capacity of ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase, apparent electron

transport, PSII efficiency factor and PSII operating efficiency, causing diffusive, biochemical

and photochemical limitations of photosynthesis. Low night temperature and water deficit

caused decreases in leaf starch content, favoring an increase in sucrose content. In the second

study, it was examined the responses of photosynthesis and carbohydrate metabolism of

sugarcane under low temperature and water deficit. We used two sugarcane cultivars,

IACSP94-2094 and IACSP95-5000. At 87 days after planting, plants were treated with low

temperature (22±1/12±1 °C) and water deficit for 22 days in a growth chamber. After this

period, plants were rehydrated and the temperature returned to 32 ± 1/20 ± 1 °C for 9 days.

Under ideal environmental conditions IACSP95-5000 has a higher photosynthetic capacity

than IACSP94-2094 cultivar. After imposition of the treatments in both cultivars were

observed decreases in CO2 assimilation due to diffusive, metabolic, and photochemical

xx

factors. However the IACSP95-5000 cultivar was more tolerant to chilling, due to lower

reduction in CO2 assimilation and better recovery. While under low temperature and water

deficit, the IACSP94-2094 cultivar was more tolerant. With the imposition of the treatments,

it was observed an increase in soluble sugars and starch in both cultivars. However, the

soluble sugars increase on IACSP94-2094 cultivar under low temperature and water deficit,

was due sucrose increase, when there is an activity increase of sucrose phosphate synthase.

Key Words: Saccharum spp., gas exchange, chlorophyll fluorescence, chilling, sucrose

phosphate synthase

1

CAPÍTULO I

2

1 INTRODUÇÃO

A cana-de-açúcar tem importância mundial como fonte alimentar e de energia e o seu

cultivo no Brasil tem crescido significativamente nos últimos anos. Essa expansão foi

ocasionada pelo incentivo da indústria sucro-alcooleira, alavancada pelo consumo crescente

de etanol e pela política mundial de bioenergia (FRONZAGLIA, 2007; YUAN et al., 2008).

A sustentabilidade da produção agrícola da cana-de-açúcar no Brasil está fundamentada no

suprimento contínuo de variedades com maior tolerância às pragas e doenças e às variações

ambientais (MACEDO, 2007).

A necessidade dos países desenvolvidos substituírem os derivados de petróleo por

biocombustíveis estimulou a demanda global de etanol. Em vários países, sobretudo nos

Estados Unidos, a produção local não vem sendo suficiente para o consumo e o setor

sucroalcooleiro do Brasil rapidamente respondeu a essa nova demanda com safras recordes

consecutivas (FNP CONSULTORIA & COMÉRCIO, 2009). Porém, recentemente na região

Centro-Sul do Brasil, houve uma queda da produtividade devido às adversidades ambientais,

chuvas em excesso e geadas, e entre os meses de junho e agosto houve períodos longos com

baixas temperaturas (FNP CONSULTORIA & COMÉRCIO, 2012; UNICA, 2012).

O Estado de São Paulo responde por 60% da produção nacional de cana-de-açúcar

(FNP CONSULTORIA & COMÉRCIO, 2012) e a área cultivada com cana-de-açúcar tem se

expandido para regiões situadas a Oeste e Noroeste do Estado (EMBRAPA, 2009), em áreas

marginais onde há variação anual acentuada da disponibilidade hídrica (ROLIM et al., 2007).

O produto mais importante da cana-de-açúcar é a sacarose acumulada nos colmos. O

acúmulo de sacarose em cana-de-açúcar é o resultado final do ciclo de síntese e hidrólise da

sacarose, envolvendo a atividade de várias enzimas tanto na fonte como no dreno. A diferença

na capacidade de armazenar sacarose entre genótipos de cana-de-açúcar está relacionada com

fatores morfológicos, enzimáticos e ambientais (MOORE, 2005; RAE et al., 2005). Para

entender o armazenamento de sacarose no colmo é necessário identificar os principais fatores

limitantes desse processo, ou seja: fotossíntese e síntese de sacarose; taxa de carregamento,

transporte e descarregamento no floema durante a maturação e taxa de transporte de sacarose

para o armazenamento no parênquima e vacúolos. Nos meses de inverno há acúmulo

significativo de sacarose no colmo, quando a baixa temperatura e a seca são fatores

ambientais que afetam a fisiologia da cana-de-açúcar. Estas condições causam a queda no

3

crescimento da cana-de-açúcar e favorecem o acúmulo de sacarose nos vacúolos das células

do parênquima (RAE et al., 2005). Tais condições causam queda no processo fotossintético da

cana-de-açúcar, cujo metabolismo fotossintético C4 é menos eficiente sob frio e seca

(CARMO-SILVA et al., 2008; DU & NOSE, 2002; MACHADO et al., 2009; SAGE, 2007).

Os efeitos da ocorrência de deficiência hídrica e de baixa temperatura causam várias

alterações fisiológicas, e o grau dessas alterações é decorrente da intensidade do estresse e

depende do genótipo (DU & NOSE, 2002; MACHADO et al., 2009; RIBEIRO et al., 2013;

SALES et al., 2012; SMIT & SINGELS, 2006).

O objetivo deste trabalho foi testar a hipótese que cultivares de cana-de-açúcar

tolerantes à deficiência hídrica e/ou à baixa temperatura apresentam metabolismo do carbono

menos suscetível a estes fatores ambientais, estudando seus efeitos sobre a fotossíntese,

atividade das enzimas do metabolismo de carboidratos e conteúdo de carboidratos foliares em

plantas jovens de duas cultivares de cana-de-açúcar.

Esta tese foi dividida em dois experimentos, sendo o primeiro avaliando o efeito

simultâneo da deficiência hídrica e baixa temperatura noturna sobre a fotossíntese e conteúdo

de carboidratos foliares de plantas jovens de cana-de-açúcar na cultivar IACSP94-2094.

No segundo experimento, foi avaliado o efeito da baixa temperatura diária e da

deficiência hídrica sobre a fotossíntese, atividade das enzimas do metabolismo de

carboidratos e conteúdo de carboidratos foliares em plantas jovens de cana-de-açúcar, nas

cultivares IACSP94-2094 e IACSP95-5000.

2 REVISÃO DE LITERATURA

A cana-de-açúcar possui metabolismo fotossintético do tipo C4, na qual a assimilação

de CO2 pode atingir valores próximos de 63 mol CO2 m-2

s-1

(MOORE & MARETZKI,

1996). Em apenas um dia, a cana-de-açúcar pode acumular 40 g m-2

de fitomassa, sendo

grande parte do carbono assimilado direcionado aos colmos (MACHADO et al., 1982;

MOORE & MARETZKI, 1996). Apesar da grande capacidade fotossintética da cana-de-

açúcar, não há relação direta com a produção de sacarose e com o acúmulo nos colmos. Essa

afirmativa é sustentada pela comparação de duas espécies de Saccharum: S. spontaneum, que

tem baixa produção de sacarose (2% sacarose/ massa fresca), enquanto a S. officinarum tem

alta produção (25% sacarose/ massa fresca), entretanto observou-se que a fotossíntese de S.

spontaneum é duas vezes maior que da S. officinarum (IRVINE, 1975; MOORE &

4

MARETZKI, 1996). A produção de sacarose em cana-de-açúcar está relacionada com a

produção de fitomassa, sendo ambos os processos incrementados pela máxima interceptação

de energia solar e/ ou alta eficiência na conversão de fitomassa (SINGELS et al., 2005). A

interceptação de radiação está relacionada com a dimensão do aparelho fotossintético, i.e.,

com o índice de área foliar. O acúmulo de sacarose nos colmos é regulado pela capacidade de

armazenar açúcar e pelo metabolismo e transporte de açúcar tanto na fonte como no dreno. Há

evidências que tanto a atividade da fonte como a do dreno são determinantes na produção e

acúmulo de sacarose (GROF & CAMPBELL, 2001; MOORE & MARETZKI, 1996;

MOORE, 2005; RAE et al., 2005).

O acúmulo de sacarose é um processo complexo envolvendo diversas etapas (Figura

1).

Figura: 1 - Produção, transporte e acúmulo de sacarose em cana-de-açúcar. Adaptado de

GROF e CAMPBELL (2001).

5

É necessário compreender os fatores que limitam essas etapas, incluindo: a

fotossíntese, as enzimas envolvidas na síntese e partição de sacarose, o carregamento da

sacarose no floema das folhas e o descarregamento nos tecidos dreno, além da taxa de

armazenamento primário em células do parênquima e vacúolos e a taxa de remobilização de

sacarose para o crescimento vegetativo.

O acúmulo de sacarose varia de acordo com o genótipo, estádio de desenvolvimento

da planta e do ambiente em que é cultivada. A planta responde ao ambiente através da

transdução de sinais que coordenam o seu desenvolvimento, além do acúmulo de sacarose

(GROF & CAMPBELL, 2001; MOORE, 2005).

A fotossíntese é o principal mecanismo que transforma a energia solar em energia

química utilizável (ATP) e em NADPH, nas membranas dos tilacóides no cloroplasto.

A característica de alta produtividade de fotoassimilados em plantas C4 é atribuída à

cooperação metabólica de dois tipos de células das folhas fotossinteticamente ativas, que

constituem a anatomia do tipo Kranz, na bainha do feixe vascular (BFV) (HATCH, 1987).

As plantas de metabolismo do tipo C4 estão agrupadas em três sub-tipos bioquímicos,

que diferem principalmente no ácido C4 transportado (malato ou aspartato) e na forma de

descarboxilação. O primeiro grupo, do qual faz parte a cana-de-açúcar entre outras plantas

cultivadas, é o NADP-ME em que a enzima málica é dependente de NADPH e a

descarboxilação do ácido C4 ocorre no cloroplasto das células da BFV. O segundo grupo é o

NAD-ME, no qual a enzima málica é dependente de NADH e a descarboxilação do ácido C4

ocorre na mitocôndria das células da BFV. No terceiro grupo a descarboxilação é realizada

pela fosfoenolpiruvato carboxiquinase (PCK) e ocorre predominantemente no citoplasma das

células da BFV (GHANNOUM, 2009; TAIZ & ZEIGER, 2009; VON CAEMMERER &

FURBANK, 2003).

A fixação de CO2 ocorre inicialmente nos cloroplastos das células do mesofilo foliar

através da enzima fosfoenolpiruvato (PEP) carboxilase (PEPcase), onde é produzido ácido

oxaloacético (OAA) que é convertido em malato, que se difunde para as células da BFV. Na

BFV o OAA é descarboxilado resultando em CO2 que é fixado através da ribulose bisfosfato

carboxilase/oxigenase (Rubisco), no ciclo de Calvin. Na BFV a descarboxilação do malato

resulta em CO2 e piruvato em reação catalisada pela enzima citoplasmática NADP-málica

(HATCH, 1987). O produto de três carbonos (piruvato) do ciclo de Calvin retorna ao mesofilo

sendo utilizado na síntese de PEP, receptor inicial de CO2, com utilização de ATP. A via C4

funciona como uma "bomba" bioquímica que concentra o CO2 nas células da BFV de tal

forma a saturar eficazmente o ciclo de Calvin e inibir a fotorrespiração (LUNN &

6

FURBANK, 1999), que em plantas C3 é responsável por uma perda substancial de

fotoassimilados devido à oxidação.

Assim, a energia extra envolvida na supressão da fotorrespiração nas plantas C4 lhe

permite um aumento significativo na produtividade potencial sobre as plantas C3,

especialmente em ambientes onde a temperatura e intensidade de luz são altas (SAGE, 2007).

No estroma dos cloroplastos das células da BFV, ATP e NADPH são utilizados na redução do

CO2 à triose-P. A partir da triose-P são sintetizados a sacarose e o amido. A sacarose é

transportada para todos os órgãos da planta (HARTT et al., 1963), e constitui o substrato

primário para o crescimento e desenvolvimento enquanto o amido é um carboidrato de reserva

temporário nas folhas. Em cana-de-açúcar supõe-se que o amido seja sintetizado no

cloroplasto das células da BFV e a sacarose no citoplasma do mesofilo (GROF & CAMPBEL,

2001; LUNN & FURBANK, 1999).

Em cana-de-açúcar a sacarose além de principal produto da fotossíntese, é uma

molécula de transporte envolvida no crescimento, desenvolvimento, armazenamento,

transdução de sinais e aclimatação a estresses ambientais (HARTT et al., 1963; SALERNO &

CURATTI, 2003). A síntese de sacarose pode ser catalisada por duas enzimas: a sintase de

sacarose fosfato (SPS):

e a sintase de sacarose (SuSy):

A SPS é uma proteína de baixa abundância (< 0,1% da proteína solúvel foliar) e é

relativamente instável (HUBER & HUBER, 1996). É considerada uma enzima chave no

processo de síntese de sacarose, porém ambas as enzimas (SPS e SuSy) estão solúveis no

citoplasma e catalisam livremente as reações. Entretanto, a principal via de síntese de sacarose

envolve a ação sequencial da SPS, que catalisa a penúltima etapa da rota de síntese e da

enzima fosfatase de sacarose fosfato (SPP;) que remove rapidamente o fosfato inorgânico (Pi)

da sacarose-6-fosfato liberando a sacarose. A liberação da sacarose torna a reação da SPS

irreversível, proporcionando uma eficiente produção de sacarose, mesmo em condições de

baixa concentração de substrato (HUBER & HUBER, 1996; SALERNO & CURATTI, 2003).

A SPS exerce controle maior em altas taxas fotossintéticas e, como tal, tem grande

controle sobre o fluxo máximo através da rota de síntese de sacarose (HUBER & HUBER,

1996). Além disso, a SPS é o passo limitante da velocidade da biossíntese da sacarose, e se

UDP-glicose + frutose sacarose + UDP + H+

UDP-glicose + frutose-6-fosfato sacarose-6-fosfato + UDP + H+

7

correlaciona com exportação deste açúcar (HUBER & HUBER, 1996; STITT et al.,1988).

GROF & CAMPBEL (2001) observaram que a atividade da SPS foliar está correlacionada

com o conteúdo de sacarose entre cultivares de cana-de-açúcar, entretanto isso somente no

tecido fonte.

A SPS também está presente em outros tecidos que atuam na síntese de sacarose,

como por exemplo, frutos em fase de amadurecimento, e em cana-de-açúcar (RAE et al.,

2005), tendo importante ação sobre o acúmulo e metabolismo da sacarose nos colmos (GROF

et al., 2007). Os mecanismos de controle da SPS são: a expressão gênica, o controle alostérico

pela glicose-6-fosfato (Glu-6-P) (ativador) e Pi (inibidor) e ainda pela fosforilação reversível

da porção seril da molécula da enzima (HUBER & HUBER, 1996; VERMA et al., 2011).

A sacarose é sintetizada nas células do mesofilo e também como resultado da hidrólise

de amido na BFV (Figura 1). A sacarose sintetizada nas folhas da cana-de-açúcar é

transportada para os outros tecidos, via floema. Duas hipóteses de como a sacarose entra no

floema foram postuladas: o carregamento simplástico, através do plasmodesmata, e

carregamento apoplástico, mediada por um sistema de transporte ativo (FROMMER &

SONNEWALD, 1995). Em cana-de-açúcar, as células do floema não estão conectadas a

outras células da folha por plasmodesmas (ROBINSON-BEERS & EVERT, 1991) sugerindo

que o carregamento do floema ocorra, principalmente, via apoplasto. O carregamento ativo

ocorre no sentido da célula do mesofilo para as células do floema, contra um gradiente de

concentração. O gradiente de prótons, que é necessário para o co-transporte de sacarose e de

prótons (DELROT, 1981), é gerado por uma H+-ATPase, localizada na membrana plasmática

das células companheiras (BOUCHE-PILLON et al., 1994).

O transporte da sacarose da fonte para os drenos inicia-se com seu movimento a partir

do citoplasma das células do mesofilo para os complexos células companheiras-elementos

crivados (cc-ec) do floema. Ou seja, o carregamento do floema, é uma interface entre a

produção de fotoassimilados na fonte e o seu consumo nos drenos. O carregamento do floema

é regulado tanto pela fonte como pelo dreno (SMITH & STITT, 2007). Em cana-de-açúcar o

carregamento do floema ocorre possivelmente via apoplasto nas folhas. No floema o

transporte da sacarose a partir das folhas para os outros órgãos drenos, ocorre em resposta a

um gradiente de concentração (VAN BEL, 2003; RAE et al., 2005).

O fluxo de sacarose das células do mesofilo para o complexo cc-ec é afetado pela

temperatura (DU & NOSE, 2002), deficiência hídrica (DU et al., 1998), e pela atividade de

enzimas relacionadas com o metabolismo da sacarose, como a SPS, SuSy, invertases neutras

(IVN), invertases ácidas (IVA) (VERMA et al., 2010) e demanda por fotoassimilados pelo

8

dreno (WARDLAW, 1990). Em condições limitantes na folha, o aumento da fotossíntese

líquida acarreta aumentos proporcionais ao fluxo de fotoassimilados. Durante o curso de um

dia há variação no fluxo de radiação e consequentemente, na produção fotossintética. Sob alta

radiação o excesso de fotoassimilado é armazenado como amido no cloroplasto (PAUL &

PELLNY, 2003) e/ou como sacarose nos vacúolos (SOUZA, 2011). Conforme ocorre

diminuição da radiação e queda na fotossíntese pode ocorrer mobilização e exportação de

amido acumulado durante o dia (SMITH & STITT, 2007; SOUZA, 2011). Durante a noite o

amido é degradado produzindo sacarose, a qual é transportada e utilizada metabolicamente. A

intensidade de remobilização e de exportação durante a noite é consistente com o teor de

amido nas folhas no final do dia (HENDRIX & GRANGE 1991).

O fluxo de exportação da sacarose parece ser definido pela atividade da SPS

(GALTIER et al., 1993; HARTT et al., 1963; VERMA et al., 2011) que é afetada pela

demanda do dreno e pelo ambiente (DU et al., 1998; DU & NOSE, 2002; YANG et al., 2001).

Por exemplo, a duração do dia tem efeito significativo sobre a partição de fotoassimilados

entre a sacarose e o amido. Há forte correlação na proporção de sacarose e de amido em

folhas com a atividade da SPS (GALTIER et al., 1993). Sob condições de dias curtos o

acúmulo de amido aumenta e há queda na atividade da SPS. O aumento da síntese de amido

durante o dia possibilita a manutenção da exportação de fotoassimilados durante o período da

noite (SMITH & STITT, 2007). A taxa de exportação de sacarose está relacionada com o teor

de amido nas folhas no final do dia. Desta forma, a atividade da SPS nas folhas desempenha

um papel crucial na partição de carbono, a partir do substrato da hidrólise do amido. Além

disso, os níveis elevados de SPS têm o potencial de aumentar as taxas fotossintéticas em

condições favoráveis (GALTIER et al., 1993). Ocorre, portanto uma coordenação entre a

produção de fotoassimilados e a utilização destes produtos para o metabolismo e crescimento

(GRAHAM & MARTIN, 2000).

O movimento da sacarose a partir do floema para o parênquima de armazenamento

inicia-se com o descarregamento do floema. A presença de inúmeros plasmodesmas nas

células sugere que as células sejam conectadas simplasticamente e que o transporte de

sacarose poderia ser potencialmente via simplasto. No entanto, a presença de sacarose no

apoplasto sugere que a sacarose também seja descarregada via apoplasto (RAE et al., 2005).

Assim, a sacarose e os produtos da sua hidrólise (hexoses) pelas IVA (GLASZIOU &

GAYLER, 1972) podem ser acumulados nas células do parênquima, via transportadores de

membrana. Sugere-se que a atividade das invertases mantém o gradiente de sacarose entre a

fonte e o floema, dando continuidade ao descarregamento do floema.

9

A rota do movimento de sacarose e o local da sua quebra, além de serem fundamentais

para o mecanismo de importação, têm importância devido aos sinais gerados pelos açúcares.

Dependendo da via de entrada de sacarose nos drenos, ou seja, via plasmodesmata ou parede

celular, a sacarose pode ser quebrada pela invertase de parede celular, invertase

citoplasmática ou invertase vacuolar (produzindo hexoses) ou pela SuSy (gerando frutose e

UDP-glicose) (KOCH, 2004). Entretanto na quebra da sacarose via invertases há duas vezes

mais produção de hexoses que pela SuSy.

Como descrito anteriormente, a SuSy também está envolvida com a síntese, assim

como na quebra da sacarose, gerando UDP-glicose e frutose, sendo esta última a, sua função

principal (SALERNO & CURATTI, 2003). A quebra da sacarose é vital em plantas, não só na

alocação do carbono, mas na sinalização a base de hexoses nos drenos. Apenas as reações das

invertases e da SuSy estão envolvidas na rota da quebra da sacarose in vivo, sendo a regulação

dessas reações e suas consequências, importantes no metabolismo de carbono em plantas

(KOCH, 2004). De maneira geral, a SuSy está envolvida em processos de direcionamento da

sacarose a processos anabólicos, partição de sacarose entre fonte e dreno, em respostas à

anaerobiose e frio, armazenamento e maturação (KOCH, 2004; STURM & TANG, 1999).

As invertases estão relacionadas com a quebra da sacarose em glicose e frutose. As

invertases presentes no citoplasma tem pH ótimo entre 6,5 e 8,0, sendo chamadas de

invertases neutras (IVN) e as presentes nos vacúolos e parede celular, tem um pH ótimo ácido

(pH 5,0), portanto sendo chamadas de invertases ácidas (IVA). Geralmente a invertase da

parede celular está envolvida na partição da sacarose entre fonte e dreno, respiração, redução

do turgor em zonas relacionadas ao carregamento do floema, respostas a ferimentos e

infecções e no controle da diferenciação celular e desenvolvimento da planta. A invertase

vacuolar está envolvida no processo de osmorregulação e expansão celular, respiração,

máxima geração de hexoses no vacúolo, controle da composição de açúcares em frutas e

órgão de armazenamento e resposta ao frio. A invertase citoplasmática tem provável função

no catabolismo (STURM & TANG, 1999; KOCH, 2004).

Em cana-de-açúcar, um acúmulo significativo de sacarose ocorre no inverno, quando

as baixas temperaturas e a seca são fatores ambientais comuns que afetam a fisiologia da

planta. No inverno, a baixa taxa de crescimento da planta favorece os processos de acúmulo

de sacarose nos colmos, ou seja, crescimento ativo e armazenamento são processos

competitivos e determinados pelas condições do ambiente (HATCH & GLASZIOU, 1963).

A baixa temperatura e a deficiência hídrica são fatores que afetam diretamente o

crescimento e produtividade dos cultivos agrícolas (MACHADO et al., 2009; PEARCE,

10

1999; PIMENTEL, 2004). A taxa máxima de crescimento da cana-de-açúcar ocorre entre 25 e

35 °C e quando expostas a temperatura de 15 °C já se observa inibição do crescimento

vegetativo (EBRAHIM et al., 1998; SALES et al., 2012).

A mudança de temperatura incide diretamente sobre todo processo cinético e

termodinâmico nos aspectos bioquímicos e fisiológicos da planta (PEARCE, 1999). Sob baixa

temperatura, as plantas são classificadas em três categorias em relação a sensibilidade: 1)

suscetíveis ao frio, ou seja, são danificadas por temperaturas abaixo de 12 °C; 2) tolerante ao

frio, mas suscetíveis ao congelamento, ou seja, podem aclimatar em temperaturas inferiores a

12 °C, mas são incapazes de sobreviver ao congelamento; e 3) tolerantes ao congelamento, ou

seja, capazes de se adaptarem para sobreviver em temperaturas abaixo de zero. A baixa

temperatura tem efeito direto sobre as células, enquanto o congelamento, muitas vezes age de

forma indireta e danificando as células pela desidratação (PEARCE, 1999). Entretanto, em

espécies tropicais sensíveis ao resfriamento podem ocorrer danos mesmo quando expostas a

temperaturas superiores à de congelamento do tecido (KAKANI et al., 2008; SAGE, 2007).

Folhas de plantas expostas ao resfriamento mostram inibição da fotossíntese,

translocação de sacarose, menor respiração, inibição do metabolismo de proteínas, geração de

espécies reativas de oxigênio, crescimento lento e murcha foliar. Estas modificações são

causadas por disfunções em processos metabólicos promovidos por alterações das

propriedades da membrana, mudanças na estrutura de proteínas e nas interações entre

macromoléculas, além de inibição de reações enzimáticas (CARMO-SILVA et al., 2008;

KAKANI et al., 2008; LIU et al., 2012; SOARES-CORDEIRO et al., 2010).

Entretanto, plantas que permanecem ativas durante o inverno, têm a respiração, a

fotossíntese e a síntese de proteínas reguladas pelo frio (GUY, 1990). Em geral, essa

regulação do metabolismo primário é essencial para sustentar o crescimento, ainda que este

seja menor que em temperaturas mais elevadas (PEARCE, 1999). Segundo LEVITT (1980) e

SAKAI & LARCHER (1987) citados por PEARCE (1999), durante o crescimento sob baixas

temperaturas ocorre acúmulo de solutos como aminoácidos livres e, especialmente,

carboidratos. Uma possível explicação para esse acúmulo durante a aclimatação ao frio é que

nesse período há maior limitação do crescimento do que da fotossíntese, sendo assim uma

consequência direta do menor uso do carboidrato (PEARCE, 1999). A formação de reserva

contribui para o crescimento rápido quando o ambiente torna mais quente (PEARCE, 1999;

POLLOCK & JONES, 1979). Há uma variedade de solutos que podem ser acumulados e

correlacionados com a tolerância ao frio. Em gramíneas, por exemplo, foi observado o

acúmulo de sacarose e frutanos (POLLOCK & JONES, 1979).

11

Além das condições térmicas, a deficiência hídrica do solo constitui um dos estresses

mais limitantes da produtividade vegetal (PIMENTEL, 2004). A deficiência hídrica tem

impacto variável na produtividade agrícola dependendo da fase fenológica em que ocorre e da

cultivar (INMAN-BAMBER & SMITH, 2005; MACHADO et al., 2009, SALES et al., 2012).

A emergência da plântula e o período compreendido entre a pré e pós-floração são as fases

fenológicas de maior suscetibilidade à seca em termos de produção agrícola de grãos

(PIMENTEL, 2004). Contudo, nos cultivos em que os órgãos de interesse econômico não são

os frutos ou sementes, como no caso da cana-de-açúcar (colmo), os efeitos da deficiência

hídrica são prejudiciais quando a mesma ocorre na fase inicial de estabelecimento das plantas

(MACHADO, 2009), bem como na de intenso crescimento (ROBERTSON et al., 1999).

Sob deficiência hídrica, as plantas apresentam alterações morfofisiológicas, tais como

enrolamento e alteração do ângulo da folha, redução da área foliar, da transpiração, da

condutância estomática, da fotossíntese (comprometimento das etapas fotoquímica e

bioquímica), da condutividade hidráulica das raízes, modificação da atividade de enzimas do

metabolismo do carbono e mudanças nos teores de antioxidantes (GHANNOUM, 2009;

LOPES et al., 2011; MACHADO et al., 2009; RIBEIRO et al., 2013). Algumas destas

respostas visam reduzir os efeitos deletérios da baixa disponibilidade hídrica, constituindo,

portanto, mecanismos de tolerância à seca (KRAMER, 1980). No caso da cana-de-açúcar,

alguns genótipos mostram diferentes capacidades de recuperação no crescimento após eventos

de seca (LANDELL et al., 2004; MACHADO et al., 2009; SALES et al., 2012).

A fotossíntese sob deficiência hídrica decresce inicialmente devido ao fechamento

estomático e, com o agravamento da seca, também se evidenciam limitações metabólicas

(CARMO-SILVA et al., 2008; GHANNOUM et al., 2003; GHANNOUM, 2009; LOPES et

al., 2011). O fechamento estomático é a primeira linha de defesa contra dessecação, pois é

mais rápido que as mudanças no crescimento radicular, da área foliar, da ultraestrutura dos

cloroplastos, dos pigmentos e proteínas. Espécies tolerantes à seca tem controle estomático

que permite alguma fixação de carbono durante o estresse, melhorando assim a eficiência do

uso da água, ou ainda, os estômatos abrem rapidamente após reidratação (MACHADO et al.,

2009; YORDANOV et al., 2000).

São poucos os estudos envolvendo a atividade das enzimas do metabolismo da

sacarose e amido em folhas (fonte) de cana-de-açúcar sob deficiência hídrica e/ou baixa

temperatura, assim como as trocas gasosas quando estes fatores ocorrem de forma simultânea

(SALES et al., 2012). A maioria dos trabalhos relaciona as enzimas do metabolismo de

sacarose apenas com o transporte e armazenamento nos colmos (dreno). No entanto, o

12

conhecimento de como estas enzimas atuam nas folhas e os efeitos dos estresses ambientais

sobre suas atividades são fundamentais para a compreensão da partição dos fotoassimilados,

do crescimento e do acúmulo de sacarose em cana-de-açúcar (GROF & CAMPBELL, 2001).

13

3 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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19

CAPÍTULO II

20

Baixa temperatura noturna e deficiência hídrica na fotossíntese de cana-de-açúcar

RESUMO

O objetivo deste trabalho foi avaliar as respostas fotossintéticas da cana-de-açúcar aos

efeitos simultâneos e isolados de temperatura noturna (TN) baixa e deficiência hídrica (DH).

Após 128 dias do plantio, as plantas da cultivar IACSP94-2094 foram submetidas aos

tratamentos: controle sem DH e TN de 20 °C (TN20); com DH e TN de 20 °C (DH/TN20); sem

DH e TN de 12 °C (TN12); e com DH e TN de 12 °C (DH/TN12) por cinco dias. Após o período

de tratamento as plantas foram irrigadas e retornaram a TN de 20 °C por mais quatro dias, para

recuperação. Houve decréscimos na assimilação de CO2 em todos os tratamentos. A

recuperação total da assimilação de CO2 foi observada apenas nas plantas do tratamento TN12.

A ocorrência simultânea da baixa temperatura noturna e da deficiência hídrica causou efeito

negativo na condutância estomática, na capacidade máxima da ribulose-1,5-bisfosfato

carboxilase e no transporte aparente de elétrons, fator de eficiência e eficiência operacional do

fotossistema II, causando limitações difusivas, bioquímicas e fotoquímicas da fotossíntese. A

ocorrência de baixa temperatura e déficit hídrico causa queda no teor de amido nas folhas,

favorecendo o aumento no teor de sacarose.

Palavras-chaves: Saccharum spp.; assimilação de CO2; PEPcase; resfriamento; Rubisco.

21

Low night temperature and water deficit on photosynthesis of sugarcane

ABSTRACT

The objective of this work was to evaluate the photosynthetic responses of sugarcane

to the isolate and simultaneous effects of low night temperature (TN) and water deficit (WD).

After 128 days of planting, plants of the cultivar IACSP94-2094 were subjected to the

following treatments: control, without WD and TN of 20 °C (TN20); with WD and TN of 20 °C

(DH/TN20); without WD and TN of 12 °C (TN12); and with WD and TN of 12 °C (DH/TN12).

After five days in each treatment, plants were irrigated and subjected to TN of 20 °C for four

days for recovering. There were decreases in leaf CO2 assimilation in all treatments. Total

recovery of CO2 assimilation was noticed only in plants of treatment TN12. The simultaneous

occurrence of low night temperature and water deficit caused a negative effect on stomatal

conductance, on the maximum capacity of ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase and on

electron transport rate, efficiency factor and operational efficiency of photosystem II, causing

diffusive, biochemical and photochemical limitations of photosynthesis. The occurrence of

low temperature and water deficit causes a decrease in starch content in the leaves, favoring

an increase in sucrose content.

Keys-words: Saccharum spp.; CO2 assimilation; PEPcase; cooling; Rubisco.

22

1 INTRODUÇÃO

A cultura de cana-de-açúcar (Saccharum spp.) tem importância mundial como fonte de

alimento e de energia e o cultivo dessa espécie no Brasil aumentou em áreas marginais, onde

há variações anuais acentuadas de temperatura e da disponibilidade hídrica (ROLIM et al.,

2007). Episódios de baixa temperatura noturna ocorrem com certa frequência e causam danos

que podem afetar a produtividade das plantas (SALES et al., 2012; SOARES-CORDEIRO et

al., 2010). Nas regiões subtropicais, a ocorrência de baixas temperaturas noturnas é comum no

final do inverno, quando há deficiência hídrica no solo e dias com temperaturas relativamente

altas.

As plantas têm tolerância variável à baixa temperatura e em espécies tropicais

sensíveis ao resfriamento podem ocorrer danos mesmo em temperaturas bem acima da

temperatura de congelamento do tecido (KAKANI et al., 2008; SAGE, 2007). Folhas de

plantas expostas ao resfriamento mostram inibição da fotossíntese, translocação mais lenta de

carboidratos, menor respiração, inibição do metabolismo de proteínas, geração de espécies

reativas de oxigênio, crescimento lento e murcha foliar. Estas modificações são causadas por

disfunções em processos metabólicos promovidos por alterações das propriedades da

membrana, mudanças na estrutura de proteínas e nas interações entre macromoléculas, além

de inibição de reações enzimáticas (CARMO-SILVA et al., 2008; KAKANI et al., 2008;

SOARES-CORDEIRO et al., 2010; LIU et al., 2012). Em condições de baixa temperatura

noturna (5 a 12 °C), observaram-se decréscimos na fotossíntese em espécies C4 (milho e

gramíneas) devido tanto a fatores difusivos quanto metabólicos (KAKANI et al., 2008;

SOARES-CORDEIRO et al., 2010).

Além das condições térmicas, a deficiência hídrica do solo constitui um dos estresses

mais limitantes da produtividade vegetal. A deficiência hídrica tem impacto variável na

produtividade agrícola dependendo da fase fenológica em que ocorre (INMAN-BAMBER &

SMITH, 2005; MACHADO et al., 2009), havendo genótipos de cana-de-açúcar que mostram

diferentes capacidades de recuperação no crescimento após eventos de seca (LANDELL et

al., 2004; MACHADO et al., 2009). Sob deficiência hídrica, as plantas apresentam alterações

morfofisiológicas, tais como enrolamento e alteração do ângulo da folha, redução da área

foliar, da transpiração, da condutância estomática, da fotossíntese, da condutividade

hidráulica das raízes, modificação da atividade de enzimas do metabolismo de nitrogênio e de

23

carbono e mudanças nos teores de antioxidantes (GHANNOUM, 2009; LOPES et al., 2011;

MACHADO et al., 2009; RIBEIRO et al., 2013). A fotossíntese decresce inicialmente devido

ao fechamento dos estômatos e, com o agravamento da deficiência hídrica, também se

evidenciam limitações metabólicas (CARMO-SILVA et al., 2008; GHANNOUM et al., 2003;

GHANNOUM, 2009; LOPES et al., 2011).

Os estudos sobre os danos causados pela baixa temperatura noturna e deficiência

hídrica em espécies C3 são frequentes (ALLEN et al., 2000; BERTAMINI et al., 2005;

FLEXAS et al., 1999; MACHADO et al., 2010) porém, em espécies C4 como cana-de-açúcar,

são menos estudadas principalmente quando ocorrem simultaneamente (SALES et al., 2012).

O objetivo deste trabalho foi avaliar as respostas fotossintéticas e relações hídricas à

ocorrência de baixa temperatura noturna do ar e de restrição hídrica no solo, isoladamente ou

em conjunto, considerando os processos, bioquímicos, fotoquímicos e estomáticos em plantas

jovens de cana-de-açúcar.

2 MATERIAL E MÉTODOS

Em bandejas contendo substrato comercial (Carolina Soil®, Vera Cruz, RS) composto

de turfa de Sphagno, vermiculita expandida, calcário dolomítico, gesso agrícola e fertilizante

NPK (traços) foram plantados mini-toletes de cana-de-açúcar (Saccharum spp.) cv. IACSP94-

2094 (Figura 1A e B).

Aos 35 dias após o plantio (DAP), as mudas foram transplantadas para vasos plásticos

contendo 8,5 L de uma mistura de terra, areia e substrato comercial na proporção 1:1:1

(v/v/v). Foi plantada uma muda por vaso e conduzidos somente o colmo primário. As plantas

foram mantidas em casa de vegetação (Figura 1C) e receberam tanto irrigação diária quanto

aplicações de nutrientes. As aplicações dos nutrientes foram parceladas em três vezes,

totalizando, por vaso: 18,21 g de Ca(NO3)2; 5,31 g de fosfato monoamônico; 7,29 g de KCl;

2,12 g de MgSO4; 0,17 g de H3BO3; 0,20 g de MnSO4; 0,02 g de CuSO4; 0,02 g de

(NH4)6Mo7O24 x 4(H2O); 0,09 g de ZnSO4; e 0,212 mg de FeEDTA (6% Fe).

Aos 128 DAP (06/01/2011), as plantas foram submetidas aos seguintes tratamentos: 1)

testemunha, com temperatura noturna (TN) de 20 °C irrigada (TN20); 2) TN de 20 °C com

deficiência hídrica (TN20/DH); 3) TN de 12 °C irrigada (TN12) e 4) TN de 12 °C com

deficiência hídrica (TN12/DH).

24

B A

C

Para imposição da baixa temperatura noturna, as plantas foram transferidas para uma

câmara de crescimento (modelo PGR14, Conviron, Canadá) nas seguintes condições

ambientais: temperatura do ar 12±1 °C e umidade relativa de 65% e permaneceram nessa

condição durante 12 h (19:00 às 7:00h).

Figura 1 - Fotografias ilustrando (A) bandeja para germinação contendo substrato comercial

e mini-toletes de cana-de-açúcar, (B) detalhe do mini-tolete contendo a gema, e (C) visão

geral das plantas em casa de vegetação aos 56 dias após o plantio.

As plantas foram irrigadas diariamente, fazendo-se a reposição da água

evapotranspirada, que foi medida por pesagens diárias dos vasos. A deficiência hídrica foi

imposta pela suspensão da rega e o substrato foi mantido com 50% da capacidade máxima de

retenção de água, medida pela pesagem dos vasos. Ou seja, foi reposta somente a água

suficiente para manter ao substrato com 50% da capacidade de retenção total de água (SALES

et al., 2012). Os tratamentos foram impostos pelo período de cinco dias. Na sequência, as

plantas foram submetidas a um período de quatro dias de recuperação, quando os tratamentos

TN12 e TN12/DH retornaram à temperatura noturna de 20 °C e as plantas com DH foram

reidratadas. A reidratação do substrato foi realizada ao entardecer do 5º dia de tratamento, até

90% de capacidade máxima de retenção de água.

25

Durante o período experimental a temperatura do ar e a radiação solar foram

registradas continuamente pelo posto meteorológico, distante 300 m do experimento, do

Centro Experimental Central (CEC) do Instituto Agronômico (IAC), em Campinas-SP.

2.1 Variáveis medidas e calculadas

Assimilação de CO2 e fluorescência da clorofila a

Na primeira folha totalmente expandida e com a lígula aparente (folha +1), foram

realizadas simultaneamente as medidas de trocas gasosas e fluorescência da clorofila a, por

meio de um analisador de gases por infravermelho integrado com câmara de fluorescência,

modelo Li 6400-40F (Licor, Inc. Nebraska, EUA). Foram realizadas curvas de resposta da

assimilação de CO2 (A) e da fluorescência da clorofila a pela variação da concentração

intercelular de CO2 (Ci), nas condições de radiação fotossinteticamente ativa (Q) de 2000

μmol m-2

s-1

, temperatura foliar de 30 °C e déficit de pressão de vapor entre a folha e o ar ao

redor de 1,5 kPa. A variação de Ci foi obtida pela variação da concentração de CO2 do ar (Car)

de entrada da câmara de medida de acordo com LONG & BERNACCHI (2003). Essas curvas

foram realizadas no período entre 9:00 h e 12:00 h.

As variáveis analisadas em relação à fluorescência da clorofila a foram: fluorescência

mínima (Fo) e máxima (Fm), medidas após adaptação ao escuro; fluorescência no estado de

equilíbrio dinâmico (F') e máxima (Fm'), medidas após adaptação à luz (MAXWELL &

JOHNSON, 2000). A fluorescência variável máxima no escuro e à luz foram calculadas,

respectivamente, por Fv=Fm-Fo e Fv'=Fm'-Fo', onde Fo' representa a fluorescência mínima em

folhas adaptadas à luz. O termo Fq' foi calculado por Fq'=Fm'-F', representando a extinção

fotoquímica da fluorescência causada pelos centros oxidados do fotossistema II (FSII)

segundo BAKER (2008). Desta forma, calculou-se a eficiência quântica máxima (Fv/Fm) e a

eficiência operacional do FSII (Fq'/Fm'), o transporte aparente de elétrons (ETR=Fq'/Fm' x Q x

0,4 x 0,85) e o fator de eficiência do FSII (Fq'/Fv') de acordo com MAXWELL & JOHNSON

(2000) e BAKER (2008), respectivamente. Para o cálculo de ETR, considerou-se uma

distribuição de elétrons entre o FSI e FSII de 0,4 (EDWARDS et al., 1993) e a absorção de

luz 0,85. Calculou-se também a eficiência quântica da fotossíntese (CO2) pela relação

A/0,85Q, para cada valor de Ci.

A partir da curva A vs. Ci foram calculadas a eficiência aparente de carboxilação da

fosfoenolpiruvato carboxilase (PEPcase, Vpmax) e a capacidade máxima da ribulose-1,5-

26

bisfosfato carboxilase/oxigenase (Rubisco, Vmax) Os dois parâmetros bioquímicos foram

calculados à partir da solução analítica das equações propostas por COLLATZ et al. (1992):

θM² - M(Vmax + Q) + VmaxQ

Ag² - Ag (M + Vpmax /P) + M Vpmax /P = 0 (2)

onde significa a convexidade da curva A/Q, M a assimilação de CO2 no platô da curva A/Ci,

α significa a eficiência quântica aparente da curva A/Q, significa a convexidade da curva

A/Ci, Ag é a assimilação bruta de CO2, e P a pressão atmosférica. Ag foi calculada por Ag = A +

Rd, onde Rd é a respiração foliar.

Para estimar a convexidade , foi ajustada a curva A/Ci, pela equação proposta por

LIETH & REYNOLDS (1987), respectivamente:

A=(((*Ci+Amax+Rd)-((* Ci +Amax+Rd)²-(4** Ci **(Amax+Rd))0,5

)/(2*))-Rd (3)

onde Amax significa a assimilação de CO2 sob saturação de luz.

A convexidade θ relativa à curva A vs. Q, também foi estimada pela equação proposta

por LIETH & REYNOLDS (1987). As curvas de reposta de A em função da variação da luz

foram medidas aplicando-se 13 Q, de forma decrescente: 2300, 1900, 1500, 1100, 900, 700,

600, 500, 300, 200, 100, 50 e 0 mol m-2

s-1

. O tempo mínimo de equilíbrio para cada medida

em cada Q foi 180 segundos e o máximo 300 segundos, ou até que a medida apresentasse um

coeficiente de variação de 0,5 %. A concentração de CO2 e a DPVfolha-ar no ar foram de 400

mol CO2 mol-1

e 1,5 kPa, respectivamente.

Também a partir da curva A vs. Ci foram calculadas a assimilação de CO2 a 400 μmol

mol-1

no ar e a assimilação potencial de CO2 em concentração saturante de CO2 (Apot).

Estimou-se a limitação metabólica (LM) pela equação LM=[(A–A')/A]*100 conforme

LAWLOR (2002), onde A é a assimilação de CO2 das plantas controle, TN20 e A' a das plantas

sob estresse, ambas medidas em Ci de 400 μmol mol-1

. As curvas A vs. Ci foram realizadas no

1º, 2º e 4º dias após o início dos tratamentos e no 1º e 4º dias após a reidratação do solo, sob

condições naturais.

A variação diária da assimilação de CO2 foi avaliada no 3º e 5º dias após o início dos

tratamentos, considerando-se a variação natural das condições atmosféricas. Os valores de Q

27

foram medidos no início de cada horário de avaliação para ajustar a fonte de luz da câmara de

medida em Q constante homogeneizando assim as repetições. As medidas foram realizadas

entre 07:00 h e 17:00 h, em intervalos de três horas. Calculou-se a assimilação diária de CO2

(Ai) a partir da integração da assimilação instantânea de CO2 ao longo do dia.

Teor de carboidratos solúveis

No período de máximo estresse e recuperação, foram coletadas folhas +1 das plantas,

que foram imediatamente imersas em nitrogênio líquido e mantidas em freezer (-80 °C) até o

momento das análises. As folhas coletadas para análise do teor de carboidratos foram

submetidas à secagem em estufa com circulação forçada de ar à temperatura de 60 °C, por

quatro dias ou até massa constante.

Os extratos para análises de sacarose (SAC) e de açúcares solúveis totais (AST) foram

obtidos pelo método do MCW (metanol, clorofórmio e água) na proporção 12:5:3 (v/v),

descrito por BIELESK & TURNER (1966). Foram transferidos para um tubo de rosca

contendo 75 mg de amostra previamente macerada, 3 mL da solução de MCW e ficaram sob

refrigeração por 2 dias. Após a separação de fases obtida pela adição de 1,8 mL de

clorofórmio e 1,2 mL de água, coletou-se o sobrenadante que em seguida foi concentrado em

banho-maria (50 °C) para evaporação do metanol e resíduos de clorofórmio.

A determinação do teor de AST foi feita pelo método do fenol-sulfúrico (DUBOIS et

al.,1956). Em tubo de ensaio adicionaram-se 15 μL de extrato e 485 μL de água destilada,

500μL de solução de fenol 5% e 2 mL de ácido sulfúrico (H2SO4) concentrado. Após agitação

e resfriamento à temperatura ambiente, fez-se a leitura da absorbância em espectrofotômetro

(Genesys 10UV Scanning, Thermo Scientific) no comprimento de onda de 490 nm. A

concentração de AST foi calculada a partir de uma curva padrão de glicose (0,25 mg/mL) cuja

concentração variou entre 5 e 50 μg. Como branco, colocou-se água no lugar da amostra.

Determinou-se a concentração de SAC pelo método descrito por VAN HANDEL

(1968) e a dosagem pelo método do fenol-sulfúrico (DUBOIS et al.,1956). Em tubo de ensaio

adicionaram-se15 μL de extrato, 485 μL de água destilada e 500 μL de solução de hidróxido

de potássio (KOH) 30%. Os tubos foram vedados e levados ao banho-maria a 100 °C por 10

minutos. Em seguida, foram adicionados 500 μL de solução de fenol 5% e 2 mL de H2SO4

concentrado. Após agitação e resfriamento à temperatura ambiente, fez-se a leitura da

absorbância em espectrofotômetro no comprimento de onda de 490 nm. A concentração de

28

SAC foi calculada a partir de uma curva padrão de sacarose (0,25 mg/mL) cuja concentração

variou entre 5 e 50 μg. Como branco, colocou-se água no lugar da amostra.

Teor de amido

O extrato para quantificação de amido foliar foi obtido utilizando o método enzimático

descrito por AMARAL et al. (2007). Em microtubo contendo 10 mg de amostra realizou-se

uma extração prévia dos açúcares solúveis, pigmentos e fenóis adicionando-se 500 μL de

etanol 80%, levando em seguida ao banho-maria a 80 °C por 20 minutos e descartando em

seguida o sobrenadante. Este passo foi repetido quatro vezes. Após secagem do material

restante em temperatura ambiente até completa evaporação do etanol, foram adicionados 500

μL de uma solução contendo 120 U mL-1

da enzima α-amilase (EC 3.2.1.1) termoestável de

Bacillus licheniformis (Megazyme, Irlanda), diluída em tampão MOPS 10 mM e pH 6,5.

Essas amostras foram incubadas a 75 °C por 30 minutos. Este procedimento foi repetido mais

uma vez. Em seguida, adicionaram-se 500 μL de uma solução contendo 30 U mL-1

da enzima

amiloglucosidase (EC 3.2.1.3) de Aspergillus niger (Megazyme, Irlanda), diluída em tampão

acetato de sódio 100 mM e pH 4,5. Essas amostras foram incubadas a 50 °C por 30 minutos.

Este procedimento foi repetido mais uma vez. Foram acrescentados 100 μL de ácido

perclórico 0,8 M para parar a reação e precipitar as proteínas. O extrato foi centrifugado por

dois minutos a 10.000 g e procedeu-se a dosagem de amido. A glicose liberada foi dosada

adicionando-se em um microtubo 50 μL do extrato e 750 μL do reagente glicose GOD-PAP

(Laborlab, Brasil), incubados a 37 °C por 15 minutos. Fez-se a leitura da absorbância em

leitor de microplacas de ELISA (modelo EL307C, Bio- Tek Instruments, Winooski, Vermont)

no comprimento de onda de 490 nm. A concentração de glicose foi calculada a partir de uma

curva padrão de glicose (1 mg/mL) cuja concentração variou entre 2,5 e 30 µg de glicose.

Como branco, colocou-se água no lugar da amostra.

Potencial da água na folha

O potencial da água na folha (Ψw) foi medido em câmara psicrométrica (C-52, Wescor,

Logan, EUA) acoplada a um microvoltímetro (modelo HR-33T, Wescor, Logan, EUA) no

modo higrométrico às 6:00h e 14:00h (BOYER, 1995) em discos retirados da folha +2.

Delineamento experimental

29

O delineamento experimental foi inteiramente ao acaso com parcelas subdivididas no

tempo, sendo as causas de variação os quatro tratamentos (TN20; TN20/DH; TN12 e TN12/DH)

e o tempo de avaliação. Os resultados foram submetidos à análise de variância, sendo as

médias provenientes de três repetições para as medidas de fotossíntese e quatro para as

medidas de teor de carboidrato. Quando encontradas diferenças significativas, as médias

foram comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.

3 RESULTADOS E DISCUSSÃO

A figura 2 mostra a variação da radiação solar e da temperatura durante o período de

imposição dos tratamentos de baixa temperatura noturna e deficiência hídrica em cana-de-

açúcar, quando foram feitas as medidas de trocas gasosas e fluorescência da clorofila a.

Figura 2 - Variação da radiação solar (A) e da temperatura (B) durante o período

experimental. Setas indicam os dias de medidas de trocas gasosas e fluorescência da clorofila

a em cana-de-açúcar.

A imposição do frio noturno e da deficiência hídrica causou redução significativa na

assimilação diária de CO2 (Ai) a partir do 3o dia de tratamento, com reduções de 24%, 31% e

0

200

400

600

800

1000

Rad

iaçã

o s

ola

r (W

m-2

)

5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

A

16

18

20

22

24

26

28

Tem

per

atura

(oC

)

B

Janeiro /2011

30

0

200

400

600

800 3

0 dia 5

0 dia A

Ai (

mm

ol

m-2

d-1

)

Tratamentos

TN20 DH/T

N20 TN12 DH/T

N12

42% nos tratamentos DH/TN20, TN12 e DH/TN12, respectivamente, em relação à testemunha

TN20 (Figura 3). No 5º dia de tratamento, Ai teve um decréscimo mais acentuado com 71%,

50% e 61% nos tratamentos DH/TN20, TN12 e DH/TN12, respectivamente, mostrando efeito

cumulativo conforme o tempo de estresse. Os menores valores observados, nas plantas

testemunha, em Ai no 5º dia em relação ao 3º dia foram devidos à menor incidência de

radiação solar (Figura 2A).

Figura 3 - Variação da assimilação diária de CO2 (Ai) de cana-de-açúcar, cv. IACSP94-2094

aos seguintes tratamentos: TN20, temperatura noturna de 20 °C - irrigada; DH/TN20,

temperatura noturna de 20 °C - não irrigada; TN12, temperatura noturna de 12 °C - irrigada e

DH/TN12, temperatura noturna de 12 °C - não irrigada. As colunas indicam média de três

repetições (± erro padrão).

Após o 2º dia, A nas plantas submetidas à deficiência hídrica (DH/TN20) e ao frio

noturno e deficiência hídrica (DH/TN12) continuou menor em relação a TN20, atingindo

valores menores que as plantas submetidas ao tratamento TN12 (Figura 4A). Após quatro dias

da reidratação do substrato e retorno da temperatura noturna a 20 °C, apenas as plantas TN12

apresentaram A semelhante à testemunha, persistindo o efeito do frio associado à deficiência

hídrica sobre A nas plantas DH/TN12 e DH/TN20 (Figura 4A).

O decréscimo da fotossíntese observada em plantas tanto em baixa temperatura

noturna quanto sob deficiência hídrica ou a combinação de ambos os estresses, pode ser

devido a fatores difusivos, metabólicos ou fotoquímicos (GHANNOUM et al., 2003;

GHANNOUM, 2009; MACHADO et al., 2009, 2010).

A queda em gs em plantas submetidas à baixa temperatura noturna (TN12 e DH/TN12)

ocorreu possivelmente devido à redução da condutância hidráulica ocasionada pelo

31

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0 1 2 3 4 5 6 7 8 90

10

20

30

40

TN20 DH/T

N20 T

N12 DH/T

N12

Dias Dias

B

gs (m

ol m

-2 s-1)

A

A (

mol

m-2 s

-1)

decréscimo da permeabilidade do protoplasma (SELLIN & KUPPER, 2007), visto que não

houve variação do potencial da água na folha (ΨW14) nestes tratamentos (Figura 5A).

Figura 4 - A, Resposta da assimilação de CO2 (A) e B, condutância estomática (gs) em cana-

de-açúcar cv. IACSP94-2094. Tratamentos: TN20, temperatura noturna de 20 °C - irrigada

(■); DH/TN20, temperatura noturna de 20 °C - não irrigada (○); TN12, temperatura noturna de

12 °C - irrigada (∆) e DH/TN12, temperatura noturna de 12 °C - não irrigada (▼). Dados

retirados da curva A vs. Ci, sob saturação de luz e 400 μmol mol-1

de CO2. Período de

aplicação dos tratamentos, dias 1 a 5; período de recuperação com retorno da irrigação das

plantas e temperatura noturna de 20 °C, dias 5 a 9.

O fechamento estomático devido à redução da umidade do substrato está relacionado

com a diminuição do ΨW14 em DH/TN20 (Figura 5A), com a condutividade hídráulica e com o

transporte de sinais bioquímicos como o transporte e redistribuição do ácido abscísico devido

à alcalinização da seiva do xilema, desde as raízes até as folhas (GHANNOUM et al., 2009;

MACHADO et al., 2009; 2010).

Assim como observado para gs, a transpiração (E) foi menor nos tratamentos TN12,

DH/TN20 e DH/TN12 em relação à testemunha, após quatro dias dos tratamentos (Figura 5B).

Somente as plantas do tratamento DH/TN20 tiveram menor ΨW14 em relação à

testemunha (Figura 5A). Este resultado é intrigante, pois em relação às plantas DH/TN12, gs e

E foram semelhantes à DH/TN20 (Figuras 4B e 5B). No 4º dia de reidratação e retorno da

temperatura noturna a 20 °C, nas plantas DH/TN20 e DH/TN12 houve recuperação parcial de

gs e E (Figuras 4B e 5B). Somente TN12 recuperou totalmente gs e E após retorno da

temperatura noturna a 20 °C. As plantas do tratamento DH/TN20 recuperaram totalmente o

ΨW14 no 4º dia após a reidratação (Figura 5A).

A assimilação máxima de CO2 (Apot) dos tratamentos TN12, DH/TN20 e DH/TN12

foram menores que a testemunha (p<0,05) a partir do 1º dia. No 2º dia as plantas que foram

32

submetidas a TN12 e DH/TN12 apresentaram Apot menor que as DH/TN20, sugerindo efeito

mais intenso da baixa TN do que do DH no início do estresse.

Figura 5 - A, Variação de potencial da água na folha (W14) e B, transpiração (E) em cana-

de-açúcar cv. IACSP94-2094 submetida aos tratamentos: TN20, temperatura noturna de 20 °C

- irrigada; DH/TN20, temperatura noturna de 20 °C - não irrigada; TN12, temperatura noturna

de 12 °C - irrigada e DH/TN12, temperatura noturna de 12 °C - não irrigada. As colunas

indicam média de três repetições (± erro padrão). Período de aplicação dos tratamentos, dias 1

a 5; período de recuperação com retorno da irrigação das plantas e temperatura noturna de 20

°C, dias 5 a 9.

No 4º dia, Apot de DH/TN20 e DH/TN12 foram as menores, enquanto as plantas TN12

apresentaram aclimatação (Figura 6A). Apot é medida em condições de saturação de CO2 e,

portanto, desconsidera limitações difusivas. Assim, os valores inferiores em relação às plantas

TN20 indicam limitações metabólicas. Em DH/TN20 e DH/TN12 os valores de Apot foram

menores que os outros tratamentos no final do período de recuperação sugerindo que as

limitações metabólicas ainda persistiram nestes dois tratamentos, destacando DH/TN12 que foi

menor que DH/TN20. De fato, o decréscimo da fotossíntese foi associado ao aumento

significativo da limitação metabólica (LM) nas plantas que sofreram restrição hídrica

(DH/TN20 e DH/TN12) e que não apresentaram redução de LM após a reidratação do solo

(Figura 6B). Também neste caso a LM de DH/TN12 ficou maior que DH/TN20 na recuperação.

O ciclo fotossintético C4 da cana-de-açúcar caracteriza-se por adaptações celulares,

bioquímicas e fisiológicas. O CO2 atmosférico é inicialmente fixado pela fosfoenolpiruvato

carboxilase (PEPcase) em ácido C4 nas células do mesofilo. Os ácidos C4 são transportados

para as células da bainha do feixe vascular (BFV), onde são descarboxilados, e o CO2 liberado

entra no metabolismo C3 via ribulose-1,5-bisfosfato (RuBP) carboxilase/oxigenase (Rubisco)

confinada nas células da BFV. Este mecanismo concentra CO2 próximo à enzima Rubisco,

-1,0

-0,8

-0,6

-0,4

-0,2

0,01 4 9

W

14 (

MP

a)

A

1 4 90

1

2

3

4

5

6

7

E (m

mol m

-2 s-1)

TN20 DH/TN20

TN12 DH/TN12

B

Dias

Dias

33

-20

0

20

40

60

80

100

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0 1 2 3 4 5 6 7 8 90

10

20

30

40

50

0

10

20

30

40

50

LM (%

)

B

Dias

Vp

ma

x (m

ol

m-2 s

-1)

Dias

C

Vm

ax (

mo

l m-2 s

-1)

D

TN20 DH/T

N20 T

N12 DH/T

N12

Ap

ot (

mo

l m

-2 s

-1)

A

permitindo sua maior atividade como carboxilase e consequente maior eficiência do uso de

água e de nitrogênio e ausência de fotorrespiração (SAGE, 2007). Desta forma, a LM da

fotossíntese pode estar relacionada a alterações na atividade enzimática da PEPcase e da

Rubisco, com a regeneração dos substratos das enzimas e transporte de elétrons (CARMO-

SILVA et al., 2008; GHANNOUM, 2009; RIPLEY et al., 2007; SOARES-CORDEIRO et al.,

2010). A eficiência aparente de carboxilação da PEPcase (Vpmax) foi menor, em relação a

testemunha, no 1º dia, em todos os tratamentos. No entanto, houve aclimatação das plantas no

início do período de recuperação, ou seja, os valores de Vpmax se igualaram aos verificados em

TN20 (Figura 6C). Alguns estudos também mostram a redução na atividade da PEPcase com a

diminuição do conteúdo de água no solo (DU et al., 1996; MARKELZ et al., 2011) e com a

baixa temperatura noturna (KAKANI et al., 2008; SOARES-CORDEIRO et al., 2010).

Figura 6 - A,Variação de assimilação máxima em CO2 saturante (Apot); B, limitação

metabólica (LM); C, eficiência de carboxilação da PEPcase (Vpmax) e D, eficiência máxima da

Rubisco (Vmax) em cana-de-açúcar cv. IACSP94-2094 submetida aos tratamentos: TN20,

temperatura noturna de 20 °C - irrigada (■); DH/TN20, temperatura noturna de 20 °C - não

irrigada (○); TN12, temperatura noturna de 12 °C - irrigada (∆) e DH/TN12, temperatura

noturna de 12 °C - não irrigada (▼). Os símbolos indicam média de três repetições (± erro

padrão). Período de aplicação dos tratamentos, dias 1 a 5; período de recuperação com retorno

da irrigação das plantas e temperatura noturna de 20 °C, dias 5 a 9.

34

A capacidade máxima da Rubisco (Vmax) in vivo foi menor que a testemunha em todos

os tratamentos no 1º dia, sendo mais acentuada em TN12 e DH/TN12 no 2º dia e DH/TN20 e

DH/TN12 no 4º dia de tratamento. Nas plantas do tratamento TN12 foi observada a aclimatação

de Vmax. Os valores de Vmax foram maiores que dos outros tratamentos e próximos a

testemunha no 4º dia de tratamento e semelhantes à testemunha no final do período de

recuperação (Figura 6D). As plantas DH/TN12 apresentaram recuperação parcial de Vmax ao

término do período de recuperação (Figura 6D).

As reduções de Vpmax e Vmax indicam limitações bioquímicas do metabolismo

fotossintético C4 da cana-de-açúcar em condições de baixa temperatura noturna e deficiência

hídrica. A atividade da Rubisco foi mais sensível aos tratamentos, em especial nas plantas

submetidas à deficiência hídrica (DH/TN20 e DH/TN12), mesmo após a reidratação quando

apresentavam LM ao redor de 25%, devido aos baixos valores de Vmax (Figura 6B, D). No 4º

dia de recuperação Vmax de DH/TN12 foi menor que DH/TN20 (Figura 6D).

Os tratamentos não causaram variações significativas na eficiência quântica máxima

do FSII (Fv/Fm), sugerindo que não houve fotoinibição da fotossíntese (Figura 7A). No

entanto, o transporte aparente de elétrons (ETR) e a eficiência operacional do FSII (Fq'/Fm')

foram menores no 1º dia dos tratamentos do que no controle (Figura 7B, C).

Apenas as plantas do tratamento DH/TN12 não recuperaram ETR e Fq'/Fm' após quatro

dias da reidratação. O decréscimo de Fq'/Fm' indica diminuição significativa da dissipação da

energia dos elétrons na etapa fotoquímica, também confirmada pela redução do fator de

eficiência do FSII (Fq'/Fv') (Figura 7D), implicando aumento na dissipação não fotoquímica

de fluorescência (RIPLEY et al., 2007). Assim, a redução de Fq'/Fm' pode estar relacionada ao

fechamento (redução) dos centros de reação do FSII sob condição de baixa temperatura e

deficiência hídrica (BAKER, 2008), refletindo em acúmulo de QA em estado reduzido,

indicado pela diminuição de Fq'/Fv', devido à significativa redução da assimilação de CO2 em

DH/TN20, TN12 e DH/TN12.

A diminuição de gs causa menor fluxo de CO2 para o mesofilo foliar podendo causar

redução na concentração de CO2 junto à Rubisco e assim estimular a atividade da oxigenase,

ou seja, a fotorrespiração (CARMO-SILVA et al., 2008). De fato, no nosso experimento

houve queda de Ci somente em DH/TN20 e no 4º dia de estresse (Ci =115±25 μmol mol-1

em

DH e Ci =176±19 μmol mol-1

nos demais tratamentos).

35

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

30

60

90

120

150

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,65

0,70

0,75

0,80

0 1 2 3 4 5 6 7 8 90,1

0,2

0,3

0,4

Dias Dias

ET

R (

mol

m-2 s

-1) C

Fq '/F

m '

B

TN20 DH/T

N20 T

N12 DH/T

N12

A

Fv/F

m

Fq '/F

v '

D

Figura 7 - A, Resposta de eficiência quântica máxima do fotossistema II (Fv/Fm); B,

eficiência operacional do FSII (Fq'/Fm'); C, transporte aparente de elétrons (ETR) e D, fator de

eficiência do FSII (Fq'/Fv') em cana-de-açúcar cv. IACSP94-2094 submetida aos tratamentos:

TN20, temperatura noturna de 20 °C - irrigada (■); DH/TN20, temperatura noturna de 20 °C -

não irrigada (○); TN12, temperatura noturna de 12 °C - irrigada (∆) e DH/TN12, temperatura

noturna de 12 °C - não irrigada (▼). Os símbolos indicam média de três repetições (± erro

padrão). Período de aplicação dos tratamentos, dias 1 a 5; período de recuperação com retorno

da irrigação das plantas e temperatura noturna de 20 °C, dias 5 a 9.

A relação entre a eficiência quântica CO2 e Fq'/Fm' não foi modificada pelos

tratamentos (Figura 8), sugerindo que não houve aumento na atividade de drenos alternativos

de elétrons, como fotorrespiração e reação de Mehler (GHANNOUM, 2009), e sim

decréscimo no uso da energia em reações fotoquímicas da fotossíntese. Este resultado sugere

que, apesar de ter ocorrido menor fluxo de CO2 devido à diminuição de gs, o mecanismo de

concentração de CO2 da cana-de-açúcar nos tratamentos avaliados é efetivo em limitar a

fotorrespiração (CARMO-SILVA et al., 2008).

O carboidrato gerado pela fotossíntese é a fonte de energia e substrato para o

crescimento e manutenção da fitomassa. Com relação aos carboidratos, os teores de açúcares

solúveis totais (AST) não foram alterados até o 5º dia de tratamento (Tabela 1), porém ocorreu

queda no 4º dia da recuperação em DH/TN20 e TN12, sugerindo efeito da seca e da baixa

temperatura, respectivamente.

36

0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,250,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25

0,00

0,01

0,02

0,03

C

O2 [

(m

ol

CO

2

mo

l fó

ton

s)-1

]

TN20 DH/T

N20 T

N12 DH/TN12

Fq'/F

m'

Figura 8 - Relação entre eficiência quântica de CO2 (CO2) e eficiência operacional do

fotossistema II (Fq’/Fm’) em cana-de-açúcar cv. IACSP94-2094 submetida aos tratamentos:

TN20 (), temperatura noturna de 20 °C - irrigada; DH/TN20 (), temperatura noturna de

20 °C - não irrigada; TN12 (), temperatura noturna de 12 °C - irrigada e DH/TN12 (),

temperatura noturna de 12 °C - não irrigada, um (símbolos cheios e linha, CO2=-

0,003+0,132*Fq´/Fm´, R2=0,93, p<0,01) e quatro dias após os tratamentos (símbolos vazios e

linha tracejada, CO2=-0,005+0,136*Fq´/Fm´, R2=0,87, p<0,01).

No 5º dia de estresse, o teor de sacarose (Tabela 2) aumentou em função da deficiência

hídrica somente a 20 °C (DH/TN20) e da baixa temperatura noturna (média de TN12).

Tabela 1 - Teor de açúcares solúveis totais (μmol g-1


IACSP94-2094 submetida aos tratamentos: TN20, temperatura noturna de 20 °C - irrigada;

DH/TN20, temperatura noturna de 20 °C - não irrigada; TN12, temperatura noturna de 12 °C -

irrigada e DH/TN12, temperatura noturna de 12 °C - não irrigada, no 5º dia de tratamento e 4º

dia de recuperação. Período de aplicação dos tratamentos, dias 1 a 5; período de recuperação

com retorno da irrigação das plantas e temperatura noturna de 20 °C, dias 5 a 9.

5º dia de tratamento 4º dia de recuperação

TN20 296,43 ± 92,59 Aa* 251,19 ± 35,83 Aa

DH/TN20 391,92 ± 38,82 Aa 270,84 ± 34,24 Ab

Média 344,18 ± 83,22 Aa 261,02 ± 34,11 Ab

TN12 382,02 ± 41,7 Aa 209,83 ± 48,85 Bb

DH/TN12 296,32 ± 74,27 Aa 366,45 ± 70,51 Aa

Média 339,18 ± 72,16 Aa 288,15 ± 100,80 Aa

*Letras maiúsculas diferentes na coluna indicam diferença significativa ao nível de 5% pelo teste de

Tukey entre irrigações na mesma temperatura e médias. Letras minúsculas diferentes na linha indicam

diferença significativa entre 5º dia de tratamento e o 4º dia de recuperação, ao nível de 5% pelo teste

de Tukey

37

Os teores de SAC no 5º dia de tratamento aumentaram com a deficiência hídrica e com

a baixa temperatura noturna, sendo que este aumento foi maior nos tratamentos com baixa

temperatura noturna (Tabela 2).

No 4º dia de recuperação, somente os tratamentos com baixa temperatura noturna

apresentaram decréscimo de SAC (TN12 e DH/TN12) atingindo valores próximos aos do

controle (TN20, Tabela 2).

Tabela 2 - Teor de sacarose (μmol g-1

MS) em folhas de cana-de-açúcar cv. IACSP94-2094

submetida aos tratamentos: TN20, temperatura noturna de 20 °C - irrigada; DH/TN20,


DH/TN12, temperatura noturna de 12 °C - não irrigada, no 5º dia de tratamento e 4º dia de

recuperação. Período de aplicação dos tratamentos, dias 1 a 5; período de recuperação com

retorno da irrigação das plantas e temperatura noturna de 20 °C, dias 5 a 9.


TN20 36,37 ± 13,60 Ba* 56,46 ± 16,55 Aa

DH/TN20 74,13 ± 24,25 Aa 78,20 ± 13,45 Aa

Média 55,25 ± 27,18 Ba 67,33 ± 18,17 Aa

TN12 102,99 ± 30,08 Aa 59,12 ± 18,55 Ab

DH/TN12 107,69 ± 39,28 Aa 63,42 ± 24,64 Ab

Média 105,35 ± 32,49 Aa 61,27 ± 20,32 Ab


Tukey, entre irrigações na mesma temperatura e médias. Letras minúsculas diferentes na linha indicam


de Tukey.

No estresse máximo, foi observado decréscimo na concentração de amido (AMI) no

tratamento DH/TN20, em função do déficit hídrico (Tabela 3). Esse decréscimo em plantas sob

estresse por temperatura e deficiência hídrica, possivelmente foi devido a dois principais

fatores: queda em A e Ai (Figuras 3 e 4) e aumento na hidrólise do AMI, permitindo assim a

manutenção do suprimento de carbono em condições de reduzida fixação de CO2 (SALES et

al., 2012). Por outro lado, o aumento do teor de SAC deve estar relacionado com o aumento da

hidrólise de AMI, além do possível aumento na atividade da sintase de sacarose fosfato (DU et

al., 1999, 2000; FU et al., 2010; VANDOORNE et al., 2012).

38

Tabela 3 - Teor de amido (μmol de Glu g-1

MS) em folhas de cana-de-açúcar cv. IACSP94-

2094 submetida aos tratamentos: TN20, temperatura noturna de 20 °C - irrigada; DH/TN20,


DH/TN12, temperatura noturna de 12 °C - não irrigada. No 5º dia de tratamento e 4º dia de

recuperação. Período de aplicação dos tratamentos, dias 1 a 5; período de recuperação com

retorno da irrigação das plantas e temperatura noturna de 20 °C, dias 5 a 9.


TN20 208,97 ± 66,92 Aa* 32,68 ± 9,02 Bb

DH/TN20 134,34 ± 82,89 Ba 55,61 ± 6,91 Ab

Média 171,65 ± 80,34 Aa 44,14 ± 14,34 Aa

TN12 140,28 ± 30,70 Aa 94,51 ± 29,27 Aa

DH/TN12 80,05 ± 48,92 Ab 162,47 ± 38,77 Aa

Média 110,17 ± 49,66 Aa 128,49 ± 48,28 Aa


Tukey entre irrigações na mesma temperatura e médias. Letras minúsculas diferentes na linha indicam


de Tukey.

A deficiência hídrica e baixa temperatura noturna afetaram a fotossíntese devido a

fatores relacionados com a abertura dos estômatos e queda na atividade de Rubisco e PEPcase

(Figura 6C e D), sendo esperado que ocorresse diminuição da síntese de açúcar, no entanto,

paradoxalmente aumentou o teor de sacarose. Possivelmente o aumento da síntese de sacarose

seja devido ao estímulo da sintase de sacarose fosfato (FU et al. 2010; VANDOORNE et al.,

2012).

4 CONCLUSÕES

1. Na cultivar IACSP94-2094 a assimilação diurna de CO2 decresce em função da baixa

temperatura noturna e da deficiência hídrica, sendo associada à diminuição da condutância

estomática (fator difusivo), redução na atividade da PEPcase e da Rubisco (fatores

bioquímicos) e à menor atividade fotoquímica.

2. A ocorrência simultânea de baixa temperatura noturna e deficiência hídrica em plantas

jovens de cana-de-açúcar interferem na recuperação fotossintética das plantas.

3. A ocorrência de baixa temperatura e deficiência hídrica causa queda no teor de AMI

favorecendo o aumento no teor de SAC nas folhas.

39


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43

CAPÍTULO III

44

Metabolismo de carboidratos em duas cultivares de cana-de-açúcar sob baixa

temperatura e deficiência hídrica

RESUMO

Para sobreviver às condições adversas, as plantas exibem uma série de respostas aos estresses

ambientais, que frequentemente, ocorrem de forma simultânea. Tais respostas também estão

relacionadas com diferentes tolerâncias ou sensibilidades aos diversos tipos de estresses. O

objetivo deste trabalho é testar a hipótese de que cultivares de cana-de-açúcar mais tolerantes

à deficiência hídrica e/ou baixa temperatura apresentam a fotossíntese e o metabolismo de

carboidratos menos suscetível a estes fatores ambientais. Para tanto, foram utilizadas as

cultivares de cana-de-açúcar IACSP94-2094 e IACSP95-5000 plantadas em potes plásticos de

8,5 L. Aos 87 dias após o plantio, foram submetidas aos tratamentos de baixa temperatura

(22±1/12±1 °C) e deficiência hídrica, por 22 dias, em câmara de crescimento. Após este

período, as plantas foram reidratadas e a temperatura retornou a 32±1/20±1 °C, por 9 dias.

Sob condições ambientais ideais, a IACSP95-5000 tem maior eficiência fotossintética que a

IACSP94-2094. A IACSP95-5000 mostrou ser mais tolerante ao frio, devido a menor redução

da assimilação de CO2 e maior recuperação, superando as plantas controle. Sob frio e

deficiência hídrica, a IACSP94-2094 é mais tolerante por não ter apresentado decréscimo

maior da fotossíntese nos estresses simultâneos. Com a imposição dos tratamentos, foi

observado aumento no teor de açúcares solúveis e amido em ambas cultivares. Na cultivar

IACSP94-2094 sob baixa temperatura e deficiência hídrica o aumento dos açúcares solúveis

totais foi devido ao aumento da sacarose, quando há também aumento da atividade da sintase

de sacarose fosfato.

Palavras-Chave: Saccharum spp., estresses ambientais, trocas gasosas, sintase de sacarose

fosfato, invertases

45

Carbohydrate metabolism in two cultivars of sugarcane under low temperature and

water deficit

ABSTRACT

To survive under adverse environmental conditions, plants show some responses to

environmental stress that often act simultaneously. These responses are also related to

different tolerances or sensitivities to various types of stress. The aim of this study is to test

the hypothesis that sugarcane cultivars more tolerant to water deficit and/or low temperature

have photosynthesis and carbohydrate metabolism less susceptible to these environmental

factors. We used two sugarcane cultivars, IACSP94-2094 and IACSP95-5000 and planted in

plastic pots of 8.5 L. At 87 days after planting, plants were treated with low temperature

(22±1/12±1 °C) and water deficit for 22 days in a growth chamber. After this period, the

plants were rehydrated and the temperature returned to 32±1/20±1 °C for 9 days. Under ideal

environmental conditions IACSP95-5000 has a higher photosynthetic capacity than

IACSP94-2094 cultivar. The IACSP95-5000 cultivar was more tolerant to chilling, due to

lower reduction in CO2 assimilation and greater recovery, overcoming the control plants.

Under low temperature and water deficit, the IACSP94-2094 cultivar was more tolerant for

not having higher decrease of photosynthesis in combined stresses. After treatments, we

observed an increase in soluble sugars and starch in both cultivars. Soluble sugars increase on

IACSP94-2094 cultivar under low temperature and water deficit, was due to sucrose increase,

when there is an activity increase of sucrose phosphate synthase.

Key Words: Saccharum spp., environmental stress, gas exchanges, sucrose phosphate

synthase, invertases

46

1 INTRODUÇÃO

Os carboidratos gerados pela fotossíntese constituem a fonte de energia para produção

e manutenção da biomassa (VANDOORME et al., 2012). Em plantas superiores, a sacarose

além de principal produto da fotossíntese, é uma molécula de transporte para o crescimento,

desenvolvimento, armazenamento, transdução de sinais e aclimatação a estresses ambientais

(SALERNO & CURATTI, 2003).

O acúmulo de sacarose varia de acordo com o genótipo e estádio de desenvolvimento

da planta e do ambiente em que é cultivada. A planta responde ao ambiente através da

transdução de sinais que coordenam o desenvolvimento, além do acúmulo de sacarose (GROF

& CAMPBELL, 2001; MOORE, 2005).

Em plantas C3 a síntese de sacarose pode ser controlada pela regulação da frutose-1,6-

bisfosfatase e sintase de sacarose fosfato (SPS) dependendo da disponibilidade de substrato,

pela regulação alostérica e, em algumas espécies, pela fosforilação proteica (LUNN &

FURBANK, 1999). Esses mecanismos de regulação permitem que a síntese de sacarose seja

coordenada pela fotossíntese e pelas exigências de exportação ou armazenamento temporário

de carboidratos na folha. Entretanto, esse controle é mais complexo em plantas C4, devido à

presença de dois tipos de células fotossintéticas. Assim, os processos de fixação de carbono e

a síntese do produto final são coordenados não só entre cloroplasto e citosol, mas também

entre mesofilo e as células da bainha do feixe vascular (BFV) (LUNN & FURBANK, 1999).

Assim como a síntese de sacarose, a sua quebra é vital para as plantas, não só pela

alocação de carbono, mas também como iniciador de sinais por hexoses, mantendo um

equilíbrio entre ambos. Diferentes mecanismos são ativados por hexoses e outros metabólitos,

além da própria sacarose. Apenas as invertases e a reação reversível da sintase de sacarose

(SuSy) catalisam esta quebra in vivo da sacarose em tecidos vegetais. Entretanto, as invertases

produzem glicose e frutose livres em vez de UDP-glicose e frutose, gerando duas vezes mais

hexoses que a quebra da sacarose pela SuSy (KOCH, 2004).

No campo, as plantas estão expostas a diversos estresses ambientais (YORDANOV et

al., 2000), como temperaturas extremas, deficiência hídrica e salinidade. Frequentemente,

alguns estresses agem de forma simultânea, como a combinação de baixa temperatura e

deficiência hídrica, fatores comuns no inverno, que afetam a fisiologia da cana-de-açúcar.

Entretanto, para sobreviver às condições adversas, as plantas exibem uma série de respostas

47

ao estresse. Tais respostas também estão relacionadas com diferentes tolerâncias ou

sensibilidades aos diversos tipos de estresses.

O metabolismo de carboidratos responde de maneira diferente à baixa temperatura e à

deficiência hídrica, dependendo da espécie e exposição ao estresse (DU et al. 1998, DU &

NOSE, 2002). Em cana-de-açúcar são poucos os trabalhos que relatam estas respostas,

principalmente quando a exposição a estas condições ocorrem de forma simultânea (SALES

et al., 2012).

Em plantas submetidas ao resfriamento, há acúmulo dos principais açúcares como

glicose, frutose e sacarose. Além disso, a atividade da SPS foliar aumenta enquanto a da SuSy

e das invertases não (GUY et al., 1992). Sob baixa temperatura, a sacarose acumulada como

carboidrato de reserva pode ser rapidamente mobilizada conforme as necessidades

metabólicas. Dessa forma, a sacarose é rapidamente translocada para ser utilizada após o

retorno a temperaturas favoráveis, em reações como, por exemplo, a respiração. Além disso,

sob baixa temperatura o crescimento ativo é quase sempre reduzido ou paralisado (GUY et

al., 1992; JAVIER et al., 1997; SALES et al., 2012), resultando em diminuição da demanda

por produtos da fotossíntese podendo, mesmo sob estresse, acumular reservas na forma de

amido.

DU & NOSE (2002) observaram que em cultivares de cana-de-açúcar com três meses

de idade, tolerantes à baixa temperatura, após 52 h de exposição ao frio houve acúmulo de

açúcares solúveis (glicose, frutose e sacarose), semelhante ao que ocorre em plantas C3

tolerantes. Além disso, o conteúdo de amido se manteve alto durante todo o tratamento. Após

exposição ao frio, nestas cultivares tolerantes a atividade da enzima SPS foi semelhante à das

plantas controle, porém houve aumento do estado de ativação da enzima, sugerindo que o frio

não afetou o conteúdo de proteína. Já a cultivar suscetível, apresentou decréscimo da

atividade da SPS após exposição ao frio, provavelmente devido a uma redução desta enzima.

Sob deficiência hídrica moderada, DU et al. (1998) observaram em folha de cana-de-

açúcar, que os processos bioquímicos de síntese de sacarose e amido, do ciclo de Calvin e da

rota C4 não foram seriamente afetados sendo o fechamento estomático a causa do declínio da

fotossíntese. Esses autores sugerem que sob deficiência hídrica severa, a queda significante da

atividade da PPDK (piruvato ortofosfato diquinase) seja responsável pela queda da

fotossíntese. Foi observado ainda aumento da glicose e frutose, possivelmente, devido ao

aumento da atividade de enzimas de quebra do amido e da sacarose, resultando em aumento

da concentração osmótica em folhas de cana-de-açúcar.

48

VANDOORME et al. (2012) observaram em chicória que, sob deficiência hídrica, não

houve impacto sob a concentração de proteína, porém houve aumento da atividade da SPS

foliar, enquanto a atividade da SuSy não foi significativamente afetada. Já a atividade da

invertase ácida foi maior no início do tratamento de deficiência hídrica, enquanto a invertase

neutra teve decréscimo no final do tratamento quando comparada às plantas controle. Além

disso, as plantas sob estresse aumentaram a eficiência do uso da água e a concentração de

açúcares solúveis, houve diminuição na proporção raiz-parte aérea e baixou o potencial

osmótico.

Algumas cultivares de cana-de-açúcar apresentam diferentes respostas de aclimatação

e de recuperação após a ocorrência de deficiência hídrica (LANDELL et al., 2004;

MACHADO et al., 2009; RIBEIRO et al., 2013) e de baixa temperatura (DU & NOSE, 2002;

SALES et al., 2012).

Nossa hipótese é que cultivares de cana-de-açúcar mais tolerantes à deficiência hídrica

e/ou baixa temperatura apresentam metabolismo do carbono (fotossíntese e metabolismo de

carboidratos) menos suscetível a estes fatores ambientais. Baseado nesta hipótese, nosso

objetivo é estudar os efeitos da ocorrência de baixa temperatura e/ou deficiência hídrica sobre

a fotossíntese (trocas gasosas e atividade fotoquímica) e sobre o metabolismo de carboidratos

(acúmulo de carboidratos e atividade de enzimas) em duas cultivares de cana-de-açúcar, com

diferentes características quanto a sua rusticidade.

2 MATERIAL E MÉTODOS

Em bandejas contendo substrato comercial (Carolina Soil®, Vera Cruz, RS) composto

de turfa de esfagno, vermiculita expandida, calcário dolomítico, gesso agrícola e fertilizante

NPK (traços) foram plantados mini-toletes de cana-de-açúcar (Saccharum spp.) cv. IACSP94-

2094 e cv. IACSP95-5000. A IACSP94-2094 apresenta rusticidade sendo indicada para

ambientes desfavoráveis e a IACSP95-5000 é uma cultivar produtiva e indicada para

ambientes favoráveis (LANDELL et al., 2005).

Aos 35 dias após o plantio (DAP), as mudas foram transplantadas para vasos plásticos

contendo 8,5 L de uma mistura de terra, areia e substrato na proporção 1:1:1 (v:v:v). Foram

plantadas uma muda por vaso e conduzidos somente o colmo primário. As plantas foram

mantidas em casa de vegetação onde receberam tanto irrigação diária quanto aplicações de

nutrientes. As aplicações dos nutrientes foram parceladas em três vezes, totalizando, por vaso:

49

18,21 g de Ca(NO3)2; 5,31 g de fosfato monoamônico; 7,29 g de KCl; 2,12 g de MgSO4; 0,17

g de H3BO3; 0,20 g de MnSO4; 0,02 g de CuSO4; 0,02 g de (NH4)6Mo7O24 x 4(H2O); 0,09 g

de ZnSO4; e 0,212 mg de FeEDTA (6% Fe).

Aos 87 DAP, as plantas foram transferidas para câmara de crescimento (Instalafrio,

Brasil) onde permaneceram por um período de 18 dias, recebendo irrigação diária, nas

seguintes condições ambientais: fotoperíodo 14 h/10 h (dia/noite), temperatura do ar

32±1/20±1 °C (dia/noite), umidade relativa de 65% e Q de 1000 μmol m-2

s-1

(14 h). Após o

18º dia, a temperatura da câmara foi diminuída para 22±1/12±1 °C (dia/ noite). Metade das

plantas permaneceu irrigada e a outra metade foi submetida à deficiência hídrica. A restrição

hídrica foi imposta pela suspensão da rega até 30% da capacidade máxima de retenção de

água do substrato, medida por pesagem dos vasos. As plantas permaneceram nestas condições

(22±1/12±1 °C sem ou com restrição hídrica) por 22 dias, após este período, elas foram

reidratadas e a temperatura da câmara de crescimento foi reajustada para 32±1/20±1 °C

(dia/noite) e permaneceram assim por um período de 8 dias.

Durante o período experimental, foram realizadas seis medidas/coletas, nos seguintes

dias, contados após o período de aclimatação das plantas: 1ª medida/coleta feita no 18º dia na

temperatura 32±1/20±1 °C em plantas irrigadas (I) (testemunha); 2ª medida/coleta feita após

34 horas de baixa temperatura com e sem deficiência hídrica; 3ª medida/coleta feita após 13

dias de baixa temperatura e deficiência hídrica (estresse intermediário); 4ª medida/coleta feita

após 20 dias de baixa temperatura e deficiência hídrica (máximo estresse); 5ª medida/coleta

feita após dois dias de retorno à temperatura inicial e reidratação; e a 6ª (medida/coleta) feita

após 8 dias de retorno à temperatura inicial e reidratação.

2.1 Variáveis medidas e calculadas

Assimilação de CO2 e fluorescência da clorofila a

Mediu-se a variação diurna das trocas gasosas e fluorescência da clorofila a por meio

de um analisador de gases por infravermelho integrado com câmara de fluorescência, modelo

Li 6400-40F (Licor, Inc. Nebraska, EUA). As medidas foram realizadas na primeira folha

totalmente expandida e com lígula aparente (folha +1), no terço médio do limbo foliar, em

intervalos de três horas, totalizando cinco medidas, em Q de 1300 μmol m-2

s-1

e déficit de

pressão de vapor entre a folha e o ar ao redor de 1,5 kPa, as temperatura utilizadas foram as

mesmas indicadas nos tratamentos testemunha (32 °C) e baixa temperatura (22 °C). As

50

variáveis medidas em relação às trocas gasosas foram: assimilação de CO2

(A, μmol m-2

s-1

),

condutância estomática (gs, mol m

-2 s

-1), transpiração (E, mmol m

-2 s

-1) e concentração interna

de CO2 (Ci). Calculou-se a eficiência aparente de carboxilação pela razão entre A/Ci (ZHANG

et al., 2001) e a eficiência intrínseca do uso da água (EUAi) pela razão (A/gs).

As variáveis analisadas em relação à fluorescência da clorofila a foram realizadas

como descrito no capítulo II.

Para análise dos dados tanto das trocas gasosas como da fluorescência da clorofila a,

foram utilizadas as médias das 20 medidas (quatro medidas por horário) realizadas em cada

dia do período experimental. Calculou-se a assimilação diurna de CO2 (Ai) a partir da

integração da assimilação instantânea de CO2 ao longo do dia, utilizando a média de 4

repetições.

Potencial da água na folha

Em cada um dos dias de medidas das trocas gasosas também foram realizadas medidas

do potencial da água na folha (Ψw), antes das lâmpadas da câmara de crescimento serem

acesas (pré-manhã) e às 14:00 h, como descrito no capítulo II.

Teor de carboidratos

Nos dias de medidas, às 9:00 h foram coletadas folhas +1 de quatro plantas por

tratamento, as quais foram imediatamente imersas em nitrogênio líquido e mantidas em

freezer (-80 °C) até o momento das análises. Antes da elaboração do extrato para análise do

teor de carboidratos, as folhas foram submetidas à secagem em estufa com circulação forçada

de ar à temperatura de 60 °C, por quatro dias ou até massa constante. Os procedimentos foram

realizados como descrito no capítulo II.

Os extratos para análises de sacarose (SAC) e de açúcares solúveis totais (AST) foram

obtidos pelo método descrito por BIELESK & TURNER (1966).

A determinação do teor de AST foi feita pelo método do fenol-sulfúrico, descrito por

DUBOIS et al. (1956), de SAC pelo método descrito por VAN HANDEL (1968) e de amido

pelo método enzimático descrito por AMARAL et al. (2007).

51

Atividade de enzimas do metabolismo de carboidratos

A atividade das enzimas envolvidas no metabolismo de carboidratos foi quantificada

em folhas +1 que foram coletadas às 9:00 h e imediatamente imersas em nitrogênio líquido e

mantidas em freezer (-80 °C) até o momento das análises.

Para obtenção do extrato para determinação da atividade enzimática foram macerados

com nitrogênio líquido, 300 mg de material vegetal fresco em almofariz com 5% de

polivinilpolipirrolidona (PVPP) e 1,5 mL de tampão fosfato de potássio 100 mM contendo

EDTA 1mM com pH 7,0. Em seguida esse extrato foi centrifugado a 14.000 g por 30 minutos

a 4 °C e o sobrenadante foi utilizado para as análises.

Proteína solúvel total

A dosagem de proteína total no extrato foi feita segundo BRADFORD (1976),

utilizando-se um reagente preparado (Sigma-Aldrich, Brasil). Em tubo de ensaio adicionaram-

se 10 μL de extrato, 90 μL de água e 3 mL do reagente preparado, diluído na proporção 1:4

(reagente: água). Fez-se a leitura da absorbância em espectrofotômetro (Genesys 10UV

Scanning, Thermo Scientific) no comprimento de onda de 595 nm. A concentração de

proteína total foi calculada a partir de uma curva padrão obtida com leituras de soluções

contendo 5, 10, 20, 40 e 60 µg de albumina sérica bovina (BSA). Como branco, colocou-se

água no lugar da amostra.

Atividade da sintase de sacarose fosfato

A determinação da atividade da sintase de sacarose fosfato (SPS, EC 2.4.1.14) foi feita

segundo ZHU et al. (1997) com adaptações. Foram adicionados, em tubo de rosca, 50 μL de

extrato e 50 μL de tampão de reação contendo: tampão Tris-HCl 200 mM em pH 7,5, cloreto

de magnésio (MgCl2) 10 mM, EDTA 2 mM, frutose-6-fosfato (Fru-6-P) 8 mM, glicose-6-

fosfato (Glu-6-P) 40 mM e UDP-glicose (uridina 5'-difosfoglicose) 50 mM. A reação foi

incubada a 37 °C por 0, 30 e 60 minutos. A reação foi interrompida em banho-maria a 100 °C

por três minutos.

A dosagem da sacarose formada na reação foi realizada como descrito por VAN

HANDEL (1968). Foram adicionadas à reação 100 μL de KOH 30% e mantida, por 10

52

minutos, em banho-maria a 100 °C. Em seguida, acrescentou-se 1,5 mL de reagente antrona

preparado da seguinte forma: 76 mL de H2SO4, 30 mL de água e 150 mg de antrona. A reação

foi incubada a 40 °C por 20 minutos e realizada a leitura da absorbância em

espectrofotômetro (Genesys 10UV Scanning - Thermo Scientific) no comprimento de onda de

620 nm. A concentração de sacarose foi calculada a partir de uma curva padrão obtida com

leituras de soluções contendo respectivamente 0,5, 1, 2, 3 e 4 mM de sacarose. Como branco,

colocou-se água no lugar da amostra.

Atividade da sintase de sacarose

A determinação da atividade da sintase de sacarose (SuSy, EC 2.4.1.13) foi feita

segundo ZHU et al. (1997) com adaptações, em tubo de rosca foram adicionados 50 μL de

extrato e 50 μL de tampão de reação contendo: tampão Tris-HCl 200 mM em pH 7,5, MgCl2

15 mM, frutose 25 mM e UDP-glicose 25 mM. A reação foi incubada a 37 °C por 0, 30 e 60

minutos e foi interrompida em banho-maria a 100 °C por três minutos. A dosagem da

sacarose formada foi realizada como descrito anteriormente para a enzima SPS, segundo VAN

HANDEL (1968).

Atividade das invertases ácidas

A atividade da enzima invertase ácida solúvel (IVA, EC 2.4.1.25) foi obtida pelo

método descrito por ZHU et al. (1997). Em microtubo foram adicionados: 50 μL de extrato,

50 μL de tampão de reação acetato de sódio 1 M e pH 4,5 e 100 μL de uma solução de

sacarose 120 mM. A reação foi incubada a 37 °C por 0, 30 e 60 minutos. A reação foi

interrompida acrescentando-se 30 μL de Tris 2,5 M e levada ao banho-maria a 100 °C por três

minutos.

A dosagem de açúcares redutores foi realizada pelo método de Somogyi-Nelson

(NELSON, 1944; SOMOGYI, 1945; 1952). Foram colocados em tubos de ensaio 100 μL de

reação enzimática e 400 μL de água, em seguida adicionou-se 500 μL de solução Somogyi

A+B (misturadas na proporção 4:1), os tubos foram agitados, vedados e levados ao banho-

maria 100 °C por 10 minutos. Ao término do tempo a reação foi colocada em banho de gelo e

em seguida adicionou-se 500 μL de solução de Nelson e 1000 μL de água. Os tubos foram

agitados e foram feitas as leituras de absorbância em espectrofotômetro (Genesys 10UV

53

Scanning - Thermo Scientific) no comprimento de onda de 560 nm. A concentração de

açúcares redutores foi calculada a partir de uma curva padrão obtida com leituras de soluções

contendo respectivamente 0,5, 1, 2, 3 e 4 mM de glicose. Como branco, colocou-se água no

lugar da amostra.

Atividade das invertases neutras

Procedeu-se a atividade da enzima invertase neutra (IVN, EC 2.4.1.26) pelo método

descrito por ZHU et al. (1997). Em microtubo foram adicionados: 50 μL de extrato, 50 μL de

tampão de reação acetato de sódio 1 M e pH 7,5 e 100 μL de uma solução de sacarose 120

mM. A reação foi incubada a 37 °C por 0, 30 e 60 minutos. A reação foi interrompida em

banho-maria a 100 °C por três minutos. A dosagem de açúcares redutores foi realizada pelo

método de Somogyi-Nelson (NELSON, 1944; SOMOGYI, 1945; 1952), como descrito para

IVA.

Delineamento experimental

O delineamento experimental foi inteiramente ao acaso com parcelas subdivididas no

tempo, sendo os fatores de variação as cultivares (IACSP94-2094 e IACSP95-5000), a

temperatura (32/20 °C e 22/12 °C) e o status hídrico (irrigado e deficiência hídrica). Os

resultados foram submetidos à análise de variância (ANOVA) sendo as médias provenientes

de vinte repetições (trocas gasosas e fluorescência da clorofila a) e quatro repetições

(assimilação diária de CO2, potencial hídrico e metabolismo de carboidratos). Quando

encontradas diferenças significativas, as médias foram comparadas pelo teste de Tukey ao

nível de 5% de probabilidade.

3 RESULTADOS

Ambas as cultivares submetidas à DH tiveram decréscimo significativo do potencial

hídrico foliar (Ψw6h) atingindo o valor de -0,69 no período de estresse máximo, nas plantas NI

(Tabela 1), considerado estresse moderado (DU et al., 1996), sendo que somente a baixa

temperatura não afetou Ψw6h. Não houve diferença significativa no Ψw medido às 14:00 h

(dados não apresentados).

54

Tabela 1 - Resposta do potencial hídrico foliar (Ψw6h) de cana-de-açúcar cv. IACSP94-2094 e

cv. IACSP95-5000 submetidas aos tratamentos de baixa temperatura e deficiência hídrica.

Médias de quatro repetições (± desvio padrão).

Ψw6h (MPa)

cv. Controle

(32/20 °C)

Máximo estresse

(22/12°C)

IACSP94-2094 I -0,35 ± 0,02 -0,36 ± 0,02

IACSP94-2094 NI -0,35 ± 0,02 -0,69 ± 0,02

IACSP95-5000 I -0,40 ± 0,02 -0,40 ± 0,015

IACSP95-5000 NI -0,40 ± 0,02 -0,68 ± 0,02

Independente do tratamento (controle, baixa temperatura e baixa temperatura e

deficiência hídrica), a assimilação de CO2 (A) (Figura 1A, B) e a assimilação diária de CO2

(Ai) (Figura 1C, D) da IACSP95-5000 foram significativamente maiores que o da IACSP94-

2094.

Em ambas as cultivares após 34 horas de baixa temperatura houve decréscimo

significativo de A e de Ai (Figura 1C, D). Após a imposição dos tratamentos, o decréscimo de

A na IACSP94-2094 foi de 35% enquanto na IACSP95-5000 foi de 17,5%, permanecendo

baixo durante todo o período de tratamento (Figura 1A, B).

No dia de máxima restrição hídrica (dia 20), A do tratamento não irrigado (NI) da

IACSP95-5000 foi significativamente mais baixo quando comparado às plantas irrigadas (I)

(Figura 1B), enquanto na IACSP94-2094 A nos tratamentos I e NI foi semelhante. Após dois

dias de retorno às temperaturas 32/20 °C (dia/noite) e reidratação das plantas, a IACSP94-

2094 recuperou A e Ai (Figura 1A, C) enquanto que na cv. IACSP95-5000 NI esta

recuperação ocorreu após 8 dias (Figura 1B, D).

Houve decréscimo significativo da condutância estomática (gs) (Figura 2A, B) e

transpiração (E) (Figura 2C, D) após 34 h de resfriamento em ambas as cultivares,

independente do status hídrico, permanecendo assim durante todo o período de estresse.

Ambas cvs. recuperaram gs e E após dois dias de retorno às temperaturas mais altas e

reidratação das plantas. Interessante notar que após 8 dias em recuperação gs e E da

IACSP95-5000 I e NI foram maiores que o controle, ocorrendo um súbito aumento.

55

Figura 1 - (A, B) Resposta da assimilação de CO2 (A) e (C, D) assimilação diária de CO2 (Ai)

de cana-de-açúcar, cultivares IACSP94-2094 e IACSP95-5000, sendo o dia 0 (testemunha)

medida feita após 18 dias de aclimatação a 32/20 °C (dia/ noite) com plantas irrigadas; dia 2

medida feita após 34 horas a 22/12 °C (dia/ noite) com plantas irrigadas (I) e não irrigadas

(NI); dia 13 medida feita após 13 dias de baixa temperatura em plantas irrigadas e não

irrigadas (estresse intermediário); dia 20 medida após 20 dias de baixa temperatura em plantas

irrigadas e não irrigadas (estresse máximo); dia 22 medida após 2 dias de retorno à

temperatura de 32/20 °C e reidratação e dia 28 medida após 8 dias de recuperação das plantas.

Símbolos indicam média de 20 repetições ± erro padrão para A e 4 repetições ± erro padrão

para Ai.

Houve decréscimo significativo da eficiência intrínseca do uso da água (EUAi) após 13

dias de baixa temperatura em ambas as cvs., independente do status hídrico, permanecendo

baixo durante o estresse máximo (Figura 2E, F). Entretanto, EUAi no máximo estresse na cv.

IACSP94-2094 NI foi maior que nas plantas I (Figura 2E).

Foi observado aumento significativo de Ci em ambas as cultivares após 13 dias de

imposição dos tratamentos, mantendo-se alto até o máximo estresse (Figura 3A, B). A

IACSP94-2094 I apresentou Ci mais alto que das plantas NI após 34 h de baixa temperatura

(Figura 3A). Após dois dias de retorno às temperaturas mais altas e reidratação das plantas, Ci

voltou aos valores controle (Figura 3A, B).

5

10

15

20

25

30

0 2 13 20 22 28

200

400

600

800

1000

1200

0 2 13 20 22 28

A (

mol

m-2

s-1

)

IACSP94-2094 I

IACSP94-2094 NI

A B

IACSP95-5000 I

IACSP95-5000 NI

C

Ai (

mm

ol

m-2 d

-1)

Dias de tratamento

D

56

Figura 2 - (A, B) Resposta da condutância estomática (gs), (C, D) transpiração (E) e (E, F)

eficiência intrínseca do uso da água (EUAi) de cana-de-açúcar, cultivares IACSP94-2094 e

IACSP95-5000, sendo o dia 0 (testemunha) medida feita após 18 dias de aclimatação a 32/20

°C (dia/ noite) com plantas irrigadas; dia 2 medida feita após 34 horas a 22/12 °C (dia/ noite)

com plantas irrigadas (I) e não irrigadas (NI); dia 13 medida feita após 13 dias (estresse

intermediário); de baixa temperatura em plantas irrigadas e não irrigadas; dia 20 medida após

20 dias de baixa temperatura em plantas irrigadas e não irrigadas (estresse máximo); dia 22

medida após 2 dias de retorno à temperatura de 32/20 °C e reidratação e dia 28 medida após 8

dias de recuperação das plantas. Símbolos indicam média de 20 repetições ± erro padrão.

O frio e a deficiência hídrica causaram queda na eficiência aparente de carboxilação

(A/Ci) em ambas as cultivares e tratamentos, sendo a queda em IACSP95-5000 foi

relativamente mais acentuada. Porém, comparativamente, os valores de A/Ci foram mais

elevados em IACSP95-5000. A resposta de A/Ci foi oposta a de Ci, ou seja, quando Ci

aumentou, A/Ci diminuiu (Figura 3C e 3D).

A partir de 34 h de baixas temperaturas, a eficiência operacional do FSII (Fq'/Fm') de

ambas as cultivares, tanto das plantas I como nas NI, baixou significativamente

permanecendo baixa durante todo o período de estresse (Figura 4A, B). As duas cultivares

recuperaram Fq'/Fm' logo no primeiro dia de retorno às temperaturas mais altas e reidratação

(Figura 4).

1,5

3,0

4,5

6,0

7,5

0 2 13 2022 28

60

90

120

150

180

0,04

0,08

0,12

0,16

0,20

0,24

0 2 13 2022 28

B

IACSP95-5000 I

IACSP95-5000 NI

CE

(m

mo

l m

-2 s

-1)

D

E

EU

Ai (

mo

l m

ol-1

)

Dias de tratamento

gs (

mo

l m

-2 s

-1)

IACSP94-2094 I

IACSP94-2094 NI

A

F

57

Figura 3 - (A, B) Variação da concentração intercelular de CO2 (Ci) e da (C, D) eficiência

aparente de carboxilação (A/Ci) de cana-de-açúcar, cultivares IACSP94-2094 e IACSP95-

5000, sendo: dia 0 (testemunha) medida feita após 18 dias de aclimatação a 32/20 °C (dia/

noite) com plantas irrigadas; dia 2 medida feita após 34 horas a 22/12 °C (dia/ noite) com

plantas irrigadas e não irrigadas; dia 13 medida feita após 13 dias (estresse intermediário) de

baixa temperatura em plantas irrigadas (I) e não irrigadas (NI); dia 20 medida após 20 dias de

baixa temperatura em plantas irrigadas e não irrigadas (estresse máximo); dia 22 medida após

2 dias de retorno à temperatura de 32/20 °C e reidratação e dia 28 medida após 8 dias de

recuperação das plantas. Símbolos indicam média de 20 repetições ± erro padrão.

Houve aumento significativo do coeficiente de extinção não fotoquímico (NPQ)

durante o período de baixas temperaturas na cv. IACSP94-2094 I e NI, e no dia de máximo

estresse, o NPQ das plantas NI foi significativamente menor que das plantas I (Figura 5A). Na

cv. IACSP95-5000 o NPQ foi semelhante durante todo o período experimental (Figura 5B).

Nas plantas I e NI das duas cultivares houve decréscimo significativo de Fv/Fm após 34

h de baixa temperatura, permanecendo baixo durante todo o período de tratamento (Figura

5C, D) e ambas recuperaram Fv/Fm após o período de retorno às temperaturas mais altas e

reidratação.

Houve decréscimo significativo da eficiência quântica máxima do FSII sob luz

(Fv'/Fm'), durante o período de baixas temperaturas na IACSP94-2094 I e na NI, porém, nas

plantas NI o Fv'/Fm' foi significativamente maior que nas plantas I. A IACSP94-2094 NI

recuperou parcialmente Fv'/Fm' (Figura 5C). A IACSP95-5000 NI apresentou decréscimo

significativo de Fv'/Fm' após 34 h de baixa temperatura e durante o máximo estresse por

100

150

200

250

300

0 2 13 20 22 28

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

0 2 13 20 22 28

Ci (

mo

l m

ol-1

)

IACSP94-2094 I

IACSP94-2094 NI

A B

IACSP95-5000 I

IACSP95-5000 NI

C

A/C

i (

mo

l m

-2 s

-1 P

a-1)

Dias de tratamento

D

58

temperatura e deficiência hídrica tendo se recuperado totalmente após retorno às temperaturas

mais altas e reidratação (Figura 5D).

Figura 4 - (A, B) Resposta da eficiência operacional do FSII (Fq'/Fm') de cana-de-açúcar,

cultivares IACSP94-2094 e IACSP95-5000, sendo o dia 0 (testemunha) medida feita após 18

dias de aclimatação a 32/20 °C (dia/ noite) com plantas irrigadas; dia 2 medida feita após 34

horas a 22/12 °C (dia/ noite) com plantas irrigadas (I) e não irrigadas (NI); dia 13 medida feita

após 13 dias (estresse intermediário); de baixa temperatura em plantas irrigadas e não

irrigadas; dia 20 medida após 20 dias de baixa temperatura em plantas irrigadas e não

irrigadas (estresse máximo); dia 22 medida após 2 dias de retorno à temperatura de 32/20 °C e

reidratação e dia 28 medida após 8 dias de recuperação das plantas. Símbolos indicam média

de 20 repetições ± erro padrão.

Na IACSP94-2094 I e NI houve decréscimo significativo do fator de eficiência do

fotossistema II (Fq'/Fv') após 34 h de frio, ocorrendo em seguida a recuperação (Figura 6A). Já

na IACSP95-5000, tanto I como NI, Fq'/Fv' decresceu significativamente por todo período de

estresse (Figura 6B), com o retorno às temperaturas maiores e reidratação os valores de Fq'/Fv'

se recuperaram.

Em ambas as cultivares o transporte aparente de elétrons (ETR) decresceu

significativamente após 34 h de baixas temperaturas, permanecendo baixo durante todo o

período de tratamento (Figura 6C, D) e recuperando ETR após o retorno às temperaturas mais

altas e reidratação (Figura 6C, D).

Houve aumento significativo do teor de açúcares solúveis (AS) no período de máximo

estresse (Figura 7A) na IACSP94-2094 I e NI. Após o retorno às temperaturas de 32/20 °C e

reidratação, os valores não retornaram aos do controle, enquanto que nas NI, retornaram

(Figura 7A). Já na IACSP95-5000 I e NI houve aumento significativo de AS após 34 h de

baixa temperatura, permanecendo alto durante todo o período de estresse (Figura 7B) e

0 2 13 20 22 28

0,08

0,12

0,16

0,20

0,24

0,28

0 2 13 20 22 28

F

q'/F

m'

Dias de tratamento

IACSP94-2094 I

IACSP94-2094 NI

A B

IACSP95-5000 I

IACSP95-5000 NI

59

recuperando aos valores do controle após o período de retorno às temperaturas mais altas e

reidratação (Figura 7B).

Figura 5 - (A, B) Variação do coeficiente de extinção não fotoquímico (NPQ) e da (C, D)

eficiência quântica máxima do FSII (Fv/Fm) e eficiência quântica máxima do FSII sob Q

(Fv'/Fm') de cana-de-açúcar, cultivares IACSP94-2094 e IACSP95-5000, sendo o dia 0

(testemunha) medida feita após 18 dias de aclimatação a 32/20 °C (dia/ noite) com plantas

irrigadas; dia 2 medida feita após 34 horas a 22/12 °C (dia/ noite) com plantas irrigadas (I) e

não irrigadas (NI); dia 13 medida feita após 13 dias de baixa temperatura em plantas irrigadas

e não irrigadas; dia 20 medida após 20 dias de baixa temperatura em plantas irrigadas e não

irrigadas (máximo estresse); dia 22 medida após 2 dias de retorno à temperatura de 32/20 °C e

reidratação e dia 28 medida após 8 dias de recuperação das plantas. Símbolos indicam média

de 20 repetições ± erro padrão.

O teor de sacarose (SAC) aumentou significativamente na IACSP94-2094 NI no

período de máximo estresse (Figura 7C), enquanto na IACSP95-5000 I e NI o aumento de

SAC ocorreu logo após 34 h de baixa temperatura, permanecendo alto durante todo o período

de estresse (Figura 7D). SAC tanto da IACSP94-2094 NI como da IACSP95-5000 I e NI

retornaram aos valores do controle após o retorno da temperatura e reidratação (Figura 7C,

D).

0,6

0,9

1,2

1,5

1,8

2,1

0 2 13 20 22 280,30

0,45

0,60

0,75

0 2 13 20 22 28

NP

Q

IACSP94-2094 I

IACSP94-2094 NI

A B

IACSP95-5000 I

IACSP95-5000 NI

C

Fv'/

Fm'

F

v/Fm

Dias de tratamento

D

60

Figura 6 - (A, B) Variação do fator de eficiência do FSII (Fq'/Fv') e do (C, D) transporte

aparente de elétrons (ETR) de cana-de-açúcar, cultivares IACSP94-2094 e IACSP95-5000,

sendo o dia 0 (testemunha) medida feita após 18 dias de aclimatação a 32/20 °C (dia/ noite)

com plantas irrigadas; dia 2 medida feita após 34 horas a 22/12 °C (dia/ noite) com plantas

irrigadas (I) e não irrigadas (NI); dia 13 medida feita após 13 dias de baixa temperatura em

plantas irrigadas e não irrigadas; dia 20 medida após 20 dias de baixa temperatura em plantas

irrigadas e não irrigadas (máximo estresse); dia 22 medida após 2 dias de retorno à


Símbolos indicam média de 20 repetições ± erro padrão.

Em ambas as cultivares, independente do status hídrico, houve um aumento

significativo no teor de amido foliar (AMI), sendo na IACSP94-2094 no período de baixa

temperatura e deficiência hídrica (Figura 7E), enquanto que na IACSP95-5000 o aumento

ocorreu logo após 34 h de baixa temperatura (Figura 7F). Após o período de retorno da

temperatura e reidratação na IACSP94-2094 (Figura 7E), os teores de AMI não atingiram os

valores do controle, enquanto na IACSP95-5000 houve recuperação parcial dos teores de AMI

(Figura 7F).

A atividade da sintase de sacarose (SuSy) aumentou na IACSP94-2094 I e NI com as

baixas temperaturas (Figura 8A). Nas plantas I esse aumento foi observado somente no

período de máximo estresse, enquanto nas plantas NI esse aumento ocorreu no período de

estresse intermediário (Figura 8A).

0 2

13

20

22

28

40

60

80

100

120

0,18

0,27

0,36

0,45

0,54

0 2

13

20

22

28

C

ET

R (

mol

m-2 s

-1)

Dias de tratamento

Fq'/F

v'

IACSP94-2094 I

IACSP94-2094 NI

A B

IACSP95-5000 I

IACSP95-5000 NI

D

61

Figura 7 - (A, B) Variação no teor dos açúcares solúveis (AS), da (C, D) sacarose (SAC) e do

amido (AMI) em folhas de cana-de-açúcar, cultivares IACSP94-2094 e IACSP95-5000, sendo

o dia 0 (testemunha) medida feita após 18 dias de aclimatação a 32/20 °C (dia/ noite) com

plantas irrigadas; dia 2 medida feita após 34 horas a 22/12 °C (dia/ noite) com plantas

irrigadas (I) e não irrigadas (NI); dia 13 medida feita após 13 dias de baixa temperatura em

plantas irrigadas e não irrigadas; dia 20 medida após 20 dias de baixa temperatura em plantas



Símbolos indicam média de quatro repetições ± erro padrão.

Durante o máximo estresse observou-se ainda que a atividade da SuSy na IACSP94-

2094 I foi significativamente maior que das plantas NI (Figura 8A). A atividade da SuSy na

IACSP94-2094 retornou aos valores do controle no período de recuperação (Figura 8A). Foi

observado aumento significativo da atividade da SuSy na IACSP95-5000 NI no estresse

intermediário (Figura 8B), retornando aos valores do controle já no máximo estresse.

Houve aumento significativo na atividade da sintase de sacarose fosfato (SPS) na

IACSP94-2094 I e NI durante o período de baixas temperaturas (Figura 8C). No período de

máximo estresse, a atividade da SPS foi maior nas plantas NI (Figura 8C). Na IACSP95-5000

a atividade da SPS foi semelhante durante todo o período experimental (Figura 8D).

240

320

400

480

560

50

100

150

200

250

0 2 13 20 22 28

0

70

140

210

280

350

420

0 2 13 20 22 28

AS

(

mo

l g

-1 M

S)

IACSP94-2094 I

IACSP94-2094 NI

A

B

IACSP95-5000 I

IACSP95-5000 NI

C

SA

C (

mo

l g

-1 M

S)

D

E

AM

I (

mo

l g

-1 M

S)

Dias de tratamento

F

62

Figura 8 - Variação da atividade das enzimas (A, B) sintase de sacarose (SuSy) e da (C, D)

sintase de sacarose fosfato (SPS) em folhas de cana-de-açúcar, cultivares IACSP94-2094 e

IACSP95-5000, sendo o dia 0 (testemunha) medida feita após 18 dias de aclimatação a 32/20

°C (dia/ noite) com plantas irrigadas; dia 2 medida feita após 34 horas a 22/12 °C (dia/ noite)

com plantas irrigadas e não irrigadas; dia 13 medida feita após 13 dias de baixa temperatura

em plantas irrigadas e não irrigadas; dia 20 medida após 20 dias de baixa temperatura em

plantas irrigadas e não irrigadas (máximo estresse); dia 22 medida após 2 dias de retorno à



Foi observado decréscimo significativo da atividade das invertases ácidas (IVA) na

IACSP94-2094 I e NI durante o período de estresse (Figura 9A) e houve recuperação dos

valores após o retorno às temperaturas de 32/20 °C e reidratação (Figura 9A). Nas IACSP95-

5000 I e NI houve decréscimo, apesar de não significativo, na atividade das IVA somente após

34 h de baixa temperatura, recuperando os valores mesmo com a continuidade do estresse

(Figura 9B). Em IACSP95-5000 I, no 8º dia de recuperação, a atividade da IVA foi

significativamente maior que a da testemunha (Figura 9B).

Houve aumento significativo na atividade das invertases neutras (IVN) nas cultivares

IACSP94-2094 I e IACSP95-5000 I no máximo estresse (Figura 9C, D), enquanto neste

mesmo período houve decréscimo significativo das atividades em ambas as cultivares NI

(Figura 9C, D). As cultivares NI recuperaram a atividade das IVN após dois dias de retorno às

temperaturas mais altas e reidratação das plantas (Figura 9C, D).

0,00

0,15

0,30

0,45

0,60

0 2 13 20 22 28

0,00

0,15

0,30

0,45

0,60

0,75

0 2 13 20 22 28

Su

Sy

(m

ol

gM

F m

in-1

)

IACSP94-2094 I

IACSP94-2094 NI

A

B

IACSP95-5000 I

IACSP95-5000 NI

C

SP

S

(m

ol

gM

F m

in-1

)

Dias de tratamento

D

63

Figura 9 - Variação da atividade das (A, B) invertases ácidas (IVA) e das (C, D) invertases

neutras (IVN) em folhas de cana-de-açúcar, cultivares IACSP94-2094 e IACSP95-5000,

sendo o dia 0 (testemunha) medida feita após 18 dias de aclimatação a 32/20 °C (dia/ noite)

com plantas irrigadas; dia 2 medida feita após 34 horas a 22/12 °C (dia/ noite) com plantas

irrigadas e não irrigadas; dia 13 medida feita após 13 dias de baixa temperatura em plantas

irrigadas e não irrigadas; dia 20 medida após 20 dias de baixa temperatura em plantas




4 DISCUSSÃO

Período de baixa temperatura e deficiência hídrica

Diversos fatores ambientais, como por exemplo a seca, temperaturas extremas e a

salinidade, afetam negativamente o crescimento e desenvolvimento das plantas, além do

rendimento médio de uma cultura (ASHRAF & FOOLAD, 2007), devido a uma série de

distúrbios morfológicos, fisiológicos, bioquímicos e moleculares (WANG et al., 2003), o que

leva ao interesse em elucidá-los e relacioná-los à tolerância das plantas a estes fatores

ambientais.

A assimilação de CO2 (A) da IACSP95-5000 na testemunha (32/20 °C e irrigada) foi

significativamente maior que a da IACSP94-2094 (Figura 1A, B). Dois fatores determinam

0,0

0,9

1,8

2,7

3,6

4,5

5,4

0 2 13 20 22 280,0

0,9

1,8

2,7

3,6

4,5

0 2 13 20 22 28

IVA

(m

ol

gM

F m

in-1

)

IACSP94-2094 I

IACSP94-2094 NI

A

B

IACSP95-5000 I

IACSP95-5000 NI

C

IVN

(m

ol

gM

F m

in-1

)

Dias de tratamento

D

64

esta resposta, ou seja, os maiores valores de gs (Figura 2A, B) permitindo maior fluxo de

difusão do CO2 através das aberturas estomáticas, combinados com os maiores valores da

razão A/Ci (Figura 3C), que indica maior eficiência de carboxilação. Outras características se

destacam na IACSP95-5000, como a maior eficiência operacional do fotossistema II (Fq'/Fm',

Figura 4A, B) e consequentemente, maior ETR em relação a IACSP94-2094 (Figura 6C, D).

A IACSP95-5000 destaca-se em relação à IACSP94-2094 como sendo uma cultivar menos

rústica e mais produtiva em ambientes favoráveis (LANDELL et al., 2005), e neste trabalho

destacou-se também como uma cultivar com maior capacidade fotossintética.

Sob estresse, independente do tratamento, baixa temperatura com e sem deficiência

hídrica, A e Ai da IACSP95-5000 tiveram valores significativamente maiores que o da

IACSP94-2094 (Figura 1). Entretanto, nas duas cultivares ocorreu decréscimo significativo

destes parâmetros devido ao estresse. A queda relativa de Ai na IACSP94-2094 sob estresse

máximo de baixa temperatura (48%) e baixa temperatura e deficiência hídrica (38%) foram

estatisticamente semelhantes, não apresentando efeito cumulativo importante. No entanto, na

IACSP95-5000 ocorreu efeito cumulativo dos dois estresses, já que sob baixa temperatura Ai

decaiu 16%, enquanto em baixa temperatura e deficiência hídrica decaiu 35%, ou seja, mais

que o dobro. Outro aspecto a considerar é que houve um aumento significativo de NPQ

durante o período de baixa temperatura e restrição hídrica na IACSP94-2094 I e NI (Figura

5A). Na IACSP95-5000, o NPQ foi semelhante durante todo o período experimental (Figura

5B). Segundo LAWLOR & TEZARA (2009), o NPQ é uma forma de dissipação de energia

muito frequente quando há excesso de energia não utilizada. Estes resultados sugerem que a

fotossíntese de ambas as cultivares foi sensível à baixa temperatura, porém a IACSP95-5000

com menor intensidade que a IACSP94-2094. Por outro lado, com a ocorrência simultânea de

baixa temperatura e deficiência hídrica, a IACSP95-5000 foi, possivelmente, mais sensível ao

efeito cumulativo de frio e seca. Interessante notar que RIBEIRO et al. (2013) observaram

que sob deficiência hídrica mais severa (ΨW6h = -1,8 MPa) a IACSP94-2094 apresentou as

menores quedas em A, quando comparada a outras cultivares, SP87-365 e IACSP96-2042.

Comparativamente, a cv. IACSP95-5000 apresentaram queda maior da razão A/Ci do que a

IACSP94-2094 (Figura 3C e D). MARTINS (2012) também sugeriu que a maior tolerância à

deficiência hídrica da IACSP94-2094 em relação a IACSP95-5000 estaria relacionada com a

maior fotoproteção indicada pelo NPQ e maior atividade e expressão de PEPcase.

A queda de A após 34 h de imposição dos tratamentos pode estar relacionada a fatores

difusivos, metabólicos e fotoquímicos (ALLEN & ORT, 2001; DU et al., 1996;

GHANNOUM et al., 2003; GHANNOUM, 2009; MACHADO et al., 2009, 2010). De fato,

65

no presente trabalho a queda em A foi devida tanto a fatores difusivos, relacionados à queda

de gs (Figura 2A e B), como metabólicos, queda na razão A/Ci (Figura 3C e D) e também

fotoquímico, queda em Fq'/Fm', (Figura 4) com consequente queda em ETR (Figura 6C e D).

DU et al. (1996) observaram em cana-de-açúcar sob deficiência hídrica moderada (ΨW6h = -

0,85 MPa), que o declínio da fotossíntese ocorreu devido, principalmente, a fatores

estomáticos. Sob deficiência hídrica mais severa (ΨW6h < -0,85 MPa), o declínio de A foi

devido, em parte, à queda de gs, acrescido por componentes metabólicos, sendo o fator

limitante a enzima PPDK. LOBO (2012) também relatou que a deficiência hídrica em cana-

de-açúcar promoveu decréscimos em gs e da atividade e expressão de Rubisco e PEPcase.

O efeito máximo da baixa temperatura sobre A ocorreu de forma rápida, ou seja, já nas

34 horas iniciais, visto que durante o resto do período experimental, até o 20º dia, o

incremento na queda de A foi negligível em ambas as cultivares. Como já foi descrito, na

IACSP94-2094 não ocorreu maior queda de A, mesmo com a adição do estresse hídrico

(Figura 1A).

Após o resfriamento, com o declínio de A, foi observado o fechamento estomático, que

pode ter ocorrido devido a um efeito direto do frio sobre as células-guarda ou ainda, uma

resposta indireta ao aumento de Ci, induzido pela diminuição da atividade de carboxilação

(ALLEN & ORT, 2001). De fato, Ci aumentou progressivamente enquanto A/Ci diminuiu em

ambas as cultivares (Figura 3). Além disso, pode ocorrer sinalização química causada pelo

frio e também pela deficiência hídrica o que poderia ainda causar o fechamento estomático

(LIANG & ZHANG, 1999; VESELOVA et al., 2005; ZHOU et al., 2007). No tratamento com

baixa temperatura, as respostas em ambas as cultivares foram semelhantes, porém mais

acentuadas na IACSP94-2094. Em relação ao efeito conjunto da baixa temperatura e

deficiência hídrica, os mesmos efeitos podem ter ocorrido acrescidos da queda do Ψw6h.

Entretanto, em nenhuma das cultivares ocorreu aumento da fotorrespiração devido aos

estresses, como pode ser verificado pela relação linear entre eficiência operacional (Fq'/Fm') e

eficiência quântica (CO2), dada por CO2 = -0,00312 + 0,09783*Fq’/Fm’ (R2=0,96, p<0,01)

(dados não apresentados). Esta relação indica a utilização de 10,2 fótons/CO2 fixado,

independente do tratamento.

Quando ambos os estresses ocorreram conjuntamente, com a queda de A também

ocorreu queda em gs evitando assim a desidratação. O aumento de Ci só ocorreu no período de

seca intermediária e máxima (respectivamente no 13o e 20º dias) (Figura 3A e B). O aumento

de Ci (Figura 3A e B) na IACSP94-2094 NI e na IACSP95-5000 NI coincide com o

decréscimo do Ψw6h (Tabela 1), sugerindo que o declínio de A pode também ter ocorrido

66

devido a fatores não estomáticos (DU et al., 1996; LOBO 2012), como foi sugerido pela

queda de A/Ci (Figura 3C e D).

Quando as plantas são expostas a estresses bióticos e abióticos, são frequentemente

observados decréscimos na eficiência quântica máxima do FSII (Fv/Fm) (BAKER, 2008).

Fv/Fm representa a eficiência máxima com que a luz absorvida pelo FSII é usada para a

redução da QA (BAKER, 2008). Neste experimento, ambas as cultivares apresentaram

decréscimo significativo de Fv/Fm após o resfriamento (Figura 5C e D), permanecendo baixo

durante todo o período de tratamento, porém somente a IACSP94-2094 I e NI apresentaram

valores abaixo de 0,725 caracterizando fotoinibição (CRITCHLEY, 1998). A alteração do

Fv/Fm pode ter ocorrido devido a mudança na eficiência da dissipação não-fotoquímica

(MAXWELL & JOHNSON, 2000). De fato, na IACSP94-2094 I e NI houve aumento de

NPQ acompanhado do decréscimo de Fv'/Fm' durante o período de tratamento (Figura 5A e

C).

A taxa de consumo de ATP e NADPH é um dos principais fatores que determinam a

eficiência operacional FSII (Fq'/Fm') em muitas situações. Alterações na eficiência de

carboxilação, na taxa de regeneração da ribulose 1,5-bisfosfato (RuBP), no fornecimento de

CO2 para os sítios de carboxilação via estômatos e na taxa de transporte de carboidratos para

fora da célula podem influenciar a taxa de utilização de ATP e NADPH e, consequentemente,

Fq'/Fm'. Muitos estresses ambientais alteram a assimilação de CO2, embora os locais da

limitação da fotossíntese possam ser muito variados. O estresse induz a redução da

condutância estomática, do metabolismo de carbono e do transporte, podendo diminuir a

eficiência do FSII. Aumentos de NADPH e ATP diminuem o fluxo linear de elétrons e a taxa

de oxidação de QA, que podem ser monitorados por diminuições no fator de eficiência do FSII

(Fq'/Fv'). No entanto, a acidificação do lúmen, bem como o aumento dos teores de ATP

também resultam num aumento do NPQ (Figura 5A, B) e uma diminuição do Fv'/Fm' (Figura

5C, D) (BAKER, 2008).

A assimilação de CO2 pelas folhas resulta em triose-P, da qual é sintetizada sacarose e

amido como produtos finais de duas rotas gliconeogênicas: a sacarose no citosol das células

do mesofilo e o amido nos cloroplastos da BFV em cana-de-açúcar (GROF & CAMPBELL,

2001; LUNN & FURBANK 1999). Durante o dia, a sacarose é continuamente exportada para

tecidos não fotossintetizantes da planta, enquanto o amido é acumulado nos cloroplastos. Os

teores de amido do cloroplasto são máximos durante o dia e mínimos a noite, quando é

degradado para síntese de sacarose, mantendo assim, sua exportação durante a noite. Em

condições adequadas, baixos teores de açúcar estimulam a fotossíntese (McCORMICK et al.,

67

2006; LOBO, 2012), a mobilização de reservas e a exportação, enquanto a alta concentração

de açúcar promove o crescimento e o armazenamento de carboidratos (SMITH & STITT,

2007; SOUZA, 2011; TAIZ & ZEIGER, 2009).

Em folhas de cana-de-açúcar, sob condições normais de crescimento, a glicose e a

frutose apresentam a maior concentração às 10 h, enquanto o conteúdo de sacarose começa a

aumentar às 10h, atingindo valores máximos entre 13 e 16 h e o declínio da sacarose ocorre

após as 19 h. A concentração de amido começa a aumentar a partir das 10 h e tem um pico

máximo às 16 h. A partir das 19 h, 90% do amido produzido na folha são então consumidos

no período noturno (SOUZA, 2011).

Neste experimento, durante o período de estresse, as folhas para análises bioquímicas

foram coletadas às 9 h e foi observado aumento no teor de AS (composto principalmente por

glicose + frutose + sacarose) em ambas as cultivares (Figura 7A, B, C e D). Na IACSP95-

5000 I e NI este aumento ocorreu após 34 h de frio, enquanto na IACSP94-2094 I e NI o

aumento de AS ocorreu no período de máximo estresse. Houve acúmulo de SAC nas folhas na

IACSP94-2094 NI no período de estresse máximo. Este aumento provavelmente está

relacionado com a alta atividade da SPS (Figura 7C e 8C). No trabalho apresentado no

capítulo II, também foi observado aumento da concentração de SAC nas plantas expostas à

baixa temperatura noturna e deficiência hídrica (Tabela 2, Capítulo II).

Em ambas as cultivares, independente do status hídrico, foi observado aumento da

concentração de AMI foliar, porém este aumento foi bem maior na IACSP94-2094,

independente do regime hídrico, em relação à testemunha. MACHADO (2009) também

observou em citros, após o tratamento com baixa temperatura noturna, que houve aumento na

concentração de AMI, provavelmente devido à inibição de enzimas de mobilização do amido,

ou ainda, a queda no crescimento, diminuindo assim a demanda (ALLEN & ORT, 2001). O

acúmulo de carboidratos nas folhas após a imposição dos tratamentos, também observado por

LOBO (2012), pode ser devido à baixa demanda de carboidratos. Ou seja, é possível que a

queda no crescimento das plantas, que tem temperatura ideal em 35 °C (EBRAHIM et al.,

1998; SALES et al., 2012), tenha sido mais afetada do que a queda em A, e portanto,

decorrente disto, ocorreu acúmulo de reservas. Esta formação de reserva pode ser

remobilizada para suprir o substrato necessário ao crescimento rápido, quando o ambiente se

tornar favorável (PEARCE, 1999; POLLOCK & JONES, 1979).

Na rota de síntese de sacarose, a enzima chave é a SPS, exercendo alto controle em

altas taxas fotossintéticas e, portanto, também sobre o fluxo máximo de síntese (HUBER &

HUBER, 1996). Foi observado que em plantas sob baixas temperaturas houve aumento da

68

atividade da SPS e da SuSy em folhas de espinafre (GUY et al., 1992), ou ainda, aumento no

estado de ativação da enzima em folhas de cana-de-açúcar de cultivar tolerante (DU & NOSE,

2002). Entretanto, sob deficiência hídrica severa, DU et al. (1998) observaram que a atividade

enzimática relacionada com a síntese de sacarose e amido diminuíram, porém em menor

proporção que as trocas gasosas, indicando baixa possibilidade dos componentes da rota da

sacarose e amido como fatores limitantes das trocas gasosas.

No presente experimento houve respostas diferenciadas entre cultivares (Figura 8).

Houve aumento da atividade da SPS em IACSP94-2094 I e NI durante o período de

tratamento, sendo que no período de máximo estresse a atividade da SPS foi maior nas plantas

NI. O aumento da SPS indica mudança nas propriedades regulatórias da enzima

(BASCUÑÁN-GODOY et al., 2006). Além disso, sob baixas temperaturas, o aumento da

atividade da SPS associado ao acúmulo de SAC sugerem que a resposta não é simplesmente

de ajuste deste processo metabólico para superar a cinética enzimática lenta em baixas

temperaturas, mas provavelmente, um processo adaptativo para maximizar a síntese do

composto com propriedades osmóticas importantes na tolerância a esse estresse (GUY, et al.,

1992).

A utilização da sacarose como fonte de energia depende de sua quebra, gerando

hexoses, e nas plantas duas enzimas catalisam esta reação: a SuSy, gerando FRU + UDP-

glicose, ou as invertases gerando GLU + FRU, que regulam a entrada da sacarose em

diferentes rotas de utilização (STURM, 1999), incluindo o carregamento de carboidratos no

complexo cc-ec para exportação da sacarose (LALONDE et al., 2003: RAE et al., 2005;

SMITH & STITT, 2007). Em plantas de cana-de-açúcar, mudanças na atividade do dreno

podem promover ajustes nas taxas de descarregamento pelo floema (LALONDE et al., 2003)

promovendo a manutenção de um gradiente de exportação de sacarose.

A atividade da SuSy (Figura 8A e B) aumentou na IACSP94-2094 com a baixa

temperatura (no máximo estresse) e com a deficiência hídrica (no estresse intermediário). Na

IACSP95-5000 NI houve aumento significativo da atividade da SuSy no estresse

intermediário. VANDOORME et al. (2012) observaram em plantas de chicória, que a

deficiência hídrica não influenciou significativamente a atividade da SuSy, indicando a

utilização de seus produtos em processos anabólicos.

Durante o período de estresse, a atividade da IVA decresceu na IACSP94-2094 I e NI,

enquanto em ambas as cultivares nas plantas I houve aumento da IVN e nas plantas NI

decréscimo, indicando sensibilidade da IVN aos estresses impostos de forma simultânea

(Figura 9). Em decorrência do aumento da atividade das invertases, houve um aumento do

69

teor de AS (Figura 7A, B). Decréscimo de IVA foi observado por FU et al. (2010) em uma

espécie de gramínea sob deficiência hídrica, sugerindo que a alta concentração de sacarose

seja uma consequência do aumento da atividades das enzimas SPS e SuSy e declínio da IVA.

Na IACSP95-5000 o aumento da atividade da IVN nas plantas I pode ter contribuído

para a menor queda de A em relação às plantas NI, devido ao aumento no teor de hexoses, que

pode incrementar o potencial osmótico (Figura 1B, 7B e 9D).

Período de recuperação

Após o estresse máximo, as plantas foram reidratadas e retornaram à temperatura de

32/20 °C. Dois dias depois ocorreu aumento súbito de A e Ai em ambas as cultivares,

atingindo valores semelhantes aos da testemunha (Figura 1). Esta recuperação no 2º dia está

relacionada com a recuperação de gs, Ci, A/Ci, Fq'/Fm' e ETR, a valores semelhantes à

testemunha, antes do estresse (Figuras 1, 2, 3, 4 e 6).

É interessante notar que A e Ai em IACSP95-5000 que foi submetida à baixa

temperatura continuou a aumentar até o 8º dia de recuperação e superaram em 45% e 30%,

respectivamente, aos valores de A e Ai da testemunha (Figura 1B, D). Esta resposta está

relacionada com o aumento de 79% em gs (Figura 2B), o que deve proporcionar aumento do

fluxo de CO2 aumentando o Ci em 40% (Figura 3B). Também pode estar relacionado com o

aumento de 15 e 25%, respectivamente, em Fq'/Fm' e ETR, em relação ao 2º dia de

recuperação (Figuras 4B e 6D). No tratamento de baixa temperatura combinado com a

deficiência hídrica, o aumento de A e Ai maior do que a testemunha não ocorreu, apesar de ter

ocorrido em gs e Ci. Porém, A/Ci permaneceu menor que a testemunha (Figura 3D), sugerindo

efeito residual da deficiência hídrica sobre o metabolismo fotossintético, como também foi

observado por DU et al. (1996).

As plantas quando retornaram às condições ideais durante a recuperação,

possivelmente tiveram aumento no crescimento, demandando mais fotoassimilados. A taxa

máxima de crescimento da cana-de-açúcar ocorre entre 25 e 35 °C e quando expostas à

temperatura de 15 °C já se observa inibição do crescimento vegetativo (EBRAHIM et al.,

1998; SALES et al., 2012). Concomitantemente ao aumento de A, ocorreu queda significativa

no teor dos demais carboidratos no tecido foliar (Figura 7), principalmente na IACSP95-5000.

Assim, sugere-se que o aumento súbito de A em relação à testemunha durante a recuperação

da IACSP95-5000 I seja causado pela ação combinada dos aumentos em gs, A/Ci, Fq'/Fm' e da

queda acentuada nos teores de carboidratos, possivelmente causado pelo fluxo de sacarose ao

70

floema (McCORMICK et al., 2008; LOBO, 2012). LOBO (2012) observou que a maior

concentração de sacarose, frutose ou glicose causa queda acentuada na assimilação de CO2 e

no ETR. Os processos de inibição ou estímulo da fotossíntese estão relacionados com o

consumo de intermediários nos drenos (McCORMICK et al., 2006; 2008; 2009) prevenindo a

falta ou o acúmulo de metabólitos. Na recuperação também houve mudança geral nas

atividades de enzimas relacionadas ao metabolismo de carboidratos, bem como de seus teores

nas folhas. Os teores de carboidratos (AS, SAC e AMI) em todos os tratamentos, exceto na

IACSP94-2094 I, decresceram significativamente durante a recuperação em relação ao

máximo estresse. Este tipo de resposta sugere que ocorreu grande exportação da fonte em

direção aos drenos em crescimento ativo. Ao mesmo tempo, as atividades de SPS e SuSy

decresceram, enquanto as atividades das invertases aumentaram do 2º para 8º dia de

recuperação. Alta atividade de invertases indica alta taxa de catabolismo.

5 CONCLUSÕES

1. Sob condições ideais, a cv. IACSP95-5000 tem maior fotossíntese que a cv. IACSP94-2094

devido à maior condutância estomática e à eficiência aparente de carboxilação.

2. A cv. IACSP95-5000 é mais tolerante à baixa temperatura e apresenta maior capacidade de

recuperação da fotossíntese após a sua ocorrência.

4. Sob a ocorrência conjunta de frio e deficiência hídrica, a cv. IACSP94-2094 é mais

tolerante do que a cv. IACSP95-5000.

5. O declínio da assimilação de CO2 em ambas as cultivares, em consequência da ocorrência

de frio e/ou deficiência hídrica é devido a fatores difusivos, metabólicos e fotoquímicos.

6. O alto teor de açúcares solúveis totais nas folhas da cv. IACSP94-2094 NI no período de

estresse máximo é devido, principalmente, ao aumento no teor de sacarose, quando há

também aumento da atividade da sintase de sacarose fosfato.

7. O alto teor de açúcares solúveis totais nas folhas da cv. IACSP94-2094 I no período de

estresse é devido, principalmente, à hidrólise do amido. Neste mesmo período ocorre também

aumento da atividade das invertases neutras.

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