fotaleza 2010 - dr gilberto almodin - slides exibidos em aula

Vitrificação e Reprodução Vitrificação e Reprodução Assistida: Assistida: uma revolução ?uma revolução ?Vitrificação e Reprodução Vitrificação e Reprodução Assistida: Assistida: uma revolução ?uma revolução ?

Carlos Gilberto Almodin Carlos Gilberto Almodin

• Sobrevida embriões camundongo -Sobrevida embriões camundongo - Whittinghan Whittinghan

19721972• Congelamento embrião humano - Congelamento embrião humano - lentolento Trouson & Mohr 1983 embriões Trouson & Mohr 1983 embriões 4/8 cels4/8 cels

Congelamento Histórico

Estágio de transferência

Sobrevida/descongelament

o (%)

Gravidez clínica/transferência

(%)

Implantação/no. transferidos

(%)

Embriões pró-núcleo

1101/1441 (76,4) 99/235 (42,1) 170/997 (17,10)

Embriões divididos

1646/2093 (78,6) 153 /409 (37,4) 231/1516 (15,2)

Blastocistos 196/254 (77,2) 52/81 (64,2) 67/174 (38,5)

Resultados de 1995 – 2002 Veeck LL RBMOnLine 6:367-74

Congelamento lento – embriões humanosHistórico

Criopreservação de oócitosHistórico- Importância

• Casos de comprometimento da reserva ovariana – tratamento para doenças malignas, falha ovariana prematura

• Problemas éticos relacionados à criopreservação de embriões em FIV-ET

• Síndrome de hiperestimulação ovariana

• Banco de oócitos - doação

• Aumento no sucesso dos resultados de FIV-ET – nova tentativa

Criopreservação de oócitos:Criopreservação de oócitos:Histórico - DificuldadesHistórico - DificuldadesCriopreservação de oócitos:Criopreservação de oócitos:Histórico - DificuldadesHistórico - Dificuldades

OócitosOócitos

• Características membrana plasmáticaCaracterísticas membrana plasmática

• Presença de grânulos corticaisPresença de grânulos corticais

• Fusos na metáfase IIFusos na metáfase IIChen et al.,2003Chen et al.,2003

VitrificaçãoVitrificaçãoHistórico - DificuldadesHistórico - DificuldadesVitrificaçãoVitrificaçãoHistórico - DificuldadesHistórico - Dificuldades

Criopreservação de OócitosCriopreservação de Oócitos

• Baixo coeficiente de permeabilidadeBaixo coeficiente de permeabilidade

• Alta concentração de lipídeos Alta concentração de lipídeos cristais gelocristais gelo

• Alta sensibilidade ao congelamentoAlta sensibilidade ao congelamentoParks & Ruffing, 1992Parks & Ruffing, 1992


Oócitos - EmbriõesOócitos - Embriões

• Menor superfície/volume dificulta desidrataçãoMenor superfície/volume dificulta desidrataçãoFabbri et al.,2000Fabbri et al.,2000

• Fecundação - Fecundação - Ca livre citoplasma - PermeávelCa livre citoplasma - PermeávelGook et al., 1993Gook et al., 1993

• Melhor transito crioprotetor e água Melhor transito crioprotetor e água

• Diminuição da formação cristais de geloDiminuição da formação cristais de geloGook et al., 1993Gook et al., 1993


Oócitos – Metáfase IIOócitos – Metáfase II

• Fusos – microtúbulos – dímeros tubulina alfa e Fusos – microtúbulos – dímeros tubulina alfa e betabeta

Zhou et al., 2002Zhou et al., 2002

• Cromossomos aos pares em forma de barrilCromossomos aos pares em forma de barrilMaro et al., 1986Maro et al., 1986

• Crioprotetor – alteração dos fusos - Crioprotetor – alteração dos fusos - viabilidadeviabilidade

Chen et al., 2000Chen et al., 2000

• Vesicula germinal – menor condutividade Vesicula germinal – menor condutividade hídricahídrica

Agca et al., 1997Agca et al., 1997

VitrificaçãoVitrificaçãoHistórico - NecessidadeHistórico - NecessidadeVitrificaçãoVitrificaçãoHistórico - NecessidadeHistórico - Necessidade

Criopreservação de oócitos Criopreservação de oócitos

• Grande velocidade de resfriamento e Grande velocidade de resfriamento e reaquecimentoreaquecimento

• Reduzido tempo de exposiçãoReduzido tempo de exposição

• Pequeno volume de crioprotetorPequeno volume de crioprotetor

VitrificaçãoVitrificaçãoSucessoSucessoVitrificaçãoVitrificaçãoSucessoSucesso

• Capacidade de permeação CP• Concentração dos CPs• Tempo de exposição aos CPs• Volume da solução

• Impede formação cristais de gelo• Não provoca lesão osmótica ou toxica

Rall & Fahy, 1985

Vitrificação - Vitrificação - DefiniçãoDefiniçãoVitrificação - Vitrificação - DefiniçãoDefinição

““Vitrificação é a solidificação de uma solução em Vitrificação é a solidificação de uma solução em baixa temperatura sem a formação de cristais de baixa temperatura sem a formação de cristais de

gelo”gelo”Vatja G, 2000Vatja G, 2000

VitrificaçãoVitrificaçãoDefinição – Como ocorre Definição – Como ocorre VitrificaçãoVitrificaçãoDefinição – Como ocorre Definição – Como ocorre

O fenômeno é obtido com o aumentoextremo da viscosidade, associando

grande velocidade de resfriamento e o uso de soluções crioprotetoras que impeçam a

formação de cristais de gelo.

Congelamento VitrificaçãoLento

Cristais de gelo ++++ / ++ -Resfriamento ++++ - / +Toxicidade ++ ++++Efeitos osmóticos ++ ++++Problemas Mecânicos +++ +

Equipamento ++++ - / ++Habilidade ++ ++Velocidade ++ ++++

Contaminação + + / ++++

Avanço da criopreservação nos últimos 30 anos

`70`70 ‘80 ‘90 ‘80 ‘90 ‘00 ‘00

Potencial

lentolento

Décadas

vitvit

Porque algumas pessoas preferem congelamento lento

1. Educação conservadora

2. Congelamento lento leva a bons resultados com criopreservação de embriões

3. Congelamento lento traz resultados satisfatórios na criopreservação de oócitos

3. Vitrificação não tem uma única técnica padronizada

4. Empresas não estão interessadas

•Primeiro trabalho por Rall e Fahy (1985)Primeiro trabalho por Rall e Fahy (1985)• Procedimentos simples e eficientesProcedimentos simples e eficientes• Alta (CPAs) permeação celularAlta (CPAs) permeação celular• - Solidificação sem formação de gelo- Solidificação sem formação de gelo• Sólido contém distribuição iônica normal de estado Sólido contém distribuição iônica normal de estado líquido líquido • - viscoso, super-resfriamento líquido “glass-like”- viscoso, super-resfriamento líquido “glass-like”• Nenhum equipamento $ especial é requeridoNenhum equipamento $ especial é requerido• Todo o custo é baixoTodo o custo é baixo

Vitrificação - Congelamento rápido/ultra-rápidoVitrificação - Congelamento rápido/ultra-rápido

•Vitrificaçaõ: Embriões Vitrificaçaõ: Embriões HumanosHumanos

Autor Ano CPAs/ equipamento Estágio Resultados

Mukaida et al. 1998 EG, ficoll, sacarose/straw

D2-3 (4-8 c) Nascimento 1

Lane et al. 1999 EG, DMSO, ficoll, sacarose/cryolop

D6 spares Sobrevida pós descongel.

Choi et al. 2000 EG, sacarose/ EM grid D5-6 Nascimento 7

Yokota et al. 2000 EG, DMSO/straw D5 Gravidez

Yokota et al. 2001 EG, DMSO/straw D5 Nascimento

Mukaida et al 2001 EG, ficoll, sacarose/ cryoloop

D5 Nascimento

El-Danasouri et al. 2001 EG, sacarose/OPS D3 (6-8 c) Nascimento

Selman et al. 2002 EG, sacarose/OPS D1 zigoto Gravidez

Liebermann et al. 2002 EG, sacarose/ flexipet D1 zigoto Dev. Blast.

Vanderzwalmen et al. 2002 EG, ficoll, sacarose/straw

D 4-5, w/artificial redução da blastocele

Gravidez

Vitrificação: Oócitos HumanosVitrificação: Oócitos HumanosAutor Ano CPAs/

instrumentoEstágio Resultados

Pensis et al. 1989 DMSO, PROH, sacarose/straw

MII Sobrevida pós-descongelamento

Hunter et al. 1995 DMSO, PROH, EG/straw

MII Fert., desenvolvimento

Hong et al. 1999 EG, sacarose/ EM grid

GV/MII Sobrevida, formação de blastocisto

Kuleshova et al. 1999 EG, sacarose / OPS

MII Nascimento (1)

Chung et al. 2000 EG, sacarose/ grid

GV/ MI Blast., cromossomos normais

Yoon et al 2000 EG, sacarose/ EM grid

MII Nascimento (3)

Wu et al. 2001 EG, sacarose/ EM grid

GV Gravidez bioquímica

Chen et al. 2001 EG, sacarose/ straw

MII Sobrevida, fertilização, clivagem

Yoon et al. 2002 EG, sacarose/ EM grid

MII Sobrevida, fertilização, clivagem, PR (21%) IR (6,4%), nascimento 7

Esforços para melhorar a vitrificação

• 1985 -1997 decréscimo da toxicidade de crioprotetores

• 1996 – aumento das taxas de congelamento e resfriamento

• 1999 – busca de equipamentos apropriados

VitrificaçãoVitrificaçãoSucessoSucessoVitrificaçãoVitrificaçãoSucessoSucesso

O aumento da velocidade de resfriamento reduziu os danos produzidos pelas gotas lipídicas

intracelulares, principalmente as contidas nas membranas e no citoesqueleto, por atravessar mais rapidamente as faixas críticas (+15°C a –

5°C) de temperatura

Dobrinski, 1996;Martino, 1996b; Isachenko, 1998; Zeron, 1999

•Desidratação em 2 passos antes da vitrificaçãoDesidratação em 2 passos antes da vitrificação• Solução de equilíbrio (15-20% CPA): 2-20 min.Solução de equilíbrio (15-20% CPA): 2-20 min.• Solução de vitrificação (30-40% CPAs + sacarose): 20-90 Solução de vitrificação (30-40% CPAs + sacarose): 20-90 seg.seg.• Equipamentos para o congelamento ultra-rápido:Equipamentos para o congelamento ultra-rápido:

Cryostraw, EM grid, Cryoloop, OPS, Hemistraw, Cryotop Cryostraw, EM grid, Cryoloop, OPS, Hemistraw, Cryotop (mínimo volume no congelamento), Cryotip (straw puxado (mínimo volume no congelamento), Cryotip (straw puxado e fechado), Vitri-Ingáe fechado), Vitri-Ingá• Mergulhados diretamente no nitrogênio líquidoMergulhados diretamente no nitrogênio líquido• Diluição de CpAs e reidratação em 3 passos com Diluição de CpAs e reidratação em 3 passos com decréscimo da concentração de sacarose.decréscimo da concentração de sacarose.•Solução de descongelamento (1.0 M de sacarose)Solução de descongelamento (1.0 M de sacarose)•Solução de diluição (0,5 M de sacarose)Solução de diluição (0,5 M de sacarose)•Solução de lavagem (não sacaroseSolução de lavagem (não sacarose) )

Métodos de vitrificaçãoMétodos de vitrificação

VitrificaçãoVitrificação

vitrificação está baseada no contato direto da solução crioprotetora com o nitrogênio líquido

VitrificaçãoVitrificação

vitrificação está baseada no contato direto da solução crioprotetora com o nitrogênio líquido

•A taxa de resfriamento calculada:14.000 a 24.000°C/minuto - Martino, 1996b; Arav, 1997

20.000°C/minuto por Vajta et al., 1997 (OPS), Mezzalira et al., 1999 (vidro), Lane et al., 1999 (cryoloop), Matsumoto et al., 2001(nylon mesh)

Straw Grid&loop OPS SOPS Cryotop Straw Grid&loop OPS SOPS Cryotop Vitri-ingáVitri-ingá

2000020000

Taxa de Taxa de resfriamentoresfriamento

°C/min°C/min20002000

Velocidade de resfriamento

Método de vitrificação

Volume de solução (ul)

Taxa de congelamento

(C/min)

Taxa de aquecimento

(C/min)

Straw 25.0 4460 1300

OPS 1.5 16340 13900

Cryotop/ Vitri-ingá

<0.1 22800 42100

Kuwayama M, RMBOnline 11:300-8,2005

Método No. de oócitos No (%) comMorfologia

normal

No (%)clivados

Desenvolvimento

a blastocisto

Straw 152 144 (94.7) 60 (39.5) 8 (5.3)

OPS 149 143 (96.0) 71 (47.7) 11 (7.4)

Cryotop 153 148 (96.7) 91 (59.5) 35 (22.9)

Controle fresco

152 - 118 (77.6) 68 (44.7)

Desenvolvimento de oócitos bovinos depois da vitrificação

Kuwayama M, RMBOnline 11:300-8,2005

Vitri-ingá 100 86 (86.0) 32 (37,0)

JBRA 12:20-3,2008

Gestação 2009

Procedimento Gravideztotal

Gravidez clínica

Gravidez química

Aborto

Descongelamento de embriões

50,0% 50,0% 0,0% 0,0%

Descongelamento de oócitos

39,3% 10,7% 10,7% 17,9%

FIV 56,6% 45,3% 3,8% 7,5%

ICSI 56,3% 40,6% 9,4% 6,3%

ICSI + PESA 100,0% 100,0% 0,0% 0,0%

Gestação 2009 < 35 anos


Gravidez clínica

Gravidez química

Aborto


75,0% 75,0% 0,0% 0,0%


35,3% 11,8% 0,0% 23,5%

FIV 56,2% 53,1% 0,0% 3,1%

ICSI 59,1% 50,0% 9,1% 0,0%

ICSI + PESA 100,0% 100,0% 0,0% 0,0%

Gestação 2010


Gravidez clínica

Gravidez química

Aborto


20,0% 20,0% 0,0% 0,0%


58,4% 41,7% 16,7% 0,0%

FIV 55,6% 55,6% 0,0% 0,0%

ICSI 42,9% 33,3% 4,8% 4,8%

ICSI + PESA 28,6% 28,6% 0,0% 0,0%

Gestação 2010 < 35 anos


Gravidez clínica

Gravidez química

Aborto


25,0% 25,0% 0,0% 0,0%


60,0% 40,0% 20,0% 0,0%

FIV 50,0% 50,0% 0,0% 0,0%

ICSI 40,0% 30,0% 0,0% 10,0%

ICSI + PESA 40,0% 40,0% 0,0% 0,0%

Preparo endometrial• Embrião

Ciclo espontaneo + sup.Lutea. Prg+Est+Bus

• Oocitos

Neovlar 15 ou mais dias

Lupron 0.15 ml nos 5 ultimos dias do neovlar

Estrofen 2 mg/3d + 4 mg/3d + 6mg/d

Prl 100 mg + Bus no 4° d / Est 6 mg (Endométrio > 7 mm / A)

Aquecimento dia seguinte

Transferencia dia 3 pós aquecimento/ICSI

LANÇAMENTO

Vitrificação e Reprodução Vitrificação e Reprodução Assistida: Assistida: uma revolução ?uma revolução ?

Sem duvida Sem duvida

OBRIGADO

fotaleza 2010 - dr gilberto almodin - slides exibidos em aula

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