folha de aprovaÇÃo - arca: home · ... que realmente a vida tem valor e que você tem valor...

ii

FOLHA DE APROVAO

Cepas de Haemophilus influenzae circulantes, antes e aps a utilizao da vacina contra o

sorotipo b, e o contexto epidemiolgico das doenas por Haemophilus no Brasil.

Antonio Eugenio Castro Cardoso de Almeida.

Tese de Doutorado submetida Comisso Examinadora composta pelo corpo docentedo Programa de Ps-Graduao em Vigilncia Sanitria do Instituto Nacional de Controlede Qualidade em Sade da Fundao Oswaldo Cruz e por professores convidados de outrasinstituies, como parte dos requisitos necessrios obteno do grau de Doutor emVigilncia Sanitria.

Aprovado:

Prof._________________________________________________(USP/FIOCRUZ)

Dr. Jos da Rocha Carvalheiro

Prof._________________________________________________(IMPPG/UFRJ)

Dr. Milton de Uzeda

Prof._________________________________________________(IMPPG/UFRJ)Dr. Srgio Eduardo Longo Fracalanzza

Prof._________________________________________________(IPEC/FIOCRUZ)Dra. Keyla Belzia Feldman Marzochi

Prof._________________________________________________(INCQS/FIOCRUZ)Dra.. Maria Helena Simes Villas-Bas

Orientadores: ________________________________ _____________________Dra. Keyla Belzia Feldman Marzochi Dr. Andr Lus Gemal.

IPEC/FIOCRUZ INCQS/FIOCRUZ

Rio de Janeiro

2005

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http://www.pdfpdf.com/0.htm

iii

FICHA CATALOGRFICA

Almeida, Antonio Eugenio Castro Cardoso

Cepas de Haemophilus influenzae circulantes, antes e aps autilizao da vacina contra o sorotipo b, e o contexto epidemiolgico dasdoenas por Haemophilus no Brasil./ Antonio Eugenio Castro Cardosode Almeida. Rio de Janeiro: INCQS / FIOCRUZ, 2005.

xviii, 144p. il., tab

Tese de Doutorado em Vigilncia Sanitria, Prog. Ps-Graduao emVigilncia Sanitria / INCQS, 2005.Orientadores: Keyla Belzia Feldman Marzochi e Andr Lus Gemal.

1. Haemophilus influenzae e Haemophilus influenzae b (Hib).2. Haemophilus influenzae no b. 3. Meningite por Hib. 4.Vacinasconjugadas. 5. Caracterizao molecular: Identificao e Tipagem.6. Vigilncia epidemiolgica.

I. Ttulo



iv

.......O melhor disso tudo foi descobrir que pude ir mais longe, depois de pensar que no

podia mais.... e, que realmente a vida tem valor e que voc tem valor diante da vida!

... e jamais devemos deixar que nossas dvidas traidoras nos faam perder o bem que

poderamos conquistar e fazer se no fosse o medo de tentar.....

(adaptado da obra beijos no so contratos de William Shakeaspeare)



v

CAMINHO DA PERFEIO

Nada te perturbe, nada te espante, tudo passa. Deus no muda, a pacincia tudo

alcana;

Quem a Deus tem nada lhe falta, s Deus basta. Eleva

o pensamento, ao cu sobe, por nada te angusties, nada te perturbe.

A Jesus Cristo segue com peito grande e, venha o que vier, nada te espante.

Vs a glria do mundo? glria v; Nada de estvel, tudo passa;

Aspira s coisas celestes que sempre duram: Fiel e rico em promessas, Deus no muda.

Ama-o como merece, bondade imensa; Mas no h amor fino sem a pacincia.

Confiana e f viva mantenha a alma, que quem cr e espera, tudo alcana.

Do inferno acossado muito embora se veja, burlar os furores quem a Deus tem.

Advenham-lhe desamparos, cruzes, desgraas; Sendo Deus o seu tesouro, nada lhe

falta.

Ide, pois, bens do mundo. Ide, ditas vs; Ainda que tudo perca, s Deus basta.

Santa Teresa de vila



vi

Irm Dulce o anjo bom da Bahia, de quem pude presenciar exemplos de caridades e

amor ao prximo.

A Oswaldo Cruz, o fundador dessa casa que tenho a honra de pertencer e que sempre

esteve presente com o seu lema No esmorecer para no desmerecer.



vii

Aos meus pais, pelos seus exemplos, lies de fora e de sempre ir em frente.....

A minha me por ter me ensinado que os seres humanos so iguais e somente

as oportunidades os tornam diferentes....



viii

s Marias, do Cu e da Terra, que sempre estiveram presentes em minha vida.

Especialmente as trs:

Isabel, Elisa e Fernanda.

Obrigado pela pacincia e as provas de amor dirio.



ix

AGRADECIMENTOS

Primeiramente Dra. Suraia Hagge Barreto, da Faculdade de Farmcia da UFBa, pelos

primeiros ensinamentos e a empolgao do amor pela Bacteriologia.

Ao Instituto de Microbiologia da UFRJ, hoje honrando o nome do Professor Paulo de Ges,

pela acolhida e em especial ao Depto. de Microbiologia Mdica onde conheci os Drs.

Wilson Chagas de Arajo, Milton de Uzeda e Maria Cndida de Souza Ferreira que fazem

parte da nossa caminhada. No poderia esquecer Fernando pela sua alegria e amizade

principalmente nos anos de mestrado.

Aos Drs. Jos da Rocha Carvalheiro e Srgio Henrique Ferreira que, nas suas passagens

pelo INCQS, me ensinaram a confiar no futuro e no temer aos obstculos. Hoje estou

concluindo um compromisso do passado. Obrigado pelo desafio!........

Dra. Keyla Belizia Feldman Marzochi devo e dedico este trabalho. Obrigado pela sua

acolhida naquela manh de julho de 2001. Hoje tomo emprestado suas palavras e digo

que foi uma honra ser seu orientando. Como Deus foi bom em ter me conduzido sua

presena!

Ao Dr. Andr Luis Gemal, Diretor do INCQS, incentivador deste trabalho. Obrigado pela

sua presena, seus incentivos em meu trabalho e sua orientao.

Dra. Maria Regina Branquinho ex-Chefe do Depto de Microbiologia, pela confiana no

meu trabalho ao iniciar a rea de H. influenzae no INCQS e aos incentivos constantes.

s amigas do Setor de Saneantes Clia, Neide e Maria Helena sempre com pacincia,

estmulo e apoio nesses longos anos. Clia, em especial, pelas palavras e a presena

amiga sempre constante e principalmente nos momentos difceis, que ns cinqentes

estamos vivendo!.... Sabemos quantas montanhas tivemos de atravessar nesses ltimos

anos!

Lucia C. Werneck, obrigado pela sua amizade e sua presena de irm em muitos

momentos em todos esses anos!.....

Marisa C. Adati, amiga e companheira desses anos. Obrigado por dividir as alegrias e as

tristezas!



x

Aos colegas e amigos do Departamento de Imunologia, em especial ao Alexandre Alves

Dias, e ao GT-VAC pela ajuda em muitos momentos.

Ao Laboratrio de Substncia de Referncia, Setor de Colees de Culturas, primeiramente

ao Ivano R. V. de Filippis: amigo, irmo, filho e professor. Obrigado por fazer parte de

minha histria..... Maysa Mandetta Clementino, amiga, tia e professora. Nesse setor

comecei a entender a Biologia Molecular e aprendi o melhor de tudo: que estamos sempre

numa fila e h sempre algum na sua frente..... e atrs de voc.....Obrigado pela pacincia e

amizade em muitos momentos. No posso jamais esquecer outros grandes amigos: Ctia

Chaia, Nilson Pecly Ribeiro, Ana Paula Alves do Nascimento e Claudia Andrade que foram

fundamentais com a pacincia e generosidade nesses anos de convivncia.

s estagirias Alessandra, Diana e Letcia. Vocs marcaram minha existncia! Agradeo

porque aprendi mais com vocs do que pude ensinar. Cada uma surgiu em seu momento

mostrando-me o porqu de cada dia, de cada pgina da nossa vida.......

Marise Magalhes, Chefe do Departamento de Microbiologia do INCQS, pelo apoio ao

desenvolvimento deste trabalho.

Aos colegas do Departamento de Microbiologia do INCQS, que direta ou indiretamente,

colaboraram com palavras, trabalho e fora para a realizao dessa tese.

Dra. Cristina Rebelo, Chefe do Laboratrio de Bacteriologia do Instituto Estadual de

Infectologia So Sebastio, pelo apoio atravs do fornecimento de cepas clnicas,

indispensveis na realizao desse trabalho.

Dra. Clia Maria Monteiro da Cunha, do Laboratrio de Bacteriologia do Instituto

Fernandes Figueira IFF/FIOCRUZ, pela acolhida e fornecimento de isolados clnicos para

a realizao desse trabalho.

s Dras. Nadjla N. F. Souza do LACEN-PE e Rita de Cssia Campos Bertoncini do

LACEN-SC, pela colaborao na doao de cepas clnicas viabilizando nosso projeto.

Ao Programa de Ps-Graduao em Vigilncia Sanitria do INCQS, sob a Coordenao da

Dra. Maria Helena S. Villas-Bas, pela sua ateno e gentileza sempre presente, no

esquecendo a pacincia de Simone, Gisele e Pedro.

Aos pacientes e seus familiares, que a despeito das circunstncias adversas, contriburam

para a realizao desse trabalho.



xi

RESUMO

As bactrias do gnero Haemophilus, famlia Pasteutelleaceae tm na espcie influenzae a

mais importante nas infeces humanas. O Hi, que inclui os sorotipos capsulares a-f e os

NT, responsvel por diversos quadros infecciosos, predominando em crianas,

destacando-se a patogenicidade para o SNC e o trato respiratrio associada principalmente

ao Hib. Desde 1988 as doenas associadas ao Hib so prevenveis pela vacina conjugada

formada do PRP e uma protena carreadora, includa no PNI/MS em agosto de 1999. Foi

ento criada uma linha de pesquisa sobre o Hi no INCQS-FIOCRUZ com nfase no estudo

de cepas isoladas antes e aps a implantao da vacina, que reduziu mas no impediu a

ocorrncia da doena. O presente estudo incluiu 235 cepas, procedentes dos estados de

Santa Catarina (SC), Rio de Janeiro (RJ) e Pernambuco (PE). Verificamos que o Hib antes

da vacinao predominava em mais de 90% dos casos, sendo os outros tipos sorolgicos

raros. Aps a vacinao, cai o tipo b, crescem os tipos no b, em meningites, septicemias e

infeces respiratrias. Os biotipos I e II foram os mais isolados. Houve variao da

sensibilidade aos antimicrobianos testados (ampicilina, amoxicilina-cido clavulnico,

ceftriaxona, rifampicina, cloranfenicol e sulfametoxazol-trimetoprim), sobretudo na

associao SMX-TMP cuja resistncia dos Hi aumentou de 32,6% para 65,8% entre os dois

perodos; enquanto se mantiveram taxas semelhantes de resistncia para a ampicilina

(17,5% e 15,8%) e a presena de cepas produtoras de -lactamase; a sensibilidade

amoxicilina-cido clavulnico e ceftriaxona foi de 100%. Alterao na resistncia ao

cloranfenicol de 19,4 para 12,5% e da rifampicina de 8,2 para 9,7%.A tipagem sorolgica

realizada pelo mtodo da SAL, teve bons resultados (96,2%) e a molecular, pela PCR,

diferenciou as cepas NT das capsuladas b-. Embora a estrutura populacional dos Hi tenha

sido inicialmente descrita como clonal, os resultados obtidos atravs da tcnica de ERIC-

PCR, revelaram diversidade gentica nas cepas estudadas. As do sorotipo b, revelaram 4

clones com diferentes caractersticas epidemiolgicas. A diversidade gentica foi maior nas

Hinb e HiNT. Dos estados estudados, PE teve a mais alta diversidade gentica (6 clones

em 15 cepas) seguido do RJ (3 clones em 23 cepas) e SC (2 clones em 13 cepas).

Conclumos, portanto, que h necessidade do monitoramento das cepas circulantes de Hi no

pas observando as possveis alteraes na prevalncia dos sorotipos atuais e a real

estimativa do impacto da vacina contra o Hib atualmente utilizada no Brasil.



xii

ABSTRACT

The bacterial genus Haemophilus is included in the family Pasteurellaceae and the most

important specie causing infectious diseases in humans is the Hi. It shows capsular

serotypes (a-f) as well as NT strains. A great number of different acute infectious diseases

are caused by this organism, especially affecting the CNS, as well as RD, occurring

frequently in children, especially with the Hib. Since 1988 disease associated with Hib has

been vaccine-preventable, by means of the first conjugate vaccine showing great efficacy.

The vaccine is composed by the PRP and a carrier protein. However, the Hib is still

considered one of the most important human pathogens, which leaded us to develop

different research lines, with isolates from different source of infections, after the

introduction of the conjugate vaccine against Hib by PNI/MS in 1999. We used in our

study 235 Hi isolates, from the brazilian states of Santa Catarina, Rio de Janeiro and

Pernambuco. Our results, show that the rate of type b infections before vaccination was

more than 90%, whereas other serological types were rare. After the advent of the vaccine,

we observe a decrease of type b and an increase of non-b isolation. Biotypes I and II are

still the most frequently isolated. The antimicrobial susceptibility found against ampicillin,

amoxicillin-clavulanate, ceftriaxone, rifampicin, chloranphenicol and TMP-SMX, showed a

recent increasing resistance against antibiotics commonly used to treat RD, especially

among the ones administrated by oral route, showing a resistance rate from 32.6% to 65.8%

between the two periods studied. Ampicillin, showed resistance rates of 17.5% and 15.8%

in the two periods studied and the presence of -lactamase producing strains. Strains

evaluated against amoxicillin/clavulanate and ceftriaxone, were 100% sensible.

Chloranphenicol showed a decrease in the resistance rates of the strains isolated during the

post-vaccination period, while rifampicin, showed an increase in the resistance rate from

8.2 to 9.7%. The seroaglutination method used for capsular typing, showed good results,

however, mutant b capsulated strains (b-), were only detected by the PCR, using specific

primers for the capsule region. The population structure of Hi which has been described as

clonal, revealed a great genetic diversity by ERIC-PCR. Therefore we can conclude that

there is a need of systematic tracking of circulating Hi strains in the country, continuously

watching possible epidemiological changes and the evaluation of the impact of the vaccine

against Hib used in Brazil to date.



xiii

LISTA DE SIGLAS, SMBOLOS E ABREVIATURAS

ATCC American Type Culture Collection

CDC Center for Disease Center

CDI Centro de Doenas Infecciosas

CENEPI Centro Nacional de Epidemiologia

CNS Central Nervous System

CIM Concentrao Inibitria Mnima

COVER Coordenao de Vigilncia Sanitria das Doenas de Transmisso

Respiratrias e Imunoprevenveis.

DEVEP Departamento de Vigilncia Epidemiolgica

DNA Deoxyribonucleic acid

ERIC Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus

EUA Estados Unidos da Amrica

FUNASA/ FNS Fundao Nacional de Sade

Hi Haemophilus influenzae

Hib Haemophilus influenzae tipo b

Hinb Haemophilus influenzae no b

HiNT Haemophilus influenzae no tipvel

HIV Human Immunodeficiency Virus

IS 1016 Insertion Sequence

ITR Infeco do Trato Respiratrio

MS Ministrio da Sade

NT No Tipvel

OMS Organizao Mundial da Sade

PCR Polymerase Chain Reaction

PNI Programa Nacional de Imunizaes

PRP Polirribosil-Ribitol-Phosphate

RD Respiratory disease

SAL Soro Aglutinao em Lmina



xiv

SES Secretaria Estadual de Sade

SINAN Sistema de Informaes de Agravos de Notificao

SNC Sistema Nervoso Central

SUS Sistema nico em Sade

SVS Secretaria de Vigilncia em Sade

TBE Tris Borato-EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)

TMP-SMX trimethoprim/sulfamethoxazole

WHO World Health Organization



xv

LISTA DE ILUSTRAES

FIGURA 1 - Esfregao de cultura do H. influenzae (Colorao pelo mtodo de

Gram).................................................................................................................................... 1

FIGURA 2 - Modelo simplificado da organizao do locus cap no genoma do

H. influenzae......................................................................................................................... 6

QUADRO 1 - Fisiopatologia das infeces por Haemophilus influenzae de tipo b..............7

FIGURA 3 - Criana com um ano de idade com infeco no membro inferior (prpura

fulminante) por Haemophilus influenzae sorotipo a ocasionando amputao de dois dedos

(ADDERSON et al., 2001).....................................................................................................9

FIGURA 4 - Esfregao de lquido cefalorraquidiano (LCR) com Haemophilus influenzae

(colorao pelo mtodo de Gram).........................................................................................10

QUADRO 2 - Tipos de vacina conjugada contra o H. influenzae tipo b (Hib)....................17

FIGURA 5 - Estrutura da vacina conjugada contra o H. influenzae tipo b (Hib)................20

QUADRO 3 - Calendrio Bsico de Vacinao contra o H. influenzae tipo b (Hib)-PNI/MS.......21

GRFICO 1- Meningite p/ Haemophilus Srie histrica de casos e bitos. Brasil, 1980

2003.......................................................................................................................................63

GRFICO 2 Incidncia de meningite por diversas causas em crianas menores de

4 anos, Brasil, 1987 a 1991.............................................................................................. 66

GRFICO 3 Evoluo dos casos de meningite bacteriana no especificada no

municpio do Rio de Janeiro.................................................................................................66



xvi

GRFICO 4 - Taxa de incidncia de meningites no municpio do Rio de Janeiro 1997 a

2002.......................................................................................................................................67

GRFICO 5 - Evoluo dos casos de meningite por H. influenzae no municpio do Rio de

Janeiro (1997-2002)..............................................................................................................68

TABELA 1 - N de cepas de H. influenzae tipo b (Hib) e Hi no b utilizadas em cada

manuscrito.............................................................................................................................71

TABELA 2 - Iniciadores (primers) para as regies cpsula-especfico e tipo - especifico do

genoma do H. influenzae.......................................................................................................73

FIGURA 6 - Eletroforese em gel 1 % (1xTBE) com produto da reao da PCR de cepas de

isolados clnicos de Hi onde esto representados todos os tipos sorolgicos encontrados em

nosso estudo pelo mtodo da tipagem molecular por PCR...................................................74

FIGURA 7 - Modelo simplificado de funcionamento da tcnica de ERIC-PCR em parte do

genoma do H. influenzae ......................................................................................................82



xvii

SUMRIO

RESUMO...............................................................................................................................xi

ABSTRACT..........................................................................................................................xii

LISTA DE SIGLAS, SMBOLOS E ABREVIATURAS...................................................xiii

LISTA DE ILUSTRAES................................................................................................xv

SUMRIO..........................................................................................................................xvii

1- Introduo...........................................................................................................................1

1.1- Consideraes gerais..........................................................................................1

1.2- Histrico.............................................................................................................4

1.3- Patogenia: A cpsula..........................................................................................5

1.4- A infeco e a doena........................................................................................6

1.4.1- Quadro clnico..............................................................................................8

1.5- O diagnstico confirmatrio............................................................................11

1.5.1- Isolamento e Identificao do Microrganismo...........................................11

1.5.2- Sorotipagem.................................................................................................12

1.6- Caracterizao molecular do H. influenzae: Identificao e Tipagem.............13

1.7- Profilaxia: A vacina..........................................................................................14

1.8- Mecanismo imune envolvido...........................................................................16

1.9- Tipos de vacina................................................................................................16

1.10- Epidemiologia..................................................................................................18

2- Objetivos...........................................................................................................................23

2.1- Objetivo geral....................................................................................................23

2.2- Objetivos especficos.........................................................................................23



xviii

3- Resultados.........................................................................................................................24

3.1 - MANUSCRITO 1 Occurrence of Haemophilus influenzae strains in three Brazilianstates since the introduction of a conjugate Haemophilus influenzae type b vaccine(publicado em Brazilian Journal of Medical Biological Research, 38 (5):777-781,2005)....25

3.2 - MANUSCRITO 2 Antimicrobial susceptibility of Haemophilus influenzae isolatescollected from four centers in Brazil (1990-2003). (publicado em DiagnosticMicrobiology and Infectious Disease, 54 (1):57-62, 2006..31

3.1- MANUSCRITO 3 Molecular and phenotypic characterization of Haemophilusinfluenzae strains isolated from Brazilian patients before and after vaccination againstHaemophilus influenzae type b (Hib). (submetido para publicao na Journal ofMedical Microbiology em setembro de 2005).............................................................38

4- Discusso..........................................................................................................................62

5- Concluses e Perspectivas................................................................................................84

5.1- Concluses.........................................................................................................84

5.2- Perspectivas.......................................................................................................85

6- Referncia Bibliogrfica...................................................................................................87

7- Anexos............................................................................................................................105

7.1- Anexo 1............................................................................................................105

7.2- Anexo 2............................................................................................................106

7.3- Anexo 3............................................................................................................109

7.4- Anexo 4............................................................................................................112

7.5- Anexo 5............................................................................................................115



1. INTRODUO

A proposta dessa pesquisa, abrindo uma linha de investigao no Instituto Nacional de

Controle de Qualidade em Sade (INCQS) pertencente Fundao Oswaldo Cruz

(FIOCRUZ), est associada necessidade de, sob diferentes aspectos, monitorar o

comportamento dos processos infecciosos por Haemophilus influenzae (Hi) em todo o pas,

tomando por marco divisrio a incluso da vacinao contra o Haemophilus influenzae b

(Hib) no Programa Nacional de Imunizaes (PNI) do Ministrio da Sade (MS), a partir de

agosto de 1999.

1.1. CONSIDERAES GERAIS

As bactrias do gnero Haemophilus pertencem famlia Pasteurellaceae e so

microrganismos aerbios, imveis, no-hemolticos (com exceo das espcies hemolyticus e

parahemolyticus). So tambm Gram-negativos, pleomrficos e no esporulados, conforme

mostrado na figura1. Existem dezenove espcies, sendo dez parasitas obrigatrios do homem

e nove encontradas em outros animais. As espcies isoladas de humanos fazem parte da

microbiota dos tratos respiratrio, geniturinrio e da cavidade oral de indivduos saudveis

(MENDELMAN, 1987).

FIGURA 1 - Esfregao de cultura do H. influenzae(Colorao pelo mtodo de Gram).



2

A espcie Haemophilus influenzae a mais importante e inclui diversos sorotipos

capsulares (a-f) bem como espcies no tipveis. As doenas causadas por esse

microrganismo compem um leque de infeces, de carter agudo, com maior patogenicidade

para o Sistema Nervoso Central (SNC) e o trato respiratrio alto e baixo, francamente

predominante em crianas e associadas principalmente ao Haemophilus influenzae do tipo

sorolgico b ou Hib.

Desde 1988 os processos infecciosos associados ao Hib so prevenveis por vacinao.

Contudo, anos depois, o Hib ainda descrito como importante patgeno humano, responsvel

por diversas infeces invasivas e graves, principalmente em crianas menores de 5 anos

(MURPHU et al., 1993; IWARSON,1993). A partir de 1997, a Organizao Panamericana da

Sade (OPAS) recomendou a aplicao da vacina contra o Hib em toda Amrica Latina, sendo

o Uruguai (1994) e Chile (1996) os pioneiros com reduo importante na incidncia da

meningite (BEPA, 2004).

No Brasil poucos estudos foram feitos sobre a freqncia do Hib nas infeces. Em

2002, Zanella e colaboradores analisaram 3204 cepas do Centro de Referncia do Instituto

Adolfo Lutz So Paulo, isoladas no perodo de 1990-1999, revelando o Hib na quase

totalidade (97,8%) seguido, muito distante, pelos H. influenzae no tipavis (1,5%) e pelo

sorotipo a (0,5%). Dados recentes mostraram que, de 229 cepas coletadas no perodo de 1990-

2003, originrias de trs estados brasileiros, 81,7% eram H. influenzae do tipo sorolgico b

sendo todas procedentes de pacientes com meningite (DE ALMEIDA et al., 2005). Este

microrganismo tem sido, classicamente, includo entre os trs principais causadores de

meningite /meningoencefalite bacteriana, ao lado da Neisseria meningitidis e do Streptococcus

pneumoniae (FREIRE, 1987; JOKLIK et al., 1992; BARQUET et al., 1996). Outras

enfermidades causadas pelo Hib, de considervel freqncia e gravidade, envolvem epiglotite,

pneumonia, otite mdia aguda, celulite, abscessos, artrite sptica e conjuntivite (GRANOFF &

CATES, 1985; ANDERSON et al., 1989; LIPUMA, RICHMAN & TERRENCE, 1990;

IWARSON, 1993; BARQUET et al., 1996; KONEMAN et al., 1997). A infeco do SNC a

forma mais sria das doenas invasivas causadas por Haemophilus influenzae, principalmente

pelo tipo b, podendo ser letal ou deixar seqelas neurolgicas permanentes como perda da

audio, retardo mental e convulses (GRANOFF & CATES, 1985; BARQUET et al., 1996).



3

A letalidade em crianas infectadas j alcanou a faixa de 5 a 10%, em pases desenvolvidos,

e 30% em pases em desenvolvimento (MMWR, 1991; BIJLMER, 1991; JENNINGS & PON,

1991; IWARSON, 1993; ADAMS et al., 1993; BARQUET et al., 1996).

Com a utilizao da vacina conjugada contra o Hib houve acentuada diminuio em

berrios e creches de surtos pelo Hib, antes freqentes, como os ocorridos nos anos 70 e 80

na Europa. Casos relatados por McVernon et al. (2004), de infeco por Hib com crianas

vacinadas, numa creche na Inglaterra, mostram a necessidade do controle dos portadores bem

como, profilaticamente, da administrao de antibiticos nos comunicantes crianas e adultos.

O ser humano o nico hospedeiro natural do Haemophilus influenzae. Esta bactria

encontrada na microbiota da nasofaringe de 60 a 90% das crianas sendo a presena do

H. influenzae tipo b nas narinas e faringe de cerca de 5% de crianas normais

(MENDELMAN & SMITH, 1987). A transmisso do Haemophilus influenzae d-se atravs

de gotculas nasofarngeas, de pessoa a pessoa, procedentes de portadores sos,

principalmente, ou doentes.

A microbiota da nasofaringe humana estabelecida gradualmente durante o primeiro

ano de vida. Os microrganismos adquiridos nos primeiros dias aps o nascimento provm da

me e de outros familiares, dos profissionais de sade envolvidos no momento do parto e at

dos microrganismos do ambiente. Outros microrganismos patognicos, precocemente, podem

ser encontrados na microbiota do trato respiratrio, a partir do primeiro dia de vida. Tambm

o Hib foi detectado na nasofaringe de recm-nascidos, em 0,7% deles (ANIANSSON et al.,

1992; CAMPOS, 1999). Porm estudo bem anterior na Nova Guin mostrou que a maioria das

crianas estavam colonizadas por H. influenzae e S. pneumoniae j no primeiro ms de idade

(ROUNTREE et al., 1967).

Aproximadamente 80% das doenas por H. influenzae do tipo b ocorrem entre o

terceiro ms e o terceiro ano de vida, sendo a maior incidncia observada em lactentes com

idade entre seis meses e um ano; 35 a 40% dos casos observam-se em crianas com mais de

18 meses de vida (AMATO NETO et al., 1991). Essa bactria foi responsvel at final da

dcada de 90 por cerca de 95 % das meningites bacterianas infantis (MURPHU et al., 1993;

BARQUET et al., 1996; ZANELLA et al., 2002; HEATH et al., 2001; BEPA, 2004; DE

ALMEIDA et al., 2005).



4

Com a introduo da vacina conjugada especfica contra o Hib houve no somente

uma reduo dramtica nas doenas por Hib como tambm diminuio desse microrganismo

nos portadores, tanto nas crianas vacinadas como no vacinadas (MEATS et al., 2003). Por

outro lado, entretanto, aps a poltica mundial de imunizao com a referida vacina pouco se

conhece sobre a nova epidemiologia associada aos sorotipos circulantes e a expresso clnica

de infeces localizadas ou invasivas pelo H. influenzae (CAMPOS et al., 2003).

Assim, torna-se necessrio avaliar as possibilidades de um novo papel eco-

epidemiolgico e clnico dos sorotipos no b do H. Influenzae.

1.2. HISTRICO

Em 1882, Robert Koch foi quem primeiro descreveu um microrganismo semelhante ao

Haemophilus encontrado em exsudato conjuntival. Entretanto, considera-se Richard Pfeiffer

como o primeiro que identificou o patgeno designando-o de Influenza bacillus em 1892. O

isolamento desta bactria no esputo e em tecido de pulmo de indivduos que morreram na

pandemia de gripe, naquele mesmo ano, contribuiu para que fosse considerado como o agente

etiolgico tornando-se responsvel pela denominao gripe conhecida como influenza

(KILIAN, 1986). Ainda em 1892, Pfuhl fez o primeiro relato de meningite pelo Influenza

bacillus, tendo sido o organismo identificado aps a morte dos pacientes. Em 1898, Slawyk

relatou o isolamento do Influenza bacillus de um lquor purulento de um paciente ainda em

vida (FREIRE, 1987).

Winslow e colaboradores em 1917 sugeriram a denominao de Haemophilus para este

grupo de microrganismo por apresentar crescimento significativo quando cultivado em meio

sinttico contendo sangue ou hemcias lisadas. O reconhecimento desta denominao ocorreu

bem mais tarde quando o Comit de Nomenclatura da Associao Americana de

Bacteriologistas denominou-o de Haemophilus influenzae (PITTMAN, 1931). Neste mesmo

trabalho a autora revelou que o H. influenzae poderia ser encontrado sob duas formas:

encapsulado e no encapsulado. Foi tambm capaz de identificar seis tipos de cpsulas

antignicas, que caracterizou de a at f. Dando continuidade a esta linha de trabalho, Pittman

(1935) demonstrou que, dessas seis cpsulas sorotipadas, o sorotipo b era o responsvel por

quase todas as infeces graves causadas por H. influenzae, o que tem sido at hoje verificado

por outros autores (FREIRE, 1987; JOKLIK et al., 1992; ELLIS & GRANOFF, 1994).



5

Pensava-se ento que as linhagens no capsuladas, encontradas em 50-80% do trato

respiratrio de pessoas saudveis como microbiota natural, no estariam relacionadas a

doenas invasivas (KILIAN & BIBERSTEIN, 1984; FREIRE, 1987; JOKLIK et al., 1992).

Em continuao a caracterizao fenotpica, Kilian (1986) subdividiu o Haemophilus

influenzae em quatro biotipos (I a IV). Esta classificao baseou-se em ensaios bioqumicos,

portanto em caracteres fenotpicos, associados s caractersticas de produzir enzimas como:

urease, ornitina-descarboxilase e triptofanase. Atualmente so oito biotipos (I a VIII), e no

tm relao com os sorotipos (KONEMAN et al., 1997). Existe, porm uma associao entre a

cpsula do tipo b e o biotipo I, que o mais freqente, inclusive nos estudos pioneiros

realizados com cepas isoladas em So Paulo (LANDGRAF & VIEIRA, 1993).

1.3. PATOGENIA: A CPSULA

A patogenicidade de H. influenzae est relacionada cpsula, como principal fator de

virulncia (ROBBINS, SCHJEERSON & PITTMAN, 1984; GRANOFF & CATES, 1985;

JOKLIK et al., 1992; KONEMAN et al., 1997). Na clula bacteriana esta estrutura, formada

de monmeros contendo unidades de ribose, ribitol e fosfato, que constituem o polissacardeo

poliribosil-ribitol-fosfato (PRP), est firmemente aderida parede celular (CRISEL et al.,

1975).

A sntese e o transporte do polissacardeo para a cpsula do H.influenzae so regulados

por um complexo de genes, denominado de locus cap, contidos em uma unidade funcional

chamada cassete. O locus cap tem uma organizao comum para todos os seis tipos

capsulados e formado por trs regies: I, II e III. As regies I e III contm os gens

necessrios para o processamento e exportao do polissacardeo, que so comuns para todos

os sorotipos. Estas regies flanqueiam a regio II, onde se encontram os genes responsveis

pela sntese dos dissacardeos sendo, portanto, a regio capsular sorotipo-especfica. Na

maioria das cepas invasivas do tipo b, o cap flanqueado por seqncia de insero (IS1016).

Estes podem estar inseridos entre as regies I e II, interferindo na funcionalidade do cap,

originando assim as cepas no tipveis (NT). Esta regio pode ser tambm flanqueada por

seqncias repetitivas (KROLL et al., 1989; FALLA et al., 1994).

A organizao do cap predispe duplicao ou perda do cassete capsular, podendo

faltar a regio I ou III. A maioria das cepas isoladas de Hib contm uma duplicao parcial do

cap, que consiste de uma cpia intacta e uma segunda cpia que carrega uma deleo parcial



6

do bexA estando localizado na regio I do cap que participa na exportao do material

capsular e se apresenta conservada em todos os seis tipos capsulados (KROLL, HOPKINS &

MOXON, 1988; KROLL et al., 1989, 1990). A reao em cadeia da polimerase bexA

(Polymerase Chain Reaction-bexA) visa, portanto, distinguir as cepas capsuladas das no

capsuladas. Portanto, a deteco da cpsula tipo-especfico de fundamental importncia

quando se deseja identificar as cepas invasivas de H. influenzae (VAN KETEL, DE WEVER

& VAN ALPHEN, 1990; KROLL, LOYNDS & MOXON, 1991). A figura 2 mostra o modelo

simplificado da organizao do locus cap no genoma do H. influenzae.

Regio I Regio II Regio III

regio comum regio capsular tipo-especfico regio comum

bexA bex B bex C bex Da b c d e f

Genes associados ao Genes sorotipo-especficos Genes ligados ps-transporte de protenas para polimerizao da cpsulacpsula ATP-dependente

Regio truncada pelo IS 1016 IS 1016

IS 1016 (facultativa)

FIGURA 2 Modelo simplificado da organizao do locus cap no genoma do H. influenzae.

1.4. A INFECO E A DOENA

A aderncia e colonizao do epitlio da nasofaringe o primeiro passo para o

desenvolvimento da infeco (subclnica) ou da doena sistmica pelo Haemophilus

influenzae, sobretudo pelo Hib. Foi demonstrado que os contatos de pacientes com doena

sistmica por Hib, como familiares e freqentadores de creches e orfanatos, apresentavam

maior intensidade de colonizao. Nestas famlias foram encontradas taxas de 60 a 70% de

colonizao entre irmos e 20% entre pais, concluindo-se que, pela maior exposio, os

contatos citados estariam mais vulnerveis doena.

Certamente a diferena entre a taxa dos colonizados e os que adoecem deve

corresponder proporo de infectados que desenvolvero imunidade contra essa bactria.

Isso justificaria a raridade da doena a partir dos sete anos de idade, a qual pode

eventualmente reaparecer nos grupos etrios avanados associando-se queda da imunidade.



7

A colonizao pode persistir na nasofaringe durante meses e seu sucesso depende da

cepa do Haemophilus influenzae e das defesas locais do hospedeiro. Existem evidncias de

que a infeco viral concomitante pode potencializar a colonizao e a doena invasiva.

O desenvolvimento da infeco sistmica exigiria uma grande quantidade de bastonetes

(BOUSKELA et al., 2000).

A patogenia da doena por H. influenzae no est compreendida inteiramente, embora a

presena da cpsula do polissacardeo seja considerada como o fator principal de virulncia. A

invaso sistmica pode se dar atravs do epitlio da nasofaringe, penetrando diretamente os

capilares sanguneos. A cpsula bacteriana dificulta a fagocitose e a lise, mediada pelo

complemento. Por isso considerava-se que as espcies no capsuladas ou no tipavis fossem

menos invasivas, podendo aparentemente induzir uma resposta inflamatria que levasse a um

quadro patgnico. Em 2003, Murphy chamou ateno para outras estruturas antgnicas, alm

da cpsula, que fazem parte do mecanismo de patogenia dos Hi. O lipopolissacardeo (LPS) e

as protenas de membrana externa (OMP) so fatores de virulncia importantes, sobretudo

para se entender o isolamento do HiNT em processos infecciosos.

O H. influenzae, a partir da porta de entrada na nasofaringe, pode causar diversas

manifestaes clnicas localizadas e sistmicas como faringite, sinusite, otite, laringite,

pneumonia, meningite, septicemia, e outras possivelmente mais raras como: celulite,

osteomielite e artrite, como sintetizado no quadro 1.

QUADRO 1 - FISIOPATOLOGIA DAS INFECES POR HAEMOPHILUSINFLUENZAE DE TIPO b

CONTATO BACTRIA - HOSPEDEIRO

ADESO/ COLONIZAONASOFARINGE

CORRENTE SANGNEA

LOCALIZAO SECUNDRIASepse

Outros

Pneumonia

Meningite

Sinusite

Otite

Epiglotite

Laringo - TrqueoBronquite



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Os H. influenzae no tipveis (HiNT) so agentes freqentes e comuns de otites e

sinusites infantis sendo por vezes associados tambm a pneumonias em adultos. O Hib, que

sempre se destacou como agente infeccioso, aparece somente em 20% das otites infantis

(AMATO NETO et al., 1991). Aps a utilizao da vacina conjugada essa taxa caiu para

5-10% (CDC, 2004).

Apresentamos, a seguir, a conduta e suas bases, a serem consideradas diante de pacientes

com suspeita de doena por H. influenzae (DE ALMEIDA & MARZOCHI, no prelo).

Justifica-se no s pela relevncia do diagnstico clnico e laboratorial ao tratamento precoce,

capaz de evitar bitos e seqelas, mas como subsdio ao monitoramento dos casos suspeitos

no perodo pr-vacinal.

1.4.1 Quadro clnico

A meningite purulenta ainda considerada a forma mais sria das doenas invasivas

causadas por Hib, que persiste como o terceiro principal agente de meningite bacteriana

purulenta aguda seguido de Neisseria meningitidis e Streptococcus pneumoniae (JOKLIK,

WILLETT & AMOS, 1980; FREIRE, 1987; BARQUET et al., 1996). Embora o bito ocorra

em menos de 10% dos casos, pode evoluir com manifestaes graves ou complicaes e

deixar seqelas neurolgicas permanentes (GRANOFF & CATES, 1985; BARQUET et al.,

1996). Outras enfermidades graves, alm da infeco do SNC, podem ser causadas por esta

bactria incluem, ainda hoje, infeces do trato respiratrio, articulaes e pele

(ANDERSON et al., 1989; IWARSON, 1993). Entre as formas clnicas freqentes esto a

epiglotite, pneumonia, otite mdia aguda, celulite, artrite sptica e conjuntivite (GRANOFF &

CATES 1985; LIPUMA, RICHMAN & TERRENCE., 1990; MURPHU et al., 1993;

KONEMAN et al., 1997).

A meningite por H. influenzae, clinicamente indistinguvel das demais meningites

purulentas agudas, tem instalao rpida com febre alta, cefalia, vmitos, comprometimento

do estado geral e sinais de irritao menngea. Pode acompanhar-se de sepse; porm, mais

raramente, nos casos de sepse grave, pode ocorrer choque e at mesmo prpuras nas primeiras

48 horas.

Na evoluo da meningite, pode haver comprometimento sensorial e observar-se

progressivamente sonolncia, desorientao, torpor e coma. Nas crianas menores, recm-

nascidos e lactentes, o diagnstico mais difcil, pois a cefalia no caracterizada e os sinais



9

menngeos e outros podem faltar, mas chamam a ateno a irritabilidade, recusa alimentar,

abaulamento da fontanela, apatia, crise convulsiva, apnia e instabilidade trmica. Essas

manifestaes em geral denotam a presena maior ou menor de edema cerebral. Sobretudo em

lactentes, pode ocorrer coleo subdural, capaz de evoluir a empiema subdural, e abscesso

cerebral. Nestes casos observam-se manuteno ou retorno da febre e aparecimento de sinais

neurolgicos focais e/ou convulses. A coleo, de patognese desconhecida,

freqentemente bilateral, contm lquido xantocrmico e estril com volume varivel (de 4 a

100 ml) e com alta concentrao de protenas; quando, excepcionalmente, esse lquido

purulento e contm o agente etiolgico caracteriza o empiema. Diferentemente da efuso

subdural que no costuma agravar o diagnstico, o empiema e o abscesso por seu efeito de

massa podem no ter boa evoluo, requerendo de regra interveno cirrgica.

Seqelas permanentes das meningites como surdez, comprometimento cognitivo de

diferentes nveis, epilepsia, hidrocefalia, cegueira, diabete inspido so referidas (GRANOFF

& CATES 1985; BARQUET et al., 1996). As baixas faixas etrias acometidas so em si

importantes fatores de risco. H registros de casos de prpura grave tambm ocasionando

seqelas como amputaes de membros, ou fulminantes, figura 3 (ADDERSON et al., 2001).

FIGURA 3 - Criana com um anode idade com infeco no membroinferior (prpura fulminante) porHaemophilus influenzae sorotipo aocasionando amputao de doisdedos (ADDERSON et al., 2001).



10

Apresentaes clnicas mais raras, isoladas ou acompanhando outros quadros, podem

ocorrer, como artrite, pericardite e endocardite.

fundamental uma suspeita clnica etiolgica para o tratamento precoce, capaz de levar

mais provavelmente a evoluo favorvel, sobretudo nas formas clnicas graves do

acometimento associvel ao H. influenzae. A histria clnica completa e acurada, com exame

clnico minucioso, incluindo a busca de infeces consideradas como porta de entrada, como

otite, sinusite e pneumonia, so essenciais, principalmente nos casos de meningites.

Exames laboratoriais inespecficos, inclusive de imagem, so indicados na dependncia

da orientao clnica.

No caso da suspeita de meningite, deve-se sempre proceder a puno do lquido

cefaloraquidiano, salvo raras contra-indicaes. O lquor caracterstico das meningites

purulentas mostra celularidade acima de 500, predomnio acentuado de neutrfilos, aumento

de protenas e reduo de glicorraquia. O exame citolgico e bioqumico do lquor, e sricos

como protena C reativa (PCR) e dosagem de procalcitonina (VIALLON, 1999; TUNKEL et

al., 2004) contribuem para diferenar as meningites bacterianas das linfomonocitrias viral e

tuberculosa ou fngica, entre os principais agentes.

A bacterioscopia, no caso do lquor ou eventualmente de outras espcimes, permite

evidenciar, na dependncia da concentrao bacteriana, formas de cocobacilos Gram

negativos, como mostra a figura 4. Entretanto, a diferenciao devida entre as bactrias

requer, obrigatoriamente, a busca de identificao do agente biolgico.

FIGURA 4 Esfregao de lquido cefalorraquidiano (LCR) comHaemophilus influenzae (colorao pelo mtodo de Gram)



11

1.5-O DIAGNOSTICO CONFIRMATRIO

1.5.1 - Isolamento e Identificao do Microrganismo

A cultura da amostra de lquor, de sangue e/ou de outros materiais secrees de

ouvidos, seios da face, celulites, abscessos e outras de fundamental importncia visando ao

isolamento do H. influenzae bem como a sua identificao, incluindo a determinao do tipo

sorolgico. Essas bactrias so oxidase positiva, porm a reao da catalase varivel.

Possuindo um sistema enzimtico inadequado para crescimento em meios de cultura no-

enriquecidos, torna-se necessria a adio de nutrientes especiais como a nicotinamida

adenina dinucleotdeo (NAD) e/ou a hematina, chamados de fator V e fator X,

respectivamente, os quais esto presentes no sangue de alguns mamferos. A exigncia destes

fatores serve para definir o gnero Haemophilus e tambm distinguir as diferentes espcies do

gnero.

Os meios de cultura convencionalmente utilizados em Bacteriologia, na sua maioria,

utilizam o sangue de carneiro para confeco do clssico gar sangue. Como a maioria das

espcies do gnero Haemophilus necessita dos fatores V e X, que esto nas hemcias

utilizadas, no indicado o uso do sangue desse animal. Isso porque o fator V, requerido para

o crescimento inativado em um processo natural de lise, pela enzima NADase que liberada

das prprias clulas durante o armazenamento. Em contraste, o sangue de coelhos e cavalos

no libera NADase. Desta forma os meios de cultura ideais devem se constitudos de uma

base de nutrientes, esterilizada e posteriormente resfriada 80C, adicionando-se ento o

sangue de um desses animais. O aspecto do meio de cultura torna-se escurecido sendo por isso

chamado de gar chocolate favorecendo o crescimento da maioria das espcies de

Haemophilus. Certamente este um dos pontos limitantes para o isolamento destas bactrias

em material clnico suspeito e, muitas vezes, com quadro clnico sugestivo, de infeco por

Haemophilus (KILLIAN & BIBERSTEIN, 1984; LIPUMA, RICHMAN & TERRENCE,

1990; CAMPOS, 1999). Alguns microrganismos, incluindo espcies de Staphylococcus,

Neisseria e certas espcies de fungos podem sintetizar NAD ou fator V. Quando esses

microrganismos esto presentes nas culturas mistas, espcies de Haemophilus, que requerem o

fator V podem aparecer como pequenas colnias, na rea de produo do NAD, prxima da

colnia da bactria produtora. Este fenmeno chama-se de satelitismo, podendo desta forma

colaborar na identificao desses microrganismos (KONEMAN et al., 1989; CAMPOS, 1999).



12

1.5.2 - Sorotipagem

Todos os isolados de H.influenzae devem ser sorotipados. Este procedimento deve ser

solicitado especialmente tratando-se de pacientes menores de 15 anos, faixa etria na qual est

sendo freqente o aparecimento de infeco pelo H. influenzae aps a introduo da vacinao

de rotina contra o Hib. Este ensaio determina se um isolado do tipo b, portanto, de

fundamental importncia considerando-se a especificidade da vacina. A sorotipagem

usualmente feita pelos Laboratrios Centrais Estaduais de Sade Pblica (LACEN). Outros

laboratrios podem tambm realiz-la com anti-soros disponveis no mercado (Marcas Difco,

BBL, Oxoid).

A deteco do antgeno deve sempre ser feita, porm apresenta dificuldades em relao

aos resultados, sobretudo quando o paciente j est em uso de antimicrobianos e o

microrganismo podendo no estar vivel nas culturas. Entre os mtodos indicados,

destacam-se (LIPUMA et al., 1990; CAMPOS, 1999):

a) Aglutinao em ltex: rpido, sensvel, especfico para deteco do antgeno capsular do

Hib no lquor, soro, urina, fludo pleural e fludo de articulaes. H disponibilidade no

mercado de Kits para este ensaio. Alm disso, permite o diagnstico diferencial com outras

bactrias como Neisseria meningitidis (menos sorogrupo W135), Streptococcus pneumoniae,

Streptococcus grupo B e Escherichia coli K1.b) Contraimunoeletroforese (CIE): similar a aglutinao em ltex, porm um mtodo menos

sensvel, mais demorado e exige equipamento especfico.

c) Identificao molecular pela PCR: uma reao mais rpida e sensvel por ser capaz de

detectar a presena de fragmentos de DNA da bactria mesmo na ausncia do crescimento

bacteriano em cultura. Pode ser realizada diretamente do fludo biolgico suspeito ganhando-

se tempo. A desvantagem o custo do equipamento e os reagentes especficos, porm o

investimento inicial pode compensar a rapidez do diagnstico.



13

1.6 - CARACTERIZAO MOLECULAR DO H. influenzae: IDENTIFICAO E

TIPAGEM

de extrema necessidade que se tenha um mtodo de tipagem capsular eficaz para a

caracterizao das cepas de H. influenzae, principalmente as do tipo b, neste perodo de ps-

vacinao com a vacina conjugada contra o Hib. Portanto, sorologicamente, as cepas de H.

influenzae podem ser visualizadas como capsuladas (a-f) e no capsuladas (NC), onde se

inclui as b- genotipo capsular. A incidncia de infeces invasivas por Hi com cepas mutantes,

deficientes de cpsula do tipo b (cepas b-) tem sido relatada. Na era das vacinas conjugadas

este tipo de H. influenzae particularmente importante, porque poder ser considerado como

uma das causas de falha vacinal. Podem-se ter situaes em que cepas do tipo b perdem

temporariamente a cpsula, porm so capazes de recuper-la ao invadir o organismo. O papel

das cepas b- no perodo ps-vacinal no est claro. Quando so detectadas associadamente a

uma infeco invasiva, elas podem ser classificadas como resultado de falha vacinal.

Entretanto, quando aparecem em portadores, considera-se uma fonte significante de cepas NC

invasivas (FALLA et al., 1994). Assim, cepas mutantes no encapsuladas de H. influenzae

tm sido reportadas em diferentes estudos como variantes desse microrganismo podendo

reverter para a forma capsulada. Portanto, deve ser visto com cautela a possibilidade da

doena com o Hib invasivo em vacinado pois este poder ter sido um Hib que sofreu mutao

em um individuo previamente imunizado contra o Hib. Nesta situao o uso de um mtodo

eficaz de tipagem importante para detectar e determinar a origem da doena causada por

estas cepas. Por conseguinte, as cepas mutantes b- podem ser confundidas com cepas NC

pelos mtodos sorolgicos tradicionais (LUONG et al., 2004).

A classificao tradicional das cepas de H. influenzae pela determinao do biotipo e do

sorotipo, ou seja, pelas variaes fenotpicas no fornece informaes sobre sua origem

clonal. Para isso necessria a avaliao de variaes no genoma do H. influenzae atravs de

tcnicas de biologia molecular.

Muitos autores descreveram a existncia de seqncias genmicas repetidas em

diversas bactrias e sua utilizao para determinar a relao gentica entre diferentes cepas

da mesma espcie. Um tipo de seqncia repetida foi inicialmente descrito em espcies

pertencentes s famlias Enterobacteriaceae e Vibrionaceae e foi chamada de ERIC

(Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus) (VERSALOVIC, KOEUTH. & LUPSKI,



14

1991; DE BRUIJN, 1992; VERSALOVIC et al., 1994; VAN BELKUM et al.,1998). Baseia-

se, portanto, no pareamento de iniciadores com seqncias repetitivas, distribudas no

genoma. Neste caso, os iniciadores ou primers promovem amplificao do DNA presente

entre duas seqncias ERIC prximas. Essas seqncias no codificantes se repetem ao longo

do genoma em intervalos de tamanhos diferentes, sendo as mesmas repetidas como ponto para

o anelamento dos "primers" ou iniciadores. Muitos estudos reportam a utilizao da tipagem

molecular para determinar a variabilidade gentica em cepas de H. influenzae utilizando a

tcnica da ERIC-PCR (GMEZ-DE- LEON et al., 2000; PETTIGGREW et al., 2002).

1.7- PROFILAXIA: A VACINA

Os primeiros trabalhos com polissacardeos como antgenos e imungenos partiram da

utilizao da cpsula do Streptococcus pneumoniae. Na era pr-antibitico, a pneumonia pelo

pneumococo foi a doena mais freqente e a que mais causou mortes. Em 1923, Heidelberger

& Avery demostraram que polissacardeos eram o antgeno-tipo para imunizao. Em 1929,

os trabalhos de Avery & Goebel mostraram que os polissacardeos do pneumococo, quando

quimicamente conjugados a protenas, aumentavam a imunogenicidade bem como as

respostas de reforo. Em 1945, foi demonstrado que os polissacardeos purificados de

pneumococo, se utilizados como vacina parenteral, poderiam prevenir a pneumonia por

pneumococo.

As vacinas bacterianas tradicionais so feitas com clulas inteiras ou mortas de

bactrias como a do Bacilo Calmette-Gurin (BCG) ou a Bordetella pertussis, e toxides

(toxinas bacterianas quimicamente inativadas) como as vacinas contra ttano e difteria.

Expectativas de grandes descobertas e avanos tecnolgicos foram ampliadas com a

possibilidade de vacinas conjugadas. Estas incluem veculos proticos, mais imunognicos,

acoplados a polissacardeos especficos formando o terceiro grupo de vacinas bacterianas. As

tradicionais, no entanto, so produzidas em alta escala e a custo no elevado tendo sua

produo difundida em todo o mundo, enquanto as conjugadas ainda so restritas a poucos

pelo alto custo tecnolgico. O custo por dose de US$ 2.50 (trs doses US$ 7.50), o que

compensa grandemente visto que o custo de um paciente com meningite por Hib pode variar

de US$ 1000 a 10.000 para livr-lo da morte, em casos extremos (RUSSELL et al., 2003) ou

como j mencionado nesse trabalho, minimizar as seqelas, muitas vezes graves, deixadas

com essa doena.



15

O desenvolvimento das vacinas polissacardicas conjugadas foi um marco na produo

de imunobiolgicos aps a disponibilidade da clssica trplice bacteriana (contra a difteria,

ttano e coqueluche /DTP). Neste novo grupo, a primeira vacina conjugada apresentada foi

contra o Haemophilus influenzae tipo b (Hib), destinada a prevenir, principalmente, a

meningite por Hib. Previu-se, ento, que o sucesso desse imungeno traria novas vacinas

conjugadas de polissacardeos contra doenas causadas por outras bactrias patognicas, como

Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Pseudomonas aeruginosa (POOLMAN,

1990).

A primeira vacina disponvel para preveno de doenas provocadas por Haemophilus

influenzae tipo b foi desenvolvida no incio dos anos 70, composta basicamente de cpsula

polissacardica purificada de Hib (RODRIGUES et al., 1971; ANDERSON et al., 1972;

ADAMS et al., 1993). O polissacardeo purificado demonstrou uma eficincia satisfatria em

crianas acima de 18 meses (GRANOFF & CATES, 1985; WHO, 1991; MMWR, 1991;

ADAMS et al., 1993). Estudos realizados na Finlndia, a partir de 1974, demonstraram a

capacidade imunognica da vacina constituda pelo polissacardeo capsular do Haemophilus

influenzae, o polirribosil-ribitol-fosfato ou PRP (MKEL et al., 1977, 1988; PELTOLA et

al, 1977, 1984). Os autores concluram que o PRP era capaz de conferir proteo a 90% das

crianas vacinadas com 18 a 71 meses de idade contra todas as formas de doena invasivas

causada por H. influenzae tipo b. Observaram tambm que a vacina no conferia imunidade a

crianas menores e que a resposta imunognica tornava-se mais intensa e duradoura com o

aumento da idade, passando a ser semelhante entre adultos e crianas a partir do sexto ano de

vida. A persistncia de nvel protetor de anticorpos, nos vacinados entre 18 e 35 meses de

idade, variou de um ano e meio a trs anos e meio. A eficcia protetora dessa vacina, em 90%

das crianas entre 24 e 59 meses de idade, foi tambm comprovada (HARRISON, BROOME

& HIGHTOWER, 1989). Em outros estudos realizados nos EUA, a vacina utilizando o PRP

sozinho protegeu 41 a 88% das crianas estudadas com idade igual ou superior a 18

meses.(MMWR, 1991).



16

1.8 - MECANISMO IMUNE ENVOLVIDO

A resposta imunitria ao polissacardeo desenvolve-se pela presena do antgeno e

ativao do linfcito B, sem interveno dos linfcitos T. Isto provoca uma resposta primria

do tipo IgM, sem grande amplitude e que no permite estimular a memria imunitria

duradoura.

O PRP, como todo polissacardeo, um antgeno timo-independente. At a idade de 18

meses os linfcitos B do lactente se encontram em estado de maturao, insuficiente para

permitirem resposta sem ajuda do linfcito T. Foi necessrio acoplar ao PRP uma protena

carreadora para se obter uma resposta timo dependente, eficaz em crianas com idade abaixo

dos 18 meses. Desta forma, a resposta imunitria passa ento pela estimulao dos linfcitos

T, que ativam os linfcitos B por intermdio de fatores solveis. Isto permite uma produo

precoce, a partir do segundo ms, de anticorpos anti-PRP nos quais a IgG predomina, e doses

subseqentes estimulam a memria imunitria. esta a base da vacinao atual.

Em 1980, a partir deste conhecimento, Schneerson e colaboradores fizeram

modificaes que tornaram o polissacardeo de Haemophilus influenzae tipo b mais

imunognico, ligando-o quimicamente a uma protena carreadora. A vacina constituda por

este composto foi testada em crianas de diferentes faixas etrias e o resultado foi bastante

satisfatrio para crianas menores de 18 meses.

Em 1987, a vacina PRP foi substituda, nos EUA, por vacinas conjugadas mais eficazes

dotadas de capacidade imunognica em crianas menores (AMERICAN ACADEMY OF

PEDIATRICS, 1988, 1989, 1990; MMWR, 1988, 1991).

1.9 - TIPOS DE VACINA

Atualmente, quatro tipos de vacinas conjugadas contra Hib so licenciadas para

crianas a partir de seis semanas, adotando-se, de regra, o critrio da primeira dose com 2

meses de idade . Todas elas utilizam o mesmo princpio imunognico variando apenas quanto

ao tipo de carreador protico, como sintetizamos a seguir no quadro 2:



17

QUADRO 2 - Tipos de vacina conjugada contra o H. influenzae tipo b (Hib)

Vacina Protena Carreadora Produtor

PRP-D toxide diftrico Connaught Labs.

HbOC protena de mutante Lederle/Praxis

de C. dipheteriae

PRP-T toxide tetnico Pasteur Merieux

SmithKline

Bio-Manguinhos

PRP-OMP protena de membrana externa

de N. meningitidis B Merck S. Dhome

a) PRP-D: o PRP conjugado com o toxde diftrico.

b) HbOC: utiliza oligossacardeos da cpsula (segmentos curtos de PRP) so conjugados com

a protena de uma cepa mutante de Corynebacterium diphtheriae, a CRM 197.

c) PRP-T: possui o PRP conjugado com o toxide tetnico.

d) PRP OMP: neste tipo o PRP est conjugado com as protenas da membrana externa do

meningococo do grupo B.

Adaptado de WHO (1991)



18

1.10 - EPIDEMIOLOGIA

Antes da implementao de vacinas conjugadas contra H. influenzae tipo b nos Estados

Unidos ao final da dcada de 1980, o ndice anual de incidncia de infeces causadas por esta

bactria estava na faixa de 67 a 129 casos / 100.000 crianas de at 5 anos de idade, sendo que

50% dos casos ocorriam em crianas com idade inferior a 2 anos. Com a generalizao do uso

das vacinas conjugadas para Hib nos pases industrializados, as infeces clssicas invasoras

produzidas por este microrganismo tm diminudo drasticamente (LPEZ et al., 2000).

Aps o incio da vacinao em 1988, houve um declnio de 80 a 85% dos casos totais de

meningite por H. influenzae tipo b em crianas, no somente nos EUA, mas tambm em

pases da Europa (ADAMS et al., 1993; BROADHURST et al., 1993; MURPHU et al., 1993;

BARQUET et al., 1996; MENDELMAN et al., 1997). Em 1998, Foxwell e colaboradores, em

uma avaliao da vacinao iniciada nos Estados Unidos e na Europa, descreveram e

reforaram os esforos empreendidos para o desenvolvimento da vacina conjugada contra o

Hib mostrando sua eficcia, mas consideraram tambm que o foco nesta rea da sade

humana tem revelado uma mudana para os H. influenzae no tipveis (HiNT), explicado pelo

fato da vacina conjugada anti-Hib, ao agir diretamente contra a cpsula do polissacardeo tipo

especfico, no tem, portanto, capacidade de prevenir infeces causadas pelos HiNT, bem

como pelos outros tipos capsulares.

De fato, com a reduo das doenas invasivas na Europa e Estados Unidos pelo

decrscimo do Hib, os problemas de Sade Pblica apontam para a observao dos outros

tipos capsulares (a,c e f) e das cepas no capsuladas (GMEZ-DE-LEON et al., 2000).

Estudos recentes realizados no Reino Unido e Repblica da Irlanda (HEATH et al.,

2001) mostraram que, com o declnio das doenas causadas pelo Haemophilus influenzae tipo

b devido a ampla utilizao das vacinas conjugadas, o Haemophilus influenzae no b (Hinb)

aparece em muitos processos infecciosos como agente principal, o que poder torn-lo a mais

importante causa da doena por Haemophilus influenzae. Os H. influenzae no b constituem,

atualmente, um campo de investigaes em diversas regies do mundo.



19

Nas crianas vacinadas com a vacina conjugada contra o Hib, os Hi no b podero ser

expressivos agentes infecciosos de doena (HEATH et al., 2001). Reforando este

pensamento, Adderson et al., 2001 consideram que, com a drstica diminuio e a hipottica

eliminao do Haemophilus influenzae tipo b, outros sorotipos podem adquirir forte virulncia

e emergir como importantes patgenos em crianas (REIS et al., 2002; DE ALMEIDA et al.,

2005), como foi mostrado na figura 3.

Em pases desenvolvidos, onde o uso da vacina conjugada contra o Hib teve eficcia

de 95-98% e os sistemas de vigilncia epidemiolgica so ativos e rastreadores facilitando o

inicio imediato das aes necessrias para o controle da situao, tm-se relatado casos por

HiNT (FALLA et al., 1993).

J nos pases pobres ou em desenvolvimento os sistemas de sade existentes so

muitas vezes limitados nas aes pertinentes para a situao emergencial requerida. Ali,

muitos recm-nascidos prematuros, com tempo de gestao de 28-30 semanas, nascem com

complicaes respiratrias, e dificilmente sobrevivem, tendo-se em 90% desses bitos o

isolamento do HiNT em hemoculturas (FRIESEN, C. A & CHO C. T., 1986; GARCIA et al.,

1985). Estudos recentes em Israel relataram, pela primeira vez, 9 casos de recm-nascidos

prematuros, que desenvolveram septicemia e pneumonia tendo em 8 deles o isolamento do

HiNT e um Hid no perodo de 2000 a 2004 (HERSHCKOWITZ et al., 2004).

Pequisas realizadas (GRANOFF & CATES, 1985; BIJLMER, 1991; JENNINGS &

PON, 1991; MMWR,1991; WHO, 1991; ADAMS et al., 1993; IWARSON, 1993;

BARQUET et al., 1996; MURPHY, 2003) reforam claramente que as infeces do trato

respiratrio associadas aos HiNT ainda so freqentes, como na dcada de 80, em muitos

pases em desenvolvimento ou no industrializados como uma das maiores causas de

morbidade e mortalidade, ou ambas, em crianas, onde o Hib j alcanou at 30% de

letalidade como citado anteriormente (item 1.1).

Em nosso pas onde a vacinao s teve incio, na segunda metade de 1999, atingindo

ento a maioria dos municpios, seu impacto na diminuio dos casos de meningite por Hib

conhecido parcialmente, havendo carncias de publicaes. Dados do CDI/ CENEPI/ FNS,

atualizados em 11/02/03, mostram que em 1999 foram notificados 1616 casos, enquanto 2003

houve 111 casos confirmados de meningite por H. influenzae tipo b, uma reduo de 93,3%

em relao a 1999, ano do inicio da vacinao no Brasil.



20

A figura 5 ilustra a estrutura da vacina brasileira cuja frao imunognica o PRP-T.

.

A apresentao desse imunobiolgico na forma de lofilo, facilitou sua combinao

vacina DTP (Difteria, Ttano e Pertussis) que, por sua vez, sendo apresentada na forma

lquida, funcionou tambm como diluente. Constituiu-se assim a vacina tetravalente que

permite reduzir o nmero de injees, evaso de retorno para doses subseqentes e custos por

utilizar apenas uma seringa. Ambos os produtos, PRP-T e DPT, so produzidos no Brasil

pelos Institutos Bio-Manguinhos / FIOCRUZ e Butantan, respectivamente. O esquema de

vacinao atualmente utilizado no pas pelo PNI/MS, apresentado no quadro 3.

Toxide tetnico

Ponte de ligao covalente

PRP

ESTRUTURA DA VACINA PRP-T

FIGURA 5 - Estrutura da vacina conjugada contra o H. influenzae tipo b (Hib).Composta de polissacardeo capsular poliribosil-ribitol-fosfato (PRP) purificado de Hib,covalentemente ligado ao toxide tetnico.



21

QUADRO 3 - Calendrio Bsico de Vacinao contra o H. influenzae tipo b (Hib)-PNI/MS

IDADE VACINAS DOSES DOENAS EVITADAS

2 meses Vacina Tetravalente(DTP + Hib)

1 DoseDifteria, ttano, coqueluche,meningite e outras infecescausadas pelo H. influenzae

tipo b.


2 Dose idem


3 Dose idem

12 a 23 mesescom esquemaincompleto eno vacinados

Hib 1 doseMeningite e outras

infeces causadas peloH. influenzae tipo b.

Como existem diferentes esquemas vacinais, utilizando trs ou quatro doses, o Ministrio

da Sade optou pelo esquema de trs doses no primeiro ano de vida, dispensando o reforo

aos quinze meses. Crianas de 12 a 23 meses que no completaram o esquema de trs

doses ou no se vacinaram no primeiro ano de vida, devero fazer apenas uma dose. Se a

imunizao primria for feita com vacina conjugada com protena da membrana externa

da N. meningitidis B (PRP-OMP), recomenda-se aplicao de somente duas doses no

primeiro ano de vida, sendo necessrio o reforo (Capacitao de Pessoal em Sala de

Vacinao Manual do Monitor-FUNASA, 2001; ANFARMAG, 2005). Alguns pases

como os da pennsula Escandinvia, onde se deu incio a vacinao contra o Hib houve

uma reduo da incidncia da meningite pelo Hib em quase 100%. Na Dinamarca,



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segundo Hviid & Melbye (2004), a eficcia com 3 doses foi de 99,29%. Na Finlndia o

uso de 3 doses, iniciado desde 1988, at hoje utilizado com sucesso (4, 6 e 14 18

meses), embora trs casos de meningite por Hib em vacinados tenham sido descritos nos

ltimos dez anos, um em 1995, de uma menina de 6 anos de idade, vacinada com as trs

doses de PRP-D; um em 1999, um menino de 4 anos de idade, vacinado com trs doses de

HbOC; e um em 2000, um menino de 4 meses de idade, este vacinado somente com uma

dose da vacina HbOC. Outros trs casos de meningites, porm, por Hi no b, foram

encontrados nesse perodo: dois pelo Hif e um pelo HiNT, de pacientes sem problemas

imunolgicos (PELTOLA, SALO & SEXN, 2005). Anteriormente, Campos Marques &

Aracil Garcia (2003) j relatavam o aparecimento de falhas vacinais na Europa, sobretudo

aps o uso das vacinas combinadas. O Reino Unido passou a administrar uma dose de

reforo, em 2003, recomendada a todas as crianas de 6 meses a 4 anos; ali so usadas

rotineiramente vacinas combinadas de Hib com: poliovrus inativado (IPV), trplice

bacteriana tradicional, a clula inteira da B. pertussis (DTP), DTP com o componente

pertussis acelular e com a anti-hepatite B. A Holanda que no faz uso da DTP com o

componente acelular e sim a DTP tradicional combinada com a vacina contra o Hib,

tambm teve casos de falha vacinal. O significado clnico ainda no foi esclarecido. A

Espanha que usa Hib+DTP acelular adotou uma dose de reforo da vacina conjugada

contra o Hib aos 18 meses. Dessa forma os autores concluram que o uso da dose de

reforo tornou-se importante quando se observou o declnio de anticorpos especficos

(anti-PRP). Este cenrio nos leva a prever estudos futuros da permanncia dos anticorpos

em nveis protetores, j que em nosso pas, desde 2002, utilizada pelo PNI/MS no

calendrio de vacinao, a vacina combinada Hib+DTP, como citada anteriormente.



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2 OBJETIVOS

2.1- OBJETIVO GERAL

Ampliar os conhecimentos epidemiolgicos sobre o Haemophilus influenzae tipo b

(Hib) e o no b (Hinb), atravs da caracterizao de cepas isoladas de material clnico por

marcadores fenotpicos e moleculares, visando ao monitoramento das cepas circulantes em

diferentes reas geogrficas e deteco de possveis clones relacionados filogeneticamente,

em perodos pr e ps - vacinao contra Hib no Brasil.

2.2 - OBJETIVOS ESPECFICOS

Caracterizao dos sorotipos e biotipos de isolados clnicos de Haemophilus influenzae por

metodologias sorolgicas e bioqumicas (Manuscrito 1).

Avaliao da sensibilidade aos antimicrobianos utilizados no tratamento de infeces por

Haemophilus influenzae, bem como a deteco de cepas produtoras de -lactamase

(Manuscrito 2).

Determinao da variao gentica pela tcnica "Enterobacterial Repetitive Intergenic

Consensus (ERIC-PCR)" e observao da relao gentica entre as diferentes cepas da espcie

H. influenzae utilizadas (Manuscrito 3).

Caracterizao e tipagem molecular por amplificao dos genes da regio capsular cap das

cepas isoladas de H. influenzae (Manuscrito 3).



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3 - RESULTADOS

Optamos por apresentar os resultados obtidos nessa tese no formato de coletnea de

artigos cientficos, com a apresentao de trs manuscritos. O primeiro publicado em maio de

2005 (Manuscrito1), o segundo recentemente (Manuscrito 2) e o terceiro j submetido

(Manuscrito 3).



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3.1 - MANUSCRITO 1 Occurrence of Haemophilus influenzae strains in three Brazilianstates since the introduction of a conjugate Haemophilus influenzae type b vaccine(publicado em Brazilian Journal of Medical Biological Research, 38 (5):777-781, 2005).



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3.2- MANUSCRITO 2 Antimicrobial susceptibility of Haemophilus influenzae isolatescollected from four centers in Brazil (1990-2003).(publicado em DiagnosticMicrobiology and Infectious Disease, 54 (1):57-62, 2006).



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3.3 - MANUSCRITO 3 Molecular and phenotypic characterization of Haemophilusinfluenzae strains isolated from Brazilian patients before and after vaccination againstHaemophilus influenzae type b (Hib). (submetido para publicao na Journal ofMedical Microbiology em setembro de 2005).



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4 - DISCUSSO

O Instituto Nacional de Controle da Qualidade em Sade (INCQS), pertencente

Fundao Oswaldo Cruz - FIOCRUZ no Rio de Janeiro RJ, tem como misso contribuir

para a promoo e recuperao da sade e preveno de doenas atuando como referncia

nacional para as questes cientficas e tecnolgicas relativas ao controle da qualidade de

produtos, ambientes e servios vinculados Vigilncia Sanitria.

Assim, se justifica possuir colees de microrganismos de referncia a serem utilizadas

nos ensaios oficiais. Neste sentido, a partir de 1990 criou-se uma nova coleo de isolados

bacterianos de processos infecciosos humanos por Haemophilus, considerando-se o interesse

em projetos de pesquisa de relevncia ou programas de monitoramento de diagnstico e

controle para a sade pblica, na rea da Microbiologia.

A iniciativa do INCQS de obteno de isolados de casos clnicos com suspeita de

meningites bacterianas, comeou no perodo de 1989-1990 quando foram implementadas

campanhas de vacinao com a vacina produzida em Cuba, em So Paulo e Rio de Janeiro,

visando o controle da meningite causada pela N. meningitidis sorogrupo B, que j apresentava

uma taxa de ocorrncia elevada na populao (DE FILIPPIS, 2005). A partir de ento passou-

se a preservar as cepas isoladas, iniciando-se com aquelas procedentes do estado do Rio de

Janeiro, atravs do Instituto Estadual de Infectologia So Sebastio (IESS)/ SES. Este

integrava, juntamente com o INCQS e outros participantes, o grupo tcnico de Meningites do

Rio de Janeiro - RJ. Observou-se desde a que, uma parte considervel dos isolados clnicos

enviados ao INCQS era de Haemophilus influenzae b (Hib). Ao mesmo tempo,

acompanhvamos a persistncia ou o avano das meningites bacterianas em todo o mundo,

inclusive a causada pelo Hib em nosso pas, conforme mostrado no grfico1. A partir de 2003,

constatava-se o sucesso da primeira vacina conjugada contra o Hib, aplicada na populao

brasileira desde 1999, apesar de disponvel em outros pases desde 1988, capaz de proteger

crianas menores de 2 anos, como se observava na Finlndia e nos EUA, e a seguir na

Dinamarca, Reino Unido e Canad (HVIID & MELBYE, 2004; McVERNON et al., 2004;

PELTOLA, SALO & SEXN, 2005; SCHEIFELE et al., 2005).



GRFICO 1 - MENINGITE P/ HAEMOPHILUS Srie histrica de casos e bitos.Brasil, 1980 2003.

Fonte: COVER / SINAN / DEVEP / SVS / MSDados atualizados em 11/02/04



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Esse fato fez com que o PNI/MS se decidisse por sua incluso no calendrio das

vacinas infantis. Preocupava-nos o fato de que, no Brasil, raras pesquisas haviam sido

publicadas sobre o H. influenzae b (ou outros sorotipos) seja como agente de meningite ou de

outros quadros clnicos. A necessidade de possveis anlises desses aspectos nos motivou a

realizar o presente estudo dentro dos objetivos considerados nesse projeto.

A proposta inicial, mais abrangente, envolvia todas as regies brasileiras, pela incluso

de cepas de H. influenzae de pelo menos um estado de cada regio. Pretendia tambm

estabelecer correlao entre as cepas isoladas e os aspectos clnicos da infeco incluindo

forma clnica, resposta teraputica, letalidade e histria vacinal dos pacientes. Entretanto, a

heterogeneidade no preenchimento das fichas obtidas trazendo informaes muitas vezes

incompletas, levaria a uma reduo da incluso de casos e, portanto, de isolados, que porm

poderiam ser aproveitados sob outros aspectos considerados no estudo. Contudo, as anlises

no realizadas nesta oportunidade, devero ser feitas posteriormente, com a continuao dessa

linha de pesquisa.

Como o Instituto Adolpho Lutz de S. Paulo-SP (IAL-SP) inclui o Centro Nacional de

Meningites, planejamos inicialmente a realizao da pesquisa em parceria. Porm (em que

pese a concordncia da Diretoria, o envio do projeto e a visita pessoal para acertos entre as

partes envolvidas), no obtivemos colaborao, o que foi ento justificado por estar sendo ali

desenvolvido projeto semelhante ao proposto. Diante disso, admitimos que uma possvel

dupla abordagem poderia ser interessante para comparao. Assim, optamos por desenvolver

nosso estudo com as cepas que dispnhamos, procedentes das trs maiores regies

populacionais do Brasil, Sul, Sudeste e Nordeste, atravs dos estados de Santa Catarina, Rio

de Janeiro e Pernambuco, respectivamente, os quais, por vnculos prvios, nos enviavam

cepas desde o perodo pr-vacinao contra o Hib.

Justamente a regio norte ficou sem material representativo em nosso projeto, com

folha de aprovaÇÃo - arca: home · ... que realmente a vida tem valor e que você tem valor...

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