UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE – ICS

DEPARTAMENTO DE BIOINTERAÇÃODISCIPLINA: IMUNOLOGIA I – ICS 045

Trabalho realizado pela Acadêmica de Ciências Biológicas da UCSal Paula Braga Daltro sob orientação dos Professores Robert Schaer, Roberto Meyer, Claudia

Brodskyn e Ricardo Portela. Atualizado em Fevereiro de 2010.

FIXAÇÃO DO COMPLEMENTO

CARACTERÍSTICAS BÁSICAS

CARACTERÍSTICAS BÁSICAS

• O teste de fixação do complemento (FC) é um método sorológico usado

para determinar a presença ou semi-quantificar anticorpos (Ac) ou

antígenos (Ag) (Inibição da Fixação do Complemento) em uma amostra,

utilizando a ação do Sistema do Complemento.

• O sistema complemento é um conjunto de proteínas séricas que tem por

função ajudar na eliminação de microorganismos invasores. Este sistema

funciona em cascata e possui três vias. O teste de fixação do complemento

tem como base a via clássica, onde o complemento liga-se ao sítio ativo

formado pelo complexo antígeno-anticorpo.

• O complexo Ag-Ac: Quando moléculas de anticorpos ligam-se ao antígeno,

os sítios ativos da região Fc tornam-se disponíveis para a ligação do

complemento.

CARACTERÍSTICAS BÁSICAS

o FUNDAMENTOS:

• A ativação do sistema complemento por anticorpos ligados a

antígenos resulta na formação de complexos de ataque a

membrana que podem romper a membrana celular. Se o

anticorpo é ligado a antígenos adsorvidos nas hemácias, estas

são destruídas e ocorre hemólise.

• Pode ser um teste qualitativo ou semi-quantitativo, quando é

então realizada uma diluição seriada da amostra, observando-se

a máxima diluição onde ocorre reação positiva.

CARACTERÍSTICAS BÁSICASo CURIOSIDADES SOBRE O SISTEMA COMPLEMENTO PARA MELHOR

COMPREENSÃO DO ENSAIO:

• Função: ligar covalentemente a moléculas específicas na superfície

de microorganismos invasores, ou em complexos Ag-Ac.

• Objetivo: induzir desequilíbrio osmótico e/ou apoptose em

microorganismos invasores ou células tumorais.

• Componentes : formado por um grupo de proteínas séricas

numericamente denominadas, e na sua maioria produzidas pelo

fígado.

CARACTERÍSTICAS BÁSICASo CURIOSIDADES SOBRE O SISTEMA COMPLEMENTO PARA MELHOR

COMPREENSÃO DO ENSAIO:

• Complexo de ataque a

membrana: Ao unir-se à

membrana microbiana ou ao

complexo Ac-Ag, o complemento

forma um canal transmembrânico

de forma anelar, causando uma

lise osmótica, induzindo apoptose

e, conseqüentemente, a morte da

célula.

Complexo de ataque à membrana

Bicamada fosfolipídicaCitoplasma

Influxo de fluidos

CARACTERÍSTICAS BÁSICAS

o ELEMENTOS NECESSÁRIOS PARA A REALIZAÇÃO:

• Soro teste

• Sistema Complemento

• Sistema hemolítico (hemácias recobertas com antígenos)

• Estufa para incubação

• Centrífuga

• Antígeno purificado (na Inibição da Fixação do Complemento)

CARACTERÍSTICAS BÁSICASo ELEMENTOS NECESSÁRIOS PARA A REALIZAÇÃO:

Estufa incubadora

Centrífugas de microtubos

Microtubos

CARACTERÍSTICAS BÁSICAS

o VANTAGENS:

• Baixo custo.

• Boa especificidade.

• Boa sensibilidade.

o DESVANTAGENS:

• Probabilidades para falso-negativos devido a:

• Perda da atividade do complemento.

• Diluições inadequadas.

• Contaminação em soluções (gerando efeito

anticomplementar).

• Sensibilização insuficiente de hemácias.

• Probabilidades para falso-positivos devido a:

• Hemácias fragilizadas (velhas).

• Soro não-inativado.

• Baixa especificidade (dependendo do

antígeno adsorvido na hemácia).

CARACTERÍSTICAS BÁSICAS

• Além do teste de fixação do complemento, também

existe o teste de inibição da fixação do complemento,

o qual tem por objetivo detectar e semi-quantificar

Ags específicos em uma amostra.

FIXAÇÃO DO COMPLEMENTO

Y

1) O soro do paciente é incubado para a inativação do complemento provavelmente existente, para não causar interferência no teste.

3) O complemento é inserido para identificar a presença ou não do complexo Ag/Ac. Em caso positivo, as proteínas do sistema complemento se ligarão à porção Fc dos Acs, iniciando uma cascata de reações que culminará com a lise das hemácias, liberando hemogoblina.

4) Após centrifugação, o que se observa é uma solução vermelho-amarronzada homogênea, devido a liberação de hemoglobina das hemácias.

2) O soro inativado é incubado com hemácias (ou outras células) que contêm o Ag específico para os Acs pesquisados adsorvido em sua membrana. O Ac pesquisado, caso presente na amostra, se ligará ao Ag da superfície das células.

FIXAÇÃO DO COMPLEMENTO

Y

Y

Y

Sistema Complemento

Ac do soro

Sistema Hemolítico (hemácias recobertas com Ag específico)

FIXAÇÃO DO COMPLEMENTOo INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS: • No caso de não haver anticorpo específico para o

antígeno pesquisado, não ocorre hemólise e nem

liberação de material intracelular (hemoglobina) (teste

negativo). Portanto, após a centrifugação dos tubos,

será observada a presença de um precipitado

avermelhado no fundo dos mesmos, o qual

corresponde às hemácias não lisadas.

• No caso de encontrar o complexo Ag/Ac, o

complemento é ativado e leva a lise das hemácias, com

liberação de material intracelular (hemoglobina) (teste

positivo).

Resultado negativo

Resultado positivo

FIXAÇÃO DO COMPLEMENTO

Resultado Negativo Resultado Positivo

FIXAÇÃO DO COMPLEMENTO

INIBIÇÃO DA FIXAÇÃO DO COMPLEMENTO

Y

1) O soro do paciente é incubado para a inativação do complemento provavelmente existente, para não causar interferência no teste.

5) Portanto, após centrifugação, o que se observa é um precipitado avermelhado no fundo do tubo (resultado positivo).

2) O soro inativado é incubado com anticorpo monoclonal dirigido para o antígeno pesquisado. No caso de haver o antígeno pesquisado na amostra, os sítios de ligação do anticorpo monoclonal ficarão ocupados.

INIBIÇÃO DA FIXAÇÃO DO COMPLEMENTO

3) A solução de soro-Ac monoclonal é então incubada com Sistema Hemolítico e com o Sistema Complemento. Caso os Acs monoclonais estejam previamente ligados aos Ags da amostra, eles não se ligarão com os Ags na membrana da hemácia, não havendo hemólise e nem liberação de material intracelular (hemoglobina).

Y

Sistema Complemento

Ac monoclonal

Sistema Hemolítico (hemácias recobertas com Ag específico)

Ag do soro

Y

o INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS:

• No caso de não haver o antígeno pesquisado na amostra, o

anticorpo monoclonal ficará com seus sítios de ligação

livres, podendo se ligar ao antígeno adsorvido na

membrana das hemácias, ativando o complemento e

causando hemólise com liberação de material intracelular

(hemoglobina) (teste negativo).

• No caso de haver o antígeno pesquisado na amostra, os

sítios de ligação do anticorpo monoclonal ficarão ocupados,

o que inibirá a sua ligação com os antígenos na membrana

da hemácia, não havendo hemólise e nem liberação de

material intracelular (hemoglobina) (teste positivo).

INIBIÇÃO DA FIXAÇÃO DO COMPLEMENTO

Resultado negativo

Resultado positivo

REFERÊNCIAS

• Imunologia Veterinária 6ª ed. Tizard, Ian R. Editora

ROCA.

• Imunoensaios: Fundamentos e Aplicações. Vaz,

Adelaide J.; Takei, Kioko; Bueno, Ednéia C. Editora

Guanabara Koogan

• Imunologia Celular e Molecular 5ª ed. Abbas, Abul K.