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INTRODUÇÃO

Com cerca de 30 anos de idade,ocupando uma área aproximada de 30 milhectares, em quatro Estados da União(RS, SC, PR e SP) a pomicultura brasileirase depara com questões de sanidade domaterial propagativo muito similaresàquelas já enfrentadas pelos paísestradicionais produtores de maçãs.

Embora programas europeus e norte-americanos de limpeza clonal tenham sidoiniciados em meados dos anos 50, aindanos anos 80, a contaminação com vírus edoenças similares em pomares e viveirosde maçã podia chegar até 60% dos clonesamostrados. Isto dá uma idéia do caráter delonga duração de um programa até aeliminação total de vírus e similares e danecessidade de permanente monitoramento.

Assim, não surpreende que o materialpropagativo utilizado na implantação dosprimeiros pomares brasileiros estivessealtamente contaminado e que até mesmointroduções recentes dos Estados Unidos,da Europa e do Japão ainda contenhamvírus.

Os vírus são agentes patogênicos quese encontram, segundo definição consensual,além da fronteira que delimita e agrupa osseres vivos; afetam o desenvolvimento dasplantas, interferindo de forma parasítica nometabolismo vegetal.

Cerca de 30 doenças de macieiras sãocausadas por vírus, viróides e agentessimilares e, segundo a virulência do isoladoviral, a suscetibilidade do tecido afetado e

as condições ambientais, podem manifes-tar-se em folhas, flores, frutos, na casca ena madeira de troncos e em galhos estrutu-rais, ramos e raízes.

A título de simplificação daabordagem, far-se-á distinção entre doisgrupos de vírus em macieiras: aqueles queproduzem sintomas reconhecíveisvisualmente nas variedades comerciais eos chamados vírus latentes que exigem aindexagem (enxertia em plantas indica-doras lenhosas e inoculação mecânica emplantas herbáceas, e testes serológicos emoleculares) para sua detecção.No primeiro grupo incluem-se a depres-são-do-lenho (“Flat Limb”), ruga-verde(“Green crinkle”), rachadura-estrela (“Starcrack”) e o lenho-mole (“Apple rubberywood”), de natureza ainda desconhecida, ovírus-do-mosaico-da-macieira(“Applemosaic virus”, ApMV), e casca-áspera(“Apple rough skin”). Por não produziremsintomas visualmente perceptíveis namaioria das cultivares comerciais, os víruslatentes podem passar despercebidos e serpropagados indefinidamente. Incluem-seneste grupo: vírus-do-acanalamento-do-tronco-da-macieira (“Apple stem groovingvirus”, ASGV), vírus-das-caneluras-do-tronco-da-macieira” (“Apple stem pittingvirus”, ASPV), e o vírus da mancha cloróticada folha da macieira (“Apple chlorotic leafspotvirus”, ACLSV). Embora haja controversia,existem evidências experimentais de queo sintoma epinastia e declínio do Spy (Spyepinasty and decline, SED) possa ser causadopor ASPV, razão porque o mesmo, a título

12 DOENÇASCAUSADASPOR VÍRUS

Osmar Nickel

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de simplificação, é abordado neste contex-to, como sintoma de ASPV.

Há farta documentação científicasobre os efeitos negativos de vírus emmacieiras. Entre os danos causados porinfecções virais, destacam-se:

• Danos em mudas — redução dopegamento de enxertias de materialinfectado, vigor reduzido das mudas,cancros nos porta-enxertos sensíveis edeclínio da planta no viveiro ou após aimplantação do pomar.

• Redução de produção de frutas —pode variar de 16% a 84% segundo avariedade de maçã e do isolado viral ou damistura dos vírus.

• Redução no crescimento das plan-tas — redução do calibre dos frutos, dotamanho e do vigor das plantas, dodiâmetro do tronco, do comprimento dosramos laterais e da brotação.

• Aumento da suscetibilidade a infec-ções por fungos — plantas infectadas sãomais sensíveis à ocorrência de podridõesfoliares e radiculares, cancros e pragas oque torna necessário o aumento do uso deagrotóxicos.

• Redução da capacidade de aproveita-mento de fertilizantes — plantas livres devírus crescem satisfatoriamente com dosesmenores de fertilizantes, reduzindo oimpacto ambiental e o custo de produção.

• Redução da armazenabilidade dasfrutas.

• Aumento da sensibilidade a geadastardias pela indução de floração precocede plantas infectadas.

VÍRUS LATENTES

Vírus-da-mancha-clorótica-foliar-da-macieira (ACLSV)

O ACLSV é um vírus latenteamplamente difundido em macieiras emtodo o mundo; afeta também a pêra, Prunusspp., outras espécies de rosáceas frutíferas

e ornamentais além de espécies de outrosgêneros. Sua relevância econômica, emvirtude do elevado potencial de destruição,é grande, mas variável segundo a estirpeviral e a cultivar contaminada. Em média,a produção de plantas infectadas é reduzidaem cerca de 10% a 20%. Emboraconsiderado um vírus relativamente poucoimportante por causa da tolerânciaobservada nos principais porta-enxertoscomerciais, adquiriu destaque em algumasregiões pomicultoras brasileiras com oincremento significativo do uso do porta-enxerto Maruka-kaido, altamente sensível,resultando em declínio de plantas adultasem conseqüência de severas caneluras namadeira e necrose interna da casca doporta-enxerto (Fig.1). É comum observar-se depósitos de resíduos da casca necrosadanas caneluras.

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Fig. 1. Caneluras (C) na madeira e necroseinterna (N) da casca do porta-enxertoMaruba-kaido causadas por ACLSV. Notarque os sintomas não atingem a copa da cv.Fuji (São Joaquim, SC).

ACLSV transformou-se em problemaem razão do uso de porta-enxertos clonaisinfectados e, na ausência de matrizes livresde vírus, pela utilização indiscriminada deplantas de pomares, infectadas, não-indexadas, como matrizes de materialpropagativo (borbulheiras).

Levantamentos em Santa Catarina eno Rio Grande do Sul revelam que ACLSVocorre de forma latente com freqüêncianos porta-enxertos das séries M e MM.

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Vírus do acanalamento dotronco da macieira (ASGV)

ASGV ocorre em todas as regiões domundo onde se planta maçã. O vírus infectaum espectro considerável de hospedeiros,incluindo a maioria das variedades comerciaisde Malus domestica sem produzir nestas,reações perceptíveis visualmente. Estima-se que 75% do material proveniente doJapão contenha ASGV, que causa, em média,uma redução da produção de cerca de 15%.

No Brasil, ASGV foi diagnosticadoem 1997 em Santa Catarina como causa dedeclínio e morte generalizada de plantasde viveiro, nas cvs. Fuji, Royal Gala,Belgolden, Braeburn e outras, enxertadasno porta-enxerto sensível Maruba-kaido(M. prunifolia var. ringo), nas quais se obser-vam necrose (cancro) e destruição total dacasca do porta-enxerto (Fig.2), declínio emorte de mudas.

Alguns isolados de ASGV nãoproduzem sintomas em espécies de Malusnormalmente sensíveis. Na indicadoraVirginia Crab o ASGV produz uma clássicanecrose na união de enxertia e provoca oinchamento da base do ramo da indicadora(Fig. 3).

Vírus-das-caneluras-do-tronco-da-macieira(ASPV)

O vírus das caneluras do tronco damacieira ocorre em todas as regiõespomicultoras do mundo, freqüentementeem combinação com ACLSV e epinastia edeclínio do Spy 227. O vírus é latente namaioria das cultivares comerciais e nãocausa sintomas perceptíveis, exceto o efeitosobre crescimento e a produção, a qualpode ser reduzida em cerca de 10% a 20%.A epinastia e declínio de Spy (SED) é umadisfunção causada por um vírus latente,considerado por alguns autores idêntico aASPV. Nesse contexto, ambas asdisfunções são consideradas conjunta-

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Fig. 2. Cancro da casca do porta-enxerto Maruba-kaidocausado por ASGV em mudas de viveiro cv. Fuji. Notar quea necrose não atinge o filtro MM106 (Fraiburgo, SC).

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Fig. 3. Necrose na união de enxertia (N) e inchamentoda base do ramo da indicadora Virginia Crab (VC)(IN) causados por ASGV; inóculo cv. Hillwell (Vacaria,RS).

mente. ASPV produz em Spy 227 epinas-tia foliar em 4-6 semanas pós-inoculação(Fig. 4). A formação de caneluras emVirginia Crab requer incubação no mínimode um ano.

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em toda a superfície foliar, ou ocupar toda aárea entre as nervuras (Fig. 5).

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Fig. 4. Epinastia foliar em Spy 227 causadapor ASPV (inóculo cv. Gala; Vacaria, RS).

VÍRUS E OUTROSAGENTES TRANSMISSÍVEISPOR ENXERTIA

Vírus-do-mosaico-da-macieira (ApMV)

Por conta da facilidade de visualizaçãodos sintomas em variedades comerciais, ovírus do mosaico-da-macieira causa umadas doenças virais mais conhecidas damacieira. Os sintomas foliares variam,segundo a virulência do isolado e asensibilidade da cultivar e podem ser muitodiscretos, passando despercebidos. Plantasinfectadas mostram áreas irregulares decor amarelo-creme nas folhas, podendoreduzir-se a diminutas manchas nasnervuras, bandeamento de nervuras, manchas

Os sintomas, geralmente, são maisfortes em primaveras frias. É comum ascvs. Gala e Granny Smith conterem o vírusde forma latente. Após períodos de forteexpressão de sintomas podem ocorrerflores anormais, atrofiadas e queda de frutasjovens (não confundir com infecção defungos). ApMV causa danos relevantes àmacieira, reduzindo a pega da enxertia e ocrescimento da planta. A redução deprodução pode ser da ordem de 30%, masvaria segundo a cultivar, o ano e a estirpedo vírus. O efeito de ApMV é especialmen-te forte quando ocorre infecção mista comvírus latentes.

Lenho-mole-da-macieira(“Apple rubbery wood “)

O lenho-mole ou emborrachamento-do-lenho é uma disfunção de naturezaainda desconhecida. O envolvimento deagentes do tipo fitoplasma, bactériasrestritas ao xilema e ricketsias na etiologiadessa doença foi proposto, mas não háprova de patogenicidade. É uma doençamuito difundida em variedades comerciaisde macieiras e pereiras e porta-enxertosclonais. Provoca perdas de produção, emmédia, de cerca de 20% a 30%. A flexibi-lidade anormal da madeira, principal

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Fig. 5. Manchas e áreas irregulares de coramarelo-creme de macieiras infectadas comApMV (Vacaria, RS).

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sintoma da doença, resultado de síntesedeficiente de lignina, dificulta a formaçãodas macieiras; os ramos, sem frutos,curvam-se sob a ação do próprio peso. Ocalibre dos frutos é menor e a maturação éretardada. Os internós são curtos e ocrescimento vegetativo é reduzido. A con-dição lenho-mole observa-se principal-mente nos ramos jovens, do 2º ano decrescimento, com espessura de no máximoum dedo. Mais tarde as plantas podemproduzir madeira normal e “ladrões” oriun-dos do líder e de galhos estruturais, e ossintomas podem desaparecer por completo.A transmissão da doença ocorre pela uniãode tecidos ou pela propagação vegetativade porta-enxertos clonais infectados.

Vírus-da-mancha-anelar-do-tomateiro (“Tomatoringspot virus”, ToRSV)

Este Nepovirus (vírus transmitido pornematóides, com partículas poliédricas) éassociado à necrose-da-união-da-enxertiada macieira. Essa forma um anel marromao redor do tronco, na junção da copa como porta-enxerto. Às vezes, ao invés desseanel necrótico observam-se canelurasmuito discretas na união de enxertia.A necrose impede a soldadura da enxertia,deixa a planta debilitada e raquítica, epassível de ser derrubada por ventos fortes.ToRSV induz sintomas em cultivares-copae porta-enxertos comerciais das séries MM,EM e MAC. ToRSV é facilmente trans-missível pela enxertia durante a propagaçãoclonal.

DOENÇAS DE MENORIMPORTÂNCIA ECONÔMICATRANSMISSÍVEIS PORENXERTIA

A depressão-do-lenho, cuja naturezaainda se desconhece, inicia-se comdepressões locais, curtas, em ramos jovens;posteriormente, desenvolvem-se ranhuras

longitudinais que se alargam, dando lugaràs depressões da madeira (Fig. 6). O agentepode ser eliminado por termoterapia.

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Fig. 6. Sintomas de depressão-do-lenho nacv. Royal Gala, 3 anos de idade (Caxias doSul, RS).

Em pomares mais velhos foram obser-vadas frutas infectadas com ruga verde. Ossintomas desenvolvem-se em frutinhos decerca de 2 a 3 cm de diâmetro, logo após afloração, na forma de pequenas depressõesda casca, que se tornam mais severas (Fig. 7).

O tecido abaixo das depressões é verde,mais escuro que o tecido que o circunda.O agente foi transmitido somente pelaenxertia, mas há relatos de disseminaçãovagarosa em pomares. Assim, medidas desanidade, como a termoterapia, representama melhor forma de prevenção. O patógeno,de natureza ainda desconhecida, é latenteem algumas variedades comerciais, e afeta aprodução e a armazenabilidade.

Embora ocorra raramente, a rachadura-estrela foi constatada em pomares maisantigos. A natureza do agente, transmissível

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pela enxertia, é desconhecida, mas o agen-te pode ser eliminado por termoterapia.Os isolados mais virulentos causam, alémda rachadura típica, distorção e reduçãodo tamanho dos frutos (Fig. 8), redução dovigor, declínio e cancros ao redor das gemas.

em casa de vegetação, telado ou em cam-po, ou conduzida em laboratório por sero-logia e técnicas moleculares como a PCR.

Muitos vírus são latentes em macieirase, por isso, usam-se plantas indicadoraspara realizar a indexagem biológica (Tabe-la 1). Sintomas dessas indicadoras, quandoinfectadas, incluem: manchas necróticase/ou cloróticas, mosaico, necrose foliar,distorção foliar, bandeamento cloróticodas nervuras, epinastia, morte de ponteiros,necrose da casca e da união de enxertia,caneluras na madeira, enfezamento edeclínio da planta, entre outros.

O teste imunoenzimático ELISA (evariações) é, atualmente, o mais ampla-mente utilizado teste serológico para adetecção de doenças virais em fruteiras emgeral. Consiste na reação de um extrato daamostra com um anticorpo específico queserá detectado por um anticorpo (específicoou universal) ligado a uma enzima. Umavez adicionado à mistura o substrato dessaenzima, a reação positiva produzirá umaalteração de cor visível a olho nu. Apesarde algumas peculiaridades (sazonalidadedo teste; distribuição desuniforme dos vírusem certos tecidos) que podem dificultar odiagnóstico em certas estações do ano odiagnóstico serológico apresenta-se comoinstrumento que reúne simplicidade,possibilidade de execução em larga escala,baixo custo e alta sensibilidade. Anticorpose conjugados existentes no mercado,necessários à execução de ELISA, aindasão importados.

A PCR ou reação de polimerase emcadeia (e suas variações) é um método dedetecção extremamente sensível que permiteo diagnóstico de agentes virais, geralmente,desde que se conheça pelo menos parte dovírus. Consiste no uso de pequenosoligonucleotídeos chamados “iniciadores”,que se pareiam com o vírus e permitem suaamplificação em reações catalizadas porenzimas. Os produtos resultantes dessaamplificação são visualizados sob luzultravioleta. A necessidade de extração dosácidos nucléicos virais das amostras comagentes desproteinizantes, enquanto ELISA

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Fig.7. Sintomas de ruga-verde em frutinhos da cv. GalaStandard (Vacaria, RS).

Fig.8. Sintomas de rachadura-estrela em frutinhos da cv.Gala Standard (Vacaria, RS).

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DIAGNÓSTICO DE VÍRUS

Geralmente, chama-se “indexagem”o diagnóstico de vírus de fruteiras perenes.Pode ser biológica, enxertando-se tecidosde plantas suspeitas em plantas indicadoras

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Tabela 1. Espécies/cultivares utilizadas na indexagem biológica de vírus de macieiras e os sintomas quedesenvolvem.

Espécie / Variedade

1) LL-S5: Lord Lambourne Seedling nº 5; Mo84: Maruba-kaido Seleção Morioka nº 84; BC: bandeamento clorótico de nervuras; C: caneluras; CR: curvatura deramos; DF: deformação foliar; DSF: depressões verde-escuras na superfície dos frutos; E: epinastia; EC: erupções da casca; IBE: inchamento da base do enxerto;LA: lenho avermelhado; M: mosaico; MAC: manchas anelares cloróticas; MC: manchas cloróticas; MN: manchas necróticas; MP: morte de ponteiros; MV: manchasvermelhas, que se tornam necróticas; NF: necrose foliar; NIC: necrose interna da casca; NC: necrose do caule; NN: necrose de nervuras; NUE: necrose na uniãode enxertia; REF: rachadura de frutos; DL: depressão longitudinal do lenho; ( ): sintoma ocorre com certos isolados, não via de regra.Fonte: 2) Siebert & Engelbrecht, 1981; 3) Fridlund, 1989.

M. domestica ‘LL-S5’M. adstringens ‘Hopa’M. platycarpaM. prunifolia cv. ringo ‘Mo84’,Maruba-kaidoM. domestica ‘Spy 227’M. domestica ‘R-12740.A’Pyronia veitchiiM. domestica cv. Virginia CrabM. domestica cv. Radiant CrabM. domestica cv. Lord LambourneM. micromalus cv. GMAL 273.AM. domestica cv. Golden DeliciousM. domestica cv. GalaM. domestica cv. Gravenstein

Vírus

ACLSVACLSVACLSV

ACLSVASPV-SED, ACLSV

ACLSVACLSV, ASGV, ASPV

ASGV, ASPVASPV

Lenho-mole, ApMVASGV

Rachadura-estrela, Lenho-mole, ApMVRuga-verde

Depressão-do-lenho

Sintomas 1

MC, DF, MMV, MN, NF, NC, LA

MC, EC, MAC2)

MC, NF, MP, NIC, E, EC, (C)MC, C, E, NICMC, NF, NIC, CMAC, BC, C2)

NUE, C, IBEE, NNM, CR

NC, MN, E, DFREF, CR, M3)

DSF3)

DL3)

e suas variações usam seiva bruta ou clarifi-cada, reduz a versatilidade da PCR comométodo para análises massais. Ambos osmétodos, entretanto, têm seu lugar noinstrumentário de diagnóstico, e especial-mente na limpeza clonal, formando um tripécom a indexagem biológica.

PRODUÇÃO DEPLANTAS LIVRES DE VÍRUS

Controle de vírus é sempre profilático.Consiste na prevenção. Não há métodoscurativos ou viricidas aplicáveis empomares. Planta infectada, uma vez nopomar, permanece infectada e é irrecu-perável. O único controle eficiente devírus, especificamente daqueles de fruteiraslenhosas, que se transmitem exclu-sivamente pela enxertia, consiste no usode plantas livres de vírus na formação dopomar.

É comum, na ausência de plantaslivres de vírus de uma variedade ou clonede importância comercial, que essas plantastenham que ser desenvolvidas a partir domaterial infectado, o que pode ser feito pora) avaliação de “escapes” naturais (plantasque permaneceram sadias) via indexagem;b) termoterapia; c) por cultura de tecidos.Na prática, é comum a associação determoterapia à cultura de tecidos.

Termoterapia ou tratamento comcalor (nesse contexto entendido como arquente) pratica-se, hoje, como nos anos60, quando estes trabalhos se iniciaramnos EUA e Europa. Para o tratamentotérmico, utilizam-se desde câmaras decrescimento totalmente automatizadas atésimples gabinetes de madeira comlâmpadas como fontes internas de calor.Câmaras de termoterapia devem preenchertrês requisitos básicos: ser controláveis,confiáveis e permitir a exposição atemperaturas constantes.

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Os procedimentos consistem de: a) es-colha da variedade segundo critérios agronô-micos, pomológicos, fitossanitários e merca-dológicos; b) preparação da cultivar destina-da ao tratamento térmico em plântulas desemente bem desenvolvidas e enraizadas.Uma vez soldado o enxerto, a planta recebetratamento para fomentar vigorosa brotaçãoe crescimento, permitindo o acúmulo desubstâncias de reserva na raiz e no tronco,fundamental para o êxito da termoterapia,que é um tratamento bastante agressivo.Forte poda, boa fertilização e suprimento deágua forçam nova brotação sob temperaturasque variam de 36ºC a 40ºC, por diferentesperíodos, conforme o vírus ou o isolado.Nessas condições de temperatura, ocrescimento vegetativo da planta é maisrápido que a replicação e o movimento dovírus na planta. Como conseqüência os ápiceslaterais e apicais de plantas tratadas têm altaprobabilidade de estar livres de vírus (viróidesnão são, aparentemente, afetados pelatermoterapia). Esses ápices são cortados eenxertados em cunha, em porta-enxertospreparados simultaneamente. Deve-se terem mente que a termoterapia tem efeitodiferenciado sobre os diversos vírus. ACLSVe ApMV são de fácil eliminação pelo calor,ASPV-SED ocupa posição intermediária eASGV, extremamente termoestável, segundoa termossensibilidade do isolado, pode nãoser eliminado pela termoterapia. Neste último,e em outros casos, a termoterapia pode serum ótimo pré-tratamento do materialdestinado à cultura de meristemas.

Como o tratamento térmico nãorepresenta garantia de que todos os vírussejam eliminados, é procedimento-padrãoa indexagem (biológica, serológica emolecular) na seqüência da termoterapia,segundo a disponibilidade de material. Apósa termoterapia, se não houver a eliminação

total dos vírus, pelo menos terá ocorridouma forte redução na sua concentração,possivelmente inferior ao nível de detecção,o que exige cuidados especiais na avaliaçãodas plantas e determina o monitoramentoposterior durante três enfolhamentos.

A cultura de tecidos englobaprocedimentos para a eliminação de vírusde tecidos vegetais, entre os quaisdestacam-se a cultura de meristemas e amicroenxertia in vitro. A cultura demeristemas já foi usada com êxito paraeliminar um grande número de vírus denumerosas espécies de plantas. Há relatosda eliminação de ASGV de macieiras pormicroenxertia.

A concentração de vírus em plantasreduz-se na proximidade do meristema api-cal. Geralmente, no próprio meristema nãohá vírus. Esse é o fundamento do uso dessetecido para a limpeza clonal. Trata-se de umtecido ainda não diferenciado, de cerca deaté 0,25 mm de comprimento. O meristemaé extraído sob lupa em condições asséticas,de tecidos que podem ter sido submetidospreviamente à termoterapia, e cultivado emmeios de cultivo para: iniciação de cultivo,proliferação e enraizamento. As plântulas,na seqüência, são aclimatadas em casa devegetação, reduzindo-se gradativamente aumidade, e são submetidas, assim quepossível, aos primeiros testes de vírus,idênticos aos descritos em plantas oriundasda termoterapia e enxertia de ápicescaulinares.

Os procedimentos de limpeza clonalde macieiras, seja pela termoterapia sejapor cultura de tecidos, caracterizam açõesde longa duração, envolvendo etapas deindexação (três enfolhamentos), avaliaçãoda autenticidade varietal e o monito-ramento dos materiais egressos dessesprocedimentos.