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PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM TECNOLOGIA AMBIENTAL - MESTRADO

Fernanda Ravasio Rodrigues Maidana

CONTROLE DA CARGA POLUENTE DE FORMALDEÍDO EM EFLUENTE DE LABORATÓRIO DE ANATOMIA, POR CLAE, APÓS

DERIVATIZAÇÃO COM 2,4-DNPH

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Santa Cruz do Sul, dezembro de 2008

Fernanda Ravasio Rodrigues Maidana

CONTROLE DA CARGA POLUENTE DE FORMALDEÍDO EM EFLUENTE DE LABORATÓRIO DE ANATOMIA, POR CLAE, APÓS

DERIVATIZAÇÃO COM 2,4-DNPH

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Tecnologia Ambiental – Mestrado, Área de Concentração em Gestão e Tecnologia Ambiental, Universidade de Santa Cruz do Sul – UNISC, como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Tecnologia Ambiental.

Orientadora: Profa. Dr. Ana Lucia Becker Rohlfes

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Santa Cruz do Sul, dezembro de 2008

3

A Deus, por ter me permitido trilhar este caminho, protegendo-me com seu amor e orientando-me com sua sabedoria. Aos meus familiares, por todo carinho e compreensão durante minha presença ausente, necessária para a realização deste trabalho.

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AGRADECIMENTOS

Gostaria de agradecer, em primeiro lugar, a minha orientadora, profa. Dr. Ana

Lucia Becker Rohlfes, que foi, sem dúvida alguma, peça importante na elaboração

deste trabalho, principalmente pelo tempo a mim dispensado. De forma mais geral,

gostaria de agradecê-la por sempre me estimular a escolher os caminhos certos,

não os mais fáceis, os já percorridos, mas sim aqueles que mais teriam a

acrescentar, os mais desafiadores, que me faziam cruzar limites.

Aos Professores e Colegas do Programa de Pós Graduação em Tecnologia

Ambiental, pela contribuição em minha formação acadêmica.

À Juliana Rogeri, Bruna Valandro Trolli, Nelma Balbinoti e Vanessa Dalla

Colletta pelo interesse, dedicação e amizade.

À Leandro, pela paciência e compreensão durante todo este trabalho, pelas

palavras de apoio e incentivo que sempre me fizeram sorrir.

Aos meus pais e irmãs, pelo incentivo e estímulo com que acompanharam

este trabalho. Uma palavra de reconhecimento muito especial para eles, por todo o

carinho dedicado ao longo destes anos.

5

RESUMO

Devido às vantagens do uso do formaldeído em diversos ramos da indústria,

principalmente na conservação de cadáveres e peças anatômicas em laboratórios

de anatomia, visto a sua eficiência e menor custo, é importante a preocupação com

o destino final deste resíduo, que por sua vez faz parte de um grupo de produtos que

são potencialmente perigosos à saúde devido ao seu fator carcinogênico. O principal

objetivo deste trabalho foi desenvolver uma metodologia para a quantificação do

formaldeído gerado em laboratório de anatomia, em busca de uma ferramenta que

auxiliasse nos processos de tratamento deste efluente. A metodologia proposta

baseou-se na identificação deste aldeído por Cromatografia Líquida de Alta

Eficiência com detector UV/VIS acoplado e leituras com comprimentos de onda fixos

em 365 nm, a qual foi possível através da reação de derivatização entre o

formaldeído e a 2,4-dinitrofenilhidrazina, na construção de uma curva analítica com

concentrações de 10 mg L-1 a 50 mg L-1, obtendo para este, um coeficiente de

correlação de 0,99. Os estudos envolveram as análises de amostras sintéticas e

reais (provindas do Laboratório de Anatomia da Universidade de Santa Cruz do Sul).

As melhores condições para que a reação de derivatização ocorresse foram

estabelecidas com um tempo de reação (repouso) de 2 h, pH=5 no meio reacional e

4,04 mmol L-1 da solução derivatizante. Estas características foram de extrema

importância para a formação do produto desejado, a 2,4-dinitrofenilhidrazona.

Palavras-chave: Formaldeído, 2,4-dinitrofenilhidrazina, cromatografia líquida de alta

eficiência.

_____________________________Dissertação de Mestrado Fernanda R. R. Maidana –UNISC - 2008

3

ABSTRACT

Due to the advantages of the use of formaldehyde in various areas of the

industry, especially in the conservation of cadavers and anatomical pieces in

laboratories of anatomy, having seen its efficiency and lower cost, it is important to

be concerned with the final destination of this residue, which is part of a group of

products that are potentially dangerous for health due to its carcinogenic factor. The

main objective of this work was to develop a methodology for the quantification of

formaldehyde, developed in a laboratory of anatomy, in the search for a tool, which

could aid in the processes of treatment of this effluent. The proposed methodology

was based on the identification of this aldehyde by Liquid Chromatography of High

Efficiency with a UV/VIS detector attached and readings of the lengths of waves fixed

in 365 nm, which was possible through the reaction of derivatization between the

formaldehyde and the 2,4-dinitrophenylhydrazine, in the building of an analytical

curve with concentrations of 10 mg L-1 to 50 mg L-1, obtaining for this test, a

coefficient of correlation 0,99. The studies involved the analyses of synthetic and real

samples (Coming from the Laboratory of Anatomy of the University of Santa Cruz do

Sul). The best conditions for the reaction of derivatization to occur were established

with a time of reaction (rest) of 2 h, pH=5 in a mean of reaction and 4,04 mmol L-1 of

the derivatizing solution. These characteristics were of extreme importance for the

formation of the desired product, the 2,4- dinitrophenylhydrazone.

Keywords: Formaldehyde, 2,4-dinitrophenylhydrazine, Liquid Chromatography of

High Efficiency.


4

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Estrutura molecular do formaldeído....................................................13Figura 2 – Reação entre aldeídos e a 2,4-dinitrofenilhidrazina em meio ácido. (SOLOMONS, 1996)..................................................................................................14Figura 3 – Espectro característico do produto da reação entre formaldeído e ácido cromotrópico em meio ácido (FAGNANI et al, 2007).................................24Figura 4 – Cromatograma referente a separação de HCHO-DNPH por HPLC. (ZEGOTA, 1999)........................................................................................................26Figura 5 – Fluxograma representativo da metodologia utilizada.......................30 Figura 6 – Sistema CLAE empregado nas análises............32Figura 7 – Principais pontos geradores de formaldeído nos Laboratório de Anatomia da UNISC..................................................................................................42Figura 8 – Cromatograma obtido na separação entre 2,4-DNPH (1) e hidrazona (2) a partir de solução de formaldeído 10 mg L-1. Condições: coluna C18, fase móvel metanol-água (75:25), vazão 1 mL min-1 e detector com comprimento de onda em 365 nm..................................................................................................44Figura 9 – Cromatograma obtido na separação entre 2,4-DNPH (1) e hidrazona (2) a partir de solução de formaldeído 50 mg L-1. Condições: coluna C18, fase móvel metanol-água (75:25), vazão 1 mL min-1 e detector com comprimento de onda em 365 nm..................................................................................................45Figura 10 – Áreas obtidas quando ao emprego de 2,02.10-5 e 4,04.10-5 mmol L-1 da solução de 2,4-DNPH 0,4% para análise em triplicata de soluções padrão de formaldeído 10 mg L-1 .......................................................................................46Figura 11 – Áreas obtidas quando ao emprego de 2,02.10-5 e 4,04.10-5 mmol L-1 da solução de 2,4-DNPH 0,4% para análise em triplicata de soluções padrão de formaldeído 30 mg L-1........................................................................................47Figura 12 – Curva analítica para o formaldeído com análise cromatográfica imediatamente após reação entre formaldeído e 2,4-DNPH................................49Figura 13 – Curva analítica para o formaldeído com análise cromatográfica após uma hora de repouso entre formaldeído e 2,4-DNPH.................................49_____________________________Dissertação de Mestrado Fernanda R. R. Maidana –UNISC - 2008

5

Figura 14 – Curva analítica para o formaldeído com análise cromatográfica após duas horas de repouso entre formaldeído e DNPH....................................51Figura 15 – Hidrazona, formada devido à reação de formaldeído com 2,4-DNPH, solúvel (a) e insolúvel (b) em metanol. .....................................................52Figura 16 – Cromatograma obtido na separação entre 2,4-DNPH (1) e hidrazona (2) a partir de análise de amostra oriunda do laboratório de anatomia, utilizando-se um fator de diluição igual a 250 vezes. Condições: coluna C18, fase móvel metanol-água (75:25), vazão 1 mL min-1 e detector com comprimento de onda em 365 nm.................................................................58

LISTA DE TABELAS_____________________________Dissertação de Mestrado Fernanda R. R. Maidana –UNISC - 2008

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Tabela 1 – Fontes típicas da poluição do ar em ambientes internos.................19 .............................................................................................................................44Tabela 2 – Áreas e desvio-padrão relativo (DPR%) na análise das replicatas imediatamente após o início de reação entre formaldeído e 2,4-DNPH.............48Tabela 3 – Áreas e desvio-padrão relativo (DPR%) na análise das replicatas após tempo de repouso, entre formaldeído e 2,4-DNPH, de 1 hora...................48Tabela 4 – Áreas obtidas para a análise das soluções padrão de formaldeído após 2 horas de repouso com 2,4-DNPH e média das áreas após 1 hora de repouso.....................................................................................................................50Tabela 5 – Resultados obtidos na quantificação de formaldeído em amostras sintéticas...................................................................................................................52Tabela 6 – Resultados obtidos na quantificação de formaldeído nas amostras sintéticas de 40, 60 e 80 mg L-1..............................................................................54Tabela 7 – Teores de formaldeído (mg L-1) para cada replicata realizada nas alíquotas de 1, 2 e 5 mL avaliadas, com diluição num fator de 250 vezes........55TABELA 8: Teores de formaldeído (mg L-1) para cada replicata realizada nas alíquotas de 1, 2 e 5 mL avaliadas, com diluição num fator de 500 vezes........55Tabela 9 – Teores de formaldeído (g L-1) da Amostra 1, oriunda do efluente do Laboratório de Anatomia, a partir da análise de alíquotas de 2 e 5 mL.............56Tabela 10 – Teores de formaldeído (g L-1) da Amostra 2, oriunda do efluente do Laboratório de Anatomia, a partir da análise de alíquotas de 2 e 5 mL.......57Tabela 11 – Teores de formaldeído (g L-1) das Amostras fortificadas 1 e 2.....58

LISTA DE ABREVIATURAS


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ANVISA Agência Nacional de Vigilância SanitáriaAOC Association of Official Analytical ChemistsCG Cromatografia GasosaCLAE Cromatografia Líquida de Alta EficiênciaCOVs Compostos Orgânicos Voláteis

2,4-DNPH 2,4-DinitrofenilhidrazinaDPR Desvio Padrão RelativoEFS Extração em Fase SólidaELL Extração Líquido-líquidoEPA Agência de Proteção AmbientalFIA Análise por Injeção em FluxoINCA Instituto Nacional do CâncerIARC International Agency for Research on CancerLA Laboratório de AnatomiaMEFS Micro Extração em Fase SólidaNIOSH National Institute for Occupational Safety and HealthOMS Organização Mundial da SaúdeOSHA Occupational Safety & Health AdministrationPOAs Processos Oxidativos AvançadosQAI Qualidade do Ar em InterioresUV Ultra Violeta

SUMÁRIO

INTRODUÇÃO .......................................................................................................... 10 1 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .................................................................................. 13 1.1 Formaldeído ..................................................................................... 13 1.1.1 Características Físico-Químicas ................................................... 13 1.1.2 Informações Toxicológicas ........................................................... 15 1.1.3 Formaldeído e poluição ambiental ................................................ 16 1.2 Aplicações do formaldeído .............................................................. 21


8

1.3 Métodos de determinação do formaldeído ...................................... 23 1.3.1 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência .................................... 27 2 METODOLOGIA ..................................................................................................... 30 2.1 Caracterização do local de estudo .................................................. 30 2.2 Determinação de formaldeído por Cromatografia Líquida de Alta

Eficiência ........................................................................................ 31 2.2.1 Instrumentação ............................................................................. 31 2.2.2 Reagentes e preparo de soluções ................................................ 32 2.2.3 Limpeza do material utilizado ....................................................... 33 2.2.4 Otimização das condições analíticas para a determinação de

formaldeído por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência ......... 34 2.2.4.1 Concentração de 2,4-dinitrofenilhidrazina no meio reacional ........... 35

2.2.4.2 Condições de pH do meio reacional ................................................. 35

2.2.4.3 Tempo de repouso ............................................................................ 36

2.3 Aplicação do método proposto em amostras sintéticas .................. 37 2.4 Aplicação do método analítico proposto em amostras reais ........... 38 3 RESULTADOS E DISCUSSÃO .............................................................................. 40 3.1 Características do local de estudo ................................................... 40 3.2 Resultados obtidos na otimização das condições analíticas para

determinação de formaldeído por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência ........................................................................................ 43

3.3 Lineariedade de resposta do método analítico proposto ................ 52 3.4 Resultados dos ensaios com amostras sintéticas ........................... 54 3.5 Análise de amostras oriundas do Laboratório de Anatomia ............ 56 REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 62 Anexo 1 – Padronização da solução de formaldeído ........................... 68


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INTRODUÇÃO

A utilização que o homem tem feito dos recursos naturais nem sempre

ocorreu considerando suas características e as capacidades de recuperação dos

mesmos. O surgimento de problemas ambientais graves, com reflexos sobre o

próprio homem, levou-o a procurar compreender melhor os fenômenos naturais e a

entender que deve agir como parte integrante do sistema natural (MOTA, 2006).


10

Em vista aos aspectos ambientais que estão ligados ao tratamento de

qualquer tipo de resíduo, em especial aos resíduos provindos de laboratórios de

anatomia, se faz importante o estudo de técnicas e metodologias que visem a

minimizar os impactos ambientais causados pelo formaldeído.

Estudos recentes têm mostrado que o formaldeído é a espécie que aparece

em maior quantidade nos poluentes carbonílicos representando em ambientes

fechados cerca de 60% do total dos aldeídos. Sua origem tem sido associada a

complexos processos químicos e físicos que determinam geração, emissão e

acúmulo do formaldeído. As fontes usuais são carpetes, fumaça de cigarros,

madeiras compensadas. Atualmente vem sendo considerada a sua formação, via

reações químicas no ar, como produto de reações entre compostos orgânicos

voláteis (COVs) e oxidantes (PEREIRA E CARDOSO, 2001).

Devido a sua grande reatividade química e propriedades desinfetantes, o

formaldeído é um dos produtos químicos mais amplamente usados nos dias atuais.

Sua utilização como matéria-prima e insumo químico é feita em vários tipos de

indústrias, e constituem tópicos de várias pesquisas nos últimos anos devido as

suas características toxicológicas (FARAH, 2007).

Entre suas aplicações, pode-se citar a fabricação de compósitos, fórmulas em

indústria têxtil, operações de higiene e limpeza, como também na preservação de

peças anatômicas, o qual é gerado via lixívia ou descarte direto (OMIL et al, 1999;

VIDAL et al, 1999; LU e HEGEMANN, 1998; OLIVEIRA et al, 2004).

Os laboratórios de estudos de anatomia utilizam formaldeído em altas

concentrações para a conservação de cadáveres e peças anatômicas, os quais

geram uma grande quantidade de efluente. As instituições de ensino superior, nos

últimos anos, têm se preocupado com o tratamento e a disposição de resíduos e

efluentes gerados nestas atividades de ensino e pesquisa. Neste sentido, a busca

pela remediação de águas residuárias contendo formaldeído representa uma grande

preocupação ambiental.


11

Muitas Universidades repassam a outras empresas à responsabilidade pelo

recolhimento e disposição final em usinas de reciclagem, porém, estes

procedimentos desencadeiam elevados custos e riscos ambientais.

Considerando-se a necessidade de contornar todos os problemas gerados a

partir de efluentes contendo formaldeído, surgem alternativas que buscam pelo

tratamento deste tipo de resíduo. Assim, é de fundamental importância que existam

métodos sensíveis, com resultados rápidos e de fácil utilização para quantificação

dos aldeídos de baixo peso molecular presente nos ambientes. O desenvolvimento

de novos métodos e/ou a otimização dos já existentes é de grande interesse tanto

do ponto de vista analítico ambiental como toxicológico.

Sabe-se, que o conceito de gestão ambiental mais adequado deve

contemplar sempre, que possível, a redução de poluentes químicos em sua fonte.

Em função disto, este trabalho desenvolveu e aperfeiçoou métodos analíticos para a

caracterização e quantificação do formaldeído provindo do Laboratório de Anatomia

da Universidade de Santa Cruz do Sul. Para tanto, utilizou-se a cromatografia

líquida de alta eficiência como método de separação entre o formaldeído e o

derivatizante (2,4-dinitrofenilhidrazina). A fase preliminar do estudo envolveu a

determinação das principais fontes geradoras de formaldeído no Laboratório de

Anatomia, e posterior análise das condições ideais para favorecer a reação entre

formaldeído e 2,4-dinitrofenilhidrazina, as quais foram aplicadas em amostras

sintéticas e reais.


12

1 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

1.1 Formaldeído

1.1.1 Características Físico-Químicas

O formaldeído é um gás normalmente utilizado em solução aquosa, com

fórmula molecular CH2O, cuja estrutura é demonstrada na Figura 1. Este composto

orgânico volátil possui inúmeras aplicações devido a sua grande reatividade. É

comumente comercializado em solução aquosa contendo 37 %, de formaldeído

como preservativo contra a polimerização, é incolor possui odor irritante

característico (SOLOMONS, 1996).

Figura 1 – Estrutura molecular do formaldeído.

No que se refere às propriedades físicas e químicas, o formaldeído, também

conhecido por aldeído fórmico ou metanal, possui peso molecular igual a 30,03 g

mol-1, ponto de ebulição de - 21°C, ponto de solidificação igual a - 92°C, sendo muito

solúvel em água. É incompatível a oxidantes fortes, álcalis, ácidos, fenóis e uréias,


13

reage fortemente com óxidos nitrogenados, carbonato de manganês e peróxidos,

além de poder sofrer oxidação na presença do ar e da luz (HSDB, 2002).

O formaldeído pertence ao grupo funcional dos aldeídos, os quais apresentam

na molécula um radical funcional denominado carbonila. Nestes compostos, uma

das valências do carbono é preenchida obrigatoriamente pelo hidrogênio e a outra

por um radical aquila ou arila (FELTRE, 2004). Esta substância é a mais simples do

grupo dos aldeídos, pois não possui um grupo carbonila ligado a outro átomo de

carbono. Dentre as propriedades físicas, é importante ressaltar, que o grupo

carbonila é um grupo polar, devido a este fato, os aldeídos possuem pontos de

ebulição mais elevados que os hidrocarbonetos com o mesmo peso molecular

(SOLOMONS, 1996).

O átomo de oxigênio carbonílico permite que as moléculas dos aldeídos

formem ligações de hidrogênio fortes com as moléculas de água, sendo assim, os

aldeídos de baixo peso molecular exibem solubilidade apreciável na água.

Os produtos das reações dos aldeídos com a 2,4-dinitrofenilhidrazina são

freqüentemente usados na identificação de aldeídos. O composto formado a partir

desta reação em meio ácido, apresentado na Figura 2, é a 2,4-dinitrofenilhidrazona,

um precipitado de coloração alaranjada relativamente insolúvel com pontos de fusão

nítidos os quais permitem uma fácil caracterização (OLIVA et al, 2002).

C O

R

R

(H)

+

NO2

NO2

NHNH 2

H SO 2 4

NO 2

2NO

NH N CR

R(H)

Figura 2 – Reação entre aldeídos e a 2,4-dinitrofenilhidrazina em meio ácido. (SOLOMONS, 1996)


14

1.1.2 Informações Toxicológicas

Segundo o INCA (Instituto Nacional do Câncer), o produto formaldeído é

tóxico quando ingerido, inalado ou quando entra em contato com a pele por via

intravenosa, intraperitoneal ou subcutânea. Em concentrações de 20 mg L-1 no ar

causa rapidamente irritação nos olhos.

O potencial carcinogênico do formaldeído foi comprovado por diversas

instituições de pesquisa. Em 1995, a Agência Internacional e Pesquisa em Câncer

(IARC), classificou este composto como sendo carcinogênico para humanos,

tumorogênico e teratogênico por produzir efeitos na reprodução dos mesmos. A

Agência de Proteção Ambiental (EPA), dos EUA, como também a Associação de

Saúde e Segurança Ocupacional (OSHA), chegou à conclusão que o formaldeído

era considerado suspeito de causar câncer em humanos.

A probabilidade de desenvolvimento de câncer pelo formaldeído é através do

sistema respiratório. A inalação deste composto pode causar irritação nos olhos,

nariz, mucosas e trato respiratório superior (HSDB, 2002).

Ainda conforme HSDB (2002), o formaldeído pode ser absorvido pelas vias

oral, dérmica e inalatória, apresentando elevado potencial e irritabilidade local. Em

exposições crônicas apresenta potencial de carcinogenicidade. A inalação em altas

concentrações pode causar bronquite, laringite ou ainda pneumonia, sendo que, os

sintomas mais freqüentes nestes casos são fortes dores de cabeça, tosse, falta de

ar, vertigem, dificuldade para respirar e edema pulmonar.

De acordo com o INCA, medidas de concentração de formaldeído no ar têm

apontado níveis entre 0,07 e 2,94 mg L-1. Fazendo uma relação entre concentração

e sintomas, constatou-se que o limiar para o odor ocorre próximo a 0,8 mg L-1, e que

danos severos são causados a partir de 50 a 100 mg L-1 com exposição de 5 a 10

minutos.


15

A Associação de Saúde e Segurança Ocupacional estabeleceu 0,75 mg L-1

como limite de exposição para uma jornada diária de 8 horas, totalizando 40 horas

semanais. Já o Instituto Nacional de Segurança e Saúde Ocupacional (NIOSH) é

mais rigoroso, recomendando um limite de exposição de 0,016 mg L-1 em

concentração de formaldeído.

1.1.3 Formaldeído e poluição ambiental

A evolução da sociedade moderna e a mudança de estilo de vida vêm

influenciando a qualidade do ar nos interiores. Nas últimas décadas, a poluição

indoor tem chamado a atenção da comunidade como um todo. Diferentemente do

que ocorre com os poluentes externos, que geralmente sofrem processos de

dispersão ao longo do dia, em ambientes confinados o indivíduo pode estar exposto

a concentrações aproximadamente constantes de poluentes, por períodos

relativamente longos. Neste sentido, Sodré e Correa (2006), avaliaram a qualidade

do ar do interior de 50 locais públicos nas cidades do Rio de Janeiro e Niterói em

relação aos compostos formaldeído, acetaldeído e acetona. Os locais foram

organizados em oito categorias: salas de cinemas, terminais rodoviários, salas de

aula, recintos de hospitais públicos, salões de beleza e cozinhas domiciliares e as

amostras foram coletadas no período de novembro de 2005 a agosto de 2006,

sendo as análises realizadas por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE),

com detecção UV em comprimento de onda de 360 nm, após derivatização dos

compostos carbonílicos com DNPH. Os resultados obtidos demonstram que a

grande maioria dos locais amostrados apresentou teores de formaldeído superiores

ao limite do valor de exposição, de 20 µg m-3, recomendado pelo NIOSH, sendo nos

ambientes hospitalares encontrados os índices mais elevados, uma vez que

produtos médicos ou de limpeza que contém compostos orgânicos voláteis (COVs)

são empregados rotineiramente.

Ainda, conforme Sodré e Correa (2006), no Brasil, esforços têm sido feitos no

intuito de melhorar a qualidade do ar de ambientes confinados, tais como a criação


16

da Portaria n° 3.523 de 28/08/1998 do Ministério da Saúde (1998) que regulamenta

as normas para avaliação e controle de ambientes climatizados de uso coletivo e a

Resolução n° 9 de 16/01/2003 da ANVISA (2003). No entanto, tais normas não são

suficientes. Para o formaldeído - substância cancerígena segundo a IARC (2004) – é

urgente uma mudança nos níveis de exposição para ambientes confinados,

climatizados ou não, face aos estudos recentes e a tendência mundial para o

controle desse poluente. Para a realidade brasileira, estudos mais aprofundados são

necessários, principalmente para avaliar os valores médios destes poluentes no ar

externo e aspectos tais como sazonalidade, antes do estabelecimento de limites

nacionais. Limites tais como 20 μg m-3 estabelecido pela NIOSH para o formaldeído

serão provavelmente impossíveis de serem atendidos em algumas metrópoles, tais

como a cidade do Rio de Janeiro que apresenta valores bem superiores.

Segundo Motyka e colaboradores (2007), o formaldeído é emitido para a

atmosfera a partir de fontes naturais ou antropogênicas. As fontes antropogênicas

mais importantes são decorrentes da emissão de gases automotivos e industriais,

onde sua deposição atmosférica é uma importante fonte de contaminação de

sistemas aquáticos, em que concentrações na ordem de três vezes mais elevadas

são esperadas para as águas de chuva em relação às águas de superfície.

A importância ambiental do formaldeído e de seus derivados está muito bem

estabelecida e aceita pela comunidade científica; portanto, o interesse por seu

estudo vem aumentando a cada dia devido a sua presença nas fases, sólida, líquida

e gasosa, sua alta reatividade – que resulta na formação de poluentes secundários –

e seus efeitos tóxicos à saúde humana. Sendo estes efeitos classificados em três

tipos: irritação, sensibilidade imunológica imediata e mutagênese ou carcinogenese.

Como os aldeídos representam grande parcela de gases presentes na

atmosfera, estudos recentes nos têm mostrado que o formaldeído é a espécie mais

abundante dos poluentes carbonílicos. As fontes de formaldeído presentes na

atmosfera são as mais variadas, sendo a emissão direta ocasionada pelo resultado

da formação de aldeídos durante a combustão incompleta de combustíveis e

biomassa. Os aldeídos também são formados na atmosfera através do produto de


17

reações de oxidação fotoquímica de compostos orgânicos voláteis envolvendo óxido

de nitrogênio.

Conforme Grosjean e Tavares, (1991), durante episódios de smog

fotoquímico, um dos exemplos mais conhecidos de poluição do ar, onde o processo

de formação abrange centenas de reações diferentes envolvendo um número

indeterminado de substâncias químicas, a formação de aldeídos atmosféricos pode

chegar a ser dez vezes maior que a emitida diretamente. Em regiões não urbanas,

ricas em vegetação, a principal fonte de aldeído é proveniente de reações entre

compostos orgânicos naturalmente emitidos pelas plantas e oxidantes presentes na

atmosfera.

Estudos realizados por Shepson (1991), demonstram que em ambientes

fechados o formaldeído representa cerca de 60 % do total dos aldeídos, sendo sua

origem associada a complexos processos químicos que determinam geração,

emissão e acúmulo do formaldeído. As fontes usuais são carpetes, fumaça de

cigarro e de fritura de alimentos, divisórias, madeiras compensadas, espumas

isolantes, máquinas copiadoras entre outras, sendo também considerada a sua

formação, via reações químicas no ar, como produto de reação entre compostos

orgânicos voláteis (COVs) e oxidantes.

O formaldeído possui características de poluentes orgânicos persistentes,

provocando efeitos de carcinogenicidade para humanos e toxicidade pra

microorganismos aeróbios e anaeróbios (LU e HEGEMANN, 1998).

A toxicidade do formaldeído tem sido bastante estudada, sendo

reconhecidamente irritante aos olhos e trato respiratório. Sua ação citotóxica e

genotóxica tem sido atribuída a ataques nucleofílicos a grupos aminos e sulfidrílas

presentes em muitas biomoléculas.

De acordo com Pereira e Cardoso (2001), a presença de aldeídos em

concentrações elevadas em ambientes abertos é indicativa de atmosfera poluída

com COVs e espécies químicas envolvidas em reações fotoquímicas, enquanto em


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ambientes fechados sua presença pode ser indicativa de possíveis atmosferas

insalubres que podem afetar diretamente atividades ocupacionais.

Conforme Baird (2002), o formaldeído é o poluente orgânico mais importante

e que causa maior controvérsia no ar em ambientes internos. Embora sua

concentração no ar exterior seja pequena, em ambientes internos estes níveis

aumentam consideravelmente.

Estudos de Gioda e Neto (2002) mostraram que são inúmeras as fontes de

poluentes em ambientes internos, além das atividades ocupacionais do próprio

homem. Dentre os contaminantes usualmente monitorados estão os dióxidos e

monóxidos de carbono, componentes orgânicos voláteis, matéria particulada,

nicotina e microrganismos. A Tabela 1 mostra as fontes mais comuns destes

compostos.

Tabela 1 – Fontes típicas da poluição do ar em ambientes internos.AMBIENTES FONTES POLUENTES

RESIDÊNCIA

Fumo, Fogão a Gás e a lenha, Materiais de construção e

mobiliário, Superfícies e materiais úmidos, Atividades de limpeza.

Partículas respiráveis, CO, COVs, nicotina, HPA, fenóis, nitrosaminas,

NO2, formaldeído, agentes biológicos, partículas respiráveis.Partículas

respiráveis, CO,

ESCRITÓRIO

Fumo, Materiais de construção e mobiliário, Ar condicionado,

Fotocopiadoras e impressoras a laser, Atividades de limpeza.


NO2, formaldeído, agentes biológicos, partículas respiráveis.Partículas

respiráveis, CO, radônio, ar externo

TRANSPORTEFumo

Queima de combustível


NO2, formaldeído, agentes biológicos, aldeídos

Fonte: Gioda e Neto (2002)

Em ambientes internos, a principal fonte de formaldeído refere-se à utilização

de resinas de uréia-formaldeído através de produtos construídos em madeira, além

de emissões de fumaça de cigarro (BRIKUS e AQUINO NETO, 1999).


19

De acordo com Hohreiter e Rigg (2001), o formaldeído é encontrado na água

da chuva em baixas concentrações, e devido ao metabolismo, eliminado pelos

humanos e pelas plantas em adiantamento estado de decomposição.

Pesquisas de Abrantes e colaboradores (2005) identificaram os aldeídos

como também sendo emitidos por veículos do ciclo do diesel, sendo os mesmos

prejudiciais à saúde. Estas emissões de acetaldeído e formaldeído ainda não estão

regulamentadas e representam significativa importância, já que a frota de veículos a

diesel vem aumentando consideravelmente.

No que se refere aos impactos ambientais, o formaldeído por se degradar

rapidamente no ar constituindo importante componente que causa preocupações

quanto à qualidade do ar. Para organismos aquáticos este poluente é tóxico,

podendo causar mortalidade em diversas espécies (MSDS, 2007).

Nos estudos de Arthaud e colaboradores (2006), foram identificados os

efluentes da indústria petrolífera como grandes contribuintes na composição de

substâncias recalcitrantes, entre eles, fenóis, hidrocarbonetos poliaromáticos e

metais pesados, que são especialmente tóxicos e potencialmente carcinogênicos ao

homem e aos organismos marinhos. Este grupo de pesquisa buscou avaliar a

redução da toxicidade neste tipo de efluentes através da degradação destas

substâncias prejudiciais com reações metabólicas advindas do fungo Aspergillus

Níger, buscando minimizar os impactos ambientais causados por estes despejos.

Embora, segundo a legislação vigente no país, não existam limites de

toxicidade crônica e aguda estabelecido para a emissão de efluentes, o efeito tóxico

destes necessitam ser bem avaliados. Levando-se em consideração que as análises

químicas geralmente identificam e quantificam as substâncias presentes nos

efluentes, se fazem indispensáveis também às análises ecotoxicológicas para

detectar os efeitos causados sobre a biota, pois estão fundamentadas na utilização

de organismos que são diretamente afetados pelos desequilíbrios que

eventualmente ocorrem nos ecossistemas.


20

Sapia e Morita (2002) se preocuparam em avaliar os critérios de recebimento

de efluentes não domésticos em sistemas de esgotos. O crescente avanço da

tecnologia industrial tem resultado na geração de águas residuárias perigosas. Em

estações de tratamento de efluentes, os poluentes perigosos podem, dependendo

de sua concentração, inibir os microorganismos do processo biológico, ser

removidos por volatilização, adsorção no floco biológico e biodegradação ou

atravessar intactos, alcançando os corpos d’água. Neste último caso, estes

poluentes podem causar danos à vida aquática e ao homem, bem como inviabilizar

o reuso, pois são biodegradados muito lentamente e persistem no meio ambiente

por um longo período de tempo, podendo ainda penetrar na cadeia alimentar e

mesmo não sendo detectadas no corpo receptor, podem estar presentes em

quantidades elevadas nos níveis tróficos mais altos devido a sua característica de

bioacumulação.

Os principais agentes tóxicos encontrados nos despejos industriais são os

fenóis, formaldeído, lindano, prata, chumbo e cádmio. Estes poluentes podem inibir

a digestão aeróbia ou anaeróbia e ainda gerar lodo com características perigosas

que pode torná-lo inconveniente ao uso na agricultura (SAPIA e MORITA, 2002).

Segundo o ranking de impactos ambientais gerados por 45 produtos

químicos, propostos por Edward e colaboradores (1999), o formaldeído ocupa o

primeiro lugar, sendo realizado para este estudo dados de toxicidade de emissão no

ar, na água e no solo.

1.2 Aplicações do formaldeído

O aldeído fórmico é produzido industrialmente pela oxidação do metanol.

Devido a sua reatividade é utilizado nos mais diversos ramos da indústria. No que se

refere às aplicações, é largamente utilizado na indústria química, têxtil, de papel e

processamentos de madeira. Também faz parte da produção de resinas,

lubrificantes, adesivos e fertilizantes (ARTS et al, 2006).


21

Entre outras aplicações industriais, o formaldeído é utilizado em salões de

beleza, hospitais e farmácias de manipulação.

Além das aplicações diretas das soluções aquosas, como desinfetante e

conservante, o formaldeído é também utilizado em uma grande variedade de

indústrias, tais como: alimentícia, cosmética e na agricultura (LITEPLO et al., 2002).

Em odontologia, além das várias outras aplicações, é bastante utilizado sob a forma

de pastilhas para manter a esterilização de cones de papel usados no tratamento

endodôntico.

Laboratórios de estudos de anatomia e histologia de análises

anatopatológicas, bem como hospitais utilizam formaldeído em elevadas

concentrações (4 a 8% ou maiores que 4000 mg L-1) para a conservação de

cadáveres, de órgãos, materiais para a biópsia e para esterilização de artigos como

catéteres, drenos, tubos e laparoscópios. Conforme estudos realizados por Farah

(2007), sabe-se que no laboratório de Anatomia da Universidade Estadual de

Campinas (UNICAMP) são consumidos aproximadamente 1300 L de formaldeído

(37 a 55%) ao ano. Uma solução 10 vezes mais diluída é empregada nas cubas

onde estão as peças (cadáveres), sendo trocada a cada 4 ou 6 meses.

Em Instituições de Ensino Superior, é vastamente empregado em laboratórios

de anatomia, onde se faz necessária a preservação de peças de anatomia. Segundo

Machado e colaboradores (2007), tem-se conhecimento que em instituições de

médio porte, pode-se encontrar um residual de 6 m3 por ano de efluente contendo

formaldeído.

As resinas líquidas, sintetizadas a partir de formaldeído e uréia, são indicadas

para a colagem de madeiras, compensados, aglomerados e MDF proporcionando

alta qualidade de colagem e baixa emissão de formaldeído no material produzido.

Da combinação da resina uréia-formaldeído surge um adesivo que apresenta alto

desempenho nas colagens de madeira em geral, na fabricação de portas, divisórias,

folheações, chapas de fibra e aglomerados. O formaldeído surge neste cenário

como uma fonte alternativa pesquisada por Santos e colaboradores (2003), na


22

substituição dos fenóis, de origem petroquímica, que normalmente são usados

nestes adesivos, constituindo fontes não-renováveis.

1.3 Métodos de determinação do formaldeído

Ao se tratar de metodologias analíticas para a quantificação do formaldeído,

uma diversidade de reagentes e métodos analíticos é estudada. Na maior parte das

indústrias, os métodos mais empregados são os titulométricos, que são baseados

em reações envolvendo o grupo carbonílico de aldeídos e cetonas, ou ainda,

envolvendo reações de oxidação usando peróxido de hidrogênio, mercurimetria ou

iodometria. Porém, esses métodos não são seletivos para o formaldeído, além de

apresentarem sensibilidade limitada (AFKHAMI e REZAEL, 1999; FAGNANI et al,

2007; PIRES e CARVALHO, 1999; SOUZA, 2006).

Nascimento (1998), em seus estudos comparou métodos analíticos, tais como

titulometria e colorimetria, indicados pela Official Analytical Chemists (AOC) e

cromatográficos na análise de aldeídos e ácidos em bebidas alcoólicas. Os métodos

oficiais e cromatográficos apresentam similar exatidão e reprodutibilidade, porém os

métodos cromatográficos possuem a vantagem de identificar e quantificar

componentes de uma série. A metodologia proposta utilizou as técnicas de

Cromatografia Gasosa (CG) e Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) as

quais permitem uma maior sensibilidade. Com o emprego da CLAE, para a

determinação dos aldeídos utilizou-se solução 0,4% de 2,4 – DNPH em acetonitrila,

a qual reagia com a amostra em estudo em meio ácido. Os resultados obtidos para

os métodos oficiais apresentaram exatidão e precisão comparáveis, entretanto

existem limitações quando comparados a métodos cromatográficos.

Outro método de quantificação de formaldeído é descrito por Fagnani e

colaboradores (2007), em seus ensaios foi empregada uma técnica

espectrofotométrica para a análise do paraformaldeído presente em amostras de

saneantes industriais, utilizando reação com ácido cromotrópico a 5 % em meio de

ácido clorídrico concentrado e peróxido de hidrogênio 0,025 mol L-1, o qual produziu _____________________________Dissertação de Mestrado Fernanda R. R. Maidana –UNISC - 2008

23

um composto púrpuro avermelhado com máximo de absorção em comprimento de

onda de 575 nm. A Figura 3 apresenta o espectro de absorção do produto de reação

formado. Neste estudo, os autores verificaram uma linearidade de resposta na faixa

de 0,8 – 4,8 mg L-1 de formaldeído, apresentando excelente coeficiente de

correlação (r2= 0,9999). Este método se destaca no contexto analítico por apresentar

grande sensibilidade e alta seletividade.

Figura 3 – Espectro característico do produto da reação entre formaldeído e ácido cromotrópico em meio ácido (FAGNANI et al, 2007)

Pires e Carvalho (1999) apresentaram um estudo sobre a qualidade do ar em

diferentes ambientes internos, onde os compostos carbonílicos têm recebido

atenção especial devido a seus efeitos prejudiciais à saúde do homem. O protocolo

de amostragem e análises envolveu a pré-concentração e derivatização dos

compostos em cartuchos contento um substrato sólido de sílica gel, impregnado

com o reagente 2,4 – DNPH. Este composto reage com as espécies de interesse

dando origem a compostos secundários, carbonil-hidrazonas, que foram extraídas

do amostrador com acetonitrila. Este eluente foi então analisado por CLAE com

detecção por Espectroscopia de Absorção Molecular na região UV, em comprimento

de onda fixo de (360, 385 e 430 nm).


24

Neste mesmo contexto, Oliva-Teles e colaboradores (2002), também

analisaram o formaldeído em resinas através da derivatização do mesmo com 2,4-

DNPH em meio ácido. Nesta metodologia analítica, o procedimento foi otimizado e

adaptado para matrizes com características específicas. A determinação do

composto foi feita por CLAE/UV após a derivatização com 2,4-DNPH. O pH da

reação de derivatização foi controlado, e o tempo de reação era igual a 30 minutos a

uma temperatura ambiente. Este método oferece uma boa separação do

formaldeído e 2,4-DNPH, sendo que a linearidade ocorreu para as concentrações de

1 – 10 mg L-1, e o limite de detecção nestas condições eram de 319 µgL,

apresentando um bom coeficiente de correlação.

De acordo com Kiba e colaboradores (1998), baixos níveis de formaldeído

também podem ser determinados pela pré-concentração com poliaminas, e

analisados por sistema de injeção em fluxo através da imobilização do formaldeído

dentro de uma coluna de ferro incorporada a um sistema de injeção em fluxo com

detector fluorométrico.

Com o propósito de comparar, Hanoune e colaboradores (2006), usaram

simultaneamente a espectroscopia no infravermelho e o método de derivatização

convencional com 2,4-DNPH, seguida de CLAE com detector UV acoplado. A

concentração de formaldeído obtido por ambas às técnicas sempre apresentam

bons resultados, mostrando que o infravermelho pode ser usado para o

monitoramento de formaldeído em atmosfera interna, com uma resolução de tempo

de poucos minutos.

Usando técnicas de CLAE, Zegota (1999), concluiu que seria possível realizar

a derivatização do formaldeído com 2,4-dinitrofenilhidrazina, foi observado neste

estudo, que o tempo de reação era de extrema importância para a formação do

derivado que era estável por 48 h, além de ressaltar, que resultados melhores

ocorriam com uma relação molar DNPH/HCHO superior a 5. Na Figura 4, pode-se

observar o cromatograma referente a separação de HCHO-DNPH por CLAE.


25

Figura 4 – Cromatograma referente a separação de HCHO-DNPH por HPLC. (ZEGOTA, 1999).

Testes com o sistema FIA para determinação fluorimétrica de formaldeído em

cachaça também foram efetuados. Nos ensaios, a determinação do formaldeído

baseava-se na reação do mesmo com um fluoral-P, sendo o produto formado

fluorescente com comprimento de onda entre 410 e 510 nm. Este sistema

apresentou elevada precisão com desvio padrão relativo menor que 5% em todas as

determinações. (SOUZA, et al, 2006).

Outro método envolvendo o Fluoral-P foi utilizado no monitoramento do

formaldeído em ambientes hospitalares através de detecção espectrofluorimétrica.

Neste trabalho, o produto fluorescente analisado por técnicas espectrofluorimétricas

apresentou resultados sensíveis, específicos e de baixo custo. (PINHEIRO et al,

2004).

Estudos de Gigante e colaboradores (2002) utilizaram métodos

espectrofotométricos para a análise de ácido glicólico, esta metodologia baseava-se

na reação colorida entre o formaldeído liberado pelo ácido glicólico e o ácido


26

cromotrópico em meio de ácido fosfórico concentrado com aquecimento em forno de

microondas para acelerar a reação. O composto formado apresentava um máximo

de absorção em 570 nm. Este método se mostrou rápido, simples e seletivo,

obedecendo a lei de Beer para o intervalo de 0 – 2208 mg L-1.

Segundo Pereira e Tavares (2006), em seus estudos para avaliação de

contaminantes inorgânicos e orgânicos em álcool combustível, indicam que os

métodos clássicos para a análise de ânions inorgânicos são baseados em métodos

por via úmida, colorimétricos e cromatográficos, porém referem-se aos métodos por

via úmida como sendo pouco sensíveis, além de exigir diferentes etapas analíticas.

Por outro lado os métodos cromatográficos têm a vantagem de poder especificar os

componentes, mas apresentam como desvantagem elevado consumo de solventes.

Os métodos recomendados para aldeídos requerem uma intensa purificação

de reagentes e solventes antes da utilização na etapa de derivatização. Em vista

disto, surge o estudo que apresenta um método alternativo utilizando a eletroforese

capilar em solução livre e cromatografia eletrocinética micelar para a determinação

de ânions inorgânicos e aldeído. Esta técnica, conforme estudos de Pereira e

Tavares (2006) apresentaram vantagens como rapidez, eficiência, menor custo para

análise além de reduzir o consumo de reagentes.

1.3.1 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

A cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) foi desenvolvida entre os

anos de 1960 e 1970 sendo hoje largamente utilizada como técnica de separação

para análises e purificação de amostras em diversas áreas. Esta técnica de

separação passou a ser um dos métodos analíticos mais utilizados para fins

qualitativos e quantitativos. As razões para este crescimento estão relacionadas à

sua adaptabilidade para determinações quantitativas com boa sensibilidade, a

possibilidade de separar espécies não voláteis e termicamente instáveis, com

destaque para a indústria farmacêutica, bem como as suas aplicações em


27

determinações ambientais e em muitos outros campos da ciência, como o da

medicina (SETTLE, 1997).

Conforme Ciola (1998), o emprego de CLAE para solucionar problemas

analíticos ou preparativos, necessita, além da instrumentação adequada a

combinação correta das condições experimentais, tais como: tipo de coluna, fase

móvel (composição e vazão), temperatura, quantidade de amostra injetada, etc. A

separação dos compostos deve-se aos fenômenos que ocorrem na interface fase

estacionária/ fase móvel e podem ser classificados em adsorção, partição e

exclusão. A escolha da fase móvel empregada em CLAE constitui a parte mais

importante do desenvolvimento de um método cromatográfico. Uma fase móvel

adequada deve apresentar força suficiente para a eluição dos analitos da coluna

cromatográfica, originando picos simétricos.

Diversos materiais foram e estão sendo estudados como fases estacionárias

na cromatografia líquida. Grande importância tem sido dada a sílica e seus

derivados orgânicos, os copolímeros termorrígidos e infusíveis, derivados de

reagentes di e tetrafuncionais. Em alguns casos, são empregados alumina e

carvões. Dentre muitas fases estacionárias, podemos citar como muito importantes

as fases não polares, com 18 carbonos, C18 , adequadas para separar espécies não

polares ou moderadamente polares, como ácidos graxos, glicerídeos,

hidrocarbonetos aromáticos polinucleares, ésteres, vitaminas lipossolúveis,

esteróides e aminoácidos (SETTLE, 1997; CIOLA, 1998).

Os detectores de UV/Visível são os mais empregados em CLAE. Eles medem

as variações na absorbância da luz na região espectral de 190 a 800nm durante a

passagem do efluente da coluna na célula de fluxo.

Uma variedade muito grande de trabalhos já foi realizada utilizando técnicas

de cromatografia líquida de alta eficiência. Pires e Carvalho (1999) utilizaram com

êxito este método através da pré-concentração e derivatização de compostos em

cartuchos contendo um substrato sólido de sílica gel-C18 (microcolunas)

impregnadas com 2,4-DNPH que reagia com a espécie de interesse formando


28

compostos secundários que após serem extraídos do amostrador eram analisados

por CLAE.


29

2 METODOLOGIA

A metodologia empregada para o desenvolvimento desta dissertação está

esquematizada no fluxograma da Figura 5.

Figura 5 – Fluxograma representativo da metodologia utilizada.

2.1 Caracterização do local de estudo


Laboratório de Anatomia (caracterização do local de estudo)

Otimização das condições para análise por CLAE

Formaldeído

Soluções padrão

Solução derivatizante

Tempo de repouso

Método Analítico

Amostras efluentes LA

Amostras efluentes LA fortificadas

Amostras sintéticas

Revisão Bibliográfica

30

O trabalho teve seu início com uma seqüência de visitas e questionamentos

direcionados aos funcionários do Laboratório de Anatomia (LA) da Universidade de

Santa Cruz do Sul, sendo os dados coletados pela autora deste trabalho.

A determinação do perfil do referido laboratório envolveu a caracterização e

monitoramento das atividades desenvolvidas, além da identificação dos cursos de

graduação e pós-graduação atendidos, gerenciamento de resíduos e principalmente

o fluxo das atividades relacionadas ao processo de formolização de cadáveres.

2.2 Determinação de formaldeído por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

A determinação de formaldeído nas amostras sintéticas e nas amostras de

efluente do LA foi realizada empregando um sistema CLAE e reação de

derivatização do formaldeído com solução de 2,4-dinitrofenilhidrazina, resultando em

uma hidrazona com máximo de absorção em comprimento de onda de 365 nm.

2.2.1 Instrumentação

A análise do produto de reação entre formaldeído e 2,4-dinitrofenilhidrazina foi

realizada empregando um cromatógrafo a líquido Shimadzu SCL-IOP com software

classe VP, coluna C18 Phemomenex modelo Luna 5µ (250 x 4,6 mm) 100A0, injetor

automático e detector UV/VIS modelo SPB-IOAV acoplado. A Figura 6 ilustra o

sistema empregado.


31

Figura 6 – Sistema CLAE empregado nas análises.

2.2.2 Reagentes e preparo de soluções

A água utilizada no preparo das soluções e amostras foi purificada em

sistema Milli-Q (resistividade 18,2 MΩcm-1). Os reagentes utilizados foram produtos

de grau analítico, sendo citados:

Formaldeído PA, Vetec, 37% v/v empregado como solução padrão;

2,4 Dinitrofenilhidrazina Merck, como derivatizante do formaldeído;

Metanol Grau HPLC, 99,99 %, para uso em Cromatografia Líquida e

Espectrofotometria da J.T.Baker, empregado na composição da fase

móvel.

Hidróxido de sódio PA Vetec, 99%.

A solução padrão estoque de formaldeído 1000 mg L-1 foi preparada pela

dissolução de 510 µL de formaldeído P.A. em balão volumétrico de 200 mL

empregando água como solvente. Esta solução foi padronizada semanalmente pelo

método descrito por Graziano e colaboradores (2002), onde a solução aquosa de

formaldeído foi analisada por titrimetria iodométrica, conforme descrito no Anexo 1.

O doseamento do formaldeído, pelo método iodométrico, é baseado na oxidação do

formaldeído para ácido fórmico na presença de solução alcalina de iodo. O

hipoiodeto formado na solução alcalina atua como agente oxidante na transformação

do formaldeído em ácido fórmico. Na etapa de acidificação, o hipoiodeto não


32

consumido pelo formaldeído forma novamente o iodo que é titulado com a solução

padrão de tiossulfato de sódio.

As soluções padrões de trabalho de formaldeído foram preparadas

diariamente pela dissolução, em água, de alíquotas volumétricas da solução padrão

de trabalho.

A solução derivatizante de 2,4-dinitrofenilhidrazina 0,4 %(m/v) foi preparada

através da dissolução de 0,15 g de 2,4-DNPH em 5 mL de ácido sulfúrico

concentrado, acrescidos de 7 mL de água e 25 mL de metanol, seguindo

metodologia descrita em Solomons (1996).

A fase móvel empregada na separação cromatográfica foi preparada pela

combinação de metanol e água na proporção de 75:25, respectivamente.

A solução de hidróxido de sódio 5% (m/v) foi preparada pela dissolução de 5 g

de NaOH em água suficiente para 100 mL de solução.

No tanque de efluente do Laboratório de Anatomia, alguns reagentes tais

como, Peróxido de Hidrogênio, Hipoclorito de Sódio, Ácido Nítrico e Glicerina são

encontrados de forma diluída devido a lavagem de peças anatômicas.

2.2.3 Limpeza do material utilizado

A vidraria empregada na execução dos ensaios foi lavada com água corrente e

detergente, em seguida deixada em contato com uma solução etanólica de ácido

nítrico (5% v/v) durante 24 horas. Após, os materiais foram lavados com água

destilada e deionizada em abundância e secos à temperatura ambiente.

Posteriormente os procedimentos de lavagem, os materiais foram fechados e

armazenados em local adequado.


33

2.2.4 Otimização das condições analíticas para a determinação de formaldeído por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

De acordo com Sandner e colaboradores (2001), a determinação de

formaldeído em amostras de água, água potável, ar atmosférico e outras amostras

ambientais é realizada a partir da derivatização do formaldeído com 2,4-DNPH e

posterior separação cromatográfica por CLAE/UV. Compostos pertencentes à classe

dos aldeídos e cetonas, à temperatura ambiente, reagem rápida e quantitativamente

com 2,4-DNPH, originando desta forma compostos estáveis e de baixa volatilidade,

as 2,4 dinitrofenilhidrazonas (VOGEL et al, 2000). Ainda, conforme Liu e

colaboradores (2005) o procedimento analítico mais comumente utilizado para a

determinação do formaldeído é baseado na reação deste com 2,4-DNPH, com

formação da hidrazona correspondente que pode ser obtida por Extração Líquido-

líquido, Extração em Fase Sólida e Micro Extração em Fase Sólida das mais

variadas amostras. Os referidos autores citam também que o método de

derivatização com 2,4-DNPH, o qual apresenta uma boa seletividade. Sendo assim,

a separação cromatográfica foi precedida de uma reação de derivatização,

empregando solução de 2,4-DNPH 0,4% (m/v).

A escolha das condições instrumentais de análise, para a separação

cromatográfica, foi baseada em estudos descritos por vários autores, que

empregaram coluna C18 e detector UV-Vis, como detector. A fase móvel empregada

por Liu e colaboradores (2005) consistia da mistura de acetonitrila e água (70:30)

com vazão de 1,2 mL min-1; Abrantes e colaboradores (2005), por sua vez,

empregaram uma fase móvel contendo acetonitrila e água (65:35) e vazão de 1 mL

min-1; Chi (2006) obteve a separação cromatográfica de aldeídos empregando

eluição por gradiente com fase móvel de composição variada com acetonitrila, água

e solução de acetato de amônia 1 mmol L-1. Por outro lado, Nascimento e

colaboradores (1998) empregaram fase móvel composta por metanol e água, para a

determinação de compostos carbonílicos em amostras de aguardentes de cana-de-

açúcar. Assim, com base nestes autores e considerando o emprego de metanol no

preparo da solução derivatizante, para a separação cromatográfica da 2,4-

dinitrofenilhidrazona e do derivatizante 2,4-DNPH, empregou-se coluna C18 como _____________________________Dissertação de Mestrado Fernanda R. R. Maidana –UNISC - 2008

34

fase estacionária e a mistura metanol-água (75:25) com vazão de 1 mL min -1, como

fase móvel. O analito foi quantificado a partir do sinal cromatográfico obtido no

detector em comprimento de onda de 365 nm.

Para a otimização das condições analíticas algumas variáveis foram

avaliadas, tais como concentração de derivatizante no meio, tempo de reação, pH

do meio e solubilização da hidrazona.

2.2.4.1 Concentração de 2,4-dinitrofenilhidrazina no meio reacional

A 2,4-dinitrofenilhidrazona, formada a partir da reação de derivatização, é

insolúvel em meio aquoso, sendo necessária, deste modo, a reação de formaldeído

com 2,4-DNPH na presença de um solvente orgânico capaz de solubilizar o produto

formado. Desta forma, buscando empregar sempre o mesmo solvente orgânico, a

reação foi realizada na presença de metanol e, buscando a redução do resíduo

gerado, balões volumétricos de 10 mL foram empregados. Considerou-se também a

facilidade para um processo de recuperação de solventes, na escolha do metanol

como solvente orgânico, o que possibilitaria o emprego de uma destilação simples,

para sua possível recuperação e posterior reaproveitamento.

Para o estudo do efeito da concentração de derivatizante no meio, foram

empregadas soluções padrões de formaldeído de 10 e 30 mg L-1, preparadas em

triplicata, acrescidas de 1 e 2 mL de solução de 2,4-DNPH 0,4% o que correspondia

respectivamente a concentração de 2,02 e 4,04 mmol L-1 da solução derivatizante no

meio reacional. Cada replicata foi analisada em sistema CLAE, nas condições

instrumentais descritas anteriormente, após meia hora de reação.

2.2.4.2 Condições de pH do meio reacional


35

Considerando que para o preparo da solução de 2,4-DNPH é empregado

ácido sulfúrico concentrado, o pH do meio reacional é extremamente baixo, sendo

próximo a 1. No entanto, segundo Teles e colaboradores (2002) a reação

quantitativa entre o formaldeído e resinas impregnadas com 2,4-DNPH ocorre na

condição de pH igual a 5. Sendo assim, após se estabelecer a reação do

formaldeído com 4,04 mmol L-1 de solução de 2,4-DNPH 0,4% em balão volumétrico

de 10 mL, avaliou-se a influência do pH no meio, novamente com soluções padrão

contendo 10 e 30 mg L-1, em triplicata, sendo analisadas após meia hora de reação.

As replicatas de cada solução padrão foram preparadas de dois modos

diferentes. No primeiro, a reação se processa em meio extremamente ácido (pH

próximo a 1). No segundo, com auxílio de solução de NaOH 5% (m/v), o pH do meio

foi elevado a 5, totalizando a adição de 1 mL da solução alcalina ao meio.

2.2.4.3 Tempo de repouso

A influência do tempo de repouso para a formação da hidrazona foi avaliada a

partir da construção de uma curva analítica, em triplicata, com análise

imediatamente após a mistura dos reagentes, bem como após 1 e 2 horas de

repouso. Para a curva analítica foram considerados os pontos obtidos a partir das

concentrações de 10; 20; 30; 40 e 50 mg L-1 de formaldeído.

2.2.4.4 Solubilidade da hidrazona

O estabelecimento de um volume final de 10 mL no meio reacional implica

diretamente na quantidade de hidrazona formada que pode ser solubilizada. Desta

forma, soluções padrões de formaldeído nas concentrações de 60; 80; 100; 200 e

500 mg L-1, foram avaliadas quanto à solubilização da hidrazona. Esta avaliação foi

realizada por análise qualitativa, observando-se a formação ou não de precipitado no

meio. Todas as concentrações foram preparadas em triplicata._____________________________Dissertação de Mestrado Fernanda R. R. Maidana –UNISC - 2008

36

2.2.5 Avaliação da lineariedade de resposta do método analítico proposto

Objetivando a quantificação de formaldeído em amostras do efluente gerado

em Laboratórios de Anatomia, a lineariedade de resposta da área do pico

cromatográfico em função da concentração de formaldeído no meio, foi avaliada

experimentalmente. Para tanto, amostras sintéticas nas concentrações de

formaldeído de 0,05; 0,1; 0,5; 1,0; 5,0; 50,0; 60,0; 70,0; 80,0 e 100 mg L-1 foram

preparadas. Em seguida, as mesmas foram levadas para derivatização, nas

condições analíticas determinadas e injetadas no sistema CLAE para a

quantificação. As áreas, referentes a cada concentração de formaldeído, foram

inseridas na equação da reta da curva analítica traçada, com a finalidade de

comparar o teor real de formaldeído com o teórico da amostra sintética.

2.3 Aplicação do método proposto em amostras sintéticas

Após a otimização das condições analíticas para a determinação de

formaldeído por CLAE, precedido de reação de derivatização com 2,4-DNPH, as

mesmas foram aplicadas para a quantificação de formaldeído em amostras

sintéticas, com objetivo de comparar a concentração teórica de formaldeído na

amostra, com a encontrada. As amostras sintéticas foram preparadas nas

concentrações de 40, 60 e 80 mg L-1, bem como de 15 g L-1. Para a reação de

derivatização em balão volumétrico de 10 mL foram empregadas, isoladamente,

alíquotas de 1, 2 e 5 mL de cada amostra sintética preparada. Em seguida, as

alíquotas foram acrescidas de 4,04 mmol L-1 de solução de 2,4-DNPH 0,4%, 1 mL de

solução de NaOH 5%, tendo o volume completado com metanol para 10 mL, em

balão volumétrico. Após, a solução formada foi agitada manualmente por 1 minuto e

colocada, sob proteção de luz, para completar a reação por um período de uma

hora. Ao término do tempo de repouso (uma hora), as amostras foram levadas para


37

análise cromatográfica, empregando-se as condições instrumentais descritas no

item 2.2.4.

Para a amostra sintética na concentração de 15 g L-1 um fator de diluição na

ordem de 250 e 500 vezes foi testado.

2.4 Aplicação do método analítico proposto em amostras reais

Com o intuito de quantificar o formaldeído no efluente gerado no Laboratório

de Anatomia, este foi recolhido durante o preparo e manutenção dos cadáveres nas

mesas quando do emprego nas aulas das disciplinas de Anatomia. Esta amostra

real consiste na lixívia resultante da umidificação dos lençóis que recobrem os

cadáveres no Laboratório de Anatomia da UNISC. As referidas amostras foram

coletadas, em baldes de 3 litros, em duas mesas de uma das salas de estudo

(Laboratório de Práticas Anatômicas I e II) e utilizadas nos ensaios, sendo

nomeadas por Amostra 1 e Amostra 2.

Para a análise das referidas amostras, uma alíquota de 1 mL foi transferida

volumetricamente para balão volumétrico de 250 mL, tendo seu volume completado

com água destilada/deionizada. A partir das amostras diluídas, alíquotas de 2 mL e

de 5 mL, em triplicata, foram transferidas para balão volumétrico de 10 mL, sendo

acrescidas de 2 mL de solução de 2,4-DNPH, 1 mL de solução de NaOH 5% e

metanol até atingir a marca do balão. Após a homogeneização do meio e repouso

por uma hora ao abrigo da luz, as amostras preparadas foram levadas para análise

em sistema CLAE, empregando as condições instrumentais de análise descritas no

item 2.2.4.

Ainda nesta etapa, as amostras de efluente dos Laboratórios de Anatomia

foram fortificadas com formaldeído na concentração de 5 g L-1. Estas amostras

fortificadas foram analisadas nas mesmas condições de análise descritas

anteriormente e os resultados obtidos foram comparados.


38


39

3 RESULTADOS E DISCUSSÃO

3.1 Características do local de estudo

O início do trabalho se deu com uma pesquisa e visita ao Laboratório de

Anatomia da Universidade de Santa Cruz do Sul. A caracterização do local de

estudo envolveu um levantamento do cotidiano e das atividades desenvolvidas, o

qual realizou-se através de visitas técnicas e questionamentos aos funcionários.

As visitas realizadas ao laboratório de anatomia tiveram como objetivo tomar

conhecimento das instalações, atividades, descarte de efluentes e resíduos. Assim,

foi possível avaliar o fluxo do formaldeído, utilizado como conservante de cadáveres,

dentro do estabelecimento que foi foco deste estudo em busca de uma ferramenta

que viabilize a sua quantificação.

Segundo os funcionários dos laboratórios, os cadáveres que chegam a

universidade passam por um processo de formolização, que consiste em injetar no

cadáver uma solução formada pela combinação de formaldeído, glicerina, álcool,

fenol e água destilada. Após este estágio, os corpos são imersos em tanques

contendo solução de formaldeído, permanecendo imersos por um período de 30

dias. Ao término deste período, o cadáver já pode ser utilizado para aulas práticas

das disciplinas de anatomia.

Nas salas de estudo, os corpos ficam dispostos sobre bancadas onde podem

permanecer durante 15 a 20 dias. Para garantir a conservação, os cadáveres são

cobertos por um lençol que é umidificado com água três vezes por turno, gerando

deste modo um efluente com teores significativos de formaldeído.

A Universidade possui em seu Laboratório de Anatomia, dois tanques

contendo aproximadamente 4.600 litros de solução de formaldeído, que é trocada,


40

em média, a cada cinco anos, sendo a solução recolhida por uma empresa

terceirizada.

As quatro salas de estudo dos Laboratórios de Anatomia são destinadas aos

cursos de medicina, enfermagem, fisioterapia, farmácia, educação física entre

outros. Os alunos ao iniciarem suas atividades participam de uma aula inaugural

com o objetivo de conhecer o funcionamento, procedimentos padrões, equipamentos

de segurança e medidas de emergência.

Apartir dos dados obtidos durante a visita aos Laboratórios de Anatomia da

Universidade, foi possível observar os principais pontos geradores de formaldeído,

apresentados no esquema da Figura 7. No entanto, é importante salientar que existe

uma preocupação com o efluente proveniente das águas de umidificação via lixívia

de cadáveres e da lavagem de materiais que são descartados na fossa séptica

situada ao lado do laboratório.


41

Figura 7 – Principais pontos geradores de formaldeído nos Laboratório de Anatomia da UNISC.

A visita realizada revelou que os Laboratórios de Anatomia, através de suas

práticas, representam uma fonte poluidora em potencial, devido à utilização de

produtos químicos tóxicos em grande quantidade. No entanto, foi possível perceber

que existe uma preocupação no que se refere ao gerenciamento dos resíduos, bem

como com a saúde dos profissionais, professores e estudantes.


Tanque de conservação de

cadáveres

Sala de estudos

(mesa de exposição)

Umidificação Lavagem de material

Efluente (formaldeído)

Fossa Séptica

42

3.2 Resultados obtidos na otimização das condições analíticas para determinação de formaldeído por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

De um modo geral, os aldeídos não apresentam boa detectabilidade perante

os detectores normalmente empregados em análises cromatográficas, sendo assim,

importante a utilização de uma reação de derivatização, tornando o aldeído

detectável. Dentre os trabalhos encontrados na literatura envolvendo a separação e

quantificação de aldeídos, bem como de cetonas, a maioria emprega a técnica de

derivatização com 2,4-DNPH seguida de separação cromatográfica (CHI, et al, 2006;

SANDNER, et al.2001; CORDIS, G.A.; DAS, D.K.; RIEDEL, W., 1998).

Medidas de absorção baseadas em radiação ultravioleta encontram vasta

aplicação para identificação e determinação de uma vasta gama de espécies

inorgânicas e orgânicas. Os métodos de absorção molecular talvez sejam os mais

amplamente usados dentre todas as técnicas de analise quantitativas em

laboratórios químicos e clínicos em todo o mundo. A espectrofotometria na região

UV-VIS do espectro eletromagnético é uma das técnicas analíticas mais

empregadas, em função de robustez, custo relativamente baixo e grande número de

aplicações desenvolvidas. Os procedimentos envolvem medidas diretas de espécies

que absorvem radiação, medidas após derivação química e acoplamento a diversas

técnicas ou processos, como cromatografia, eletroforese e análises em fluxo. Além

disso, constituem-se em uma importante ferramenta para determinação de

parâmetros fisico-químicos, tais como constantes de equilíbrio e de velocidade de

reações. Porém, para o estudo em questão, a espectroscopia não se mostrou eficaz,

pois a absorbância do produto formado pela reação entre formaldeído e o

derivatizante 2,4-DNPH, absorviam em um mesmo comprimento de onda, o que

impossibilitava a quantificação.

Deste modo, a determinação de formaldeído foi realizada com um sistema

CLAE, empregando detector UV-Vis, após sua derivatização com 2,4-DNPH. O

emprego da CLAE permitiu a separação entre a hidrazona formada a partir da

reação do formaldeído com o 2,4-DNPH e o próprio derivatizante adicionado em

excesso na reação. A Figura 8 representa a separação cromatográfica entre a


43

hidrazona e o 2,4-DNPH, obtida com uso de coluna C18 como fase estacionária, fase

móvel metanol-água (75:25) com vazão de 1 mL min-1 e detector em comprimento de

onda de 365 nm. A escolha das condições instrumentais de análise foi baseada nos

trabalhos publicados por Sandner e colaboradores (2001), Liu e colaboradores

(2005) e Abrantes e colaboradores (2005), com substituição do solvente orgânico

acetonitrila por metanol na composição da fase móvel. Todas as soluções padrão e

amostras analisadas foram filtradas através de um sistema Millipore com auxílio de

filtros de 0,45 nm antes da injeção no sistema cromatográfico.

Figura 8 – Cromatograma obtido na separação entre 2,4-DNPH (1) e hidrazona (2) a partir de solução de formaldeído 10 mg L-1. Condições: coluna C18, fase móvel metanol-água (75:25), vazão 1 mL min-1

e detector com comprimento de onda em 365 nm.

Adicionalmente, o cromatograma da Figura 9 demonstra o consumo de

2,4-DNPH decorrente do aumento de formaldeído no meio, o que é visualizado pelo

decréscimo no pico cromatográfico (1) em função do aumento no sinal

cromatográfico (2), demonstrando que a área do pico formado pelo produto de

reação do formaldeído é inversamente proporcional à área do pico relativo ao

reagente 2,4-DNPH, corroborando as afirmações descritas por Zampieri (2005) que

empregaram o mesmo método para estudar a ligação cruzada induzida pela

presença de formaldeído em cápsulas de gelatina dura.


1

2

44

Figura 9 – Cromatograma obtido na separação entre 2,4-DNPH (1) e hidrazona (2) a partir de solução de formaldeído 50 mg L-1. Condições: coluna C18, fase móvel metanol-água (75:25), vazão 1 mL min-1

e detector com comprimento de onda em 365 nm.

Os cromatogramas apresentados nas Figuras 8 e 9 demonstram que as

condições instrumentais empregadas proporcionam uma boa resolução

cromatográfica viabilizando a separação entre o derivatizante 2,4-DNPH, com tempo

de retenção (tR) próximo a 4,5 minutos, e, o formaldeído derivatizado, com tR de 7

minutos.

Por outro lado, estes mesmos cromatogramas (Figuras 8 e 9) foram obtidos

testando-se uma curva analítica com concentrações de formaldeído de 10; 20; 30;

40 e 50 mg L-1, preparadas em balão volumétrico de 10 mL e adicionadas de

2,02 mmol L-1 de solução de 2,4-DNPH 0,4% (m/v). A análise cromatográfica foi

realizada cerca de 30 minutos após a reação. Os resultados obtidos para esta

condição reacional não apresentaram uma boa lineariedade de resposta entre

concentração e área do pico da hidrazona formada, com um coeficiente de

correlação inferior a 0,98. Desta forma, fatores como volume de solução de

2,4-DNPH adicionado, pH do meio e tempo de repouso foram estudados. A

concentração da solução de 2,4-DNPH foi mantida em 0,4% (m/v) de acordo com

metodologia descrita por Nascimento e colaboradores (1998). Estes autores


45

empregaram a Cromatografia Líquida de Alta Eficiência para a avaliação dos teores

de aldeídos em bebidas alcoólicas.

Com o intuito de minimizar o volume de resíduos gerados, estabeleceu-se o

emprego de balões volumétricos de 10 mL no preparo da curva analítica, bem como

das amostras a serem analisadas. Desta forma, neste volume máximo limitado,

avaliou-se o emprego dos volumes de 1 e 2 mL, o que correspondia

respectivamente a concentração de 2,02.10-5 e 4,04.10-5 mmol L-1 da solução

derivatizante no meio reacional . Nesta etapa, manteve-se ainda um tempo de

reação de 30 minutos. A definição do volume de derivatizante adicionado foi

baseada nas medidas de áreas obtidas após a análise cromatográfica de soluções

padrão de formaldeído nas concentrações de 10 e 30 mg L-1, em triplicata, onde

todos os resultados demonstraram um aumento significativo de área quando do

emprego da concentração de 4,04.10-5 mol de solução de 2,4-DNPH (Figura 10). A

Figura 10 corresponde as áreas obtidas para a análise de soluções padrões a

10 mg L-1, enquanto o gráfico da Figura 11 representa os resultados obtidos quando

do emprego de soluções em concentração 30 mg L-1.

Figura 10 – Áreas obtidas quando ao emprego de 2,02.10-5 e 4,04.10-5 mmol L-1 da solução de 2,4-DNPH 0,4% para análise em triplicata de soluções padrão de formaldeído 10 mg L-1 .


46

Figura 11 – Áreas obtidas quando ao emprego de 2,02.10-5 e 4,04.10-5 mmol L-1 da solução de 2,4-DNPH 0,4% para análise em triplicata de soluções padrão de formaldeído 30 mg L-1.

A análise dos gráficos da Figura 10 e 11 demonstram a mesma tendência

reacional descrita por Zegotta (1999), onde o autor comenta que os melhores

resultados foram obtidos para uma razão molar DNPH/formaldeído superior a 5.

Desta forma, a utilização de 1 ml da solução de 2,4-DNPH correspondente a

concentração molar de 2,02.10-5 mmol L-1 caracteriza a falta de solução derivatizante

no meio reacional para a formação de hidrazona.

Quanto ao estudo do efeito do pH no meio reacional, o mesmo foi elevado a

pH próximo a 5 com a adição de um volume de 1 mL de solução de NaOH 5%. Os

resultados obtidos a partir das análises cromatográficas das soluções padrão de 10

e 30 mg L-1, após meia hora de reação, demonstram que a reação de derivatização

do formaldeído é mais favorecida em pH 5. De fato, nos ensaios realizados por

Teles e colaboradores (2002) para a determinação de formaldeído empregando

resinas com 2,4-DNPH para o clean up do formaldeído e posterior determinação

cromatográfica, os autores observaram nos ensaios de fortificação que a adsorção

do formaldeído na resina é mais efetiva em pH 5, meio no qual a reação ocorre mais

efetivamente.

O tempo de repouso para a formação da hidrazona foi avaliado a partir da

construção de uma curva analítica, em triplicata, com análise imediatamente após a _____________________________Dissertação de Mestrado Fernanda R. R. Maidana –UNISC - 2008

47

mistura dos reagentes, bem como após 1 e 2 horas de repouso. Nesta etapa,

avaliou-se também a estabilidade da hidrazona formada por um período de 24

horas, uma vez que segundo Stafiej e colaboradores (2006), o emprego de um

tempo de reação de 30 minutos até 24 horas, a temperatura ambiente, garante boa

reprodutibilidade de resultados. As Tabelas 2 e 30 apresentam as áreas obtidas para

cada uma das replicatas analisadas, partindo-se das concentrações de 10; 20; 30;

40 e 50 mg L-1 de formaldeído, considerando-se, respectivamente, a análise imediata

e o tempo de reação de uma hora.

Tabela 2 – Áreas e desvio-padrão relativo (DPR%) na análise das replicatas imediatamente após o início de reação entre formaldeído e 2,4-DNPH.

Formaldeído (mg L-1)

Área (replicata 1)

Área (replicata 2)

Área (replicata 3)

Área média DPR (%)

10 657495 1077476 815454 850142 20,420 487985 753666 563215 601622 31,830 1134048 1135929 1200430 1156802 22,240 1075434 1780098 1380515 1412016 25,150 1376144 1811804 2012304 1733417 25,8

Tabela 3 – Áreas e desvio-padrão relativo (DPR%) na análise das replicatas após tempo de repouso, entre formaldeído e 2,4-DNPH, de 1 hora.

Formaldeído (mg L-1)

Área (replicata 1)

Área (replicata 2)

Área (replicata 3)

Área média

DPR (%)

10 1254828 1355915 1445916 1352220 5,820 2186111 2221224 2251334 2219556 1,230 4324448 3391793 3425238 3713826 11,640 4657258 4549340 4574513 4593704 1,050 5676860 5600019 5627143 5649674 0,6

Os resultados apresentados nas Tabelas 2 e 3 demonstram que a reação de

derivatização do formaldeído ocorre de maneira gradativa o que é confirmado pelas

áreas mais elevadas, observadas em todas as replicatas após uma hora de reação.

Ainda, na Tabela 3 são observados valores de desvio-padrão relativo inferiores aos

apresentados na Tabela 2, indicando possivelmente uma maior estabilidade de

reação. Outro fator que demonstra a necessidade de um tempo maior de reação é o

coeficiente de correlação obtido a partir da construção das curvas analíticas a partir _____________________________Dissertação de Mestrado Fernanda R. R. Maidana –UNISC - 2008

48

da média das áreas obtidas em cada replicata. As Figuras 12 e 13 apresentam,

respectivamente, as curvas analíticas para análise do formaldeído imediatamente e

após 1 hora de repouso para a derivatização.

Figura 12 – Curva analítica para o formaldeído com análise cromatográfica imediatamente após reação entre formaldeído e 2,4-DNPH.

Figura 13 – Curva analítica para o formaldeído com análise cromatográfica após uma hora de repouso entre formaldeído e 2,4-DNPH.

Por outro lado, o tempo de duas horas de repouso não demonstrou um

aumento de área para as análises quando comparadas às áreas obtidas para uma

hora de repouso. A Tabela 4 apresenta a área obtida para soluções padrão de

formaldeído nas concentrações de 10; 20; 30; 40 e 50 mg L-1, considerando-se duas


49

horas de repouso em comparação com a média das áreas obtidas quando do

emprego de uma hora de repouso.

Tabela 4 – Áreas obtidas para a análise das soluções padrão de formaldeído após 2 horas de repouso com 2,4-DNPH e média das áreas após 1 hora de repouso.

Formaldeído (mg L-1) Área média após 2h de repouso

Área média após 1h de repouso

10 1376276 135222020 2409570 221955630 3908457 371382640 4656388 459370450 5752502 5649674

Os resultados apresentados na Tabela 4 demonstram que valores de área

muito próximos aos de uma hora de repouso foram obtidos, caracterizando que a

reação entre 2,4-DNPH e formaldeído, nas concentrações estudadas, se completa

em um período máximo de uma hora. No entanto, a curva analítica obtida nesta

última situação, com coeficiente de correlação de 0,991 indica uma reação com

formação de um derivatizado estável, viabilizando sua quantificação após duas

horas de repouso, permitindo deste modo, uma análise em batelada. A Figura 14

apresenta a curva analítica obtida após duas horas de repouso entre analito e

derivatizante.


50

Figura 14 – Curva analítica para o formaldeído com análise cromatográfica após duas horas de repouso entre formaldeído e DNPH.

Condições semelhantes foram empregadas por Velikonja e colaboradores

(1995) que num estudo empregaram um tempo de 1 hora de repouso entre

2,4-DNPH e formaldeído, antes de sua determinação por CLAE. Neste estudo, os

autores compararam as técnicas cromatográficas e espectrofotométricas para a

determinação de formaldeído em água, demonstrando a necessidade da separação

cromatográfica para a eliminação de interferentes antes de sua quantificação. Do

mesmo modo, Nascimento e colaboradores (1998) estabeleceram um tempo mínimo

de 45 minutos de reação de derivatização para a determinação de aldeídos em

bebidas alcoólicas. Assim, estabeleceu-se para o estudo proposto a análise do

formaldeído, na forma de 2,4-dinitrofenilhidrazona, após no mínimo uma hora de

repouso.

A avaliação da solubilização da hidrazona formada, em presença de metanol,

foi feita visualmente. Foram testadas soluções padrões de formaldeído nas

concentrações de 60; 80; 100; 200 e 500 mg L-1, preparadas em balão volumétrico

de 10 mL, adicionadas de 4,04 mmol L-1 de solução de 2,4-DNPH 0,4%, 1 mL de

NaOH 5% e completou-se o volume com metanol. A Figura 15 apresenta as

hidrazonas formadas, onde em (a) tem-se uma hidrazona completamente

solubilizada no meio e, em (b) a formação de um produto em suspensão. As

concentrações de 60 – 80 e 100 mg L-1 estão representadas em (a) e as de 200 e

500 mg L-1, em (b).


(a) (b)

51

Figura 15 – Hidrazona, formada devido à reação de formaldeído com 2,4-DNPH, solúvel (a) e insolúvel (b) em metanol.

3.3 Lineariedade de resposta do método analítico proposto

A linearidade do método, visando à quantificação de amostras reais em

concentrações variadas foi determinada experimentalmente, uma vez que os limites

de detecção e quantificação são associados às flutuações da linha de base dos

cromatogramas. No entanto, existem outras variáveis que interferem diretamente na

quantificação do formaldeído. Dentre estas, pode-se citar a razão do sinal

cromatográfico entre o 2,4-DNPH e a hidrazona, bem como a proporção molar entre

o derivatizante e o formaldeído, que segundo Zegota (1999) deve ser de 1:40,

respectivamente, 2,4-DNPH e formaldeído. Assim, amostras sintéticas foram

preparadas em concentrações variadas de formaldeído, como 0,05; 0,1; 0,5; 1,0;

5,0; 50,0; 60,0; 70,0; 80,0 e 100 mg L-1 e derivatizadas com 2,4-DNPH nas

condições analíticas otimizadas e analisadas por sistema CLAE, em triplicata. Após,

as áreas obtidas, foram levadas à curva analítica e a concentração real da amostra

sintética foi calculada. A Tabela 5 apresenta os resultados obtidos.

Tabela 5 – Resultados obtidos na quantificação de formaldeído em amostras sintéticas.

AmostraFormaldeído determinado

(mg L-1)

Média formaldeído determinado

(mg L-1)

Formaldeído teórico(mg L-1)

DPR* (%)


52

10,81,41,2

1,1 1,0 10,0

24,84,55,3

4,9 5,0 2,0

344,547,750,1

47,4 50,0 5,5

457,157,358,0

57,5 60,0 4,2

569,571,267,8

69,5 70,0 0,7

672,872,371,4

72,2 80,0 9,8

771,572,070,9

71,5 100,0 28,5

*DPR: desvio-padrão relativo em relação ao teórico

As amostras de 0,05 a 0,5 mg L-1 não foram quantificadas apesar do sinal

analítico obtido, uma vez que a substituição de suas áreas obtidas na equação da

reta origina um valor de “x” negativo, incompatível com a quantificação. Por outro

lado, as amostras sintéticas com concentrações superiores a 70 mg L-1 não

apresentaram aumento de área do pico cromatográfico, proporcional à concentração

esperada. Deste modo, a resposta de concentração do analito para as condições

otimizadas é linear na faixa de 1 a 70 mg L-1. Esta faixa estreita de lineariedade de

resposta pode ser justificada por motivos distintos. Quando o formaldeído está

presente em concentrações baixas, a concentração de 2,4-DNPH excedente na

reação de derivatização é grande, gerando um pico cromatográfico de área bastante

elevada. Esta área induz a um erro analítico instrumental, que reflete diretamente na

área do analito. Associado a este fato, tem-se uma condição analítica, cuja reta

formada na construção da curva analítica não passa pela origem, limitando deste

modo, a quantificação de amostras. Adicionalmente, os resultados obtidos para _____________________________Dissertação de Mestrado Fernanda R. R. Maidana –UNISC - 2008

53

concentrações superiores a 70 mg L-1 indicam uma reação de derivatização

incompleta, possivelmente associado a uma quantidade insuficiente de 2,4-DNPH no

meio, reforçando a proporção mínima de 1:40, citada por Zegota (1999), o qual

ressalta a necessidade de uma razão molar para o meio reacional

DNPH/formaldeído superior a 5 .

3.4 Resultados dos ensaios com amostras sintéticas

A escolha das concentrações de 40, 60 e 80 mg L-1 para as amostras

sintéticas foi aleatória. A Tabela 6 apresenta as concentrações de formaldeído

encontradas quando da aplicação das condições analíticas otimizadas em relação

ao referencial teórico de cada amostra sintética preparada. Todas as amostras

sintéticas analisadas foram realizadas em triplicata para cada uma das alíquotas

empregadas.

Tabela 6 – Resultados obtidos na quantificação de formaldeído nas amostras sintéticas de 40, 60 e 80 mg L-1.

Ainda, conforme os resultados apresentados na Tabela 6 pode-se afirmar que

as reações de derivatização ocorrem de maneira constante para cada uma das

alíquotas testadas, uma vez que os desvios apresentados não superam o valor de

10% em nenhuma das alíquotas. No entanto, observa-se que nos ensaios realizados

a partir do emprego da alíquota de 5 mL foram encontrados teores reais muito _____________________________Dissertação de Mestrado Fernanda R. R. Maidana –UNISC - 2008

Formaldeído teórico (mg L-1)

Formaldeído (mg L-1) a partir de 1 mL



40 39,7 ± 3,1 40,6 ± 2,5 39,5 ± 3,560 61,3 ± 1,8 60,2 ± 1,5 41,6 ± 3,980 80,5 ± 2,3 82,1 ± 2,4 42,0 ± 2,8

54

distantes dos teóricos esperados. Este fato, deve estar associado ao não

cumprimento da razão molar formaldeído/DNPH superior a 5 mencionada por

Zegotta (1999).

Os ensaios empregando uma amostra sintética com concentração igual a

15 g L-1 de formaldeído demonstraram a aplicabilidade das condições analíticas. No

entanto, teores mais elevados de formaldeído sugerem a necessidade de diluição da

amostra, buscando manter a participação do reagente derivatizante em excesso na

reação. O intuito de simular o emprego de amostras mais concentradas busca refletir

uma situação real do efluente gerado nos Laboratórios de Anatomia, onde a

concentração de formaldeído é inicialmente elevada e vai diminuindo à medida que

umidificações são feitas nos cadáveres.

Quando a amostra sintética de concentração igual a 15 g L-1 foi diluída a um

fator de 250 vezes, sua real concentração em formaldeído deveria se aproximar de

60 mg L-1. Os resultados obtidos quando do emprego das alíquotas de 1, 2 e 5 mL

após a diluição da amostra sintética são apresentados na Tabela 7.

Tabela 7 – Teores de formaldeído (mg L-1) para cada replicata realizada nas alíquotas de 1, 2 e 5 mL avaliadas, com diluição num fator de 250 vezes.

Replicata Formaldeído (mg L-1) a partir de 1 mL



1 58,74 68,19 62,32

2 56,30 66,05 62,54

3 54,32 68,37 62,43

O mesmo comportamento repetiu-se quando a diluição foi de 500 vezes, onde

os resultados deveriam aproximar-se da concentração de 30 mg L-1, conforme

Tabela 8.

TABELA 8: Teores de formaldeído (mg L-1) para cada replicata realizada nas alíquotas de 1, 2 e 5 mL avaliadas, com diluição num fator de 500 vezes.

Replicata Formaldeído (mg L-1) Formaldeído (mg L-1) Formaldeído (mg L-1) _____________________________Dissertação de Mestrado Fernanda R. R. Maidana –UNISC - 2008

55

a partir de 1 mL a partir de 2 mL a partir de 5 mL

1 15,10 25,36 28,77

2 11,84 24,85 28,37

3 15,85 25,83 28,56

Para amostras com teores mais elevados de formaldeído, como os efluentes

gerados na lixiviação dos cadáveres em Laboratórios de Anatomia, os resultados

obtidos nos ensaios apresentados sugerem o emprego de alíquotas de 2 e 5 mL

para a reação de derivatização.

3.5 Análise de amostras oriundas do Laboratório de Anatomia

As amostras, denominadas de Amostra 1 e Amostra 2, coletadas nos

Laboratórios de Anatomia foram submetidas as condições analíticas previamente

estabelecidas. As mesmas foram diluídas a um fator de 250 vezes e alíquotas de

2 mL e 5 mL foram submetidas à reação de derivatização com posterior

determinação cromatográfica.

Os resultados obtidos na quantificação de formaldeído na Amostra 1,

considerando o uso de alíquotas de 2 e 5 mL, são apresentados na Tabela 9.

Tabela 9 – Teores de formaldeído (g L-1) da Amostra 1, oriunda do efluente do Laboratório de Anatomia, a partir da análise de alíquotas de 2 e 5 mL.

Alíquota (g L-1) replicata 1

(g L-1) replicata 2

(g L-1) replicata 3

Teor Médio (g L-1)

2 mL 20,2 19,3 19,8 19,8 ± 0,4

5 mL 21,2 20,7 20,9 20,9 ± 0,2


56

A análise dos resultados apresentados na Tabela 9 permite inferir que o

efluente gerado nos Laboratórios de Anatomia pelo processo de lixiviação de

cadáveres dispostos em mesas para as aulas dos cursos de graduação, representa

um grave risco ao meio ambiente, apresentando elevados teores de formaldeído.

Contudo, considerando que a Amostra 1 corresponde ao primeiro balde recolhido no

processo de lixiviação, pode-se assegurar que as demais amostras do mesmo

cadáver apresentam a tendência de diminuição de formaldeído no meio.

Por outro lado, os resultados obtidos na análise da Amostra 2, originada da

segunda coleta no Laboratório de Anatomia, demonstram que a lixiviação vai

diminuindo o teor de formaldeído no efluente. Esta diminuição é demonstrada nos

resultados apresentados na Tabela 10.

Tabela 10 – Teores de formaldeído (g L-1) da Amostra 2, oriunda do efluente do Laboratório de Anatomia, a partir da análise de alíquotas de 2 e 5 mL.

Alíquota (g L-1) replicata 1

(g L-1) replicata 2

(g L-1) replicata 3

Teor Médio (g L-1)

2 mL 14,9 13,8 13,9 14,2 ± 0,5

5 mL 13,2 14,7 13,8 13,9 ± 0,6

Os resultados apresentados nas Tabelas 9 e 10 demonstram que alíquotas de

2 mL, bem como de 5 mL, podem ser empregadas na metodologia em amostras

previamente diluídas a um fator de 250 vezes conforme cromatograma da FIGURA

16, cujo teor de formaldeído esteja compreendido na faixa 14 a 20 g L-1.


57

Figura 16 – Cromatograma obtido na separação entre 2,4-DNPH (1) e hidrazona (2) a partir de análise de amostra oriunda do laboratório de anatomia, utilizando-se um fator de diluição igual a 250 vezes. Condições: coluna C18, fase móvel metanol-água (75:25), vazão 1 mL min-1 e detector com comprimento de onda em 365 nm.

Adicionalmente, as amostras 1 e 2 cujos teores de formaldeído foram

apresentados anteriormente foram fortificadas com quantidade suficiente de

formaldeído para representar um incremento de 5 g L-1 de formaldeído em cada uma

das amostras. Assim, teoricamente a Amostra fortificada 1 deveria apresentar em

média uma concentração de formaldeído de 25 g L-1, e a amostra fortificada 2, de

19 g L-1. As amostras fortificadas foram diluídas a um fator de 250 vezes e

analisadas a partir de uma alíquota de 2 mL. A Tabela 11 apresenta os resultados

obtidos, bem como o percentual de recuperação de formaldeído em relação ao valor

teórico esperado.

Tabela 11 – Teores de formaldeído (g L-1) das Amostras fortificadas 1 e 2.Amostra

fortificada (g L-1)

replicata 1 (g L-1)

replicata 2 (g L-1)

replicata 3 Teor Médio (g L-1) Recuperação (%)

1 25,8 24,9 26,1 25,6 ± 0,5 102,4

2 17,6 18,8 17,8 18,1 ± 0,5 95,3

Os percentuais de recuperação de 102,4 e 95,3%, respectivamente, para as

amostras fortificadas 1 e 2, demonstram que as condições analíticas otimizadas são

viáveis para serem empregadas no controle do teor de formaldeído residual nos

efluentes gerados em Laboratórios de Anatomia. Em comparação, Mateos e

colaboradores (2005) descreveram percentuais de recuperação de 96,3 a 99,8 %

para o malondialdeído em um trabalho de validação de metodologia analítica para a

determinação do referido analito em amostra de plasma humano, por CLAE, após

derivatização com 2,4-DNPH. Rodgher e colaboradores (2006) em um estudo _____________________________Dissertação de Mestrado Fernanda R. R. Maidana –UNISC - 2008

58

eletroquímico do produto da derivatização de acetaldeído com sulfato de hidrazina

em meio aquoso sobre eletrodo de mercúrio utilizando-se a técnica de voltametria de

onda quadrada, visando investigar a potencialidade do método eletroanalítico para

sua determinação apresentaram percentuais de recuperação de 95 a 101% para a

análise de amostras fortificadas, enquanto Chi e colaboradores (2006) obtiveram

percentuais de recuperação de 90 a 104 % em metodologia aplicada para a

determinação de 32 compostos carbonílicos em ar atmosférico, após derivatização

com 2,4-DNPH, de uma área residencial da China.

Ainda, estes mesmos percentuais demonstram que o fenol e outros reagentes

possivelmente presentes nas amostras dos efluentes não apresentam risco de

interferência no processo analítico.


59

CONSIDERAÇÕES FINAIS

A utilização do formaldeído em Laboratórios de Anatomia apresenta impactos

ambientais, no que se referem às etapas pela qual o produto é submetido, ocorrendo

desta forma, impactos relacionados ao ar, emissão de efluentes na formalização,

além de exposição de peças anatômicas em aulas práticas.

A metodologia para quantificação do formaldeído através da 2,4 DNPH por

Cromatografia Líquida de Alta Eficiência se mostrou eficaz, quando empregada de

forma a combinar o tempo de repouso da reação entre formaldeído e

2,4-dinitrofenilhidrazina em 1 horas, como também, manter o meio reacional com

pH = 5, além de manter uma proporção molar entre derivatizante e derivatizado

através da concentração de 2,4-dinitrofenilhidrazina no meio reacional.

Observando as atividades no Laboratório de Anatomia, percebe-se a

necessidade de um maior controle na utilização de águas para a umidificação dos

cadáveres, como também na lavagem de utensílios contendo residual de

formaldeído, evidenciando a importância de métodos que auxiliem na quantificação

do formaldeído em processos de degradação do mesmo.

Os teores de formaldeído detectados no efluente do Laboratório de Anatomia,

gerado pelo processo de lixiviação de cadáveres representam um grave risco ao

meio ambiente devido as altas concentrações de formaldeído encontradas no meio.

Porém, quando as amostras foram fortificadas, percentuais de recuperação de 102,4

e 95,3%, foram encontrados, demonstrando que as condições analíticas otimizadas

são viáveis para serem empregadas no controle do teor de formaldeído residual nos

efluentes gerados em Laboratórios de Anatomia.


60

Com base nos resultados obtidos neste trabalho foi possível concluir que a

metodologia empregada se mostrou efetiva na quantificação do formaldeído, As

condições experimentais foram otimizadas demonstrando que existe estabilidade

tanto do reagente de derivatização quanto do analito, permitindo sua utilização em

condições laboratoriais usuais. Nestas condições experimentais, o método

apresentou precisão e exatidão.

Desta forma, este trabalho apresentou resultados confiáveis com utilização de

técnicas e equipamentos de fácil manejo, visando sempre à redução de poluentes

químicos, e resíduos contendo formaldeído que são considerados perigosos aos

profissionais da saúde, professores e estudantes em vista ao seu fator mutagênico e

carcinogênico.


61

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66

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ANEXOS


67

Anexo 1 – Padronização da solução de formaldeído

Para a padronização foram pipetados 50 mL da solução de formaldeído,

acrescentados 10 mL de solução de hidróxido de potássio e 20 mL de solução

padrão de iodo 0,1eq L-1 e a mistura permaneceu em repouso por 5 minutos ao

abrigo da luz. Após esse tempo, foram acrescentados 5 mL de solução de ácido

clorídrico diluído, tampando-se imediatamente o frasco e deixando-se em repouso

por mais 15 minutos ao abrigo da luz. Em seguida, o excesso de iodo foi titulado

com solução padrão de tiossulfato de sódio 0,1 eq L-1 adicionando-se o indicador

amido 0,3% quando a solução apresentava-se com a coloração levemente

acastanhada e a titulação prosseguiu até a viragem da cor da solução de violeta

para incolor.

Para cada análise, foi feito um ensaio em branco, ou seja, utilizando-se os

mesmos reagentes, sem o formaldeído, determinando-se a quantidade de tiossulfato

de sódio 0,1 eq L-1 consumida pelo iodo para que possibilitasse a determinação do

diferencial do consumo de iodo enquanto houvesse formaldeído presente na

solução. Para o cálculo da concentração de formaldeído considerou-se que cada mL

de iodo 0,1 eq L-1 consumido correspondem a 1,5013 mg de formaldeído presente

na solução.


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