Aluno: Carla SouzaTítulo: “Sistemas líquido-cristalinos de monoleína e água para veiculação de antimicrobianos com aplicabilidade bucal”Orientador: Profa. Dra. Marilisa Guimarães LaraData da Defesa: 26/03/2013

RESUMOSOUZA, C. Sistemas líquido-cristalinos de monoleína e água para veiculação de antimicrobianos com aplicabilidade bucal. 2013. 107 f. Dissertação (Mestrado). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2013.Cristais líquidos são sistemas que se apresentam em um estado intermediário entre o estado sólido e líquido. A monoleína é um lipídio polar com capacidade de formar diferentes tipos de cristais líquidos liotrópicos na presença de água, caracterizados como fase lamelar, cúbica e hexagonal. Devido à capacidade de controlar a liberação dos fármacos incorporados e às propriedades mucoadesivas, estes sistemas são considerados potenciais veículos para a liberação controlada de fármacos na mucosa bucal. Sabendo que o desenvolvimento da cárie e doença periodontal está relacionado com a formação do biofilme, é necessário seu controle e prevenção para manutenção da saúde bucal. Dentre os agentes químicos disponíveis para prevenir e/ou diminuir a formação do biofilme, cloreto de cetilpiridínio (CCP), polihexametileno biguanida (PHMB) e Triclosan® têm sido amplamente utilizados. Em vista disso, o objetivo deste estudo foi desenvolver e caracterizar sistemas líquido-cristalinos de fase lamelar e cúbica formados por monoleína e água contendo antimicrobianos com aplicabilidade bucal. Os sistemas foram desenvolvidos usando monoleína e água e os antimicrobianos avaliados foram o CCP, o PHMB e o Triclosan®. A formação das fases líquido-cristalinas com e sem a presença de cada fármaco estudado foi identificada por microscopia de luz polarizada. Além disso, foi avaliado o intumescimento dos sistemas contendo os fármacos estudados após contato com saliva artificial; a atividade antimicrobiana e o perfil de liberação in vitro, bem como o tempo de permanência e a força de mucoadesão ex vivo em mucosa de bochecha de porco. Foi possível obter os sistemas líquido-cristalinos para os fármacos avaliados, e o intumescimento de todos os sistemas foi caracterizado como cinética de segunda ordem. Os resultados do perfil de liberação e da atividade antimicrobiana in vitro para PHMB e Triclosan® foram favoráveis para aplicação bucal, no entanto, o CCP não é adequado para veiculação neste sistema. O perfil de liberação dos fármacos à partir desses sistemas foi influenciado pelas propriedades físico-químicas e concentração dos fármacos, bem como pelo intumescimento. Ainda, a fase lamelar apresentou maior tempo de permanência que a fase cúbica e a força de mucoadesão média da fase lamelar foi de 1,02 ± 0,50 N e da fase cúbica foi de 0,45 ± 0,10 N. Logo, os sistemas líquido-cristalinos de monoleína e água são um interessante veículo com potencial para liberação controlada dos antimicrobianos PHMB e Triclosan® na mucosa bucal com o objetivo de otimizar a eficácia destes fármacos.Palavras-chave: cristais líquidos, monoleína, sistemas de liberação de fármacos, administração bucal, mucoadesão, antimicrobianos.

ABSTRACTSOUZA, C.. Liquid crystalline systems formed by monoolein and water with antimicrobial agents to buccal release. 2013. 107 f. Dissertation (Master). Pharmaceutical Sciences School of Ribeirão Preto – University of São Paulo, Ribeirão Preto, 2013.Liquid crystals are systems which are in an intermediate state between solids and liquids. Monoolein is a polar lipid capable of forming different types of lyotropic liquid crystals in aqueous environment, which can be classified into lamellar, cubic and hexagonal mesophases. Due to its ability to control drug release and its mucoadhesive properties, these systems have been considerated as potential vehicle to control drug release on buccal mucosa. Based on the knowledge that the development of caries and periodontal disease is related to the biofilm formation, it is necessary their control and prevention to maintain the buccal health. Among the available chemical agents to prevent and/or reduce biofilm formation, cetylpyridinium chloride (CPC), polyhexamethylene biguanide (PHMB) and Triclosan® have been widely used. Based on these facts, the objective of this study was to develop and characterize liquid-crystalline systems formed by monoolein and water, containing antimicrobial agents with buccal applicability. The systems were developed using monoolein and water, and the antimicrobial agents evaluated were CCP, PHMB and Triclosan®. The liquid-crystalline phases with and without the presence of each drug was identified by polarized light microscopy. Furthermore, it was evaluated the swelling of the systems containing the drugs studied after contact with artificial saliva; the in vitro antimicrobial activity and its release profile, as well as the residence time and ex vivo mucoadhesion strength on pig cheek mucosa. It was possible to obtain liquid-crystalline phases for all drugs, and the swelling of all systems was characterized according to second-order kinetics. The results of release profile and antimicrobial activity in vitro to PHMB and Triclosan® were favorable for buccal application, however CCP is not suitable to be released from these systems. The drug release profile from these systems was influenced by the physicochemical properties and loading of the drugs, as well as by swelling. Furthermore, the lamellar phase showed greater residence time that the cubic phase and the mucoadhesion strength average of lamellar phase was 1.02 ± 0.50 N and for cubic phase was 0.45 ± 0.10 N. Thus, the liquid crystalline systems forming by monoolein and water are an interesting vehicle with potential to control release of the PHMB and Triclosan® on the buccal mucosa in order to optimize the drug effectiveness.Keywords: liquid crystals, monoolein, drug release systems, buccal administration, mucoadhesion, antimicrobials.

Aluno: Fernanda de Lima MoreiraTítulo: “Estudo de metabolismo in vitro do triterpeno pentacíclico amirina empregando microssomas hepático de ratos”Orientador: Prof. Dr. Anderson Rodrigo Moraes de oliveiraData da Defesa:01/03/2013

RESUMOMOREIRA, F. L. Estudo de metabolismo in vitro do triterpeno pentacíclico amirina empregando microssomas hepático de ratos. 2013. 89 f. Dissertação (Mestrado). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto- Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2013.Os isômeros de posição do triterpeno pentacíclico amirina (alfa e beta), estão presentes em várias espécies de plantas, como a Protium spruceanum. Estas moléculas vêm mostrando várias propriedades farmacológicas importantes, como efeitos anti-inflamatórios, efeito gastroprotetor, efeito antipruriginoso, efeito antitumoral, entre outros, sendo, dessa forma, uma candidata a um novo fármaco. No entanto, o comportamento destas substâncias frente as enzimas do citocromo P450 (CYP 450) ainda não foram estudadas. Portanto, o presente trabalho tem como objetivo realizar um estudo de metabolismo in vitro com esses triterpenos, caracterizar os parâmetros cinéticos enzimáticos assim como possíveis metabólitos que possam surgir empregando microssomas hepático de ratos. Para isto, foi desenvolvido e validado um método bioanalítico para análise desses triterpenos em microssomas de ratos e análise por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas (CG-EM). Como técnica de preparação das amostras foi empregado a extração liquido-liquido utilizando hexano como solvente extrator. A metodologia para quantificação dos triterpenos em microssomas hepático foi validada de acordo com a legislação vigente para análise de fármacos em fluidos biológicos, avaliando os seguintes parâmetros: linearidade, sensibilidade, seletividade, precisão, exatidão, estabilidade e recuperação. Todos os parâmetros avaliados corroboraram com as exigências da legislação. Após validação, iniciou-se os estudos para determinação dos parâmetros cinéticos enzimáticos avaliando a variação do tempo de incubação e da concentração de proteínas microssomais no consumo dos subtratos. Utilizando a faixa linear destes experimentos foideterminada a concentração de 0,25 mg mL-1 e o tempo de incubação de 20 min, respeitando as condições de Velocidade Inicial. Em seguida, ao avaliar a variação da concentração do substrato observou-se que a cinética obtida é do tipo sigmoidal. Dessa forma, para os cálculos dos parâmetros cinéticos foi utilizado a equação de Hill, obtendo Vmax = 0,698 ± 0,022 μmol/MG proteína/min, S50 = 55,1 ± 10,5 μM e o coeficiente de Hill 2,7 ± 0,17, já os parâmetros da beta amirina foram: Vmax = 0,775 ± 0,034 μmol/mg proteína/min, S50 = 130,4 ± 42,8 μM e coeficiente de Hill 2,5 ± 0,21. A partir destes dados obteve-se o clearance intrínseco para a beta e a alfa amirina de 3,05 mL/min/kg e 6,55 mL/min/kg, respectivamente. Apesar das amirinas serem metabolizadas pelas enzimas da CYP 450, nenhum metabólito foi encontrado. Nesse trabalho, foi demostrando pela primeira vez, o comportamento das enzimas das CYP 450 de ratos frente aos produtos naturais alfa e beta amirina, no qual foi verificado um comportamento atípico, que não segue a cinética michaeliana.Palavras-chave: Cinética enzimática, Comportamento Sigmoidal, Produto Natural, Cinética não-michaeliana, Cooperativismo positivo.

ABSTRACTMOREIRA, F. L. In vitro metabolism study of the pentacyclic triterpene amyrins employing rat liver microsomes. 2013. 89 f. Master’s thesis. Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto- Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2013.The isomers of pentacyclic triterpene amyrins (alpha and beta) occurring in a variety of plants, as Protium spruceanum. These molecules have showed significant pharmacological effects, as anti-inflammatory, gastroprotective and antitumor effects. Based on that, these substances have demonstrated great potential to become new drugs. However, the metabolic behavior by employing CYP enzymes (CYP450) has not been studied yet. The aim of this work was to perform an in vitro metabolism study by using these triterpenes and to determine the enzymatic kinetic parameters and possible metabolites by employing rat liver microsomes. To perform that, a bioanalytical method was developed and validated to analysis amyrins in rat microsomes. Gas chromatography coupled with mass spectrometer (GC-MS) was applied in the analysis. Liquid-liquid extraction was used to clean the sample and hexane was used as extraction solvent. Before metabolism studies, the method was validated according to current legislation to analysis of drugs in biological fluids. The following parameters were evaluated: linearity, sensitivity, selectivity, precision, accuracy, stability and recovery. All parameters evaluated were in agreement to legislation guidelines. After validation, enzymatic kinetic parameters were determined through variation of incubation time and concentration of microsomal proteins. By using linear range, the incubation time of 20 min and microsomal protein concentration of 0.25 mg mL-1 were determined to respect V0 conditions. The enzymatic kinect results showed a sigmoidal profile. Thus, to calculate the kinetic parameters it was used the Hill equation. It was observed a Vmax = 0.698 ± 0.022 μmol/mg protein/min, S50 = 55.18 ± 10.5 μM and Hill coefficient of 2.7 ± 0.17 to alpha amyrin and a Vmax = 0.775 ± 0.034 μmol/mg protein/min, S50 = 130.4 ± 42.8 μM and Hill coefficient of 2.5 ± 0.21 to beta amyrin. The intrinsic clearance to beta and alpha amyrin was 3.05 mL/min/kg e 6.55 mL/min/kg, respectively. In spite of amyrins were metabolized by the CYP 450 enzymes, none metabolite was found. In this work, it was demonstrated, for the first time, the behavior of rat liver microsomes front to alpha and beta amyrin, in which it was observed an atypical behavior, that it does not follow the Michaelis-Menten kinetics.Keywords: Kinetic enzymatic, Sigmoidal behavior, Natural products, Nonmichaelian kinetic, Positive cooperative

Aluno: Gisele Maria MettaTítulo: “AVALIAÇÃO DE FUNGOS NA OBTENÇÃO DO METABÓLITO QUIRAL E ATIVO FEXOFENADINA”Orientador: Prof. Dr. Anderson Rodrigo Moraes de oliveiraData da Defesa:06/12/2013

RESUMO METTA, G. M. Avaliação de fungos na obtenção do metabólito quiral e ativo fexofenadina. 2013. 116f. Dissertação (Mestrado). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2013. A fexofenadina (FEX) tem sido o fármaco de primeira escolha no tratamento sintomático de manifestações alérgicas, por ser um anti-histamínico dos receptores H1 de 2ª geração não sedativo. É o metabólito ativo e quiral da terfenadina (TERF), medicamento cuja produção e comercialização foram suspensas em função dos eventos adversos apresentados. Fungos têm se apresentado como uma alternativa promissora na produção de compostos com atividade biológica. Dessa forma, o objetivo desse projeto foi avaliar a capacidade de fungos em biotransformar enantiosseletivamente a terfenadina em seu metabólito ativo, a fexofenadina empregando fungos como agentes catalisadores. Para a análise enantiosseletiva da fexofenadina foi desenvolvido um método de separação cromatográfica empregando a coluna quiral Lux® cellulose-1, fase móvel constituída de água: metanol (35:65, v/v) + 0,3% trietilamina + 0,4% ácido acético, vazão de 0,5 mL min-1, com detecção em 220nm. Duas microtécnicas de preparação de amostras foram avaliadas na extração dos analitos do meio de cultura: a microextração liquido-liquido dispersiva (DLLME) e a microextração em fase liquida empregando membranas cilíndricas ocas (HF-LPME). Entre essas, a DLLME foi a microtécnica de escolha, pois forneceu melhores resultados tais como, maior valor de recuperação, cromatogramas sem picos de possíveis interferentes, maior rapidez e facilidade de preparação das amostras. As condições otimizadas da DLLME foram: clorofórmio (300 μL) como solvente extrator, isopropanol (300 μL) como solvente dispersor. Após a formação do ponto nuvem, as amostras foram submetidas à agitação por vórtex durante 15 segundos e centrifugação durante 10 minutos a 3000 rpm. As recuperações foram de 43% para ambos enantiômeros. O método se mostrou linear na faixa de concentração 2.0 - 15.0 μg mL-1 para cada enantiômero da FEX (r > 0,990). O limite de quantificação foi de 2 μg mL-1 para os enantiômeros da FEX. Dentre os sete fungos estudados (Papulaspora immersa Hotson SS13, Penicillium crustosum VR4, Mucor rouxii, Nigrospora sphaerica SS67, Fusarium oxysporum SS50, Cunninghamella echinulata var. elegans ATCC 8688A e Cunninghamella elegans NRRL 1393 ATCC 10028B) somente o fungo Fusarium oxysporum SS50 e Cunninghamella echinulata var. elegans ATCC 8688A apresentaram potencial para biotransformação da terfenadina em fexofenadina nas condições de incubação empregadas nesse trabalho. Palavras-chave: Análise enantiosseletiva, Biotransformação, CLAE, DLLME, Fexofenadina, HF-LPME.

ABSTRACT METTA, G. M. Evaluation of fungi in obtaining chiral active metabolite fexofenadine. 2013. 116f. Dissertation (Master). Faculty of Pharmaceutical Sciences of Ribeirão Preto - University of São Paulo, Ribeirão Preto, 2013. Fexofenadine (FEX) has been the drug of choice for the symptomatic treatment of allergic manifestations, being an antihistamine H1 receptor 2nd generation non-sedating. It is the active and chiral metabolite of terfenadine (TERF), a drug whose production and marketing was suspended as a result of adverse events. Fungi have been presented as a promising alternative for the production of compounds with biological activity. Thus, the goal of this project was to evaluate the ability of fungi to biotransform asymmetric terfenadine to its active metabolite, fexofenadine using fungi as agents catalysts. For enantioselective analysis of fexofenadine a method for chromatographic separation was developed employing a chiral column Lux® cellulose -1, mobile phase water : methanol (35:65,v/v) + 0.3% triethylamine + 0.4% acetic acid, flow rate of 0.5 mL min-1, with detection at 220nm. Two sample preparation microtechnology were evaluated in the extraction of analytes from the culture medium: the dispersive liquid-liquid microextraction (DLLME) and hollow fiber liquid phase microextraction (HF- LPME). Between the two, the DLLME was the microtechnic chosen because it provided better results such as higher recovery values, chromatograms with no possible interfering peaks, greater speed and ease of sample preparation. The optimized conditions of DLLME were: chloroform (300 μL) as extractor solvent, isopropanol (300 μL) as disperser solvent. After the formation of the cloud point, the samples were subjected to agitation by vortexing for 15 seconds and centrifuging for 10 minutes at 3000 rpm. The recoveries were 43 % for both enantiomers. The method was linear in the concentration range from 2.0 -15.0 μg mL-1 for each enantiomer of FEX (r > 0.990). The limit of quantification was 2 μg mL-1 for the enantiomers of FEX. Among the seven fungi studied (Papulaspora immersa Hotson SS13, Penicillium crustosum VR4, Mucor rouxii, Nigrospora sphaerica SS67, Fusarium oxysporum SS50, Cunninghamella echinulata var. elegans ATCC 8688A e Cunninghamella elegans NRRL 1393 ATCC 10028B), only the fungi Fusarium oxysporum SS50 e Cunninghamella echinulata var. elegans ATCC 8688A showed potential for biotransformation of terfenadine in fexofenadine in the incubation conditions employed in this work. Keywords: Biotransformation, DLLME, Enantioselective analysis, Fexofenadine, HF-LPME, HPLC.

Aluno: Jennifer Michiko Chauca YokoyaTítulo: “Análise enantiosseletiva da fluvastatina em plasma por eletroforese capilar”Orientador: Prof. Dr. Cristiane Masetto de GaitaniData da Defesa:04/09/2013

RESUMOYOKOYA, J.M.C. Análise enantiosseletiva da fluvastatina em plasma por eletroforese capilar. 2013. 100 f. Dissertação (Mestrado). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto - Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2013.Atualmente, as doenças cardiovasculares constituem as principais causas de morte no Brasil e no mundo. As estatinas são consideradas os agentes mais efetivos e mais bem tolerados para o tratamento do aumento excessivo dos níveis de colesterol no sangue, ou hipercolesterolemia. A fluvastatina (FLV), um fármaco hipolipêmico, de segunda geração, pertencente à classe das estatinas, e é comercializada como mistura racêmica, ou seja, uma mistura equimolar da (+)-3R, 5S-FLV e (-)-3S, 5R-FLV. Além disso, é descrito na literatura que o enantiômero (+)- 3R, 5S- FLV possui atividade cerca de trinta vezes maior do que seu antípoda, o que justifica a importância e necessidade de métodos para análise enantiosseletiva de fármacos que possuam um ou mais centros de assimetria. Assim, este trabalho teve como objetivo a extração dos enantiômeros da FLV de matriz biológica (plasma) utilizando uma técnica de eletromigração em capilar, a cromatografia eletrocinética (EKC). A análise da FLV por cromatografia eletrocinética empregou como técnica de concentração online o stacking por injeção de grande volume, em um capilar de sílica fundida não revestido, de 50,0 cm de comprimento efetivo e 75 μm de diâmetro interno, solução tampão tetraborato de sódio 50 mmol L-1, pH 9,5; adicionado de 20 mmol L-1 de 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina como eletrólito de corrida, tensão de +25 kV, temperatura de 15 °C, injeção hidrodinâmica (0,5 psi por 30 segundos) e detecção em 300 nm. A separação dos enantiômeros foi obtida com valores de resolução de 3,0 e eficiência de 255840 e 150056, e tempos de migração de 7,2 e 7,4 minutos para a (+)-3R, 5S- FLV e (-)-3S, 5R- FLV, respectivamente. O procedimento de preparo de amostra foi baseado na extração em fase sólido-líquida (SLE), com a adição de 0,5 mL de solução tampão fosfato de sódio 0,1 mol L-1 pH 7,0 em 0,5 mL de plasma, previamente fortificado com padrão de FLV. A amostra foi aplicada na coluna e depois de 15 minutos, a FLV foi eluída com 4 mL de éter etílico. O método analítico foi validado avaliando os parâmetros seletividade, linearidade, precisão e exatidão inter e intra-dia, limite de quantificação, carry-over, efeito matriz, integridade da diluição e estudos de estabilidade. Além disso, foi realizado o estudo de racemização. Os resultados apresentaram linearidade na faixa de concentração plasmática de 250 a 725 ng mL-1 para cada enantiômero, sendo o limite de quantificação a concentração de 250 ng mL-1. Os estudos de precisão e exatidão apresentaram valores aceitáveis, com variação menor do que 15%. Além disso, não foi observado efeito carry-over e as amostras foram estáveis quando submetidas a ciclos de congelamento e descongelamento, estabilidade de curta e longa duração, pós-processamento e não foi observada racemização dos enantiômeros. Em relação ao efeito matriz, procedimentos alternativos foram usados com sucesso para análise de amostras lipêmicas e hemolisadas de plasmas. Sendo assim, este é o primeiro método bioanalítico desenvolvido, rápido e confiável, para quantificar os enantiômeros da FLV em amostras de plasma por EKC usando a SLE como técnica de preparo de amostra.Palavras-chave: Fluvastatina, cromatografia eletrocinética, análise quiral, extração em fase sólido-líquida

ABSTRACTYOKOYA, J.M.C. Enantioselective analysis of fluvastatin in plasma by capillary electrophoresis. 2013. 100 f. Dissertation (Master). Faculty of Pharmaceutical Sciences of Ribeirão Preto – University of São Paulo, Ribeirão Preto, 2013.Nowadays, cardiovascular diseases are the main causes of death in Brazil and worldwide. Statins are considered the most effective and well tolerated agents for the excessive increase in cholesterol blood levels, or hypercholesterolemia. Fluvastatin (FLV), a hypolipidemic second generation drug belongs to statin drug class, and it is commercialized as a racemate, that is, a equimolar mixture of (+)-3R, 5S- FLV and (-)-3S, 5R- FLV. Moreover, literature describes that (+)-3R, 5S- FLV enantiomer activity is thirty times higher than its antipode, which justifies the importance and necessity of methods for the stereoselective analysis of drugs which possess one or more than one asymmetry centers. Thus, this work aims the extraction of FLV enantiomers from a biological matrix (plasma) using one of the electromigration techniques, the EKC. FLV analysis by EKC employed large volume sample stacking as sample on-column concentration technique using a fused-silica capillary with 50.0 cm effective length and 75 μm internal diameter, 50 mmol L-1 sodium tetraborate buffer, pH 9,5 plus 20 mmol L-1 2-hydroxipropyl-β-cyclodextrin as a background electrolyte, voltage of +25 kV, temperature of 15ºC, with sample injected in hydrodynamic injection mode (0,5 psi for 30 seconds) and detection using a diode array detector set at 300 nm. The enantiomers resolution was achieved with a resolution value of 3.0, and efficiency of 255840 and 150056, migration times of 7.2 and 7.4 minutes for (+)-3R, 5S- FLV and (-)-3S, 5R- FLV, respectively. Supported liquid extraction was the chosen sample preparation procedure, with the addition of 0.5 mL of 0.1 mol L-1 pH 7.0 phosphate buffer to 0.5 mL of plasma, the mixture was applied to the column and allowed to wet for 15 minutes, 4 mL of ethyl ether was then applied to the top of the column, allowed to percolate by gravity and the eluted solvent was collected in an ambar tube, the solvent was submitted to evaporation under nitrogen flow and the residue was ressuspended for injection in the capillary electrophoresis equipment. The analytical method was validated covering selectivity, linearity, within-run and between-run precision and accuracy, limit of quantification, carry-over, matrix effect, dilution integrity and stability studies parameters. The racemization study was also performed. The results support that the analytical method is linear in the range of concentrations from 250 to 725 ng mL-1for eachenantiomer, and the limit of quantification was 250 ng mL-1; the method is precise and accurate, with variation under 15%. Besides, no carry-over effect was observed, and both enantiomers showed to be stable under thaw and freeze cycles, short and long term stability studies, autosampler stability, and also no racemization was observed. Related to matrix effect, alternative procedures were employed successfully in case of analysis of lipemeic and hemolized matrices. So, this is the first bioanalytical method developed, fast and reliable, to quantify FLV enantiomers in plasma samples using EKC with SLE as sample preparation procedure.Keywords: fluvastatin, electrokinetic chromatography, chiral analysis, supported liquid extraction

Aluno: Jirrah Pedro de AndradeTítulo: “Desenvolvimento e eficácia clínica de dermocosméticos para a pele acneica contendo vitamina B3 e derivados de vitamina B6 e zinco”Orientador: Prof. Dr. Patrícia Maria Berardo Gonçalves Maia CamposData da Defesa:03/12/2013

RESUMOANDRADE, J. P. Desenvolvimento e eficácia clínica de dermocosméticos para a pele acneica contendo vitamina B3 e derivados de vitamina B6 e zinco. 2013. 142f. Dissertação (Mestrado). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – Universidade de SãoPaulo, Ribeirão Preto, 2013.A acne é uma doença de pele com alta prevalência e seu tratamento é importante para evitar lesões cutâneas permanentes ou o agravamento de transtornos psicológicos provenientes do abalo à autoestima. Dessa forma, o desenvolvimento de formulações dermocosméticas eficazes que possam melhorar as condições desse tipo de pele é de grande valia. Dentre os ativos com potenciais benefícios para o controle de alguns dos principais fatores causadores da acne, estão a vitamina B3, um derivado de vitamina B6 e o PCA zinco. Assim o objetivo deste estudo foi o desenvolvimento de formulações dermocosméticas para a pele acnéica contendo vitamina B3, derivado lipossolúvel de vitamina B6 e PCA zinco bem como a avaliação da estabilidade e eficácia clínica dessas formulações. Para tal, foram desenvolvidas diferentes formulações, as quais, em um primeiro momento, foram avaliadas quanto à estabilidade frente à adição do ingrediente ativo Zinc PCA. Após esta etapa, os demais ingredientes ativos foram adicionados e as formulações foram submetidas a testes preliminares de estabilidade e ao estudo da estabilidade física por determinação do comportamento reológico. A formulação mais estável foi avaliada quanto à compatibilidade cutânea e também em relação à comedogenicidade do veículo. A formulação composta pelos ingredientes ativos foi avaliada, ainda, quanto as suas características sensoriais e eficácia clínica. Os estudos de eficácia foram realizados por meio de métodos objetivos e subjetivos, após seis semanas do uso da formulação. Os métodos objetivos consistiram no uso de metodologias in vivo, não invasivas (métodos biofísicos e de imagem), sendo avaliados parâmetros relacionados à hidratação, função barreira, conteúdo lipídico, pH cutâneo, contagem de porfirinas, de microcomedões e de lesões inflamatórias. Em relação aos métodos subjetivos, foi realizada a percepção da eficácia por meio de um questionário para a comparação da pele antes e após o tratamento. Os resultados mostraram que, de todas as formulações desenvolvidas, apenas uma mostrou-se estável frente aos testes de estabilidade realizados. A formulação (veículo e adicionada de ingredientes ativos) apresentou compatibilidade cutânea considerada como “muito boa”, de acordo com o teste realizado, e o veículo sem potencial comedogênico. Na avaliação sensorial as frequências obtidas para os parâmetros considerados como ruins foram baixas, indicando que o sensorial da formulação mostrou-se adequado para as finalidades propostas. No estudo de eficácia clínica, a formulação não alterou a hidratação e a função barreira da pele e mostrou-se eficaz na redução da contagem de porfirinas e das lesões inflamatórias (p<0,05). A avaliação clínica por métodos subjetivos mostrou a eficácia da formulação quanto à melhora da acne inflamatória, oleosidade da pele, hidratação e maciez. Por fim, os resultados obtidos mostraram que a formulação desenvolvida é eficaz e compatível com a pele, bem como a importância da pesquisa e desenvolvimento para a obtenção de formulações estáveis, seguras, eficazes e com sensorial adequado.Palavras-chave: Acne; Eficácia clínica; Vitamina B3; Derivado de vitamina B6; PCA de zinco.

ABSTRACTANDRADE, J. P. Development and clinical efficacy of cosmetics for acneic skin with vitamin B3 and derivatives of vitamin B6 and zinc. 2013. 142f. Dissertation (Master). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2013.Acne is a skin disease with high prevalence and its treatment is important to prevent permanent skin lesions or the aggravation of psychological disorders due to self-esteem shaken. This way, the development of effective dermocosmetic formulations, that can improve the conditions of this skin type, is very important. Vitamin B3, a vitamin B6 derivative and zinc PCA are among the active ingredients which present potential benefits in the controlling of some pathogenic factors of acne. Thus, the aim of this research was to develop cosmetic formulations for acneic skin containing vitamin B3, vitamin B6 lipophilic derivative and zinc PCA, as well as the evaluation of stability and clinical efficacy. For this purpose, were developed different formulations which, at first, were evaluated in terms of stability face to zinc PCA addition. After this, the others active ingredients were added and the formulations were submitted to preliminary tests of stability and physical stability studies by rheological behavior determination. The most stable formulation was subject to skin compatibility evaluation and vehicle comedogenicity. The formulation with the active ingredients was also evaluated regarding their sensorial characteristics and clinical efficacy. Efficacy studies were performed by means of objective and subjective methods, after a sixweek period of use of the formulation. The objective methods consisted in non-invasive in vivo methodologies (biophysical techniques and image analysis) where were evaluated hydration, barrier function, lipid content, skin pH and the counting of porphyrins, microcomedones and inflammatories lesions. In relation to subjective methods, was performed the efficacy perception using a questionnaire in order to compare the skin before and after the treatment. The results showed that among the formulations developed, only one kept stable after the stability tests. The formulations were considered as “very good" on skin compatibility test and showed no comedogenic potential. In sensorial evaluation, frequencies obtained for the parameters considered bad were low, which indicate the sensorial of the formulation was adequate for the purposes. In clinical efficacy study, the formulation under study did not alter the parameters related to hydration and skin barrier function and was effective in reducing the counting of porphyrins and inflammatories lesions (p<0,05). Clinical evaluation by subjective methods showed the formulation effectiveness regarding the improvement of inflammatory acne, skin oiliness, hydration and softness. Finally, the results obtained showed the formulation developed is effective and compatible with the skin and, besides the importance of research and development for obtaining stable, safe and effective formulations with suitable sensorial.Keywords: Acne; Clinical efficacy; Vitamin B3; Vitamin B6 derivative; Zinc PCA.

Aluno: Juliana Vescovi de FreitasTítulo: “Avaliação da fotoestabilidade e penetração cutânea de fotoprotetores contendo associações de filtros solares, trans-resveratrol e beta-caroteno”Orientador: Prof. Dr. Lorena Rigo Gaspar CordeiroData da Defesa:22/08/2013

RESUMO FREITAS, J. V. Avaliação da fotoestabilidade e penetração cutânea de fotoprotetores contendo associação de filtros solares, trans-resveratrol e beta-caroteno. 2013. 162f. Dissertação (Mestrado). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2013. Em virtude da necessidade de proteger a pele contra as espécies reativas de oxigênio, geradas excessivamente após exposição ao raios UV, substâncias antioxidantes têm sido adicionadas aos fotoprotetores. Entretanto associações fotoinstáveis podem levar à formação de intermediários reativos, que são prejudiciais ao organismo, e à redução da atividade fotoprotetorados filtros solares e antioxidantes. Além disso, as características de penetração dos filtros solares e antioxidantes influenciam diretamente a segurança e a eficácia dos fotoprotetores. Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi desenvolver e avaliar a fotoestabilidade e a penetração cutânea de formulações fotoprotetoras contendo diferentes associações de filtros solares acrescidas ou não de trans-resveratrol e beta-caroteno, por meio do uso de CLAE e espectrofotometria e de células de Franz, respectivamente. Para tal, foram desenvolvidas formulações contendo diferentes associações de filtros solares (associações 1, 2 e 3), que apresentavam em comum avobenzona, metoxicinamato de etil-hexila e octocrileno, acrescidas de trans-resveratrol e beta-caroteno, isoladamente ou em combinação. Para avaliar a fotoestabilidade, amostras das formulações foram aplicadas em lâminas de vidro e expostas à radiação UVA e, a seguir, submetidas a análises por CLAE, para determinar o teor dos filtros solares e antioxidantes em estudo, e por espectrofotometria, para determinação da razão UVA/UVB. Para avaliar a penetração cutânea, as formulações contendo a associação de filtros solares mais fotoestável foram aplicadas sobre a pele de orelha de porco, e foi realizada a quantificação das substâncias em estudo, presentes no estrato córneo (EC), na epiderme/derme (E+D) e na solução receptora, por CLAE. O estudo de fotoestabilidade por CLAE dos filtros solares e antioxidantes presentes nas formulações avaliadas mostrou que, apesar de terem apresentado boa fotoestabilidade, todas as substâncias foram fotoinstáveis, com exceção do bemotrizinol, octiltriazona e octocrileno. Além disso, foi observado que o uso dos antioxidantes em associação foi melhor do que utilizá-los separadamente em fotoprotetores. As análises espectrofotométricas mostraram que, após irradiação, houve redução significativa da razão UVA/UVB de todas as formulações e que as formulações contendo bemotrizinol (associação 2) e octiltriazona (associação 3) apresentaram, respectivamente, aumento e redução significativos da razão UVA/UVB, com relação às formulações que não apresentavam esses filtros. No estudo de penetração cutânea, foi observado que, após aplicação das formulações contendo bemotrizinol (associação 2), os filtros solares e antioxidantes avaliados penetraram a pele, mas não permearam até a solução receptora, ou seja, ficaram retidos no EC, majoritariamente, e na E+D. Além disso, foi observada redução significativa da retenção no EC dos filtros solares e antioxidantes avaliados na presença do beta-caroteno. Os resultados desse estudo contribuíram para mostrar os benefícios da utilização de uma combinação de antioxidantes em fotoprotetores, uma vez que a combinação do trans-resveratrol e do beta-caroteno, resultou em melhor fotoestabilidade das formulações e também apresentou vantagens no estudo de penetração cutânea, pois reduziu a penetração dos filtros solares. Palavras-chave: Filtros solares. Trans-resveratrol. Beta-caroteno. Fotoestabilidade. Penetração cutânea.

ABSTRACT FREITAS, J. V. Evaluation of photostability and cutaneous penetration of sunscreens containing combinations of UV-filters, trans-resveratrol and beta-carotene. 2013. 162f. Dissertation (Master). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2013. Due to the need to protect the skin against reactive oxygen species, which are excessively generated after exposure to UV rays, antioxidants compounds have been added to sunscreens. However, photounstable combinations can lead to generation of reactive intermediates, that are harmful to the body, and decrease the photoprotective activity of UV-filters and antioxidants. Furthermore, the penetration characteristics of UV-filters and antioxidants influence directly sunscreens safety and efficacy. Thus, the aim of this study was to develop and to evaluate the photostability and cutaneous penetration of sunscreen formulations containing different combinations of UV-filters supplemented or not with trans-resveratrol and beta-carotene, by using HPLC and spectrophotometry and Franz cells, respectively. For this, formulations containing different UV-filters combinations (combinations 1, 2 and 3), which had in common avobenzone, ethyl-hexyl methoxycinnamate and octocrylene, supplemented with trans-resveratrol and beta-carotene, alone or in combination, were prepared. For photostability evaluation, samples of the formulations were spread onto glass plates, exposed to UVA radiation and then analyzed by HPLC to determine the concentration of UV-filters and antioxidants under study, and by spectrophotometry to determine the UVA/UVB ratio. To assess cutaneous penetration, formulations containing the most photostable combination of UV-filters were applied on pig ear skin, and the quantification of substances under study present into stratum corneum (SC), viable epidermis plus dermis (E+D) and receptor fluid was performed by HPLC. HPLC photostability study, which analyzed the UV-filters and antioxidants present in formulations, showed that all substances, despite having good photostability, were photounstable, except bemotrizinole, octyltriazone and octocrylene. Furthermore, it was observed that the use of antioxidants in combination was better than using them separately in sunscreens. The spectrophotometric analysis showed that after irradiation, all formulations had a significant decrease of UVA/UVB ratio, and that formulations containing bemotrizinole (combination 2) and octyltriazone (combination 3) presented, respectively, significant increase and decrease of the UVA/UVB ratio, in comparison with formulations that did not contained these UV-filters. In the cutaneous penetration study it was observed that after application of formulations containing bemotrizinole (combination 2), the UV-filters and antioxidants under study penetrated the skin, but did not reach the receptor fluid, which means that they were retained in SC, predominantly, and in E+D. Furthermore, a significant decrease on SC retention of UV-filters and antioxidants under study in the presence of beta-carotene was observed. The results of this study contributed to demonstrate the benefits of using a combination of antioxidants in sunscreens, since the combination of trans-resveratrol with beta-carotene, resulted in improved photostability of the formulations and also showed advantages in the skin penetration study, because it reduced UV-filters penetration. Keywords: UV-filters. Trans-resveratrol. Beta-carotene. Photostability. Cutaneous penetration.

Aluno: Laura Freire Cardoso PimentaTítulo: “Influência de dendrímeros e da iontoforese na penetração da protoporfirina IX em tumores cutâneos”Orientador: Prof. Dr. Renata Fonseca Vianna LopezData da Defesa:27/11/2013

RESUMO PIMENTA, L. F. C. Influência de dendrímeros e da iontoforese na penetração da protoporfirina IX em tumores cutâneos. 2013. 85f. Dissertação (Mestrado). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2013. A terapia fotodinâmica (TFD) associada à administração tópica de agentes fotossensibilizantes é uma terapia promissora para o tratamento tópico do câncer de pele. A protoporfirina IX (PpIX) é uma substância fotodinamicamente ativa usada na TFD, entretanto, devido a sua alta lipofilia ela forma agregados em meio aquoso, o que diminui sua atividade fotodinâmica e dificulta sua administração na pele. Assim, sistemas de liberação nanoparticulados vêm sendo investigados para melhorar a distribuição da PpIX na pele e facilitar sua penetração até as células tumorais. Os dendrímeros de poliamidoamina (PAMAM) representam uma nova geração de nanosistemas que tem despertado grande interesse nos últimos anos. Eles são uma classe especial de polímeros que apresentam estrutura muito ramificada e regular e que interagem com a PpIX formando complexos (nanopartículas dendriméricas de PpIX-PAMAM). A aplicação de uma corrente elétrica de baixa intensidade, conhecida como iontoforese, pode influenciar na penetração cutânea dessas nanopartículas, direcionando-as para o interior das células. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar a influência da iontoforese e de nanopartículas de PAMAM de geração 4 hidroxilado (PAMAM G4-OH) com a PpIX na localização subcelular e penetração deste agente fotossensibilizante em tumores cutâneos. Assim foram preparados complexos de PpIX–PAMAM, os quais foram caracterizados em função do tamanho de partículas e potencial zeta. A localização subcelular da PpIX a partir dos complexos foi investigada em carcinoma de células escamosas. A influência dos complexos na geração de oxigênio singleto quando a PpIX sofre irradiação também foi avaliada. Por fim, a penetração da PpIX a partir dos complexos PpIX-PAMAM foi avaliada, in vivo, em pele sadia e em tumores induzidos em camundongos Nude BalbC, com e sem aplicação da iontoforese. O tamanho médio das nanopartículas dendriméricas contendo a PpIX dispersas em meio aquoso foi de aproximadamente 220 nm. Quando avaliadas em função do tempo, este tamanho sofreu um aumento de apenas 5% depois de 24 h, permanecendo constante por 7 dias. O potencial zeta das dispersões foi de 10 mV, em pH 7, e de 30 mV, em pH 5,5, possibilitando a contribuição da eletromigração durante a iontoforese. Nos estudos em cultura de células tumorais observou-se que a complexação com o PAMAM aumentou 30 vezes a localização da PpIX na mitocôndria quando comparada a PpIX livre. Além disso, a quantidade de oxigênio singleto gerada foi semelhante para a PpIX livre não agregada e complexada, 4,3 x 10-3 e 4,6 x 10-3 , respectivamente, sugerindo que o PAMAM manteve a atividade fotodinâmica da PpIX. Nos experimentos in vivo, em pele sadia, verificou-se que a PpIX administrada a partir do complexo com o PAMAM se distribuiu homogeneamente pela pele, enquanto que a PpIX livre apresentou uma fluorescência localizada em apenas algumas área da superfície da pele. A iontoforese facilitou a penetração da PpIX para as camadas mais profundas da pele. Finalmente, no tratamento dos tumores cutâneos, a administração tópica dos complexos por apenas 30 min possibilitou a penetração da PpIX até os tumores localizados abaixo da pele, em concentrações semelhantes para a aplicação passiva e iontoforética. Portanto, a complexação da PpIX com o PAMAM é um sistema de liberação nanoparticulado promissor para o tratamento tópico de tumores cutâneos por TFD. Palavras-chave: dendrímero, PAMAM, protoporfirina IX, iontoforese, câncer de pele, terapia fotodinâmica. X

ABSTRACT PIMENTA, L. F. C. Influence of dendrimers and iontophoresis in protoporphyrin IX penetration into skin tumors. 2013. 85f. Dissertation (Master). School of Pharmaceutical Science of Ribeirão Preto, University of São Paulo, Ribeirão Preto, 2013. Photodynamic therapy (PDT) associated with topical administration of photosensitizer agents is a promising therapy for topical treatment of skin cancer. Protoporphyrin IX (PpIX) is a photosensitizer commonly used in PDT; however, due to its high lipophilicity it aggregates in aqueous medium, which decreases its photodynamic activity and hinders its penetration through the skin. In this way, nanoparticles have been designed to improve the distribution of PpIX in the skin and enhance its tumor cell penetration. The polyamidoamine dendrimers (PAMAM) represent a new generation of nanosystems that has aroused great interest in recent years. They are hyberbranched polymers capable to form complexes with PpIX (PpIX–PAMAM), increasing PpIX aqueous solubility. The application of a low intensity electrical current, known as iontophoresis, may influence the nanoparticles skin penetration, directing them to the tumor cells. Therefore, the aim of this study was to evaluate the influence of iontophoresis and PpIX-PAMAM G4-OH complexes in PpIX subcellular localization and penetration into skin tumors. The complexes were prepared and characterized as a function of particle size and zeta potential. The subcellular localization of PpIX from the complexes was investigated in squamous cell carcinoma. The influence of PpIX-PAMAM on the generation of singlet oxygen after irradiation was also evaluated. Finally, the penetration of PpIX from the PpIX-PAMAM complexes was evaluated in vivo in healthy skin and in tumors induced in BalbC nude mice with and without application of iontophoresis. The average size of PpIX-PAMAM nanoparticles dispersed in aqueous medium was approximately 220 nm. When evaluated as a function of time, this size was increased only 5% after 24 h and remained constant for 7 days. The zeta potential of the dispersions was 10 mV at pH 7 and 30 mV at pH 5.5, allowing the contribution of electromigration during iontophoresis. In studies in culture tumor cells it was observed that complexation with PAMAM increased 30 times the localization of PpIX in the mitochondria compared to free PpIX. Furthermore, the amount of singlet oxygen generated when PpIX-PAMAM was irradiated was similar to that generated by the irradiation of the non-aggregated free PpIX, 4.6 x 10-3 and 4.3 x 10-3, respectively, suggesting that PAMAM did not modify the photodynamic activity of PpIX. In vivo experiments on healthy skin have shown that PpIX from the PpIX-PAMAM was homogeneously distributed throughout the skin, whereas free PpIX fluorescence was visualized only in some restricted areas of the skin surface. Iontophoresis facilitated PpIX diffusion to deep layers of the skin. Finally, the treatment of skin tumors have shown that the topical administration of the PpIX-PAMAM for only 30 min, passively or by iontophoresis, allowed the penetration of PpIX into the tumors located below the skin. Therefore, the PpIX complexation with PAMAM is a promising nanoparticle delivery system for the topical treatment of skin tumors by PDT. Keywords: dendrimer, PAMAM, protoporphyrin IX, iontophorese, skin cancer, photodynamic therapy.

Aluno: Liana Inara de JesusTítulo: “Avaliação de fungos na obtenção do metabólito quiral e ativo 9-hidroxirisperidona (paliperidona) e análise por eletroforese capilar”Orientador: Prof. Dr. Anderson Rodrigo Moraes de OliveiraData da Defesa:09/05/2013

RESUMOJESUS, L.I. Avaliação de fungos na obtenção do metabólito quiral e ativo 9- hidroxirisperidona (paliperidona) e análise por eletroforese capilar. 2013. 67f. Dissertação (Mestrado). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2013.A risperidona (RISP) é um fármaco neuroléptico que após sua administração oral é metabolizado resultando em dois metabólitos quirais, a 7-hidroxirisperidona (7- RispOH) e a 9-hidroxirisperidona (9-RispOH). A 9-RispOH é o metabólito majoritário da risperidona a qual é comercializada na forma de racemato com o nome de paliperidona. Esse projeto teve como finalidade avaliar a capacidade dos fungos endofíticos Penicillium crustosum (VR4), Chaetomium globusum (VR10), Aspergillus fumigatus (VR12), Papulaspora immersa Hotson (SS13), Nigrospora sphaerica (Sacc.) E.W. Mason (SS67) e Glomerella cingulata (VA1) e do fungo de solo Mucor rouxii em biotransformar a risperidona em seu metabólito ativo 9-RispOHenantiosseletivamente. Foi objeto de estudo também a otimização do processo de biotransformação através do emprego de diferentes meios de cultura (Czapek, Czapek Dox e Koch`s K1) para o cultivo dos fungos utilizados no estudo. O método escolhido para a separação da risperidona e seus metabólitos quirais foi a eletroforese capilar (CE). As separações eletroforéticas dos analitos foram realizadas empregando um capilar de sílica fundida de 40 cm de comprimento e 75 μm de diâmetro interno, uma solução tampão fosfato de sódio 100 mmol L-1 pH 3,0 contendo CD-α-sulfatada 2,0% (p/v) e carboximetil-β-CD 0,5% (p/v) como seletores quirais. Todos os experimentos no CE foram realizados no modo reverso aplicando uma tensão de -10kV. As amostras foram injetadas aplicando uma pressão 0,5 psi por 8 s. O capilar e as amostras permaneceram na temperatura de 20◦C. Para a extração dos analitos do meio de cultura foi utilizado a microextração em fase líquida empregando membranas cilíndricas ocas (HF-LPME). A técnica de preparação de amostra foi realizada no modo de três fases utilizando uma fibra de polipropileno impregnada com n-octanol e preenchida com uma solução de ácido clorídrico 100 mmol L-1 pH 3,0. A fibra foi mergulhada na amostra tamponada com uma solução de fosfato de potássio dibásico 500 mmol L-1 pH 12,0. O método foi validado de acordo com os parâmetros estabelecidos pela ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária) para análise de fármacos em material biológico avaliando os seguintes parâmetros: seletividade, linearidade, precisão, exatidão, limite de quantificação eestabilidade. Todos os parâmetros avaliados ficaram dentro dos limites estabelecidos pela ANVISA. Entre os fungos avaliados, apenas o Mucor rouxii foi capaz de biotransformar a risperidona em seu metabólito ativo e quiral 9-RispOH. Nas condições empregadas a razão enantiomérica foi de 79,6%. Palavras-chave: Risperidona. Paliperidona. Fungos. Biotransformação. Eletroforese capilar. HF-LPME.

ABSTRACTJESUS, L.I. Evaluation of fungi to obtain the chiral and active metabolite 9-hydroxyrisperidone (paliperidone) and analysis by capillary electrophoresis. 2013. 67f. Dissertation (Master). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2013.Risperidone (RISP) is a neuroleptic drug which after oral administration is metabolized into two chiral metabolites, 7-hydroxyrisperidone (7-RispOH) and 9-hydroxyrisperidone (9-RispOH). 9-RispOH is the major metabolite and it is commercialized under the generic name paliperidone. The objective of this project was to evaluate the capability of the endophytic fungi Penicillium crustosum (VR4), Chaetomium globusum (VR10), Aspergillus fumigatus (VR12), Papulaspora immerse Hotson (SS13), Nigrospora sphaerica (Sacc.) E.W. Mason (SS67) and Glomerella cingulata (VA1) and the soil fungus Mucor rouxii to biotransform risperidone into its chiral and active metabolite 9-RispOH, enantioselectively. In addition, it was also optimized the biotransformation process through the use of different culture medium (Czapek, Czapek Dox and Koch`s K1). The chiral analysis was performed by capillary electrophoresis (CE). The electrophoretic separation of the analytes was accomplished in a silica capillary with 40 cm of length and 75 μm of internal diameter. The background electrolyte was a sodium phosphate 100 mmol L-1 pH 3.0 plus 2.0% (w/v) sulfated-α-CD and 0.5% (w/v) carboxymethyl-β-CD. All experiment on CE was performed in reverse mode by applying a voltage of -10 KV. The samples were injected hydrodynamically by applying a pressure of 0.5 psi for 8 s. The temperature of analysis was 20oC. For the extraction of the analytes from the culture medium it was employed the hollow fiber liquid-phase microextraction (HF-LPME). The extraction conditions were: n-octanol as organic solvent and a hydrochloridric acid solution of 100 mm L-1 pH 3.0. The pH of the sample was controlled by the addition of potassium phosphate buffer 500 mmol L-1 pH 12.0. The method was validated according to ANVISA guidelines (Agência Nacional de Vigilância Sanitária) for the analysis of drugs in biological fluids. The following parameters were evaluated: selectivity, linearity, precision, accuracy, limit of quantification and stability. All parameters were in agreement with the established limits by ANVISA. From all the evaluate fungi only Mucor rouxii was able to biotransform risperidone into its chiraland active metabolite 9-RispOH. In the conditions used in these project the enantiomeric ratio was 79.6%. Keywords: Risperidone. Paliperidone. Fungi. Biotransformation. Capillary Electrophoresis. HF-LPME.

Aluno: Lucas de Andrade HuberTítulo: “Influência da iontoforese na penetração de nanopartículas lipídicas sólidas em tumores cutâneos”Orientador: Prof. Dr. Renata Fonseca Vianna LopezData da Defesa:25/03/2013

RESUMOHUBER, L. A. Influência da iontoforese na penetração de nanopartículas lipídicas sólidas em tumores cutâneos. 2013. 106f. Dissertação (Mestrado). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2013.O tratamento tópico do câncer de pele é uma estratégia promissora para aumentar a biodisponibilidade local de antineoplásicos e diminuir efeitos sistêmicos adversos. No entanto, altas concentrações do fármaco nos tumores, que acometem as camadas mais profundas da pele, são requeridas para que o tratamento seja adequado. Para promover a penetração cutânea dos antineoplásicos e atingir o tumor, sistemas de liberação nanoparticulados associados a métodos físicos, como a iontoforese, vêm sendo estudados. Nanopartículas lipídicas sólidas (NLS) são sistemas carreadores explorados para a administração tópica, principalmente, de produtos cosméticos. Pouco se sabe, no entanto, sobre sua influência na penetração cutânea de fármacos e sobre os mecanismos pelos quais as NLS agem para aumentar esta penetração. A iontoforese é um método físico que aumenta a permeação cutânea de fármacos através da aplicação de uma corrente elétrica de baixa densidade. Sua influência na penetração tumoral de fármacos carreados por NLS ainda não foi explorada. Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar a influência da iontoforese na penetração tumoral do antineoplásico modelo doxorrubicina (DOX) a partir deNLS catiônicas. Para tanto, NLS contendo DOX foram preparadas e caracterizadas quanto a distribuição de tamanho, potencial zeta e pH. NLS idênticas, mas marcadas com um fluoróforo lipofílico, o BODIPY FSE-8 (BOD), sintetizado especificamente para este fim, também foram obtidas e caracterizadas. Estas nanopartículas fluorescentes contendo DOX e BOD foram utilizadas para estudar, por microscopia confocal de varredura a laser, in vitro e in vivo, as vias de penetração dos compostos lipofílicos presentes nas NLS e da própria DOX. A penetração da DOX nas diferentes camadas da pele foi avaliada in vitro usando-se células de difusão vertical e pele de suíno. In vivo, a penetração do fármaco foi avaliada também no tumor e no plasma, após 1 h de aplicação passiva e iontoforética das NLS em tumores de células escamosas induzidos em camundongos imunossuprimidos. Nos estudos de microscopia observou-se que a aplicação das NLS levou a uma distribuição mais homogênea da fluorescência no estrato córneo (EC) do que a aplicação de soluções dos fluoróforos livres. A iontoforese aumentou a fluorescência de todas as amostras testadas, levando inclusive a presença de agregados fluorescentes abaixo dos folículos pilosos e a formação de regiões de transporte localizadas mais permeáveis no EC. Nos estudos quantitativos in vitro a iontoforese anódica (a partir do eletrodo positivo) das NLS-DOX levou a concentrações cerca de 39 vezes maiores de DOX na epiderme viável do que todas as outras formulações, indicando um efeito positivo da eletromigração na penetração das NLS catiônicas. Nos estudos in vivo, o aumento da quantidade de DOX acumulada na pele após a iontoforese anódica das NLS-DOX foi bem acentuado frente às outras formulações. Já apresença de fármaco no tumor, apesar de apresentar uma tendência maior de acúmulo quando a iontoforese foi aplicada, não foi estatisticamente diferente das demais formulações. No entanto, a tendência das NLS de ficarem acumuladas na pele, diminuindo a presença da DOX na circulação, foi bastante característica. Pode-se concluir, portanto, que a aplicação de NLS associadas a iontoforese apresenta alto potencial de sucesso para o tratamento tópico, localizado, de tumores cutâneos.Palavras-chave: Iontoforese; Nanopartículas Lipídicas Sólidas; Doxorrubicina; Câncer de pele.

ABSTRACTHUBER, L. A. Influence of iontophoresis on the penetration of solid lipid nanoparticles in skin tumors.. 2013. 106f. Dissertation (Master). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2013.Topical treatment of skin cancer is a promising strategy to increase local bioavailability of antineoplastic drugs and to reduce systemic adverse effects. However, elevated concentrations of the drug in tumors presented in deep skin layers are required for the adequate treatment. To increase drug skin penetration, nanoparticles associated with physical methods, such as iontophoresis, have been studied. Solid lipid nanoparticles (SLN) are drug carrier systems developed for topical administration, especially of cosmetic products. However, almost nothing is known about their influence on the skin penetration of drugs or on the mechanisms by which they enhance drug penetration through the skin. Iontophoresis is a physical method which increases the skin permeation of drugs through the application of a low density electrical current. Its influence on tumor penetration of drugs carried by SLN has not been explored yet. Therefore, the aim of this study was to evaluate the influence of iontophoresis on the penetration of the antineoplastic model drug doxorubicin (DOX) carried by cationic SLN. To this end, SLN containing DOX were prepared and characterized according to their medium size, zeta potential and pH. Besides that, identical SLN containing a lipophilic fluorophore BODIPY FSE-8 (BOD), synthesized specifically for this study, has also been obtained and characterized. These fluorescent nanoparticles containing DOX and BOD were used to study the in vitro and in vivo penetration routes of both DOX and lipophilic compounds present in the SLN, by confocal laser scanning microscopy analysis. The penetration of DOX in the different skin layers was evaluated in vitro using vertical diffusion cells and pig skin. In vivo, the drug penetration was also easured in the tumor and plasma after 1 hour of iontophoretic and passive application of SLN on squamous cells tumors, previously induced in immunosuppressed mice. The microscopy studies showed that the application of SLN resulted in a more homogeneous distribution of fluorescence in the stratum corneum (SC) compared to the application of solutions containing free fluorophores at the same conditions. Iontophoresis increased fluorescence for all samples tested, leading yet to the presence of fluorescent aggregates below the hair follicles and the formation of localized transport regions at the SC. The in vitro quantitative studies showed that anodic iontophoresis (from the positive electrode) of SLNDOX led to about 39 times higher concentrations of DOX in viable epidermis than all the others formulations, indicating a positive effect of electromigration on the penetration of cationic SLN. In the in vivo studies, the amount of DOX accumulated in the skin after anodic iontophoresis of SLN-DOX was also well pronounced. The tendency of SLN accumulation in the skin, reducing the presence of DOX in the blood circulation, was very characteristic. Therefore, it can be concluded that the application of SLN associated with iontophoresis has a great potential for success in the topical treatment of localized skin tumors.Keywords: Iontophoresis; Solid Lipid Nanoparticles; Doxorubicin; Skin Cancer.

Aluno: Lucas Maciel Mauriz MarquesTítulo: “Estudo de metabolismo in vitro do alcalóide Piplartina empregando microssomas hepático de ratos”Orientador: Prof. Dr. Anderson Rodrigo Moraes de OliveiraData da Defesa:25/07/2013RESUMOMARQUES, L. M. M. Estudo de metabolismo in vitro do alcalóide Piplartina empregando microssomas hepático de ratos. 2013. 97f. Dissertacao (Mestrado). Faculdade de Ciencias Farmaceuticas de Ribeirao Preto – Universidade de São Paulo, Ribeirao Preto, 2013.O genero Piper pertencente a familia Piperaceae, encontra-se distribuido nas regioes tropicais e subtropicais do globo. Estudos quimicos tem demonstrado diversidade de metabolitos secundarios com atividade biologica. Os alcaloides são metabolitos caracteristicos. A piplartina, (E)-1-(3-(3,4,5-trimetoxifenil)acriloil)-5,6-diidropiridin-2(1H)-ona, e um alcaloide encontrado em muitas especies. Tem atividade citotoxica contra celulas de linhagem tumoral, ansiolitica, antidepressiva, antifungica e antiagregacao plaquetaria, sendo dessa forma, uma molécula candidata a um novo farmaco. O conhecimento do metabolismo de um candidato a farmaco e um fator importante na avaliacao da sua seguranca e eficacia. Ensaios in vitro estao crescentemente sendo utilizados como screening e os microssomas hepaticos representam o sistema in vitro mais utilizado. Dessa forma, o presente trabalho tem como objetivo determinar os parametros cineticos enzimaticos in vitro da piplartina utilizando microssomas de figado de ratos, bem como a determinação dos possiveis metabolitos formados. Para tanto, foi desenvolvido um metodo de quantificacao da piplartina utilizando cromatografia liquida de alta eficiencia. Como condicao de analise, empregou-se uma coluna C18, fase movel acetonitrila:água (40:60, v/v) e vazao de 1 mL min-1. Para extracao da piplartina dos microssomas hepatico de ratos foi empregado a extracao liquido-liquido utilizando 4,0 mL de hexano como solvente extrator. Apos otimizacao da extracao, o metodo foi validado, mostrando-se linear na faixa de 2,4-157,7 μM, obtendo-se uma equacao da reta y=0,0934x + 0,0027, (r= 0,99) e limite de quantificacao de 2,4 μM. A recuperação media foi de 85%. A precisao e exatidao apresentaram resultados dentro do recomendavel pela ANVISA. A piplartina manteve-se estavel ate 50 minutos em condicoes de incubacao, e ate 6h sob a bancada. Apos validacao da metodologia, estabeleceram-se as condicoes lineares para a quantidade de proteínas microssomais: 0,28 mg mL-1 e para o tempo de incubacao: 16 minutos no consumo da piplartina no meio microssomal, e entao efetuou-se a determinacao dos parametros cineticos enzimaticos da piplartina empregando as condicoes de V0. Nesse estudo foi observado um Vmax= 4,74 } 0,26 μM/μg mL� -1/min, h= 2,53 } 0,37, � S50= 44,69 } 0,32� μM e CLmax= 0,054 μL/min/mg proteina, um perfil cinético indicativo de cooperatividade. Um estudo qualitativo para determinacao dos possiveis metabolitos foi feito utilizando-se a espectrometria de massas, por meio da qual foi possivel identificar a formacao de dois produtos hidroxilados. Deste modo, os microssomas mostraram-se uma ferramenta util, rapida e simples para determinacao da cinetica enzimatica, e na conducao dos estudos preliminares de metabolismo in vitro.Palavras-chave: Cinetica enzimatica; Cooperatividade; Metabolismo in vitro; Microssomas hepatico de ratos; Perfil sigmoidal; Piplartina.

ABSTRACTMARQUES, L. M. M. In vitro metabolism study of the piplartine alkaloid using rats liver microsomes. 2013. 97f. Dissertation (Master’s degree). Faculdade de Ciencias Farmaceuticas de Ribeirao Preto – Universidade de Sao Paulo, Ribeirao Preto, 2013.The genus Piper belongs to the Piperaceae family and includes species that are widely distributed throughout the tropical and subtropical regions of the world. Chemical studies have shown diversity of secondary metabolites with biological activity. The alkaloids are characteristic metabolites. The piplartine, (E)-1-(3-(3,4,5- trimethoxyphenyl)acryloyl)-5,6-diidropiridin-2(1H)-one is an alkaloid found in many species. It shows cytotoxic activity against tumor cell lines, anxiolytic, antidepressant, antifungal, and antiplatelet therapy, thus being a drug candidate. The knowledge regarding the oxidative metabolism is an important tool in assessing the safety and efficacy of a drug candidate. In vitro assays are increasingly being used as a screening tool and liver microsomes represent the most widely in vitro system used for that. This study aims to determine the in vitro enzymatic kinetic parameters for piplartine by cytochrome P450 enzymes (CYP) present in the rat liver microsomes, and the determination of possible metabolites. To accomplish, it was developed a method to quantify the piplartine using high performance liquid chromatography. The analysis was carried out employing a C18 column, mobile phase: acetonitrile: water (40:60, v/v) at a flow rate of 1 ml min-1. To extract piplartine from rat liver microsomes it was employed the liquid-liquid extraction (4.0 mL of hexane). The method was validated and proved to be linear in the range of 2.4 to 157.7 μM, the equation for calibration curve was: y= 0.0934x + 0.0027 (r = 0.99), and a limit of quantification of 2.4 μM. The mean recovery was 85%. The precision and accuracy were in agreement with ANVISA guidelines. The piplartine remained stable until 50 minutes of incubation conditions, and until 6 hours under the bench. Once validated, it was set the conditions for the linear amount of microsomal protein: 0.28 mg mL-1 and to the incubation time: 16 minutes, then it was performed the determination of enzymatic kinetic parameters, that revealed a sigmoidal profile with Vmax = 4.74 } 0.26 μM/mg mL-1/min, h = 2.53 �} 0.37, S50 = 44.69 �} 0.32 μM, and CLmax = 0.054 μL/min/mg protein, indicating a cooperativity behavior. A qualitative study to determine possible metabolites carried out using mass spectrometry, through which it was possible to identify the formation of two hydroxylated products. To conclude, the microsomes showed to be a useful, fast and simple tool to determination of enzymatic kinetics and in vitro metabolism studies. Keywords: Enzymatic Kinetic; Cooperativity; In vitro metabolism; Hepatic rat microsomes; Sigmoidal profile; bioanalytical validation; Piplartine.

Aluno: Luciana Pereira LourençoTítulo: “Análise enantiosseletiva da lercanidipina: controle de qualidade de formulações farmacêuticas por eletroforese capilar e avaliação dafotodegradação por cromatografia líquida de alta eficiência”Orientador: Prof. Dr. Cristiane Masetto de GaitaniData da Defesa:26/03/2013

RESUMO LOURENÇO, L. P. Análise enantiosseletiva da lercanidipina: controle de qualidade de formulações farmacêuticas por eletroforese capilar e avaliação da fotodegradação por cromatografia líquida de alta eficiência. Dissertação (Mestrado). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2013. A lercanidipina (LER) é uma dihidropiridina bloqueadora de canais de cálcio disponível comercialmente como uma mistura racêmica, ou seja, uma mistura equimolar dos enantiômeros (R)-LER e (S)-LER. Os efeitos farmacológicos da LER residem essencialmente no enantiômero (S)-LER, e estudos in vitro mostram que este enantiômero apresenta cerca de 100-200 vezes maior afinidade pelos canais de cálcio que o enantiômero (R)-LER. Consequentemente, os efeitos farmacodinâmicos da LER são devidos, principalmente, ao enantiômero (S)-LER. Neste sentido, fármacos racêmicos são exaustivamente estudados, para avaliar suas propriedades farmacocinéticas e farmacodinâmicas estereosseletivas e verificar se existem vantagens na produção do enantiômero puro. Além disso, devido às diferenças na atividade dos enantiômeros, é imprescindível realizar o controle de qualidade enantiosseletivo destas formulações. Associado a isto, as moléculas pertencentes a esta classe de fármacos são fotossensíveis. Assim, o objetivo deste trabalho foi desenvolver e validar um método enantiosseletivo para análise da LER e aplicá-lo no controle de qualidade de formas farmacêuticas e também avaliar sua fotodegradação. A análise enantiosseletiva da LER e aplicação no controle de qualidade de formas sólidas foi realizado por eletroforese capilar (CE) utilizando tampão acetato de sódio 200 mmol L-1, pH 4,0 como eletrólito de corrida, adicionado de TM-β-CD (2, 3, 6-O-metil-β-ciclodextrina) 10 mmol L-1 como seletor quiral, na temperatura de 15 °C e 25 kV de tensão. Os parâmetros de desempenho analítico, linearidade, precisão, exatidão, limite de quantificação e detecção, seletividade e robustez foram avaliados e estão de acordo com os requisitos preconizados pelos guias oficiais. O método foi aplicado para análise de comprimidos comerciais contendo LER, e mostrou ser adequado para quantificação das amostras, apresentando valores de coeficiente de variação (CV, %) e erro relativo (E, %) inferiores a 5 %. Além disso, foi avaliada a fotoestabilidade dos enantiômeros da LER na mistura racêmica e também dos enantiômeros separados, quando expostos à luz UVC (254 nm) e visível, por HPLC. A separação dos enantiômeros da LER foi alcançada empregando a coluna quiral Chiralpak® AD 250 × 4,6 mm, partículas de 10 μm e fase móvel composta por hexano-etanol-dietilamina (97:3:0,3, v/v/v) e vazão de 1,0 mL min-1. O método foi validado e aplicado nos estudos de fotodegradação em soluçãos-padrão de LER. Em relação à exposição na luz UVC (254 nm) e visível foi observada degradação significativa dos enantiômeros da LER após 0,5 h de exposição. Além disso, os produtos de degradação foram caracterizados por LC/MS/MS e foi observada que a principal fragmentação ocorre no anel dihidropiridínico, assim como para outros fármacos desta classe, formando piridinas sem efeitos farmacológicos. Palavras-chaves: 1. Eletroforese capilar. 2. Cromatografia líquida de alta eficiência. 3. Controle de Qualidade. 4. Estudo de fotodegradação. 5. Lercanidipina. ii

ABSTRACT LOURENÇO, L. P. Enantioselective analysis of lercanidipine: quality control of pharmaceutical by capillary electrophoresis and evaluation of photodegradation by high performance liquid chromatography. Dissertação (Mestrado). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2013. Lercanidipine (LER) is a dihydropyridine calcium channel blocker commercially available as a racemic mixture, or an equimolar mixture of enantiomers (R) and LER (S)-LER. The pharmacological effects of LER essentially reside in the enantiomer (S)-LER, and in vitro studies show that this enantiomer has about 100-200 times greater affinity for calcium channels that the enantiomer (R)-LER. Consequently, the pharmacodynamic effects of LER are due mainly to the enantiomer (S)-LER. Thus, racemic drugs are extensively studied to evaluate their pharmacokinetic and pharmacodynamic properties stereoselective and check if there are advantages in the production of pure enantiomer. Moreover, due to differences in the activity of the enantiomers is essential to perform quality control enantioselective these formulations. Additonally, the molecules of this class of drugs are photosensitive. The objective of this study was to develop and validate a method for enantioselective analysis of LER and apply it in the quality control of pharmaceutical forms and also evaluate their photodegradation. The enantioselective analysis of LER and application in quality control of solid forms was performed by capillary electrophoresis (CE) using sodium acetate buffer 200 mmol L-1, pH 4.0 as background electrolyte, 10 mmol L-1TM-β-CD (2, 3, 6-O-methyl-β-cyclodextrin) as chiral selector, at temperature of 15 °C and 25 kV voltage. The analytical parameters, linearity, precision, accuracy, limit of quantification and detection, selectivity and robustness were evaluated and accordance with the requirements recommended by official guideline. The method was applied for the analysis of commercial tablets containing LER, and proved to be suitable for quantification of the samples, with of CV (%) and E (%) less than 5%. In addition, the photostability was evaluated on the LER enantiomers and racemic mixture of the enantiomers also separated when exposed to UVC (254 nm) and visible light by HPLC. Separation of enantiomers of LER was achieved using the chiral column Chiralpak ® AD 250 × 4.6 mm, particles of 10 micrometres and a mobile phase composed of hexane-ethanol-diethylamine (97:3:0.3 v/v/v ) and flow rate of 1.0 mL min-1. The method was validated and applied in studies of photodegradation of standard solutions of LER. The method was validated and applied in studies of photodegradation in soluçãos standard of LERR With relation to UVC exposure (254 nm) and visible light, significant degradation was observed after 0.5 hour exposure of the solution containing the racemic mixture and after 1 h of exposure the solution containing the isolated enantiomers of LER. Also, the degradation products were characterized by LC/MS/MS and it was observed that the major fragmentation occurs in dihydropyridine ring, as well as other drugs of this class, forming pyridines no pharmacological effects. Keywords: 1. Capillary electrophoresis. 2. High performance liquid chromatography. 3. Quality control. 4. Study photodegradation. 5. Lercanidipine.

Aluno: Mirela Mara de Oliveira Lima Leite VazTítulo: “A quimioluminescência na quantificação da penetração de componentes antioxidantes do extrato de açaí na pele”Orientador: Prof. Dr. Maria José Vieira FonsecaData da Defesa:27/09/2013

RESUMO VAZ, M. M. O. L. L. A quimioluminescência na quantificação da penetração de componentes antioxidantes do extrato de açaí na pele. 2013. 77 f. Dissertação (Mestrado). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2013. A exposição excessiva às radiações UV é capaz de limitar a capacidade dos sistemas de defesa antioxidante em nosso organismo, provocando o estresse oxidativo. Assim, extratos vegetais ricos em compostos antioxidantes são fortes candidatos a serem veiculados em formulações tópicas para a prevenção ou tratamento dos danos causados pela RUV na pele. Dentre a gama de extratos vegetais com atividade biológica, o extrato de açaí, fruto da espécie Euterpe olerecea Mart., tem se destacado por apresentar grande quantidade de antioxidantes na sua composição. Geralmente, a quantidade de ativos que consegue penetrar na pele é pequena, exigindo métodos analíticos muito sensíveis. Assim, o presente trabalho teve como objetivo avaliar o emprego do método de quimioluminescência para a quantificação da penetração dos componentes do extrato de açaí na pele por medida da atividade antioxidante. Os resultados mostraram que o IC50 do extrato de açaí para o ensaio de inibição da quimioluminescência gerada no sistema xantina/luminol/xantina oxidase foi de 0,63 μg/mL. Além disso, a quantificação do extrato de açaí utilizando esse método foi possível para porcentagens de inibição obtidas até o valor de 60%. Ainda, esse método mostrou-se preciso e exato na determinação da porcentagem de inibição da quimioluminescência do extrato de açaí na concentração próxima a IC50, sendo essa inibição não influenciada pelos componentes das diferentes formulações estudadas. No entanto, o uso da quimioluminescência como um método de quantificação da penetração de componentes antioxidantes de extratos hidrossolúveis torna o processo de extração desses componentes da pele um fator importante, no qual a escolha do solvente extrator é um ponto crítico. Assim, o solvente extrator escolhido para a realização dos estudos de penetração/retenção cutânea foi metanol:água (80:20), visto que esse solvente foi capaz de extrair os componentes antioxidantes do extrato de açaí sem retirar grande quantidade dos compostos inerentes da pele com atividade antioxidante. Por fim, a determinação da inibição da quimioluminescência gerada no sistema xantina/luminol/xantina oxidase mostrou-se um método importante na medida da atividade antioxidante de extratos na pele. Ainda, esse método foi eficaz na quantificação do extrato de açaí nos estudos de penetração/retenção com célula de difusão vertical, apesar de todos os erros inerentes desse método. Palavras-chave: açaí, antioxidantes, formulações tópicas, penetração cutânea, quimioluminescência, radiação UV. ii

ABSTRACT VAZ, M. M. O. L. L. The employment of chemiluminescence to quantify the penetration of the açai extract antioxidant components in the skin. 2013. 77 f. Dissertation (Master). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2013. The excessive exposure to UV radiation is able to decrease the antioxidant defense systems in the skin leading to the oxidative stress. Thus, plant extracts, rich in antioxidant compounds, are strong candidates to be added in topical formulations for the prevention or treatment of UV radiation induced damages. Among the range of plant extracts with biological activity, the extract of açai, fruit of the Euterpe olerecea Mart. species has become known due to the considerable amount of antioxidants in its composition. Generally, the amount of active compounds that can penetrate in the skin is low requiring sensitive analytical methods. Thus, the present study aimed to evaluate the use of chemiluminescence assay for the quantification of the penetration of açai extract components in the skin by measuring the antioxidant activity. The results showed an IC50 value of 0.63 μg/mL for the antioxidant activity determined by chemiluminescence assay using the xanthine/luminol/xanthine oxidase system. Moreover, the quantification of acai extract using this method was possible for percentages of inhibition obtained until the 60% of inhibition value. Additionally, this method proved to be precise and accurate in determining the percentage of chemiluminescence inhibition of acai extract at concentrations values close to the IC50 value. Additionally, it was observed that the inhibition was not influenced by the different components of the formulations studied. However, the use of chemiluminescence assay to quantify the penetration of water-soluble extract antioxidant components makes the extraction process of these components from the skin an important step in which the selection of the extractor solvent is a critical point. In the present study it was selected methanol:water (80%) as an organic extractor solvent which was able to extract the antioxidant components of the acai extract without removing large amounts of inherent compounds of the skin with antioxidant activity. Finally, the determination of the chemiluminescence generated in the xanthine/luminol/xanthine oxidase system inhibition showed to be an important method for the measurement of the antioxidant activity of plant extracts in the skin. Still, this method was effective in quantifying the acai extract in cutaneous penetration/retention studies using vertical diffusion cells despite all the intrinsic errors of this used method. Keywords: acai, antioxidants, topical formulations, cutaneous penetration, chemiluminescence, UV radiation.

Aluno: Raquel PetrilliTítulo: “Nanopartículas de fase líquido cristalina hexagonal funcionalizadas com peptídeos de transdução para veiculação de siRNA na terapia de doenças tópicas”Orientador: Prof. Dr. Maria Vitoria Lopes Badra BentleyData da Defesa:08/03/2013

RESUMO PETRILLI, R. Nanopartículas de fase líquido cristalina hexagonal funcionalizadas com peptídeos de transdução para veiculação de siRNA na terapia de doenças tópicas. 2013. 99f. Dissertação (Mestrado). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2013. O processo de interferência de RNA refere-se ao silenciamento pós transcricional seqüência-específico de genes em animais e plantas capaz de ser promovido por dsRNA homólogo à seqüência do gene silenciado. Este processo pode ser aplicado como terapia, que apresenta como vantagens a especificidade pelos alvos escolhidos, a possibilidade de tratar uma enorme gama de doenças genéticas, além do fato de ser muito potente e eficaz. Contudo, o principal desafio consiste em manter a estabilidade dos siRNAs nos fluidos biológicos, visto que estes são bastante susceptíveis à excreção renal e a degradação por RNAses. Com isso, reforça-se a necessidade de sistemas de liberação adequados, que sejam capazes de manter a estabilidade dos siRNAs por tempo suficiente para que atinjam os órgãos alvo da terapia e promover sua liberação sustentada. De particular interesse são determinadas proteínas e peptídeos de transdução (PTDs) que podem ser ligados a fármacos hidrofílicos e assim tornam possível com que estes atravessem membranas. Neste sentido, muitos sistemas carreadores não-virais tem sido estudados para a veiculação de siRNA, sendo de cunho inovador o desenvolvimento de sistemas de liberação nanoestruturados baseados em cristais líquidos funcionalizados com peptídeos de transdução de membrana para a veiculação tópica de siRNAs. Desta forma, nanopartículas de cristais líquidos de fase hexagonal contendo ou não os aditivos catiônicos polietileimina (PEI) e oleilamina (OAM) foram funcionalizadas com peptídeos de transdução de membranas TAT (TAT) ou penetratin (PNT). Os sistemas obtidos foram complexados com siRNA por interação eletrostática e caracterizados através de medidas de tamanho de partícula/ polidispersividade, potencial zeta e eficiência de complexação. A citotoxicidade dos sistemas foi avaliada em fibroblastos L929 pelo ensaio do MTT e por citometria de fluxo e a avaliação da transfecção in vitro foi realizada por citometria de fluxo e por microscopia de fluorescência. Os sistemas contendo PEI ou OAM apresentavam potencial zeta positivo e foram capazes de complexar o siRNA adicionado na concentração de 10 μM. Os estudos em culturas celulares demonstraram que os sistemas contendo ácido oleico (AO) foram mais eficientes quanto à transfecção em células de fibroblastos L929 e esta eficiência de transfecção foi aumentada com a funcionalização com o peptídeo TAT. A partir daí, os sistemas selecionados foram avaliados quanto a penetração cutânea in vivo. Os sistemas nanodispersos formados por MO/AO/PEI proporcionaram uma maior liberação de siRNA na pele e a eficiência de supressão de TNF-alfa em modelo animal de inflamação cutânea foram maiores que formulações controle. Com isso, demonstrou-se que os sistemas desenvolvidos são promissores para a futura aplicação na terapia gênica tópica de doenças cutâneas inflamatórias. Palavras-chave: siRNA, nanodispersões líquido cristalinas, pele, fibroblastos. Introdução

ABSTRACT PETRILLI, R. Hexagonal phase liquid crystalline nanonoparticles functionalyzed with transduction peptides for siRNA vehiculation in the therapy of topical diseases . 2013. 99f Dissertation (Master’s). College of Pharmaceutical Sciences of Ribeirão Preto – University of São Paulo, Ribeirão Preto, 2013. The RNA interference process refers to the sequence-specific post-transcriptional silencing of genes in animals and plants capable of being promoted by dsRNA that are homologous to the sequence of the silenced gene. This process can be applied as therapy, which presents advantages such as the specificity to the chosen targets, the possibility to treat a variety of genetic diseases, besides being very potent and efficacious. However, the major hurdle consists in keeping the siRNAs stability in the biological fluids, because they are susceptible to renal clearance and degradation by RNAses. Thus, there is the need for suitable delivery systems, capable of maintaining the stability of siRNAs for sufficient time so they can reach the target organ in the therapy and promote sustained release. Of particular interest are certain proteins and peptides transduction domains (PTDs) that can be connected to hydrophilic drugs and thus make it possible to cross cell membranes. Within this context, many non-viral vectors have been studied for siRNA vehiculation which makes innovative the present study because it aims at the development of nanostructured delivery systems based on liquid crystals functionalyzed with membrane transduction peptides for the topical vehiculation of siRNAs. Thus, hexagonal phase liquid crystal nanoparticles containing or not the cationinc polyethylenimine (PEI) and oleylamine (OAM) were functionalyzed with membrane transduction peptides TAT (TAT) or penetratin (PNT). The obtained systems were complexed with siRNA by eletrostatic interaction and characterized for particle size, polidispersity, zeta potential and complexation efficiency. The cytotoxicity of the formulations was performed with L929 fibroblasts by MTT assay and flow cytometry and the in vitro transfection was evaluated by flow cytometry and fluorescence microscopy. The systems containing PEI or OAM presented positive zeta potential and could complex siRNA at the concentration of 10 μM. The cell culture studies demonstrated that the systems containing oleic acid (OA) were the most efficient to transfect L929 cells and the transfection efficiency was enhanced with the functionalization with the TAT peptide. Thereafter, the selected systems were evaluated for the in vivo skin penetration. The nanosdispersed systems composed of MO/OA/PEI functionalyzed with TAT resulted in a higher siRNA penetration and release in the skin, promoting higher TNF alfa supression in animal model of cutaneous inflammation, compared to the control formulations. Hence, we demonstrated that the developed systems are promising for the treatment of inflammatory skin diseases. Key-words: siRNA, liquid crystalline nanodispersions, fibroblasts

Aluno: Sônia Aparecida FigueiredoTítulo: “Avaliação in vitro e in vivo do potencial fotoprotetor e/ou fotoquimioprotetor do extrato etanólico do epicarpo de Garcinia brasiliensis”Orientador: Prof. Dr. Maria José Vieira FonsecaData da Defesa:21/03/2013

RESUMOFIGUEIREDO, S. A. Avaliação in vitro e in vivo do potencial fotoprotetor e/ou fotoquimioprotetor do extrato etanólico do epicarpo de Garcinia brasiliensis (EEEGb). 2013. 101 p. Dissertação (Mestrado). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2013.A radiacao solar ultravioleta (RUV) pode induzir efeitos a pele devidos a sua acao direta ou indireta, por meio da geracao de radicais livres. Esses efeitos podem provocar diversas lesões na pele humana como o cancer de pele. No Brasil, segundo o Instituto Nacional do Cancer (INCA, 2012), este tipo de cancer corresponde a 25% de todos os tumores diagnosticados. Como medida profilatica de protecao da pele contra os efeitos da radiacao solar pode-se citar o uso de protetores solares, produtos topicos adicionados de filtros solares UV sinteticos com propriedades de absorcao e reflexao dos raios solares, e como medida preventiva e recomendado o uso de fotoquimioprotetores, produtos topicos ou de administracao oral incorporados de extratos vegetais ou substancias naturais isoladas com atividades antioxidante e/ou sequestradora de radicais livres e atividade anti-inflamatoria. Os protetores solares são considerados produtos OTC, em alguns paises, e por isso devem ter sua eficacia comprovada por metodos in vitro ou in vivo padronizados. Assim, o presente trabalho teve como objetivo investigar o potencial fotoprotetor e/ou fotoquimioprotetor do extrato etanolico do epicarpo de Garcinia brasiliensis usando metodos in vitro e in vivo, respectivamente. O extrato foi caracterizado quimicamente por medida dos teores de flavonoides, polifenois e lipidios e funcionalmente pela determinacao da atividade antioxidante e/ou sequestradora de radicais livres por diferentes metodos in vitro. A citotoxidade e fotoestabilidade do extrato, como tambem, o potencial fotoprotetor do extrato e das formulacoes adicionadas deste em diferentes concentracoes foram avaliados in vitro por medida da viabilidade celular de cultura de celulas de fibroblastos (L929). A eficacia fotoprotetora e/ou fotoquimioprotetora da formulacao adicionada do extrato foi testada in vivo por medida das quantidades de GSH endogeno e das interleucinas IL-1β e TNF-α, como tambem, pela medida da atividade da mieloperoxidase, usando os camundongos hairless, como modelo animal. Os teores de flavonoides e polifenois de 3,4 mg EQ/g e 69,84 mg EAG/g, respectivamente, foram menores aqueles de outros extratos vegetais. Os menores teores de flavonoides e polifenois refletiram na menor atividade antioxidante desse extrato que apresentou valores de IC50 de 47,47 μg/mL e 425,06 μg/mL para atividade antioxidante determinada pelos metodos de DPPH• e peroxidacao lipidica, respectivamente. O teor de lipidio encontrado foi de 45%, isto sugere que esse extrato deve ser armazenado em condicoes controladas para minimizar a sua instabilidade por meio da oxidacao dos lipidios por reacoes oxidativas. Os estudos de citotoxidade mostraram que o extrato na concentracao de 25 μg/mL diminuiu em 40% a viabilidade das celulas L929. A citotoxidade do extrato foi maior quando exposto a radiação UVA que a UVB, sugerindo que este extrato pode ser mais fotoinstavel a radiacao UVA. Nos testes de fotoprotecao empregando culturas de celulas, o extrato na concentracao de 100 mg/mL e formulacao adicionada de 20% de extrato aumentaram a viabilidade das células L929 expostas a radiacao UVB na mesma proporcao aquela do protetor solar comercial com FPS 15. Nos testes in vivo, a formulacao adicionada de 20% de extrato mostrou eficácia fotoprotetora, protegeu o GSH da deplecao, nao permitiu o aumento da atividade da mieloperoxidase e das quantidades das citocinas, IL-1β e TNF- α, na pele exposta a radiacao

UVB.Palavras chave: Garcinia brasiliensis, atividade antioxidante, citotoxidade, fotoprotecao,fotoquimioprotecao, metodo in vitro, metodo in vivo.

ABSTRACTFIGUEIREDO, S. A. In vitro and in vivo photochemical/photoprotective potential of epicarp ethanolic extract of Garcinia brasiliensis (GbEEE). 2013. 101 p. Dissertation (Master). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2013.The solar ultraviolet radiation (UVR) can induce harmfull effects to the skin by direct action or through the generation of free radicals. These effects can cause various skin lesions such as skin cancer. According to the National Institute of Cancer (INCA, 2012) this type of cancer accounts for 25% of all tumors diagnosed in Brazil. In order to protect the skin against the effects of solar radiation it is recommended the use of sunscreens and topical products added to synthetic sunscreens with properties of absorption and reflection of solar rays. Moreover it is increasing the interest in the use of photochemoprotectors including topical or oral products incorporated with plant extracts or natural substances isolated with antioxidant and/or free radical scavenging and anti-inflammatory activity. Sunscreens are considered OTC products, in some countries, and therefore must have proven effective for in vitro or in vivo standardized. Thus, the present study aimed to investigate the photochemical/photoprotective potential of the ethanolic extract of the Garcinia brasiliensis epicarp using in vitro and in vivo methods, respectively. The extract was chemically characterized by measuring the levels of flavonoids, polyphenols and lipids and functionally by determining the antioxidant activity and/or free radical scavenging using different methods in vitro. The cytotoxicity and photostability of the extract and the photoprotective potential of the extract and formulations added extract with different concentrations of the extract were assessed in vitro by measurement of cell viability using cell culture of fibroblasts (L929). The photochemical/protoprotective effect of the formulation added with the extract was tested in vivo by measuring the amounts of endogenous GSH and interleukins IL-1β and TNF-α, besides by measuring myeloperoxidase activity using hairless mice as an animal model. The determined levels of flavonoids and polyphenols of 3.4 mg EQ/g and 69.84 mg GAE/g, respectively, were considered lower than those observed in other plant extracts. The lower levels of flavonoids and polyphenols reflected in lower antioxidant potential of the extract which showed IC50 values of 47.47 and 425.06 mg/mL for antioxidant activity determined by DPPH• and lipid peroxidation methods, respectively. The lipid content was found to be 45%, which suggests that this extract must be stored under controlled conditions to minimize their instability by oxidation of the lipids by oxidative reactions. Cytotoxicity studies showed that the extract at a concentration of 25 mg/mL decreased in 40% the viability of L929 cells. The cytotoxicity of the extract was higher when exposed to UVA than to UVB, suggesting that this extract might be more photoinstable to UVA radiation. In photoprotection tests employing cell culture the extract (100 mg/mL) and the formulation added with 20% of the extract increased the viability of L929 cells exposed to UVB radiation at the same rate to that observed when it was used a commercial sunscreen with an SPF of 15. In vivo results showed that the formulation added with 20% of the extract showed a photoprotective effect when observed the reduction of GSH depletion in treated mice as such as the reduction of myeloperoxidase activity and amounts of cytokines IL-1β and TNF-α in treated skin exposed to radiation UVB in comparison to the non-treated irradiated control. Keywords: Garcinia brasiliensis, antioxidant activity, cytotoxicity, photoprotection, photochemioprotection, in vitro method, in vivo method.

Aluno: Ana Claudia Rodrigues de SiqueiraTítulo: “Bioprocessos fermentativos, purificação, caracterização e estabilização de peptidase secretada pelo fungo Aspergillus terreus”Orientador: Prof. Dr. Hamilton CabralData da Defesa: 15/ 03 / 2013

RESUMOSIQUEIRA, A. C. R. Bioprocessos fermentativos, purificação, caracterização e estabilização de peptidase secretada pelo fungo Aspergillus terreus. 2013. 67 p. Dissertação (Mestrado). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2013.Os fungos filamentosos são utilizados em larga escala na produção de produtos biotecnológicos na indústria devido a sua versatilidade e um dos exemplos são as peptidases que representam uma das principais classes de enzimas hidrolíticas. As peptidases são hidrolases que catalisam a quebra das ligações peptídicas das proteínas e que nos microrganismos são responsáveis por funções fisiológicas e patológicas, além de ter muitas aplicações em diversos campos industriais. Neste estudo foram analisados diferentes bioprocessos fermentativos para produção de peptidases pelo fungo Aspergillus terreus. Este microrganismo foi capaz de produzir peptidases em ambos os bioprocessos, sólido ou submerso, obtendo melhor performance e o pico de produção no bioprocesso fermentativo sólido de valor 677U/mL, nas condições 5g de farelo de trigo, 72 horas, 30°C e 75% de umidade. Utilizando o bioprocesso fermentativo submerso também obtivemos resultados satisfatórios com pico de atividade de 360U/mL, nas condições de meio padrão suplementado com Caseína 0,5%, 72 horas e 35°C. A caracterização bioquímica parcial dos extratos dos dois bioprocessos mostrou semelhanças entre algumas características das enzimas produzidas como a faixa extensa de pH ótimo abrangendo regiões ácidas, neutra e alcalinas, temperatura ótima pontual de 55°C e perfil de inibição pelo PMSF e EDTA. Contudo, os perfis de estabilidade (pH e temperatura) e comportamento frente a adição de íons apresentaram respostas diferentes entre si, o que sugere a produção de enzimas diferentes produzidas pelomesmo fungo em meios distintos. A microencapsulação por Spray Drying como processo de estabilização foi satisfatória obtendo rendimentos de 37,5-58,2% e com níveis acima de 50% de atividade enzimática. Em contrapartida, a imobilização enzimática demonstrou ser eficaz na etapa de ligação ao suporte, mas não foi capaz de estabilizar a enzima presente no extrato, o que ficou caracterizado pela perda de atividade proteolítica.Palavras-chave: peptidase, bioprocessos fermentativos, fungos filamentosos, microencapsulação, imobilização.

ABSTRACTSIQUEIRA, A. C. R. Fermentation bioprocesses, purification, characterization and stabilization of peptidase secreted by the fungus Aspergillus terreus. 2013. 67 p. Dissertation (Master). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2013.Filamentous fungi are extensively used in the production of biotechnological products in industry because of their versatility and one of the examples are peptidases which constitute a major class of hydrolytic enzymes. The peptidases are hydrolases which catalyze the cleavage of peptide bonds of proteins and microorganisms that are responsible for the physiological and pathological roles, in addition to having many applications in various industrial fields. This study evaluated various bioprocesses for fermentative production of peptidases by the fungus Aspergillus terreus. This microorganism was able to produce peptidase in both bioprocess, solid or submerged, achieving better performance in the solid bioprocess with peak of production of 677U/mL under the conditions 5g wheat bran, 72 hours, 30°C and 75% humidity . Using submerged fermentation bioprocess we also obtained satisfactory results with peak of activity of 360U/mL with conditions of standard medium supplemented with 0.5% casein, 72 hours and 35°C. Biochemical characterization of the two partial purified extracts showed similarities between some characteristics of the enzymes produced, as large optimum pH range spanning regions acidic, neutral and alkaline point temperature optimum of 55 ° C and the inhibition profile of PMSF and EDTA. However, the stability profiles (pH and temperature) and behavior in addition ions showed different responses to each extract, which suggests the production of different enzymes in different ways. Microencapsulation by Spray Drying and stabilization process was obtaining satisfactory yields of 37.5 to 58.2%, with levels above 50% of enzyme activity. In contrast, the enzyme immobilization step was effective in bonding the support, but was not able to stabilize the enzyme present in the extract, which was characterized by the loss of proteolytic activity. Keywords: peptidase, fermentation bioprocesses, filamentous fungi, microencapsulation, immobilization.

Aluno: Andres Mauricio Caraballo RodriguezTítulo: “Acesso a produtos naturais mediante a estratégia de cultivos mistos de endofíticos: o fungo Colletotrichum boninense FLe 8.1 ea actinobactéria Streptomyces albospinus RLe 7”Orientador: Profa. Dra. Monica Tallarico PupoData da Defesa: 22/ 02 / 2013

RESUMOCARABALLO RODRÍGUEZ, A. M. Acesso a produtos naturais mediante a estratégia de cultivos mistos de endofíticos: o fungo Colletotrichum boninense FLe 8.1 e a actinobactéria Streptomyces albospinus RLe 7. 2013. 167 f. Dissertação. Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2013.Na literatura encontram-se referências de estudos envolvendo micro-organismos endofíticos, e mais recentemente estudos que avaliam a interação entre micro-organismos o que resulta na modificação, no tipo ou quantidade dos compostos que são produzidos. Neste trabalho foram realizados cultivos simples e mistos do fungo Colletotrichum boninense FLe 8.1 e da actinobacteria Streptomyces albospinus RLe 7, endófiticos isolados de Lychnophora ericoides que pertencem à coleção do Laboratório de Química de Microorganismos (LQMo) da FCFRP-USP, com o objetivo de aumentar suas capacidades de produção de novos compostos com atividade biológica. O cultivo misto, ou co-cultivo, é uma estratégia que tem sido usada para o acesso aos produtos naturais de origem microbiana. Existem poucos relatos de compostos com atividade biológica isolados a partir de S.albospinus e não há relatos de metabólitos secundários obtidos a partir de C. boninense. Nenhum desses micro-organismos tem sido descrito como endofítico na literatura e não existem relatos sobre co-cultivos envolvendo qualquer um deles na busca de compostos bioativos. Juntando as informações geradas através das diferentes técnicas de detecção utilizadas, como TLC, HPLC-DAD, GC-MS, ESI-MS, RMN e depois da análise correspondente, foi possível identificar e atribuir as estruturas de algumas substâncias conhecidas de origem microbiana como a mevalonolactona, o tirosol, a fisostigmina, a desferrioxamina E. ESI-MS foi utilizada para análises dos extratos brutos originados dos cultivos em meio arroz parbolizado permitindo visualizar compostos produzidos em baixas quantidades pelos micro-organismos na cultura simples quanto na co-cultura. Além disso, foram obtidos os perfis metabólicos desses micro-organismos a partir de cultivos em placa de Petri, possibilitando a detecção dos metabólitos em regiões específicas da interação microbiana, o que conduziu à identificação da fisostigmina e o seu análogo N-etilcarbamato produzidos pela actinobactéria, na interação com o fungo. Análises posteriores de MS sequencial permitiram obter perfis de fragmentação, os quais, juntamente com os dados dos íons detectados nos extratos, foram comparados com a informação disponível em bases de dados como DNP, METLIN e MassBank. Tais informações geradas a partir dessas análises permitiram sugerir possíveis compostos envolvidos na interação dos micro-organismos endofíticos mencionados. Foi sugerido que a fisostigmina, substância produzida pela actinobactéria S. albospinus RLe 7 e isolada nesse trabalho, poderia ter algum papel na inibição do crescimento do fungo C. boninense FLe 8.1 já que a inibição só foi observada quando cultivados ambos os micro-organismos na mesma placa de Petri. Porém, bioensaios com fisostigmina pura demonstraram que essa substância não possui atividade antifúngica per se, mas é possível que exista uma sinergia com outras substancias produzidas pela actinobactéria. Os resultados apresentados nesse trabalho demonstram a importância do uso de técnicas de detecção muito sensíveis, como a ESI-MS, na identificação de substâncias envolvidas na troca metabólica e permitiram gerar informações que serão utilizadas em estudos futuros utilizando esses micro-organismos endofíticos.Palavras-chave: Micro-organismos endófiticos, produtos naturais, Streptomyces albospinus, Colletotrichum boninense, co-cultivo, fisostigmina.

ABSTRACTCARABALLO RODRÍGUEZ, A. M. Access to natural products by using the co-culture strategy of endophytic microorganisms: fungus Colletotrichum boninense FLe 8.1 and actinobacteria Streptomyces albospinus RLe 7. 2013. 167 f. Dissertation. Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2013.There are several studies involving endophytic microorganisms, and more recently some studies evaluate microbial interaction resulting in metabolic profiles modifications. In this study, simple and mixed cultures of the fungus Colletotrichum boninense FLe 8.1 and the actinobacteria Streptomyces albospinus RLe 7 were carried out. These endophytic microorganisms, isolated from Lychnophora ericoides, belong to the collection of the Laboratory of Microbial Chemistry (LQMo) of the FCFRP-USP. The main goal of this work was to increase the bioactive compounds production capacities. Co-culture, or mixed culture, is a recent strategy for accessing microbial natural products. There are few reports of bioactive metabolites from S. albospinus RLe 7 and there are no one about secondary metabolites obtained from C. boninense FLe 8.1. Neither the actinobacteria nor the fungus have been described as endophytic microorganisms and there are no co-culture studies involving these microorganisms in order to obtain natural products. Joining and analyzing all together the generated information from several detection techniques, such as TLC, HPLCDAD, GC-MS, ESI-MS, NMR, it was possible to identify and attribute the chemical structures of some known natural, such as mevalonolactone, tyrosol, physostigmine and deferrioxamine E. ESI-MS was used for extracts analysis from cultures in parboiled rice medium, allowing visualization of compounds produced in very low yields. Besides that, it was possible to obtain metabolic profiles from cultures in Petri dishes, leading to the detection of metabolites in specific regions of the microbial interaction. Physostigmine and its N-ethylcarbamate analogue were identified as actinobacteria metabolites in the interaction against the fungus. Posterior analysis by MS/MS allowed to obtain fragmentation profiles, which together with the ions detected from the extracts analysis, were compared by searching in databases, such as DNP, METLIN and MassBank. Such information allowed to suggest possible candidates for the compounds involved in the microbial metabolic exchange. It was hypothesized that physostigmine, isolated from the actinobacteria in this work, had a role in the fungal growth inhibition observed when both microorganisms were co-cultured. However, this substance did not show considerable antifungal activity when tested against C.boninense FLe 8.1, but it is possible that other compounds produced by this actinobacteria are acting in a synergistic way. The results showed here demonstrated the importance of very sensitive techniques, as ESI-MS, in the identification of molecules involved in the microbial metabolic exchange and will help in the generation of information for future studies involving those endophytic microorganisms.Keywords: Endophytic microorganisms, natural products, Streptomyces albospinus, Colletotrichum boninense, co-culture, physostigmine.

Aluno: Ariandra Guerini SartimTítulo: “Efeitos da administração de canabidiol no CPFmv de ratos submetidos ao teste do nado forçado”Orientador: Profa. Dra. Sâmia Regiane Lourenço JocaData da Defesa: 19/ 03 / 2013

RESUMO

SARTIM, A. G. Efeitos da administração de canabidiol no CPFmv de ratos submetidos ao teste do nado forçado. 2013. Dissertação (Mestrado). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2013.A administração sistêmica de canabidiol (CBD), o principal constituinte não psicomimético da Cannabis sativa, induz efeito antidepressivo em modelos préclínicos. O mecanismo de ação do canabidiol, no entanto, permanece pouco conhecido, podendo envolver a ativação de receptores serotoninérgicos do tipo 1ª (5-HT1A). Ademais, as estruturas encefálicas envolvidas nesses efeitos permanecem desconhecidas. O córtex pré-frontal medial ventral (CPFmv), dividido em infra-límbico (IL) e pré-límbico (PL), recebe densa inervação serotoninérgica e desempenha importante papel na modulação da resposta emocional ao estresse e na neurobiologia da depressão. Dessa forma, o objetivo do presente trabalho foi avaliar a hipótese de que a administração de canabidiol no CPFmv, diferenciado em PL e IL, produz efeito tipo-antidepressivo por meio da ativação de receptores 5-HT1A. Para tanto, ratos Wistar canulados bilateralmente no CPFmv, receberam CBD (10, 30, 60 nmol/0,2μl) ou veículo intra-PL e CBD (30, 45 e 60nmol/0,2μl) ou veículo intra-IL e foram submetidos ao teste do nado forçado ou ao teste do campo aberto. Outro grupo de animais recebeu microinjeção (intra PL ou IL) do agonista de receptores 5-HT1A, 8-OH-DPAT (5, 10nmol/0,2μl) e foram submetidos aos mesmos testes. Um grupo adicional recebeu um antagonista 5-HT1A, WAY1006365 (10, 30nmol/0,2μl), seguido pela administração de 8-OH-DPAT (10nmol0,2μl) ou CBD (10 nmol0,2μl) intra-PL, ou 8-OH-DPAT (10nmol0,2μl) ou CBD (45 nmol0,2μl) intra-IL, e avaliados no teste do nado forçado. Os resultados demonstraram que a administração de CBD e de 8-OH-DPAT, intra-PL e intra-IL, reduziu significativamente o tempo de imobilidade no teste do nado forçado, um efeito tipoantidepressivo, sem alterar a atividade locomotora dos animais no teste do campo aberto. Além disso, a administração de WAY100635 intra-PL e intra-IL não alterou o tempo de imobilidade per se, mas foi capaz de bloquear os efeitos da administraçãodo CBD e do 8-OH-DPAT. Esses resultados sugerem que a administração local do CBD no CPFmv induz efeito tipo-antidepressivo por meio da ativação de receptores 5-HT1A. Portanto, é possível que o CPFmv esteja envolvido no efeito tipoantidepressivo induzido pelo CBD. Palavras-chave: canabidol, córtex pré-frontal medial ventral, depressão.

ABSTRACTSARTIM, A. G. Effects of cannabidiol administration into the vmPFC of rats submitted to the forced swimming test. 2013. Dissertation (Master). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2013. Systemic administration of cannabidiol (CBD), the main non-psychotomimetic constituent of Cannabis sativa, induces antidepressant-like effects in pre-clinical models. The mechanism of action of Cannabidiol, which remains poorly understood, may involve serotonergic type 1A receptors activation (5-HT1A). Furthermore, the brain structures involved in these effects are still unknown. The ventral medial prefrontal cortex (vmPFC), divided in infra-limbic (IL) and pre-limbic (PL) subregions, receives dense serotonergic innervation and plays an important role in the modulation of emotional responses to stress and in the neurobiology of depression.Thus, the aim of this study was evaluate the hypothesis that the administration of cannabidiol into the vmPFC, differentiated into IL and PL, would induce antidepressant-like effect by activating 5-HT1A receptors. Therefore, male Wistar rats with cannulae bilaterally implanted into the Il and PL were given CBD (10, 30, 45, 60 nmol/0,2μl) or vehicle and were submitted to the forced swimming test or to the open field test. Another group of animals received microinjections (intra PL or IL) of the 5- HT1A agonist 8-OH-DPAT (5, 10nmol/0,2μl) and was submitted to the same tests. An additional group received an 5-HT1A antagonist, WAY100635 (10, 30 nmol/0,2μl.), followed by the administration of 8-OH-DPAT (10 nmol/0,2μl) or CBD (10 nmol0,2μl) intra-PL, or 8-OH-DPAT (10nmol0,2μl) or CBD (45 nmol0,2μl) intra-IL, and avaluated in the forced swimming test. The results showed that CBD and 8-OH-DPAT administration, intra-PL and intra-IL, significantly reduced the immobility time in the forced swimming test, an antidepressant-like effect, without changing the locomotor activity of the animals in the open field test. Moreover, the administration of WAY100635, intra-PL and intra-IL, did not change the immobility time per se, but blocked the CBD- and 8-OH-DPAT-induced effects. These results suggest that the local administration of CBD into the vmPFC induces antidepressant-like effects through the activation of 5-HT1A receptors. Therefore, it is possible that the vmPFCis involved in CBD-induced antidepressant-like effect.Keywords: cannabidiol, ventromedial prefrontal córtex, depression

Aluno: Camila Raquel PaludoTítulo: “Biotransformação da β-lapachona utilizando culturas microbianas: uma alternativa para estudos de metabolismo in vitro”Orientador: Profa. Dra. Niege Araçari Jacometti Cardoso FurtadoData da Defesa: 05/ 03 / 2013RESUMOPALUDO, C. R. Biotransformação da β-lapachona utilizando culturas microbianas: uma alternativa para estudos de metabolismo in vitro. 2013. 200f. Dissertação (Mestrado). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2013.A β-lapachona é uma orto-naftoquinona consagrada por suas atividades farmacológicas, principalmente pela antitumoral, porém não há descrição de estudos de biotransformação microbiana da β-lapachona. Tais estudos podem propiciar a obtenção de novos derivados dessa naftoquinona, além de fornecerem informações importantes sobre seu metabolismo. Muitos trabalhos descrevem que micro-organismos podem catalisar reações mimetizando enzimas humanas. Para o desenvolvimento dessa pesquisa, a β-lapachona foi obtida por semissíntese a partir do lapachol. Nos processos de biotransformação foram utilizados os fungos filamentosos Mucor rouxii, Cunninghamella elegans, Cunninghamella echinulata, Penicillium crustosum e Papulaspora immersa e as bactérias gastrointestinais Escherichia coli, cultivada em aerobiose e anaerobiose, Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium sp. e cultura mista composta por Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium sp. e Streptococcus salivarius subesp. thermophilus. Com o intuito de estabelecer uma comparação entre o metabolismo microbiano da β-lapachona com o do seu isômero α-lapachona, estudos de biotransformação utilizando o fungo M. rouxii foram também conduzidos com a α-lapachona. Sete derivados de biotransformação da β-lapachona com o fungo M. rouxii foram identificados, sendo um inédito, cinco já descritos na literatura em um trabalho de metabolismo dessa naftoquinona utilizando sangue de mamíferos e humanos e uma espirobenzolactona relatada em um trabalho de síntese. Outros dois derivados inéditos da β-lapachona, os quais são regioisômeros conjugados com glicose, foram produzidos após formação de hidroquinona no processo coduzido com o fungo C. elegans. O fungo P. immersa forneceu duas lactonas isoméricas também obtidas com a biotransformação com o fungo M. rouxii. Houve resultados positivos, com detecção de possíveis produtos de biotransformação da β-lapachona por CLAE-DAD, com as bactérias E. coli em aerobiose e Bifidobacterium sp. No entanto, esses processos apresentaram um baixo rendimento, sendo possível a identificação de apenas um derivado com a E. coli, que também foi obtido com a biotransformação com o fungo M. rouxii. Um derivado glicosilado da α-lapachona foi produzido após 24 horas de incubação no processo desenvolvido com o fungo M. rouxii, sendo posteriormente convertido em hidroxilapachol, que por sua vez originou a α-lapachona novamente e também a β-lapachona, a qual foi metabolizada também. O derivado glicosilado majoritário, obtido da biotransformação com a β-lapachona com o fungo C. elegans, foi submetido à avaliação da atividade citotóxica frente à linhagem de câncer de mama humano SKBR-3 apresentando IC50 igual a 312,5 μM, sendo o IC50 da β-lapachona frente à mesma linhagem igual a 5,6 μM. O derivado majoritário não apresentou citotoxidade frente à linhagem de fibroblastos normais humanos GM07492-A, enquanto a β-lapachona foi altamente citotóxica (IC50 igual a 7,25 μM). Esse mesmo derivado inédito foi também produzido em pequena quantidade no processo desenvolvido com o fungo C.echinulata. Na metabolização microbiana da β-lapachona ocorreram tanto reações de fase I como de fase II, havendo mimetização do metabolismo de mamíferos, inclusive de humanos, como relatado em trabalhos da literatura.Palavras-chave: Transformações microbianas; β-lapachona; metabolismo in vitro; fungos filamentosos; bactérias intestinais.

ABSTRACTPALUDO, C. R. Biotransformation of β-lapachone using microbial cultures: na alternative to in vitro metabolism studies. 2013. 200f. Dissertation (Master). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2013.β-lapachone is considered an important ortho-naphthoquinone by their pharmacological activities, mainly antitumor, but there is no description of microbial biotransformation studies of β-lapachone. These researches may furnish new derivatives and significant information on its metabolism. Many studies describe that microorganisms can catalyze reactions mimicking human enzymes. β-lapachone was obtained by semisynthetic procedure from lapachol. Biotransformation processes were carried out using the filamentous fungi Mucor rouxii, Cunninghamella elegans, Cunninghamella echinulata, Penicillium crustosum and Papulaspora immersa and the gastrointestinal bacteria Escherichia coli grown aerobically and anaerobically, Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium sp. and mixed culture with Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium sp. and Streptococcus salivarius subsp. thermophilus. In order to establish a comparison between β-lapachone microbial transformation and those of its isomer α-lapachone, biotransformation studies of α-lapachone were also carried out using M. rouxii. Seven derivatives of β-lapachone were produced in the process performed by M. rouxii, including one unpublished, five already described in a study of metabolism by mammalian and human blood and one spirobenzolactone reported in a syntetic study. Other two unpublished derivatives of β-lapachone, which are regioisomers conjugated with glucose, were produced after formation of hydroquinone in the process carried out by C. elegans. P. immersa provided two isomeric lactones also obtained by biotransformation with M. rouxii. Possible biotransformation products were detected by using HPLC-DAD in the processes carried out by the bacteria E. coli under aerobic condition and Bifidobacterium sp. However, these processes exhibited a low yield, and it was possible to identify only one derivative produced by E. coli, which was also obtained in the process performed by M. rouxii. A glycosylated derivative of α-lapachone was produced by biotransformation with M. rouxii after 24 hours of incubation andsubsequently was converted in hydroxylapachol, which in turn gave rise to α-lapachone again and also to β-lapachone, which was also metabolized. The major derivative produced in the process carried out by C. elegans was submitted to cytotoxic activity evaluation using human breast cancer cell line SKBR3 showing IC50 312.5 μM, being the β-lapachone IC50 5.6 μM against the same cell line. The major derivative did not show cytotoxicity to normal human fibroblast GM07492-A cell line, while β-lapachone was highly cytotoxic (IC50 7.25 μM). The same major derivative was also produced in smaller yield in the process performed by C. echinulata. In the β-lapachone microbial transformation studies occurred phase I and phase II reactions, mimicking the metabolism of mammals, including humans, as reported in literature.Keywords: Microbial transformations; β-lapachone; in vitro metabolism; filamentous fungi; intestinal bacteria.

Aluno: Eduardo Afonso da Silva JuniorTítulo: “Estudos de metabolismo in vitro de produtos naturais: biotransformação microbiana da piplartina”Orientador: Profa. Dra. Monica Tallarico PupoData da Defesa: 25/ 03 / 2013

RESUMOSILVA JUNIOR, E. A. Estudos de metabolismo in vitro de produtos naturais: biotransformação microbiana da piplartina. 2013. 141 f. Dissertação (Mestrado). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2013.A piplartina é um alcaloide natural conhecido por apresentar diversas atividades biológicas, onde se destaca a ação anticancerígena. Esse produto natural apresentou atividade seletiva frente a vários tipos de células cancerígenas, sendo assim considerado promissor para o desenvolvimento de fármacos. O conhecimento do metabolismo de produtos naturais bioativos é uma importante e necessária etapa para avaliar a eficácia e segurança dessas substâncias. Os micro-organismos são amplamente utilizados em estudos de metabolismo, uma vez que catalisam reações quimio-, régio-, e estereoespecíficas, que muitas vezes são semelhantes às catalisadas pelos seres humanos. Nesse contexto, esse trabalho teve o objetivo de estudar o metabolismo microbiano da piplartina pelos fungos endofíticos Papulaspora immersa SS13 e Penicillium crustosum VR4, de solo Mucor rouxii NRRL 1894, e de coleção comercial Cunninghamella echinulata ATCC 8688a e Beauveria bassiana ATCC 7159. Os experimentos de biotransformação foram monitorados por UPLC-DAD-MS e UPLC-DAD-MS/MS. Todos os fungos utilizados biotransformaram a piplartina, sendo que 14 substâncias majoritárias foram identificadas como produtos de biotransformação nos experimentos em pequena escala. A piplartina e seus derivados apresentaram fragmentações características em IES-EM/EM que foram explicadas utilizando cálculos computacionais. O estudo dessas fragmentações permitiu a identificação e proposição das alterações estruturais que ocorreram nos metabólitos formados. Os fungos P. crustosum VR4 e B. bassiana ATCC 7159 foram selecionados para realizar os experimentos de biotransformação em escala ampliada, pois foram capazes de formar a maior diversidade de derivados da piplartina. Cinco substâncias foram isoladas e identificadas por RMN de 1H, RMN de 13C, HMQC, HMBC, COSY e HRESIMS.Essas substâncias não tinham sido obtidas por biotransformação microbiana anteriormente, sendo que uma ainda não foi descrita na literatura. Foram identificados principalmente produtos formados a partir de reações semelhantes às do metabolismo humano de fase I, como reduções, hidroxilações e hidrólises. Dessa forma, podemos concluir que as culturas microbianas são uma ferramenta útil para estudos preliminares de metabolismo, e para obter padrões de metabólitos que podem ser formados pelo metabolismo humano.Palavras-chave: biotransformação; metabolismo humano; produtos naturais bioativos; atividade anticancerígena; piplartina.

ABSTRACTSILVA JUNIOR, E. A. In vitro metabolism studies of natural products: microbial biotransformation of piplartine. 2013. 141 p. Dissertation (Master). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2013.Piplartine is a natural alkaloid recognized by its biological properties, especially the anticancer activity. This natural product showed selective activity against several cancer cells lines, thus being considered a promising hit for drug development. Studies of bioactive natural products metabolism are an important and necessary step for the evaluation of their efficacy and safety. Microorganisms have been widely employed in metabolism studies, since they may catalyze chemo-, regio- and stereospecific reactions that are similar to human metabolism. This work aimed to study the microbial metabolism of piplartine by different fungal strains: the endophytes Penicillium crustosum VR4 and Papulaspora immersa SS13, the soil strain Mucor rouxii NRRL 1894, and the commercial collection strains Cunninghamella echinulata ATCC 8688a and Beauveria bassiana ATCC 7159. Biotransformation experiments were monitored by UPLC-DAD-MS and UPLC-DADMS/ MS. All the screened fungi were able to biotransform piplartine, and 14 compounds were identified as major biotransformation products in the small scale experiments. Piplartine and its derivatives showed characteristics fragmentations on ESI-MS/MS, which were explained using computer calculations. These fragmentation studies allowed the identification and structural proposition of piplartine metabolites. The fungi P. crustosum VR4 and B. bassiana ATCC 7159 were selected to perform the large scale biotransformation experiments, since they were capable to produce a large diversity of piplartine derivatives. Five compounds were isolated and identified by 1H NMR, 13C NMR, HMQC, HMBC, COSY and HRESIMS data. The isolated products had never been previously identified by microbial biotransformation, and one of them was found to be novel in the literature. All the identified and isolated compounds have been produced by reactions similar to those that occur in phase I of human metabolism, such as reduction, hydroxylation and hydrolysis reactions. Thus, we can conclude that the microbial cultures are useful tools for preliminary metabolism studies, and to obtain chemical standards similar to those produced by human metabolism.Keywords: biotransformation; human metabolism; bioactive natural products; anticancer activity; piplartine.

Aluno: Eduardo Felipe Alves FernandesTítulo: “Estudo do metabolismo in vitro do diterpeno ácido caurenoico”Orientador: Prof. Dr. Norberto Peporine LopesData da Defesa: 11/ 03 / 2013

RESUMOFERNANDES, E.F.A. Metabolismo in vitro do diterpeno ácido caurenoico. 2013. 61f. Dissertação(Mestrado)- Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto- Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto,2013.Apesar do amplo e histórico uso de produtos da biodiversidade brasileira com fins medicinais, pouco se sabe sobre o destino destes produtos após a sua absorção no organismo; quais são os produtos de metabolismo formados, sua toxicidade e cinética de eliminação. Neste trabalho foi estudado o metabolismo in vitro do diterpeno ácido caurenoico. Este terpeno está amplamente distribuído no reino vegetal tendo sua ocorrência destacada em dois dos maiores produtos fiterápicos consumidos pela população brasileira: o óleo de copaíba (Copaifera ssp.) e o xarope de guaco (Mikania glomerata e Mikania leavigata). Entre as principais reações do metabolismo em humanos, as reações de oxidação mediadas pelo citocromo P450(CIP450) têm um papel chave na detoxificação de xenobióticos. O objetivo deste trabalho foi estudar modelos biomiméticos in vitro das reações realizadas pelo CIP450 utilizando metaloporfirinas e reagentes de salen como catalisadores. Foram empregados sete catalisadores em meio homogêneo: Cloreto de 5,10,15,20-tetraquis(pentafluorofenil)porfirina ferro e manganês III (FeTFPP) e (MnTFPP), Cloreto de 5,10,15,20-tetraquis(2,6-diclorofenil)porfirina ferro e manganêsIII (FeTDCPP) (MnTDCPP), Cloreto de (R,R)-(-)N,N’-bis(3,5-di-terc-butil-salicilideno)-1,2-diaminociclo-hexil manganês III (R-Salen), Cloreto de (S,S)-(-)N,N’-bis(3,5-di-tercbutil-salicilideno)-1,2-diaminociclo-hexil manganês III (S-Salen) e o Cloreto de 5,10,15,20-tetraquis(fenil)porfirina ferro III (FeTPP). Como doadores de oxigênio foram avaliados o iodosilbenzeno (PhIO), peróxido de hidrogênio (H2O2), terc-butil-hidroperóxido (TBHP) e (ácido 3-cloro-peroxibenzoico (MCPBA). Nos sistemas estudados foi observada a formação predominante de três produtos de oxidação: Um derivado epoxidado, um mono- e um di-hidroxilado, que tiveram sua estrutura proposta com base na análise do seu perfil de fragmentação em espectrometria de massas e comparação com dados previamente publicados na literatura. Foi observado que a natureza do oxidante influencia de forma mais pronunciada tanto a reatividade como a formação dos produtos. Foram avaliados também os catalisadores FeTFPP e o cloreto de 5,10,15,20-tetraquis-(4-N-metilpiridil)porfirina ferro III( FeTMPyP) imobilizados em suportes inorgânicos. A utilização destes catalisadores imobilizados resultou na maior reatividade do ácido caurenoico com a formação dos mesmos três produtos, mas em maior proporção em relação ao substrato. Por fim, foi realizada a catalise em meio biológico utilizando microssomas de ratos. Neste sistema foi gerado somente um produto que apresentou espectro de massas e tempo de retenção similar ao derivado di-hidroxilado obtido nas reações que utilizaram metaloporfirinas. Este trabalho trouxe evidências da rota de metabolismo de um importante produto natural, além de reforçar a capacidade de metaloporfirinas em realizar catálises biomiméticas, que serão úteis para a geração de metabólitos de fase um para estudos pré-clínicos.

ABSTRACTFERNANDES, E.F.A. In vitro metabolism of the diterpene kaurenoic acid. 2013. 61f. Dissertation (Master). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto- Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto,2013.In spite of the widespread and historical use of products of the Brazilian biodiversity for medical purposes, little is known about the fate of these products after their absorption into the organism; which are the products of metabolism, their toxicity and elimination kinetics. In this master thesis the in vitro metabolism of the diterpene kaurenoic acid was studied. This terpene is widely spread in the plant kingdom. Its presence can especially be highlighted in two of the most consumed phytotherapeutics by the brazilian population: the copaíba oil (Copaifera ssp.) and the guaco syrup (Mikania glomerata and Mikania leavigata. Among the principal metabolic reactions in humans, the oxidation reactions catalyzed by cytochrome P450 (CYP450) have a key role in the detoxification of xenobiotics. The objective of this thesis was the study of in vitro biomimetic models of the reactions carried out by CYP450 using metalloporphyrins and salen catalysts as analogs of the CYP450. Seven catalysts were applied in a homogeneous medium: 5,10,15,20-tetrakis(pentafluorophenyl)porphyrin iron and manganese III chloride (FeTFPP) and (MnTFPP), 5,10,15,20-tetrakis(2,6-dichlorophenyl)porphyrin iron and manganese III chloride (FeTDCPP) and (MnTDCPP), (R,R)-(-)N,N-bis(3,5-di-tertbutylsalicylidene)-1,2-diaminocyclohexyl manganese III (R-Salen) chloride, (S,S)-(-)N,Nbis(3,5-di-terc- butylsalicylidene)-1,2-diaminocyclohexyl manganese III (S-Salen) chloride and 5,10,15,20-tetrakis(phenyl)porphyrin iron III chloride (FeTPP). As oxygen donors iodosylbenzene (PhIO), hydrogen peroxide (H2O2), tert-butyl hydroperoxide (TBHP) and metachlorperoxybenzoic acid (MCPBA) have been tested. In the majority of the systems the formation of three predominant oxidation products was observed: An epoxidated, a mono- and a dihydroxylated derivative, of which the chemical structure was proposed based on the analysis of the mass spectrometric fragmentation pattern. It was observed that the nature of the oxidant influences more markedly the reactivity as well as the formation of the products. The catalysts FeTFPP and 5,10,15,20-tetrakis- (4-N-methyl pyridine)porphyrin iron III chloride (FeTMPyP) immobilized with inorganic supports were assessed as well. Using these immobilized catalysts, a higher proportion of oxidation products of the kaurenoic acid was observed. Finally, the oxidation of kaurenoic acid was assessed using rat microsomes. In this system only one product was produced that showed a similar mass spectrum and retention time as the dihydroxylated derivative obtained in the reactions using metalloporphyrins.This thesis showed evidences of the route of metabolization of an important natural product, and additionally reinforces the capacity of metalloporphyrins in attaining biomimetic catalysis.

Aluno: Getúlio Gomes JunqueiraTítulo: “Síntese e avaliação de derivados galactosil-triazolobenzenossulfonamidas como potenciais inibidores de transsialidasede Trypanosoma cruzi”Orientador: Profa. Dra. Ivone CarvalhoData da Defesa: 01/ 07 / 2013

RESUMOJUNQUEIRA, G. G. Síntese e avaliação de derivados galactosil-triazolobenzenossulfonamidas como potenciais inibidores de trans-sialidase de Trypanosoma cruzi. 2013. 143f. Dissertação (Mestrado). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2013A doença de Chagas é considerada a terceira doença parasitária tropical de maior incidência no mundo, só superada pela malária e esquistossomose, e seu agente causador é o protozoário flagelado Trypanosoma cruzi. O parasita expressa uma enzima de superfície denominada trans-sialidase de Trypanosoma cruzi (TcTS), responsável pela transferência do ácidos siálicos de células do hospedeiro para moléculas de β-galactose terminais presentes em glicoproteínas de sua superfície. As moléculas de glicoproteína sialiladas estão envolvidas na adesão e subsequente penetração do parasita em células hospedeiras. O papel fundamental da TcTS no reconhecimento e na invasão de células hospedeiras, bem como sua ausência em seres humanos, torna esta enzima um alvo potencial a ser estudado. A TcTS é específica em catalisar, preferencialmente, a transferência de ácido siálico para moléculas de mucina, originando ligações α-2,3 com unidades de β-galactose aceptoras na superfície do parasita. Considerando a importância da unidade de galactose e da função carboxila do ácido siálico para interações no sítio ativo de TcTS, priorizamos na síntese de derivados galactosil-triazolo-benzenossulfonamidas com diferentes substituintes, visto que o grupo sulfonamida é bioisóstero do ácido carboxílico, na busca de potenciais inibidores de TcTS. Os derivados galactosiltriazolo- benzenossulfonamidas 45-51 foram preparados via estratégia de click chemistry, por reação de ciclo-adição azido-alcino catalisada por Cu(I) (CuAAC), a partir do intermediário de galactose contento função amino terminal 30 e os derivados aril azidas 38-44. Após etapa de desacetilação, os produtos obtidos 52-58 foram testado em TcTS por ensaio fluorimétrico in vitro para avaliação de sua atividade inibitória. Os resultados obtidos são interessantes e bastante promissores, principalmente com os obtidos com o produto 58 (contendo o grupo galactosiltriazólico ligado a sulfapiridina), que apresentou atividade inibitória promissora (81%) na concentração de 1,0 mM, abrindo perspectivas para a síntese de um maior número de derivados galactosil-triazolo-benzenossulfonamidas com diferentes substituintes em R, para o estabelecimento de estudos de relação estruturaatividade. Adicionalmente, os compostos 53-55 foram testados em ensaios in vitro para avaliação de sua atividade tripanocida e citotóxica, e apresentaram atividade tripanocida máxima de 50%, normalmente nas concentrações de 500 a 250 μM, com destaque para o derivado 55, contendo o grupo galactosil-triazólico ligado a sulfamerazina, que apresentou atividade moderada, mas superior ao benznidazol nas concentrações mais baixas (15,0 - 1,9 μmol.L-1). Por outro lado, de acordo com os resultados do ensaio de citotoxicidade, a atividade citotóxica foi observada apenas nas concentrações mais elevadas, similar ao benznidazol.Palavras-chave: Doença de Chagas; Trypanosoma cruzi; trans-Sialidase; Click chemistry; galactosil-triazolo-benzenossulfonamidas

ABSTRACTJUNQUEIRA, G. G. Synthesis and evaluation of galactosyl-triazolbenzenesulfonamides derivatives as potential inhibitors of Trypanosoma cruzi trans-sialidase. 2013. 143f. Dissertation (Master). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2013.Chagas disease is considered the third most common tropical parasitic disease worldwide, after malaria and schistosomiasis, and its causer is the flagellate protozoan, Trypanosoma cruzi. The parasite expresses a surface enzyme known as Trypanosoma cruzi trans-sialidase (TcTS), responsible for the transference of sialic acid from host cell to β-galactose terminal molecules present in surface glycoproteins. Sialylated glycoproteins molecules are involved in adhesion and further penetration of parasite in host cell. Due to TcTS primordial role in recognizing and invasion of host cells, as well as its absence in humans, this enzyme becomes apotential target to be investigated. TcTS is specific on catalyzing, specially, transference of sialic acid to mucin molecule giving α-2,3 bond with β-galactose moiety in parasite surface. Considering the importance of the galactose moiety and the function of carboxylic in sialic acid for interactions in TcTS enzyme, we prioritized the synthesis of galactosyl-triazol-benzenesulfonamides derivatives with different substituents since sulfonamide group is bioisoster of carboxylic acid, in attempt to produce potential inhibitors of TcTS. The galactosyl-triazol-benzenesulfonamides derivatives 45-51 were prepared via click chemistry reaction (Copper(I)-catalyzed azide–alkyne cycloaddition (CuAAC)) from galactose intermediate with terminal amino group 30 and aril azides derivatives 38-44. After removing acetyl group, the inhibiting activity of products 52-58 were evaluated in TcTS fluorimetric in vitro assay. We found very promising results, specially with 58 (containing galactosyl-triazolic group bonded to sulfapyridine), wich showed 81% of inhibitory activity in 1,0mM solution, bringing expectations for synthesis of greater number of galactosyl-triazolbenzenesulfonamides derivatives with different substituents in R, to establish studies of structure relationship activity. Additionally, trypanocidal and cytotoxic activity of compounds 53-55 were tested and showed maximum activity of 50%, commonly in concentrations of 500 to 250 μM, specially compound 55, containing galactosyltriazolic group bonded to sulfamerazine, with showed moderate activity, but higher then benznidazol in lower concentrations (15,0 - 1,9 μmol.L-1). On the other hand, according to cytotoxicity results, activity were observed only in higher concentrations, as for benznidazol.Keywords: Chagas disease; Trypanosoma cruzi; trans-sialidase; click chemistry; galactosyl-triazol-benzenesulfonamides

Aluno: João Luiz Esteves da SilvaTítulo: “UTILIZAÇÃO DE MODELOS MICROBIANOS PARA ESTUDOS DE METABOLISMO IN VITRO DO ÁCIDO COPÁLICO”Orientador: Profa. Dra. Niege Araçari Jacometti Cardoso FurtadoData da Defesa: 13/ 08/ 2013

RESUMOSILVA, J. L. E. da. Utilização de modelos microbianos para estudos de metabolismo in vitro do ácido copálico. 2013, 88p. Dissertação (Mestrado). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2013.O ácido copálico é um diterpeno de esqueleto do tipo labdano descrito na literatura como um dos diterpenos majoritários e biomarcador do oleorresina das espécies do gênero Copaifera. Este oleorresina é muito utilizado na medicina popular e estudos feitos com oleorresinas de diferentes espécies revelaram várias atividades biológicas. Entretanto, não há informações sobre o metabolismo dos constituintes do oleorresina após absorção no organismo. Assim, neste trabalho foram realizados estudos de biotransformação do ácido copálico com micro-organismos que apresentam potencial para mimetizar reações que ocorrem em humanos e também com alguns microorganismos presentes no trato gastrointestinal humano. O ácido copálico foi obtido de oleorresina de Copaifera disponível no mercado nacional. Devido à complexidade química do oleorresina, houve necessidade de utilizar vários processos cromatográficos visando o isolamento do ácido copálico. Assim, foram utilizadas cromatografia sob pressão reduzida, cromatografia em coluna clássica e cromatografia em coluna clássica utilizando sílica impregnada com nitrato de prata. Partindo-se de 352,0 g de oleorresina foram isolados 1224,5 mg de ácido copálico, o qual foi identificado pelas análises dos espectros de ressonância magnética nuclear de hidrogênio e de carbono treze. O diterpeno isolado foi submetido à avaliação da atividade antimicrobiana frente aos microorganismos a serem avaliados nos processos de biotransformação, o que possibilitou estabelecer a quantidade máxima de ácido copálico a ser adicionada nas culturas dos diferentes micro-organismos sem causar interferência no desenvolvimento dos mesmos. Os fungos filamentosos Mucor rouxii e Aspergillus brasiliensis, bem como as bactérias do trato gastrointestinal Bifidobacterium sp., Lactobacillus acidophillus e Escherichia coli foram utilizados no processo de triagem visando selecionar o micro-organismo mais promissor para os estudos de biotransformação do ácido copálico. Também foram realizados estudos em cultura mista de Bifidobacterium sp., Lactobacillus acidophillus e Streptococcus salivarius spp. thermophilus. O processo de biotransformação conduzido com o fungo filamentoso Mucor rouxii evidenciou o potencial deste para biotransformar o ácido copálico. Os extratos obtidos das culturas do fungo Mucor rouxii foram submetidos às análises por cromatografia líquida de alta eficiência com detecção por aerossol carregado e por arranjo de diodos, sendo detectados seis produtos de biotransformação que foram isolados por cromatografia líquida de alta eficiência em escala semipreparativa.No processo de biotransformação realizado com o fungo filamentoso Aspergillus brasiliensis vários produtos foram detectados, mas com baixos rendimentos. Quanto aos estudos de biotransformação realizados com as bactérias, não foram detectados sinais de diterpenos nas culturas de Lactobacillus acidophilus e Bifidobacterium sp. isoladas e em cultura mista incubadas com ácido copálico por 24 horas. Nas culturas de Escherichia coli foram detectados sinais do ácido copálico, mas não de produtos de biotransformação. Seis produtos de biotransformação foram isolados da cultura desenvolvida com o fungo Mucor rouxii. Dois destes tiveram suas estruturas químicas elucidadas. Nos dois produtos ocorreram hidroxilações no C-3 e no C-13 e em um dos produtos ocorreu também hidroxilação no C-18. Não há descrição na literatura das estruturas químicas dos produtos elucidados.Descritores: Biotransformação. Ácido copálico. Mucor rouxii.

ABSTRACTSILVA, J. L. E. da. The use of microbial models to study the in vitro metabolism of copalic acid. 2013, 88p. Dissertation (Master). School of Pharmaceutical Sciences of Ribeirão Preto – University of São Paulo, Ribeirão Preto, 2013.Copalic acid is a labdane type diterpene which was reported in the literature as a major constituent and biomarker of the oil resin from Copaifera species. This oil resin has been used in popular medicine and studies carried out with different species showed several biological activities. However, there is no information regarding the metabolism of the constituents after absorption in organism. Therefore, biotransformation studies were carried out using microorganisms that showed potential to mimic reactions that occur in human and also with microorganisms from the gastrointestinal tract. Copalic acid was obtained from Copaifera oil resin available in national market. Due to the chemical complexity, it was necessary to perform different chromatographic procedures in order to isolate copalic acid. Column chromatography, column chromatography under reduced pressure and column chromatography using silica gel impregnated with silver nitrate were performed. Starting from 352.0 g of oil resin, 1224.5 mg of copalic acid were isolated and the chemical structure was determined by analysis of the hydrogen and carbon nuclear magnetic ressonance. The isolated diterpene was submitted to antimicrobial activity evaluation against the microorganisms used in the biotransformation processes which enable to establish the maximum amount of copalic acid to be added into the cultures without causing inhibitory effects. The filamentous fungi Mucor rouxii and Aspergillus brasiliensis, as well as the bacteria Bifidobacterium sp., Lactobacillus acidophillus and Escherichia coli from the gastrointestinal tract were screened to select the most promising microorganism for biotransformation studies. In addition, biotransformation processes were carried out using mixed cultures of Bifidobacterium sp., Lactobacillus acidophillus and Streptococcus salivarius spp. thermophilus. The biotransformation process performed by the filamentous fungus Mucor rouxii showed the great potential of this fungus to biotransform copalic acid. The extracts from the cultures of the fungus Mucor rouxii were submitted to high performance liquid chromatography with both charged aerosol and photodiode array detection and six biotransformation products were isolated by using high performance liquid chromatography in semi-preparative mode. Several biotransformation products were detected in the biotransformation process performed by Aspergillus brasiliensis, but with low yield. Regarding the biotransformation processes performed by bacteria, biotransformation products were not detected in the isolated and mixed cultures of Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium sp. after 24 hours. Also, only the signals of copalic acid were detected in the cultures of Escherichia coli. Six biotransformation products were isolated from the culture of the fungus Mucor rouxii. The chemical structures of two products were elucidated. Hydroxyl groups were introduced at C-3 and C-13 in both compounds and another hydroxyl group was introduced at C-18 in only one compound. These structures were not reported before.Key words: Biotransformation. Copalic Acid. Mucor rouxii.

Aluno: Madeleine ErnstTítulo: “Metabolomics in plant taxonomy: The Arnica model”Orientador: Prof. Dr. Norberto Peporine LopesData da Defesa: 23/ 08 / 2013

RESUMOERNST, M. Metabolômica como ferramenta em taxonomia: O modelo em Arnica . 2013. 250f. Dissertação (Mestrado). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto - Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2013.Taxonomia vegetal é a ciência que trata da descrição, identificação, nomenclatura e classificação de plantas. O desenvolvimento de novas técnicas que podem ser aplicadas nesta área de conhecimento é essencial para dar suporte às decisões relacionadas a conservação de hotspots de biodiversidade. Nesta dissertação de mestrado foi desenvolvido um protocolo de metabolic fingerprinting utilizando MALDI-MS (matrix-assisted laser desorption/ionisation mass spectrometry) e subsequente análise multivariada utilizando scripts desenvolvidos para o pacote estatístico R. Foram classificadas, com base nos seus metabólitos detectados, 24 plantas de diferentes famílias vegetais, sendo todas elas coletadas em áreas da Savana Brasileira (Cerrado), que foi considerada um hotspot de biodiversidade. Metabolic fingerprinting compreende uma parte da Metabolômica, i.e., a ciência que objetiva analisar todos os metabólitos de um dado sistema (celula, tecído ou organismo) em uma dada condição. Comparada com outros métodos de estudo do metaboloma MALDI-MS apresenta a vantagem do rápido tempo de análise. A complexidade e importância da correta classificação taxonômica é ilustrada no exemplo do gênero Lychnophora, o qual teve diversas espécies incluídas neste estudo. No Brasil espécies deste gênero são popularmente conhecidas como "arnica da serra" ou "falsa arnica". Os resultados obtidos apontam similaridades entre a classificação proposta e a classificação taxonômica atual. No entanto ainda existe um longo caminho para que a técnica de metabolic fingerprinting possa ser utilizada como um procedimento padrão em taxonomia. Foram estudados e discutidos diversos fatores que afetaram os resultados como o preparo da amostra, as condições de análise por MALDI-MS e a análise de dados, os quais podem guiar futuros estudos nesta área de pesquisa.Palavras-chave: metabolic fingerprinting, taxonomia vegetal, MALDI-MS, análise multivariada

ABSTRACTERNST, M. Metabolomics in plant taxonomy: The Arnica model. 2013. 250p. Master’s thesis. Faculty of Pharmaceutical Sciences of Ribeirão Preto - University of São Paulo, Ribeirão Preto, 2013.Plant taxonomy is the science of description, identification, nomenclature and classification ofplants. The development of new techniques that can be applied in this field of research are essential in order to assist informed and efficient decision-making about conservation of biodiversity hotspots. In this master’s thesis a protocol for metabolic fingerprinting by matrix-assisted laser desorption/ionisation mass spectrometry (MALDI-MS) with subsequent multivariate data analysis by in-house algorithms in the R environment for the classification of 24 plant species from closely as well as from distantly related families and tribes was developed. Metabolic fingerprinting forms part of metabolomics, a research field, which aims to analyse all metabolites, i.e., the metabolome in a given system (cell, tissue, or organism) under a given set of conditions. Compared to other metabolomics techniques MALDI-MS shows potential advantages, mainly due to its rapid data acquisition. All analysed species were collected in areas of the Brazilian Savanna (Cerrado), which was classified as "hotspot for conservation priority". The complexity and importance of correct taxonomic classification is illustrated on the example of the genus Lychnophora, of which several species also have been included into analysis. In Brazil species of this genus are popularly known as "arnica da serra" or "falsa arnica". Similarities to taxonomic classification could be obtained by the proposed protocol and data analysis. However there is still a long way to go in making metabolic fingerprinting by MALDI-MS a standard procedure in taxonomic research. Several difficulties that are inherent to sample preparation, analysis of plant’s metabolomes by MALDI-MS as well as data analysis are highlighted in this study and might serve as a basis for further research. Keywords: metabolic fingerprinting, plant taxonomy, MALDI-MS, multivariate data analysis

Aluno: Mariana Bellini OliveiraTítulo: “Avaliação do potencial antialérgico de flavonóides: estudo sinergístico e influência de sistemas lipossomais”Orientador: Profa. Dra. Rose Mary Zumstein Georgetto NaalData da Defesa: 04/ 03 / 2013RESUMO Oliveira, M. B. Avaliação do potencial antialérgico de flavonóides: estudo sinergístico e influência de sistemas lipossomais. Ribeirão Preto, 2013. Dissertação (Mestrado). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2013. 115 p. Os problemas decorrentes de doenças alérgicas é tema em destaque atualmente devido ao aumento de pessoas que vêm apresentando sintomas e sofrendo as consequências de mudanças aceleradas nos costumes da nossa sociedade. Apesar das diversas terapias oferecidas, pacientes alérgicos ainda sofrem com efeitos colaterais decorrentes do uso de medicamentos anti-alérgicos. Assim, a busca por novas alternativas que possam amenizar os sintomas alérgicos torna-se relevante. As substâncias naturais tem sido alvo de intensa investigação devido às propriedades farmacológicas no tratamento de diversas doenças incluindo as alérgicas. Neste contexto, este trabalho foi focado no extrato Vimang e seu componente majoritário, a mangiferina (Mgf), que tem apresentado atividades biológicas diversas. Sabendo-se que a atividade biológica de um extrato pode ser potencializada pelo sinergismo entre seus componentes, foi avaliado o efeito sinérgico de substâncias isoladas do Vimang, tais como mangiferina, quercetina, catequina, ácido gálico e benzóico. Esses componentes foram combinados e as misturas avaliadas quanto à capacidade em inibir a desgranulação mastocitária. O Vimang, a quercetina e mangiferina inibem a desgranulação mastócitária enquanto catequina, ácido gálico e benzóico não são ativos; e porisso, não foram incluídos na determinação do isobolograma de aditividade, adotado no estudo de sinergismo. O isobolograma de aditividade mostra sinergismo para as concentrações de mangiferina iguais a 5, 10, 20 e 40 μM e quercetina iguais a 0,2, 1 e 1,6 μM; e mostra antagonismo para mangiferina 80 μM e quercetina 0,4 e 0,8 μM. Tais resultados sugerem que altas concentrações de mangiferina atrapalham a interação sinérgica entre estas substâncias e altas concentrações de quercetina exercem um efeito contrário, ou seja, favorecem o sinergismo entre quercetina e mangiferina. A baixa solubilidade de flavonóides em meio fisiológico levou ao estudo da interação da Mgf com lipossomos de Dimiristoil-L-α-Fosfatidilcolina (DMPC) para aplicação nos ensaios biológicos. A Interação da Mgf com lipossomos de DMPC, bem como a estabilidade lipossomal, foram avaliadas quanto aos efeitos de pH, força iônica e presença de colesterol. O pH influencia a eficiência de incorporação (EI) da Mgf que é maior em pHs ácidos. Em soluções de pH ácido ou fisiológico há aumento de tamanho do lipossomo na presença de Mgf, o que reforça a hipótese de interação desta com a bicamada lipídica. O aumento da força iônica, na ausência de Mgf, diminui a estabilidade do lipossomo. Na ausência de sal, a Mgf favorece a formação de agregados e diminui a estabilidade dos lipossomos e na presença de sal, a Mgf previne a agregação e estabiliza os agregados lipossomais. A EI da Mgf nos lipossomos de DMPC preparados pelo método da injeção etanólica, em pH fisiológico, foram ao redor de 13%. A tentativa de otimizar a EI foi realizada pela adição de colesterol em diferentes proporções lipídio:colesterol. Um aumento de 13% para 17% foi observado para a proporção DMPC:colesterol (9:1). A Mgf livre inibe a desgranulação dos mastócitos de forma concentração-dependente; mas a presença de lipossomos, preparados pelo método da injeção etanólica não altera significativamente esse perfil. A EI da mangiferina em lipossomos de DMPC:colesterol (9:1), preparados pelo método do filme lipídico, foi igual a 45%. Os resultados de potencial antialérgico, para este caso, mostraram que os lipossomos de DMPC favorecem o potencial antialérgico da Mgf em concentrações acima de 25 μM. Esses resultados abrem perspectivas na busca de sistemas lipossomais mais estáveis e que possam ser aplicados em ensaios biológicos in vitro e in vivo. Palavras-chave: Vimang, mangiferina, lipossomos, degranulação mastocitária, alergia.

ABSTRACT Oliveira, M. B. Evaluation of the potential antiallergic flavonoids: synergistic influence and liposomal systems. Ribeirão Preto, 2013. 115p. Dissertation (Master). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2013. The problems due to allergic diseases are currently a highlighted topic due to the increase of people who are showing symptoms and suffering the consequences of rapid changes in the habits of our society. Despite various therapies offered, allergic patients still suffer side effects from the use of anti-allergic drugs. Thus, the search for new alternatives that can alleviate the allergic symptoms becomes relevant. Natural substances have been the subject of intense research due to the pharmacological properties in the treatment of several diseases, including allergic ones. In this context, this work was focused on Vimang extract and its major component, the mangiferin (Mgf), which has shown several biological activities. Given that the biological activity of an extract can be enhanced by the synergism between its components, the synergistic effect of compounds isolated from Vimang such as mangiferin, quercetin, catechin, gallic acid and benzoic acid was evaluated. These components were combined and the mixtures tested for their ability to inhibit mast cell degranulation. The Vimang, quercetin and mangiferin inhibit mast cell degranulation while catechin, gallic acid and benzoic acid are not active and for that reason they were not included in the determination of the isobologram adopted in the synergism study. The isobologram of additivity shows synergism for the concentration of mangiferin equal to 5, 10, 20 and 40 μM and quercetin equal 0.2, 1 and 1.6 μM, and shows antagonism for mangiferin 80 μM and quercetin 0.4 and 0.8 μM. The low solubility of flavonoids in physiological medium led to the study of the interaction of Mgf with liposomes of L-α-dimyristoyl-phosphatidylcholine (DMPC) for application in biological assays. The interaction of Mgf with DMPC liposomes as well as the liposomal stability was evaluated considering the effects of pH, ionic strength and cholesterol presence. The pH influences the incorporation efficiency (IE) of mangiferin, which is higher in acidic pHs. In solutions of acidic or physiological pH, the liposome size increases in the presence of Mgf, which reinforces the hypothesis of interaction of Mgf with the lipid bilayer. The increased ionic strength in the absence of Mgf decreases the stability of the liposome. In the absence of salt, Mgf favors the formation of aggregates and decreases the stability of the liposomes. When in presence of salt, Mgf prevents the aggregation and stabilizes the liposomal aggregates. The IE of mangiferin in DMPC prepared by the ethanol injection method, at physiological pH, were around 13%. The attempt to optimize the IE was performed by the addition of cholesterol in different proportions lipid:cholesterol. An increase from 13% to 17% was observed for the proportion of DMPC:cholesterol (9:1). Free mangiferin inhibits mast cells degranulation in a dose-dependent manner, but the presence of liposomes prepared by the ethanol injection method does not significantly change this profile. The IE of mangiferin in liposomes of DMPC:cholesterol (9:1), prepared by the method of lipidic film was equal to 45%.The results of antiallergic potential in this case show that DMPC liposomes favor the mangiferin antiallergic potential at concentrations above 25 mM. These results open perspectives in the search for more stable liposomal systems and can be applied to biological assays in vitro and in vivo. Keywords: Vimang, mangiferin, liposomes, mast cell degranulation, allergy.

Aluno: Milena Moreira LimaTítulo: “Síntese de peptídeo modificado contendo grupo 1,2,3-triazol 1,4-dissubstituído”Orientador: Profa. Dra. Ivone CarvalhoData da Defesa: 28/ 06 / 2013RESUMO

LIMA, M. L. Síntese de peptídeo modificado contendo grupo 1,2,3-triazol 1,4-dissubstituído. 2013. 136f. Dissertação (Mestrado). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto,2013.Peptídeos são biomoléculas que apresentam extensa variedade estrutural efuncional, atuando em diversos processos biológicos relevantes. Estas moléculas são amplamente utilizadas na terapêutica, constituindo, atualmente, um campo investigativo bastante promissor para o desenvolvimento de novos fármacos, especialmente no desenvolvimento de vacinas sintéticas. Os avanços científicos relacionados às técnicas de identificação, análise e purificação tem estimulado diversas pesquisas na busca por fármacos baseados em peptídeos, os quais podemser obtidos a partir de fontes naturais ou por métodos químicos (em solução ou em fase sólida), enzimático ou combinação de ambos (semi-síntese) e via tecnologia do DNA recombinante. Entretanto, devido às limitações próprias dos peptídeos naturais, tais como, suscetibilidade proteolítica, toxicidade e baixa biodisponibilidade, torna-se necessária a síntese de peptídeos modificados. Como a função biológica de um peptídeo é definida por sua conformação estrutural, a inserção de modificação em uma estrutura peptídica deve ser capaz de manter ou estabilizar esta conformação estrutural. O desenvolvimento de novas e eficientes rotas de síntese de peptídeos modificados torna-se necessário para superar as limitações relacionadas à suscetibilidade proteolítica, toxicidade e baixa biodisponibilidade, afim de contribuir para novas estratégias terapêuticas, em especial no desenvolvimento de vacinas. Desta forma, a inserção de grupo 1,2,3-triazol tem fornecido propriedades físicoquímicas desejáveis no desenvolvimento de fármacos. O objetivo deste trabalho foi desenvolver um método de síntese de peptídeos contendo grupo 1,2,3-triazol 1,4-dissubstituído, como o peptídeo 1, o qual é constituído por dezesseis resíduos de treonina e um grupo 1,2,3-triazol 1-4-dissubstituído entre os resíduos Thr8 e Thr9(NH2-(Thr)7-Thr-(ciclo 1,2,3-triazol 1,4-dissubstituído)-Thr-(Thr)7-OH). Adicionalmente, devido à semelhança com mucinas de T. cruzi, as quais apresentam rica composição em resíduos de treonina, 1 poderá ser empregado na preparação de peptideomiméticos destas mucinas e no desenvolvimento de vacinas relacionadas à processos infecciosos causados por T. cruzi. A preparação de 1 envolveu uma associação entre síntese de peptídeo em fase sólida e reações de ciclo-adição azido-alcino 1,3 dipolar catalisada por cobre (I) (CuAAC). Inicialmente, o método utilizado foi padronizado a partir da síntese do modelo dipeptídeo de treonina (8), cuja ligação peptídica foi substituída pelo grupo 1,2,3-triazol 1,4- dissubstituído (NHFmoc-Thr-(ciclo 1,2,3-triazol 1,4 dissubstituído)-Thr-OH). Aestratégia via CuAAC conduziu à obtenção do dipeptídeo modificado em excelente rendimento (98%) e permitiu estabelecer as condições a serem empregadas na obtenção do peptídeo mais complexo de cadeia longa 1. A reação de CuAAC gerou o peptídeo 1 com rendimento bruto satisfatório (70%). A obtenção de 1 foi confirmada pela análise de Ressonância Magnética Nuclear de próton (RMN 1H), a qual permitiu identificar a presença do grupo 1,2,3-triazol 1,4-dissubstituído. Adicionalmente, análises posteriores por espectrometria de massas (ESI-MS) sugerem a obtenção do peptídeo 1.Palavras-chave: peptídeos; “Click Chemistry”; peptídeos modificados; grupo 1,2,3-triazol 1,4-dissubstituído; peptideomiméticos.

ABSTRACTLIMA, M. M. Synthesis of modified peptide containing 1,4-disubstituted 1,2,3-triazole group. 2013. 136f. Dissertation (Master). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2013.Peptides are biomolecules which present great structural and functional variety, acting in several biological processes. These molecules are widely used in therapeutics, and recently represent a very promising field for development of novel drugs, specially on synthetic vaccines. Scientific advances related to identification techniques, analysis and purification stimulate researches in attempt to produce peptides-based drugs, which can be extracted from natural sources or chemically synthesized (in liquid or solid phase), enzymatic process or both (semi-synthesis) and recombinant DNA technology. However, due to limitations concerning natural peptides, such as, proteolytic liability, toxicity and low bioavailability, becomes necessary the synthesis of modified peptides. Being biological function of a peptide defined by its structural conformation, adding a modification in a peptide structure must be able to maintain or stabilize it. The development of novel and efficient synthetic route of modified peptides is necessary to overcome the limitations related to proteolytic liability, toxicity and low bioavailability, to contribute with novel therapeutic strategies, mostly development of vaccines. So, adding a 1,2,3-triazole group can afford desirable chemical-physical properties in drug discovery. The objective was develop a method to synthesize peptides containing 1,4-disubstituted 1,2,3-triazole group, such as peptide 1, which is constituted by sixteen threonine residues and one 1,4 disubstituted 1,2,3-triazole group (NH2-(Thr)7-Thr-(1,4-disubstituted 1,2,3-triazole cycle)-Thr-(Thr)7-OH). Moreover, due to the similarity with T. cruzi mucins that present great composition of threonine, 1 can be employed in development of vaccines related to infectious processes caused by T. cruzi. The preparation of 1 envolved an association between the solid-phase synthesis of peptide and reactions of copper(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC). Initially, the method was standardized from synthesis of threonine dipeptide (8), whose peptide bond was replaced by 1,4-disubstituted 1,2,3-triazole group (NHFmoc-Thr-(1,4-disubstituted 1,2,3-triazole cycle)-Thr-OH). The strategy via CuAAC gave the modified dipeptide in good yield (98%) and allowed to establish the conditions to prepare the more complex peptide with long chain 1. The CuAACreaction gave the peptide 1 with good yield (70%). Compound 1 was confirmed by NMR proton analysis which showed the presence of 1,4-disubstituted 1,2,3-triazole group. Additionally, further analysis of mass spectrometry (ESI-MS) suggest the achievement of peptide 1.Keywords: peptides; “Click Chemistry”; modified peptides; 1,4-disubstituted 1,2,3-triazolegroup; peptidomimetics.

Aluno: Aline Kusumota Luiz de SouzaTítulo: “Clonagem, expressão heteróloga e caracterização do gene Smp_158240 de Schistosoma mansoni.”Orientador: Profa. Dra. Maria Cristina Nonato CostaData da Defesa: 13/ 09 / 2013

Resumo Luiz de Souza, A. K. Clonagem, expressão heteróloga e caracterização do gene Smp_158240 de Schistosoma mansoni. 2013. 119 f. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2013.

Segundo dados recentes da Organização Mundial de Saúde, as doenças parasitárias afetam um sexto da população mundial, totalizando de mais de um bilhão de pessoas. A esquistossomose, em particular, é uma doença parasitária negligenciada pela saúde pública, causada pelo parasita helminto trematódeo do gênero Schistosoma, e que afeta mais de 230 milhões de indivíduos em todo o mundo, 6 milhões no Brasil, causando risco a aproximadamente 700 milhões de pessoas. Na busca por novas ferramentas para o combate à esquistossomose, uma importante estratégia consiste na identificação e caracterização de alvos moleculares do parasita Schistosoma. As fumarato hidratases são enzimas que catalisam a hidratação reversível da molécula de fumarato em S-malato e têm sido consideradas potenciais alvos macromoleculares para o planejamento de novos fármacos antiparasitários. Dentro desse contexto, o presente trabalho visou a clonagem, expressão, purificação e caracterização estrutural e bioquímica do produto do gene Smp_158240, predito como codificador da enzima fumarato hidratase para o parasita Schistosoma mansoni. O gene Smp_158240 foi sintetizado quimicamente com otimização de códons para expressão em E. coli e clonado nos vetores de expressão pET28a e pET28sumo. O produto do gene, denominado SmFH foi expresso em bactéria E. coli BL21(DE3) e purificado com excelente rendimento e grau de pureza. Estudos de espalhamento dinâmico de luz, associados à cromatografia por filtração em gel indicam que a proteína SmFH se oligomeriza na forma de um tetrâmero, e estudos por dicroísmo circular foram utilizados para estimar o conteúdo de estrutura secundária em 60,8 % de α-hélices, 5,7 % de fita-β e 37,6 % de coil-turn. Apesar dos resultados indicarem que a SmFH se oligomeriza e se enovela como previamente reportado para as enzimas fumarato hidratase da classe II, os ensaios de atividade indicaram que o produto do gene Smp_158240 apresenta baixa atividade fumarásica e se mostra instável para a realização dos experimentos de cristalização. A realização de predição de estrutura por modelagem molecular por homologia identificou regiões de grandes diferenças entre o modelo gerado para SmFH e as estruturas descritas para outras enzimas da mesma classe. Em particular, uma dessas variações consiste na inserção de 7 resíduos em uma região altamente conservada do sítio ativo (SS-loop), alterando significativamente a conformação e dinâmica da proteína e fornecendo assim as bases estruturais para justificar a falta de atividade observada para o produto codificado pelo gene Smp_158240. Uma análise estrutural cuidadosa do modelo predito para SmFH, associado à análise do padrão da estrutura primária encontrado para enzimas da mesma classe sugere um erro na sequência do gene depositada no banco de dados e permite propormos a correta sequência para o gene que codifica a enzima fumarato hidratase em Schistosoma mansoni. Palavras-chave: Schistosoma mansoni, fumarato hidratase, clonagem, expressão, purificação, caracterização bioquímica, caracterização estrutural.

Abstract

Luiz de Souza, A. K. Cloning, heterologous expression and characterization of the gene Smp_158240 from Schistosoma mansoni. 2013. 119 s. Dissertation (Master) – Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2013.

According to recent data from World Health Organization, parasitic diseases affect one sixth of the world population, with a total of over a billion people. Schistosomiasis, in particular, is a parasitic disease neglected by public health system and pharmaceutical industries, caused by trematode helminth Schistosoma, which affects 230 million people worldwide, 6 million in Brazil, risking about 700 million people. In the search for new tools against schistosomiasis, an important strategy consists in the identification and characterization of potential molecular targets from Schistosoma. Fumarate hydratase are enzymes that catalyze the reversible hydration of fumarate to malate, and have been considered potential macromolecular targets for new antiparasitic drug design. Within this context, the present work report the cloning, expression, purification and structural and biochemical characterization of Smp_158240 gene product predict to code the enzyme fumarate hydratase for Schistosoma mansoni (SmFH). The gene Smp_158240 has been chemically synthesized with optmized codons for E. coli expression and cloned into pET28a e pET28sumo expression vectors. The gene product, named SmFH has been expressed in E. coli BL21(DE3) and purified with excellent yield and purity. Dynamic light scattering studies associated with molecular exclusion chromatography have indicated that protein oligomerizes in a tetramer and circular dichroism techniques have been used to estimate secondary structure content as 60.8% in α-helix, 5.7% β-ribbon and 37.6% in coil-turn. Although results indicate that SmFH oligomerization and folding state are consisted with previous data reported to fumarate hydratases from class II, activity assays indicates that Smp_158240 gene product presents low fumarasic activity as well as high instability for for crystallization experiments. The 3D structure prediction by molecular modeling based on homology has allowed us to identify large differences between the SmFH model and the structures reported for enzymes within the same class. In particular, one of these variations includes an insertion of 7 residues in a highly conserved region within the active site (SS loop), significantly altering the conformation and dynamics of the protein and providing the structural basis in order to justify the lack of activity observed for the product of the gene Smp_158240. A careful structural analysis for the predicted model, associated to the observation of primary structure pattern found for enzymes from the same class, suggest a mistake in the sequence reported in the data bank and allow us to predict the correct sequence that codes for the enzyme fumarato hydratase in Schistosoma mansoni. Keyword: Schistosoma mansoni, fumarate hydratase, cloning, expression, purification, biochemical characterization, biophysical characterization.