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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE TECNOLOGIA

DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA QUÍMICA

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO

Extração do corante do fruto de castanhola (Terminalia

catappa Linn) e estudos dos seus compostos fenólicos,

antocianinas e atividade antioxidante

Viviane Hiromi Uchida

Orientadora: Profª. Drª. Márcia Maria Lima Duarte

Natal/RN

Dezembro/2014

Viviane Hiromi Uchida

Extração do corante do fruto de castanhola (Terminalia

catappa Linn) e estudos dos seus compostos fenólicos,

antocianinas e atividade antioxidante

Dissertação de mestrado apresentada ao

Programa de Pós-Graduação em Engenharia

Química da Universidade Federal do Rio

Grande do Norte, como parte dos requisitos

necessários para obtenção do título de mestre

em Engenharia Química, sob orientação da

Profª. Drª. Marcia Maria Lima Duarte.

Natal/RN

Dezembro/2014

Catalogação da Publicação na Fonte.

UFRN / CT / DEQ

Biblioteca Setorial “Professor Horácio Nícolás Sólimo”.

Uchida, Viviane Hiromi.

Extração do corante do fruto de castanhola (Terminalia catappa Linn) e estudos

dos seus compostos fenólicos, antocianinas e atividade antioxidante / Viviane Hiromi

Uchida. - Natal, 2014.

76 f.: il.

Orientador: Márcia Maria Lima Duarte.

Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro

de Tecnologia. Departamento de Engenharia Química. Programa de Pós-graduação

em Engenharia Química.

1. Pigmentos vegetais - Dissertação. 2. Antocianinas - Dissertação. 3. Antioxidantes -

Dissertação. 4. Compostos fenólicos - Dissertação. I. Duarte, Márcia Maria Lima. II.

Universidade Federal do Rio Grande do Norte. III. Título.

RN/UF CDU 667.272/.276 (043.3)

UCHIDA, V. H. – Extração do corante do fruto de castanhola (Terminalia catappa Linn) e

estudos dos seus compostos fenólicos, antocianinas e atividade antioxidante. Dissertação de

Mestrado, UFRN, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química, Área de

concentração: Engenharia Química, Natal, Brasil, 2014.

Orientadora: Profª. Drª. Marcia Maria Lima Duarte

Resumo: A Terminalia catappa Linn pertencente à família Combretaceae, popularmente

conhecida como castanhola, possui frutos constituídos por uma polpa carnosa, semente

arredondada e uma casca muito dura. A pigmentação natural existentes no fruto da castanhola

indica a presença de antocianinas, componentes de natureza fenólica pertencentes ao grupo

dos flavonóides, que apresentam atividade antioxidante. A presente pesquisa foi realizada

com a castanhola e teve como principal objetivo o estudo de fatores que influenciam a

extração de corantes a partir de sua polpa. Os extratos foram obtidos utilizando-se um reator

enjaquetado por extração sólido líquido. Os fatores avaliados foram a temperatura, o tempo, a

proporção do solvente e o pH de extração. Adotando-se um planejamento fatorial de 24, com 4

repetições no ponto central, os efeitos destes fatores sobre o processo de extração foram

analisados utilizando-se o software Statistica 7.0. A atividade antioxidante (AA), o teor de

compostos fenólicos totais (CFT) e o teor de antocianinas monoméricas totais (AMT) foram

avaliadas como variáveis resposta do planejamento. Na análise estatística dos resultados, os

efeitos que mais influenciaram a extração foram diferentes para cada uma das respostas (CFT,

AMT e AA). No entanto o pH se mostrou significativo para a extração de todos os compostos.

O comportamento cinético da extração do corante também foi estudado para os compostos

fenólicos totais, antocianinas monoméricas e atividade antioxidante, em que o equilíbrio foi

atingido após os 90 minutos de extração. No estudo da estabilidade das antocianinas a

temperatura foi o fator que mais influenciou na estabilidade, contudo a concentração e o pH

também tiveram influência.

Palavras-chave: Terminalia catappa Linn, compostos fenólicos, antocianinas, atividade

antioxidante.

UCHIDA, V. H. – Extraction of dye from the fruit of castanhola (Terminalia catappa Linn)

and studies of its phenolic compounds, anthocyanins and antioxidant activity. Dissertation,

UFRN, Graduate Program in Chemical Engineering, Area of Concentration: Chemical

Engineering, Natal, Brazil, 2014

Advisor: Dr. Marcia Maria Lima Duarte

Abstract: The Terminalia catappa Linn belonging to Combretaceae family, popularly known

as castanets, has fruits consists of a fleshy pulp, rounded seed and a very hard shell. The

natural pigmentation existing in the fruit of castanet indicates the presence of anthocyanins,

phenolic nature components belonging to the group of flavonoids, which have antioxidant

activity. This research was conducted with the castanets and aimed to the study of factors

influencing the extraction of dyes from its pulp. The extracts were obtained using a reactor

enjaquetado by solid-liquid extraction. The factors were evaluated as temperature, time,

solvent ratio and pH extraction. Adopting a factorial design of 24, with 4 repetitions at the

central point, the effects of these factors on the extraction process were analyzed using

Statistica 7.0 software. The antioxidant activity (AA), the content of phenolic compounds

(CFT) and the total monomeric anthocyanin content (AMT) were evaluated as response

variables planning. Statistical analysis of the results, the effects that influenced the extraction

were different for each response (CFT, AMT and AA). However, the pH was significant for

the extraction of all compounds. The kinetic behavior of the dye extraction was also studied

for phenolic compounds, monomeric anthocyanins and antioxidant activity, in which the

equilibrium was reached after 90 minutes of extraction. To study the stability of anthocyanins

temperature was the factor that most influenced the stability, however the concentration and

pH also played a part.

Keywords: Terminalia catappa Linn, phenolic compounds, anthocyanins, antioxidant

activity.

AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente aos meu pais que tanto me ajudaram na realização de meus

estudos.

Ás professoras Márcia Maria e Ana Lúcia pela orientação, paciência e transmissão de

conhecimento que muito contribuíram para a minha formação.

Aos meus colegas do Laboratório de Tecnologia de Alimentos, Glenda, Mayara,

Isadora, Camila, Thaise, professora Fátima e especialmente a Thais pela amizade,

companheirismo e por todas as sugestões para o desenvolvimento deste trabalho.

Não poderia esquecer dos meus amigos Suzara, Emyliane, Indira, Paula e Pedro pelos

momentos ótimos e por sempre estarem ao meu lado.

Ao meu namorado Marcelo pela ajuda que me forneceu no mestrado e principalmente

amor e paciência durante tantos anos.

As minhas amigas queridas de longa data, Dalva e Sabrina que tanto me incentivaram

nos estudos.

Por fim, agradeço à CAPES e à UFRN pelo apoio financeiro deste projeto.

SUMÁRIO

1 - INTRODUÇÃO ................................................................................................................ 2

2 - REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .......................................................................................... 5

2.1 - Castanhola (Terminalia catappa Linn) ........................................................................... 5

2.1.1 - Composição nutricional da castanhola ......................................................................... 6

2.2 - Compostos fenólicos .................................................................................................... 10

2.3 - Flavonóides ................................................................................................................. 12

2.4 - Antocianinas ................................................................................................................ 14

2.5 - Estabilidade das antocianinas ....................................................................................... 15

2.5.1 - Copigmentação ......................................................................................................... 15

2.5.2 - pH..................................................................................................................................16

2.5.3 - Temperatura .............................................................................................................. 18

2.5.4 - Luz............... ............................................................................................................. 18

2.6 - Ação antioxidante ........................................................................................................ 18

2.7 - Extração sólido-líquido por imersão ............................................................................. 19

2.8 - Solvente ....................................................................................................................... 20

2.9 - Metodologia da superfície de resposta .......................................................................... 23

2.9.1 - Análise da variância .................................................................................................. 23

3 - MATERIAIS E MÉTODOS ........................................................................................... 26

3.1 - Matéria-prima .............................................................................................................. 26

3.2 - Obtenção do corante por extração sólido-líquido .......................................................... 26

3.2.1 - Seleção do fruto e obtenção da polpa......................................................................... 27

3.2.2 - Secagem e moagem e análise granulométrica ............................................................ 27

3.2.3 - Planejamento Experimental ....................................................................................... 28

3.2.4 - Extração sólido-líquido por imersão .......................................................................... 29

3.2.5 - Análises do extrato .................................................................................................... 30

3.2.5.1 - Determinação de Compostos fenólicos totais (CFT) ............................................... 30

3.2.5.2 - Determinação da Atividade antioxidante (AA) pelo sequestro do radical DPPH· .... 31

3.2.5.3 - Determinação de antocianinas monoméricas totais (AMT) ..................................... 32

3.3 - Estudo cinético do processo de extração ....................................................................... 34

3.4 - Estudos da estabilidade das antocianinas nos extratos .................................................. 34

4 - RESULTADOS E DISCUSSÕES ................................................................................... 37

4.2 - Extração do corante e avaliação do planejamento ......................................................... 38

4.3 - Análise da superfície de resposta .................................................................................. 43

4.3.1 - Atividade antioxidante .............................................................................................. 43

4.3.2 - Compostos Fenólicos Totais ...................................................................................... 46

4.3.3 - Antocianinas monoméricas totais .............................................................................. 49

4.4 - Correlação na extração entre os compostos fenólicos, antocianinas e a atividade

antioxidante ......................................................................................................................... 52

4.5 - Estudo Cinético do processo de extração ...................................................................... 54

4.5.1 - Análise do comportamento cinético ........................................................................... 55

4.6 - ESTUDOS DA ESTABILIDADE DE ANTOCIANINAS PRESENTES NO

EXTRATO... ....................................................................................................................... 58

5 - CONCLUSÃO ................................................................................................................ 63

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................................. 64

APÊNDICE I. CURVAS DE CALIBRAÇÃO ..................................................................... 76

LISTA DE FIGURAS

Figura 2. 1- Ávore de castanhola ............................................................................................ 5

Figura 2. 2 - Fruto da castanhola ............................................................................................ 6

Figura 2. 3 - Capacidade de sequestrar o radical DPPH (%) ................................................... 7

Figura 2. 4 - Metabolismo dos compostos fenólicos em plantas. ........................................... 11

Figura 2. 5 - Biossintese dos Flavonoides. ............................................................................ 12

Figura 2. 6 - Estruturas químicas dos principais flavonóides................................................. 13

Figura 2. 7 - Forma básica das antocianinas. ........................................................................ 14

Figura 2. 8 - Estrutura química das antocianinas ................................................................... 15

Figura 2. 9 - Possíveis mudanças estruturais das antocianidinas em meio aquoso em função do

pH. ....................................................................................................................................... 17

Figura 3. 1 - Fluxograma do processo de extração do corante ............................................... 26

Figura 3. 2 - Pó da castanhola pronta para a extração ........................................................... 28

Figura 3. 3 - Reator enjaquetado acoplado a um banho termostático ..................................... 30

Figura 3. 4 - Extratos com concentrações de 50 e 30% com as soluções tampão de KH2PO4

(pH = 6) e KCl (pH = 3). ...................................................................................................... 35

Figura 4. 1 - Valores preditivos em relação aos valores observados para a atividade

antioxidante ......................................................................................................................... 41

Figura 4. 2 - Valores preditivos em relação aos valores observados para os Compostos

Fenólicos Totais ................................................................................................................... 41

Figura 4. 3 - Valores preditivos em relação aos valores observados para as Antocianinas

Monomérica Totais .............................................................................................................. 42

Figura 4. 4 - Diagrama de Pareto para AA ............................................................................ 44

Figura 4. 5 - Curvas de nível para a interação da porcentagem do etanol com o pH (2by4) para

a extração da atividade antioxidante ..................................................................................... 45

Figura 4. 6 - Curvas de nível para a interação da temperatura com o pH (1by4) para a extração

da atividade antioxidante ...................................................................................................... 46

Figura 4. 7- Diagrama de Pareto para os compostos fenólicos .............................................. 47

Figura 4. 8 - Curvas de nível para a interação da temperatura (ºC) com o pH(1by4) para a

extração de compostos fenólicos .......................................................................................... 48

Figura 4. 9 - Diagrama de Pareto para as antocianinas .......................................................... 49

Figura 4. 10 - Curvas de nível para a interação da porcentagem do etanol com o tempo (2by3)

para a extração de antocianinas ............................................................................................ 50

Figura 4. 11 - Curvas de nível para a interação da temperatura com o tempo (1by3) para a

extração de antocianinas ...................................................................................................... 51

Figura 4. 12 - Curvas de nível para a interação da temperatura com o pH (1by4) para a

extração de antocianinas ...................................................................................................... 52

Figura 4. 13 - Correlação entre a extração dos compostos fenólicos com antocianinas com r =

0,79...................................................................................................................................... 53

Figura 4. 14 - Correlação entre a extração dos compostos fenólicos com a atividade

antioxidante com r = 0,69 ..................................................................................................... 53

Figura 4. 15 - Correlação entre a extração das antocianinas com a atividade antioxidante com

r = 0,64 ................................................................................................................................ 54

Figura 4. 16 - Concentração dos compostos fenólicos em função do tempo nas condições de

50°C, 50% de etanol e pH igual a 3,5. .................................................................................. 56

Figura 4.17 - Concentração de antocianinas em função do tempo nas condições de 50°C, 75%

de etanol e pH igual a 3,5. .................................................................................................... 57

Figura 4.18 - Concentração de atividade antioxidante em função do tempo nas condições de

50°C, 75% de etanol e pH igual a 3,5. .................................................................................. 58

Figura 4. 19 - Gráfico da porcentagem de degradação em função das temperaturas a, pH e a

porcentagem da concentração em cada um dos ensaios. ....................................................... 60

Figura 6. 1 - Curva de calibração para CFT .......................................................................... 76

Figura 6. 2 - Curva de calibração de AA .............................................................................. 76

LISTA DE TABELAS

Tabela 2. 1 - Composição nutricional dos resíduos de polpas de frutas tropicais. .................... 8

Tabela 2. 2 - Composição química (ou nutricional) do fruto da castanhola. ............................ 8

Tabela 2. 3 - Parâmetros físicos da castanhola. ....................................................................... 9

Tabela 2. 4 - Estudos publicados sobre a utilização de solventes na extração e as condições de

operação para a recuperação de compostos bioativos naturais. ............................................. 22

Tabela 2. 5 - Análise de variância para o ajuste do modelo matemático através da tabela

ANOVA. ............................................................................................................................. 24

Tabela 3. 1 - Planejamento experimental 24 (4 fatores e 2 níveis) ......................................... 29

Tabela 4. 1 - Diâmetro da abertura das peneiras e o valor da fração mássica (xi) da massa

retida em cada peneira. ......................................................................................................... 37

Tabela 4. 2 - Resultados da extração de atividade antioxidante, compostos fenólicos e

antocianinas da polpa do fruto de castanhola ........................................................................ 39

Tabela 4. 3 - Valores dos efeitos para AA, CFT e AMT ....................................................... 40

Tabela 4. 4 - Valores de Fcal e Ftab para AA, CFT e AMT .................................................. 42

Tabela 4. 5 - Valores de Fcal/Ftab para AA, CFT e AMT respectivamente ........................... 43

Tabela 4. 6 - Concentrações de CFT, AMT e AA com o tempo de extração ......................... 55

Tabela 4. 7 - porcentagem de degradação de antocianinas em 5 dias a 25°C ......................... 58

Tabela 4. 8 - Porcentagem de degradação de antocianinas em 5 dias a 60°C ......................... 59

LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIAÇÕES

AA – Atividade antioxidante

CFT – Compostos fenólicos totais

AMT – Antocianinas monoméricas totais

DPPH – 2,2-difenil-1-picril-hidrazila (C18H12N5O6)

Ci-3-gli – Cianidina-3-glicosídeo

GAE – Equivalentes em ácido gálico

%SRL – Porcentagem do radical livre

ANOVA – Análise da variância

CAPÍTULO 1

INTRODUÇÃO

Capítulo 1 - Introdução

2 Viviane Hiromi Uchida, dezembro/2014

1- Introdução

Terminalia catappa Linn (da família Combretaceae), popularmente conhecida como

castanhola, cresce em regiões tropicais e subtropicais, particularmente localizadas em áreas

costeiras (RODRIGUES, 2012). Ela é nativa de áreas próximas a regiões costeiras do Oceano

Índico. Os frutos da castanhola possuem uma polpa carnosa, contendo em seu interior uma

semente arredondada e rica em óleo, envolvida por uma casca muito dura (LIMA, 2012). A

coloração do fruto é verde passando ao amarelo e vermelho quando maduros. Eles são

comestíveis, fonte de proteínas e lipídios e são utilizados como alimentos, aves e outros

animais (MARQUES et al., 2013). A pigmentação natural presente no fruto da castanhola

indica a presença de antocianinas, componentes de natureza fenólica pertencente ao grupo dos

flavonóides, que apresentam atividade antioxidante.

Os corantes são adicionados aos alimentos por várias razões, que incluem as perdas ou

alterações da cor natural que ocorrem durante o processamento e estocagem, ou ainda por

problemas de matérias-primas de origens diferentes (AZEREDO, 2012). Além disso, se

espera ver nos alimentos, principalmente naqueles processados, uma aparência natural que os

torna atraentes.

Tem havido uma tendência crescente para substituir os tradicionais corantes artificiais,

empregados em alimentos industrializados, pelos corantes naturais, em virtude dos efeitos

nocivos, tal como alergias, apresentados por alguns corantes artificiais (OLIVEIRA, 2005).

Os corantes naturais estão espalhados pela natureza, geralmente nos frutos, nos

vegetais, nas sementes e nas raízes. Estes pigmentos apresentam propriedades físicas e

químicas muito distintas, são sensíveis à oxidação, as mudanças de pH, à luz e apresentando

uma estabilidade muito inferior a dos corantes sintéticos (MEINICKE, 2008).

Muitos dos pigmentos naturais utilizados, inicialmente, com o objetivo de colorir os

alimentos, são fotoquímicos com um elevado poder antioxidante (PEREIRA et al., 2008;

SOUSA et al., 2011). O fato que as reações de oxidação podem estar relacionadas com o

aparecimento de diversas doenças, impulsiona o desenvolvimento de métodos de extração de

corantes naturais e inúmeros investimentos na sua aplicação industrial.

Um grupo de antioxidante bastante estudado é o das antocianinas, pertencentes a um

dos maiores grupos de pigmentos solúveis em água. Esses pigmentos naturais são encontrados

em diversas plantas e, em elevada quantidade, em diversos frutos. Estes compostos são

potentes antioxidantes e apresentam uma forte atividade bioquímica e farmacológica, que

Capítulo 1 - Introdução


inclui efeitos anticarcinogênicos, anti-inflamatórios e antimicrobianos (SALES, 2013). As

antocianinas que são extraídas de certas plantas e frutos comestíveis são utilizadas como

corantes alimentares. Estas constituem uma das subclasses dos flavonoides, compostos

polifenólicos constituídos por dois anéis de benzeno e um anel central heterocíclico contendo

oxigênio.

A extração dos produtos naturais depende de uma série de fatores, tais como suas

propriedades físico-químicas e a finalidade a que se destina. Por isso existem vários fatores

que influenciam a extração de corantes como: Tamanho da partícula, solvente, temperatura e

pH.

Este trabalho propõe o estudo do processo de extração do corante do fruto da

castanhola (Terminalia catappa Linn) e, o estabelecimento das melhores condições para o

processo de extração do corante, caracterizando o extrato obtido em suas principais

potencialidades. O estudo propõe realizar extrações sólido-líquido por imersão mediante o

controle de parâmetros por planejamento, para se conhecer a influência dos parâmetros no

processo de extração: relação do solvente, temperatura, tempo e pH. Propõe-se ainda

descrever a curva cinética dos compostos fenólicos, antocianinas e a atividade antioxidante no

processo de extração em estudo baseado nas condições de operação ótimas do sistema.

Finalmente o presente trabalho teve por objetivo o estudo da estabilidade do corante visando o

seu armazenamento e a utilização em alimentos.

CAPÍTULO 2

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

Capítulo 2 – Revisão bibliográfica


2 - Revisão bibliográfica

2.1 - Castanhola (Terminalia catappa Linn)

A castanhola existe em grande quantidade na região Nordeste. A amendoeira-da-praia

(Terminalia catappa Linn) com origem na Índia e Malásia, também chamada de castanhola, é

uma árvore de grandes dimensões que pode atingir 35 metros de altura. Foi introduzida no

Brasil pelos Portugueses no período de colonização do país e se adaptou em diversos climas.

Esta árvore (Figura 2.1) foi bastante cultivada ao longo do litoral brasileiro. Como é muito

resistente à salinidade e aos efeitos do vento, desenvolve-se bem na areia das praias.

Figura 2. 1- Ávore de castanhola

O fruto da castanhola (Figura 2.2) apresenta uma coloração entre o verde intenso e o

vermelho rubro. Embora seja abundante em algumas regiões, seu consumo in natura é

moderado. As cascas da castanhola são usadas como diurético e as folhas agem como

sudorífico e contra a dor de cabeça (PAWAR et al., 2002).



Figura 2. 2 - Fruto da castanhola

2.1.1 - Composição nutricional da castanhola

Alimentos de origem vegetal contêm quantidades significativas de compostos

bioativos, que fornecem benefícios à saúde e são desejáveis além da nutrição básica

(CARTEA et al., 2011).

O consumo de frutas está recebendo uma maior atenção, devido principalmente ao fato

destas apresentarem propriedades funcionais serem reconhecidas como fontes de vitaminas,

minerais e fibras, logo são alimentos nutricionalmente importantes da dieta (MELO et al.,

2008).

Segundo Kuskoski et al. (2006), o consumo de frutas tropicais tem aumentado com o

passar do tempo devido ao valor nutritivo e aos efeitos terapêuticos.

Vizzotto (2013) relata que frutas vermelhas, possuem diferentes grupos de

fitoquímicos e que podem trazer benefícios para a saúde humana quando consumidos como

parte da dieta habitual.

Têm sido desenvolvidas pesquisas envolvendo compostos antioxidantes provenientes

de fontes naturais, devido a sua importância na prevenção de reações oxidativas, já que os

antioxidantes podem agir retardando ou prevenindo a oxidação do substrato envolvido nos

processos oxidativos e, portanto impedindo a formação de radicais livres (BROINIZI et al.

2007). Segundo Cartea et al. (2011) os efeitos benéficos do Brássicas (família de hortaliças)

para a melhoria da saúde têm sido, em parte, atribuídos à fitoquímicos que possuem atividade

antioxidante.

Estudos anteriores têm demonstrado que as frutas são ricas em muitos nutrientes e

compostos antioxidantes, e que esses constituintes se concentram em sua grande maioria nas

cascas e sementes (COSTA et al., 2000; MELO et al., 2008; ABRAHÃO et al., 2010 apud

SOUSA et al., 2011).

A maior parte do efeito antioxidante das frutas é devido, principalmente, à presença de

compostos fenólicos, que têm sido associados com características de sabor e cor dos frutos e

legumes (CARTEA et al., 2011).



Existe diferença nos teores de compostos bioativos em espécies de diferentes frutas

vermelhas (VIZZOTTO et al., 2013). Segundo Broinizi et al. (2007) frutas e outros vegetais

contêm substâncias antioxidantes distintas.

Melo et al. (2008) estudaram a habilidade de sequestrar o radical estável 1,1-difenil-2-

picrilhidrazil (DPPH), em diversas frutas tropicais (Figura 2.3), com extratos aquosos e

acetônicos. Foi constatado que todas as frutas estudadas apresentaram capacidade

antioxidante, entretanto a intensidade desta ação foi diferenciada entre elas.

Figura 2. 3 - Capacidade de sequestrar o radical DPPH (%). Fonte: (MELO et al., 2008)

Sousa et al. (2011) disseram que as frutas não são fontes de proteínas, entretanto esse

macronutriente é predominantemente nas cascas e sementes.

Os compostos fenólicos presentes nas plantas estão relacionados, principalmente, com

a proteção, conferindo alta resistência a microrganismos e pragas (ROCHA et al., 2011). Nos

alimentos, estes compostos podem influenciar o valor nutricional e a qualidade sensorial,

conferindo atributos como cor, textura, amargor e adstringência. Na maioria dos vegetais, os

compostos fenólicos constituem os antioxidantes mais abundantes (EVERETTE et al., 2010).



Tabela 2. 1 - Composição nutricional dos resíduos de polpas de frutas tropicais. Fonte: Sousa,

et al. (2011)

Resíduo Umidade% Cinzas% Proteína% Lipídios% Carboidratos

totais%

Calorias

(100g)

Goiaba 65,54 ±0,32a 0,72 ±0,02a 2,82 ±0,19a 2,94 ±0,01c 27,98 150

Acerola 83,45 ±0,06b 0,55 ±0,03a 1,65 ±0,26b 3,59 ±0,15d 10,76 82

Abacaxi 88,19 ±0,80b 0,53 ±0,04a 1,05 ±0,01b 0,69 ±0,03a 9,54 49

Graviola 83,16 ±0,83b 0,48 ±0,04a 1,09 ±0,07b,c 2,28 ±0,13b 12,99 77

Bacuri 85,81 ±0,13b 0,65 ±0,28a 0,56 ±0,03b,c 3,84 ±0,02e 9,14 74

Cupuaçu 93,86 ±0,08b 0,20 ±0,12a 1,65 ±0,38c 3,69 ±0,02d 0,6 42

a,b,c,d,e médias, na mesma coluna, seguidas de letras diferentes, diferem entre si pelo teste

de Tukey a 5% de probabilidade.

A composição nutricional dos frutos pode variar em função das condições climáticas,

do solo e do manuseio (Augusta, 2011). A castanhola possui um teor de umidade bem abaixo

em relação às frutas apresentadas na Tabela 2.1. De acordo com a Tabela 2.2 pode-se

observar que a castanhola possui uma quantidade mais elevada de carboidratos e calorias em

relação a outras frutas apresentadas na Tabela 2.1.

Tabela 2. 2 - Composição química (ou nutricional) do fruto da castanhola. Fonte Marques et

al. (2013)

Nutrientes Castanhola

Umidade 17,2 ± 1,13

Lipídios 2,79 ± 0,58

Proteínas 2,30 ± 0,00

Carboidratos 76,88 ± 0,58

Vitamina C (mg.100 g-1

) 0,22 ± 0,00

Valor energético total (TEV) (kcal.100 g-1

) 341,83



Tabela 2. 3 - Parâmetros físicos da castanhola. Fonte Marques et al. (2013)

Parâmetros Valores obtidos

Numero de frutos 20

Média do peso dos frutos (g) 19,60 ± 0,00

Polpa (g) 11,24 ± 2,35

Casca (g) 1,08 ± 0,00

Semente (g) 7,28 ± 0,59

Rendimento da polpa (%) 57,34

Porcentagem da casca 5,51

Porcentagem da semente 97,14

Altura (cm) 4,32 ± 0,00

Largura (cm) 3,16 ± 0,00

Espessura (cm) 2,57 ± 0,00

Sólidos solúveis (ºBrix) 8 ± 0,00

De acordo com Huber e Rodriguez-Amaya (2008) a quantidade de flavonóides em

alimentos são determinados geneticamente, entretanto fatores como estação do ano, clima,

composição do solo, estágio de maturação, preparo, processamento e estocagem dos

alimentos podem influenciam nestas concentrações (HUBER e RODRIGUEZ-AMAYA,

2008). Vizzotto (2013) afirma que existe diferença nos teores de compostos bioativos em

diferentes espécies de frutas vermelhas. Nos frutos de castanhola existem diferentes

quantidades de compostos bioativos dependendo da maturação ou em condições climáticas e

de solos diferentes.

Embora os frutos da castanhola não sejam explorados comercialmente, segundo

Marques et al. (2013), estes possuem um elevado teor calórico e podem ser usados como uma

fonte de hidratos de carbono, sendo uma fonte de compostos fenólicos com propriedades

antioxidantes.



2.2 - Compostos fenólicos

Os compostos fenólicos são substâncias bastante distribuídas na natureza que estão

presentes em vegetais. Estes estão presentes nos alimentos como ácidos fenólicos,

flavonóides, lignanas, estilbenos, coumarinas, e taninos (BERTOLD, 2006).

Segundo Shahidi e Naczk (2004a), os compostos fenólicos também podem agir como

antibióticos, pesticidas naturais, agentes de proteção contra radiação ultravioleta (UV),

materiais isolantes para fazer as paredes das células impermeáveis à água e gás como

materiais estruturais para dar estabilidade plantas.

Desses compostos fazem parte os pigmentos que dão a aparência colorida aos

alimentos, sabor e adstringência, sendo produtos do metabolismo secundário, derivando de

reações de defesa das plantas contra agressões do ambiente (SILVA et al., 2010; SOTO et al.

2011). Segundo Ignat et al. (2011), estes compostos são de grande importância fisiológica e

morfológica em plantas.

Os compostos fenólicos possuem um anel aromático com um ou mais grupos

hidroxilos variando de uma molécula fenólica simples para compostos altamente

polimerizados (BALASUNDRAM et al., 2006; IGNAT et al., 2011).

Os compostos fenólicos obtidos dos vegetais são constituídos de fenóis simples, ácidos

fenólicos (tanto benzóico e derivados do ácido cinâmico), cumarinas, flavonóides, estilbenos,

taninos hidrolisáveis e condensados, lignanas e ligninas (SHAHIDI e NACZK, 2004a).

Várias pesquisas estão sendo feitas para os compostos fenólicos, pois demonstram que

estes compostos possuem a capacidade de capturar radicais livres, e por isso podem prevenir

várias doenças degenerativas.

A atividade antioxidante de compostos fenólicos deve-se principalmente às suas

propriedades redutoras e estrutura química. Segundo Sousa et al. (2007) estas características

desempenham um papel importante na neutralização ou sequestro de radicais livres. Sousa et

al. (2007) ainda afirmam que os intermediários formados pela ação de antioxidantes dos

compostos fenólicos são relativamente estáveis, devido à ressonância do anel aromático

presente na estrutura destas substâncias.

Os compostos fenólicos que ocorrem em alimentos pertencem à família dos

fenilpropanóides (C6-C3) que são derivados de ácido cinâmico (ANGELO e JORGE, 2006).

Estes compostos não estão de forma homogênea nos frutos e vegetais, assim como as classes

e subclasses destes compostos (CRUZ, 2008).



Segundo Cartea et al. (2011) estudos recentes sugerem que os vegetais podem ser uma

boa fonte de antioxidantes naturais, devido aos altos níveis de carotenóides, tocoferóis e ácido

ascórbico.

Os compostos fenólicos são derivados metabólicos da fenilalanina que é produzida em

células vegetais (CRUZ, 2008). Por meio da eliminação de uma molécula de amônia, a

fenilalanina se transforma no ácido cinâmico (Figura 2.4), onde é catalisada pela fenilalanina

amonialiase (PAL) (AZEVEDO, 2010). Esta é uma etapa reguladora na formação de vários

compostos fenólicos nos vegetais.

Figura 2. 4 - Metabolismo dos compostos fenólicos em plantas. Fonte: Shahidi e Naczk

(2004a)



2.3 – Flavonóides

Os flavonóides são metabólicos secundários sintetizados pelas plantas (HUBER et al.,

2008). Segundo Kahkonen et al. (1999) os principais subgrupos de flavonóides em frutos são

as antocianinas, flavonóis, e catequinas.

Estes compostos são formados a partir de fenilalanina (Figura 2.4), a condensação de

compostos C3-C6 através da participação de malonil-coenzima A, conduz à formação de

chalconas, e sob condições ácidas, produz flavonóides e isoflavonas, entre outros (SHAHIDE

e NACZK, 2004) (Figura 2.5).

Figura 2. 5: Biossintese dos Flavonoides. Fonte: Shahidi e Naczk. (2004b)

Sugundo Huber e Rodriguez-Amaya (2008) a estrutura dos flavonóides é baseada no

núcleo que consiste de dois anéis fenólicos A e B e um anel C, e que se diferem em dois

grupos: pirano heterocíclico (flavanóis e antocianidinas) e pirona (flavonóis, flavonas,

isoflavonas e flavanonas) que compreendem as principais classes dos flavonóides (Figura

2.6).



As classes de flavonoides que são consideradas as mais importantes são os flavonóis e

as antocianidinas (MARÇO e POPPI, 2008).

Segundo Huber e Rodriguez-Amaya (2008) a atividade biológica dos flavonóides e de

seus metabólitos depende da sua estrutura química e dos vários substituintes da molécula, já

que é possível a estrutura básica sofrer uma série de modificações como a glicosilação,

esterificação, amidação, hidroxilação, que podem alterar a polaridade, toxicidade e

direcionamento intracelular.

Figura 2. 6 - Estruturas químicas dos principais flavonóides. Fonte: Huber e Rodriguez-

Amaya. (2008)



2.4 - Antocianinas

Antocianinas são importantes flavonóides que são responsáveis por apresentarem

cores visíveis ao olho humano presentes nas flores, frutas e folhas desempenhando um papel

importante na sobrevivência fisiológico das plantas (HARBORNE e WILLIAMS, 2000).

Segundo Harborne e Williams (2000), a cor vermelho-púrpura que aparece nas flores

das orquídeas são derivados de cianidina e glicosídeos peonidina, com ligações de açúcares

acilados.

As antocianinas possuem uma estrutura principal chamada de aglicona e tem como

cromóforo básico o 2-fenilbenzopirílio, também conhecido como catião flavílio (Figura 2.7)

(COSTA, 2012).

As antocianinas são classificadas de acordo com o número de moléculas de hidratos de

carbono (ou glicosídeos) ligadas ao cromóforo em monoglicosiladas, diglicosiladas e

triglicosiladas (COSTA, 2012).

Figura 2. 7 - Forma básica das antocianinas. Fonte: Cruz (2008)

As funções que as antocianinas desempenham nas plantas são: ação antioxidante,

proteção à luz, mecanismo de defesa e função biológica (LOPES et al., 2007b)

Segundo Cruz (2008), as antocianinas se apresentam no vegetal mais

predominantemente na forma de mono ou di-glicosídeos, e muito pouco na forma de

agliconas.

As antocianinas são pigmentos naturais e por isso, são responsáveis por uma variedade

de cores nas frutas (Figura 2.8), flores e folhas, que variam do vermelho ao azul (SANTOS et

al., 2014). Enquanto que as chalconas e flavonas são amarelos. Essas cores variam de acordo

com as ligações feitas no anel “B” nos radiais R1 e R2 (Figura 2.8).



Shahidi e Naczk (2004b) também relatam que as antocianinas são pigmentos solúveis

em água.

Figura 2. 8 – Estrutura química das antocianinas Fonte: Bobbio e Bobbio (1995)

2.5 – Estabilidade das antocianinas

A utilização de antocianinas na indústria de alimentos é bastante restrita devido à sua

baixa estabilidade. Segundo Schmitz (2014) a instabilidade das antocianinas está associada a

composição inicial do fruto como enzimas, íons metálicos, ácido ascórbico, dióxido sulfúrico,

açúcares e copigmentos. Sendo os principais fatores da estabilidade das antocianinas são as

influências como a copigmentação, temperatura, luz e pH. A interação entre estes fatores

também pode afetar a estabilidade (FAVARO, 2008).

2.5.1 - Copigmentação

Segundo Stringheta e Bobbio (2000), nos vegetais o pH se encontra na faixa

ligeiramente ácida para neutra e por isso seria impossível que as antocianinas estejam

coloridas se considerarmos que a coloração das antocianinas são apenas em função do pH. A

presença de compostos chamados copigmentos pode ser um dos fatores que determinem a

estabilidade de antocianinas em pH neutro.

Capítulo 2 –Revisão Bibliográfica


Stringheta e Bobbio (2000), também relata que os flavonóides não antociânicos,

alcalóides, aminoácidos e nucleosídeos, entre outros, podem atuar como copigmentos e a

própria antocianina pode agir copigmentando outra antocianina.

2.5.2 - pH

O pH tem grande influência na estabilidade das antocianinas. Segundo Falcão (2006) a

estrutura das antocianinas em meio ácido são determinadas por uma substituição no anel B da

aglicona. Assim, com o aumento do grau de metoxilação, a cor vermelha é intensificada. Já

um maior grau de hidroxilação a intensidade da cor azul é aumentada.

Lopes et al. (2007)b relatam que as antocianinas em solução aquosa são encontradas

com diferentes estruturas químicas e em equilíbrio. Estas estruturas estão na forma de cátion

flavilio, de cor avermelhada, base anidra quinoidal possuem cor azul, pseudo-base carbitol

sendo incolor, e a chalcona que varia do incolor a levemente amarelado (XAVIER, 2004).

Segundo Março e Poppi (2008), a característica importante das antocianinas é o fato

de, em soluções aquosas, estas apresentam diferentes estruturas em função do pH. A Figura

2.9 apresenta as diferentes estruturas químicas das antocianinas em função da mudança do

pH.

Em um pH abaixo de 2 (ácido) as antocianinas estão na forma do cátion flavílico

(AH+), mas com o aumento do pH ocorre uma desprotonação formando uma estrutura

chamada de pseudobase carbinol (B) (XAVIER, 20040; MARÇO e POPPI, 2008).

Março e Poppi (2008) relatam que, com o aumento do pH, as antocianinas perdem a

cor até se tornarem incolores em pH aproximadamente igual a 6, devido o pseudobase

carbinol (B) ser predominante. Março e Poppi (2008) também afirmam que em um pH acima

de 6,0, as duas estruturas: pseudobase carbinol(B) e anidrobase quinoidal (A) podem formar a

espécie cis-chalcona (CC) e que quando se aumenta, de forma brusca, o valor do pH a

Anidrobase Quinoidal(A) tende a formar a Anidrobase Quinoidal Ionizada(A-).

Segundo Heredia et al. (1998) com o aumento da temperatura o equilíbrio se desloca

na direção da formação da base chalcona.

As antocianinas são solúveis em água e a acidez influi na cor, por causar mudanças na

estrutura química (AUGUSTA, 2011) como pode ser observado na Figura 2.9.



Figura 2. 9 - Possíveis mudanças estruturais das antocianidinas em meio aquoso em função do

pH. Fonte: Março e Poppi (2008)

A cor das antocianinas é diretamente influenciada pela substituição dos grupos

hidroxila e metoxila na molécula (XAVIER, 2004). Segundo Bridle e Timberlake (1997)

quando um ou mais grupos acilas estão presentes na molécula da antocianina, estes tendem a

dificultar a hidrólise do cátion flavilium, de coloração vermelha, formando a base carbinol,

sendo incolor, permitindo a formação da base quinoidal que possui coloração azul.

Segundo Xavier (2004), o aumento de grupos hidroxilas na molécula tendem a tornar a

coloração azul e aumentos do número de grupos metoxilas aumentam a intensidade do

vermelho.



2.5.3 - Temperatura

A temperatura é um fator importante na degradação destes pigmentos. Brouillard e

Dubois (1977) relataram que o aumento da temperatura favorece à formar a chalcona, que e

incolor, a partir do carbinol.

A estabilidade das antocianinas frente à temperatura é influenciada pelo grau de

acilação (LOPES et al., 2007). Um estudo feito por Falcão (2006) em um sistema modelo de

geleia de uvas, mostrou que no processamento a 45ºC não houve diferença significativa na

concentração de antocianinas depois do processo.

Malacrida e Motta (2006) relatam que existem evidências que a principal causa da

perda de cor seja a hidrólise glicosídica das antocianinas, pois a velocidade da liberação do

açúcar é proporcional à velocidade da perda da cor vermelha.

2.5.4 - Luz

A luz é um dos principais fatores de degradação das antocianinas. Segundo Malacrida

et al. (2006) as antocianinas são instáveis à luz visível e ultravioleta, ou até mesmo fontes de

radiação ionizante.

Extratos de antocianinas são mais estáveis sob proteção da luz quando comparados

àqueles que permaneceram expostos à luz. A radiação UV interage no extrato de maneira a

facilitar reações como, por exemplo, copigmentação com outros compostos presentes

alterando a estabilidade das antocianinas, além de favorecer a formação de produtos de

degradação oxidativa das antocianinas que possuem coloração marrom (FAVARO, 2008).

Segundo Nachtigallo et al. (2010) em um estudo do impacto da luz na estabilidade das

antocianinas constataram que o efeito da luz foi bastante destrutivo para a cor das

antocianinas, principalmente em pH 4,0.

2.6 - Ação antioxidante

Os compostos fenólicos encontrados em plantas possuem vários efeitos biológicos,

entre elas a atividade antioxidante (KAHKONEN et al., 1999). Os ácidos fenólicos são

compostos fenólicos primários responsáveis pela ação antioxidante. Bernardes (2014) relata

que alguns fitoquímicos, tais como flavonoides, ácidos fenólicos, alcalóides, esteróides e



saponinas foram descritos na literatura com potencial antioxidante, ou seja, com capacidade de

sequestrar ou neutralizar espécies reativas de oxigênio e/ou nitrogênio.

Segundo Sucupira et al. (2012), os compostos fenólicos são poderosos antioxidantes,

pois atuam combatendo os radicais livres através da doação de um átomo de hidrogênio de um

grupo hidroxila (OH), isto porque através da sua estrutura aromática possui a capacidade de

suportar um elétron desemparelhado através do deslocamento deste ao redor de todo o sistema

de elétrons da molécula e assim interrompendo a reação de propagação dos radicais livres.

Frankel (1980) apresentou o mecanismo da ação antioxidante (Equação 2.1).

𝑅𝑂𝑂∙ + 𝐴𝐻 → 𝑅𝑂𝑂𝐻 + 𝐴∙ (2.1)

Sendo: 𝑅𝑂𝑂∙– radical livre;

𝐴𝐻 – antioxidante com um átomo de hidrogênio ativo;

𝐴. – radical inerte.

O átomo de hidrogênio ativo presente no antioxidante é afastado pelo radical livre

(𝑅𝑂𝑂∙) formando uma espécie inativa (𝑅𝑂𝑂𝐻) e um radical inerte (𝐴∙) procedente do

antioxidante, logo estabilizado por ressonância, não tendo a capacidade de iniciar reações

de oxidação.

Segundo Frankel (1980) o processo de inibição dos compostos fenólicos está na

facilidade de doar um átomo de hidrogênio.

2.7 - Extração sólido-líquido por imersão

A extração tem como objetivo retirar dos materiais orgânicos ou inorgânicos as

substâncias de interesse. Para cada substância a ser extraída há um tipo de extração, pois o

caráter das substância pode variar. O método de extração vai depender da proposta de

aplicação, para uma aplicação industrial, será considerado um método simples, rápido, custo

baixo e que utilize solventes extratores de baixa toxicidade (FAVARO, 2008).

Existem diversas técnicas de extrações que têm sido desenvolvidas para melhorar o

isolamento e produção de compostos bioativos de origem vegetal. Os métodos mais utilizados

são as extrações sólido-líquido que podem ser realizadas por percolação ou imersão.



A extração sólido-líquido é utilizada para se obter determinados compostos de

materiais diferentes, tais como sedimentos, solos, polímeros, bactérias, fungos, algas e de

microalgas, e mais comumente de plantas. (HATTAB et al., 2007). Nessa extração os

componentes de uma fase sólida podem ser separados a partir de um dissolução da parte

solúvel do sólido por meio de um solvente apropriado.

A extração sólido-líquido por imersão normalmente é utilizada para separar compostos

bioativos de produtos vegetais. A extração desses compostos é influenciada pela natureza

química, o método de extração utilizado, o tamanho da partícula, o tempo e as condições de

armazenamento, assim como a presença de substâncias interferentes (AZEVEDO, 2010). A

identificação e isolamento de compostos bioativos em fontes naturais, como frutas, é

necessária a realização da extração com solventes orgânicos (ANDREO et al., 2006).

Os grãos do material orgânico quando colocados em contato com o solvente ocorre

uma troca contínua entre o composto a ser extraído. Neste processo é necessário uma agitação

para garantir que o solvente localmente saturado seja substituído pelo solvente (OETTERER,

REGITANO D´ARCE, SPOTO, 2006).

O rendimento da extração pode ser influenciado por fatores como: o tamanho da

partícula, o solvente, temperatura e a agitação. Na extração de substâncias antioxidantes com

solventes orgânicos pode ser eficiente para alguns casos e exige controle de alguns fatores

como, a polaridade do solvente, o tempo e a temperatura de extração, pois podem ocorrer

perda ou destruição dos compostos antioxidantes (ANDREO, 2006). As antocianinas são

compostos bastantes solúveis em água e podem ser facilmente extraídas com solventes

polares (CARDOSO, 2011). Segundo Hattab et al. (2007), o processo para extração de

compostos antioxidantes é normalmente realizado a partir da matéria-prima com diferentes

solventes, com o objetivo de otimizar a extração dos compostos de interesse.

Alguns dos solventes bastante utilizados nos processos de extração são o hexano, éter,

clorofórmio, acetonitrilo, benzeno, acetona, metanol, e etanol e são comumente usado em

diferentes proporções com água.

2.8 - Solvente

Os compostos fenólicos podem ser extraídos de vegetais e plantas. Existem diversos

métodos para a extração destes compostos em frutas e vegetais utilizando solventes orgânicos.

Os solventes mais utilizados para estas extrações são água, etanol, metanol e acetona. O



metanol é pouco utilizado pela indústria de alimentos por ser impróprio para o consumo, já

que é um solvente bastante toxico.

Não existe um sistema perfeito de extração para o isolamento de todos os compostos

bioativos, Andreo (2006) relata que há uma grande diversidade de compostos que podem

fazer interações formando complexos entre eles.

As antocianinas são compostos bastante solúveis em água e podem ser facilmente

extraídas com solventes polares (CARDOSO, 2011). O etanol é bastante utilizado como

solvente, já que não é toxico.

Lopes et al. (2007) relata que o recomendado é usar ácidos fracos para as extrações,

como o ácido cítrico. O ácido clorídrico diluído é o mais efetivo, contudo é corrosivo e

prejudicial para a saúde humana por isso não pode ser empregado para fins alimentícios. É

comum a utilização de solventes acidificados, pois auxilia a penetração do solvente nos

materiais orgânicos, além de aumentar a estabilidade dos extratos e assim favorecem a

extração (FAVARO, 2008).

Segundo Favaro, (2008) é necessário o cuidado na adição dos ácidos nos solventes

para a extração de antocianinas, pois o excesso de ácido pode levar à formação de

antocianidinas e outros flavonóides por hidrólise, então gerar resultados superestimados da

quantidade total de antocianinas presentes no material extraído.

A extração de substâncias antioxidantes com solventes orgânicos pode ser eficiente

para alguns casos e exige controle de alguns fatores como, a polaridade do solvente, o tempo

e a temperatura de extração, pois podem ocorrer perda ou destruição dos compostos

antioxidantes (ANDREO, 2006).

Na Tabela 2.4 são apresentados alguns estudos, em que utilizam diferentes solventes e

as condições de operação das extrações realizadas, seguidos dos compostos obtidos a partir

dessas condições. É necessária a realização da extração com solventes de diferentes

polaridades para a identificação e isolamento de compostos bioativos em fontes naturais.


22

Tabela 2. 4 - Estudos publicados sobre a utilização de solventes na extração e as condições de

operação para a recuperação de compostos bioativos naturais. Fonte: Gil-Ch´avez et al. (2013)

Solvente e condições

de operação Material

Composto

de interesse

Rendimento da

extração Referencia

Etanol acidificado,

ácido tartárico e

ácido málico, 1,25%

v/v, 40 ºC, 60-80 min

Casca de berinjela Antocianinas 65,79–76,44 mg/100 g

de casca Todaro et al., 2009

Decano e decano 190

mM CH2Cl2

Microalga: Dunaliella

salina β-Caroteno 345±5 μg/mL Mojaat et al., 2008

Etanol 68%, 55 ºC,

sólido-líquido de

32,7 mL / g

Cascas Pajang

Mangifera fenólicos 12,9 mg GAE/g

Nagendra et al.,

2011

Acetona: água 50%

v/v, 2 horas, 60ºC

Refosk bagaço de

uvas.

Fenólicos e

antocianinas

16,7 mg GAE / g e 0,74

mg / g de material seco Vatai et al., 2008

Etanol, acetato de

etilo e acetona, 20-

60ºC, 2 h

Sabugueiro (EB) e 3

variedades de bagaço

de uva vermelha

(RGM): Refosk,

Merlot, e Cabernet

Fenólicos e

antocianinas

EB: 60,6 mg GAE / g

RGM: 17,3-20,2

mg GAE/g de material

seco EB:

0,5-1,2 mg/g RGM: 10,5

mg/g de

material seco para

antocianinas

Vatai et al., 2009

Metanol, etanol,

acetona, água

acidificada, ou

misturas (1:1, v/v). 1

ou 120 min, pH 3 ou

8, 22 ou 55ºC

Cascas de banana a

partir de 2 cultivares

(Grande Naine e

Gruesa) Subproduto

Fenóis totais

e

antocianinas

3,1-3,8 GAE/100 g e 434

ug c-3-gE/100 g de

material seco

(Gonz´alez-

Montelongo

et al., 2010)

Acetona a 50%, de

solventes para-sólido

proporção de 20

mL/g, 35-36ºC e

100-102 min

Parkia speciosa

vagem de agro-

resíduos

Fenólicos

totais e

flavonóides

668 mg GAE / 100 g e

49,6 mg pirocatecol E /

100 g

(Gan e Latiff,

2010)

mg GAE/100 g: miligramas de acido gálico equivalentes a 100 g de extrato.

mg CE/100 g: milligramas de catechin equivalentes a 100 g de extrato.

PLE, Extração liquido pressurizado; SE, solvente extração.


23

2.9 - Metodologia da superfície de resposta

O planejamento fatorial, associados à análise de superfície de resposta, é uma

ferramenta estatística, que fornece informações seguras sobre o processo (Lopez, Jiménez,

Vargas, 2007).

A metodologia de superfície de resposta baseia-se na construção de modelos

matemáticos empíricos que geralmente empregam funções polinomiais lineares ou

quadráticas para descrever o sistema estudado (SANTO et al., 2008). Usa-se a análise de

superfície de resposta quando as variáveis de resposta são influenciadas por muitas variáveis

independentes.

A superfície de resposta pode ser representada pelo modelo matemático apresentado

na Equação (2.2).

�̂� = 𝛽𝑜 + 𝛽1𝑥1 + 𝛽2𝑥2 + 𝛽3𝑥3 + 𝛽4𝑥4 + 𝛽12𝑥12 + 𝛽13𝑥13 + 𝛽14𝑥14 + 𝛽23𝑥23 + 𝛽24𝑥24

+𝛽34𝑥34 (2.2)

Em que:

�̂� é o valor experimental do composto a ser estudado;

𝛽𝑖 são os parâmetros do modelo em função dos fatores

𝑥𝑖 são os fatores

2.9.1 - Análise da variância

O modelo matemático obtido pode não ser exatamente aquele que descreve a região

estudada do sistema, assim não pode ser usado para fazer estimativas para deslocamento e

muito menos para extrair conclusões (TEÓFILO e FERREIRA, 2006). Logo, é necessário

avaliar a qualidade do ajuste deste modelo. Esta avaliação é determinada com o emprego da

análise de variância (ANOVA).

O exame dos resíduos é fundamental, para a avaliação a qualidade do ajuste de

qualquer modelo (BARROS NETO et al., 2010). Sendo que o valor dos resíduos deve ser

pequenos.

Para se avaliar a qualidade do ajuste é necessário calcular os valores de Fcalc através

dos valores obtidos a partir da tabela ANOVA e assim comprovar se o modelo é adequado

(Tabela 2.5).


24

Tabela 2. 5 - Análise de variância para o ajuste do modelo matemático através da tabela

ANOVA. Fonte: Azevedo (2010)

Fonte de Variação

Soma

Quadrática

Média

Quadrática Fcal

Regressão 𝑆𝑄𝑅 𝑀𝑄𝑅 𝑀𝑄𝑅

𝑀𝑄𝑟

Resíduo 𝑆𝑄𝑟 𝑀𝑄𝑟

Falta de Ajuste 𝑆𝑄𝑓.𝑎𝑗. 𝑀𝑄𝑓.𝑎𝑗.

𝑀𝑄𝑓.𝑎𝑗.

𝑀𝑄𝑒𝑝

Erro puro 𝑆𝑄𝑒𝑝 𝑀𝑄𝑒𝑝

Total 𝑆𝑄𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙

% da variação explicada

𝑆𝑄𝑅

𝑆𝑄𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙

% máxima da variação

explicável

𝑆𝑄𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙 − 𝑆𝑄𝑒𝑝

𝑆𝑄𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙

Para o modelo ser satisfatório é necessário realizar a análise dos valores de Ftab, onde

se 𝑀𝑄𝑅 𝑀𝑄𝑟⁄ > Ttab o modelo linear é satisfatório sendo então significativo. Se 𝑀𝑄𝑅 𝑀𝑄𝑟⁄ <

Ttab o modelo é preditivo. Sendo o modelo significativo e preditivo o R2 também será

satisfatório. O valor máximo de R2 é igual 1. Isto só ocorre se não houver resíduo nenhum e

toda a variação em torno da média for explicada pela regressão (BARROS NETO et al.,

2010). Portanto quanto mais próximo de 1 for o valor de R2, melhor terá sido o ajuste do

modelo em relação às variáveis respostas.

O R2 (coeficiente de determinação do modelo) fornece uma medida da proporção da

variação explicada pela equação de regressão em relação à variação total das respostas

(RODRIGUES et al., 2009). Ou seja, fornecer uma medida da qualidade do ajustamento da

reta de regressão à nuvem de pontos.

CAPÍTULO 3

MATERIAIS E MÉTODOS

Capítulo 3 – Materiais e Métodos


3 – Materiais e Métodos

Neste item o projeto será dividido em etapas. A primeira etapa irá tratar da otimização

da extração dos compostos bioativos do fruto da castanhola, utilizando o planejamento

experimental; a segunda será o estudo cinético do processo de extração e a última etapa será

sobre os estudos na estabilidade do fruto da castanhola.

3.1 - Matéria-prima

Os frutos da castanhola in natura utilizados neste trabalho foram obtidos no Campus

Universitário da UFRN, colhidos manualmente durante seu período de safra, nos meses de

dezembro a março de 2013 e em novembro de 2014.

3.2 - Obtenção do corante por extração sólido-líquido

As etapas desenvolvidas para extração do corante encontram-se descritas no

fluxograma apresentado na Figura 3.1 e serão descritas a seguir.

Figura 3. 1 - Fluxograma do processo de extração do corante

Castanhola

Seleção do fruto

Obtenção da Polpa

Secagem e moagem

Análise granulométrica

Planejamento experimental

Extração

Análises



3.2.1 – Seleção do fruto e obtenção da polpa

Os frutos de castanhola in natura depois de obtidos foram lavados em água corrente e

então selecionados de acordo com a cor e o grau de maturidade. Em seguida foram

descascados para a retirada da polpa. A casca e o caroço foram desprezados.

3.2.2 – Secagem e moagem e análise granulométrica

Os frutos de castanhola foram submetidos à secagem em uma estufa com ventilação

(Marco, modelo MA033) a uma temperatura de 70ºC por 1 hora. Segundo Malacrida e Motta

(2006), processos utilizando baixo tempo em altas temperaturas têm sido recomendados para

melhor retenção dos pigmentos.

Após a secagem, as amostras foram trituradas e então foi realizado a análise

granulométrica do material. Esta foi feita em peneiras vibratórias (Bertel, série Tyler 12.11).

Foram analisadas abertura, por polegada linear das peneiras de 10, 24, 32 e 48 mesh, com

duração de 10 minutos e intensidade de vibração 4. O pó que estava retido nas peneiras foi

utilizado para calcular o diâmetro médio das partículas através do cálculo do diâmetro de

Sauter de acordo com a Equação (3.1).

𝑑𝑝𝑠 =1

∑𝑥𝑖𝑑𝑖

(3.1)

Depois o pó foi acondicionado em potes plásticos brancos e opacos, de forma que não

recebessem luz, e foi refrigerado até o momento de ser utilizadas. O pó é apresentado na

Figura 3.2.



Figura 3. 2 - Pó da castanhola pronta para a extração

3.2.3 - Planejamento Experimental

A extração foi realizada variando: temperatura, porcentagem do etanol, tempo e pH

sendo aplicado o planejamento experimental de acordo com esses parâmetros. Para o solvente

foi escolhido um sistema binário de água e etanol representado por porcentagem de etanol. O

etanol foi o solvente escolhido para as extrações por não ser tóxico e o mais indicado para

aplicação para fins alimentícios.

O planejamento fatorial consiste, em selecionar um número fixo de níveis nos quais

cada variável investigada varia em todas as combinações possíveis umas com as outras

(LOPES et al., 2007a). Os resultados obtidos são aplicados ao planejamento fatorial,

fornecendo os efeitos das variáveis em relação a variável resposta. Assim o uso do

planejamento determina as variáveis mais importantes que influenciam no processo de

extração.

Os valores dos fatores foram escolhidos a partir de testes realizados anteriormente,

para estabelecer as condições operacionais, para um melhor rendimento dos extratos. Um

planejamento com maiores valores de água no solvente não obteve condições necessárias para

a realização do planejamento, pois o modelo não era adequado para as condições de operação.

O planejamento foi realizado a partir de dois níveis e 4 pontos centrais conforme é

apresentado na Tabela 3.1.



Tabela 3. 1 - Planejamento experimental 24 (4 fatores e 2 níveis)

Níveis

Fatores -1 0 1

Temperatura (ºC) 25 37,5 50

Porcentagem do etanol 50 62,5 75

Tempo (min) 10 20 30

pH 3,5 5,5 7,5

Ensaio Temperatura Etanol % Tempo pH

1 + + + +

2 - + + +

3 + - + +

4 - - + +

5 + + - +

6 - + - +

7 + - - +

8 - - - +

9 + + + -

10 - + + -

11 + - + -

12 - - + -

13 + + - -

14 - + - -

15 + - - -

16 - + - -

17 0 0 0 0

18 0 0 0 0

19 0 0 0 0

20 0 0 0 0

3.2.4 – Extração sólido-líquido por imersão

Para a extração foram utilizados 8 g de pó para cada extração com 80 mL de solvente

de acordo com os níveis (superior e inferior), que representam a porcentagem do solvente,

para cada ensaio.

O pó foi submetido à extração sólido-líquido em um reator por agitação mecânica

acoplado onde foi realizado o controle dos parâmetros: temperatura, pH, porcentagem de

etanol e tempo.

Esta extração possui um mecanismo simples de baixo custo. A Figura 3.3 apresenta o

os aparelhaem utilizada para a extração. O material a ser extraído é agitado em uma

velocidade de 12 rpm, previamente estabelecida, em um reator enjaquetado (Sulglass). O



reator é acoplado em um banho termostático (Tecnal, série TE – 184) onde ocorre

recirculação de água a uma temperatura constante.

Figura 3. 3 - Reator enjaquetado acoplado a um banho termostático

A extração sólido-líquido é uma operação unitária que basicamente se resume na

separação de um ou mais componentes de uma mistura sólida através de um solvente líquido.

Neste processo ocorrem as seguintes etapas: contato do solvente com o sólido, que lhe cede o

componente solúvel; separação da solução do sólido remanescente por filtração para

recuperação do soluto dissolvido no líquido extrator (FELLOWS, 2006).

3.2.5 – Análises do extrato

Após a realização do experimento, as amostras foram retiradas e levadas às análises de

compostos fenólicos totais, antocianinas monoméricas totais e atividade antioxidante.

3.2.5.1 - Determinação de Compostos fenólicos totais (CFT)

O teor de compostos fenólicos totais foi determinado segundo a metodologia descrita

por Cheplick et al., (2010). A metodologia consiste em colocar em um tubo de ensaio 1 mL

do extrato, 1 mL de etanol 95%, 5 mL de água destilada e 0,5 mL do reagente Folin-

Ciocalteau. A solução é homogeneizada e deixada em repouso durante 5 minutos. Após este

tempo adiciona-se à solução 1 mL de Na2CO3 5% e mantem-se em câmara escura por 60



minutos. Após o tempo determinado, homogeneízam-se as amostras novamente e medem-se

suas absorbâncias no comprimento de onda de 725 nm contra branco, constituído apenas de

solução etanoica 95%. Estas medidas expressam os resultados de compostos fenólicos em

miligramas equivalentes de ácido gálico (GAE) por 100g de pó. Para isto utilizou-se uma

curva de calibração (Figura 6.1), apresentada no Apêndice, construída a partir de diferentes

concentrações de ácido gálico.

Os reagentes necessários foram preparados da seguinte maneira: Para o reagente

Folin-Ciocalteau mediu-se 25 mL do reagente que foi dissolvido com 25 mL de água

destilada. Foi preparado apenas o necessário para os experimentos semanais para não

ultrapassar a sua validade. O reagente foi conservado sob refrigeração e em ausência de luz. A

solução de Carbonato de sódio 5% foi preparada pesando 5g de Na2CO3 e diluído em água

destilada, completando o volume em um balão de 100 mL.

3.2.5.2 – Determinação da Atividade antioxidante (AA) pelo sequestro do radical DPPH·

O método mais utilizado para se determinou-se a atividade antioxidante é apresentado

por Brand-Williams et al. (1995) e consiste em avaliar a atividade sequestradora do radical

livre DPPH (2,2-difenil-1-picril-hidrazila) por antioxidantes. Por ação de um antioxidante

(AH) ou uma espécie de radical (R-), o DPPH é reduzido, formando o difenil-picril-hidrazina.

Isto ocasiona o desaparecimento da absorção, podendo a mesma ser monitorada pelo

decréscimo da absorbância a 515 nm. Rezende (2010) relata que o método DPPH possui

vantagens como: poder avaliar grande quantidade de amostras em um curto período de tempo;

o método é sensível e detecta pequenas concentrações do ativo contido na amostra; permite

avaliar antioxidantes lipofílicos, isto porque o solvente do processo é metanol ou etanol.

A partir dos resultados obtidos determina-se a porcentagem de atividade antioxidante

(sequestradora de radicais livres) ou a porcentagem de DPPH remanescente no meio

reacional.

A porcentagem de atividade antioxidante corresponde à quantidade de DDPH·

consumida pelo antioxidante. A quantidade de antioxidante necessária para decrescer a

concentração inicial de DPPH em 50% é denominada concentração eficiente (CE50), também

chamada de concentração inibitória (CI50). Quanto maior o consumo de DPPH por uma

amostra, menor será a sua CE50 e maior a sua atividade antioxidante (SOUSA et al., 2007).



Preparou-se uma solução metanólica de 0,004 g de DPPH em 100 mL de álcool

metílico, sendo homogeneizado e transferido para um frasco de vidro âmbar, devidamente

etiquetado.

O decaimento da absorbância das amostras (Aamostra) correlacionado ao decaimento da

absorbância do controle (Acontrole), resultando na porcentagem de sequestro de radicais livres

(%SRL), que pode ser expresso através da Equação (3.2):

% 𝑆𝑅𝐿 = 𝐴𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙𝑒 −𝐴𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎𝐴𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙𝑒

× 100 (3.2)

A curva de calibração foi estabelecida conforme o procedimento a seguir. Após

realizar a extração do corante, uma amostra de 0,3 mL era retirada e adicionada a 1,7 mL do

reagente em um frasco de eppendorf. Para o controle o procedimento foi repetido trocando o

extrato por metanol. Para o branco foram adicionados em um eppendorf 2 mL de metanol.

Aguardando-se 30 min em uma câmara escura. Foram realizadas leituras das absorbâncias em

um espectrofotômetro no comprimento de onda de 517 nm.

Uma curva de calibração (Figura 6.2), apresentada no Apêndice, foi construída a partir

de diferentes valores da concentração do extrato.

Os resultados para a atividade antioxidante foram expressos em grama de

concentração inibitória (IC50).

3.2.5.3 – Determinação de antocianinas monoméricas totais (AMT)

O método diferencial baseia-se nas mudanças de absorbância resultantes da variação

do pH das soluções e no fato das características espectrais dos produtos de degradação não

serem alteradas por mudanças no pH (MALACRIDA e MOTTA, 2006). O conteúdo de

antocianinas monoméricas e poliméricas foi determinado pelo método do pH diferencial

descrito por Giusti e Wrolstad (2001). As antocianinas, em pH baixo, encontram-se

predominantemente na forma de cátion flavílico, apresentando coloração vermelha em

solução aquosa. Em pH alto, esse cátion é convertido em outras espécies incolores.

Cada extrato foi diluído, tanto em tampão cloreto pH = 1,0 quanto em tampão acetato

pH = 4,5, de acordo com o valor do fator de diluição (FD) previamente calculado (FD = 10,

ou seja, 2 mL de amostra / 0,2 mL extrato). Sendo assim, será adicionado 1,8 mL de cada

tampão em 0,2 mL de extrato, homogeneizados em agitador e deixados a temperatura

ambiente e na ausência de luz por 30 minutos. Ao término desse período, a absorbância foi



medida no comprimento de onda do visível, em 510 nm e 700 nm de acordo com o método de

Giusti e Wrolstad (2001). O comprimento a 510 nm é a máxima absorbância para a

identificação das antocianinas e a 700 nm é usado para corrigir o espalhamento de luz

produzido por uma possível turbidez da amostra (AZEVEDO, 2010). Foi utilizado o mesmo

procedimento para o preparo do branco, sendo substituído o extrato por 0,2 mL de H2O

destilada. Todas as medidas foram realizadas em triplicatas para cada amostra.

Em seguida determinou-se a absorbância resultante (A) pela Equação (3.3), partindo-

se das leituras das soluções obtidas.

𝐴 = (𝐴510 − 𝐴700)𝑝𝐻1,0 − (𝐴510 − 𝐴700)𝑝𝐻4,5 (3.3)

O calculo da concentração das antocianinas nos extratos foi realizado de acordo com a

Equação (3.4).

𝐶 =(𝐴×𝐹𝐷×𝑀𝑀×1000)

(𝜀×𝑏) (3.4)

em que:

C é a concentração de antocianinas (mg / L);

A é a absorbância;

FD é o fator de diluição utilizado;

MM é a massa molar do padrão (g / mol);

ɛ é o coeficiente de absortividade molar do padrão (L / cm.mol);

b é o caminho óptico ( a espessura da cubeta utilizada para leitura no espectrofotômetro) (cm).

Para o procedimento foram preparados o tampão KCl (pH 1,0) pela pesagem de 1,86 g

de KCl e diluição em 980 mL de água destilada. Foi ajustado o pH desejado da solução com

HCl (37%), em seguida a solução foi transferida para um balão de 1 L que teve seu volume

completado com água destilada.

Também foi preparada a solução tampão CH3COONa (pH 4,5) pesando-se 54,43 g de

CH3COONa, e que foram diluídos em 960 mL de água destilada. Ajustado o pH desejado da

solução com HCl (37%), a solução foi transferida para um balão de 1 L e completado o seu

volume com água destilada.



3.3 – Estudo cinético do processo de extração

Para o estudo cinético foram realizados ensaios em que se acompanhou a concentração

ao longo do tempo.

Os ensaios foram realizados utilizando 8 g de pó de castanhola com 80 mL do

solvente. A proporção de água e etanol foi obtida a partir dos resultado do planejamento

realizado anteriormente para cada composto analizado. O estudo foi realizado com extrações

em batelada a cada 20 minutos, avaliando os teores dos compostos fenólicos, antocianinas e a

atividade antioxidante.

As condições de extração foram realizadas a partir das condições ótimas obtidas no

planejamento fatorial 24

dos melhores valores obtidos nas extrações de compostos fenólicos,

antocianinas e atividade antioxidante.

Os ensaios realizados foram então analisados em espectrofotômetro, seguindo as

metodologias citadas no item 3.2.5.

3.4 - Estudos da estabilidade das antocianinas nos extratos

Foram feitos estudos de estabilidade no extrato do fruto de castanhola em relação a

temperatura (25°C e 60°C), concentração do extrato (30% e 50%) e pH (3 e 6). As amostras

foram diluídas com concentrações diferentes de extrato em duas soluções tampão. Para o pH

igual a 3 foi utilizado a solução tampão de KCl e para o pH igual a 6 foi utilizado uma

solução tampão de KH2PO4.

O extrato foi obtido a partir de uma extração sólido-liquido por imersão, utilizando 30

g de pó de castanhola com 300 ml de solvente. As condições de operação (%Etanol,

temperatura, pH e tempo) foram obtidas a partir dos dados do planejamento experimental.

As concentrações de extratos foram realizadas de acordo com Chigurupati et al. (2002)

da seguinte maneira: utilizou-se um volume total de 100 mL para cada amostra. Para as

amostras com concentrações de 30% foram adicionados em dois elermeyers 30 mL de extrato

e 70 mL de cada solução tampão. Para a concentração de 50% foram adicionados 50 mL de

extrato e 50 mL da solução tampão. Para cada concentração foram alternados os tampões de

pH 3 e 6. Foram preparadas um total de 8 amostras. Metade das amostras (Figura 3.6) foram

mantidas em um shaker com velocidade de agitação de 80 rpm a 25°C em um período de 5

dias. A outra metade foi colocada em outro shaker com temperatura de 60°C com agitação de

80 rpm por 5 dias.



Figura 3. 4 – Extratos com concentrações de 50 e 30% com as soluções tampão de

KH2PO4(pH = 6) e KCl(pH = 3).

No estudo da estabilidade foram feitas análises para a queda do teor de antocianinas

monoméricas em 5 dias.

Método espectrofotométrico foi utilizado para determinar o teor de antocianinas

monoméricas.

O resultado foi expresso pela porcentagem da queda do teor de antocianinas

monoméricas totais presentes ao final do estudo.

O calculo da queda do teor de antocianinas é realizado pela equação (3.5).

%𝐶𝑓 =𝐶𝑓×100

𝐶𝑖 (3.5)

Em que:

%𝐶𝑓 - Porcentagem da concentração final de antocianinas monoméricas totais.

𝐶𝑓 - Concentração final de antocianinas monoméricas totais.

𝐶𝑖 - Concentração inicial de antocianinas monoméricas totais.

CAPÍTULO 4

RESULTADOS E DISCUSSÕES

Capítulo 4 – Resultados e discussões


4 - Resultados e discussões

No presente capítulo serão apresentados e discutidos os resultados obtidos conforme a

metodologia descrição do capítulo anterior.

4.1 – Análise granulométrica do pó da polpa de castanhola

A partir do pó adquirida foi realizada a análise granulométrica. Na Tabela 4.1 é

apresentada a massa das partículas retidas e a respectiva fração mássica (xi) do material retido

em cada peneira. Foram utilizadas 3 peneiras onde o fundo é a sobra do material que

conseguiu passar por todas as peneiras. As aberturas das peneiras são apresentadas em

milímetros e o diâmetro médio de cada partícula (di) em milímetros.

Tabela 4. 1 - Diâmetro da abertura das peneiras e o valor da fração mássica (xi) da massa

retida em cada peneira.

Diâmetro das

peneiras (mm) di (mm) xi

0,7 0,7 0,383

0,5 0,6 0,219

0,3 0,4 0,239

Fundo 0,15 0,159

O valor do diâmetro médio de Sauter foi calculado de acordo com a Equação (3.1) no

Item 3.2.2. A partir dos valores obtidos na Tabela 4.1, o diâmetro de Sauter obtido foi de

0,389 mm.



4.2 - Extração do corante e avaliação do planejamento

As extrações foram realizadas de acordo com o planejamento fatorial 24 conforme os

itens 3.2.3 e 3.2.4. Os extratos retirados do reator e filtrados eram submetidos às análises de

compostos fenólicos, antocianinas e atividade antioxidante.

Os resultados experimentais decorrentes do processo de extração do corante do fruto

de castanhola conforme o planejamento previamente mostrado na Tabela 3.1, estão

apresentados na Tabela 4.2.

O melhor resultado obtido com a amostra em base seca foi: 30307,53 mg GAE/100g

da amostra para o teor de compostos fenólicos totais (CFT) quando utilizaram-se 50°C, 30

minutos, 50% de Etanol e pH igual a 3,5. Para a para a atividade antioxidante (AA) obteve-se

0,17 de IC50 (g/mL) da amostra em 50°C, 75% de etanol, 10 minutos e pH igual a 3,5. Para a

concentração de antocianinas monoméricas totais (AMT) verificou-se 376,33 mg ci-3-gli/100

g para 50°C, 30 minutos, 75% de etanol e pH igual a 3,5. O melhor resultado para a atividade

antioxidante foi o menor valor obtido, já que este valor representa a concentração do extrato

que inibe o radical livre (DPPH).

Os resultados para CFT, AA e AMT foram bastante superiores quando comparados a

resultados obtidos por outros autores para o estudo da castanhola, como Marques et al. (2012), que

obtiveram 244,33 mg de GAE/100g de compostos fenólicos e Lima (2012) com 142,84 mg de GAE/g

no processo de extração da polpa da castanhola. Esta diferença pode ter ocorrido devido o fruto ter

sido produzido em condições climáticas, grau de maturação, condições de estocagem ou condições do

processo para a extração do corante não semelhante.



Tabela 4. 2 - Resultados da extração de atividade antioxidante, compostos fenólicos e

antocianinas da polpa do fruto de castanhola

T

(⁰C)

Etanol

%

t

(min)

pH AA

IC50(g/mL)

CFT

mg GAE/100g

AMT

mg ci-3-gli/100 g

50 75 30 7,5 1,51 2767,62 92,90146

25 75 30 7,5 1,55 3548,67 76,64788

50 50 30 7,5 1,16 6365,27 88,61542

25 50 30 7,5 1,24 3415,33 80,3773

50 75 10 7,5 1,57 5089,36 86,3332

25 75 10 7,5 1,47 13564,6 78,45693

50 50 10 7,5 1,31 2268,84 53,9374

25 50 10 7,5 1,22 5142,25 75,47896

50 75 30 3,5 0,64 26106,8 376,3929

25 75 30 3,5 1,21 20668,5 218,3101

50 50 30 3,5 0,84 30307,5 203,0584

25 50 30 3,5 1,45 14958,1 163,4264

50 75 10 3,5 0,17 23361,5 177,5648

25 75 10 3,5 1,11 18324,1 151,4032

50 50 10 3,5 1,14 23274,3 209,6267

25 50 10 3,5 0,90 20106,2 213,1891

37,5 62,5 20 5,5 1,29 14034,2 161,4226

37,5 62,5 20 5,5 1,30 17302,4 119,0074

37,5 62,5 20 5,5 1,08 14034,2 161,4226

37,5 62,5 20 5,5 1,11 18302,4 169,9077

A partir dos valores reais obtidos na extração foram calculadas as estimativas dos

efeitos, que correspondem aos parâmetros β (Tabela 4.3) dos modelos matemáticos de

regressão. A Tabela 4.3 apresenta também os parâmetros estatisticamente significantes (p ≥

0,05), sendo que os efeitos em negrito dizem respeito aos valores dos efeitos dos fatores e a

interação entre eles que apresentaram significância estatística.



Tabela 4. 3 - Valores dos efeitos para AA, CFT e AMT

Efeitos

Fator AA CFT AMT

βo 37,2907 14062,4 142,020

β1 10,9131 2763,1 12,272

β2 -0,2698 -949,1 0,296

β3 -4,3869 -732,2 47,097

β4 -21,5537 -16868,2 -156,611

β12 -6,5371 2171,8 -1,618

β13 4,7310 3119,2 45,761

β14 -11,7350 -4771,6 -47,769

β23 2,7290 1437,8 -57,489

β24 14,1859 -995,5 33,888

β34 5,5216 -2117,9 0,950

β123 7,4545 1238,7 -29,999

β124 7,2130 161,4 35,426

β134 -1,0387 116,9 4,463

β234 -0,8258 2239,0 23,027

As Equações (4.1), (4.2) e (4.3) representam os modelos obtidos no estudo dos

compostos AA, CFT e AMT respectivamente.

𝑦𝐴𝐴 = 37,29 + 10,91𝑥1 − 21,55𝑥4 − 11,73𝑥14 + 14,19𝑥24 (4.1)

𝑦𝐶𝐹𝑇 = 14062,4 − 16868,2𝑥4 − 4771,6𝑥14 (4.2)

𝑦𝐴𝑀𝑇 = 142,02 + 47,097𝑥3 − 156,61𝑥4 + 45,76𝑥13 − 47,76𝑥14 − 57,49𝑥23 (4.3)

Os valores dos coeficientes de correlação (R2) de cada modelo matemático gerado

foram 94,68%, 97,03% e 98,26% (Figuras 4.1, 4.2, 4.3) para a atividade antioxidante,

compostos fenólicos totais e antocianinas monoméricas totais, respectivamente.



Os gráficos nas Figuras 4.1, 4.2 e 4.3 apresentam os valores preditivos, que são

adquiridos a partir do modelo matemático gerado, versus os valores observados ou valores

experimentais. Os valores de R2 são adquiridos a partir destes gráficos.

Figura 4. 1 - Valores preditivos em relação aos valores observados para a atividade

antioxidante

Figura 4. 2 - Valores preditivos em relação aos valores observados para os Compostos

Fenólicos Totais



Figura 4. 3 - Valores preditivos em relação aos valores observados para as Antocianinas

Monomérica Totais

Os valores de R2 representam a quantidade de variabilidade nos dados que é explicada

pelo modelo de regressão ajustado, ou seja a média da qualidade do ajuste. Entretanto, não

demonstra a significância do modelo realizado. Para isso usa-se a análise da variância.

A partir da ANOVA podem ser obtidos os valores de Fcal e Ftab (Tabela 4.4).

Tabela 4. 4- Valores de Fcal e Ftab para AA, CFT e AMT

Fcal Ftab

AA CFT AMT AA CFT AMT

𝑴𝑸𝑹

𝑴𝑸𝒓

6,40 17,96 13,37 4,62 5,66 5,86

𝑴𝑸𝒇𝒂𝒋

𝑴𝑸𝒆𝒑

0,75 2,07 1,76 9,55 19 19

A partir da Tabela 4.4 foram obtidos os valores de Fcal/Ftab para os testes F de

significância (Tabela 4.5).



Tabela 4. 5- Valores de Fcal/Ftab para AA, CFT e AMT

Fcal/Ftab

AA CFT AMT

𝑴𝑸𝑹

𝑴𝑸𝒓 1,38 3,17 2,28

𝑴𝑸𝒇𝒂𝒋

𝑴𝑸𝒆𝒑 0,07 0,10 0,09

A partir da Tabela 4.4 pode-se observar que para todas as variáveis (AA, CFT e AMT)

o Fcal > Ftab para 𝑀𝑄𝑅 𝑀𝑄𝑟⁄ , sendo Fcal muito maior que o Ftab, levando a valores de

Fcal/Ftab (1,38, 3,17, 2,28) na Tabela 4.5, portanto o modelo é significativo. Tem-se então

evidência estatística suficiente para se acreditar na existência de uma relação linear entre as

variáveis resposta (AA, CFT e AMT) e as variáveis independentes (Temperatura, proporção

do solvente, tempo e pH).

Além do modelo ser significativo deve ser observado se o modelo também é preditivo

para a falta de ajuste. Foi observado que os valores para 𝑀𝑄𝑓.𝑎𝑗 𝑀𝑄𝑒𝑝⁄ (0,07, 0,10, 0,09)

estão abaixo de 𝑀𝑄𝑅 𝑀𝑄𝑟⁄ (1,38, 3,17, 2,28) na Tabela 4.5, então o modelo é preditivo. Isto

reforça ainda mais a significância do modelo, o que também pode ser confirmado pelos

valores de Fcal serem muito menores que Ftab na Tabela 4.4 para a falta de ajuste e o erro.

Portanto todos os modelos são significativos e preditivos para o intervalo de confiança de

95%. Nenhum dos modelos demonstraram a necessidade de modificação dos níveis dos

parâmetros de controle.

4.3 - Análise da superfície de resposta

4.3.1 - Atividade antioxidante

O Diagrama de Pareto (Figura 4.4) demostram os valores para os efeitos das variáveis

sobre a resposta para 95% de confiança, sendo o pH o fator mais significativo na extração.

Observa-se também que a interação da proporção do solvente com o pH (2by4), a interação da

temperatura com o pH (1by4) e o efeito isolado da temperatura foram também significativos.



Figura 4. 4 - Diagrama de Pareto para AA

O pH influenciou bastante o processo de extração. O valor negativo do tcalc observado

no Diagrama de Pareto demonstra que a extração alcançou valores maiores no nível inferior,

ou seja em pH igual a 3,5. Entretanto aumentando o pH, a atividade antioxidante diminuiu.

Isto se deve ao fato de que com o aumento do pH menos compostos bioativos, responsáveis

pela atividade antioxidante, são extraídos, ocasionando uma queda na extração de compostos

antioxidantes.

A temperatura também apresentou uma influência na extração, contudo a partir do

valor tcalc observado na Figura 4.4, demonstra que em temperaturas mais altas, na faixa de

25°C a 50°C, pode ser extraído mais composto antioxidante.

A interação da porcentagem de etanol com o pH (Figura 4.5) também influenciou na

extração, sendo que quando esses dois fatores interagiram ocasionou numa melhor extração,

ou seja, contribuiu favoravelmente para a extração dos compostos antioxidantes, usando-se

quantidades maiores de etanol e em baixo pH na faixa de 3,5 a 7,5. Constata-se que em boa

parte da faixa da porcentagem do etanol, de 75% até 66% de etanol, e pH entre 3 e 4, o

rendimento foi favorável para a extração.



Figura 4. 5 - Curvas de nível para a interação da porcentagem do etanol com o pH (2by4) para

a extração da atividade antioxidante

No presente estudo o efeito isolado da porcentagem de etanol utilizada no solvente não

foi significativo, entretanto observou-se que, tanto na interação de proporção do solvente com

o pH como no ponto de melhor rendimento da extração, obteve um melhor resultado quando

se utilizaram quantidades maiores de etanol. Sun et al. (2007) afirmaram em seus estudos,

envolvendo cinco solventes (água, metanol, etanol, éter dietílico e acetona) na extração da

atividade antioxidante utilizando cascos Avellana gevuina, que os extratos de etanol e de

metanol apresentaram um maior teor de atividade antioxidante, enquanto a extração apenas

com água resultou em um menor teor de atividade antioxidante, determinada pelo método de

DPPH. Segundo Azevedo (2010), em um estudo com o jambo, a temperatura e a proporção de

solventes foram bastante significativas na extração da atividade antioxidante, sendo observado

um melhor desempenho em toda a faixa de temperatura para maiores quantidades de etanol.

Num estudo com brócolis e aspargos Sun et al. (2007) observaram que os extratos de metanol

e acetona obtinham uma atividade antioxidante mais elevada do que os extratos de água,

concluindo que os flavonoides são mais solúveis em metanol e acetona do que em água.

Assim, concluíram que a utilização de água apenas, não é favorável à extração dos

antioxidantes de espargos ou brócolis.

A Figura 4.6 apresenta as curvas de níveis da interação da temperatura com o pH. Esta

interação gerou em um baixo rendimento para a extração. Apenas uma pequena faixa de pH

entre 3 e 4 com temperaturas mais altas, na faixa de 45°C a 50°C, apresentaram um bom

rendimento na extração.



Segundo Sartori (2013), as condições de pH igual a 4, temperatura de 70°C e 40% de

etanol foi a combinação entre os parâmetros que melhor possibilitou a extração de substâncias

com propriedade antioxidante, quando utilizou-se a cana-de-açúcar como matéria-prima.

Figura 4. 6 - Curvas de nível para a interação da temperatura com o pH (1by4) para a extração

da atividade antioxidante

Oliveira et al. (2009) afirmaram que a obtenção de antioxidantes é influenciada pelo

substrato utilizado no ensaio, pelo solvente e pela técnica de extração empregada, bem como

o tempo e temperatura.

4.3.2 Compostos Fenólicos Totais

Na análise do diagrama de Pareto (Figura 4.7), para a extração de compostos fenólicos

totais, observou-se que o pH foi bastante significativo e também a interação da Temperatura e

pH (1by4), sendo esta bem menos significativa.

De acordo com a Figura 4.7 o valor de tcalc negativo para o pH indica que o nível

inferior referente ao pH favoreceu a extração, ou seja, quanto menor o valor do pH no

solvente maior será a extração de compostos fenólicos. Assim, para a remoção desses

compostos, uma solução mais ácida seria mais favorável, já que de acordo com a literatura os

compostos fenólicos são extraídos de forma mais eficiente em pH ácido. Lopes et al. (2007)b

afirma que a utilização de solvenes ácidos facilitam a extração de compostos fenólicos. É

comum a utilização de solventes acidificados, pois auxiliam na penetração do solvente nos

materiais orgânicos, além de aumentar a estabilidade dos extratos e assim favorecem a

extração (FAVARO, 2008).



Na interação da temperatura com o pH pode-se observar que a junção desses dois

fatores na extração não favoreceu a extração, em que uma análise da curva de nível (Figura

4.8) permite avaliar o resultado sobre esta interação.

Figura 4. 7- Diagrama de Pareto para os compostos fenólicos

Na Figura 4.8 é apresentada a curva de nível da interação entre a temperatura e o pH

(1by4). Constatou-se que as condições ótimas para determinação dos compostos fenólicos

totais estão com valores de temperatura maiores e um menor pH. Souza et al. (2013) em um

estudo com extratos vegetais concluíram que todos os extratos etanólicos acidificados

extraídos em alta temperatura apresentaram elevados teores de compostos fenólicos e

concluiram que o aumento da temperatura promoveria um aumento da reatividade do etanol,

facilitando o processo extrativo das fibras vegetais.



Figura 4. 8 - Curvas de nível para a interação da temperatura (ºC) com o pH(1by4) para a

extração de compostos fenólicos

Os efeitos isolados da porcentagem de etanol, temperatura (ºC) e o tempo (min) não

influenciaram na extração. Entretanto, a maior concentração dos compostos fenólicos foi

obtida com 75 % de etanol, tempo de 30 min e a uma temperatura de 50°C, ou seja, uma

maior proporção de etanol, maior temperatura e maior tempo apresentaram um melhor

rendimento para a extração dos compostos fenólicos. Segundo Sartore et al. (2013), no

processo de extração, o tipo de solvente, a temperatura e pH afetam a quantidade de

compostos fenólicos extraída, mas não foram encontrados na literatura estudos que

relacionam os três parâmetros citados. Haida et al. (2011) afirmaram em um estudo com

folhas de goiaba vermelha, goiaba branca e arruda, que na extração com solvente etanólicos e

aquosos houve extração de compostos fenólicos nas duas variedades de goiaba. Azevedo

(2010) também analisou que as condições ótimas de extração para a determinação de

compostos fenólicos do extrato de jambo estão na faixa de temperatura entre 50ºC a 60ºC com

intervalos de tempo de 25 a 30 min.

Os compostos fenólicos são os maiores responsáveis pela atividade antioxidante em

frutos (HEIM et al., 2002). Segundo Kuskoski et al. (2006), a média dos valores de atividade

antioxidante se correlaciona de forma positiva com a média dos valores de polifenóis e

antocianinas. Os autores observaram uma resposta tanto entre o conteúdo total de polifenóis e

a atividade antioxidante de 15 frutos e que isso indicaria que os compostos fenólicos são

contribuintes na atividade antioxidante dos frutos analisados.

Thoo et al. (2010) relataram que, embora a extração dos compostos fenólicos fosse

melhorada utilizando um solvente composto por 100% de etanol no processo, esta condição



não contribuiu para elevar a quantidade da atividade antioxidante. Já Chirinos et al. (2007)

inferiram que tal fato devido ao processo utilizar 100% de etanol, o que pode incapacitar a

extração dos compostos fenólicos, por estes serem mais solúveis em água.

Estudos anteriores mostraram que um sistema de solvente binário foi superior a um

sistema de apenas um componente (água ou etanol puros) para a extração de compostos

fenólicos no que diz respeito à sua polaridade relativa (Thoo et al., 2010).

Thoo et al. (2010) afirmaram que em relação ao princípio do equilíbrio, a temperatura

elevada poderia aumentar a taxa de extração e, portanto, reduzir o tempo de extração para

alcançar a máxima recuperação de polifenóis. Entretanto, elevar a temperatura pode não ser

adequado para a extração de todos os tipos de compostos fenólicos. O aumento da

temperatura no presente estudo foi significativo para a faixa de temperatura estudada (25°C a

50°C), o que não garante que em outras faixas de temperatura os resultados se manteriam

significativos.

4.3.3 Antocianinas monoméricas totais

A Figura 4.9 mostra o Diagrama de Pareto relativo ao estudo das AMT, sendo o pH o

fator mais significativo para a extração seguido pela interação da proporção do solvente com

o tempo (2by3), pela a interação da temperatura com o pH e a interação da temperatura com o

tempo.

Figura 4. 9 - Diagrama de Pareto para as antocianinas



O fator isolado pH (Figura 4.9) foi o mais significativo em relação aos outros. Isto

pode ser afirmado observando o valor de tcalc negativo, que indica que o rendimento da

extração aumenta em valores de pH baixos no processo, tal como ocorreu na extração dos

compostos fenólicos. Portanto, em pH mais baixo é possível extrair um teor maior de

antocianinas. Xavier (2004), em um estudo com repolho roxo, concluiu que quanto menor o

pH maior a quantidade de antocianinas extraídas e que a melhor condição de operação seria

com um pH de 3,5. Favaro (2008) afirma que soluções muito ácidas na presença de agentes

oxidantes favorecem a hidrólise ácida das antocianinas podendo afetar a estabilidade dos

extratos e que soluções muito alcalinas levam à formação irreversível da cis-chalcona

ionizada (solução amarelada). Segundo Kato et al. (2012), o fator determinante na extração de

antocianinas de uvas do tipo Vitis vinífera L. foi a condição do pH, em que quanto mais baixo

o pH, maior foi a concentração destes pigmentos.

De acordo com a Figura 4.19, o segundo fator isolado significativo no processo foi o

tempo. O tempo influenciou de forma positiva na extração, concluindo que quanto maior o

tempo de extração, melhor será o rendimento do teor de antocianinas. No presente estudo o

teor de antocianinas apresentou melhor rendimento em um tempo de 30 minutos de extração.

Ainda na Figura 4.9 observa-se que as interações da porcentagem de etanol com o

tempo (2by3) e a interação da temperatura com o pH (1by4) também foram significativas na

extração.

Pelas curvas de níveis (Figuras 4.10, 4.11 e 4.12) pode-se avaliar melhor as interações

da temperatura com a porcentagem de etanol utilizada

Figura 4. 10 - Curvas de nível para a interação da porcentagem do etanol com o tempo (2by3)

para a extração de antocianinas



Na interação da porcentagem de etanol com o tempo (2by3) apresentado na Figura

4.10 pode-se observar que a interação entre eles ocasionou um bom rendimento para a

extração de antocianinas, em que o valor de tcalc é positivo. As antocianinas tiveram um

melhor rendimento em um tempo maior com maiores quantidades de etanol. Também se

observa que o rendimento foi maior na faixa de 28 a 32 minutos de extração e 66% a 76 % de

etanol. Entretanto Thoo et al. (2010) não obtiveram bons resultados na extração de

antocianinas com altas concentrações de etanol (80%). Os autores também constataram um

menor rendimento de extração das antocianinas para concentrações de etanol abaixo de 40%.

Na interação da temperatura com o tempo (1by3) (Figura 4.11), há um melhor

rendimento na extração de antocianinas quando se empregam temperaturas e tempos de

extração maiores. Os melhores rendimentos na extração de antocianinas foram observados

com valores de temperatura na faixa de 42ºC a 52ºC com o tempo na faixa de 28 a 32 minutos

de extração.

Figura 4. 11 - Curvas de nível para a interação da temperatura com o tempo (1by3) para a

extração de antocianinas

A interação da temperatura com o pH (1by4) (Figura 4.12) proporcionou um bom

rendimento na extração de antocianinas. Observou-se que em temperaturas maiores e pH

baixo ocorre um melhor rendimento na extração numa faixa de temperatura de 32ºC a 52 ºC e

pH entre 3 e 4.



Figura 4. 12 - Curvas de nível para a interação da temperatura com o pH (1by4) para a

extração de antocianinas

Apesar do efeito isolado temperatura não ter sido significativo no sistema de extração

estudado, Sartore et al. (2013) afirmam, em seus estudos sobre extração de compostos

fenólicos, que os teores de flavonóides totais foram maiores para temperaturas inferiores a

30°C. Contudo os autores afirmam que o aumento da temperatura promoveria um aumento da

reatividade do etanol, o que facilitaria o processo de extração das fibras vegetais. Contudo no

presente trabalho a extração de antocianinas foi mais alta em uma temperatura de 50ºC.

4.4 – Correlação na extração entre os compostos fenólicos, antocianinas e a

atividade antioxidante

No presente trabalho foram analisadas correlações entre os compostos fenólicos,

antocianinas e a atividade antioxidante a partir dos dados experimentais adquiridos no

planejamento fatorial 24 avaliando a relação existente entre eles. Os valores e gráficos das

correlações foram obtidos a partir do software Statistica 7.0.

A intensidade da correlação pode ser descrita por Dancey e Reidy (2005), onde

apontam uma classificação sendo: r = 0,10 até 0,30 (fraco); r = 0,40 até 0,6 (moderado); r =

0,70 até 1 (forte).

Na (Figura 4.13) é apresentado a correlação dos compostos fenólicos com o teor de

antocianinas com um valor de r igual a 0,79. Conclui-se que na extração de antocianinas e

compostos fenólicos possui uma forte correlação entre eles. Esta forte correlação também foi



observada por Azevedo (2010) em um estudo com o jambo, em que constatou um valor de r

igual a 0,97 para a correlação de compostos fenólicos e antocianinas extraídas.

Figura 4. 13 - Correlação entre a extração dos compostos fenólicos com antocianinas com r =

0,79

Na correlação entre os compostos fenólicos e a atividade antioxidante (Figura 4.14) a

correlação demonstrou ser moderada apresentando um valor de r igual a 0,69. Azevedo (2010)

também observou uma correlação na extração de compostos fenólicos com a atividade

antioxidante, no estudo com o jambo, apresentando uma correlação forte com de r igual a

0,83. Já Dos Santos et al. (2008) em um estudo com polpas de açaí, constatou uma correlação

moderada para o compostos fenólico e a atividade antioxidante com valor de r igual a 0,59.

Figura 4. 14 - Correlação entre a extração dos compostos fenólicos com a atividade

antioxidante com r = 0,69



A correlação da extração de antocianinas com a atividade antioxidante (Figura 4.15)

também mostrou ser uma correlação moderada apresentando um valor de r igual a 0,64.

Segundo Azevedo (2010), a correlação de antocianinas com a atividade antioxidante, em um

estudo com o jambo, demostrou ter um valor de r igual a 0,72, sendo esta uma forte

correlação. Dos Santos et al. (2008) também observaram uma forte correlação entre as

antocianinas com a atividade antioxidante apresentando um valor de r igual a 0,72.

Figura 4. 15 - Correlação entre a extração das antocianinas com a atividade antioxidante com

r = 0,64

Este estudo demonstrou que todos o compostos estudados apresentaram correlação

positiva. Onde a maior correlação observada foi da extração dos compostos fenólicos com o

teor de antocianinas monoméricas. Na correlação dos compostos fenólicos com a atividade

antioxidante e o teor de antocianinas com a atividade antioxidante foi observado uma

correlação moderada. Na extração outros compostos de natureza antioxidante são extraídos,

portanto os compostos fenólicos e antocianinas não são os únicos responsáveis pela atividade

antioxidante no extrato.

4.5 - Estudo Cinético do processo de extração

Neste capítulo serão apresentados os estudos referentes à cinética, demonstrando o

comportamento ao longo de tempo dos compostos fenólicos, antocianinas e atividade

antioxidante.



4.5.1 - Análise do comportamento cinético

O estudo das condições de operação (temperatura, pH, proporção dos solventes) para a

extração de antocianinas, compostos fenólicos totais e a atividade antioxidante, permitiu fixar

as condições ótimas de extração.

Assim, para o estudo cinético foram realizadas extrações nas condições ótimas pré-

estabelecidas para compostos fenólicos, antocianinas e atividade antioxidante apresentadas no

Item 4.2.

A partir dos dados da Tabela 4.6 foram construídas as curvas para compostos fenólicos

totais (CFT) e para antocianinas monoméricas totais (AMT) e atividade antioxidante (AA),

representadas nas Figuras 4.16, 4.17 e 4.18 respectivamente. Tal como o estudo de

Sant’Anna, Marczak, Tessaro, (2011), verifica-se um aumento gradativo na concentração do

componente, com o tempo, com exceção da AA.

Tabela 4. 6- Concentrações de CFT, AMT e AA com o tempo de extração

Tempo (min) CFT (mg GAE/100g) AMT (ci-3-gli/100g) AA (%SRL)

10 23274,35 209,63 52,71

30 30307,53 203,06 62,72

50 16674,92 260,82 75,14

70 16674,92 179,57 79,19

90 20665,95 189,25 23,93

110 18988,81 229,78 30,51

130 20805,94 312,94 25,91

Na curva cinética para a extração dos compostos fenólicos (Figura 4.16) houve um

aumento atingindo 30307,53 mg de GAE/100g de pó. Depois de 30 min o teor de compostos

fenólicos sofreu uma queda apresentando um valor de 16674,92 mg de GAE/100g de pó. Isto

deve-se ao fato que os compostos atingiram o máximo extração e a degradação térmica teve

início após os 30 minutos de extração. Segundo Thoo et al. (2010), em um estudo da extração

de compostos bioativos com o tempo, o excesso de tempo de extração, de fato, reduziu a

produção de compostos fenólicos, concluindo que o tempo de extração (20-120 min) não teve

efeito significativo na extração dos compostos fenólicos. Guedes (2013) afirma que extrações

com um longo tempo provavelmente causa a degradação dos compostos fenólicos. Luz e

oxigênio são os dois fatores mais importantes que facilitam as reações de degradação.



A partir dos 50 minutos de extração de compostos fenólicos (Figura 4.16), a curva

começa a se tornar estável apresentando o começo da estabilidade. Amendola, De Faveri,

Spigno, (2010) em um estudo com uvas, observaram o começo da estabilidade a partir dos

120 minutos de extração a 60ºC utilizando um solvente com 60% de etanol e 40% de água.

Sant’Anna et al. (2011) em um estudo com bagaços de uvas, também analisaram a cinética de

extração dos compostos fenólico, concluindo que o teor de compostos fenólicos na extração a

60ºC foi maior que a 50ºC, atingindo uma concentração estável em 30 e 45 minutos

respectivamente utilizando um solvente com 50% de metanol.

Figura 4. 16 - Concentração dos compostos fenólicos em função do tempo nas condições de

50°C, 50% de etanol e pH igual a 3,5.

Na curva cinética para antocianinas, Figura 4.17, a concentração de AMT aumenta de

forma gradativa ao longo do processo. A degradação que pode ser observada a partir de 50

minutos de extração, em que o teor de antocianinas cai de 260,08 ci-3-gli/100g em 50 minutos

para 179,57 ci-3-gli/100g em 70 minutos, ocorrendo provavelmente devido ao início do

processo de degradação térmica do composto no extrato (REYES e CISNEROS-ZEVALLOS,

2007). No estudo com bagaços de uvas Sant’Anna et al. (2011) observaram que a estabilidade

na extração começou em 40 minutos de extração. Contudo a partir de 90 minutos a curva

tende a crescer novamente, provavelmente compostos de antocianinas remanescentes no

material.

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

45000

50000

0 20 40 60 80 100 120 140

mg

de

GA

E/1

00

g

Tempo (min)



Figura 4.17- Concentração de antocianinas em função do tempo nas condições de 50°C, 75%

de etanol e pH igual a 3,5.

Na curva cinética da atividade antioxidante (Figura 4.18) observa-se um aumento

gradativo até os 70 minutos de extração, segundo Wang et al. (2007) condições de operação

favoráveis fazem com que os compostos tenham uma maior estabilidade, não havendo tempo

suficiente para que ocorresse a degradação dos compostos antioxidantes. Vieira et al. (2011)

em um estudos com várias frutas regionais (acerola, bacuri, cajá, caju, goiaba e tamarino)

avaliando a atividade antioxidante com o tempo de extração, concluiram que para todas as

frutas em estudo, a curva cinética começou a estabilidade a partir de 10 minutos de extração

utilizando um solvente com 20% de etanol e 80% de água. Segundo Marques et al. (2012) o

equilíbrio da curva cinética para a atividade antioxidante começou em 10 minutos utilizando

um solvente etanoico, já na extração com solvente aquoso a curva cinética não atingiu o

equilíbrio em um tempo total de 20 minutos.

Após os 70 minutos de extração (Figura 4.18) a curva sofre uma queda no valor da

%SRL de 79,19% em 50 minutos para 23,93% em 90 minutos. Isto provavelmente por causa

da degradação térmica dos compostos antioxidantes. Entretanto a partir de 90 minutos de

extração a curva tende a se tornar estável, provavelmente atingindo o equilíbrio.

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

0 20 40 60 80 100 120 140

C (

mg

ci-3

-gli/

L)

Tempo



Figura 4.18- Concentração de atividade antioxidante em função do tempo nas condições de

50°C, 75% de etanol e pH igual a 3,5.

Todas as curvas cinéticas demostraram que após 90 minutos os compostos tendem a

chegar a estabilidade. Contudo para a curva cinética das antocianinas o tempo necessário para

se chegar a estabilidade se mostrou ser maior em relação aos compostos fenólicos e a

atividade antioxidante.

4.6 – Estudos da estabilidade de antocianinas presentes no extrato

As tabelas 4.7 e 4.8 mostram os teores das antocianinas no primeiro dia e no quinto dia

para as temperatura de 25ºC e 60ºC respectivamente. Observou-se que para a temperatura de

60ºC as antocianinas tiveram uma degradação bastante acentuada.

Tabela 4. 7 - Porcentagem de degradação de antocianinas em 5 dias a 25°C

Concentração de AMT

(mg ci-3-gli/L)

concentração de extrato % pH 1º dia 5º dia Degradação %

30 3 37,46 26,66 28,83

50 3 54,44 41,80 23,21

30 6 33,62 6,04 82,04

50 6 53,21 12,47 76,57

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 20 40 60 80 100 120 140

%SR

L

Tempo (min)



Tabela 4. 8 - Porcentagem de degradação de antocianinas em 5 dias a 60°C

Concentração de AMT

(mg ci-3-gli/L)

concentração do extrato % pH 1º dia 5º dia Degradação %

30 3 49,98 26,22 47,55

50 3 54,10 41,91 22,53

30 6 33,01 0,95 97,13

50 6 50,99 4,73 90,72

A concentração de antocianinas afeta na manutenção da cor (LOPES et al., 2007). A

estabilidade da cor é dependente da temperatura, do pH, bem como da concentração

(CHIGURUPATI et al., 2002).

Nas Tabelas 4.7 e 4.8 observou-se que o pH teve bastante influencia na degradação

das antocianinas. As antocianinas em pH igual a 3 obteve maior estabilidade, ou seja, houve

pouca degradação ao longo de 5 dias em relação as antocianinas nos extratos com pH igual a

6.

Na Tabela 4.8 observou-se que as antocianinas em pH igual a 3 em concentração

menor (30%) em temperatura de 60°C, houve uma maior degradação que o extrato com

concentração de 50% em pH igual a 3.

Comparando os valores da Tabela 4.7 e 4.8 do extrato com concentração de 30% e pH

igual a 3 observou-se que o extrato em concentrações baixas pode aumentar a degradação das

antocianinas estando a temperatura 60°C.

De acordo com a Figura 4.19 pode-se perceber que não só o pH e temperatura

influenciaram na degradação. As concentrações dos extratos tiveram influência, sendo que em

concentrações de 30% de extrato, as antocianinas tiveram uma maior degradação em relação

aos ensaios com extratos cujas concentrações foram de 50% para os pH 3 e 6 como também

para as temperaturas de 25°C e 60°C. Também observou-se que a maior degradação das

antocianinas ocorreu em concentrações baixas e pH alto. Em geral, a estabilidade dos extratos

é afetada também pela temperatura.

Malacrida e Motta (2006), afirmam que antocianinas, em pH baixo, permanecem na

forma de cátion flavílio, o qual apresenta coloração vermelha em solução aquosa. Leidens

(2011) afirma que as antocianinas são mais estáveis em soluções ácidas (pH inferior a 3), na



cor laranja ou vermelha, mas quando se aumenta o pH, ocorre a perda do próton para produzir

as formas quinoidais, azuis ou violetas.

Lima (2012) observou que os extratos de compostos bioativos do fruto de castanhola

possuíam um comportamento diferenciado de acordo com a concentração utilizada do extrato

e que a degradação ocorria logo nos primeiros 5 minutos.

Wang et al. (2007) em um estudo da estabilidade com a temperatura e estocagem com

a amora-preta constataram que a degradação foi mais acentuada com o aumento da

temperatura. Assim, uma maior estabilidade de antocianinas foi conseguida utilizando uma

temperatura mais baixa. Schmitz (2014) afirma que estudos têm demonstrado que a

degradação de antocianinas não é só função da temperatura de processamento e sim de

propriedades intrínsecas do produto e de características do processo realizado.

Figura 4. 19 - Gráfico da porcentagem de degradação em função das temperaturas a, pH e a

porcentagem da concentração em cada um dos ensaios.

Os extratos da polpa da castanhola possuem compostos antioxidantes de ação rápida,

tendo em vista de que os radicais livres fisiológicos são altamente instáveis e com meia vida

muito curta (LIMA, 2012).

A temperatura foi o fator que mais influenciou na estabilidade. A temperatura tem

grande influência na degradação das antocianinas. Albarice e Pessoa, (2012) relata que em

seus estudos com a estabilidade de antocianinas em polpa de açaí, em temperaturas entre

10°C e 40°C não afetaram na degradação das antocianinas. Constatou-se, no estudo da

estabilidade, que a temperatura utilizada na obtenção das propriedades avaliadas poderia estar

0

20

40

60

80

100

120

pH=3 30% pH=3 50% pH=6 30% pH=6 50%

De

grad

ação

T=25ºC

T=60ºC



muito alta, sendo então, esta, responsável pela degradação excessiva das antocianinas nos

ensaios avaliados no presente estudo. Wang e Xu (2007) observaram que as antocianinas

extraídas de amoras, a temperatura de 60ºC, não apresentaram degradação com 60 min nesta

temperatura, ultrapassando um tempo de 150 min para se atingir uma degradação de

aproximadamente 10%. Segundo Falcão (2006), em um estudo da estabilidade das

antocianinas de uvas Merlot (Vitis vinefera L.), o aumento da temperatura resultou em um

aumento da degradação das antocianinas.

CAPÍTULO 5

CONCLUSÃO

Capítulo 5 - Conclusão


5 - Conclusão

Os resultados obtidos sob as condições de extração analisadas no presente trabalho

levaram às conclusões que se seguem.

O pH foi o fator que mostrou mais influência na extração de cada um dos compostos

estudados (CFT, AMT e AA). As condições ótimas de extração para CFT são: temperatura de

50oC, 30 minutos, 50% de etanol e pH igual a 3,5; para AMT a temperatura de 50

oC, 30

minutos, 75% de etanol e pH igual a 3,5; para AA as condições ótimas são com temperatura

de 50oC, 10 minutos, 75% de etanol e pH igual a 3,5.

Através do planejamento fatorial 24

foi possível obter os modelos apresentando os

principais fatores que afetaram a extração. Para todos os compostos, o pH foi o que mais

influenciou no processo de extração. Apesar de a temperatura não ter apresentado

significância estatística, como um fator isolado, para os compostos na análise do

planejamento, esta apresentou bastante influência nos rendimento de todos os compostos

estudados.

O presente estudo demonstrou que todos os compostos estudados apresentaram

correlação positiva. Onde a maior correlação observada foi da extração dos compostos

fenólicos com o teor de antocianinas monoméricas com r igual a 0,79. Na correlação dos

compostos fenólicos com a atividade antioxidante e o teor de antocianinas com a atividade

antioxidante foi observado uma correlação moderada apresentando valores de r iguais a 0,69 e

0,64 respectivamente. A correlação moderada dos compostos fenólicos e antocianinas com a

atividade antioxidante pode-se constatar que na extração outros compostos de natureza

antioxidante são extraídos, portanto os compostos fenólicos e antocianinas não são os únicos

responsáveis pela atividade antioxidante no extrato.

Todas as curvas cinéticas apresentam uma queda a partir dos 50 minutos e após 90

minutos os compostos tendem a chegar a estabilidade para os compostos fenólicos e a

atividade antioxidante. Contudo para as antocianinas, a curva cinética demostrou que é

necessário um tempo maior para se chegar a estabilidade.

Na avaliação da estabilidade, todos os fatores (temperatura, pH e concentração) foram

influentes na degradação das antocianinas, sendo aquela temperatura foi a que mais

influenciou na degradação.

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XAVIER, M. F. Estudo da extração de antocianinas em colunas recheadas. 2004. 135f.

Dissertação (Mestrado) – Programa de Pós Graduação em Engenharia Química. Universidade

Federal de Santa Catarina. Florianópolis. 2004

Apêndice I. Curvas de Calibração


Apêndice I. Curvas de calibração

Figura 6. 1 - Curva de calibração para CFT

Figura 6. 2 - Curva de calibração de AA

y = 0,0099x - 0,0888 R² = 0,9912

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

0 20 40 60 80 100 120

Ab

sorb

ânci

a

mg GAE/100g

y = -1,7184x + 98,302 R² = 0,991

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 10 20 30 40 50

%SR

L

Concentração de DPPH (µg/mL)

extração do corante do fruto de castanhola …...catalogação da publicação na fonte. ufrn / ct...

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