I

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

FACULDADE DE ENGENHARIA QUMICA

REA DE CONCENTRAO

Sistemas de Processos Qumicos e Informtica

Anlise de Viabilidade Econmica de um Processo de Extrao e Purificao da

Bromelina do Abacaxi

Autor Ana Claudia Wabiszczewicz Cesar Orientador Prof. Dr. Elias Basile Tambourgi

Tese de Doutorado apresentada Faculdade de Engenharia Qumica como parte dos requisitos exigidos para a obteno do ttulo de Doutor em Engenharia Qumica.

Campinas - So Paulo Dezembro - 2005

IV

Aos meus pais Ary Cesar e Janina Wabiszczewicz Cesar(in memoriam)

V

Agradecimentos

Deus, por ter me dado oportunidade de merecer este caminho.

Ao Prof. Dr. Elias Basile Tambourgi pela orientao, confiana e amizade.

Aos Prof.s Dr.s Jabra Haber, Jlio Csar Dutra e Luiz Carlos Bertevello,

pelo apoio e pelas valiosssimas contribuies.

Aos professores da UNINOVE pelo apoio, colaborao e discusso dos

resultados.

Ao amigo mdico, Odair Manzini Jr., por demonstrar, sua maneira, a

importncia da minha determinao para concluso deste trabalho.

Ao prezado amigo MsC.Paulo Eduardo Orlandi Mattos da Universidade

Federal de So Paulo, UNIFESP, por partilhar a paixo e o conhecimento pelos

bioprodutos.

minha famlia, pelo amor, pacincia e compreenso nas minhas

ausncias.

Aos meus fiis companheiros Fbio De Chiara e Giovanni Cesar De

Chiara, sem os quais, no teria motivos para seguir nesta jornada.

VI

NOTAO E NOMENCLATURA

A Atividade Enzimtica (U) Ae Atividade Especfica (U/mg) Aefundo Atividade especfica da Fase Inferior Aetopo Atividade Especfica da Fase Superior ABIFARMA Associao Brasileira da Indstrias Farmacuticas BSA Albumina Bovina ( Bovine Serum Albumin) Cf Concentrao da Fase Inferior Ct Concentrao da Fase Superior CT Custo Total Da daltons g/g Grama/grama IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatstica K Coeficiente de Partio Kbioesp Fator de Afinidade Bioespecfica KDa Kilo Dalton Kconf Fator de Conformao Keletro Fator eletroqumico Khfob Fator de afinidade hidrofbica Ktam Fator Tamanho M Molaridade ou Molar MPEG Massa Molecular do PEG P Protena Total (mg/L) PEG Polietileno Glicol pI Ponto Isoeltrico Ptopo Concentrao de Proteinas na Fase Superior (mg/L) Pfundo Concentrao de Proteinas na Fase Inferior (mg/L) p/p Peso/peso PV Preo de Venda R Retorno sobre o Investimento s Desvio padro SBA Sistemas Bifsicos Aquosos sefeitpo Desvio Padro dos Efeitos TCA cido Tricloroactico v/v Volume/volume Xm Mdia dos resultados Obtidos xi Grandeza Medida

VII

LISTA DE FIGURAS Figura 1: Exemplo de um Diagrama de Fases. 32 Figura 2: Ciclo de vida de um produto 41 Figura 3: Preparo da amostra 59 Figura 4: Descrio dos testes de liquefao da gelatina . 60 Figura 5: Resultados dos volumes de perfurao da gelatina. 61 Figura 6: Curva de solubilidade em etanol da bromelina e das protenas presentes no abacaxi

63

Figura 7 : Esquema da micro-coluna de campnulas pulsantes. 64 Figura 8: Variao do preo de venda em relao margem de lucro. 78 Figura 9: Evoluo do preo de vendas em funo da margem de lucro 81 Figura 10: Prazo de retorno sobre investimento (payback) em funo as margem de lucro

82

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Dados da concentrao das amostras de polpa do fruto, casca e talo do abacaxi.

07

Tabela 2: Dados de protena total, atividade e acares redutores. 07 Tabela 3 - Produo de Frutas, Brasil 1994/1995 e 2004/2005 (1000 toneladas) 07 Tabela 4: Produo Mundial de abacaxi em 2005. 08 Tabela 5: Vantagens e desvantagens da liderana tecnolgica 44 Tabela 6: Exemplo de aplicao de um modelo de pontuao para avaliao de projetos.

56

Tabela 7: Resultados do volume de perfurao (VP) 61 Tabela 8 Variveis estudadas na operao da Micro-coluna 67 Tabela 9 - Descrio dos nveis e efeitos. 69 Tabela 10 - Efeitos calculados para porcentagem de recuperao de protena total 69 Tabela 11 - Porcentagem de recuperao de protena total 70 Tabela 12 - Clculo dos efeitos para recuperao da protena total 70 Tabela 13 - Porcentagem de recuperao de atividade enzimtica 71 Tabela 14 - Clculo dos efeitos para recuperao de atividade enzimtica 72 Tabela 15 : Descrio dos valores de investimento em equipamentos para extrao 75 Tabela 16: Custos de matria -prima para produo de 8 kg de precipitado. 76 Tabela 17: Descrio de despesas e tributos 77 Tabela 18 : Variao do Preo de venda em Funo da Margem de Lucro 77 Tabela 19: Quantidade de precipitado necessria para o retorno sobre o investimento em funo da margem de lucro

78

Tabela 20: Custos de equipamentos para extrao em contnuo. 79 Tabela 21: Custos com matria -prima para extrao em contnuo 79 Tabela 22: Custos com matria- prima para purificao na obteno de 1 grama 80 Tabela 23: Evoluo de preo de venda do extrato purificado em funo da margem de contribuio.

80

Tabela 24: Quantidade em gramas de extrato purificado a ser vendida em funo da margem de lucro para retorno sobre investimento

81

SUMRIO

Lista de Tabelas e Figuras VII 1. INTRODUO 01 2. FUNDAMENTAO 03 2.1. Protenas 03 2.1.1. Bromelina 03 2.1.2. Enzimas 05 2.1.3. Desnaturao 06 2.1.4. Protena Total, Atividade e Acares Redutores 06 2.2. Abacaxi 07 2.2.1. Fruticultura Brasileira 07 2.2.2. Cultivo e Colheita 08 2.2.3. Caracterizao da Fruta 10 2.2.4. Composio Qumica 11 2.2.5. Processamento da Fruta 11 2.2.6. Produtos e Subprodutos do Processamento. 12 2.3. Consumo de Bromelina. 15 2.4. Separao e Purificao de Protenas 17 2.4.1. Precipitao por Etanol 18 2.4.2 Extrao Lquido-Lquido 20 2.4.2.1. Sistemas de Duas Fases Aquosas 20 2.4.2.2. Tipos de Sistemas de Duas Fases Aquosas 23 2.4.2.3. Sistema PEG/Sal 24 2.4.2.4. Polietileno Glicol 25 2.4.2.5. Recuperao de Sais e Polmeros 26 2.4.3. Teoria de Formao das Fases 27 2.4.3.1. Tempo de Separao das Fases 29 2.4.3.2. Fatores que Influenciam no Sistema de Fases 30 2.4.3. 3. Diagrama de Fases 31 2.4.4. Fundamentos da Partio das Protenas 33 2.4.4.1. Coeficiente de Partio 34 2.4.4.2. Influncia do Peso Molecular do Polmero e da Protena no Coeficiente de Partio

34

2.4.4. 3. Influncia do pH do Sistema no Coeficiente de Partio 35 2.4.4.4 Influncia das Interaes entre a Protena e o Sistema de Fases no Coeficiente de Partio

36

2.4.4.5. Influncia da Concentrao dos Componentes do Sistema no Coeficiente de Partio

36

2.4.4.6. Influncia da Concentrao de Protenas no Coeficiente de Partio 37 2.4.4. 7.Modelagem Matemtica do Coeficiente de Partio 37 2.5. Planejamento Fatorial 38 3. INOVAO TECNOLGICA 39 3.1. Tecnologia e Inovao 39 3.2. Desenvolvimento de Produtos 40 3.3. Liderana Tecnolgica 42 3.4. A Adoo de uma Nova Tecnologia 45

4. CUSTOS 48 4.1. Custos Diretos e Custos Indiretos 48 4.1.1. Fatores que Afetam as Classificaes de Custos Diretos Indiretos 49 4.2. FIXAO DO PREO DE VENDA 51 4.2.1. Formao de Preos com Base em Custos 51 4.3. ANLISE ECONMICA DE PROJETOS 52 4.3.1Avaliao de Projetos de Inovao Tecnolgica 55 4.3.2. Modelo de Deciso por mltiplos Atributos ou de Pontuao 55 4.4. Anlise Linear de Equilbrio 57 4.4.1. Ponto de Equilbrio entre Receitas e Despesas 57 5. MATERIAIS E MTODOS 59 5.1. Extrao por Batelada 59 5.1.1. Preparo da Amostra 59 5.1.2. Extrao com Etanol 60 5.2. Extrao em Contnuo 64 5.2.1 Descrio do Equipamento 64 5.2.2. Procedimentos de Operao da Micro-Coluna 65 5.2.3. Variveis Estudadas 66 5.3. Extrao Contnua Utilizando Uma Micro-Coluna De Campnulas Pulsantes 67 5.3.1. Planejamento de Ensaios 68 5.3.2 Efeito da Razo entre as vazes das fases (RV) e da Freqncia da pulsao (FP) das Campnulas na Porcentagem de Recuperao de Protena Total com Bromelina P.A.

69

5.3.3. Efeito da Razo entre as vazes das fases (RV) e da Freqncia da pulsao (FP) das Campnulas na Recuperao de Protena Total.

69

5.3.4. Efeito da Razo entre as vazes das fases (RV) e da Freqncia da pulsao (FP) das Campnulas na Recuperao da Atividade da Bromelina.

70

5.4. Mtodos Analticos 72 5.4.1. Determinao de Protena Total 72 5.4.2. Determinao da Atividade Enzimtica 72 5.5. Metodologia de Clculo 73 5.5.1.Coeficiente de Partio 73 5.5.2. Atividade Especfica 74 6. RESULTADOS E DISCUSSO. 75 6.1. Custos da Extrao por Batelada 75 6. 2. Custos de Purificao 79 7. COMENTRIOS FINAIS E CONCLUSES 83 8. SUGESTO DE TRABALHOS FUTUROS 85 9. REFERNCIAS BIBLIOGRAFICAS 86 ANEXOS 95

RESUMO

O Brasil encontra-se entre um dos maiores produtores mundiais de

abacaxi ocupando o terceiro lugar no ranking mundial. Visando o aproveitamento

do material considerado resduo agrcola (caule e folhas) e resduos do

processamento do fruto, muitos estudos tem sido realizados para a obteno de

enzimas proteolticas do abacaxi. As enzimas proteolticas de origem vegetal so

provenientes principalmente do figo (ficina), do mamo (papana) e do abacaxi

(bromelina). Por bromelina entende-se o conjunto de enzimas proteolticas

produzidas por plantas da famlia das Bromeliaceae. uma enzima de amplo uso

na indstria alimentcia para o amaciamento de carne e clarificao da cerveja,

para o amaciamento de couro, e na indstria farmacutica, em medicamentos

destinados a distrbios de digestibilidade,e tambm por sua ao antiinflamatria

e antimucoltica. O desenvolvimento de novos processos de extrao e purificao

de protenas muito importante, uma vez que esta uma etapa limitante na

produo de bioprodutos. O presente trabalho prope um processo de recuperao

da bromelina do fruto de abacaxi por tcnica de precipitao do caldo prensado

com etanol frio onde foram obtidos resultados demonstrando que em uma

precipitao em 1 estgio com 80% v/v de etanol a 5C possvel recuperar praticamente toda a enzima originalmente presente, aumentando de 3 a 5 vezes a

atividade especfica inicial e purificao atravs da extrao lquido-lquido em

duas fases aquosas, formado por duas fases aquosas imiscveis ou parcialmente

miscveis entre si , obtidas pela adio de polmeros hidroflicos ou um desses

polmeros e um sal , como o sistema PEG ( polietileno glicol ) e o fosfato de

potssio. O trabalho apresenta um estudo sobre os custos do processo e estimativas

sobre o preo de venda e retorno sobre o investimento , demonstrando a

viabilidade econmica da proposta quer para utilizao como pr-processo nos

tradicionais sistemas cromatogrficos, quer para sua comercializao direta, como

alternativa para o produtor do abacaxi, ou do fabricante de sucos e compotas.

Palavras Chave: Custos, Abacaxi, Extrao Lquido-Lquido

ABSTRACT

Brazil is one of the worlds largest producers of pineapples, its production being the

third one in the world. To take advantage of the residues from fruit processing, many

studies have been conducted to obtain proteolytic enzymes from them. These proteolytic

enzymes are extracted mainly from fig (ficine), papaya (papain), and pineapple

(bromelain). Bromelain is a mixture of proteolytic enzymes found in Bromeliaceae family.

It is an enzyme with ample use in food industry for meat tenderizer and beer clarification,

in leather and pharmaceutical industries, in drugs for digestion disorders, anti-inflammatory

action, and anti-colitis action. The development of new extraction and purification

processes of proteins is very important, as this is a limiting step in the production of

byoproducts. The present work proposes a recovery process of bromelain from pineapples

by precipitation of their pressed juice with cold ethanol, whereby a one stage precipitation

with 80% v/v of ethanol at 5C made possible the recovery of practically all originally

present enzyme, increasing from 3 to 5 times the initial specific activity and purification by

a liquid-liquid extraction in two aqueous phases, formed by immiscible aqueous phases or

partially miscible ones, which are obtained from the addition of hydrophilic polymers or

one of these polymers and a salt, such as PEG system (polyethylene-glycol) and potassium

phosphate. This work presents a study about the costs of this process and the estimated sale

prices as well as its return of investment, showing its economic viability, whether it is for

use as a pre-process in traditional chromatographic systems or direct commercialisation, as

an alternative for the pineapple producer of the juice market.

Key-words: costs, pineapple, liquid-liquid extraction

1

1. INTRODUO

O abacaxizeiro produz frutos de sabor e aroma aceitveis no mundo todo. O Brasil

um grande produtor de abacaxi, sendo conhecidas cinco espcies de Ananas e uma de

Pseudoananas. Dentro da espcie Ananas comosus esto includos todos os cultivos de

interesse agrcola, onde os principais cultivados no Brasil so o Prola e o Smooth Cayenne

(SANTOS, 1995).

O abacaxi fruto a parte comercializvel da planta, porm, esta poro representa

somente 63% do total da planta, enquanto que o restante, formado por caule, folha, casca,

coroa e talos, considerado resduo agrcola, e no tem sido devidamente aproveitado,

resultando em perdas econmicas. Trabalhos j realizados demonstram que estes resduos

apresentam teores representativos de carboidratos, protenas e enzimas proteolticas, que

possibilitam a sua utilizao industrial como matria-prima para a obteno de bromelina,

amido, fibras, lcool etlico e raes animais (BALDINI et.al., 1993).

Bromelina o nome genrico dado ao conjunto de enzimas proteolticas

encontradas nos vegetais da famlia Bromeliaceae, da qual o abacaxi o mais conhecido. A

bromelina tem diversos usos, todos baseados em sua atividade proteoltica, como nas

indstrias alimentcias e farmacuticas. Pode-se mencionar sua utilizao no amaciamento

de carnes, na clarificao de cervejas, na fabricao de queijos, no preparo de alimentos

infantis e dietticos, no pr-tratamento de soja, no tratamento do couro, na indstria txtil,

no tratamento da l e da seda, no tratamento de distrbios digestivos, feridas e inflamaes,

preparo de colgeno hidrolisado, etc.

Muitas tcnicas tm sido utilizadas para a recuperao e purificao de protenas e

enzimas de origem animal, vegetal ou microbiana. Tcnicas mais antigas como a

precipitao, extrao com solventes e filtrao geralmente tem alto poder de concentrao

e baixa purificao e tcnicas mais modernas como a cromatografia de afinidade, troca

inica ou gel-filtrao, eletroforese, extrao em duas fases aquosas, extrao com micela

reversa, recuperam e purificam, com alto grau de seletividade.

2

A separao de protenas de meios aquosos por precipitao um dos mtodos

mais tradicionais para a recuperao e parcial purificao dessas biomolculas. Os

precipitados de protenas so agregados de molculas proticas, grandes o suficiente para

serem decantados ou centrifugados. uma tcnica de fcil ampliao de escala e com

viabilidade para operao contnua a custos aceitveis para grandes volumes. Porm uma

tcnica mais de concentrao do que propriamente de purificao.

A extrao lquido-lquido uma operao unitria de transferncia de massa,

utilizada para separao de componentes presentes em uma mesma soluo, distribuindo-se

entre as duas fases lquidas e insolveis entre si.

A extrao em duas fases aquosas uma tcnica que vem sendo aplicada na

indstria, principalmente em separao de enzimas, por se tratar de um processo de baixo

custo, alta seletividade e com possibilidade de reciclagem dos reagentes. Alm disso, as

enzimas permanecem estveis no sistema, devido alta concentrao de gua e utilizao

de reagentes no desnaturantes.

O interesse em novos processos biotecnolgicos vem crescendo substancialmente

nas ltimas dcadas e os estudos nesta rea esto bastante consolidados. Porm para que os

mesmos possam contribuir de forma efetiva para a sociedade, h a necessidade de definio

dos custos dos processos desenvolvidos para tornar os processos cientficos tangveis aos

olhos dos investidores.

Assim, o presente trabalho faz uma anlise dos custos diretos de fabricao

envolvidos na proposta de um processo de recuperao e purificao da bromelina do

abacaxi, baseado na anlise dos processos de precipitao por etanol e extrao lquido-

lquido em duas fases aquosas.

3

2. FUNDAMENTAO

2.1. Protenas

Berzelius cunhou a palavra protena em 1838, para salientar a importncia dessa

classe de molculas. Protena vem do grego Proteios, que significa o que vem em primeiro

lugar, sendo responsveis pelo funcionamento das funes vitais dos organismos animais,

nos quais so alguns dos principais constituintes.

As protenas so as molculas orgnicas mais abundantes nas clulas e constituem

50% ou mais de seu peso seco. So encontradas em todas as partes das clulas, uma vez

que so fundamentais sob todos os aspectos da estrutura e funo celular. Existem muitas

espcies diferentes de protenas, cada uma especializada em determinada funo biolgica

diferente.

2.1.1. Bromelina

Bromelina o nome genrico dado ao conjunto de enzimas proteolticas

encontradas nos vegetais da famlia Bromeliaceae, da qual o abacaxi o mais conhecido.

As enzimas proteolticas encontradas nos talos recebem o nome de bromelina do talo e tem

o nmero sistemtico EC 3.4.22.4, e as encontradas no fruto so chamadas de bromelina do

fruto ou ainda, bromelina e tem o nmero sistemtico EC 3.4.22.5. A bromelina uma

glicoprotena, tendo um resduo oligosacardeo por molcula, que est covalentemente

ligado cadeia peptdica. A bromelina do talo uma enzima sulfidrlica, e este grupamento

essencial para a sua atividade proteoltica. A bromelina do fruto uma protena cida, e

seu ponto isoeltrico foi determinado por focalizao isoeltrica como pH 4,6 e mudanas

conformacionais irreversveis ocorrem em valores de pH maiores que 10,3 (MURACHI,

1976).

A enzima no est presente nos primeiros estgios de desenvolvimento do fruto,

porm, seu nvel aumenta rapidamente, mantendo-se elevado at o amadurecimento, onde

tem um pequeno decrscimo. Essa uma das vantagens da utilizao das proteases do

abacaxi em comparao com outras proteases vegetais. Apesar da diminuio da atividade

proteoltica durante a maturao, o abacaxi o nico fruto que possui concentraes

relativamente altas de proteases no estado maduro. No mamo e no figo, tanto a papana

como a ficina, somente so encontradas em altos nveis quando o fruto est verde; com o

completo amadurecimento, a concentrao de proteases praticamente desaparece.

4

Diferentes partes da planta podem ser usadas como matria-prima para a obteno da

bromelina: folhas, talos, polpa da fruta, cascas e resduos industriais do processamento do

fruto.

Outras fontes de enzimas proteolticas so as proteases microbianas, por exemplo,

de: Bacillus subtilis, Aspergillus sp., Actinomyces sp., e as proteases animais tripsina (EC

3.4.21.4) e pepsina (EC 3.4.23.1), alm das vegetais papana (EC 3.4.22.2), ficina (EC

3.4.22.3) j citadas. Algumas das proteases microbianas so geralmente proteases alcalinas

e tm sido usadas na produo de sabes e detergentes para a remoo de manchas de

sangue, por exemplo.

A bromelina tem diversos usos, todos baseados em sua atividade proteoltica,

como nas indstrias alimentcias e farmacuticas. Pode-se mencionar sua utilizao no

amaciamento de carnes, na clarificao de cervejas, na fabricao de queijos, no preparo de

alimentos infantis e dietticos, no pr-tratamento de soja, no tratamento do couro, na

indstria txtil, no tratamento da l e da seda, no tratamento de distrbios digestivos,

feridas e inflamaes, preparo de colgeno hidrolisado etc. Foi verificado por ROWAN et.

al. (1990) que a bromelina do fruto tem uma atividade proteoltica maior que a bromelina

do talo em diversos substratos proticos, e sua atividade mxima em pH 8,0 e a

temperatura de 70C. A bromelina do talo apresentou atividade mxima a 60C e pH 7,0. A forma de bromelina comercialmente encontrada a bromelina do talo, apesar da grande

quantidade de resduos de abacaxi fruto proveniente das indstrias de conservas de abacaxi.

As preparaes de bromelina so impuras, e geralmente as principais enzimas

contaminantes so outras enzimas proteolticas e enzimas no proteolticas, tais como:

fosfatases, peroxidases, celulases e outras glicosidases (MURACHI, 1976). SUH et. al.

(1992) purificou a bromelina do fruto e do talo at a homogeneidade (18 e 46 vezes de

aumento de pureza respectivamente) por cromatografia de gel-filtrao e determinou os

pesos moleculares em 32.5 e 37 KDa respectivamente, com rendimento de 23% em

atividade. MURACHI (1976) purificou a bromelina do talo de abacaxi por cromatografia

de gel-filtrao, e determinou que o peso molecular da frao pura era de 28 KDa por SDS-

PAGE. (ROWAN et. al. 1990) descreve a presena de quatro proteases principais presentes

em abacaxis (Ananas comosus): bromelina do fruto, bromelina do talo, ananana e

comosana.

5

2.1.2. Enzimas

A maior parte da histria da bioqumica a histria da pesquisa sobre enzimas. A

catlise biolgica inicialmente descrita e reconhecida no incio do sculo XIX, em estudos

sobre a digesto da carne por secrees do estmago e a converso do amido em acares

simples pela saliva e por vrios extratos vegetais. Na dcada de 50, Louis Pasteur concluiu

que a fermentao do acar em lcool pela levedura catalisada por fermentos. Ele

postulou que esses fermentos depois nomeados de enzimas eram inseparveis da estrutura

das clulas vivas do levedo, uma hiptese que prevaleceu por muitos anos. Em 1897,

Eduard Buchner, descobriu que extratos de levedo podiam fermentar o acar at o lcool,

provando que as enzimas envolvidas na fermentao continuavam funcionando mesmo

quando removidas da estrutura das clulas vivas. Desde ento numerosos estudos vm

sendo realizados na tentativa do isolamento das numerosas enzimas diferentes e o estudo de

suas propriedades catalticas.

A catlise enzimtica das reaes essencial para os sistemas vivos. Sob

condies biolgicas relevantes, as reaes no catalisadas tendem a ser lentas. A maioria

das molculas biolgicas muito estvel no ambiente aquoso de pH neutro e temperatura

moderada encontrado no interior das clulas. Muitas reaes bioqumicas comuns

envolvem eventos qumicos que so muito improvveis nas condies do ambiente celular,

como a formao transiente de intermedirios eletricamente carregados e instvel ou a

coliso de duas ou mais molculas com a orientao precisa e necessria para que ocorra a

reao. ( LEHNINGER, 1995).

As reaes necessrias para digerir alimentos, enviar sinais atravs de nervos, ou

contrair um msculo simplesmente no ocorrem em velocidade til sem catlise.

Uma enzima contorna estes problemas fornecendo um ambiente especfico dentro

do qual uma reao dada energeticamente mais favorvel. A caracterstica distintiva de

uma reao catalisada enzimaticamente que ela ocorre no interior dos limites de uma

cavidade, ou fenda, na estrutura molecular da enzima chamado stio ativo. A molcula que

se liga ao stio ativo e que sofre a ao da enzima chamada substrato. O complexo

enzima-substrato tem papel central na reao enzimtica, sendo ponto de partida para os

tratamentos matemticos que definem o comportamento cintico das reaes catalisadas

enzimaticamente e para as descries tericas dos mecanismos enzimticos.

6

2.1.3. Desnaturao

Quando uma soluo de protena, como a albumina do ovo, aquecida lentamente

at 600 ou 700 C, a mesma torna-se gradualmente leitosa e logo forma um cogulo. Isto

comum j que ocorre quando fervemos ovos em gua. A clara do ovo, que contm

albumina, coagula pelo aquecimento num slido branco. Depois que o calor coagulou a

clara no sofre redissoluo pelo resfriamento, nem forma outra vez uma soluo lmpida

como a original. Portanto, o aquecimento transformou a ovoalbumina e, aparentemente, de

forma irreversvel. Esse efeito do aquecimento ocorre virtualmente com todas as protenas,

no importando seu tamanho ou funo biolgica, embora a temperatura exata para

provoc-lo varie. A mudana provocada pelo calor e outros agentes conhecida como

desnaturao.

H outra importante conseqncia da desnaturao de uma protena, que quase

sempre, perde sua atividade biolgica caracterstica. Assim, quando uma soluo aquosa de

uma enzima, por exemplo, aquecida at seu ponto de ebulio por uns minutos e depois

resfriada, a enzima torna-se insolvel e, principalmente, no mais apresenta atividade

cataltica.

A desnaturao de protenas pode ser provocada no apenas pelo calor, mas

tambm por valores inadequados de pH, por solventes orgnicos, por solutos como a uria,

pela exposio da protena a alguns tipos de detergentes, pela agitao vigorosa da soluo

protica at formao abundante de espuma, presena de certos ons ou sais caotrpicos na

soluo que contm as protenas, oxidao, fora inica, entre outros. Cada uma das formas

citadas como causa de desnaturao pode ser considerada como tratamento relativamente

suave, isto , a desnaturao pode ocorrer em condies amenas, no h necessidade de

ocorrer em condies drsticas. As molculas de protena nativa so frgeis e facilmente

desorganizadas pelo calor e outros tratamentos aparentemente suaves.

2.1.4. Protena Total, Atividade e Acares Redutores

CESAR (1999) realizou anlises de protena total, acares redutores e atividade

enzimtica de amostras preparadas da polpa do fruto, da casca e do talo para a

caracterizao do meio inicial. As concentraes e os resultados so mostrados nas Tabelas

1 e 2. O fruto e o talo apresentam o mesmo teor de protena total, porm o talo apresenta

cerca de 60% menor quantidade de enzimas proteolticas. O abacaxi utilizado para as

7

anlises foi o fruto maduro, por isso apresentou uma quantidade elevada de acares

redutores expressos em glicose, 0,2 a 0,4 g/g de abacaxi. De qualquer forma, o talo e a

casca do abacaxi maduro tem um teor de enzima considervel para recuperao, como

mostrado na Tabela 2, ainda mais se tratando de resduo de muitas indstrias de conservas.

Tabela 1: Dados da concentrao das amostras de polpa do fruto, casca e talo do

abacaxi.

massa (g) Vgua (mL) VTOTAL (mL) Concentrao Fruto 1734,11 600 3420 507 g polpa/L Casca 850,50 1000 1074 792 g casca/L Talo 413,54 400 980 422 g talo/L

Tabela 2: Dados de protena total, atividade e acares redutores.

Protena Total Atividade Enzimtica Acares Redutores (mg/L) (mg/g) (U/L) Fruto 1127,00 2,22 1428,50 Casca 842,30 1,06 865,00 Talo 893,70 2,12 431,50

2.2. Abacaxi

2.2.1. Fruticultura Brasileira

A fruticultura brasileira cresceu consideravelmente nos ltimos dez anos, como

podemos observar utilizando os dados comparativos de produo dos binios 1994/1994 e

2004/2005 apresentados na Tabela 3 .

FRUTA 2005 2004 1994 1995 Abacaxi 2.279 2.297 1.558 1.463 Banana 6.606 6.691 7.438 7.384 Laranja 17.998 18.270 14.213 16.004 Ma 827 973 456 432 Uva 1.133 1283 807 825

Tabela 3 - Produo de Frutas, Brasil 1994/1995 e 2004/2005 (1000 toneladas)

Fonte: IBGE (07/2005) Fatores de converso : abacaxi: 1,6 kg/fruto; banana 13kg/cacho;

ma 130gramas/fruta ; laranja 250 frutos por caixa com 40,8 kg.

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No Estado de So Paulo, devido aos diferentes ciclos de maturao (desde

muito precoces at tardias) e as diversas regies de cultivo, pode-se dizer que a poca de

colheita das frutas se estende por nove meses at pelo ano todo. No caso das frutas de clima

temperado e subtropical a colheita se inicia em setembro e se prolonga at junho, enquanto

que para tropicais pode durar o ano todo.

Em razo de sua posio geogrfica e do cultivo das variedades

especialmente criadas ou adaptadas para as condies de inverno brando, com poucas

horas de frio abaixo de 7,20C, a produo paulista mais precoce que as dos estados do Sul

do Brasil, assim como de pases produtores como Argentina, Uruguai e Chile, o que traz

vantagens econmicas, devido a ausncia de concorrentes no incio da safra. Ao mesmo

tempo, para vrias espcies permite-se que sejam exportadas para pases do hemisfrio

Norte quando no h produo regional tendo condies de adentrarem os mercados com

reduo ou ausncia de tarifas aduaneiras de importao.

2.2.2. Cultivo e Colheita

O abacaxizeiro uma planta muito sensvel ao frio, mas resiste bem seca.

Exige, por isso, clima quente ou mesotrmico, onde no h perigo de ocorrncia de

geadas. A temperatura mdia favorvel situa-se entre 21 e 270C. Quando a temperatura se

mantm acima de 320C, verificam-se danos na planta devido transpirao excessiva;

quando a temperatura cai abaixo de 200C, a planta entra em estado de inatividade

(MEDINA, 1978). Portanto, o Brasil possui um clima muito favorvel para a produo do

fruto. Na Tabela 4 podemos observar que o pas encontra-se em segundo lugar no ranking

mundial de produo do fruto, contribuindo com mais de 13% da produo mundial.

ABACAXI PRODUO(t) PRODUO(t/ha) Mundial 15.288.018 843.231

PRODUO (t) PRODUO (t/ha) Tailndia 1.900.000 87.000 Filipinas 1.759.290 48.230

Brasil 1.435.190 54.683 China 1.320.000 70.500 ndia 1.300.000 90.000

Tabela 4: Produo mundial de abacaxi em 2005. Fonte: FAO (2005). Atualizado em fevereiro/2005.

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Os frutos colhidos durante o vero apresentam melhor qualidade do que os

amadurecidos durante o inverno. Aqueles se apresentam mais aromticos e mais ricos em

slidos solveis, menos cidos e com maior contedo de leos volteis.

O momento da colheita depende do fim a que se destinam os frutos. Se for

para a fabricao de conservas, deve-se aguardar at que os frutos fiquem maduros, ou seja,

o momento em que suas qualidades organolpticas sejam timas. Mas, se destina-se

exportao como fruta fresca, a colheita deve ser feita com antecipao para que sua

maturao total no ocorra at o momento em que seja ofertado ao consumidor. preciso,

contudo, neste caso, no colher frutos demasiado verdes.

A colorao da casca habitualmente tomada como indicao para julgar se

um fruto est ou no maduro. A madureza da polpa e a colorao da casca ocorrem

progressivamente, iniciando-se ambas pela base do fruto e se estendendo paulatinamente

para o pice. Tal avaliao, contudo, muito mais difcil do que parece primeira vista,

pois h necessidade de se levar em conta o tamanho do fruto, as condies ecolgicas, por

ocasio da sua maturao e variedade do produto.

O abacaxizeiro frutifica dentro de 24 meses aps o plantio, quando as mudas

so do tipo coroa. De modo geral, pode-se obter 15 a 20 mil frutas por hectare, por safra,

servindo este valor como mdia para as variedades.

A poca da colheita est intimamente relacionada poca de plantio e ao

tipo e idade da muda. O plantio no Estado de So Paulo feito de dezembro a fevereiro, no

perodo que coincide com a colheita das frutas (poca de maior produo) e,

conseqentemente, poca favorvel para obteno de mudas.

As colheitas das frutas de um abacaxizal no podem ser feitas por meios

mecnicos, pois as frutas no amadurecem todas ao mesmo tempo. Todavia, no Hava e em

outras regies onde a cultura do abacaxi feita com alto nvel tcnico, os trabalhos de

colheita so grandemente facilitados graas utilizao de uma esteira rolante, na qual as

frutas so colocadas e transportadas para fora dos talhes to logo sejam colhidas.

No Brasil, o trabalho de colheita geralmente feito com auxlio de um faco,

com o coletor tendo as mos protegidas por luvas de lona grossa. Enquanto com a mo

esquerda segura o fruto pela coroa, com a direita secciona, com o faco, a haste a 5-6 cm

abaixo da fruta. As frutas colhidas vo sendo entregues a outro coletor, que encarregado

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de transport-las em cestas at a margem do carreador. Necessita-se, em mdia, trs

carregadores para cada colhedor. A produtividade mdia de 30.000 a 40.000

frutos/ha/ano.

Em geral, a comercializao do abacaxi feita com o fruto ainda no campo,

antecipadamente e a granel. Leva-se em conta o tamanho e a aparncia do fruto, de acordo

com os padres das variedades. Para os grandes mercados consumidores ao natural, seguem

os frutos de primeira qualidade, sadios e com peso igual ou acima de 1,5 kg. Os que no

atingem esse padro so vendidos nos mercados locais, perto das regies produtoras, ou so

destinados industrializao.

2.2.3. Caracterizao da Fruta

Em vista da grande comercializao do abacaxi, tanto no mercado interno como

internacional, e tambm para a indstria, e cuja produo agrcola vem aumentando de ano

para ano, os produtores devem procurar manter um padro de qualidade da fruta a fim de

garantir sua comercializao.

Para isso, necessrio que sejam observadas as seguintes caractersticas:

-COR: a cor revela nas frutas o seu grau de maturao, o que, apesar de ser uma

apreciao subjetiva, permite distinguir a qualidade do produto. O abacaxi dever

apresentar uma colorao uniforme, porm sem estar muito maduro, o que indesejvel,

tanto para a indstria como para o mercado consumidor.

-TAMANHO: a uniformidade de tamanho bastante importante, principalmente

para a indstria, onde os diferentes comprimentos e dimetros das frutas afetam a

regulagem das mquinas (ginaca, principalmente).

- SABOR: importante conhecer a relao Brix/acidez total titulvel da variedade

que vai ser comercializada ou industrializada. Essa relao varia de ano para ano, de acordo

com as condies climticas (principalmente), e tambm com a estao do ano. H,

portanto, grandes variaes entre as safras de vero e de inverno .

-FORMA: esta caracterstica afeta o descascamento mecnico e, portanto, o

rendimento, devendo ser a fruta de forma cilndrica para evitar uma perda excessiva de

polpa nessa operao. A variedade Smooth Cayenne de origem havaiana, apresenta frutas

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mais uniformes e cilndricas do que a variedade Prola (brasileira), que vem facilitar e

muito o trabalho das ginacas e um menor desperdcio de fruto na indstria de compotas.

2.2.4. Composio Qumica

O abacaxi apresenta uma variao muito grande na sua composio qumica, de

acordo com a poca em que produzido. De modo geral, a sua produo ocorre no vero,

sendo sua colheita uniformizada atravs da induo qumica do seu florescimento.

Neste caso, as frutas apresentam maior teor de acares e menor acidez. Por outro

lado, as frutas produzidas fora de poca, ou seja, as frutas tempors , apresentam alta acidez

e baixo teor de acares, visto a produo ocorrer nos meses que a temperatura ambiente

baixa .

O valor nutricional das frutas de abacaxi depende, principalmente, dos seus

acares solveis, das vitaminas e dos sais minerais que contm, uma vez que os teores de

protenas e de lipdeos so relativamente baixos.

O abacaxi uma fruta deliciosa, muito apreciada em todos os pases tropicais; sua

polpa sucosa, saborosa e ligeiramente cida muito refrescante. Ao lado das qualidades

organolpticas, que o distinguem universalmente, h seu alto valor diettico, comparvel

ao das melhores frutas tropicais. O suco de abacaxi um alimento energtico, pois um copo

do mesmo propicia cerca de 150 calorias ao organismo humano. O teor de acares varia

em geral em torno de 12 a 15%, dos quais aproximadamente 66% so de sacarose e 34%

de acares redutores. As cinzas, que apresentam 0,4-0,6% do peso total, so ricas em

bases, principalmente em potssio, ao qual seguem o magnsio e clcio, geralmente em

partes iguais, e essas caractersticas permanecem em sua maioria nos resduos triturados do

abacaxi para o processamento da bromelina, sendo ento este resduo de grande interesse

por suas caractersticas de alta riqueza nutricional.

2.2.5. Processamento da Fruta

O comrcio mundial de abacaxi in natura atingiu 700 mil toneladas, e o comrcio

de abacaxi transformado em suco ou conserva equivalente a quatro milhes de toneladas

de frutas frescas (AGRIANUAL, 2000).

O fruto presta-se tanto para consumo ao natural como para processamento

industrial em suas mais diversas formas (pedaos em calda, suco, pedaos cristalizados,

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gelias, licor, vinho, vinagre e aguardente). Como subproduto da sua industrializao,

pode-se obter lcool, cidos ctrico, mlico e ascrbico, raes para animais e bromelina

(enzima proteoltica de uso medicinal). O talo da planta pode ser aproveitado para extrao

de bromelina, sendo tambm fonte de amido. As folhas podem ser utilizadas para a

obteno de fibras. De alto valor diettico, a polpa do abacaxi energtica (150 calorias por

copo de suco); contm boa quantidade das vitaminas A e B1 e da C, no contendo a D.

Contm, ainda, a bromelina que favorece a digesto.

A fruta em calda, que o principal produto industrializado do abacaxi, ocupa,

atualmente, a segunda posio em vendagem no mercado internacional, logo em seguida do

pssego em calda.

As tcnicas industriais de preparo de fatias e pedaos para enlatamento so

conhecidas internacionalmente. Linhas completamente automatizadas encontram-se em

vrias fbricas espalhadas pelo mundo tais como Hava, Formosa, Filipinas, Tailndia,

Austrlia, frica do Sul e outros pases, no mundo todo.

Essas linhas, com capacidade de 80 a 120 frutas por minuto, apresentam,

atualmente, rendimentos prximos de 46% de partes slidas da fruta para enlatamento.

2.2.6. Produtos e Subprodutos do Processamento.

Na grande indstria do abacaxi, a industrializao da fruta integrada. Isso

significa que no existe uma indstria trabalhando com um ou dois produtos, mas procura-

se tirar o mximo de rendimento da fruta em relao ao produto principal (fruta em calda)

e aos produtos de carter secundrio (como o caso do suco simples e do suco

concentrado), e mesmo os subprodutos, como o caso especfico do suco da casca e

resduos e da rao, esta ltima utilizada na alimentao animal.

O processamento tem incio com a lavagem das frutas, que chegam do

campo em grandes recipientes ou carretas, j desprovidas da coroa que pode ser utilizada

para o replantio da fruta. A seguir, as frutas so conduzidas por meio de transportadoras

para uma seo superior onde a lavagem completada. Um sistema de transportadores

conduz as frutas lavadas para um segundo pavimento, no qual, feito um corte em uma das

extremidades da fruta. Essa operao tem por finalidade principal eliminar as partes

restantes da coroa e talo, a fim de facilitar o trabalho posterior da mquina ginaca. Essas

13

partes eliminadas, seguem, por meio de um transportador, para a linha de processamento de

rao.

Na etapa seguinte, ainda no segundo pavimento, as frutas so selecionadas

por tamanho, seleo esta que feita por meio de roscas sem fim, dispostas de tal forma

que permitem a classificao das frutas em trs tamanhos distintos: grande, mdio e

pequeno.

As frutas de tamanho mdio constituem aproximadamente 60 a 65% do total

de abacaxis que entram na usina de processamento.

O processo tem por finalidade dar um fluxo contnuo s fases posteriores,

reduzindo assim a capacidade ociosa da ginaca. Esta mquina cujo nome foi dado em

homenagem a seu inventor o engenheiro havaiano de sobrenome Ginaca, completamente

automatizada e de grande capacidade (80-120 frutas por minuto), executando uma srie de

operaes sucessivas, e que so as seguintes: - corte das extremidades, descascamento da

fruta e encaminhamento do cilindro etapa seguinte do processamento. O equipamento

tambm dotado de um dispositivo raspador, que erradica a polpa da casca e das

extremidades do fruto. A maior parte deste material erradicado (polpa erradicada) se

destina produo de crush (espcie de salada de frutas) e uma pequena parte produo

de suco .

Nas ginacas de produo mais antiga tambm havia um dispositivo para

remoo do miolo do cilindro da fruta

Dentro de um sistema mais moderno, conhecido como sistema de

processamento de abacaxi em dois dimetros da Honiron, a remoo da parte central

do cilindro da fruta feita em fase posterior. Esse sistema permite maior rendimento

industrial em termos slidos, pois o cilindro cortado em fatias quando ainda inteiro, isto ,

com miolo, e estas apresentam maior resistncia mecnica remoo do miolo, reduzindo-

se assim, o nmero daquelas quebradas.

Nas diversas linhas de ginaca geralmente encontradas nas grandes indstrias

de abacaxi do mundo, a mquina usualmente regulada para o processamento de frutas dos

trs tamanhos anteriormente mencionados.

Pode-se ento observar, uma boa fonte da matria-prima a ser utilizada no

processo de recuperao e purificao de enzimas do abacaxi, visto que, uma das maiores

14

dificuldades da indstria de processamento do fruto a venda do suco, obtido como

subproduto e posteriormente reprocessado, tratado, pasteurizado e embalado para

comercializao em um mercado que no responde produo de suco devido ao seu alto

custo ocasionado pelo tratamento.

Do total de frutos produzidos nos Estados Unidos da Amrica em 2003,

aproximadamente 73% foram industrializados (FAO, 2005) e os restantes 27% consumidos

na forma fresca. Do total mundial industrializado, 46% foram comercializados no mercado

mundial, com seu valor de mercado quintuplicado graas aos custos de processamento,

embalagem e distribuio.

O Brasil diferencia-se completamente dos grandes produtores e consumidores

mundiais de abacaxi, pois quase toda sua produo consumida na forma fresca, sendo a

quantidade industrializada insignificante (BERTEVELLO, 2001). Portanto, uma das

principais fontes de matria prima para a extrao de enzimas no Brasil, no seriam os

subprodutos do processamento e sim os resduos agrcolas, especialmente a sua haste (stem)

que tem demonstrado bons resultados nos mais recentes estudos de extrao e purificao

(RABELO, 2004) e nas aplicaes teraputicas da Bromelina (MYNOTT, 1999).

Uma maneira que vem sendo estudada para a utilizao dos subprodutos a

silagem dos resduos do abacaxi. A silagem de resduos industriais de abacaxi, por

apresentar caractersticas nutricionais prximas da silagem de milho, poderia substitu-la

como fonte de volumoso para animais em confinamento. Alm da qualidade nutricional,

um produto de baixo custo por ser considerado um resduo, diferente de outros

freqentemente utilizados, como por exemplo, a silagem de milho, que apresenta altos

valores no perodo de entressafra do milho, sendo que neste perodo tambm h queda na

produo de forragem. Dessa maneira, o produtor passaria a dispor de mais uma alternativa

de produto, seja durante o perodo de escassez de forragem, ou como alimento para

confinamento.(PRADO et all, 2003).

A composio qumica da silagem de resduos industriais de abacaxi varia em

funo do tipo de resduo gerado, ou seja, de acordo com o produto da indstria, compondo

assim, o resduo, de diferentes partes da planta ou do fruto. RODRIGUES & PEIXOTO

(1990) utilizaram frutos descartados sem coroa, cascas e miolos, como resduo ensilado, e

obtiveram valores de 12,93% de matria seca (MS); 3,95% de protena bruta (PB); 62,76%

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de fibra em detergente neutro (FDN) e 41,27% de fibra em detergente cido (FDA). Em

outro trabalho, RODRIGUES & PEIXOTO (1990), utilizando outro tipo de resduo, no

ensilado, composto de frutos descartados, casca, miolo e coroa. Por outro lado, alguns

trabalhos tm sido desenvolvidos com o uso de resduos de plantas de abacaxi aps

colheita. Este resduo constitudo da parte superior da planta do abacaxi aps a colheita do

fruto. MLLER (1978) observou que a composio qumica dos resduos das plantas do

abacaxi e dos resduos da indstria de conserva nutricionalmente diferente.

Todos estes dados reforam a idia que subprodutos poderiam ser usados na

alimentao animal, principalmente pelo fato de contriburem para minimizar os custos de

produo, lembrando sempre que a silagem oriunda de frutos contm alta porcentagem de

gua, que acaba dificultando o transporte dos mesmos, devendo a propriedade localizar-se

prxima indstria geradora de resduos. Da mesma forma, este produto pode apresentar

deficincia em energia e protena ou ambos, exigindo o fornecimento de uma fonte de

suplementao adequada (PRADO, 2003)

Segundo Prado (2003) a silagem de resduos industriais de abacaxi apresentou

composio qumica e caractersticas fermentativas (cor, odor e pH) favorveis, podendo

ser utilizada como alimento alternativo para terminao de bovinos de corte, em

confinamento, sem alterar o desempenho do animal ou o rendimento da carcaa.

2.3. Consumo de Bromelina.

Para a utilizao de bromelina, a indstria alimentcia no se apresenta

como um mercado atrativo pois, vem sendo largamente utilizada a papana no amaciamento

de carnes e a grande barreira seria romper o cartel de indstrias produtoras da enzima, pois

o consumidor s compra a carne amaciada ou o amaciante de carnes sem preocupar-se com

o princpio ativo do produto. Tambm, atualmente a frica do Sul vem produzindo e

exportando papana a preos muito reduzidos.

A indstria de cervejas, onde a bromelina pode ser usada como clarificante,

aboliu a utilizao da mesma, alegando que esta enzima produz resduos de difcil retirada

dos tanques de armazenagem do produto.

A concentrao principal est na indstria farmacutica brasileira. Bromelina uma mistura que contm enxofre, protena da enzima digestiva (enzima proteoltica ou

protease), obtida no caule da planta do abacaxi. Bromlia foi reconhecida como agente

16

medicinal em 1957 e, desde ento, mais de 200 documentos integraram a literatura

medicinal. A Bromelina tem sido muito bem documentada pelos seus efeitos em todas

condies inflamatrias, alm de ter sua eficcia provada em vrios outros problemas de

sade tais como: angina, indigesto e problemas respiratrios.

Introduzida pela primeira vez como composto teraputico em 1957, a ao da

bromelina inclui: inibio da agregao plaquetria, atividade fibrinoltica, ao

antiinflamatria, ao antitumoral, modulao de citocinas e imunidade, propriedade

debridante de pele, aumento da absoro de outra drogas, propriedades mucolticas;

facilitador da digesto, acelerador da cicatrizao, melhora da circulao e sistema

cardiovascular. Bromelina bem absorvida por via oral e a evidncia disponvel indica que

sua atividade teraputica aumenta com as doses mais altas. Apesar de todos os seus

mecanismos de ao ainda no estarem totalmente esclarecidos, foi demonstrado que um

seguro e efetivo suplemento. A bromelina parece ter tanto ao direta quanto indireta,

envolvendo outros sistemas enzimticos, ao exercer seus efeitos antiinflamatrios.

(MATTOS, 2005).

A bromelina, uma protease sulfdrica presente nesta espcie, , talvez, o enfoque

cientfico mais estudado. Isto se d pela importncia desta protena na farmacologia, onde

foi registrada sua interferncia no crescimento de clulas malignas, inibio de cogulos,

atividade fibrinoltica e ao antiinflamatria (TAUSSIG & BATKIN, 1998). O Ananas

comosus um produto fitoterpico com ao mucoltica e fluidificante das secrees

brnquicas e das vias areas superiores (HEBRON, 2005). Contribui para a melhor

fluidificao das secrees mucosas do paciente, graas s propriedades mucolticas e

fluidificantes destas enzimas, conforme pesquisas realizadas pela Universidade Federal de

Pernambuco, Universidade de Pernambuco e Universidade Federal da Paraba. As enzimas

bromelina, ribonuclease, glucose oxidase, invertase e diastase contidas no Ananas comosus,

catalizam a quebra de ligaes entre as ligaes peptidicas, pela incorporao de molculas

de gua, facilitando, assim a fluidificao do muco espesso.

A bromelina uma endopeptidase que no necessita de sistema precursor para

desempenhar suas atividades farmacolgica e teraputica. Alm disso, o Ananas comosus

contm os ctions divalentes dos oligoelementos magnsio, mangans, zinco, ferro e clcio,

que atuam como cofatores nas funes das referidas enzimas.

17

As enzimas proteolticas so aplicadas em formulaes tpicas com a finalidade de

reduzir a espessura da camada crnea da pele por hidrolisar, em pontos especficos, a

queratina cutnea. um peeling mais suave e seguro, comparado aos tradicionais peelings

qumicos, e mais eficaz que os mtodos fsicos comumente usados em formulaes

cosmticas (RACINE, 2004).

A Bromelina tambm usada em forma de soluo para preparao de suspenso

de hemcias a ser utilizada na tipagem sangunea .

O principal foco industrial da produo de bromelina a indstria faramcutica

que um dos setores que mais investe em tecnologias e novos produtos, tendo realizado

uma previso de investimentos no perodo de 1997 2000 de US$ 1.300 milhes

(ABIFARMA). Reflexos do plano econmico, do primeiro mandato do governo de

Fernando Henrique Cardoso, que melhorou substancialmente o poder aquisitivo dos

brasileiros que esto investindo em sade e medicamentos, o que vem refletindo no

aumento da expectativa de vida pois, segundo o IBGE, o nmero de idosos atualmente o

dobro do registrado em 1980 (CESAR, 2000).

Ainda segundo Csar (2000), at bem pouco tempo atrs um novo remdio que era

lanado no mercado brasileiro no tinha a sua frmula protegida. Ento, logo que era

lanado, sem proteo legal, um concorrente logo aparecia. A proteo legal muito

importante na indstria de farmacolgicos pois chega-se a gastar 15 anos com pesquisas, o

que gera um investimento de capital em torno de US$ 700 milhes . Com esta proteo

que dura 20 anos at a patente ser de conhecimento pblico.

2.4. Separao e Purificao de Protenas

Muitas tcnicas tem sido utilizadas para a recuperao e purificao de

protenas e enzimas de origem animal, vegetal ou microbiana. Tcnicas mais antigas como

a precipitao, extrao com solventes e filtrao geralmente tem alto poder de

concentrao e baixa purificao e tcnicas mais modernas com a cromatografia de

afinidade, troca inica ou gel-filtrao, eletroforese, extrao em duas fases aquosas,

extrao com micela reversa, recuperam e purificam, muitas vezes at a homogeneidade.

O processo de separao e purificao de bioprodutos, tambm chamado

downstream processing, atualmente um segmento muito importante na indstria, pois

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pode chegar a representar de 80 a 90% do custo de produo. Portanto, o desenvolvimento

de um processo eficiente e de baixo custo de extrema importncia (BELTER et al, 1998).

A grande questo ao iniciar um processo de purificao o grau de pureza exigido

para a protena. Protenas para fins teraputicos ou de uso direto em humanos necessitam de

um alto grau de pureza, o que no necessrio para as enzimas que sero aplicadas em

processos industriais. Em uma purificao em larga escala, o processo normalmente

consiste de 4 a 6 etapas que podem ser divididas em dois grupos. O primeiro formado

pelos processos de recuperao da protena: separao e ruptura de clulas, separao dos

fragmentos e concentrao da protena. No segundo grupo o objetivo purificar a protena,

utilizando-se das etapas de pr-tratamento ou isolamento primrio, purificao de alta

resoluo e refinamento final.

A purificao de protenas encontra muitas dificuldades, do ponto de vista tcnico, e

exige um elevado nmero de etapas. Por exemplo, a remoo dos fragmentos das clulas

difcil devido ao pequeno tamanho das partculas e viscosidade da soluo. As etapas de

concentrao podem levar a baixos rendimentos e reprodutibilidade limitada. Os

procedimentos de alta purificao, como a cromatografia, limitado pela escala de

operaes e pelo custo das resinas. Por isso, a extrao lquido-lquido vem despertando

tanto interesse a fim de ser utilizada como uma etapa intermediria de separao, que

substitui mtodos de separao mais caros ou diminui o nmero de etapas de separao

necessrias ao processo (RABELO, 1999).

A purificao e separao de protenas baseadas nos princpios de partio em

sistemas de duas fases aquosas tem sido muito desenvolvido nos ltimos anos. Esta tcnica

de extrao parece ser especialmente adequada para as primeiras etapas dos procedimentos

de separao, mas pode substituir etapas cromatogrficas ou ser aplicada antes da

cromatografia. (HUSTEDT et al, 1985).

2.4.1. Precipitao por Etanol

A separao de protenas de meios aquosos por precipitao um dos mtodos

mais tradicionais para a recuperao e parcial purificao dessas biomolculas. Este mtodo

implica na alterao da estrutura tridimensional da protena, desconformando-a, e pode ser

agressivo, sendo aplicado somente quando a ressolubilizao do precipitado possvel. Os

precipitados de protenas so agregados de molculas proticas, grandes o suficiente para

19

serem decantados ou centrifugados. uma tcnica de fcil ampliao de escala e com

viabilidade para operao contnua a custos aceitveis para grandes volumes. Porm, uma

tcnica mais de concentrao do que propriamente de purificao.

A solubilidade das protenas depende da distribuio de grupos ionizveis, zonas

hidrofbicas e hidroflicas na superfcie da molcula. Tais caractersticas so responsveis

por interaes polares com o solvente aquoso, interaes inicas com os sais presentes no

meio, alm da repulso eletrosttica entre molculas de mesma carga. A presena de sais,

solventes orgnicos e o pH so fatores importantes na solubilidade das protenas (SCOPES,

1994).

A adio de solventes orgnicos miscveis tais como etanol, metanol ou acetona a

um meio aquoso contendo protenas causa uma variedade de efeitos, os quais, combinados

provocam a precipitao da protena. O solvente destri a camada de hidratao hidrofbica

em torno das zonas hidrfobas e passa a circundar tais regies devido maior solubilidade

destas em meio ao solvente. Com isso, as regies carregadas com carga positiva ou

negativa da superfcie da protena podem interagir, atraindo-se umas s outras, formando

agregados. As interaes do solvente com as zonas hidrfobas internas causam uma

desconformao irreversvel da protena. Isto pode ser minimizado pela reduo da

temperatura at valores da ordem de zero ou abaixo, pois a baixas temperaturas a

flexibilidade da molcula menor, reduzindo a capacidade de penetrao do solvente e a

desnaturao irreversvel das protenas, sendo que, os lcoois de cadeia mais longa

apresentam maior efeito desnaturante do que os de cadeia mais curta (SCOPES, 1994).

Uma carga global prxima a zero na superfcie da protena, o que acontece no

ponto isoeltrico das protenas (pH =pI= ponto isoeltrico), minimiza a repulso

eletrosttica podendo causar precipitao por interao entre as zonas hidrofbicas, e esse

processo chama-se precipitao isoeltrica, e realizado apenas com a correo do pH. De

modo geral, a precipitao por qualquer mtodo escolhido facilitada no ponto isoeltrico

da protena. A adio de sais neutros, principalmente (NH4)2 SO4 a elevadas concentraes

1,5 a 3,0 M, reduz a disponibilidade da gua devido hidratao dos ons, criando

condies para a precipitao, a qual ocorre principalmente por interao das zonas

hidrfobas. O sal e outros precipitantes no provocam a precipitao de todas as protenas

pois o seu efeito o de reduzir a solubilidade. Com isso, a concentrao de sal ou solvente

20

que provoca a precipitao varia com a concentrao da protena e a presena de outras

protenas contaminantes. Este fato aproveitado para a realizao de um fracionamento.

A precipitao uma operao unitria muito comum, e amplamente utilizada na

separao de protenas. A vantagem da utilizao do etanol como agente de precipitao

encontra-se na abundncia e baixo custo deste solvente, tornando a recuperao da enzima

economicamente interessante, alm do fato de que o etanol pode ser reciclado ao processo

por uma operao de destilao, reduzindo impactos ambientais pela liberao de efluentes,

como o caso da precipitao com sulfato de amnio. As desvantagens do uso de etanol

so: a necessidade de operao em baixa temperatura para minimizar a desnaturao da

enzima, e o perigo de inflamabilidade deste solvente.

2.4.2 Extrao Lquido-Lquido

Uma situao comum na Engenharia Qumica a separao dos constituintes de

uma mistura lquida homognea composta de dois ou mais componentes. Para realizar esta

separao existem vrios mtodos cuja aplicao limitada pelas caractersticas fsicas e

qumicas dos componentes da mistura a ser separada, pelos custos do processo de separao

e pelas condies disponveis para a implantao do processo escolhido.

A extrao lquido-lquido um processo que envolve a transferncia de massa

entre dois lquidos imiscveis. Na extrao lquido-lquido, a separao de um componente

de uma soluo lquida homognea ocorre pela adio de um constituinte lquido, insolvel

ou parcialmente solvel, o solvente, no qual o componente a ser extrado da soluo, o

soluto, preferencialmente solvel. O soluto difunde-se no solvente com uma velocidade

caracterstica at atingir as concentraes de equilbrio em cada uma das fases formadas.

Este processo de separao baseado na distribuio do soluto entre as fases e a

miscibilidade parcial dos lquidos (RABELO, 1999).

2.4.2.1. Sistemas de Duas Fases Aquosas

Na escolha de meios de extrao para aplicaes em biotecnologia, vrios critrios

devem ser considerados, j que nesta rea alguns parmetros tais quais, solubilidade e

estabilidade dos compostos so importantes e no podem ser desprezados. Entre estes

critrios deve-se citar (PORTO, 1998):

- O meio no deve ser txico ao sistema biolgico nem ao homem;

21

- A recuperao do bioproduto a partir do meio extrator deve ser fcil;

- Deve ter baixo custo e estar disponvel comercialmente em grande

quantidade;

- Ser possvel de esterilizar;

- Ser imiscvel ou parcialmente miscvel com solues aquosas;

- No deve apresentar tendncias de formao de emulses estveis com

materiais biolgicos;

- No ser inflamvel.

Alm disso, em processos de extrao lquido-lquido aplicados a quaisquer

sistemas, imprescindvel que os solventes escolhidos formem duas fases (sejam imiscveis

ou parcialmente miscveis) e tenham densidades diferentes. Alm destes fatores a separao

entre as fases deve ser rpida.

Nos processos biotecnolgicos, em que se opera com biomolculas ou clulas,

existe um nmero muito limitado de solventes adequados a serem usados. Assim, a

introduo dos sistemas de duas fases aquosas em processos biotecnolgicos uma

alternativa que possibilita o emprego da extrao lquido-lquido nestes processos, j que

estes sistemas caracterizam-se por ajustar-se aos critrios requeridos pelos processos de

bioseparao (MATIASSON et al, 1987).

O uso de solventes orgnicos , normalmente, limitado pelas caractersticas

hidroflicas dos produtos de fermentao, levando necessidade de utilizao de elevadas

razes entre as fases orgnica e aquosa, devido aos baixos coeficientes de partio dos

produtos em relao ao solvente orgnico. Alm disso, os solventes orgnicos so

geralmente txicos para as protenas e, tambm, provocam desnaturao das mesmas.

Sistemas de duas fases aquosas formam-se pela adio de solues aquosas de dois

polmeros hidroflicos, como PEG (polietileno glicol) e dextrana ou de um polmero e um

sal, como PEG e fosfato de potssio. A fase mais leve rica em polietileno glicol enquanto

a fase mais pesada enriquecida com dextrana ou sais. Os polmeros e os sais so solveis

em gua, mas so incompatveis entre si e se separam em duas fases (ALBERTSSON,

1986). Eles constituem um meio conveniente e adequado para a extrao de substncias de

origem biolgica pois a constituio das fases, entre 70% e 90% de gua, proporciona um

22

ambiente ameno para o trabalho com compostos biologicamente ativos, preservando sua

estabilidade molecular e permitindo, assim, o seu processamento neste meio

(COIMBRA,1995).

A separao espontnea, em fases distintas, devido a adio de solues aquosas de

dois polmeros foi inicialmente observada pelo microbiologista holands Beijerinck, em

1956, ao misturar gar com gelatina ou amido solvel. A fase inferior era rica em gar e a

superior em gelatina (ou amido). Em 1956, Albertsson constatou que sistemas formados por

polmeros solveis e solventes orgnicos tambm possibilitam a partio de materiais

biolgicos, ou seja, permitiam que uma terceira substncia introduzida no sistema fosse

coletada, preferencialmente, numa das fases por ajuste de parmetros fsico-qumicos.

Devido a esta particularidade os sistemas de duas fases aquosas so empregados no

isolamento e purificao de biomolculas de importncia comercial, tais como, protenas,

vrus, fragmentos de membranas e organelas celulares. De acordo com ALBERTSSON

(1986), possvel ter uma separao bastante seletiva de substncias usando sistemas

aquosos de polmeros.

Os sistemas de duas fases aquosas formados por PEG-Dextrana- gua e PEG-Sal-

gua tm sido, nos ltimos anos, os mais freqentemente estudados e utilizados para

purificao de um grande nmero de biomolculas (DIAMOND et al, 1992)

ALBERTSSON (1986) reconheceu a possibilidade de utilizarem-se sistemas de

duas fases aquosas como um mtodo de separao aplicado a materiais biolgicos sob

condies que preservam a sua atividade biolgica. Alm disso, os sistemas de duas fases

aquosas so usados tambm na determinao de propriedades superficiais de biomolculas,

tais como, carga e hidrofobicidade. Assim, ao lado de trabalhos no campo tecnolgico

existe tambm o interesse na utilizao da partio como meio de preparao de amostras

para uso em tcnicas analticas. Para tanto, so aplicados os diferentes tipos de sistemas de

duas fases aquosas existentes.

A variada faixa de aplicabilidade dos sistemas de duas fases aquosas tem estimulado

o estudo a fim de estabelecer fundamentos para o trabalho com estes sistemas, alm de

identificar os mais adequados para a separao de diferentes biomolculas. (GUAN et al,

1993)

23

ALBERTSSON (1971) comparou sistemas de duas fases aquosas com os solventes

mais convencionais, de acordo com a natureza hidrofbica, hidroflica. A fase rica em sal

mais hidroflica e a fase rica em PEG( polietilenoglicol) mais hidrofbica.

Considera-se que a separao de molculas, incluindo protenas, em sistemas de

duas fases aquosas dependente das caractersticas da superfcie molecular dos compostos

a serem particionados tais como: carga, tamanho e propriedades hidrofbicas.

A extrao com sistemas de duas fases aquosas oferece certas vantagens para o

processamento em larga escala. Algumas delas so: o elevado rendimento, a faixa de

trabalho prxima do equilbrio, a fcil ampliao de escala (scale up) e o processamento

contnuo. Com isto, o interesse na aplicao de sistemas de duas fases aquosas deixou de se

restringir biologia celular para concentrar-se na anlise dos fundamentos da separao de

fases e da partio de protenas, na reduo dos custos do processamento, no aumento da

seletividade da extrao (por exemplo, pela adio de ligantes), na pesquisa de novos

componentes formadores das fases, especialmente para substituir a dextrana, que um

componente de elevado custo, e na operao em mltiplos estgios (COIMBRA, 1995).

2.4.2.2. Tipos de Sistemas de Duas Fases Aquosas.

Existem vrias substncias que podem formar duas ou mais fases aquosas ao se

misturarem. Estas substncias podem ser polmeros ou compostos de baixo peso molecular,

como os sais, que permitem a separao de fases.

Os sistemas de duas fases aquosas podem ser divididos em quatro grandes grupos

(ALBERTSSON, 1986):

a) dois polmeros no inicos

exemplos: PEG/ficoll, PEG/Dextrana, PEG/polivinil lcool, polipropileno

glicol/dextrana, metil celulose/hidroxipropildextrana, ficoll/dextrana;

b) um polieletrlito e um polmero no inico

exemplos: sulfato dextrana de sdio/polipropileno glicol, carboximetildextrana de

sdio/PEG, carboximetilcelulose de sdio/ metil celulose;

c) dois polieletrlitos

24

exemplos: sulfato dextrana de sdio/carboximetildextrana de sdio,

carbometildextrana de sdio/carboximetil celulose de sdio;

d) um polmero no inico e um composto de baixo peso molecular

exemplo: polipropileno glicol/fosfato de potssio, PEG/fosfato de potssio,

metoxipolietileno glicol/fosfato de potssio, polipropileno glicol/glicose, PEG/glicose,

PEG/sulfato de magnsio, PEG / citrato de sdio.

H ainda novos sistemas formados por PEG/FeSO4 e PEG/Na2SO4 que apresentam

algumas vantagens em relao aos sistemas com sais de fosfato e citrato, como, por

exemplo, o baixo nvel de PEG na fase salina, que reduz as perdas do PEG e facilita a

purificao das biomolculas e a reciclagem do PEG. Nesse tipo de sistema foi observado

que a concentrao de sal na fase PEG e a concentrao na fase salina tendem a diminuir

com o aumento da temperatura (PATHAK et al, 1991).

Apesar da grande variedade de sistemas de duas fases aquosas, a quantidade de

sistemas realmente aplicveis para extrao lquido-lquido fica reduzida basicamente aos

formados por PEG/sal (fosfato/citrato/sulfato) e PEG/dextrana, quando se levam em

considerao fatores importantes do ponto de vista industrial, como custo e possibilidade de

reciclagem dos reagentes, tempo de separao das fases, possibilidade de esterilizao,

atoxicidade e faixa de aplicao. Devido a tais fatores, os estudos mais recentes tendem a

concentrar-se mais nesses dois sistemas, sendo o sistema PEG/sal o mais estudado devido

ao seu baixo custo e menor tempo de separao das fases em relao ao sistema

PEG/dextrana (COIMBRA, 1995).

2.4.2.3. Sistema PEG/Sal

A formao de sistemas PEG/sal foi primeiro observada por Albertsson nos anos

50, mas os fundamentos tericos ainda no so bem explicados.

Eles foram introduzidos para a aplicao prtica da separao de protenas em larga

escala devido maior diferena de densidade entre as fases, menor viscosidade e menores

custos; levando a uma separao mais rpida que para os sistemas PEG/dextrana. A

aplicao industrial de sistemas PEG/sal foi incentivada e desenvolvida pela

disponibilidade de separadores comerciais que permitam separaes de protenas

continuamente e de forma mais rpida. (KULA, 1990 e FRANCO,1992).

25

Para sistemas PEG/sal, os efeitos de salting out parecem atuar aumentando o

comprimento da linha de amarrao, retirando as protenas da fase salina para a fase rica

em PEG, ou, se a solubilidade da protena na fase rica em PEG no for suficiente, elas

tendem a precipitar na interface. Os limites de solubilidade e salting out so dependentes

das protenas, portanto uma resposta diferencial esperada quando uma mistura de

protenas manipulada (KULA,1982).

2.4.2.4. Polietileno Glicol

O polietileno glicol, HO-(CH2CH2)n-CH2CH2OH, um polister sinttico neutro,

linear ou de cadeia ramificada, disponvel numa grande variedade de pesos moleculares, de

poucas centenas milhares de daltons. Solubiliza-se em gua e em diferentes solventes

orgnicos. A sua solubilizao em gua atribuda ligao das molculas de gua a

muitas ou todas as molculas em torno da cadeia de polietileno. Essa ligao ocorre pelo

mecanismo de pontes de hidrognio. Ligaes deste tipo so relativamente fracas e podem

ser quebradas de vrias maneiras.

O PEG tambm conhecido pelos nomes comerciais de poliglicol E, carbowax E, dependendo da empresa que o fabrica. Para pesos moleculares acima de 20000 daltons so denominados xidos de polietileno, PEO. So fornecidos na forma de

solues incolores estveis ou pastas se possurem pesos moleculares menores que 1000.

Os de pesos moleculares elevados, acima de 1000, so encontrados na forma de p ou de

flocos brancos. Podem ser estocados temperatura ambiente, embora a 40 C a ocorrncia de

oxidao em solues seja retardada. A oxidao do PEG, detectada pela diminuio do pH

devida a liberao de grupos cidos, altera a colorao da soluo para marrom

(COIMBRA, 1995).

Sendo no antignico nem imunognico foi aprovado pelo FDA, Food and

Drug Administration. Devido sua capacidade de formao de uma camada protetora, o

PEG pode diminuir a taxa de rejeio de materiais em sistemas biolgicos em humanos.

Devido s suas propriedades, o PEG tem uma srie de aplicaes farmacuticas, biolgicas

e bioqumicas. Ele pode formar um composto ativado PEG-protena que mantm a protena

ativa e diminui consideravelmente a reao imune, alm de aumentar o tempo de vida de

soros sangneos. Ele pode ser ligado tambm a superfcies, formando uma camada

protetora e biocompatvel, para ser empregado em aparelhos de diagnsticos, substituio

26

de artrias e dispositivos relacionados a sangue. O PEG protetor pode ser usado tambm

para evitar a adsoro de protenas em anlises bioqumicas de eletroforese por zona

capilar, que uma importante tcnica analtica empregada em bioqumica. Alm disso, o

PEG pode ser usado com lipossomas para a liberao controlada e distribuio seletiva de

medicamentos, pois os lipossomas sem o PEG podem ser rapidamente atacados e

eliminados do corpo humano, sem cumprir a sua funo. Por ser solvel em muitos

solventes orgnicos, o PEG pode ser utilizado para solubilizar enzimas neste meio sem

desnatur-las atravs da formao de uma camada protetora. Alm disso, compostos

insolveis em gua podem tornar-se solveis quando ligados ao PEG, como por exemplo

substratos de enzimas, cofatores, corantes, etc. (HARRIS, 1992).

2.4.2.5. Recuperao de Sais e Polmeros

A possibilidade de reutilizao dos constituintes das fases deve ser considerada ao

se efetuar o scale up pois os custos dos componentes das fases aumentam linearmente

com a escala de produo (KRONER et al., 1982).

A reciclagem de PEG pode ser facilmente integrada ao processo, chegando a nveis

de recuperao em torno de 90 a 95% (HUSTEDT et al.,1988). As tcnicas de recuperao

de PEG mais usadas so a ultrafiltrao e a extrao com solvente orgnico seguida de

evaporao (COIMBRA, 1995).

O descarte de sais geralmente mais problemtico. Em sistemas contendo clulas,

cido nucleico, protenas solveis e insolveis, a separao de sais da fase primria por

tcnicas de separao mecnica, tais como a centrifugao ou ultrafiltrao muito difcil

de ser conduzida eficientemente. A eletrodilise considerada um mtodo geral para a

reciclagem de sais e para a dessalinizao da fase rica em PEG (HUSTEDT et al., 1988).

Sais tambm podem ser recuperados usando uma mistura lcool aliftico-sal-gua.

Especificamente para a separao de fosfato de potssio, um resfriamento abaixo de 60 C

provoca a precipitao do sal, possibilitando a sua reutilizao (PAPAMICHAEL et al.,

1992, COIMBRA,1995).

GREVE & KULA (1991) recentemente estudaram maneiras de reciclar a fase

fosfato desses sistemas para minimizar a poluio ambiental. A reciclagem da fase fosfato

foi obtida pela sua separao atravs do uso de lcoois. O PEG da fase do topo rica em

27

PEG pode tambm ser reciclado, como pode ser visto em alguns trabalhos de KULA E

HUSTEDT, principalmente.

2.4.3. Teoria de Formao das Fases

Existem diversos modelos e teorias para a formao dos sistemas de duas

fases aquosas que tentam prever a curva binodal dos sistemas polmero-polmero e

polmero-sal. A existncia de tantos modelos deve-se ao pouco conhecimento das misturas

lquido-lquido, principalmente de polmeros e solues eletrolticas. Na realidade no

existe, at o momento, uma boa compreenso das teorias de misturas de lquidos.

(CABEZAS Jr, 1996)

A grande maioria dos modelos est contida em dois grupos bsicos: um

grupo baseado na teoria da soluo de polmeros, e outro grupo com teorias adaptadas dos

tratamentos termodinmicos do equilbrio de fase lquida. Dentro desses dois grupos, a

modelagem de formao das fases pode ser dividida em quatro tipos: modelos baseados em

expanso virial osmtica; modelos baseados na extenso da teoria de Flory-Huggins;

modelos incorporando a teoria da equao integral como principal elemento; modelos que

no se encaixam em nenhuma destas categorias, como o modelo de volume excludo.

Existe ainda, o modelo Pitzer que o mais aplicvel para os sistemas polmero-sal. No caso

dos sistemas polmero-sal, ainda no existem muitas teorias que se apliquem bem a este

tipo de sistema, pois a maioria no considera o efeito dos eletrlitos nas solues, levando a

um erro na modelagem da formao das fases. Alm disso, o estudo de tais sistemas ainda

muito recente (CABEZAS Jr, 1996, WU et al, 1996, WALTER et al. 1991).

As condies utilizadas para a modelagem da formao das duas fases so a

igualdade dos potenciais qumicos de cada componente (o solvente, a gua, e os solutos, o

polmero ou sal) nas duas fases aquosas e o balano de massa de cada componente, ambos

aps o equilbrio entre as fases (CABEZAS Jr, 1996).

O modelo de expanso virial osmtico ficou mais conhecido com o

desenvolvimento do trabalho de Edmond e Ogston. O equacionamento matemtico e a

interpretao fsica dos parmetros do modelo no so complicados. Existem dois tipos

diferentes de expanso virial osmtica: uma a teoria de McMillan - Mayer e a outra a

teoria de Hill. Na teoria de McMillan - Mayer, o solvente tratado como uma substncia

sem caractersticas especiais, e, portanto considera-se somente a interao entre as

28

molculas do soluto, simplificando muito os mecanismos estatsticos do problema. Porm,

aqui existe a necessidade de correo da presso pois como o solvente no importante, o

seu potencial qumico deve ser constante e independente do soluto e portanto a presso no

pode ser constante. Logo, para se utilizar esse modelo em condio de presso constante,

deve-se acrescentar a presso osmtica da soluo. J a teoria de Hill no considera o

solvente como uma substncia secundria e por isso os potenciais qumicos dos

componentes podem ser determinados em temperatura e presso constantes (CABEZAS Jr,

1996).

A teoria da trelia uma idia de modelagem macromolecular de misturas lquidas

em termos de uma trelia de cristal. A idia principal que em uma trelia as

macromolculas e as molculas pequenas podem se distribuir e redistribuir at que todos os

arranjos ou configuraes possam ser estudados. Basicamente um estudo estatstico de

como essas molculas podem ser arranjadas. A teoria de Flory-Huggins utiliza-se destes

princpios. a mais utilizada em sistemas polmero-polmero, chegando a oferecer uma

tima aproximao da curva binodal. A sua grande vantagem em relao a outras teorias a

simplicidade aliada qualidade de suas previses e correlaes da formao de fases. Nesse

modelo o sistema representado por uma trelia tridimensional, onde cada lado

preenchido com uma molcula de solvente ou um segmento de um dos polmeros. O

problema bsico obter a expresso da energia livre de Gibbs de mistura. Existem

tentativas de adaptar esta teoria para os sistemas polmero-sal, porm estes modelos ainda

no esto muito ajustados para a formao de fases neste tipo de sistema (CABEZAS Jr,

1996, WALTER et al, 1991, BROOKS et al., 1985, WU et al., 1996).

Outra teoria muito utilizada nos sistemas polmero-polmero, para modelar a curva

binodal, a do volume excludo, baseada em argumentos estatsticos e geomtricos: as duas

fases esto saturadas com cada polmero, ou seja, todo o volume est ocupado pelas

molculas dos dois polmeros e da gua de hidratao; a concentrao de cada polmero em

cada fase determinada pela quantidade de molculas de cada polmero ajustado no

volume da fase.

A teoria geomtrica estatstica aplicada em sistemas polmero-polmero considera as

seguintes hipteses: as molculas da mesma espcie esto distribudas randomicamente na

fase homognea; a estrutura da soluo est geometricamente saturada em termos de

tamanho e forma de todas as molculas do sistema; a existncia de interaes moleculares

29

no muda a natureza da distribuio molecular. A formao das duas fases explicada da

seguinte forma: na situao monofsica, as molculas do soluto esto separadas e as

molculas adicionais de soluto ainda podem ser inseridas no espao livre que existe. No

ponto de separao de fase, as molculas do soluto esto bem prximas umas das outras e a

soluo no aceita mais molculas adicionais de soluto. Quando a concentrao total do

soluto aumenta, ocorre a formao de duas solues geometricamente saturadas e

estruturalmente diferentes(GUAN et al., 1994).

A teoria de Debye-Huckel a mais adequada para os sistemas que contm solues

com cargas, como o caso dos sistemas polmero-sal ou sistemas polmero-polmero com

sais. Essa teoria leva em considerao a distribuio dos ons na soluo para o clculo de

potencial qumico e mais utilizada em solues com concentrao inica at 0,1 M, de

onde se obtm timos resultados. medida que a concentrao inica aumenta, o desvio

entre os resultados tericos e experimentais aumenta. Isso ocorre porque a teoria precisa

apenas para solues diludas, onde o comportamento eletrosttico domina. Em solues

concentradas, o comportamento eletrosttico reduzido devido presena de muitos ons

que tendem a isolar as cargas eletrostticas entre si (CABEZAS Jr, 1996).

O modelo virial de Pitzer um modelo que pode ser aplicado com sucesso em

sistemas polmero-sal. Ele utiliza o excesso de energia livre de Gibbs nos sistemas

polmero-sal, combinando os parmetros eletrostticos com a equao virial. Esse modelo

uma extenso do modelo de Debye-Huckel, pois alm das interaes eletrostticas,

considera-se o efeito da fora inica. Com a utilizao do termo da equao virial, o

modelo leva em considerao tambm os solutos no-eletrlitos, como o caso dos

polmeros, o que faz com que ele se adapte melhor aos sistemas polmero-sal (WU et al.,

1996).

2.4.3.1. Tempo de Separao das Fases

O tempo de separao das fases aps a mistura dos componentes depende do tipo de

sistema. Sistemas contendo PEG/sal possuem um tempo de separao das fases muito

menor que os sistemas PEG/dextrana devido densidade e viscosidade do sistema. Em

sistemas dextrana/ficoll, o tempo varia de 1 a 6 horas pela ao da gravidade, enquanto em

sistemas PEG/dextrana esse valor cai para 5 a 30 minutos, dependendo da concentrao e

30

do peso molecular dos polmeros. Nos sistemas PEG/fosfato, o tempo de separao entre as

fases inferior a 5 minutos (COIMBRA, 1995).

Outro fator que tambm influencia o tempo de separao a velocidade de

coalescncia das pequenas bolhas que se formam durante a agitao. Quando se agita um

sistema de fases de maneira a uniformiz-lo, inicialmente ocorre a formao de pequenas

regies ricas em cada componente. Com o tempo, essas regies aumentam e separam-se em

duas regies distintas (BAMBERGER et al, 1985).

A posio em relao ao ponto crtico tambm exerce influncia no tempo de

separao das fases. Nos sistemas prximos ao ponto crtico, o tempo de separao maior

devido a uma pequena diferena de densidade. J no caso dos sistemas muito distantes do

ponto crtico, a viscosidade aumenta devido ao aumento da concentrao do polmero,

tornando a separao de fases mais lenta.

2.4.3.2. Fatores que Influenciam no Sistema de Fases

Os principais fatores que influenciam no sistema de fases e

conseqentemente alteram o diagrama de fases so: peso molecular do polmero,

concentrao dos componentes do sistema e temperatura.

Quanto maior o peso molecular do polmero, menor a concentrao

necessria para a formao de duas fases. Isso significa que a curva binodal desloca-se no

sentido da regio monofsica medida que o peso molecular do polmero aumenta. Para

um sistema polmero-polmero (PEG/dextrana, por exemplo) a curva binodal torna-se cada

vez mais assimtrica a medida que a diferena entre os pesos moleculares dos polmeros

aumenta. O peso molecular do polmero afeta tambm o tempo de separao das fases, mas

tal problema pode ser minimizado pela centrifugao do sistema aps a mistura das fases

(ALBERTSSON, 1986, ALBERTSSON et al., 1994). A massa molecular afeta tambm o

comprimento da linha de amarrao, que tende a aumentar com o aumento da concentrao

dos polmeros (FORCINITI et al., 1991).

A concentrao dos componentes do sistema pode afetar a viscosidade e a

densidade do sistema, causando diferenas no tempo de separao das fases e na razo de

volumes.

A temperatura causa influncia no diagrama de fases, pois altera a

composio das fases no equilbrio, deslocando a curva binodal, e modificando tambm o

31

comprimento da linha de amarrao. Em geral, o comprimento da linha de amarrao

diminui com o aumento de temperatura. O seu efeito varia de acordo com o tipo de sistema.

No caso de sistemas PEG/dextrana, a formao das fases facilitada em temperaturas

baixas (menores que a ambiente) e para os sistemas PEG/fosfato, a situao oposta, pois

temperaturas mais altas e prximas do ambiente facilitam a separao entre as fases.

Quando o sistema est prximo ao ponto crtico, ele mais instvel devido ao

deslocamento da curva binodal, podendo atingir mais facilmente a regio monofsica. O

aumento da temperatura do sistema causa ainda, em um sistema PEG/sal, aumento na

concentrao de PEG na fase polimrica e reduo da sua concentrao na fase salina. Esse

efeito uma das razes de se trabalhar com a temperatura do sistema fixa.

O pH e o tipo de ction tambm so variveis que podem influenciar no

diagrama de fases. Diminuindo o valor do pH, as concentraes necessrias de polmero e

sal de um sistema PEG/sal aumentam, deslocando a curva binodal para a direita. Esse fato

pode ser explicado pelo aumento da razo H2PO4-/HPO42-. Para o caso do fosfato, com a

diminuio do pH, pois como o nion monovalente menos efetivo no salting out do

PEG (fenmeno de expulso devido ao tamanho do PEG), ser necessria uma

concentrao maior dos componentes para formar o sistema bifsico. No caso do tipo de

ction, a substituio de fosfato de potssio desloca a curva binodal para a direita, e

portanto a concentrao dos componentes necessria para a formao do sistema de duas

fases aumenta, sugerindo que o ction sdio mais eficiente que o ction potssio para o

efeito do salting out do PEG.

2.4.3. 3. Diagrama de Fases

A formao das duas fases aquosas depende da concentrao dos componentes do

sistema. O diagrama de fases mostra a regio monofsica e bifsica de acordo com a

concentrao de cada componente expressa em % p/p.

A curva que separa a regio de duas fases da regio de uma fase chamada curva

binodal ou curva de equilbrio. A regio acima da curva binodal chamada bifsica e

abaixo monofsica.

32

Figura 1: Exemplo de um Diagrama de Fases

A Figura 1 mostra um exemplo genrico de um diagrama de fases. A composio

inicial do sistema dada pelo ponto M e a composio final de cada fase aps atingir o

equilbrio dada pelos pontos T (fase superior ou de topo) e F (fase inferior ou de fundo).

O segmento TMF chamado de tie-line ou linha de amarrao, e todos os sistemas cuja

composio inicial est contida nessa linha possuem a mesma composio de fases aps o

equilbrio, porm com diferentes razes de volumes entre as fases: superior e inferior. J a

linha de amarrao determinada pelo ponto N define uma nova linha de amarrao que

aumentou proporcionalmente a concentrao entre as fases em relao linha de amarrao

determinada por M.

Como se pode observar, o fato de mudarmos da linha de amarrao, definida pelo

ponto M, para a linha definida pelo ponto N, variando proporcionalmente a concentrao

dos componentes das fases, no se obtm uma melhora significativa na recuperao e

purificao da protena em estudo.

%p/p PEG

%p/p Sal

M

T

F

N

33

2.4.4. Fundamentos da Partio das Protenas

Devido ateno que vem sendo dada produo de protenas pela engenharia

gentica e o desenvolvimento da tecnologia de enzimas renovaram-se os interesses pelos

processos de separao de protenas e suas descries quantitativas que servem de base

para o scale up. Os fundamentos de partio de biomolculas entre as duas fases ainda

no so totalmente compreendidos.

A tendncia de separao de fases apresentada por dois polmeros, quando

adicionados num solvente comum, ocorre porque a baixa concentrao molar dos polmeros

na soluo (tipicamente menos que 0,05 M) leva a um pequeno ganho de entropia durante a

mistura. Por outro lado, cadeias polimricas tm uma rea superficial por molcula maior

do que compostos de baixo peso molecular, tanto que as energias de interao entre dois

polmeros se sobrepem energia de Gibbs do sistema. Estes fatores levam formao de

duas fases em sistemas ternrios polmero-polmero-gua, em baixas concentraes de

polmer