Extração de ácido Indol-3-acético (AIA)

Método de quantificação: GC-MS-SIM

Referência: Chen et al. – Plant Physiol. (1988) 86:822-825.

1. Adicionar 1g do padrão interno de [13C6]-AIA em 1g de amostra.

Homogeneizar por 1 min em homogeneizador tipo Turrax, o tecido com a

solução extratora (65% isopropanol em tampão imidazol 0,2M pH 7.0). Relação

amostra: solução extratora = 1:4

2. Centrifugar a 10000 rpm por 10 min.

3. Coletar o sobrenadante e medir o volume. Dividir em duas partes: uma para

quantificação de AIA livre e outra para AIA conjugado.

4. Para a análise de AIA livre, tomar o extrato e diluir 6x com água Milli-Q para

reduzir a concentração de isopropanol para aproximadamente 10%.

5. Fazer o pré-condicionamento de um cartucho para extração em fase sólida com

resina aminopropil (Supelclean – LC-NH2 com 500mg de resina, da Supelco ou

outro equivalente) lavando sequencialmente com:

6. 2ml de hexano

7. 2ml de acetonitrila

8. 2x 2ml de água Milli-Q.

9. 2ml de tampão imidazol 0,2M pH7.0

10. 10 ml de água Milli-Q para a remoção do excesso de tampão.

11. Aplicar o extrato no cartucho pré-condicionado.

12. Após a passagem de todo o extrato pelo cartucho, lavar sequencialmente com:

2ml de hexano

2ml de acetato de etila

2ml de acetonitrila

2 ml de metanol

13. Eluir a fração contendo o AIA com 3ml de metanol contendo 2% de ácido acético

(v/v).

14. Evaporar o metanol em Speed Vac

15. Ressuspender o extrato em 100 �l de metanol 50% em água Milli-Q

16. Fracionar o extrato em HPLC (condições: coluna ODS-3 25cm x 4mm, fase

móvel 20% acetonitrila em água contendo 1% de ácido acético, fluxo de 1ml/min,

monitoramento: UV: 282nm, Fluorescência: ��excitação 280nm, � emissão

350nm. Coletar a fração correspondente ao AIA.

17. Evaporar o solvente em rotaevaporador e ressuspender o resíduo em 100�l de

metanol.

18. Metilar com 1ml de diazometano em éter por 5min a temperatura ambiente.

19. Secar o extrato metilado e ressuspender o resíduo em 100�l de acetato de etila.

20. Analisar por GC-MS-SIM.

Hidrólise do extrato para obtenção de AIA livre + AIA conjugado.

1. Evaporar o isopropanol do extrato em rotaevaporador.

2. Retornar ao mesmo volume com NaOH 1N para AIA-éster conjugado ou NaOH

7N para AIA-amida conjugado.

3. Para a hidrólise de conjugados éster incubar por 1h a temperatura ambiente.

Para a hidrólise de conjugados amida aquecer por 3h a 100oC

(preferencialmente em vial de reação)

4. Ajustar o pH do hidrolisado para 2.5 com HCl 1N.

5. Pré-condicionar um cartucho para extração em fase sólida com resina C18

(Supelclean – LC-C18 com 500mg de resina aproximadamente da Supelco ou

outro equivalente) lavando sequencialmente com:

5ml de hexano

5ml de metanol

5ml de água Milli-Q

5ml de ácido acético 1% em água.

6. Aplicar o extrato no cartucho pré-condicionado.

7. Após a passagem do extrato, lavar o cartucho com 5ml de água Milli-Q.

8. Eluir a fração contendo AIA com 2ml de acetonitrila.

9. Diluir o extrato com tampão imidazol 0,02M pH 7.0 de modo a obter uma fração

com 10% de acetonitrila.

10. Aplicar este extrato em cartucho aminopropil pré-condicionado como descrito

para a extração de AIA livre e seguir com o mesmo procedimento até a análise

por GC-MS-SIM.

11. A quantidade de AIA conjugado é obtida subtraindo o resultado da quantidade

obtida na análise do AIA livre.

Condições cromatográficas e de análise no GC-MS.

Método: AIAH1701.M

Coluna: HP1701 (30 m, 0.25 mm d.i., 50 m espessura do filme). Temp. máx. 300oC

Gás carreador: Hélio

Fluxo: 1 mL/min

Temp. Forno: 150oC por 3 min

150oC a 200oC a 4oC/min

200oC a 300oC a 10oC/min

Temp. do Injetor: 280oC

Volume injetado: 1 L

Modo de injeção: Splitless (purga 20 mL/min após 2 min)

Temp da válvula auxiliar: 180oC

Modo no MS: SIM (monitoramento dos íons a m/z 130, 136, 189, 195)

Temp da fonte de íons: 230oC

Temp do quadrupólo: 150oC

Cálculo de AIA contido na amostra:

A quantidade de hormônio livre contida na amostra pode ser calculada conforme a

equação:

Y = [(Ci / Cf) -1] x X/R

onde:

Y é a quantidade de AIA na amostra

Ci é a porcentagem inicial de m/z 136 relativa a 130+136, ou 100%

Cf é a porcentagem de m/z 136 relativa a corrente iônica total encontrada para as

massas 130 e 136

X é a quantidade de [13C6]AIA adicionada

R é a taxa da fração do AIA endógeno que tem um pico em m/z 130 em relação a

fração do padrão interno que é totalmente substituído tendo o mesmo íon com m/z 136.

Isto foi empiricamente determinado sendo 0.89 e 0,79 respectivamente, portanto, R =

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