expressão de transtirretina no sistema gastrointestinal do … · expressão de transtirretina no...

Escola Superior de Tecnologia da Sauacutede do Porto Instituto Politeacutecnico do Porto

Susete Marlene Machado Costelha

Expressatildeo de Transtirretina no Sistema Gastrointestinal do Murganho

Dissertaccedilatildeo de Mestrado em Tecnologia Bioquiacutemica em Sauacutede

Setembro de 2011


ii

ESCOLA SUPERIOR DE TECNOLOGIA DA SAUacuteDE

DO PORTO

INSTITUTO POLITEacuteCNICO DO PORTO


Expressatildeo de Transtirretina no Sistema

Gastrointestinal do Murganho

Dissertaccedilatildeo submetida agrave Escola Superior de Tecnologia da Sauacutede do Porto para cumprimento

dos requisitos necessaacuterios agrave obtenccedilatildeo do grau de Mestre em Tecnologia Bioquiacutemica em Sauacutede

realizada sob a orientaccedilatildeo cientiacutefica da Professora Doutora Maria Joatildeo Saraiva (Professora

Catedraacutetica Aacuterea das Neurociecircncias Instituto de Ciecircncias Biomeacutedicas Abel Salazar da

Universidade do Porto) e sob co-orientaccedilatildeo da Profordf Doutora Ceciacutelia Santos (Professora

Associada Aacuterea das Ciecircncias da Sauacutede Faculdade de Ciecircncias da Sauacutede da Universidade da

Beira Interior) e Profordm Doutor Ruacuteben Fernandes (Professor Adjunto Aacuterea de Bioquiacutemica

Unidade de Mecanismos Moleculares da Doenccedila do Centro de Investigaccedilatildeo em Sauacutede e

Ambiente - ESTSP e Centro de Farmacologia e Biopatologia Quiacutemica ndash FMUP)


iii

Agradecimentos

Gostaria de agradecer a todos os que de alguma forma contribuiacuteram para a realizaccedilatildeo deste

trabalho Em especial

Agrave Professora Maria Joatildeo Saraiva por me ter possibilitado os meios para a execuccedilatildeo desta

tese e por toda a orientaccedilatildeo e atenccedilatildeo que dedicou agrave mesma

Agrave Professora Ceciacutelia pela orientaccedilatildeo e por todo o apoio durante todo este tempo Pela boa

disposiccedilatildeo e enorme optimismo em relaccedilatildeo a tudo

Ao Professor Ruacuteben e Professora Cristina por terem organizado este mestrado e estarem

sempre disponiacuteveis para tudo o que fosse necessaacuterio

A todos os meus amigos do laboratoacuterio (vocecircs sabem quem satildeo) o meu muito obrigado

pelo apoio boa disposiccedilatildeo (que seria de mim sem os nossos almoccedilos) Por terem tornado

mais faacutecil todo este processo de aprendizagem e por serem sobretudo uns amigos muito

especiais

Um agradecimento especial agrave Anabela e ao Paul pela paciecircncia e dedicaccedilatildeo com que me

ajudaram sempre que necessaacuterio Eacute tudo mais faacutecil quando existem pessoas assim

Um obrigado especial agrave Paula Francisco Tacircnia Doutora Rosaacuterio Almeida e Doutora

Isabel Cardoso por toda a ajuda e apoio

Aos meus pais e avoacutes por serem as pessoas mais especiais deste mundo natildeo seria nada

sem vocecircs

Agrave minha irmatilde por ter dado um significado ainda mais especial agrave minha vida e por garantir

que todos os dias satildeo uma animaccedilatildeo Eacutes sem duacutevida uma estrela

Ao Filipe por todo o apoio dedicaccedilatildeo e amor por estar sempre ao meu lado por ser a

minha fonte de optimismo

A todos os meus amigos o meu obrigado por estarem comigo em todas as fases da minha

vida esta natildeo eacute excepccedilatildeo O meu agradecimento especial a todos voacutes


iv

Resumo

A transtirretina (TTR) eacute uma proteiacutena plasmaacutetica constituiacuteda por quatro subunidades

idecircnticas de aproximadamente 14KDa e de massa molecular de 55 KDa (Blake et al

1978)

A TTR eacute responsaacutevel pelo transporte de tiroxina (T4) (Andrea et al 1980) e retinol

(vitamina A) neste uacuteltimo tipo de transporte atraveacutes da ligaccedilatildeo agrave proteina de ligaccedilatildeo ao

retinol (RBP) (Kanai et al 1968) Eacute sintetizada principalmente pelo fiacutegado e secretada

para o sangue (Murakami et al 1987) e tambeacutem sintetizada pelas ceacutelulas epiteliais do

plexo coroacuteide e secretada para o liacutequido cefaloraquidiano (LCR) (Aleshire et al 1983)

Existem outros locais que expressam TTR mas em menor quantidade nomeadamente a

retina do olho (Martone et al 1988) o pacircncreas (Kato et al 1985) o saco vitelino

visceral (Soprano et al 1986) o intestino (Loughna et al 1995) o estocircmago coraccedilatildeo

muacutesculo e baccedilo (Soprano et al 1985) A TTR eacute uma proteiacutena do ponto de vista

filogeneacutetico extremamente conservada o que jaacute de si eacute um indicador da sua importacircncia

bioloacutegica (Richardson 2009)

O objectivo deste trabalho foi avaliar a expressatildeo de transtirretina ao longo do sistema

gastrointestinal do murganho nos seguintes oacutergatildeos esoacutefago estocircmago duodeno coacutelon e

tambeacutem bexiga com cerca de 3 meses de idade O segundo objectivo foi identificar as

ceacutelulas responsaacuteveis por essa expressatildeo nos oacutergatildeos em estudo

Foi possiacutevel verificar que apenas o estocircmago apresenta valores de expressatildeo normalizada

de TTR diferente de zero expressatildeo essa muito inferior agrave do fiacutegado tal como se esperava

Por imunohistoquiacutemicaimunofluorescecircncia foi possiacutevel determinar que as ceacutelulas que

expressam TTR satildeo pouco abundantes e estatildeo presentes na regiatildeo glandular do estocircmago

do murganho e tambeacutem do humano Para aleacutem disto verificou-se que a TTR co-localiza

com somatostatina e que as ceacutelulas que sintetizam TTR correspondem agraves ceacutelulas D

responsaacuteveis pela secreccedilatildeo de somatostatina

Palavras-chave Transtirretina Polineuropatia Familiar Amiloidoacutetica Sistema

Gastrointestinal


v

Abstract

Transthyretin (TTR) is a plasma protein composed of four identical subunits of

approximately 14 KDa and molecular mass of 55 KDa (Blake et al 1978)

TTR is responsible for the transport of thyroxine (T4) (Andrea et al 1980) and retinol

(vitamin A) by binding to the retinol binding protein (RBP) (Kanai et al 1968) It is

synthesized primarily by the liver and secreted into the blood (Murakami et al 1987) and

also synthesized by epithelial cells of the choroid plexus and secreted into the

cerebrospinal fluid (CSF) (Aleshire et al 1983) There are other sites that express TTR

but in smaller quantities namely the retina of the eye (Martone et al 1988) pancreas

(Kato et al 1985) visceral yolk sac (Soprano et al 1986) intestine (Loughna et al

1995) stomach heart muscle and spleen (Soprano et al 1985)

TTR is a highly conserved protein which from a phylogenetic standpoint is itself an

indicator of its biological importance (Richardson 2009)

The aim of this study was to evaluate the expression of transthyretin along the

gastrointestinal tract of mice (3 months old) ndash esophagus stomach duodenum colon and

bladder as well The second aim was to identify the cells responsible for this expression in

the organs under study

It was possible to verify that only the stomach showed values of normalized expression

different from zero This expression was lower than in the liver as expected

By immunohistochemistry immunofluorescence it was determined that cells expressing

TTR are present in the glandular region of the stomach of mice and also in human

stomach It was also determined that D cells responsible for secretion of somatostatin

synthesize TTR

Key-words Transthyretin Familial Amyloid Polyneuropathy Gastrointestinal Tract


vi

Iacutendice

Abreviaturas vii

Introduccedilatildeo 1

Capiacutetulo I ndash Revisatildeo Bibliograacutefica 3

1 ndash Transtirretina 4

i - Estrutura do gene da transtirretina e a sua regulaccedilatildeo 4

ii - Expressatildeo de TTR 5

iii - Estrutura da TTR 5

iv - Funccedilotildees fisioloacutegicas da TTR 7

v - Metabolismo da TTR 10

vi - Variantes da TTR 11

2 - Sistema Gastrointestinal do murganho 14

Capiacutetulo II ndash Meacutetodos 17

1- Animais 18

2 - Extracccedilatildeo de RNA total e siacutentese de cDNA 18

3 - Reacccedilatildeo em cadeia da Polimerase (PCR) de cDNA 19

4 - PCR em Tempo Real 20

5 - Imunohistoquiacutemica 20

6 - Hibridizaccedilatildeo in situ 22

Capiacutetulo III ndash Resultados 24

1 - PCR de cDNA 25



4 - Imunofluorescecircncia 29

5 - Hibridaccedilatildeo in situ 31

Capiacutetulo IV ndash Discussatildeo 32

Conclusatildeo 37

Bibliografia 39


vii

Abreviaturas

Aszlig ndash Peacuteptido szlig-amiloacuteide

Apo A1 ndash Apoliproteina A1

BSA ndash Albumina Seacuterica Bovina

cDNA ndash Aacutecido dexossiribonucleico complementar

CT ndash Treshold cycle

DEPC ndash Dietilpirocarbonato

FBS ndash Soro fetal bovino

HDL - Lipoproteina de elevada densidade

hTTR ndash Transtirretina humana

LCR ndash Liquido cefaloraquidiano

LDL ndash Lipoproteina de baixa densidade

mRNA ndash Aacutecido ribonucleico mensageiro

ORF ndash Quadro de leitura independente

mTTR ndash Transtirretina de murganho

PAF ndash Polineuropatia amiloidoacutetica familiar

PBS ndash Tampatildeo fosfato pH 75

PCR ndash Reacccedilatildeo em Cadeia da Polimerase

RBP ndash Proteina de ligaccedilatildeo ao retinol

RNA ndash Aacutecido ribonucleico

SSC ndash Tampatildeo citrato de soacutedio


viii

T3 ndash Triiodotironina

T4 ndash Tiroxina

TBG ndash Globulina de ligaccedilatildeo agrave tiroxina

TTR ndash Transtirretina

TTR KO ndash Murganho deficiente em TTR


1

Introduccedilatildeo

A descoberta da transtirretina (TTR) no plasma (Seibert and Nelson 1942) e no liacutequido

cefaloraquidiano (LCR) (Kabat et al 1942) humano ocorreu em 1942 Esta eacute uma proteiacutena

constituiacuteda por quatro subunidades idecircnticas de 14 KDa cada e com uma massa molecular

de 55 KDa (Soprano et al 1985) Eacute principalmente sintetizada pelo fiacutegado e secretada

para o sangue (Murakami et al 1987) mas tambeacutem ao niacutevel do sistema nervoso pelas

ceacutelulas epiteliais do plexo coroacuteide e secretada para o LCR (Aleshire et al 1983) Em

menor quantidade verifica-se siacutentese noutros locais meninges cerebrais (Herbert et al

1986) ceacutelulas epiteliais da retina do olho (Martone et al 1988) pacircncreas (Kato et al

1985) saco vitelino visceral (Soprano et al 1986) placenta (McKinnon et al 2005)

intestino (Loughna et al 1995) e em pequena escala no estocircmago coraccedilatildeo muacutesculo e

baccedilo (Soprano et al 1985)

Eacute uma proteiacutena que possui duas funccedilotildees principais transporta a tiroxina (Andrea et al

1980) e a vitamina A (retinol) atraveacutes da proteiacutena de ligaccedilatildeo ao retinol (RBP) (Kanai et al

1968) Os niacuteveis elevados de conservaccedilatildeo desta proteiacutena entre os mamiacuteferos e outros

vertebrados satildeo indicativos da sua importacircncia a niacutevel bioloacutegico (Richardson 2009)

Satildeo conhecidas mais de 100 mutaccedilotildees associadas a TTR com propriedades

amiloidogeacutenicas A primeira mutaccedilatildeo descrita foi associada agrave polineuropatia amiloidoacutetica

familiar (PAF) e foi identificada em 1952 por Corino de Andrade (Andrade 1952) eacute uma

patologia neurodegenerativa fatal e caracterizada pela deposiccedilatildeo de fibras de TTR mutada

principalmente no sistema nervoso perifeacuterico e autoacutenomo (Coimbra e Andrade 1971) A

sintomatologia inclui disfunccedilatildeo do sistema nervoso sensorial e autoacutenomo bem como dos

sistemas urogenital gastrointestinal e cardiacuteaco

Apesar de existirem referecircncias agrave expressatildeo de TTR no sistema gastrointestinal

desconhece-se a contribuiccedilatildeo da produccedilatildeo desta proteiacutena para a etiopatologia de PAF em

particular no que se refere agraves perturbaccedilotildees gastrointestinais observadas nesta doenccedila

Neste acircmbito os principais objectivos do presente trabalho foram (i) avaliar a expressatildeo de

transtirretina ao longo do tracto gastrointestinal ndash esoacutefago estocircmago duodeno coacutelon e

tambeacutem da bexiga de murganhos com cerca de 3 trecircs meses de idade e (ii) identificar


2

quais os locais principalmente no estocircmago e intestino onde ocorre a expressatildeo da

proteiacutena


3

Capiacutetulo I ndash Revisatildeo Bibliograacutefica


4

1 ndash Transtirretina

A proteiacutena plasmaacutetica transtirretina (TTR) foi inicialmente designada de prealbumina

devido ao facto de migrar electroforeticamente antes da albumina Foi descoberta em 1942

no plasma (Seibert e Nelson 1942) e liquido cefaloraquidiano (LCR) (Kabat et al 1942)

humano O nome desta proteiacutena resulta da sua dupla funccedilatildeo fisioloacutegica como

transportadora de tiroxina (Andrea et al 1980) e de retinol (Vitamina A) (Kanai et al

1968) atraveacutes da proteiacutena de ligaccedilatildeo ao Retinol (RBP) (Raz et al 1970)

i - Estrutura do gene da transtirretina e a sua regulaccedilatildeo

O gene da TTR estaacute localizado no cromossoma 18 mais especificamente no 18q112-q121

(Whitehead et al 1984) e a proteiacutena eacute codificada por uma simples coacutepia geneacutetica (Tsuzuki

et al 1985) O gene eacute composto por 69 kilobases (kb) e consiste em 4 exotildees (E1 a E4)

cada um com cerca de 200 pares de bases (pb) 3 introtildees (I1 a I3) uma sequecircncia TATA

box na posiccedilatildeo de -30 a -24 pb seguida de uma regiatildeo rica em GC de aproximadamente 20

pb uma sequecircncia CAAT box na posiccedilatildeo -101 a -96 pb O sinal de poliadenilaccedilatildeo

(AATAAA) encontra-se a 123 pb a jusante da regiatildeo codificante (Sasaki et al 1985) Os

introtildees I1 e I3 contecircm dois quadros de leitura independentes (ORFs) contudo a sua funccedilatildeo

eacute ainda desconhecida (Tsuzuki et al 1985) Foi sugerido que estes ORFs podiam ser

responsaacuteveis pela expressatildeo de uma sequecircncia reguladora Mais tarde foi demonstrado que

estes ORFs correspondem a transcritos de TTR que natildeo foram sujeitos a splicing ou foram

sujeitos a um splicing incompleto e que por isso natildeo satildeo expressos nem como parte de um

polipeacuteptido ou independentemente (Soares et al 2003)

Estatildeo identificados dois locais principais de regulaccedilatildeo no gene da TTR uma sequecircncia

promotora proximal de -50 a -150 pb e um enhancer distal localizado entre 16 e 25 kb a

montante da regiatildeo codificante (Costa et al 1986) As mesmas sequecircncias reguladoras

estatildeo presentes no gene humano

O cDNA de TTR no murganho apresenta 82 de homologia com o cDNA humano e 90

com o de rato A sequecircncia de aminoaacutecidos apresenta ainda maior homologia 91 com o

humano e 96 com a sequecircncia de rato (Costa et al 1986)


5

De um ponto de vista filogeneacutetico verifica-se que esta proteiacutena eacute extremamente

conservada O gene da TTR estaacute expresso nos peixes (Santos et al 1999) anfiacutebios reacutepteis

paacutessaros e ancestrais dos actuais mamiacuteferos (Richardson et al 1994)

ii - Expressatildeo de TTR

A TTR eacute expressa principalmente pelos hepatoacutecitos do fiacutegado (Murakami et al 1987) e

secretada para o sangue atingindo niacuteveis plasmaticos entre os 170 e 420 mgL (Vatassery

et al 1991) A concentraccedilatildeo plasmaacutetica de TTR eacute dependente da idade os receacutem nascidos

saudaacuteveis apresentam metade da concentraccedilatildeo encontrada nos adultos (Vahlquist et al

1975) e apoacutes os 50 anos verifica-se uma diminuiccedilatildeo dos niacuteveis desta proteiacutena (Ingenbleek

et al 1979) O fiacutegado eacute responsaacutevel pela produccedilatildeo de cerca de 90 da TTR presente no

sangue Adicionalmente a TTR eacute tambeacutem activamente sintetizada pelas ceacutelulas epiteliais

do plexo coroacuteide e secretada de forma unidireccional para o liacutequido cefaloraquidiano

(Aleshire et al 1983) Esta siacutentese representa cerca de 20 do total da proteiacutena no LCR

(Dickson et al 1986) O plexo coroacuteide apresenta os niacuteveis mais elevados de RNA

mensageiro cerca de 44 microg de mRNA por grama de peso corporal comparativamente aos

niacuteveis expressos pelo fiacutegado 030 microgg (Schreiber et al 1990)

Nos mamiacuteferos o gene da TTR eacute tambeacutem expresso nas meninges cerebrais (Herbert et al

1986) nos ilheacuteus de Langerhans do pacircncreas (Kato et al 1985) nas ceacutelulas do epiteacutelio da

retina do olho (Martone et al 1988) no saco vitelino visceral (Soprano et al 1986) na

placenta (McKinnon et al 2005) glacircndula pineal (Martone et al 1993) e em menores

quantidades no estocircmago coraccedilatildeo muacutesculo esqueleacutetico e baccedilo (Soprano et al 1985)

iii - Estrutura da TTR

A estrutura da TTR foi determinada por cristalografia de raios X em 1974 (Blake et al

1974) Eacute uma proteiacutena tetramerica constituiacuteda por quatro monoacutemeros idecircnticos distribuiacutedos

em torno de um canal central A massa molecular da proteiacutena eacute 55 KDa sendo que cada

monoacutemero tem de massa molecular 14KDa (Soprano et al 1985) e eacute constituiacutedo por 127

aminoaacutecidos (Kanda et al 1974)


6

Em 1978 foi determinada por difracccedilatildeo de raio X a estrutura secundaacuteria e terciaacuteria de

cada monoacutemero (Blake et al 1978) Verifica-se que 55 dos aminoaacutecidos de cada

monoacutemero estatildeo associados agrave formaccedilatildeo de estruturas do tipo de folha szlig e 5 estatildeo

localizados no segmento de heacutelice α Cada monoacutemero eacute constituiacutedo por 8 cadeias szlig que

datildeo origem a duas folhas de quatro cadeias cada (Blake et al 1978)

Da associaccedilatildeo de dois monoacutemeros resulta um diacutemero formado por ligaccedilotildees de hidrogeacutenio

entre as cadeias F e H de duas folhas szlig de cada monoacutemero Os dois diacutemeros associam-se

originando um tetracircmero por interacccedilotildees do tipo diacutemero-diacutemero entre os dois loops no

topo de cada cadeia (Figura 1)

Figura 1 Representaccedilatildeo da estrutura quaternaacuteria da moleacutecula de TTR (subunidade A ndash cor

azul subunidade B - cor verde subunidade C ndash cor amarela subunidade D ndash cor

vermelha) Adaptado de (Foss et al 2005)

A formaccedilatildeo especiacutefica deste tetracircmero conduz agrave existecircncia de um canal central

hidrofoacutebico que atravessa a moleacutecula (Blake et al 1978 Nilsson e Peterson 1971) onde

ocorre a ligaccedilatildeo das hormonas da tiroacuteide


7

iv - Funccedilotildees fisioloacutegicas da TTR

A TTR tem duas funccedilotildees principais transporta a tiroxina ndash T4 (353rsquo5rsquo ndash tetraiodo-L-

tiroxina) (Andrea et al 1980) e a vitamina A (retinol) atraveacutes da proteiacutena de ligaccedilatildeo ao

Retinol (RBP) (Kanai et al 1968)

Transporte das hormonas da tiroacuteide

Eacute hoje reconhecida a enorme importacircncia que as hormonas da tiroacuteide tecircm sobre o

crescimento desenvolvimento metabolismo fertilidade sistema cardiovascular e

homeostasia do sistema nervoso central (Hulbert 2000)

A glacircndula da tiroacuteide sintetiza tiroxina (T4) que sofre deionizaccedilatildeo nos tecidos alvo dando

origem agrave forma biologicamente activa desta hormona a triiodotironina (T3) (Koumlhrle 1994)

No homem apoacutes ser secretada a hormona circula associada a trecircs proteiacutenas plasmaacuteticas

transtirretina (TTR) globulina de ligaccedilatildeo agrave tiroxina e albumina (TBG) (Robbins 1991)

Embora a TBG seja a proteiacutena plasmaacutetica que existe em maior quantidade nos humanos a

TTR eacute a maior transportadora de tiroxina no plasma de roedores e no LCR quer de

roedores quer de humanos Em humanos a TTR eacute responsaacutevel pelo transporte de 15 de

T4 no plasma e 80 no LCR (Robbins 1991)

A TTR apresenta no canal central de caraacutecter hidrofoacutebico dois locais de ligaccedilatildeo para a T4

(Nilsson e Peterson 1971 Blake et al 1978) Contudo apoacutes ligaccedilatildeo de uma moleacutecula de

T4 a afinidade da TTR para a segunda moleacutecula reduz-se drasticamente fazendo com que

cada tetracircmero de TTR apenas transporte uma moleacutecula de T4 (Robbins 1991) Verifica-se

tambeacutem que devido agrave elevada afinidade para a T4 a TTR natildeo liga agrave T3 (Andrea et al

1980) Para aleacutem da funccedilatildeo de transporte esta proteiacutena parece mediar a transferecircncia da

tiroxina seacuterica para os tecidos alvo principalmente no ceacuterebro atraveacutes das barreiras

sangue-ceacuterebro e sangue-plexo coroacuteide (Schreiber et al 1990 Hagen e Solberg 1974)

(Figura 2)


8

Figura 2 Representaccedilatildeo do complexo TTR ndash tiroxina Adaptado de (Hamilton e Benson

2001)

Contudo embora os murganhos deficientes para TTR (TTR KO) apresentem diminuiccedilatildeo

dos niacuteveis de retinol e tiroxina apresentam um fenoacutetipo normal a ausecircncia de TTR natildeo

impede o transporte de tiroxina ateacute ao ceacuterebro (Palha et al 1997) bem como natildeo provoca

sinais de hipotiroidismo nem mesmo no parecircnquima cerebral (Palha et al 2000)

sugerindo a existecircncia de um mecanismo compensatoacuterio no metabolismo e transporte de

tiroxina que ocorreraacute na ausecircncia de TTR

Transporte de Retinol

O retinol tambeacutem designado de vitamina A eacute um micronutriente essencial envolvido em

inuacutemeras funccedilotildees fisioloacutegicas nomeadamente diferenciaccedilatildeo celular reproduccedilatildeo visatildeo e

desenvolvimento A TTR eacute a proteiacutena transportadora de retinol no plasma atraveacutes da

proteiacutena de ligaccedilatildeo ao retinol (RBP) (Kanai et al 1968) O RBP eacute uma proteiacutena

monomeacuterica de massa molecular de 21 kDa e consiste numa sequecircncia de 182 aminoaacutecidos

(Rask et al 1979) A ligaccedilatildeo do RBP agrave TTR aumenta a estabilidade do complexo

(Goodman 1984) e reduz os niacuteveis de filtraccedilatildeo glomerular da proteiacutena de baixo peso

molecular nos rins (Noy et al 1992) (Figura 3) O RBP previne a oxidaccedilatildeo do retinol e a

sua insolubilidade no plasma


9

Figura 3 Representaccedilatildeo do complexo TTR ndash RBP O tetracircmero de TTR (cinzento) com o

resiacuteduo 84 a amarelo e as duas moleacuteculas de ligaccedilatildeo (vermelho) e o retinol (preto)

Adaptado de (Hamilton e Benson 2001)

A concentraccedilatildeo de RBP no plasma humano eacute de cerca de 2 microM (Goodman 1984) enquanto

que a de TTR eacute de cerca de 45 microM (Ingenbleek et al 1994) e o complexo

TTRRBPRetinol estaacute presente no plasma na razatildeo de 111 (Blaner 1989)

Outras funccedilotildees da TTR

Recentemente tecircm sido descritas outras funccedilotildees importantes da TTR ao niacutevel do sistema

nervoso central Verificou-se que em animais TTR KO ocorre um aumento da actividade

exploratoacuteria e reduccedilatildeo de sinais depressivos provavelmente explicados por uma modulaccedilatildeo

do sistema noradreneacutergico (Sousa et al 2004) A TTR estaacute tambeacutem envolvida na

manutenccedilatildeo dos processos cognitivos durante o envelhecimento por actuaccedilatildeo na via de

sinalizaccedilatildeo do retinol (Brouillette et al 2008) Foi tambeacutem reportado que estes animais

apresentam niacuteveis de neuropeacuteptido Y superiores aos animais normais sendo este um

neuropeacuteptido com propriedades antidepressivas (Nunes et al 2006) A TTR tem tambeacutem

um papel importante no processo de regeneraccedilatildeo do nervo perifeacuterico in vivo apoacutes lesatildeo

(Fleming et al 2007)

Outra funccedilatildeo descrita da TTR eacute a capacidade de modular a agregaccedilatildeo do peacuteptido szlig-

amiloacuteide (Aszlig) formando complexos estaacuteveis com o Aszlig o que previne a formaccedilatildeo de

amiloacuteide (Schwarzman et al 1994) Para aleacutem disso os niacuteveis plasmaacuteticos de TTR estatildeo


10

significativamente diminuiacutedos em doentes com Alzheimer (Riisoslashen 1988 Serot et al

1997)

A TTR associa-se a lipoproteinas nomeadamente lipoproteinas de baixa densidade (LDL)

e de elevada densidade (HDL) (Tanaka et al 1994) e encontra-se tambeacutem associada agrave

apoliproteiacutena AI (apo AI) Estas observaccedilotildees sugerem uma relaccedilatildeo entre a TTR e a

biologia das lipoproteinas (Sousa et al 2000)

Para aleacutem das funccedilotildees acima descritas a TTR estaacute directamente envolvida nas fases de

resposta ao stress (Bernstein et al 1989) e em condiccedilotildees agudas de stress (Ingenbleek et

al 1994) Durante as fases de desnutriccedilatildeo ocorre uma diminuiccedilatildeo dos niacuteveis de TTR

(Ingenbleek et al 2002) O mesmo acontece durante os processos inflamatoacuterios onde se

verifica que os niacuteveis de TTR mRNA no fiacutegado decrescem (Qian et al 1995)

Outros estudos mostram a importacircncia do papel da TTR nos processos imunoloacutegicos

(Burton et al 1985) A TTR eacute capaz de inibir a secreccedilatildeo de interleucina I (Borish et al

1992) bem como estabelecer ligaccedilotildees com produtos de oxidaccedilatildeo da norepinefrina

(Boomsma et al 1991) com o aacutecido retinoacuteico (Smith et al 1994) flavonoides presentes

nas plantas (Lueprasitsakul et al 1990) contudo a importacircncia destas ligaccedilotildees natildeo eacute ainda

conhecida

v - Metabolismo da TTR

Em humanos a renovaccedilatildeo total de TTR eacute de cerca de 250-300 mgm2dia (Vahlquist et al

1973) O tempo meacutedio de vida desta proteiacutena eacute de 2 a 3 dias no ser humano (Vahlquist et

al 1973 Socolow et al 1965) e cerca de 29 horas em ratos (Dickson et al 1982) No

rato os principais locais de degradaccedilatildeo de TTR (proveniente do fiacutegado e do LCR) satildeo o

fiacutegado (36-38) o muacutesculo (12-15) e a pele (8-10) Os rins tecido adiposo testiacuteculos

e tracto gastrointestinal satildeo responsaacuteveis pela degradaccedilatildeo de cerca de 1-8 de TTR

Menos de 1 desta proteiacutena eacute degradada noutros tecidos (Makover et al 1988)

O mecanismo que conduz agrave internalizaccedilatildeo e degradaccedilatildeo de TTR ainda natildeo eacute conhecido

Alguns estudos indicam a existecircncia de um receptor responsaacutevel por mediar o transporte de

TTR para o meio intracelular (Divino e Schussler 1990 Vieira et al 1995) O receptor

designado de megalina pertencente agrave famiacutelia de receptores das lipoproteinas de baixa


11

densidade estaacute associado agrave internalizaccedilatildeo de TTR no rim prevenindo a sua filtraccedilatildeo a niacutevel

glomerular (Sousa et al 2000) A internalizaccedilatildeo de TTR ao niacutevel das ceacutelulas do fiacutegado

estaacute provavelmente associada ao metabolismo das lipoproteinas e parece ser mediada por

um receptor ainda natildeo identificado sensiacutevel para a proteiacutena RAP (Sousa et al 2001)

vi - Variantes da TTR

Ateacute agora satildeo conhecidas mais de 100 variantes de TTR com propriedades

amiloidogeacutenicas (httpamyloidosismutationscom) Haacute excepccedilatildeo de uma variante que

resulta de uma deleccedilatildeo de um aminoaacutecido na posiccedilatildeo 122 todas a outras resultam de

mutaccedilotildees pontuais na cadeia polipeptiacutedica

Satildeo conhecidas inuacutemeras mutaccedilotildees no gene de TTR sem qualquer manifestaccedilatildeo cliacutenica

um exemplo desta situaccedilatildeo eacute a mutaccedilatildeo Gly6Ser presente em 12 da populaccedilatildeo

caucasiana podendo por isso ser considerada um polimorfismo (Jacobson et al 1995)

Outras tecircm efeitos protectores como eacute o caso da mutaccedilatildeo Thr119Met esta forma de TTR

apresenta um aumento da afinidade de ligaccedilatildeo agrave T4 in vitro (Almeida et al 1997) e uma

maior capacidade de resistir agrave formaccedilatildeo de amiloacuteide (McCutchen et al 1995)

A maioria destas mutaccedilotildees conduz a situaccedilotildees de neuropatias perifeacutericas mas tambeacutem a

cardiomiopatias siacutendrome do tuacutenel caacuterpico e viacutetreopatia As mutaccedilotildees Leu55Pro e

Leu12Pro provocam quadros mais severos de doenccedila e aparecem mais precocemente As

diferenccedilas resultam muito provavelmente da instabilidade conformacional da proteiacutena

mutada (Brett et al 1999 Jacobson et al 1992) Algumas mutaccedilotildees no gene da TTR

resultam num grupo heterogeacuteneo de doenccedilas designadas por amiloidoses hereditaacuterias Em

1952 Corino de Andrade identificou a primeira forma destas doenccedilas e designou-a de

polineurapatia amiloidoacutetica familiar (PAF) (Andrade 1952) PAF eacute uma doenccedila

neurodegenerativa fatal caracterizada pela deposiccedilatildeo extracelular de fibras de TTR mutada

principalmente nos nervos e gacircnglios do sistema nervoso perifeacuterico e autoacutenomo (Coimbra

e Andrade 1971) A forma mais comum de PAF (nos doentes portugueses) resulta da

substituiccedilatildeo de uma valina por uma metionina na posiccedilatildeo 30 do gene da TTR (Val30Met)

(Saraiva et al 1984) Na regiatildeo de Portugal onde a doenccedila eacute mais comum a frequecircncia

desta mutaccedilatildeo estaacute estimada em 1 para 625 (Alves et al 1997) Para aleacutem do norte de

Portugal existem outros locais do mundo onde surgem doentes com PAF com a mutaccedilatildeo


12

Val30Met nomeadamente no Norte da Sueacutecia Japatildeo e Maiorca (Andersson 1970 Ando

et al 2000 Munar-Queacutes et al 1988)

De salientar tambeacutem que em alguns casos quando surge uma mutaccedilatildeo patogeacutenica e outra

natildeo patogeacutenica esta uacuteltima parece ter um efeito protector contra o desenvolvimento de

PAF (Coelho et al 1996) Eacute de notar tambeacutem que a TTR normal tem pouca tendecircncia a

depositar-se sobre a forma de fibras de amiloacuteide e a acontecer ocorre preferencialmente

no coraccedilatildeo numa patologia designada de amiloidose sisteacutemica senil em doentes muito

idosos (Westermark et al 1990)

Alguns estudos apontam no sentido do potencial amiloidogeacutenico da TTR resultar das

fracas interacccedilotildees entre as subunidades desta proteiacutena O tetracircmero de TTR na forma

mutada eacute pouco estaacutevel ocorrendo a dissociaccedilatildeo do mesmo em monoacutemeros com elevada

tendecircncia para se agregarem originando assim fibras de amiloacuteide insoluacuteveis (Quintas et

al 2001)

In vivo a formaccedilatildeo de amiloacuteide parece depender de outros factores para aleacutem do potencial

amiloidogeacutenico da proteiacutena (Cardoso et al 2008) Os depoacutesitos de amiloacuteide natildeo satildeo

constituiacutedos apenas por monoacutemeros de TTR mas tambeacutem por outros componentes

nomeadamente (i) componente amiloacuteide P seacuterico (Pepys 1988) (ii) glicosaminoglicanos

sulfonados (Snow et al 1987) (iii) apolipoproteina E (Gallo et al 1994) e J (Choi-Miura

et al 1992) (iv) α1-antiquimiotripsina (Abraham et al 1988) (v) componentes da

membrana ndash fibronectina laminina e colageacuteneo tipo IV (Scott et al 1983) (vi) proteiacutenas

complementares (Rogers et al 1992) e (vii) iotildees metaacutelicos (Bush et al 1994)

Os depoacutesitos de amiloacuteide podem ser facilmente identificados por coloraccedilatildeo de vermelho de

Congo observados com luz polarizada A existecircncia de depoacutesitos provoca birrrefringecircncia

de cor verde (figura 4) A acumulaccedilatildeo de fibras de amiloacuteide nos tecidos provoca danos

estruturais e funcionais nos mesmos


13

Figura 4 Deposiccedilatildeo de TTR no nervo perifeacuterico de um doente PAF (A)

Imunohistoquiacutemica para TTR (B) Coloraccedilatildeo de Congo red Adaptado de (Sousa et al

2001)

Sintomatologia de PAF

Os sintomas cliacutenicos de PAF surgem na terceiraquarta deacutecada de vida do indiviacuteduo Os

sintomas iniciais estatildeo associados a uma disfunccedilatildeo do sistema nervoso sensorial e

autoacutenomo e incluem a perda de sensaccedilatildeo de dor e de temperatura nas extremidades

corporais Eacute uma doenccedila que afecta sobretudo o sistema nervoso perifeacuterico (Sousa e

Saraiva 2003) mas tambeacutem os sistemas urogenital gastrointestinal e coraccedilatildeo

No sistema urogenital surgem sintomas de disfunccedilatildeo ereacutectil e do sistema excretor que se

traduzem por uma urgecircncia em urinar e ao mesmo tempo em dificuldade na micccedilatildeo O

mecanismo responsaacutevel por esta disfunccedilatildeo do sistema excretor parece envolver os nervos

aferentes somaacuteticos e poacutes-ganglionares colineacutergicos (Ito et al 2006) Com o evoluir da

doenccedila surgem tambeacutem sintomas de disfunccedilatildeo renal (Ando et al 1993)

O sistema gastrointestinal eacute extremamente afectado em PAF As fibras de amiloacuteide surgem

em torno dos plexos mienteacutericos em muito maior quantidade do que em outro tipo de

amiloidose (Yoshimatsu et al 1998) No esoacutefago ocorre uma diminuiccedilatildeo dos movimentos

peristaacutelticos e um relaxamento anormal do esfiacutencter esofaacuteg ico inferior (Bjerle et al 1993)

Foi tambeacutem reportado que doentes com PAF apresentam um nuacutemero reduzido de ceacutelulas

endoacutecrinas que secretam serotonina colecistoquinina gastrina e secretina no duodeno o

que pode provocar uma desregulaccedilatildeo neuro-endoacutecrina responsaacutevel pela diminuiccedilatildeo da

motilidade intestinal (El-Salhy et al 1994) As perturbaccedilotildees no tracircnsito intestinal satildeo


14

muito comuns tanto a diarreia como a obstipaccedilatildeo podem surgir em alternacircncia no mesmo

paciente A diarreia parece resultar de um crescimento bacteriano excessivo associado agrave

reduccedilatildeo da motilidade (Feurle 1987) e agrave reduccedilatildeo da absorccedilatildeo dos aacutecidos biliares (Suhr et

al 1992) A obstipaccedilatildeo parece estar associada ao fenoacutemeno de neuropatia enteacuterica (Ito et

al 2006) bem como a uma diminuiccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas endoacutecrinas no intestino

grosso tal como jaacute tinha sido proposto para o intestino delgado (El-Salhy e Suhr 1996)

Ateacute ao momento o uacutenico tratamento para a PAF passa pelo transplante de fiacutegado que

elimina a produccedilatildeo de TTR mutada no fiacutegado e reduz drasticamente os seus niacuteveis no

plasma dos doentes (Holmgren et al 1991) Apoacutes o transplante ocorre uma melhoria

cliacutenica muito significativa na funccedilatildeo autoacutenoma bem como ao niacutevel dos sintomas

gastrointestinais O transplante deve ser realizado o mais cedo possiacutevel apoacutes o iniacutecio dos

primeiros sintomas cliacutenicos se possiacutevel logo no primeiro ano (Holmgren et al 1991)

2 - Sistema Gastrointestinal do murganho

O sistema gastrointestinal do murganho eacute similar ao dos restantes mamiacuteferos agrave excepccedilatildeo

dos ruminantes e consiste no esoacutefago estocircmago duodeno jejuno iacuteleo ceco coacutelon e

recto

O estocircmago encontra-se dividido em duas aacutereas distintas uma zona glandular e outra natildeo

glandular (Figura 5)


15

Figura 5 Histologia do estocircmago A ndash Zona glandular B ndash Zona natildeo glandular

Todo o aparelho gastrointestinal desde o estocircmago ao coacutelon possui inuacutemeras ceacutelulas

endoacutecrinas As ceacutelulas enteroendoacutecrinas constituem cerca de 1 das ceacutelulas epiteliais

presentes neste sistema e encontram-se rodeadas pelas ceacutelulas parietais ceacutelulas principais e

ceacutelulas produtoras de muco no estocircmago Ao niacutevel do intestino para aleacutem das ceacutelulas

enteroendoacutecrinas existem tambeacutem ceacutelulas de goblet enteroacutecitos e ceacutelulas de Paneth (May e

Kaestner 2010) (Figura 6)

Figura 6 Ilustraccedilatildeo dos principais tipos de ceacutelulas presentes no epiteacutelio gastrointestinal

Adaptado de (May e Kaestner 2010)

Submucosa

A

A

B

Epiteacutelio secretor


Muscular

Muscular

Junccedilatildeo

esoacutefago

gaacutestrica

Enteroacutecitos

Ceacutelulas de Goblet

Ceacutelulas Endoacutecrinas

Ceacutelulas Estaminais

Ceacutelulas de Paneth

IntestinoEstocircmago

Ceacutelulas produtoras de muco

Ceacutelulas Principais

Ceacutelulas endoacutecrinas

Ceacutelulas Parietais


16

Existem pelo menos 15 tipos diferentes de ceacutelulas enteroendoacutecrinas classificadas de

acordo com o tipo de produtos hormonais e da ultraestrutura dos gracircnulos secretores (Rindi

et al 2004) Cada ceacutelula enteroendoacutecrina pode secretar uma ou mais hormonas bem como

substacircncias semelhantes a hormonas directamente para a lacircmina proacutepria do orgatildeo em

questatildeo e ser difundida ateacute aos capilares Essas hormonas incluem a gastrina histamina

serotonina colecistoquina somatostatina e peacuteptidos semelhantes ao glucagon (Rindi et al

2004) Embora estas ceacutelulas estejam presentes em pequena quantidade regulam a digestatildeo

a motilidade intestinal o apetite e o metabolismo (May e Kaestner 2010)


17

Capiacutetulo II ndash Meacutetodos


18

1- Animais

Foram utilizados murganhos de background geneacutetico Sv129 e murganhos knockout para a

TTR (Episkopou et al 1993) Toda a manipulaccedilatildeo animal decorreu de acordo com as

directrizes e regras estipuladas pela Uniatildeo Nacional e Europeia para os cuidados e

manipulaccedilatildeo de animais de laboratoacuterio (Directiva 201063EU) Os animais foram

instalados em gaiolas apropriadas com uma temperatura ambiente constante (22ordmC) e um

fotoperiacuteodo de 12h de luz 12h de ausecircncia de luz A aacutegua e raccedilatildeo foram disponibilizadas

ad libitium Toda a manipulaccedilatildeo animal decorreu de forma a minimizar a dor e stress dos

animais envolvidos na experiecircncia bem como o nuacutemero de animais utilizados

A recolha de tecidos ocorreu apoacutes os animais serem anestesiados com uma mistura de

1mgKg de medetomidina (Sededorm) e 75 mgKg de ketamina (Clorketam 100)

Foram recolhidos os seguintes oacutergatildeos esoacutefago estocircmago duodeno coacutelon fiacutegado ceacuterebro

e bexiga Metade de cada oacutergatildeo foi imediatamente fixado em formalina neutra tamponada

e posteriormente os tecidos foram processados e incluiacutedos em parafina Apoacutes inclusatildeo os

tecidos foram cortados em secccedilotildees de 5 microm A outra metade foi imediatamente congelada

em gelo seco e mantida a -80ordmC ateacute ser usado

2 - Extracccedilatildeo de RNA total e siacutentese de cDNA

O RNA (aacutecido ribonucleico) total foi extraiacutedo de cada oacutergatildeo apoacutes homogeneizaccedilatildeo com

Reagente TRIzol (Invitrogen) de acordo com as instruccedilotildees do fabricante Foram usados

dois sistemas de homogeneizaccedilatildeo manual e com ultra turax (modelo VDI12 VWR) A

avaliaccedilatildeo quantitativa e qualitativa do RNA extraiacutedo foi realizada por espectrometria

(Nanodrop) e por electroforese em gel de agarose com brometo de etiacutedeo (Sigma)

A siacutentese de cDNA foi feita a partir de 1 microg de RNA total de cada uma das amostras A

esta quantidade de RNA foram adicionados 50 ng microl de Random hexacircmeros (Invitrogen)

10 mM de dNTP (dATP dCTP dGTP dTTP) e aacutegua ateacute perfazer um volume de reacccedilatildeo

de 10 microl As amostras foram incubadas a 65ordmC durante 5 minutos para ocorrer

desnaturaccedilatildeo De seguida foram colocadas sobre o gelo durante 1 minuto para manter a

desnaturaccedilatildeo das cadeias de RNA Apoacutes arrefecimento foi adicionado a cada volume de

reacccedilatildeo 10X RT buffer (Invitrogen) 25 mM de MgCl2 (Fermentas) 01M DTT


19

(invitrogen) e 40 U microl de RnaseOUT (invitrogen) Procedeu-se a uma incubaccedilatildeo a 25ordmC

durante 2 minutos e adicionou-se a cada tubo 50U de Superscripst II (Invitrogen)

Procedeu-se a trecircs ciclos de incubaccedilatildeo no primeiro as amostras foram mantidas a 25ordmC

durante 10 minutos no segundo foram mantidas a 42ordmC durante 50 minutos durante estes

dois ciclos ocorreu siacutentese de cDNA no terceiro ciclo as amostras foram mantidas a 70ordmC

durante 15 minutos ocorrendo assim a reacccedilatildeo de terminaccedilatildeo Apoacutes o uacuteltimo ciclo

procedeu-se ao arrefecimento em gelo Adicionou-se ainda a cada tubo 2U de RNase H

(New England Biolabs) e fez-se um uacuteltimo ciclo de aquecimento a 37ordmC durante 20

minutos para remover todo o RNA natildeo convertido em cDNA Apoacutes arrefecimento as

amostras foram conservadas a -80ordmC

3 - Reacccedilatildeo em cadeia da Polimerase (PCR) de cDNA

As sequecircncias de primers utilizadas foram desenhadas pelo Laboratoacuterio e satildeo as seguintes

gene de estudo ndash mTTR 5rsquoCCTTTGCCTCGCTGGACTGGTAT 3rsquo (sequecircncia sense) e 5rsquo

AATTCTGGGGGTTGCTGACGACA 3rsquo (sequecircncia antisense) gene de referecircncia ndash

HPRT (Hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase) 5rsquo

GTAATGATCAGTCAACGGGGGAC 3rsquo (sequecircncia sense) e 5rsquo

CCAGCAAGCTTGCAACCTTAACCA 3 rsquo(sequecircncia antisense) O gene de estudo

conduz a uma banda de 419 e o de referecircncia a uma banda de 177 pares de bases Para um

volume de reacccedilatildeo de 50 microl por amostra foram utilizados 3 microl de cDNA 5 microl de 10X Taq

Buffer (Fermentas) 3 microl de Mgcl2 a 25 mM (Fermentas) 1 microl de dNTPs a 10mM

(Fermentas) 1 microl de cada um dos primers agrave concentraccedilatildeo de 10 OD 025 microl de Taq

Polimerase (Fermentas) O volume foi completado com aacutegua esteacuteril

A reacccedilatildeo de amplificaccedilatildeo ocorreu num termociclador (STRATAGENE) desnaturaccedilatildeo

inicial a 95ordmC durante 5 min 40 ciclos onde ocorreu uma desnaturaccedilatildeo a 95ordmC durante 30 s

um emparelhamento a 55ordmC durante 1 min e uma extensatildeo a 72ordmC durante 1min e 30 s (por

ciclo) e finalmente uma extensatildeo final a 72ordmC durante 6 min

Apoacutes adiccedilatildeo de loading buffer a cada amostra foi realizada uma electroforese em gel de

agarose a 2 com brometo de etiacutedeo (Sigma)


20

4 - PCR em Tempo Real

Os primers utilizados foram desenhados usando o software Beacon gene de estudo -

mTTR 5rsquo-AGCCCTTTGCCTCTGGGAAGAC-3rsquo (sequecircncia sense) e 5rsquo-

TGCGATGGTGTAGTGGCGATGG-3rsquo (sequecircncia antisense) gene de referecircncia ndash 18S

5rsquo- AAATCAGTTATGGTTCCTTTGGTC-3rsquo (sequecircncia sense) e 5rsquo-

GCTCTAGAATTACCACAGTTATCCAA-3rsquo (sequecircncia antisense)

Os primers sense e antisense emparelham em diferentes exotildees O PCR em tempo real foi

executado num termociclador IQ5 (Bio-Rad Laboratories Hercules CA USA) Para um

volume final de reacccedilatildeo de 20 microl adicionou-se 10 microl de SYBR Green master mix (Bio-

Rad) 025 microl de cada primer de mTTR a 20 mM e 030 microl de cada primer de 18S a 10mM

1 microl de cada amostra de cDNA diluiacuteda num factor de 110 e aacutegua esteacuteril As condiccedilotildees

estabelecidas para o PCR foram desnaturaccedilatildeo inicial a 95ordmC durante 10 segundos seguido

de 40 ciclos a 95ordmC durante 15 segundos e de 20 segundos a 60ordmC (temperatura de

hibridaccedilatildeo) A mediccedilatildeo do produto fluorescente ocorreu num uacutenico modo de aquisiccedilatildeo a

72ordmC apoacutes cada ciclo

As curvas de calibraccedilatildeo do gene de estudo e do gene de referecircncia foram efectuadas

usando um conjunto de diluiccedilotildees seriadas de factor 14 em triplicado Foram aceites os

valores de eficiecircncia compreendidos entre 90 e 105 Os controlos negativos (onde se

substituiu cDNA por aacutegua esteacuteril) foram feitos para cada conjunto de reacccedilotildees Procedeu-

se agrave quantificaccedilatildeo da expressatildeo do gene de mTTR pelo meacutetodo de ΔCT (threshold cycle)

usando um gene de referecircncia Os resultados foram apresentados em unidades arbitraacuterias e

correspondem agrave meacutedia plusmn desvio padratildeo Os grupos de orgatildeos em estudo foram comparados

atraveacutes da utilizaccedilatildeo do teste t Studentrsquos Os resultados foram considerados

estatisticamente significantes quando plt 005 plt 001 e plt 0001

5 - Imunohistoquiacutemica

As secccedilotildees dos diferentes tecidos recolhidos foram analisados quanto agrave expressatildeo de TTR

utilizando para isso um anticorpo produzido em coelho contra TTR recombinante de

ratinho ndash mTTR - (11500 Q-Biogen llkirch Cedex France) e tambeacutem quanto agrave expressatildeo

de cromogranina A (1400 Abcam Cambridge UK) As secccedilotildees dos tecidos dos animais

TTR KO (TTR --) funcionaram como controlos negativos de toda a anaacutelise histoquiacutemica


21

Os procedimentos para a imunohistoquiacutemica envolveram a desparafinizaccedilatildeo de cerca de 30

min em Histoclear (National Diagnostics) hidrataccedilatildeo dos tecidos a partir de uma seacuterie

decrescente de aacutelcoois (100 - 90 - 80 -70 as lacircminas permaneceram 10 min em

cada aacutelcool) apoacutes hidrataccedilatildeo os tecidos foram imersos em tampatildeo fosfato a pH 75 (PBS)

A actividade da peroxidase endoacutegena foi bloqueada com uma soluccedilatildeo de 3 de H2O2 em

PBS De seguida procedeu-se agrave incubaccedilatildeo dos tecidos com um tampatildeo de bloqueio

contendo 1 de albumina seacuterica bovina (BSA) e 4 de soro fetal bovino (FBS) em PBS

durante 1h agrave temperatura ambiente O anticorpo primaacuterio foi diluiacutedo no mesmo tampatildeo de

bloqueio e a incubaccedilatildeo ocorreu durante toda a noite a 4ordmC Apoacutes lavagens em PBS

procedeu-se agrave incubaccedilatildeo das lacircminas com o anticorpo secundaacuterio ndash anti-coelho IgG

(Sigma St Louis MO USA) 1h agrave temperatura ambiente e posteriormente com

Extravidina peroxidade (Sigma) nas mesmas condiccedilotildees Como substrato de cor foi

utilizada a diaminobenzidina (DAB ndash Sigma) e como contrastante nuclear uma soluccedilatildeo de

hematoxilina modificada segundo Gill II (Merck) Apoacutes lavagem em aacutegua corrente

procedeu-se agrave desidrataccedilatildeo dos tecidos a partir de uma seacuterie crescente de aacutelcoois (70 -

80 - 90 - 100) De seguida as lacircminas foram colocadas novamente em histoclear

durante cerca de 30 min e finalmente foram montadas utilizando para isso meio de

montagem natildeo aquoso ndash Entellan (Merck)

Para a teacutecnica de imunofluorescecircncia foram utilizadas secccedilotildees dos tecidos dos animais em

estudo e estocircmago humano (cedido pelo Laboratoacuterio de Histologia do Centro de

Investigaccedilatildeo em Ciecircncias da Sauacutede da Universidade da Beira Interior) Procedeu-se a uma

dupla marcaccedilatildeo destas secccedilotildees utilizando os seguintes conjuntos de anticorpos anti-

mTTR (11500) com anti-Somatostatina (150 Santa Cruz Biotechnology Santa Cruz CA

USA) ou com anti-Beta ATPase de hidrogeacutenio e potaacutessio (150 Abcam Cambridge UK)

No tecido humano apenas se realizou uma dupla marcaccedilatildeo com um anticorpo anti

prealbumina humana (1 200 Dako Denmark) e o anticorpo anti-Somatostanina jaacute

referido Os anticorpos secundaacuterios incluem (i) um anticorpo anti-coelho 488 (ii) um

anticorpo anti-murganho 594 e (iii) um anticorpo anti-cabra 568 e foram utilizados numa

diluiccedilatildeo de 1500 O procedimento experimental envolveu a desparafinizaccedilatildeo hidrataccedilatildeo

dos tecidos incubaccedilatildeo com o tampatildeo de bloqueio e posterior incubaccedilatildeo com os anticorpos

primaacuterios durante toda a noite a 4ordmC (procedimentos idecircnticos aos realizados para

imunohistoquiacutemica) Os anticorpos secundaacuterios foram incubados durante 2h agrave temperatura


22

ambiente De seguida procedeu-se agrave montagem das lacircminas em meio de montagem para

fluorescecircncia ndash Vectashield (Vector laboratories Inc Burlingame) As lacircminas de tecido

de ratinho foram observadas com um microscoacutepio de fluorescecircncia AxioImager Z1 (Carl

Zeiss Germany) enquanto as lacircminas de tecido humano foram observadas com um

microscoacutepio confocal Leica SP2 AOBS SE (Leica Microsystems Germany) as imagens

forma analisados com os programas associados a cada microscoacutepio

6 - Hibridizaccedilatildeo in situ

Para a hibridizaccedilatildeo in situ foram utilizadas lacircminas contendo tecido incluiacutedo em parafina

Todo o processamento manuseamento e corte dos tecidos decorreu de forma a minimizar

possiacuteveis contaminaccedilotildees com RNA Foram utilizados secccedilotildees de ceacuterebro contendo plexo

coroacuteide que serviram de controlo positivo e secccedilotildees de estocircmago todos os tecidos eram

provenientes de animais com TTR endoacutegena (TTR++)

A detecccedilatildeo do RNA mensageiro (mRNA) de TTR foi realizada pelo meacutetodo da

digoxigenina (Roche Molecular Biochemicals Indianapolis IN USA) As sondas de

mTTR foram transcritas a partir de um plasmiacutedeo PGEM-4 (Promega) contendo o cDNA

completo de mTTR A sonda antisense foi transcrita a partir do promotor SP6 apoacutes

linearizaccedilatildeo do plasmiacutedeo com a enzima de restriccedilatildeo Hind III (New England) e a sonda

sense a partir do promotor T3 apoacutes linearizaccedilatildeo do plasmiacutedeo com a enzima de restriccedilatildeo

Sma I (New England)

Apoacutes desparafinizaccedilatildeo e hidrataccedilatildeo dos tecidos (processos previamente descritos) os slides

foram tratados com uma soluccedilatildeo de HCl 02 M durante 10 min agrave temperatura ambiente 50

microgmL de proteinase K durante 10 min a 37ordmC 02 de glicina durante 5 min 4 de

paraformaldeiacutedo pH 7 durante 1 min e 133 de trietanolamina 025 de anidrido aceacutetico

durante 10 min Entre cada soluccedilatildeo os slides foram imersos duas vezes em PBS tratado

com Dietilpirocarbonato (DEPC) A preacute-hibridaccedilatildeo ocorreu durante 4h agrave temperatura de

58ordmC no tampatildeo de hibridizaccedilatildeo [10X cloreto de soacutedio tampatildeo citrato de soacutedio (SSC)

50 formamida] e a hibridaccedilatildeo ocorreu a 55ordmC durante toda a noite foi utilizada uma

concentraccedilatildeo de 25 ng microl de ribosondas No dia seguintes as lacircminas foram imersas em

4X 2X e 1X SSC durante 10 min e tratados com 20 microgmL de RNAse A durante 30 min a

37ordmC De seguida foram colocados numa soluccedilatildeo contendo 2xSSC e 50 de formamida


23

durante 1h a 52ordmC A detecccedilatildeo da hibridaccedilatildeo ocorreu utilizando um anticorpo conjugado

com fosfatase alcalina anti digoxigenina (Roche) de acordo com as instruccedilotildees do

fabricante Foram realizados 6 ensaios para optimizar as condiccedilotildees de hibridaccedilatildeo fazendo

variar a temperatura de hibridaccedilatildeo entre os 55ordmC e os 60ordmC e tambeacutem o tempo de exposiccedilatildeo

agrave proteinase K que variou entre os 10 min e os 30 min O ensaio descrito foi o uacutenico onde

ocorreu detecccedilatildeo de hibridaccedilatildeo


24

Capiacutetulo III ndash Resultados


25

1 - PCR de cDNA

Numa primeira fase para determinar se a TTR eacute expressa no tracto gastrointestinal de

murganho foi realizado um PCR para detecccedilatildeo de cDNA dos seguintes tecidos coacutelon

estocircmago pacircncreas bexiga esoacutefago duodeno e fiacutegado Os tecidos foram provenientes de

um murganho TTR ++ de 3 meses de idade (figura 7)

Figura 7 PCR de cDNA de um aninal TTR++ Legenda Cl ndash Coacutelon Et ndash Estocircmago Pc

ndash Pacircncreas Bx Bexiga Es ndash Esoacutefago Do ndash Duodeno Fg ndash Fiacutegado RT neg ndash Controlo

negativo do RT-PCR

Verificou-se que a banda correspondente a mTTR estava presente no coacutelon estocircmago e

bexiga com uma intensidade muito semelhante Essa intensidade estava diminuiacuteda no

duodeno O fiacutegado funcionou neste PCR como um controlo positivo uma vez que se sabe

ser um local de expressatildeo abundante de TTR Natildeo se observou banda de TTR no esoacutefago

A banda de HPRT (gene de referecircncia) estava presente em todas as amostras As bandas de

mTTR e HPRT natildeo apareceram no pacircncreas sendo este resultado inesperado sabendo que

o pacircncreas eacute tambeacutem um local de siacutentese de TTR Este resultado pode ter ficado a dever-se

agrave fraca qualidade do mRNA de pacircncreas usado no RT-PCR e devido ao facto deste tecido

ser rico em nucleases

Este resultado permitiu seleccionar os oacutergatildeos a utilizar nos procedimentos experimentais

seguintes tendo sido escolhidos o estocircmago coacutelon duodeno e bexiga O pacircncreas deixou

de ser usado como controlo positivo passando a ser o fiacutegado o controlo seleccionado


Apoacutes anaacutelise qualitativa pretendeu-se avaliar de forma quantitativa e comparativa a

expressatildeo de TTR nos tecidos em estudo Para este ensaio foi utilizado um grupo de 5

animais (3 fecircmeas e 2 machos) de 3-4 meses de idade


26

A B

O primeiro ensaio realizado mostrou uma enorme variabilidade na expressatildeo de TTR

entre os animais pelo que se tentou perceber o que poderia estar na base destas

observaccedilotildees Os RNA extraiacutedos tinham sido quantificados por espectrometria e a sua

qualidade avaliada atraveacutes do paracircmetro 260280 Procedeu-se por isso a uma electroforese

em gel de agarose com brometo de etiacutedeo para determinar a qualidade do RNA que estava

a ser usado O gel de agarose mostrou que os RNA extraiacutedos estavam muito degradados

natildeo sendo possiacutevel distinguir as bandas correspondes agraves subunidades ribossomais (Figura

8) Voltou-se por isso a extrair RNA dos oacutergatildeos em estudo Esta nova extracccedilatildeo foi

realizada apoacutes homogeneizaccedilatildeo dos tecidos com um homogeneizador Ultra Turax que

permite uma homogeneizaccedilatildeo muito mais raacutepida do que o meacutetodo usado na extracccedilatildeo das

amostras anteriores Apoacutes extracccedilatildeo o RNA foi quantificado por espectrometria e a sua

integridade avaliada por electroforese em gel de agarose (Figura 8)

Figura 8 Integridade das amostras de RNA obtida a partir de dois sistemas diferentes de

homogeneizaccedilatildeo Legenda Et ndash Estocircmago Cl ndash Coacutelon Do ndash Duodeno Fg ndash Fiacutegado e Bx

ndash Bexiga

O PCR em tempo real foi repetido com as novas amostras de RNA Em cada ensaio foi

realizada uma curva de calibraccedilatildeo para o gene de estudo (mTTR) e gene de referecircncia

(18S) os ensaios foram validados quando os valores de eficiecircncia estavam compreendidos

entre 90 e 105 (Figura 9)

Figura 9 Curvas de calibraccedilatildeo para mTTR (A) e 18S (B)

250 bp

500 bp

750 bp

1000 bp

1500 bp

Fg FgEt EtCl ClDo Do Bx

Extraccedilatildeo Manual Extraccedilatildeo com Ultra turax

28 S

18 S


27

A especificidade da reacccedilatildeo foi confirmada atraveacutes da curva de fusatildeo que eacute um indicador

da temperatura de dissociaccedilatildeo dos primers especiacuteficos para as sequecircncias de mTTR e 18S

(Figura 10) Para cada amostra foram realizados triplicados e depois de analisados foram

descartados os valores de CT (treshold cycle) que diferissem entre si mais de 05 unidades

Figura 10 Exemplo de uma curva de fusatildeo para mTTR

A expressatildeo de TTR foi determinada por aplicaccedilatildeo do meacutetodo de ΔCT e conduziu ao

seguinte resultado (Figura 11)

Figura 11 Expressatildeo normalizada de TTR no sistema gastrointestinal Os dados

encontram-se em unidades arbitraacuterias e correspondem agrave meacutedia plusmn desvio padratildeo (plt

0001)


28

O PCR em tempo real permitiu determinar a expressatildeo de TTR no estocircmago do murganho

embora esta expressatildeo tal como se esperava seja muito inferior aos niacuteveis encontrados no

fiacutegado Nos restantes oacutergatildeos em estudo ndash coacutelon duodeno e bexiga verificou-se que essa

expressatildeo ou natildeo existia ou era muito residual natildeo tendo por isso qualquer importacircncia

estatiacutestica Assim os ensaios seguintes incidiram apenas sobre estocircmago e fiacutegado


Apoacutes determinaccedilatildeo quantitativa da expressatildeo de mRNA de TTR no estocircmago do

murganho pretendeu-se determinar se esta expressatildeo de mRNA correspondia agrave presenccedila

de proteiacutena e no caso de ocorrer qual seria a localizaccedilatildeo celularhistoloacutegica dessa siacutentese

Para este efeito usaram-se teacutecnicas de imunohistoquiacutemicaimunofluorescecircncia

Na teacutecnica de imunohistoquiacutemica foi usado um anticorpo anti-TTR em lacircminas contendo

secccedilotildees transversais de estocircmago e pacircncreas O pacircncreas foi utilizado como controlo

positivo por ser mais faacutecil identificar neste oacutergatildeo os locais de siacutentese de TTR O controlo

negativo correspondeu aos mesmos oacutergatildeos (estocircmago e pacircncreas) de um animal TTR--

(Figura 12)

Figura 12 Imunohistoquimica para mTTR de (A) epiteacutelio secretor do estocircmago e (B)

ilheacuteus de Langerhans do pacircncreas As setas indicam o local de imunoreactividade positiva

para TTR


29

A marcaccedilatildeo de TTR no animal TTR++ surge na zona glandular do estocircmago do

murganho e parece coincidir com ceacutelulas muito especiacuteficas Natildeo eacute uma marcaccedilatildeo muito

abundante o que vem de encontro aos resultados obtidos com o PCR em tempo real O

animal TTR-- natildeo continha nenhuma marcaccedilatildeo para TTR como esperado

Com estes resultados surgiu a necessidade de identificar as ceacutelulas com reactividade para o

anticorpo anti-TTR A morfologia das ceacutelulas positivas para TTR parecia indicar tratar-se

de ceacutelulas endoacutecrinas Realizou-se por isso uma imunohistoquiacutemica para cromogranina A

marcador de ceacutelulas enteroendoacutecrinas e TTR em lacircminas contendo secccedilotildees sucessivas do

mesmo oacutergatildeo contudo nada foi possiacutevel concluir acerca da co-localizaccedilatildeo entre as duas

proteiacutenas Para co-localizar dois antigeacutenios numa mesma lacircmina optou-se pela teacutecnica de

imunofluorescecircncia que o permite fazer de uma forma simples e eficaz

Natildeo foi possiacutevel proceder a ensaios de imunofluorescecircncia com o anticorpo de

cromogranina A e mTTR porque os anticorpos satildeo produzidos no mesmo animal

4 - Imunofluorescecircncia

O primeiro ensaio consistiu na localizaccedilatildeo de mTTR e de Beta ATPase de hidrogeacutenio e

potaacutessio Este uacuteltimo anticorpo permite identificar as ceacutelulas parietais do estocircmago

responsaacuteveis pela produccedilatildeo e secreccedilatildeo de aacutecido cloriacutedrico bem como de factor intriacutenseco

Natildeo se verificou qualquer co-localizaccedilatildeo a partir dos anticorpos utilizados (dados natildeo

apresentados)

Num segundo ensaio procedeu-se agrave localizaccedilatildeo de mTTR em ceacutelulas secretoras de

somatostatina utilizando para isso o anticorpo anti-mTTR e o anticorpo anti-somatostatina

(Figura 13)


30

Figura 13 Imunofluorescecircncia para mTTR e somatostatina em (A) estocircmago e (B)

pacircncreas

Verificou-se a localizaccedilatildeo de TTR nas ceacutelulas que secretam somatostatina no estocircmago

Mais uma vez o pacircncreas funcionou como controlo positivo da teacutecnica e verifica-se que

neste oacutergatildeo as ceacutelulas que sintetizam TTR satildeo diferentes das que secretam somatostatina

Foi utilizado um animal TTR-- como controlo negativo tendo-se verificado que natildeo surgia

qualquer tipo de marcaccedilatildeo para TTR (dados natildeo apresentados)

Com estes resultados questionou-se a hipoacutetese da localizaccedilatildeo de TTR nas ceacutelulas

secretoras de somatostatina ocorrer tambeacutem no estocircmago humano Pelo que se repetiu a

imunofluorescecircncia em lacircminas contendo tecido de estocircmago humano usando agora um

anticorpo anti-hTTR e o mesmo anticorpo anti-somatostatina (Figura 14) Foi possiacutevel

verificar que tambeacutem neste tecido ocorria co-localizaccedilatildeo entre TTR e somatostatina

Figura 14 Imunofluorescecircncia para hTTR e somatostatina em estocircmago humano

Somatostatina TTRSomatostatina

TTR Somatostatina TTRSomatostatina

TTRA AA

B B B



31

5 - Hibridaccedilatildeo in situ

O uacuteltimo procedimento experimental consistiu numa hibridaccedilatildeo in situ para confirmar a

siacutentese de TTR em ceacutelulas secretoras de somatostatina Esta teacutecnica foi aplicada a lacircminas

contendo estocircmago e ceacuterebro com plexo coroacuteide (como controlo positivo) incluiacutedos em

parafina Com esta teacutecnica eacute possiacutevel detectar a presenccedila de mRNA de TTR de murganho e

ao mesmo tempo identificar o local onde esse mRNA se encontra (Figura 15)

Figura15 Hibridaccedilatildeo in situ com uma sonda anti-mTTR (A) Plexo coroacuteide hibridado com

sonda antisense (AS) (B) Ampliaccedilatildeo da imagem (A) (C) Plexo coroacuteide hibridado com

sonda sense (SS) (D) Estocircmago hibridado com sonda antisense (AS) (E) Estocircmago

hibridado com sonda sense (SS)

A sonda antisense eacute complementar ao mRNA de TTR existente no murganho ocorrendo

emparelhamento das duas sequecircncias Esse emparelhamento eacute visiacutevel na imagem A onde

todo o plexo coroacuteide aparece marcado tal como era espectaacutevel A sonda sense tem a

mesma sequecircncia do mRNA pelo que natildeo ocorre emparelhamento funciona por isso como

um controlo negativo de todo o processo (imagens C e E) Na imagem D seria de esperar

observar marcaccedilatildeo das ceacutelulas identificadas anteriormente quando o slide foi incubado

com a sonda antisense mas tal natildeo se verificou

SAA SSCB

SAD SSE


32

Capiacutetulo IV ndash Discussatildeo


33

A primeira parte deste trabalho visava sobretudo avaliar a expressatildeo de TTR ao longo do

tracto gastrointestinal de murganhos com cerca de 3 meses de idade Para isso foram

realizados dois tipos de procedimentos experimentais PCR de cDNA e PCR em tempo

real

A realizaccedilatildeo do PCR de cDNA de murganho permitiu de uma forma qualitativa

determinar que agrave excepccedilatildeo do esoacutefago todos os restantes oacutergatildeos do sistema

gastrointestinal investigado apresentavam a banda de mTTR bem como a do gene de

referecircncia Sabendo que o fiacutegado eacute um dos maiores sintetizadores de TTR do organismo

seria de esperar que a intensidade da banda de mTTR nos oacutergatildeos em estudo estivesse

diminuiacuteda em relaccedilatildeo ao fiacutegado mas tal natildeo se verificou Estes resultados permitem

concluir que este tipo de PCR tradicional apenas indica a existecircncia de cDNA de mTTR

sem estabelecer qualquer relaccedilatildeo entre a presenccedila e a quantidade de mRNA A expressatildeo

de TTR no estocircmago tinha jaacute sido referida (Soprano et al 1985) embora na mesma

publicaccedilatildeo seja referido o facto de o pacircncreas natildeo expressar TTR o que se sabe hoje de

facto acontecer

Apoacutes anaacutelise qualitativa foi necessaacuterio de uma forma quantitativa determinar a expressatildeo

de mRNA de TTR presente no estocircmago duodeno coacutelon e bexiga A quantificaccedilatildeo foi

realizada por PCR em tempo real Esta teacutecnica permite a amplificaccedilatildeo detecccedilatildeo e

quantificaccedilatildeo de DNA numa uacutenica etapa tornando mais raacutepido todo o processo de

obtenccedilatildeo de resultados e minimizando o risco de possiacuteveis contaminaccedilotildees A curva de

fusatildeo eacute uma medida da especificidade da reacccedilatildeo e indica o ponto correspondente agrave

temperatura de dissociaccedilatildeo dos primers especiacuteficos para as sequecircncias em estudo O

primeiro ensaio realizado conduziu a resultados pouco concordantes que se ficaram a dever

ao processo de homogeneizaccedilatildeo inicialmente utilizado Com a alteraccedilatildeo do meacutetodo de

extracccedilatildeo verificou-se que os resultados passaram a ser muito mais concordantes e com

uma menor variabilidade entre o grupo de animais uma vez que o RNA utilizado estava

integro Conclui-se portanto que eacute fundamental assegurar que o RNA a utilizar neste tipo

de teacutecnica seja de oacuteptima qualidade para garantir precisatildeo e exactidatildeo dos resultados Tal

como se esperava o fiacutegado foi o oacutergatildeo onde a expressatildeo normalizada de TTR foi superior

Nos restantes oacutergatildeos em estudo (estocircmago coacutelon duodeno e bexiga) apenas o estocircmago

apresentou valores de expressatildeo diferentes de zero


34

Os resultados obtidos atraveacutes dos dois tipos de PCR satildeo claramente distintos A ocorrecircncia

de bandas no PCR tradicional para coacutelon duodeno e bexiga pode ter ficado a dever-se a

uma contaminaccedilatildeo e por isso quando se passa para uma teacutecnica muito mais sensiacutevel (PCR

em tempo real) natildeo se verificam sinais de expressatildeo de TTR nestes oacutergatildeos O PCR em

tempo real eacute por isso uma teacutecnica muito mais precisa e reprodutiacutevel do que o PCR

convencional

A segunda parte deste trabalho tinha como objectivo identificar quais os locais

principalmente no estocircmago e intestino onde ocorre a expressatildeo da proteiacutena Para isso

procederam-se a teacutecnicas de imunohistoquiacutemica e imunofluorescecircncia

A imunohistoquimica forneceu dados importantes acerca da localizaccedilatildeo histoloacutegica da

TTR enquanto proteiacutena a imunoreactividade encontrada foi muito especiacutefica e pouco

abundante surgindo na mucosa do estocircmago do murganho tal como tinha sido

previamente descrito para o tecido humano (Liddle et al 1985) As ceacutelulas marcadas

poderiam por isso ser de quatro tipos diferentes ceacutelulas produtoras de muco ceacutelulas

principais ceacutelulas endoacutecrinas ou ceacutelulas parietais Foi necessaacuterio determinar que tipo de

ceacutelula presente na zona glandular do estocircmago expressava TTR A morfologia das ceacutelulas

marcadas para TTR era idecircntica agrave das ceacutelulas endoacutecrinas o que posteriormente se veio a

verificar Por imunohistoquimica foi realizada uma marcaccedilatildeo para cromogranina A

marcador de ceacutelulas enteroendoacutecrinas e para TTR em lacircminas contendo secccedilotildees

sucessivas de estocircmago contudo nada foi possiacutevel concluir acerca da co-localizaccedilatildeo entre

as duas proteiacutenas Natildeo se procederam a ensaios de imunofluorescecircncia devido ao facto de

ambos os anticorpos serem produzidos no mesmo animal

A partir de ensaios de co-localizaccedilatildeo por imunofluorescecircncia verificou-se que a TTR natildeo

se localiza em ceacutelulas parietais ocorrendo a sua localizaccedilatildeo nas ceacutelulas produtoras de

somatostatina ndash ceacutelulas D (ceacutelulas endoacutecrinas) tanto no murganho como no humano Estas

ceacutelulas possuem extensotildees citoplasmaacuteticas onde estatildeo armazenados os gracircnulos de

somatostatina (Lucey 1986) Um estudo realizado em 1992 (Kameko et al 1992) admitia

jaacute a existecircncia de ceacutelulas reactivas para TTR no estocircmago e intestino humano e mostrava a

ocorrecircncia de co-localizaccedilatildeo entre TTR e RBP sendo que as ceacutelulas que continham as

duas proteiacutenas apresentavam caracteriacutesticas morfoloacutegicas semelhantes agraves das ceacutelulas

endoacutecrinas Neste presente trabalho experimental natildeo se verificou a existecircncia de ceacutelulas


35

marcadas para TTR quer no intestino do murganho quer no intestino humano A

importacircncia bioloacutegica da expressatildeo da TTR neste tipo de ceacutelulas natildeo eacute ainda conhecida A

somatostatina funciona como um neurotransmissor inibitoacuterio do sistema nervoso e tem um

papel na regulaccedilatildeo neurohormonal (Sternini et al 1997) Da sua expressatildeo resulta a

inibiccedilatildeo de secreccedilotildees endoacutecrinas e exoacutecrinas de secreccedilotildees enzimaacuteticas e de electroacutelitos da

contracccedilatildeo muscular e proliferaccedilatildeo celular (Sternini et al 1997) No sistema digestivo a

somatostatina eacute expressa em neuroacutenios fibras e nas ceacutelulas D (Costa et al 1977 Costa et

al 1980 Ekblad et al 1988) e estaacute tambeacutem envolvida na regulaccedilatildeo da peristalsia e

motilidade interdigestiva confirmada pela presenccedila de neuroacutenios imunoreactivos a

somatostatina no plexo mienteacuterico e atraveacutes de estudos funcionais (McIntosh 1985) A

somatostatina eacute um regulador fisioloacutegico da secreccedilatildeo de aacutecido gaacutestrico por efeito directo

desta proteiacutena ao niacutevel das ceacutelulas parietais e de forma indirecta por inibiccedilatildeo da

libertaccedilatildeo de histamina e gastrina (McIntosh 1985) Seraacute por isso importante perceber se

existe alguma interacccedilatildeo entre a TTR e a somatostatina e a existir de que forma a TTR

poderaacute estar tambeacutem envolvida nas funccedilotildees acima mencionadas Tal como previamente

descrito (Liddle et al 1985) natildeo ocorreu co-localizaccedilatildeo entre TTR e somatostatina no

pacircncreas uma vez que neste oacutergatildeo satildeo as ceacutelulas α (sintetizadoras de glucagon) as

responsaacuteveis pela expressatildeo de TTR

No estocircmago natildeo eacute conhecida de que forma poderaacute a expressatildeo de TTR estar associada agrave

sintomatologia gastrointestinal caracteriacutestica de PAF nomeadamente retenccedilatildeo gaacutestrica

associada a naacuteuseas e voacutemitos bem como fenoacutemenos de obstipaccedilatildeo diarreia A niacutevel

histoloacutegico verifica-se que neste oacutergatildeo ocorre deposiccedilatildeo extracelular de fibras de TTR

mutada na camada submucosa e em torno dos plexos mienteacutericos (Yoshimatsu et al

1998) Ocorre tambeacutem a deposiccedilatildeo de amiloacuteide a niacutevel glandular originando depoacutesitos que

alteram a estrutura celular e morfoloacutegica das glacircndulas presentes no estocircmago A

deposiccedilatildeo de TTR provoca danos estruturais e tambeacutem funcionais nos tecidos A expressatildeo

da proteiacutena mutada no estocircmago poderaacute de alguma forma condicionar os processos

bioquiacutemicos que decorrem neste oacutergatildeo e assim influenciar os mecanismos bioloacutegicos

caracteriacutesticos deste sistema conduzindo aos sintomas referidos anteriormente Natildeo eacute

tambeacutem de descartar uma possiacutevel interacccedilatildeo entre a TTR na forma mutada e a

somatostatina podendo conduzir esta interacccedilatildeo agrave severidade dos sintomas

gastrointestinais caracteriacutesticos desta doenccedila


36

A uacuteltima metodologia experimental consistiu numa hibridaccedilatildeo in situ Com esta teacutecnica

apenas foi possiacutevel detectar a presenccedila de mRNA de TTR de murganho no plexo coroacuteide

utilizando a sonda antisense No estocircmago natildeo foi possiacutevel detectar qualquer tipo de

marcaccedilatildeo Estes resultados podem ter ficado a dever-se aos niacuteveis de expressatildeo de TTR

nos dois oacutergatildeos em questatildeo A sonda embora muito especiacutefica natildeo detectou a presenccedila de

mRNA na mucosa do estocircmago muito provavelmente devido ao reduzido nuacutemero de

ceacutelulas e agrave proacutepria estrutura histoloacutegica do tecido em questatildeo O plexo coroacuteide estaacute muito

mais acessiacutevel pelo que o processo de hibridaccedilatildeo ocorre naturalmente

O presente estudo permitiu detectar a expressatildeo de TTR no estocircmago bem como a

localizaccedilatildeo histoloacutegica da mesma Conduziu tambeacutem a novas questotildees que descrevemos

anteriormente e que teratildeo de ser respondidas em estudos futuros


37

Conclusatildeo

A transtirretina eacute uma proteiacutena extremamente conservada nos mamiacuteferos ao longo da

evoluccedilatildeo pelo que deveraacute ser uma proteiacutena importante para a funcionalidade bioloacutegica dos

organismos Satildeo conhecidas as duas principais funccedilotildees da TTR ndash transportar a tiroxina e a

vitamina A contudo sabe-se hoje que esta proteiacutena interveacutem noutros processos bioloacutegicos

importantes quer por associaccedilatildeo a outros peacuteptidos quer por ser um indicador de processos

inflamatoacuterios de stress etc Conhecer as interacccedilotildees que a TTR estabelece nos indiviacuteduos

portadoras de TTR natildeo mutada permite perceber que tipo de funccedilotildees poderatildeo estar

alteradas nos indiviacuteduos portadores de TTR mutada nomeadamente em PAF e se eacute a

ausecircncia ou disfunccedilatildeo dessas interacccedilotildees que conduz a muitos dos sintomas associados agrave e

doenccedila

Com este projecto foi possiacutevel investigar e caracterizar a expressatildeo de TTR ao longo do

tracto gastrointestinal do murganho nomeadamente no esoacutefago estocircmago duodeno coacutelon

e tambeacutem na bexiga Verificou-se que de todos os oacutergatildeos em estudo apenas o estocircmago

apresentou niacuteveis de expressatildeo normalizada de TTR com valores diferentes de zero

Conclui-se tambeacutem que a metodologia do PCR em tempo real eacute muito mais precisa e

especiacutefica do que o PCR convencional conduzindo este uacuteltimo a muitos falsos positivos

Foi tambeacutem possiacutevel determinar que tal como jaacute tinha sido descrito as ceacutelulas que

expressam TTR no estocircmago do murganho e humano existem em pequena quantidade e

estatildeo presentes na mucosa do oacutergatildeo em questatildeo Estas ceacutelulas co - localizam com as

ceacutelulas D responsaacuteveis pela secreccedilatildeo de somatostatina no estocircmago natildeo sendo ainda

conhecida nenhuma interacccedilatildeo funcional entre estes dois peacuteptidos Neste estudo natildeo se

observou quaisquer tipos de marcaccedilatildeo no intestino quer no murganho quer em tecidos

humanos

Os resultados obtidos entre as metodologias utilizadas (PCR em tempo real e

imunohistoquiacutemicaimunofluorescecircncia) satildeo concordantes entre si

A hibridaccedilatildeo in situ permitiu detectar a presenccedila de mRNA de TTR no plexo coroacuteide do

murganho natildeo sendo visiacutevel qualquer tipo de marcaccedilatildeo em ceacutelulas do estocircmago


38

Todos estes resultados colocam novas questotildees Ocorreraacute interacccedilatildeo entre TTR e

somatostatina De que tipo seraacute essa interacccedilatildeo Seraacute que na presenccedila de TTR mutada essa

interacccedilatildeo eacute alterada conduzindo agrave sintomatologia do sistema gastrointestinal caracteriacutestico

de PAF

Seria por isso interessante estudar futuramente a expressatildeo de TTR num modelo animal

de PAF embora o ideal seria poder utilizar o modelo humano para determinar se de

alguma forma esta expressatildeo pode estar aumentada e se ocorre nos mesmos locais


39

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46


ii

ESCOLA SUPERIOR DE TECNOLOGIA DA SAUacuteDE

DO PORTO

INSTITUTO POLITEacuteCNICO DO PORTO


Expressatildeo de Transtirretina no Sistema

Gastrointestinal do Murganho

Dissertaccedilatildeo submetida agrave Escola Superior de Tecnologia da Sauacutede do Porto para cumprimento

dos requisitos necessaacuterios agrave obtenccedilatildeo do grau de Mestre em Tecnologia Bioquiacutemica em Sauacutede

realizada sob a orientaccedilatildeo cientiacutefica da Professora Doutora Maria Joatildeo Saraiva (Professora

Catedraacutetica Aacuterea das Neurociecircncias Instituto de Ciecircncias Biomeacutedicas Abel Salazar da

Universidade do Porto) e sob co-orientaccedilatildeo da Profordf Doutora Ceciacutelia Santos (Professora

Associada Aacuterea das Ciecircncias da Sauacutede Faculdade de Ciecircncias da Sauacutede da Universidade da

Beira Interior) e Profordm Doutor Ruacuteben Fernandes (Professor Adjunto Aacuterea de Bioquiacutemica

Unidade de Mecanismos Moleculares da Doenccedila do Centro de Investigaccedilatildeo em Sauacutede e

Ambiente - ESTSP e Centro de Farmacologia e Biopatologia Quiacutemica ndash FMUP)


iii

Agradecimentos












especiais






sem vocecircs








iv

Resumo



1978)
























Gastrointestinal


v

Abstract






















synthesize TTR



vi

Iacutendice

Abreviaturas vii












1- Animais 18







1 - PCR de cDNA 25






Conclusatildeo 37

Bibliografia 39


vii

Abreviaturas






















viii


T4 ndash Tiroxina





1































2


proteiacutena


3



4






























5





























6

















7

























(Figura 2)


8


2001)


















9






















10


1997)















conhecida














11
































12













al 2001)














13



2001)





















14
















recto




15










Submucosa

A

A

B



Muscular

Muscular

Junccedilatildeo

esoacutefago

gaacutestrica

Enteroacutecitos











16










17



18

1- Animais






























19






























20
































21


































22



















Sma I (New England)













23








24



25

1 - PCR de cDNA







negativo do RT-PCR


















26

A B















ndash Bexiga






250 bp

500 bp

750 bp

1000 bp

1500 bp



28 S

18 S


27










0001)


28















(Figura 12)



para TTR


29



















apresentados)



(Figura 13)


30


pacircncreas














TTRA AA

B B B



31


















SAA SSCB

SAD SSE


32



33




real











facto acontecer


















34






convencional



























35


































36













37

Conclusatildeo










doenccedila













humanos






38




de PAF





39

Bibliografia







6(3)309-15





32(12)920-2










4









10(3)308-16











40





265(5177)1464-7












852











1990 265(3)1425-9








36(1)13-7


103(2)831-9






41





2001 58(10)1491-521








75(4)519-631




Rev Nutr 1994 14495-533


2002 40(12)1281-91



2006 45(20)1173-5








89(3)353-6





61(5)315-22







Acad Sci U S A 1985 82(8)2488-92


42


























Med Clin (Barc) 1988 91(12)441-4




Chem 1971 246(19)6098-105










Am J Physiol 1997 272(3 Pt 1)E485-93



43



15(3)1364-76



276(29)27207-13


Lett 1979 104(1)55-8




2009 276(19)5342-56












Sci U S A 1992 89(21)10016-20





Invest 1984 74(1)104-19











143 29-38




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2003 1626(1-3)65-74



9





83(19)7330-4



Neurochem 2004 88(5)1052-8





2001 159(6)1993-2000
















Chem 1985 260(22)12224-7



3(4)352-62


45



1975 35(6)569-75



197(1)19-25








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Agradecimentos












especiais






sem vocecircs








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Resumo



1978)
























Gastrointestinal


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Abstract






















synthesize TTR



vi

Iacutendice

Abreviaturas vii












1- Animais 18







1 - PCR de cDNA 25






Conclusatildeo 37

Bibliografia 39


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Abreviaturas






















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T4 ndash Tiroxina





1































2


proteiacutena


3



4






























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(Figura 2)


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2001)


















9






















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1997)















conhecida














11
































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2001)





















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recto




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Submucosa

A

A

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Muscular

Muscular

Junccedilatildeo

esoacutefago

gaacutestrica

Enteroacutecitos











16










17



18

1- Animais






























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Sma I (New England)













23








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25

1 - PCR de cDNA







negativo do RT-PCR


















26

A B















ndash Bexiga






250 bp

500 bp

750 bp

1000 bp

1500 bp



28 S

18 S


27










0001)


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(Figura 12)



para TTR


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apresentados)



(Figura 13)


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pacircncreas














TTRA AA

B B B



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SAA SSCB

SAD SSE


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real











facto acontecer


















34






convencional



























35


































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Conclusatildeo










doenccedila













humanos






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Bibliografia







6(3)309-15





32(12)920-2










4









10(3)308-16











40





265(5177)1464-7












852











1990 265(3)1425-9








36(1)13-7


103(2)831-9






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2001 58(10)1491-521








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Rev Nutr 1994 14495-533


2002 40(12)1281-91



2006 45(20)1173-5








89(3)353-6





61(5)315-22







Acad Sci U S A 1985 82(8)2488-92


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Med Clin (Barc) 1988 91(12)441-4




Chem 1971 246(19)6098-105










Am J Physiol 1997 272(3 Pt 1)E485-93



43



15(3)1364-76



276(29)27207-13


Lett 1979 104(1)55-8




2009 276(19)5342-56












Sci U S A 1992 89(21)10016-20





Invest 1984 74(1)104-19











143 29-38




44







2003 1626(1-3)65-74



9





83(19)7330-4



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2001 159(6)1993-2000
















Chem 1985 260(22)12224-7



3(4)352-62


45



1975 35(6)569-75



197(1)19-25








23







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iv

Resumo



1978)
























Gastrointestinal


v

Abstract






















synthesize TTR



vi

Iacutendice

Abreviaturas vii












1- Animais 18







1 - PCR de cDNA 25






Conclusatildeo 37

Bibliografia 39


vii

Abreviaturas






















viii


T4 ndash Tiroxina





1































2


proteiacutena


3



4






























5





























6

















7

























(Figura 2)


8


2001)


















9






















10


1997)















conhecida














11
































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Submucosa

A

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B



Muscular

Muscular

Junccedilatildeo

esoacutefago

gaacutestrica

Enteroacutecitos











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18

1- Animais






























19






























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Sma I (New England)













23








24



25

1 - PCR de cDNA







negativo do RT-PCR


















26

A B















ndash Bexiga






250 bp

500 bp

750 bp

1000 bp

1500 bp



28 S

18 S


27










0001)


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(Figura 12)



para TTR


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apresentados)



(Figura 13)


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pacircncreas














TTRA AA

B B B



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SAA SSCB

SAD SSE


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real











facto acontecer


















34






convencional



























35


































36













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Conclusatildeo










doenccedila













humanos






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de PAF





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Bibliografia







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32(12)920-2










4









10(3)308-16











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265(5177)1464-7












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103(2)831-9






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2001 58(10)1491-521








75(4)519-631




Rev Nutr 1994 14495-533


2002 40(12)1281-91



2006 45(20)1173-5








89(3)353-6





61(5)315-22







Acad Sci U S A 1985 82(8)2488-92


42


























Med Clin (Barc) 1988 91(12)441-4




Chem 1971 246(19)6098-105










Am J Physiol 1997 272(3 Pt 1)E485-93



43



15(3)1364-76



276(29)27207-13


Lett 1979 104(1)55-8




2009 276(19)5342-56












Sci U S A 1992 89(21)10016-20





Invest 1984 74(1)104-19











143 29-38




44







2003 1626(1-3)65-74



9





83(19)7330-4



Neurochem 2004 88(5)1052-8





2001 159(6)1993-2000
















Chem 1985 260(22)12224-7



3(4)352-62


45



1975 35(6)569-75



197(1)19-25








23







46


v

Abstract






















synthesize TTR



vi

Iacutendice

Abreviaturas vii












1- Animais 18







1 - PCR de cDNA 25






Conclusatildeo 37

Bibliografia 39


vii

Abreviaturas






















viii


T4 ndash Tiroxina





1































2


proteiacutena


3



4






























5





























6

















7

























(Figura 2)


8


2001)


















9






















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1997)















conhecida














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12













al 2001)














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2001)





















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recto




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Submucosa

A

A

B



Muscular

Muscular

Junccedilatildeo

esoacutefago

gaacutestrica

Enteroacutecitos











16










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18

1- Animais






























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Sma I (New England)













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24



25

1 - PCR de cDNA







negativo do RT-PCR


















26

A B















ndash Bexiga






250 bp

500 bp

750 bp

1000 bp

1500 bp



28 S

18 S


27










0001)


28















(Figura 12)



para TTR


29



















apresentados)



(Figura 13)


30


pacircncreas














TTRA AA

B B B



31


















SAA SSCB

SAD SSE


32



33




real











facto acontecer


















34






convencional



























35


































36













37

Conclusatildeo










doenccedila













humanos






38




de PAF





39

Bibliografia







6(3)309-15





32(12)920-2










4









10(3)308-16











40





265(5177)1464-7












852











1990 265(3)1425-9








36(1)13-7


103(2)831-9






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2001 58(10)1491-521








75(4)519-631




Rev Nutr 1994 14495-533


2002 40(12)1281-91



2006 45(20)1173-5








89(3)353-6





61(5)315-22







Acad Sci U S A 1985 82(8)2488-92


42


























Med Clin (Barc) 1988 91(12)441-4




Chem 1971 246(19)6098-105










Am J Physiol 1997 272(3 Pt 1)E485-93



43



15(3)1364-76



276(29)27207-13


Lett 1979 104(1)55-8




2009 276(19)5342-56












Sci U S A 1992 89(21)10016-20





Invest 1984 74(1)104-19











143 29-38




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2003 1626(1-3)65-74



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83(19)7330-4



Neurochem 2004 88(5)1052-8





2001 159(6)1993-2000
















Chem 1985 260(22)12224-7



3(4)352-62


45



1975 35(6)569-75



197(1)19-25








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vi

Iacutendice

Abreviaturas vii












1- Animais 18







1 - PCR de cDNA 25






Conclusatildeo 37

Bibliografia 39


vii

Abreviaturas






















viii


T4 ndash Tiroxina





1































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proteiacutena


3



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A

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1- Animais






























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Sma I (New England)













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1 - PCR de cDNA







negativo do RT-PCR


















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A B















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para TTR


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apresentados)



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pacircncreas














TTRA AA

B B B



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SAA SSCB

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real











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convencional



























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Conclusatildeo










doenccedila













humanos






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de PAF





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Bibliografia







6(3)309-15





32(12)920-2










4









10(3)308-16











40





265(5177)1464-7












852











1990 265(3)1425-9








36(1)13-7


103(2)831-9






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2001 58(10)1491-521








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Rev Nutr 1994 14495-533


2002 40(12)1281-91



2006 45(20)1173-5








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Acad Sci U S A 1985 82(8)2488-92


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Med Clin (Barc) 1988 91(12)441-4




Chem 1971 246(19)6098-105










Am J Physiol 1997 272(3 Pt 1)E485-93



43



15(3)1364-76



276(29)27207-13


Lett 1979 104(1)55-8




2009 276(19)5342-56












Sci U S A 1992 89(21)10016-20





Invest 1984 74(1)104-19











143 29-38




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2003 1626(1-3)65-74



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Neurochem 2004 88(5)1052-8





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Chem 1985 260(22)12224-7



3(4)352-62


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1975 35(6)569-75



197(1)19-25








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Abreviaturas






















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T4 ndash Tiroxina





1































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Sma I (New England)













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1 - PCR de cDNA







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Conclusatildeo










doenccedila













humanos






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de PAF





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Bibliografia







6(3)309-15





32(12)920-2










4









10(3)308-16











40





265(5177)1464-7












852











1990 265(3)1425-9








36(1)13-7


103(2)831-9






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2001 58(10)1491-521








75(4)519-631




Rev Nutr 1994 14495-533


2002 40(12)1281-91



2006 45(20)1173-5








89(3)353-6





61(5)315-22







Acad Sci U S A 1985 82(8)2488-92


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Med Clin (Barc) 1988 91(12)441-4




Chem 1971 246(19)6098-105










Am J Physiol 1997 272(3 Pt 1)E485-93



43



15(3)1364-76



276(29)27207-13


Lett 1979 104(1)55-8




2009 276(19)5342-56












Sci U S A 1992 89(21)10016-20





Invest 1984 74(1)104-19











143 29-38




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2003 1626(1-3)65-74



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83(19)7330-4



Neurochem 2004 88(5)1052-8





2001 159(6)1993-2000
















Chem 1985 260(22)12224-7



3(4)352-62


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1975 35(6)569-75



197(1)19-25








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T4 ndash Tiroxina





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1 - PCR de cDNA







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Conclusatildeo










doenccedila













humanos






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de PAF





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Bibliografia







6(3)309-15





32(12)920-2










4









10(3)308-16











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265(5177)1464-7












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1990 265(3)1425-9








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103(2)831-9






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2001 58(10)1491-521








75(4)519-631




Rev Nutr 1994 14495-533


2002 40(12)1281-91



2006 45(20)1173-5








89(3)353-6





61(5)315-22







Acad Sci U S A 1985 82(8)2488-92


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Med Clin (Barc) 1988 91(12)441-4




Chem 1971 246(19)6098-105










Am J Physiol 1997 272(3 Pt 1)E485-93



43



15(3)1364-76



276(29)27207-13


Lett 1979 104(1)55-8




2009 276(19)5342-56












Sci U S A 1992 89(21)10016-20





Invest 1984 74(1)104-19











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2003 1626(1-3)65-74



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Neurochem 2004 88(5)1052-8





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Chem 1985 260(22)12224-7



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1 - PCR de cDNA







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A B















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pacircncreas














TTRA AA

B B B



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SAA SSCB

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convencional



























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Conclusatildeo










doenccedila













humanos






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de PAF





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Bibliografia







6(3)309-15





32(12)920-2










4









10(3)308-16











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265(5177)1464-7












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1990 265(3)1425-9








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Rev Nutr 1994 14495-533


2002 40(12)1281-91



2006 45(20)1173-5








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Med Clin (Barc) 1988 91(12)441-4




Chem 1971 246(19)6098-105










Am J Physiol 1997 272(3 Pt 1)E485-93



43



15(3)1364-76



276(29)27207-13


Lett 1979 104(1)55-8




2009 276(19)5342-56












Sci U S A 1992 89(21)10016-20





Invest 1984 74(1)104-19











143 29-38




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2003 1626(1-3)65-74



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Neurochem 2004 88(5)1052-8





2001 159(6)1993-2000
















Chem 1985 260(22)12224-7



3(4)352-62


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1975 35(6)569-75



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Conclusatildeo










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humanos






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de PAF





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Bibliografia







6(3)309-15





32(12)920-2










4









10(3)308-16











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265(5177)1464-7












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1990 265(3)1425-9








36(1)13-7


103(2)831-9






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2001 58(10)1491-521








75(4)519-631




Rev Nutr 1994 14495-533


2002 40(12)1281-91



2006 45(20)1173-5








89(3)353-6





61(5)315-22







Acad Sci U S A 1985 82(8)2488-92


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Med Clin (Barc) 1988 91(12)441-4




Chem 1971 246(19)6098-105










Am J Physiol 1997 272(3 Pt 1)E485-93



43



15(3)1364-76



276(29)27207-13


Lett 1979 104(1)55-8




2009 276(19)5342-56












Sci U S A 1992 89(21)10016-20





Invest 1984 74(1)104-19











143 29-38




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2003 1626(1-3)65-74



9





83(19)7330-4



Neurochem 2004 88(5)1052-8





2001 159(6)1993-2000
















Chem 1985 260(22)12224-7



3(4)352-62


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1975 35(6)569-75



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Conclusatildeo










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de PAF





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Bibliografia







6(3)309-15





32(12)920-2










4









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1990 265(3)1425-9








36(1)13-7


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Rev Nutr 1994 14495-533


2002 40(12)1281-91



2006 45(20)1173-5








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Acad Sci U S A 1985 82(8)2488-92


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Med Clin (Barc) 1988 91(12)441-4




Chem 1971 246(19)6098-105










Am J Physiol 1997 272(3 Pt 1)E485-93



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15(3)1364-76



276(29)27207-13


Lett 1979 104(1)55-8




2009 276(19)5342-56












Sci U S A 1992 89(21)10016-20





Invest 1984 74(1)104-19











143 29-38




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Neurochem 2004 88(5)1052-8





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Chem 1985 260(22)12224-7



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A

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B B B



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real











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Conclusatildeo










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humanos






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de PAF





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Bibliografia







6(3)309-15





32(12)920-2










4









10(3)308-16











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1990 265(3)1425-9








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2001 58(10)1491-521








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Rev Nutr 1994 14495-533


2002 40(12)1281-91



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Acad Sci U S A 1985 82(8)2488-92


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Med Clin (Barc) 1988 91(12)441-4




Chem 1971 246(19)6098-105










Am J Physiol 1997 272(3 Pt 1)E485-93



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15(3)1364-76



276(29)27207-13


Lett 1979 104(1)55-8




2009 276(19)5342-56












Sci U S A 1992 89(21)10016-20





Invest 1984 74(1)104-19











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2003 1626(1-3)65-74



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Chem 1985 260(22)12224-7



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A B















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Conclusatildeo










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humanos






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de PAF





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Bibliografia







6(3)309-15





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4









10(3)308-16











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265(5177)1464-7












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1990 265(3)1425-9








36(1)13-7


103(2)831-9






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2001 58(10)1491-521








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Rev Nutr 1994 14495-533


2002 40(12)1281-91



2006 45(20)1173-5








89(3)353-6





61(5)315-22







Acad Sci U S A 1985 82(8)2488-92


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Med Clin (Barc) 1988 91(12)441-4




Chem 1971 246(19)6098-105










Am J Physiol 1997 272(3 Pt 1)E485-93



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15(3)1364-76



276(29)27207-13


Lett 1979 104(1)55-8




2009 276(19)5342-56












Sci U S A 1992 89(21)10016-20





Invest 1984 74(1)104-19











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Neurochem 2004 88(5)1052-8





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Chem 1985 260(22)12224-7



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Bibliografia







6(3)309-15





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1990 265(3)1425-9








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Rev Nutr 1994 14495-533


2002 40(12)1281-91



2006 45(20)1173-5








89(3)353-6





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Acad Sci U S A 1985 82(8)2488-92


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Med Clin (Barc) 1988 91(12)441-4




Chem 1971 246(19)6098-105










Am J Physiol 1997 272(3 Pt 1)E485-93



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15(3)1364-76



276(29)27207-13


Lett 1979 104(1)55-8




2009 276(19)5342-56












Sci U S A 1992 89(21)10016-20





Invest 1984 74(1)104-19











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Neurochem 2004 88(5)1052-8





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Chem 1985 260(22)12224-7



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Conclusatildeo










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Bibliografia







6(3)309-15





32(12)920-2










4









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1990 265(3)1425-9








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Rev Nutr 1994 14495-533


2002 40(12)1281-91



2006 45(20)1173-5








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Med Clin (Barc) 1988 91(12)441-4




Chem 1971 246(19)6098-105










Am J Physiol 1997 272(3 Pt 1)E485-93



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15(3)1364-76



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Lett 1979 104(1)55-8




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Sci U S A 1992 89(21)10016-20





Invest 1984 74(1)104-19











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Neurochem 2004 88(5)1052-8





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Bibliografia







6(3)309-15





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Rev Nutr 1994 14495-533


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Chem 1971 246(19)6098-105










Am J Physiol 1997 272(3 Pt 1)E485-93



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Lett 1979 104(1)55-8




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Invest 1984 74(1)104-19











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Bibliografia







6(3)309-15





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Chem 1971 246(19)6098-105










Am J Physiol 1997 272(3 Pt 1)E485-93



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Neurochem 2004 88(5)1052-8





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Chem 1985 260(22)12224-7



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Bibliografia







6(3)309-15





32(12)920-2










4









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1990 265(3)1425-9








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Rev Nutr 1994 14495-533


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Am J Physiol 1997 272(3 Pt 1)E485-93



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Lett 1979 104(1)55-8




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Invest 1984 74(1)104-19











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Neurochem 2004 88(5)1052-8





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A

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Muscular

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Sma I (New England)













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1 - PCR de cDNA







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A B















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para TTR


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apresentados)



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pacircncreas














TTRA AA

B B B



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SAA SSCB

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real











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Conclusatildeo










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humanos






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de PAF





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Bibliografia







6(3)309-15





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10(3)308-16











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1990 265(3)1425-9








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2001 58(10)1491-521








75(4)519-631




Rev Nutr 1994 14495-533


2002 40(12)1281-91



2006 45(20)1173-5








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Med Clin (Barc) 1988 91(12)441-4




Chem 1971 246(19)6098-105










Am J Physiol 1997 272(3 Pt 1)E485-93



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15(3)1364-76



276(29)27207-13


Lett 1979 104(1)55-8




2009 276(19)5342-56












Sci U S A 1992 89(21)10016-20





Invest 1984 74(1)104-19











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2003 1626(1-3)65-74



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Neurochem 2004 88(5)1052-8





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Chem 1985 260(22)12224-7



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A B















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pacircncreas














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B B B



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SAD SSE


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real











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convencional



























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Conclusatildeo










doenccedila













humanos






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de PAF





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Bibliografia







6(3)309-15





32(12)920-2










4









10(3)308-16











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265(5177)1464-7












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1990 265(3)1425-9








36(1)13-7


103(2)831-9






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2001 58(10)1491-521








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Rev Nutr 1994 14495-533


2002 40(12)1281-91



2006 45(20)1173-5








89(3)353-6





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Med Clin (Barc) 1988 91(12)441-4




Chem 1971 246(19)6098-105










Am J Physiol 1997 272(3 Pt 1)E485-93



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15(3)1364-76



276(29)27207-13


Lett 1979 104(1)55-8




2009 276(19)5342-56












Sci U S A 1992 89(21)10016-20





Invest 1984 74(1)104-19











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Neurochem 2004 88(5)1052-8





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Chem 1985 260(22)12224-7



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A B















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Conclusatildeo










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humanos






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Bibliografia







6(3)309-15





32(12)920-2










4









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265(5177)1464-7












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1990 265(3)1425-9








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2001 58(10)1491-521








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Rev Nutr 1994 14495-533


2002 40(12)1281-91



2006 45(20)1173-5








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Acad Sci U S A 1985 82(8)2488-92


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Med Clin (Barc) 1988 91(12)441-4




Chem 1971 246(19)6098-105










Am J Physiol 1997 272(3 Pt 1)E485-93



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15(3)1364-76



276(29)27207-13


Lett 1979 104(1)55-8




2009 276(19)5342-56












Sci U S A 1992 89(21)10016-20





Invest 1984 74(1)104-19











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Neurochem 2004 88(5)1052-8





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Chem 1985 260(22)12224-7



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Conclusatildeo










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Bibliografia







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Rev Nutr 1994 14495-533


2002 40(12)1281-91



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Med Clin (Barc) 1988 91(12)441-4




Chem 1971 246(19)6098-105










Am J Physiol 1997 272(3 Pt 1)E485-93



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276(29)27207-13


Lett 1979 104(1)55-8




2009 276(19)5342-56












Sci U S A 1992 89(21)10016-20





Invest 1984 74(1)104-19











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Chem 1985 260(22)12224-7



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A

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Bibliografia







6(3)309-15





32(12)920-2










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Rev Nutr 1994 14495-533


2002 40(12)1281-91



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Chem 1971 246(19)6098-105










Am J Physiol 1997 272(3 Pt 1)E485-93



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Lett 1979 104(1)55-8




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Sci U S A 1992 89(21)10016-20





Invest 1984 74(1)104-19











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Neurochem 2004 88(5)1052-8





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Bibliografia







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Rev Nutr 1994 14495-533


2002 40(12)1281-91



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Chem 1971 246(19)6098-105










Am J Physiol 1997 272(3 Pt 1)E485-93



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Conclusatildeo










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Bibliografia







6(3)309-15





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Chem 1971 246(19)6098-105










Am J Physiol 1997 272(3 Pt 1)E485-93



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Lett 1979 104(1)55-8




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Invest 1984 74(1)104-19











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Neurochem 2004 88(5)1052-8





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Bibliografia







6(3)309-15





32(12)920-2










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1990 265(3)1425-9








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Rev Nutr 1994 14495-533


2002 40(12)1281-91



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Chem 1971 246(19)6098-105










Am J Physiol 1997 272(3 Pt 1)E485-93



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Lett 1979 104(1)55-8




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Sci U S A 1992 89(21)10016-20





Invest 1984 74(1)104-19











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Neurochem 2004 88(5)1052-8





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Chem 1985 260(22)12224-7



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1 - PCR de cDNA







negativo do RT-PCR


















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A B















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apresentados)



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pacircncreas














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real











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Conclusatildeo










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Bibliografia







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Rev Nutr 1994 14495-533


2002 40(12)1281-91



2006 45(20)1173-5








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Acad Sci U S A 1985 82(8)2488-92


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Med Clin (Barc) 1988 91(12)441-4




Chem 1971 246(19)6098-105










Am J Physiol 1997 272(3 Pt 1)E485-93



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15(3)1364-76



276(29)27207-13


Lett 1979 104(1)55-8




2009 276(19)5342-56












Sci U S A 1992 89(21)10016-20





Invest 1984 74(1)104-19











143 29-38




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2003 1626(1-3)65-74



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Neurochem 2004 88(5)1052-8





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Chem 1985 260(22)12224-7



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Bibliografia







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4









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1990 265(3)1425-9








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Rev Nutr 1994 14495-533


2002 40(12)1281-91



2006 45(20)1173-5








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Acad Sci U S A 1985 82(8)2488-92


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Med Clin (Barc) 1988 91(12)441-4




Chem 1971 246(19)6098-105










Am J Physiol 1997 272(3 Pt 1)E485-93



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15(3)1364-76



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Lett 1979 104(1)55-8




2009 276(19)5342-56












Sci U S A 1992 89(21)10016-20





Invest 1984 74(1)104-19











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Neurochem 2004 88(5)1052-8





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Chem 1985 260(22)12224-7



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Bibliografia







6(3)309-15





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Rev Nutr 1994 14495-533


2002 40(12)1281-91



2006 45(20)1173-5








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Chem 1971 246(19)6098-105










Am J Physiol 1997 272(3 Pt 1)E485-93



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Lett 1979 104(1)55-8




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Neurochem 2004 88(5)1052-8





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Bibliografia







6(3)309-15





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Rev Nutr 1994 14495-533


2002 40(12)1281-91



2006 45(20)1173-5








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Chem 1971 246(19)6098-105










Am J Physiol 1997 272(3 Pt 1)E485-93



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Lett 1979 104(1)55-8




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Invest 1984 74(1)104-19











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Neurochem 2004 88(5)1052-8





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Bibliografia







6(3)309-15





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Rev Nutr 1994 14495-533


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Chem 1971 246(19)6098-105










Am J Physiol 1997 272(3 Pt 1)E485-93



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Lett 1979 104(1)55-8




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Sci U S A 1992 89(21)10016-20





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Bibliografia







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Chem 1971 246(19)6098-105










Am J Physiol 1997 272(3 Pt 1)E485-93



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Lett 1979 104(1)55-8




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Bibliografia







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Rev Nutr 1994 14495-533


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Chem 1971 246(19)6098-105










Am J Physiol 1997 272(3 Pt 1)E485-93



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Lett 1979 104(1)55-8




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Bibliografia







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Rev Nutr 1994 14495-533


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Chem 1971 246(19)6098-105










Am J Physiol 1997 272(3 Pt 1)E485-93



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Lett 1979 104(1)55-8




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Invest 1984 74(1)104-19











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Bibliografia







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Rev Nutr 1994 14495-533


2002 40(12)1281-91



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Chem 1971 246(19)6098-105










Am J Physiol 1997 272(3 Pt 1)E485-93



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Lett 1979 104(1)55-8




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Sci U S A 1992 89(21)10016-20





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Neurochem 2004 88(5)1052-8





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Chem 1985 260(22)12224-7



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Bibliografia







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Rev Nutr 1994 14495-533


2002 40(12)1281-91



2006 45(20)1173-5








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Med Clin (Barc) 1988 91(12)441-4




Chem 1971 246(19)6098-105










Am J Physiol 1997 272(3 Pt 1)E485-93



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15(3)1364-76



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Lett 1979 104(1)55-8




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Sci U S A 1992 89(21)10016-20





Invest 1984 74(1)104-19











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Neurochem 2004 88(5)1052-8





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Bibliografia







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Rev Nutr 1994 14495-533


2002 40(12)1281-91



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Acad Sci U S A 1985 82(8)2488-92


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Med Clin (Barc) 1988 91(12)441-4




Chem 1971 246(19)6098-105










Am J Physiol 1997 272(3 Pt 1)E485-93



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Lett 1979 104(1)55-8




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Sci U S A 1992 89(21)10016-20





Invest 1984 74(1)104-19











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Neurochem 2004 88(5)1052-8





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Chem 1985 260(22)12224-7



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Bibliografia







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Rev Nutr 1994 14495-533


2002 40(12)1281-91



2006 45(20)1173-5








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Chem 1971 246(19)6098-105










Am J Physiol 1997 272(3 Pt 1)E485-93



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Lett 1979 104(1)55-8




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Bibliografia







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Rev Nutr 1994 14495-533


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Chem 1971 246(19)6098-105










Am J Physiol 1997 272(3 Pt 1)E485-93



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Bibliografia







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Bibliografia







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Chem 1971 246(19)6098-105










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Am J Physiol 1997 272(3 Pt 1)E485-93



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Chem 1971 246(19)6098-105










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Rev Nutr 1994 14495-533


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Chem 1971 246(19)6098-105










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Bibliografia







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Rev Nutr 1994 14495-533


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Chem 1971 246(19)6098-105










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