evaluación del efecto antibacteriano de los irrigantes
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Evaluación del efecto antibacteriano delos irrigantes endodonticos contra cepasdel Enterococcus Faecalis (ATCC29212)
Item Type info:eu-repo/semantics/bachelorThesis
Authors Díaz Quispe, Yoselyn
Citation 1. Quispe D. Evaluación del efecto antibacteriano de losirrigantes endodonticos contra cepas del EnterococcusFaecalis (ATCC29212) [Internet]. Universidad Peruana deCiencias Aplicadas (UPC); 2017. Available from: http://hdl.handle.net/10757/621311
Publisher Universidad Peruana de Ciencias Aplicadas (UPC)
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EVALUACIÓN DEL EFECTO ANTIBACTERIANO DE LOS
IRRIGANTES ENDODONTICOS CONTRA CEPAS DEL
Enterococcus faecalis (ATCC29212)
TESIS
Para optar el título profesional de:
CIRUJANO DENTISTA
AUTOR
Yoselyn Díaz Quispe
ASESORES DE TESIS
Dr. Néstor Enrique Gonzales
Co-asesora: Juana del Valle
Lima - Perú
2017
DEDICATORIA
A Yrma y Benjamin, mis amados padres, por ser mi ejemplo de perseverancia y
paciencia, gracias por su amor constante y apoyo en todas mis metas, porque aprendí
que el éxito siempre está para todo aquel que deseé encontrarla, esto es para ustedes…
A Joseph y Aarón, mis grandes amores, porque jamás dudaron de mi potencial y
siempre me acompañaron en cada etapa de mi vida…
AGRADECIMIENTOS
A Dios por la oportunidad de cumplir mis sueños, ayudarme a vencer las pruebas y
bendecirme siempre
A la PhD. Juana del Valle Mendoza, docente e investigadora de la facultad de Ciencias
de salud de la Universidad Peruana de Ciencias Aplicadas, mi asesora, por
acompañarme en cada paso, su tiempo, su conocimiento, su amistad y apoyo total en
este presente estudio
Al CD. Esp. Néstor Gonzales por confiar en mí y su apoyo desde el comienzo de la
investigación
A la CD. Esp. Stefany Caballero por su paciencia y ayuda a lo largo de este camino
A todo el equipo de IIN, Carmen Tinco Valdez y Miguel Ángel Aguilar, por su apoyo y
paciencia al elaborar el presente trabajo
RESUMEN
Objetivo: Comparar in vitro el efecto antibacteriano de tres irrrigantes endodónticos
(Hipoclorito de sodio al 5%, Clorhexidina al 2% y EDTA al 17%) sobre cepas del
Enterococcus faecalis (ATCC29212).
Materiales y Métodos: Se trabajó con una muestra de 10 pocillos por grupo para
comparar el efecto antibacteriano en 24, 48 y 72 horas. Se realizaron cuatro pruebas: la
actividad antibacteriana se evaluó mediante el método de difusión en agar utilizando
medio Brain Heart infusión Broth (BHI). Por otro lado, para la concentración mínima
inhibitoria (CMI), y el efecto bactericida y bacteriostático (CMB) se empleó el método
de dilución en medio BHI. Para evaluar la prueba de citotoxicidad se utilizó la línea
celular MDCK mediante la prueba colorimétrica del MTT.
Resultados: Se observó a las 72 horas que la Clorhexidina al 2% tuvo efecto
antibacteriano sobre cepas del Enterococcus faecalis (ATCC29212) con una media de
30.45 + 8.54 mm, mientras que el NaOCl al 5% y el EDTA al 17% tuvieron una media
de 19.3+ 1.82 mm y 30.40 + 8.77 mm respectivamente. La CMI de la clorhexidina fue de
1:25 μg/ml, el CMB de la Clorhexidina fue de 1:125 μg/ml y la citotoxicidad de la
Clorhexidina fue de 65.6%.
Conclusiones: Al comparar los tres irrigantes endodónticos se demostró que la CHX al
2% es el irrigante con mayor efecto antibacteriano y el que posee menos efecto citotóxico.
Palabras Claves: Antibacterianos, Irrigantes del Conducto Radicular, Enterococcus
faecalis
ABSTRACT
Objective: To compare, in vitro, the antibacterial effect of three endodontic irrrigants
(5% Sodium Hypochlorite, 2% chlorhexidine and 17% EDTA) on strains of Enterococcus
faecalis (ATCC29212).
Materials and Methods: It was worked with a sample of 10 wells per group to compare
the antibacterial effect in 24, 48 and 72 hours. Four tests were conducted: the antibacterial
activity was evaluated with the agar diffusion method in Brain Heart Infusion Broth
(BHI). On the other hand, for the minimum inhibitory concentration (MIC) and
bactericidal and bacteriostatic effect (MBC), dilution in BHI method was used. To
evaluate the cytotoxicity test MDCK cell line was used by the MTT colorimetric assay.
Results: It was observed at 72 hours the 2% chlorhexidine had antibacterial effect on
strains of Enterococcus faecalis (ATCC29212) with an average of 30.45 + 8.54 mm,
while the 5% NaOCl and 17% EDTA had an average of 19.3 + 1.82 mm and 30.40 + 8.77
mm respectively. The MIC of chlorhexidine was 1:25 ug/ml, the MBC Chlorhexidine was
1: 125 ug/ml and the cytotoxicity of Chlorhexidine was 65.6%.
Conclusion: When comparing the three endodontic irrigants it was demonstrated that the
2% CHX is the irrigant with more antibacterial effect and has less cytotoxic effect.
Keywords: Anti-Bacterial Agents, Root Canal Irrigants, Enterococcus faecalis
ÍNDICE DE CONTENIDOS
Pág.
I.INTRODUCCIÓN 1
II.PLANTEAMIENTO DE LA INVESTIGACIÒN 3
II.1 Planteamiento del problema
II.2 Justificación
III.MARCO REFERENCIAL 6
IV.HIPÓTESIS 21
V.OBJETIVOS 22
V.1 Objetivo general
V.2 Objetivos específicos
VI.MATERIALES Y MÉTODO 23
VI.1 Diseño del estudio
VI.2 Grupo experimental
VI.3 Operacionalización de Variable
VI.4 Técnica y/o procedimiento
VI.5 Plan de análisis
VI.6 Consideraciones éticas
VII.RESULTADOS 32
VIII.DISCUSIÓN 44
XI.CONCLUSIONES 52
X.REFERENCIAS BIBLOGRÁFICAS 53
ANEXOS
ÍNDICE DE TABLAS
Pág.
TABLA 1 Evaluación del efecto antibacteriano de los irrigantes endodónticos
(NaOCl 5%, CHX 2% y EDTA 17%) sobre cepas del Enterococcus
Faecalis (ATCC29212)
35
TABLA 2 Evaluación de la Concentración Mínima Inhibitoria de los irrigantes
endodónticos sobre cepas de Enterococcus faecalis (ATCC29212)
37
TABLA 3
Evaluación del efecto bacteriostático y bactericida de los irrigantes
endodónticos sobre cepas de Enterococcus faecalis (ATCC29212)
39
TABLA 4 Evaluación de la citotoxicidad (CC50) de los irrigantes endodónticos
(NaOCl 5%, CHX 2% y EDTA 17%) sobre la línea celular MDCK
40
TABLA 5
Comparación del efecto antibacteriano de tres irrigantes endodónticos
según el tiempo de evaluación contra cepas del Enterococcus
Faecalis (ATCC29212)
42
TABLA 6 Comparación del efecto antibacteriano de los irrigantes
endodónticos a las 24, 48 y 72 horas contra cepas del Enterococcus
Faecalis (ATCC29212)
43
ÍNDICE DE GRÁFICOS
Pág.
GRÁFICO 1 Evaluación del efecto antibacteriano de los irrigantes endodónticos
(NaOCl 5%, CHX 2% y EDTA 17%) contra cepas del Enterococcus
Faecalis (ATCC29212)
36
GRÁFICO 2 Evaluación de la Concentración Mínima Inhibitoria de los irrigantes
endodónticos sobre cepas de Enterococcus faecalis (ATCC29212)
38
GRÁFICO 3
Evaluación de la citotoxicidad (CC50) de los irrigantes endodónticos
(NaOCl 5%, CHX 2% y EDTA 17%) sobre la línea celular MDCK
41
1
I. INTRODUCCIÓN
Los conductos radiculares presentan múltiples microorganismos que afectan la salud
de los tejidos periapicales, estudios previos demuestran que la bacteria que se ha
encontrado con mayor frecuencia (80-90%) es el Enterococcus faecalis.(1-3)
Esta
bacteria anaerobia facultativa es persistente en el sistema del conducto radicular, y se
encuentra asociada a los fracasos en los tratamientos endodónticos; debido a que puede
sobrevivir y contaminar al conducto tratado endodónticamente.(2)
Diferentes causas
acompañan al fracaso endodóntico, una de ellas es la dificultad que existe al eliminar
estos microorganismos debido a la cantidad de túbulos dentinarios que tiene las paredes
de la dentina, otra causa es la presencia de conductos accesorios o bifurcaciones por la
variable anatomía de los conductos radiculares. Esta bacteria persiste y se adhiere a la
dentina, impidiendo su remoción completa del conducto radicular. (3)
Por ello, existen diferentes procedimientos que permiten reducir o eliminar la cantidad
de bacterias, ayudando a mejorar el pronóstico de la pieza tratada. La preparación
química para eliminar los microorganismos del canal radicular son los irrigantes
endodónticos, (40) los cuales tienen capacidad antimicrobiana que permiten destruir el
Enterococcus faecalis en los tratamientos odontológicos. En la actualidad existe una
variedad de irrigantes tradicionales como, el hipoclorito de sodio (NaOCl), e irrigantes
relativamente nuevos como e l gluconato de clorhexidina (CHX) y el ácido etil
diamino tetracético (EDTA), entre otros. (3)
2
El hipoclorito de sodio (NaOCl) se emplea en concentraciones de 1% al 5%, en la
práctica odontológica, es eficaz e ideal para eliminar los microorganismos de los
conductos radiculares; pero su uso en altas concentraciones y en contacto con los tejidos
adyacentes pueden causar reacciones inflamatorias severas. (4)
El ácido etil diamino
tetracetico (EDTA) al 17% elimina la materia inorgánica a diferencia del hipoclorito de
sodio que solo elimina materia orgánica. También, se utiliza como lubricante, ayuda a
permeabilizar los conductos con difícil acceso, y remueve capas de desechos de los
túbulos dentinarios y canales laterales. (5)
Por otro lado, el gluconato de clorhexidina (CHX) al 2%, es un desinfectante
alternativo que tiene amplia actividad antimicrobiana, carece de capacidad de disolver
tejidos orgánicos, posee bajo grado de toxicidad, y es muy usado como irrigante para
alterar la permeabilidad de la membrana y ocasionar muerte celular. (6)
Por este motivo; el propósito de este estudio es evaluar in vitro el efecto antibacteriano
de tres irrigantes endodónticos (hipoclorito de sodio al 5%, gluconato de clorhexidina
al 2% y EDTA al 17%) sobre cepas de Enterococcus faecalis.
3
II. PLANTEAMIENTO DE INVESTIGACIÓN
II.1 Planteamiento del problema
Se sabe que una de las causas de los fracasos endodónticos es la recidiva de las bacterias
en el conducto radicular producido por su inadecuada eliminación al momento de la
preparación químico - mecánica. (7) Los fracasos endodónticos se deben principalmente
por la presencia del Enterococcus faecalis, la cual es persistente en los conductos
radiculares. (3,5,10,14,15,16,17,18,20,36) Este microorganismo es uno de los factores etiológicos
identificados de las patologías periapicales que conllevan al fracaso del tratamiento, por
lo cual se debe realizar retratamientos con el fin de eliminar la causa y garantizar salud
a los tejidos periapicales. (8-10,16)
Una gran variedad de irrigantes endodónticos se usan en la actualidad, y cada
odontólogo escoge a su preferencia de acuerdo a las características que poseen cada
irrigante. Se afirma que el NaOCl es el irrigante preferido, y con mayor efecto
antibacteriano en los tratamientos endodónticos.(4,35,36,39) También se afirma que el
EDTA y la clorhexidina son usados actualmente para mejorar la penetración y
desinfección del conducto radicular.(3,5,6,35,36,38-40,48) Existen numerosas
investigaciones que comparan el efecto antibacteriano de los irrigantes endodónticos
sobre cepas del Enterococcus faecalis. (3,4,17,19,20)
Conocer cada característica del
irrigante e incluso la citotoxicidad de una sustancia química es importante para evitar
daños en la mucosa oral. Existen reportes que muestran la actividad bacteriana de los
irrigantes endodónticos, sin embargo, en la mayoría de los casos es citotóxico para las
células. (,21,23,35,49) Se debe obtener un estudio completo del efecto antibacteriano, la
concentración mínima el inhibitoria, el efecto bactericida y bacteriostático, y también
4
de la citotoxicidad que es otra variable que se debe conocer para tener la seguridad que
el irrigante es biocompatible con los tejidos. El mayor efecto antibacteriano, el menor
porcentaje de concentración, e l efecto bactericida y una baja c itotoxicidad de los
irrigantes son características que hacen a un irrigante ideal para lograr el éxito en la
salud de los tejidos periapicales. (16)
Por eso, a través de esta investigación se busca responder la pregunta, ¿Cuál de los
tres tipos de irrigantes endodónticos tuvo mayor efecto antibacteriano sobre cepas de
Enterococcus faecalis?
II.2 Justificación
El presente estudio es importante porque permite generar nuevos conceptos para
conocer el efecto antibacteriano, la concentración mínima inhibitoria, el efecto
bactericida y bacteriostático, la citotoxicidad de los irrigantes endodónticos (NaOCl al
5%, CHX al 2% y EDTA al 17%) en una sola investigación; y así generar conocimiento
válido y confiable en el área de endodoncia.
Además, tiene importancia en el área clínica, ya que permite conocer los beneficios y
las desventajas de usar uno u otro irrigante. La elección correcta de irrigantes puede
lograr retratamientos efectivos y también conservar la salud a los tejidos adyacentes;
logrando así el éxito en los tratamientos de conductos. Si se logra identificar el irrigante
ideal con todas las características mencionadas, se deberá promover su uso como
primera opción y mayor frecuencia en las prácticas clínicas diarias.
5
Por este motivo, esta investigación tuvo como propósito la evaluación in vitro del efecto
antibacteriano de tres tipos de irrigantes (hipoclorito de sodio al 5%, gluconato de
clorhexidina al 2% y EDTA al 17%) sobre cepas de Enterococcus faecalis
(ATCC29212).
6
III. MARCO REFERENCIAL
Enterococcus faecalis
Es un microorganismo que tiene la capacidad de formar biopelículas a las que se
le agregan y co-agregan otros microorganismos, los cuales están incrustados en la matriz
extracelular. (4) El biofilm forma una película acondicionada en el cual se adhieren las
bacterias planctónicas o bacterias aisladas a la superficie para luego desprenderse,
este mecanismo a nivel celular es la causa de infecciones a nivel de los tejidos apicales.
Las células bacterianas dentro del biofilm desarrollan resistencia 1000 veces más que
la forma planctónica. (8)
Por ello, el Enterococcus faecalis es un o r g a n i s m o
predominante y se ha demostrado que un 70% se pueden encontrar en conductos tratados
endodónticamente. (9)
El Enterococcus faecalis es una bacteria anaerobia facultativa Grampositiva, que se
caracteriza por tener la capacidad de sobrevivir, debido a que utiliza como fuente
nutricional el suero, que se origina del ligamento periodontal y del hueso alveolar. (4)
Estos microorganismos son suficientemente pequeños para invadir y vivir dentro de los
túbulos de la dentina. Crecen en ambientes ásperos y pueden sobrevivir en los ambientes
extremos, por ejemplo, pueden crecer entre 10°C – 45°C a un pH de 9,6.(15) Poseen la
capacidad de crecer en presencia o ausencia de oxígeno. También, otra característica
importante de este organismo es que puede colonizar y sobrevivir como un organismo
solo sin el apoyo de otras bacterias. (8-10)
7
Este microorganismo es menos dependiente de los factores de virulencia, porque posee
una gran capacidad para sobrevivir y persistir como un patógeno. Cuando ingresa a los
conductos radiculares produce enzimas proteolíticas, sustancias de agregación y de
adherencia que favorecen a la persistencia de la bacteria. (8)
Además, el Enterococcus
faecalis posee serina proteasa, gelatinasa, y la proteína de unión a colágeno, que ayudan
a que se una a los túbulos dentinarios. Cada uno de estas características de la
bacteria favorece a infecciones muy diversas a nivel de los tejidos periapicales. (8,10)
Esta bacteria es un habitante normal en la cavidad oral. Se encuentra entre el 4 al 40%
de las infecciones endodónticas primarias, y la persistencia es mayor en lesiones
periapicales. En algunos casos, se ha encontrado al Enterococcus faecalis como el único
organismo presente en los dientes con lesiones periapicales. Este microorganismo se
asocia con diferentes enfermedades perirradiculares incluyendo infecciones
endodónticas, como abscesos periapicales agudos e infecciones persistentes. (11)
Efecto Antibacteriano
Es la cualidad de un fármaco o agente químico de inhibir o eliminar el crecimiento
de bacterias patógenas al actuar sobre ellas indirectamente impidiendo el desarrollo
bacteriano, o directamente causando muerte celular. (25) Existen dos métodos para
evaluar el efecto antibacteriano: El método de contacto directo y de difusión de agar.
En el método de contacto directo, el volumen del agente químico se mezcla en un
medio de cultivo; donde se puede observar la presencia o ausencia del crecimiento
bacteriano. (36) Por otro lado, en el método de difusión de agar es la prueba más común
descrito por Kirby-Bauer. (47) Este método está actualmente estandarizado por el
Subcomité Nacional de Normas de Laboratorios Clínicos (NCCLS) de los Estados
Unidos. (28,41) Se pueden efectuar este método con la ayuda de discos o solamente con
8
pocillos dentro de las placas de cultivo. (28) Dicho método, se logra saturando el disco
de papel con el agente químico o colocándolo directamente en los pocillos sobre la
superficie de placas de agar. Después de cierto periodo de tiempo se forman zonas de
inhibición alrededor de los discos o pocillos, estas zonas significan la presencia de
actividad antimicrobiana. (36)
Para poder evaluar in vitro el efecto antibacteriano, se puede distinguir efectos al
agregar un agente químico, como el efecto bacteriostático y bactericida. En el caso del
efecto bacteriostático se refiere a la inhibición del desarrollo de colonias bacterianas y
se mide mediante la Concentración Mínima inhibitoria (CMI). La técnica más frecuente
para determinar la eficacia bacteriostática in vitro es la técnica de dilución en caldo, y
radica en efectuar un cultivo en medio líquido con diferentes concentraciones de los
agentes químicos y observar la aparición de turbidez (indicador de desarrollo
bacteriano) al cabo de un tiempo determinado. También se puede efectuar en la técnica
de dilución de agar, la principal desventaja de este método es la cantidad de muestras
para evaluar. (25,26,28)
Mientras que el efecto bactericida es la muerte bacteriana producida por un fármaco o
agente químico y esto se mide por la disminución de bacterias viables. (26) Para ello se
toman muestras de los tubos en los que se determinó la CMI y se realizan diluciones
seriadas en escala logarítmica (1:2, 1:4, 1:8, etc.) que se siembran en placas de cultivo
sin microorganismo y se espera un tiempo para el desarrollo de colonias. En el recuento
de colonias se calcula el número de bacterias viables; utilizando como control un cultivo
de bacterias no expuesta al fármaco en estudio. El efecto bactericida se mide mediante
la Concentración Mínima Bactericida (CMB), la cual se define como la concentración
más baja del agente químico que elimina el 99,9% del microorganismo, al cabo de 24
9
horas de incubación. Este método es útil en casos especiales para un
conocimiento exacto de la capacidad de un antibacteriano para destruir una bacteria
específica. (28)
Efecto Citotóxico
Se define como “una alteración de las funciones celulares básicas que conlleva a que se
produzca un daño que puede ser detectado”. (31) El propósito de determinar la
citotoxicidad de diferentes sustancias y/o agentes químicos es para decidir su uso en el
área clínica. (24)
Existen diferentes pruebas in vitro para hallar el potencial citotóxico
de una sustancia química, las más comunes son: la prueba de citotoxicidad del rojo
neutro, láctico deshidrogenasa (LDH) y la prueba de MTT (bromuro de 3[4,5-
dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolio). (41,43,44) Las ventajas de estas pruebas radican
en que son sencillas, baratas, cuantificables y se pueden reproducir. (24)
En el ensayo rojo neutro se fundamenta en el protocolo descrito por Borenfreund y
Puerner (1984). En este método se realiza con placas de cultivo con 96 pocillos, cada
uno de 6,4 mm de diámetro, donde se pueda conservar las células, y utilizar múltiples
concentraciones de sustancias químicas, controles positivos y negativos. (30) Se realiza
el tratamiento a las células y se le adiciona el rojo neutro, con el fin de ser absorbido
y retenido por cada célula viva y observar los efectos inmediatos. La intensidad del
color corresponde a la acumulación del neutro rojo en los lisosomas no lesionados
que corresponde a las células vivas en cada pocillo. (44) Los resultados se obtienen
midiendo con un espectrofotómetro, donde se programa para realizar mediciones
individuales por cada pocillo. Esta metodología ayuda al investigador a tener
resultados rápidos y útiles. (27,31,32)
10
También se utiliza la prueba de LDH para hallar el efecto citotóxico. La LDH es una
enzima que se encuentra en el citoplasma de las células vivas y se libera cuando ocurre
lisis celular por una sustancia toxica. Después de realizar la prueba, se mide
inmediatamente la cantidad de LDH liberada, que es un indicador de la muerte celular
irreversible. Este ensayo se caracteriza por ser de evaluación simple y rápida. (24, 27, 44)
Otra de las pruebas más comunes es el MTT (bromuro de 3[4,5- dimetiltiazol-2-il]-2,5-
difeniltetrazolio), que fue descrito por primera vez por Mossmann en 1983. Asimismo,
Denizot y Lang, en 1986 y Hansen en 1989 realizaron modificaciones en el protocolo
con el fin de mejorar la sensibilidad del ensayo. (44,45) El MTT es una sal de tetrazolio
que es soluble en agua, el cual se convierte en un formazan de color purpura por la
unión del anillo tetrazolio a la deshidrogenasa de la mitocondria activa. Este producto
formazan es impermeable a las membranas celulares, por lo tanto, se acumula en las
células sanas. (41,44) La cantidad de formazan se puede observar por la intensidad del
color que está directamente relacionada con el grado de integridad de las mitocondrias y
se mide mediante un registro de cambios de absorbancia en un espectrofotómetro de
lectura de placas. Esta prueba es útil para descubrir compuestos citotóxicos en general,
y es un método simple, rápido y preciso. (45,46)
11
Irrigantes endodónticos
Son agentes químicos capaces de actuar sobre la flora microbiana, eliminan el tejido
necrótico y conservan lubricado el conducto. (40) Son complementos esenciales de
limpieza y conformación de los conductos radiculares para alcanzar la desinfección
antes de terminar los tratamientos endodónticos. Tres de estos irrigantes son los más
destacados: Hipoclorito de Sodio, Ácido Etilendiamino Tetracético y Clorhexidina. (50)
El Hipoclorito de sodio (NaOCl) es un líquido claro, pálido, verde-amarillento,
extremadamente alcalino (pH 11) y con fuerte olor clorino. Es el irrigante más
utilizado en el área de endodoncia por su capacidad de limpieza, efecto antibacteriano,
neutralizante de productos tóxicos, disolvente de tejido orgánico, acción emulsificante,
desodorizante y blanqueante. La falta de biocompatibilidad que posee puede originar
lesiones severas en la mucosa o en el hueso alveolar, ya que puede ocasionar
quemaduras y/o necrosis por ser un agente citotóxico. (12)
Se le ha atribuido varias
características beneficiosas durante la terapia endodóntica, como, por ejemplo: expulsa
los detritos que se liberan en la preparación biomecánica de los conductos radiculares,
humedece los conductos favoreciendo el trabajo de los instrumentos, destruye y elimina
todos los microorganismos de los conductos, tiene el poder de disolver rápidamente los
restos de tejidos y posee baja tensión superficial que ayuda a penetrar en todas las
concavidades del conducto radicular. Por ello, estas propiedades hacen al NaOCl la
opción más común para la irrigación de los conductos radiculares. (15)
El ácido etilendiamino tetracético (EDTA) es “un ácido orgánico tetracaboxilico
derivado del etano por aminación de sus dos grupos metilo y posterior diacetilación de
cada uno de los grupos aminos”. Las propiedades principales son la capacidad de
12
actuar como agente quelante de iones metálicos, fijarse al ión metálico y separarse de
la molécula en la que se encuentra. El término “quelar” deriva del griego “khele” que
significa garra o pinza. El mecanismo de acción de los agentes quelantes es “robar”
iones metálicos del complejo molecular. Gracias a esta propiedad el EDTA es muy
eficaz para eliminar Ca, Mg, Mo, Fe, Cu y Zn, que son iones metálicos que se
encuentran en la dentina del diente. (15,40)
Se afirma que el pH ideal para la descalcificación dentinaria del EDTA debe estar
próximo al pH neutro 7,5. Por ellos, en 1975 Ostby agrega sal disódica al hidróxido de
sodio para obtener sal trisódica a un pH de 7.3, logrando así la fórmula original del
EDTA al 17%.(40) Por ello, se recomienda su uso porque localiza las entradas de los
conductos, ayuda al ensanchamiento químico e inocuo de los conductos estrechos y/o
calcificados, elimina el barrido dentinario, mejora la limpieza mecánica de las paredes
del conducto radicular, posee una acción antibacteriana, aumenta la permeabilidad
dentinaria a los medicamentos y facilita la extracción de instrumentos rotos. (48)
En la década de los 40, científicos, desarrollaron la Clorhexidina (CHX) en la Industria
Imperial de Química en Inglaterra. En 1954 emergió al mercado como el antiséptico
para heridas en la piel, posteriormente comenzó a usarse en medicina y cirugía (para el
paciente). El mismo equipo de investigación desarrolló un grupo de compuestos
denominados polibisguanidas, los cuales poseen efecto antibacteriano contra
microorganismos de la cavidad bucal, siendo utilizados principalmente en el área de
endodoncia. (38)
13
La clorhexidina es un antiséptico catiónico que posee la capacidad de unirse
fuertemente a la membrana celular bacteriana, en bajas concentraciones produce un
aumento de la permeabilidad con filtración de los componentes intracelulares como el
potasio (efecto bacteriostático), y en concentraciones altas produce la precipitación del
citoplasma bacteriano y ocurre lisis celular (efecto bactericida). (6,35) En boca y los
dientes se absorbe inmediatamente a las superficies con película adquirida, proteínas
salivales y a la hidroxiapatita. Esta absorción se libera paulatinamente entre 8-12 horas
y después de 24 horas se puede encontrar la clorhexidina en concentraciones bajas.
Esta propiedad impide la colonización de bacterias durante ese tiempo. El pH de la
clorhexidina es entre 5,5 y 7,0 pero con un pH entre 5,0 y 8,0 posee efecto frente a
las bacterias Gram-positivas y Gram-negativas, y también puede reducir los
microorganismos aerobios y anaerobios. (36,38,39)
A diferencia del hipoclorito de sodio, la CHX tiene un potencial citotóxico moderado
y en el uso clínico se sugiere usar concentraciones bajas de 0.12%, 0.2 % y 2% (13)
Por ellos, cada propiedad de la clorhexidina hace de ella una opción más entre los
irrigantes endodónticos y se recomienda como una solución de irrigación final, debido
a su propiedad de inhibir la adherencia de ciertas bacterias a la dentina. (15)
En el 2003, Torabinejad y col. evaluaron la capacidad del MTAD (mezcla de un isómero
de tetraciclina, un ácido y un detergente) para eliminar al Enterococcus faecalis, y
comparar su eficacia a la del h i p o c l o r i t o de sodio (NaOCl) y ácido
etilendiaminotetraacético (EDTA). Se realizaron dos pruebas: difusión de agar y la
concentración mínima inhibitoria para estas soluciones. La medición de zonas de
14
inhibición mostró que el MTAD es tan eficaz como el NaOCl al 5,25% y
significativamente más eficaz que el EDTA (p <0,0001). La medición de las
concentraciones mínimas inhibitorias demostró que el MTAD sigue siendo eficaz a
una dilución 200x, el NaOCl deja de ejercer su actividad antibacteriana más allá de
dilución 32x y el EDTA no presentó ninguna actividad antibacteriana. Por ello, el
MTAD es una solución eficaz en la erradicación del Enterococcus faecalis. (15)
En el 2006, Bulacio y col. evaluaron la concentración mínima inhibitoria y el efecto
antibacteriano del NaOCl al 2,5%, gluconato de clorhexidina (CHX) al 0,2% y de EDTA
al 17% en Enterococcus faecalis. Se utilizó: agar y dentina radicular contaminada. Se
empleó porciones medias y apicales de raíces humanas, esterilizadas y contaminadas
con Enterococcus faecalis. Cada muestra se sumergió en soluciones de irrigación, se
incubaron a 37 ° C y se realizó un conteo de células viables a las 0, 4, 8 y 24 horas. Se
encontró que la Concentración mínima inhibitoria del NaOCl y la CHX fue de 0.2% y la
del EDTA fue menor al 5%, mientras que en la prueba de difusión de agar el NaOCl tuvo
21 mm de halos de inhibición, y la CHX y EDTA tuvieron 14 y 17 mm respectivamente.
Por lo cual se concluyó que el NaOCl al 2,5% inhibió totalmente durante 24 horas
en la zona apical y durante 8 horas en la zona media; la CHX al 0,2% provocó una
reducción de más de 5 log CFU (unidades formadoras de colonias) y el EDTA al
17% indujo una reducción de más de 3 log CFU en todas las porciones medias y apicales
de la raíz. (16)
En el 2007, Ferraz y col. evaluaron in vitro la eficacia antimicrobiana de la CHX (0,2%,
1% y 2%), CHX en gel (0,2%, 1% y 2%), y NaOCl (0.5% ,1%, 2.5%, 4% y 5.25%) contra
5 bacterias anaerobias facultativas y 4 bacterias anaerobios Gram-negativos. Se realizó la
15
prueba de difusión de agar y se midió cada pocillo para observar el efecto antibacteriano
de cada irrigante. Las zonas de inhibición de crecimiento se producen cuando las bacterias
de prueba estaban en contacto con 2% gel de gluconato de clorhexidina (11,79 mm),
siendo significativamente diferente (p <0,05) de las zonas de inhibición de crecimiento
producidos por todas las concentraciones del NaOCl, incluyendo 5.25% (9.54 mm). Sin
embargo, no hubo diferencia estadísticamente significativa (p> 0,05) entre el crecimiento
zonas de inhibición obtenidos con concentraciones iguales de solución de clorhexidina y
gel. Los resultados de este estudio indican que, en cuanto a sus propiedades
antimicrobianas se refiere, la clorhexidina tiene un gran potencial para ser utilizado como
una sustancia química auxiliar endodóntica. (35)
En el 2009, Giardino y col. evaluaron la acción antimicrobiana de Biopure MTAD,
Tetraclean, Clorhexidina y NaOCl al 5,25% contra el Enterococcus faecalis,
Porphyromonas gingivalis y Prevotella intermedia. Se utilizó el método de difusión de
agar para observar la actividad antimicrobiana. Se encontró que el NaOCl al 5,25%
indujo una zona más grande de inhibición en Prevotella intermedia y Porphyromonas
gingivalis (P <0,0001). Asimismo, el MTAD y el Tetraclean fueron más eficaces para
inhibir el crecimiento del Enterococcus faecalis bajo condiciones aeróbicas y
anaeróbicas, en comparación con la CHX al 2% y NaOCl (P <0,0001). Se concluyó que
el NaOCl al 5,25% mostró una alta actividad antimicrobiana frente a bacterias
anaerobias, el MTAD y el Tetraclean mostraron una alta acción frente a anaerobias
estrictas y facultativas, y la Clorhexidina mostró la más baja actividad antibacteriana
contra las bacterias anaerobias estrictas y facultativas. (20)
16
En el 2009, Espindel y col. compararon la efectividad en la remoción del Enterococcus
faecalis con hipoclorito de sodio al 5%, gluconato de clorhexidina al 2% y ácido
etilendiamino tetracético (EDTA) al 1,7%. Se prepararon treinta premolares extraídas
que fueron sembrados en agar BHI con las cuatro combinaciones y un grupo control
(solución salina). Se midió el crecimiento de Enterococcus faecalis por conteo de
unidades formadoras de colonias (UFC). Se observaron incontables UFC en todas las
muestras del grupo control. Finalmente, se encontró mayor cantidad de UFC en los
grupos de (hipoclorito de sodio al 5% + EDTA al 1,7%) y (gluconato de clorhexidina
al 2% + EDTA al 1,7%). El uso de EDTA al 1,7% disminuyó la efectividad de las
sustancias irrigadoras en la remoción del microorganismo. Se concluyó, que el
hipoclorito de sodio y gluconato de clorhexidina fueron relativamente efectivos en la
eliminación de Enterococcus faecalis. (3)
En el 2011, Dagna y col, compararon in vitro mediante el ensayo de MTT, la eficacia
antimicrobiana del NaOCl al 5%, CHX al 0.2%, peróxido de hidrógeno al 3% y EDTA al
17% contra Enterococcus faecalis y Streptococcus mutans. Se utilizó el método de
contacto directo con dientes humanos uniradiculares recién extraídos, los cuales se
trataron endodónticamente y se inocularon con las cepas bacterianas. Luego se dividieron
los grupos para enjuagarlos con las cuatro soluciones y un control positivo. Finalmente,
la viabilidad bacteria se evalúo por medio del ensayo de MTT. Se encontró mayor
reducción bacteriana para ambas cepas con los grupos de NaOCl al 5% y EDTA al 17%,
mostrando una reducción significativamente mayor en comparación con los otros grupos
(p<0.001). Mientras que para la CHX al 0.2% y el peróxido de hidrógeno al 3% no se
mostró diferencias significativas, pero estos dos grupos mostraron significativamente
mayores porcentajes de reducción comparado con el grupo de solución salina (p<0.001).
17
El presente estudio confirmo que el NaOCl al 5% y EDTA al 17% tuvieron mayores
efectos antimicrobianos. (50)
En el 2011, Karale y col, evaluaron in vitro la eficacia antibacteriana del NaOCl al 3%,
la alta frecuencia de corriente alterna (HFAC) (sistema endodontico endox), CHX al 2%
en la eliminación de Enterococcus faecalis de conductos infectados. Se utilizaron ochenta
dientes anteriores superiores extraídos, los cuales fueron instrumentados, esterilizados e
inoculados con la bacteria para ser incubada. Después, se dividieron los grupos para ser
sometidos a las soluciones e incubarlos durante 24 y 48 horas. Se obtuvo que el NaOCl
al 3% expuso una reducción al 100% de crecimiento bacteriano a las 24 y 48 horas.
Mientras que el HFAC mostró una reducción de 70% a las 24 horas y de 55% a las 48
horas, y para la CHX se mostró una reducción de 95% a las 24 y 48 horas. En el presente
estudio todas las soluciones son eficaces eliminando Enterococcus faecalis, pero el
NaOCl mostró una máxima actividad antibacteriana que la CHX y HFAC. (49)
En el 2012, Kamberi y col. evaluaron la eficacia antimicrobiana de Biopure MTAD,
NaOCl y EDTA contra el Enterococcus faecalis en canales de raíces contaminadas. La
muestra que se utilizó fue de cuarenta y dos dientes humanos unirradiculares extraídos,
que fueron inoculados con Enterococcus faecalis y se incubaron durante cuatro
semanas. Luego de ellos, las muestras se dividieron en dos grupos; un grupo control y
cinco grupos experimentales irrigados con soluciones de NaOCl al 1,5%, NaOCl al 3%,
Biopure MTAD; NaOCl al 1,5% / EDTA al 17% o NaOCl al 3% /EDTA al 17%. Después
de la semana de incubación, se confirmó la inhibición de la bacteria por medio de la
ausencia de turbidez del medio de incubación. Los resultados muestran diferencias
significativas entre Biopure MTAD y 1,5% NaOCl, 1,5% NaOCl / 17% de EDTA y 3%
18
NaOCl / 17% de EDTA (P = 0,008 para cada comparación), pero no hubo diferencia
significativa entre Biopure MTAD y 3% NaOCl (P = 0,242). Estos hallazgos sugieren
que Biopure MTAD posee actividad bactericida superior en comparación con el NaOCl
y E D T A contra el Enterococcus faecalis. (21)
En el 2012, Arias y col. evaluaron la actividad y la formación de biopelículas
antimicrobianas de tres barnices de clorhexidina (EC40, Cervitec - CE y Cervitec Plus
- CEP) en cinco cepas de Enterococcus faecalis: Enterococcus faecalis ATCC 29212,
Enterococcus faecalis EF-D1 (de un tratamiento endodóntico fallado), Enterococcus
faecalis 072 (queso), Enterococcus faecalis T-1765 (infección nosocomial), y una cepa
de Enterococcus durans (de un tratamiento endodóntico fracasado). Se utilizó la prueba
de contacto directo y se observaron los resultados a las 24 horas. Los resultados
demostraron que la EC40 erradico todas las cepas de Enterococcus faecalis excepto el
ATCC 29212, donde se logró una disminución de 98.78%, y la CE y CEP mostraron
mayor actividad antimicrobiana contra Enterococcus durans y Enterococcus faecalis
072. Mientras, que el EC40 inhibió completamente la formación de biofilm de
Enterococcus faecalis ATCC 29212, Enterococcus durans y Enterococcus faecalis 072,
y la CE y CEP llevaron a más del 92% de la reducción del biofilm, excepto en el caso de
Enterococcus faecalis T-1765 (76,42% en la CEP). Los tres barnices estudiados mataron
las cepas probadas de Enterococcus faecalis e inhibieron la formación del biofilm, pero
los mejores resultados se observaron en el primer barniz de clorhexidina(EC40). (13)
En 2013, Manikandan y col. evaluaron la capacidad de tolerancia alcalina del
Enterococcus faecalis. El microorganismo se cultivó en BHI y se mantuvó a diferentes
condiciones alcalinas. Se usó como irrigante el hipoclorito de sodio (NaOCl),
19
digluconato de clorhexidina (CHX) y MTAD (mezcla de un isómero tetraciclina, un
ácido, y un detergente) para evaluar la eliminación del Enterococcus faecalis. Los
resultados no mostraron diferencias estadísticamente significativas en el crecimiento
del E. faecalis debido al cambio de pH 7.3 a 12.3 y la densidad óptica media fue de
(0.193 + 0.044 a 0.139 + 0.037). Se demostró la susceptibilidad de la bacteria con el
NaOCl al 2% (0,128 + 0,03), la CHX al 1% (0,146 + 0,01), el MTAD (0.204+ 0,03) y
con el control (0,254 + 0,02). Se concluyó que la NaOCl al 2% y C H X al 1% eran
altamente eficaces en la eliminación del Enterococcus faecalis mientras MTAD tenía
actividades limitadas. (23)
En el 2013, Afzal y col. estudiaron la actividad antibacteriana de CHX 2%, NaOCl
5,25%, MTAD y Vancomicina sobre la misma bacteria. Se seleccionaron ochenta
premolares humanos y se seccionaron debajo de la unión cemento-esmalte a los 15 mm
de longitud. El Enterococcus faecalis ATCC 29212 y las cepas clínicas se sub-cultivaron
a partir de placas de agar de nutrientes en el laboratorio. Se inocularon colonias
individuales de ambas cepas a partir de cultivos de agar nutriente de triptona caldo de
soja (TSB) y se incubaron a 37 ° C durante 2 horas. Después de 2 horas, se añadieron
las muestras de dientes preparados y se incubaron a 37 ° C durante 7 días. Se dividieron
en dos grupos de 40 cada uno: el primer conjunto de 40 muestras para ATCC 29212 y
el segundo conjunto de 40 muestras de aislados clínicos. Cada set fue más subdividido
en cuatro grupos de 10 dientes de acuerdo con los irrigantes seleccionados. Los
resultados mostraron que el MTAD presento 32 mm, la Clorhexidina de 24 mm, el
Hipoclorito de Sodio de 8 mm y la vancomicina de 14 mm de halos de imbibición en el
método de difusión de agar, mientras que en método de contacto directo se realizó conteo
de unidades formadoras de colonias (UFC) encontrando para el hipoclorito de sodio cero
20
UFC, la clorhexidina tuvo 0.004 x 106 UFC, el MTAD y agua destilada tuvo una media
de 2,4 x 106 UFC y 4,7 x 106 UFC respectivamente. Se concluyó que, en el método de
difusión en disco de agar, tanta clorhexidina y MTAD mostraban una mejor propiedad
antibacteriana. Mientras, que en la prueba con dientes humanos el hipoclorito de sodio
mostro mayor propiedad antimicrobiana entre los demás irrigantes contra el
Enterococcus faecalis. (29)
21
IV. HIPÓTESIS
El hipoclorito de Sodio (NaOCl) al 5% es el irrigante con mayor efecto antibacteriano,
bacteriostático y bactericida sobre cepas de Enterococcus faecalis, y de mayor efecto
citotóxico comparado con los irrigantes de Clorhexidina al 2% y EDTA al 17%.
22
V. OBJETIVOS DEL ESTUDIO
V.1 Objetivo general:
Comparar in vitro el efecto antibacteriano de los irrrigantes endodónticos (Hipoclorito
de sodio al 5%, Clorhexidina al 2% y EDTA al 17%) sobre cepas del Enterococcus
faecalis (ATCC29212).
V.2 Objetivos específicos:
1. Evaluar el efecto antibacteriano de los irrigantes endodónticos (NaOCl 5%,
CHX 2% y EDTA 17%) sobre cepas de Enterococcus faecalis (ATCC29212).
2. Evaluar la concentración mínima inhibitoria de los irrigantes endodónticos
sobre cepas de Enterococcus faecalis (ATCC29212).
3. Evaluar el efecto bacteriostático y bactericida de los irrigantes endodónticos
sobre cepas de Enterococcus faecalis (ATCC29212).
4. Evaluar la citotoxicidad (CC50) de los irrigantes endodónticos (NaOCl 5%,
CHX 2% y EDTA 17%) sobre la línea celular MDCK.
5. Comparar el efecto antibacteriano de tres irrigantes endodónticos según el
tiempo de evaluación contra cepas del Enterococcus Faecalis (ATCC29212).
6. Comparar el efecto antibacteriano de los irrigantes endodónticos a las 24, 48 y
72 horas contra cepas del Enterococcus Faecalis (ATCC29212).
23
VI. MATERIALES Y MÉTODOS
VI1. Diseño de estudio
El diseño del estudio fue de tipo experimental in vitro.
VI2. Grupo experimental
La unidad de análisis estuvo conformada por un pocillo en placas y microplacas con
cultivos de cepas de Enterococcus faecalis (ATCC29212) frente a tres irrigantes
endodónticos NaOCl 5%, CHX 2% y EDTA 17%. El efecto antibacteriano se evaluó
mediante la técnica de difusión de agar. El tamaño muestral fue de 8 pocillos para cada
grupo, se determinó mediante el software Stata® versión 12.0, utilizando la fórmula de
comparación de dos medias, para lo cual se tomaron los datos encontrados en la prueba
piloto. Por disponibilidad de insumos se trabajó con más de 8, o sea 10 pocillos (Anexo
1)
La distribución de los grupos quedo establecida de la siguiente manera:
Grupo 1: Un pocillo e n placas y microplacas de Cultivo de Enterococcus faecalis
( ATCC29212) frente a la solución de NaOCl al 5% a las 24, 48 y 72 horas.
Grupo 2: Un pocillo e n placas y microplacas de Cultivo de Enterococcus faecalis
( ATCC29212) frente a la solución de Clorhexidina al 2% a las 24, 48 y 72 horas.
Grupo 3: Un pocillo e n p lacas y microplacas de Cultivo de Enterococcus faecalis
( ATCC29212) frente a la solución de EDTA al 17% a las 24, 48 y 72 horas.
Grupo 4: Un pocillo e n p lacas y microplacas de Cultivo de Enterococcus faecalis
( ATCC29212) frente a la solución de PBS (tampón fosfato salino) a las 24, 48 y 72
horas.
24
Criterios de Selección
1. Un pocillo en placas de 15 cm de diámetro con cultivo de Enterococcus faecalis
(ATCC29212) frente a la solución de NaOCl al 5%.
2. Un pocillo en placas de 15 cm de diámetro con cultivo de Enterococcus faecalis
(ATCC29212) frente a la solución de Clorhexidina al 2%.
3. Un pocillo en placas de 15 cm de diámetro con cultivo de Enterococcus faecalis
(ATCC29212) frente a la solución de EDTA al 17%.
4. Un pocillo en placas de 15 cm de diámetro con cultivo de Enterococcus faecalis
(ATCC29212) frente a la solución de PBS.
5. Microplacas de 96 pocillos con cultivo de Enterococcus faecalis (ATCC29212)
frente a la solución de NaOCl al 5%.
6. Microplacas de 96 pocillos con cultivo de Enterococcus faecalis (ATCC29212)
frente a la solución de Clorhexidina al 2%.
7. Microplacas de 96 pocillos con cultivo de Enterococcus faecalis (ATCC29212)
frente a la solución de EDTA al 17%.
8. Microplacas de 96 pocillos con cultivo de Enterococcus faecalis (ATCC29212)
frente a la solución de PBS.
25
VI3. Operacionalización de variables
Variable
Definición Operacional
Indicadores
Tipo
Escala de
medición
Valores
Efectividad
bacteriana
Inhibición del desarrollo o
crecimiento de las bacterias
debido a la presencia de los
irrigantes endodónticos
Método de
difusión en
pocillos
Cuantitativa
De razón
Continua
Milímetros
de
inhibición
Irrigantes
endodónticos
Agentes líquidos con
capacidad de eliminar
microorganismos
Tipos
irrigantes
Cualitativa
Nominal
politómica
- NaOCl al 5%
- CHX al 2%
- EDTA al 17%
Concentración
mínima
inhibitoria
Cantidad del extracto
en la cual es inhibido el
crecimiento bacteriano
Método de
microdilución
Cuantitativa
De razón
Continua
Milímetros de
mínima inhibitoria
Efecto
bactericida y
bacteriostático
Menor concentración de la
sustancia capaz de inhibir
totalmente el crecimiento
microbiano
Método de
difusión de
agar
Cualitativa
Nominal
Dicotómica
CMB /
Ausencia de
CMB
Citotoxicidad
Concentración de una
sustancia que disminuye la
viabilidad de las células a
un 50%
Prueba de
MTT
Cuantitativo
Intervalo
Continua
Porcentaje
de
absorbancia
Tiempo
Periodo determinado para
evaluar los resultados de
cada prueba
Ficha de
recolección
de datos
Cualitativo
Ordinal
Politómica
24, 48 y 72 horas
26
VI4. Técnica y/ o procedimiento
Permisos
Se procedió a enviar una carta por medio de la co-asesora, encargada del laboratorio
de microbiología y biología molecular del instituto de investigación nutricional (IIN)
– Universidad Agraria para poder realizar los procedimientos microbiológicos y
químicos.
Capacitación
Se realizó un entrenamiento para realizar la preparación de los especímenes, placas y
microplacas de Enterococcus faecalis, y una capacitación previa para la identificación
de las unidades formadoras de colonias bacterianas. Se elaboró bajo la supervisión y
colaboración de la co-asesora, encargada del laboratorio de microbiología y biología
molecular.
Recolección de irrigantes endodónticos y bacteria
Los irrigantes endodónticos (NaOCl al 5% “Ciatex®”, CHX 2% “FGM
®” y EDTA al
17% “Eufar®”) que se utilizaron en el estudio se adquirieron en el Stand Mogollones
(Cercado de Lima, Perú). Además, el Enterococcus faecalis (ATCC29212) se adquirió
del laboratorio GenLab del Perú, representante del laboratorio MicroBiologics (USA).
Las bacterias fueron cultivadas siguiendo las instrucciones del fabricante. (Anexo 6)
Cultivo bacteriano
Las muestras bacterianas se cultivaron en placas de agar BHI (Agar de infusión de
cerebro corazón).
27
Para lo cual se comprimió la parte superior de la ampolla del tubo que contenía el
microorganismo hasta que se liberó el líquido que hidrato a las bacterias liofilizadas.
Luego, se apretó la parte inferior de la unidad y se trituro el sedimento con el líquido
hasta que la suspensión del sedimento se volvió homogénea. Posteriormente el hisopo
incluido se saturo con las bacterias hidratadas y se transfirió a una placa de agar BHI.
Se inoculo la placa de cultivo haciendo rodar el hisopo con suavidad sobre un tercio de
la placa y con ayuda de un asa de siembra estéril, se creó vetas para facilitar el cultivo
y aislamiento de las colonias. Las placas que contenían las bacterias fueron incubadas
en una cámara de anaerobiosis controladas con anaerocult y anaerotest a 37°C durante
72 horas. (Anexo 7)
División por grupos
Se procedió a dividir en cuatro grupos y se codifico de acuerdo a cada grupo. La
distribución fue de la siguiente manera:
Grupo 1: Un pocillo e n Placas y Microplacas de Cultivo de Enterococcus faecalis
( ATCC29212) frente a la solución de NaOCl al 5% a las 24, 48 y 72 horas.
Grupo 2: Un pocillo en Placas y Microplacas de Cultivo de Enterococcus faecalis
(ATCC29212) a la solución de Clorhexidina al 2% a las 24, 48 y 72 horas.
Grupo 3: Un pocillo en Placas y Microplacas de Cultivo de Enterococcus faecalis
(ATCC29212) a la solución de EDTA al 17% a las 24, 48 y 72 horas.
Grupo 4: Un pocillo en Placas y Microplacas de Cultivo de Enterococcus faecalis
(ATCC29212) a la solución de PBS (tampón fosfato salino) a las 24, 48 y 72 horas.
28
Actividad antibacteriana
La actividad antibacteriana se analizó mediante el método de difusión de agar en
pocillos (perforación en gel de agar). (25) Se utilizó placas de Agar BHI inoculadas con
0.5 ml de la bacteria evaluada (la bacteria utilizada para la inoculación estuvo en una
infusión de Agar BHI). Las placas fueron incubadas durante 3 horas a temperatura
ambiente hasta que se solidifico el agar que contiene la bacteria. Posteriormente, con
ayuda de un sacabocado, en cada una de las placas se realizó perforaciones de 9 mm de
diámetro. A cada pocillo se le adicionará 0,2 ml de cada uno de los irrigantes
endodónticos evaluados (NaOCl 5%, CHX 2% y EDTA 17%), como control se utilizó
PSB (tampón fosfato salino). Todo el procedimiento fue realizado dentro de una cabina
de flujo laminar tipo II para mantener las condiciones de esterilidad. Todas las placas
fueron incubadas en condiciones de aerobiosis controlada, a 37°C durante 24, 48 y 72
horas. Trascurrido el tiempo de incubación, se procedió a medir con una regla los
diámetros de los halos de inhibición en milímetros (mm). Los datos fueron registrados
mediante una ficha de recolección de datos. (Anexo 2 y Anexo 8)
Concentración mínima inhibitoria (método de microdilución)
Este método permite determinar la concentración mínima inhibitoria (CMI) de cada
extracto siguiendo las recomendaciones del Clinical Laboratory Standards Institute
(CLSI, 2012).
Para lo cual se realizó diluciones seriadas entre 100-0 μg/ml de los irrigantes
endodónticos utilizados (NaOCl 5%, CHX 2% y EDTA 17%). En las placas de Agar
BHI inoculadas con la bacteria se realizaron 3 pocillos por cada placa Petri y se adiciono
29
200 µl de cada dilución, previamente se vibró en Vortex para lograr homogeneidad de
la dilución.
Las placas contenidas con las diluciones se incubaron en condiciones de aerobiosis
controladas a 37°C durante 24, 48 y 72 horas. Finalmente, se procedió a medir cada
halo de inhibición y los datos fueron registrados mediante una ficha de recolección de
datos. (Anexo 3 y Anexo 9)
Concentración mínima bactericida (CMB)
Para la determinación de la concentración mínima bactericida (CMB) se realizó en la
campana de flujo laminar diluciones de los tres irrigantes endodónticos en placas de
microtiter de 96 pocillos. Se adiciono 200 μl de cada dilución y 2 μl de suspensión
bacteriana (0.5 McFarland). Después, se colocó cada dilución en las placas de Agar
BHI y se dispersó la dilución con el asa de siembra. Finalmente, las muestras fueron
incubadas en condiciones aeróbicas a 37ºC durante 24, 48 y 72 horas. Se observaron en
estos tiempos y los datos fueron registrados mediante una ficha de recolección de datos
(Anexo 4 y Anexo 10)
Actividad citotóxica o prueba de citotoxicidad (ensayo del MTT)
La citotoxicidad de los irrigantes endodónticos (NaOCl 5%, CHX 2% y EDTA 17%)
fue evaluado utilizando una prueba colorimétrica basada en la reducción de 3-(4,5-
Dimetiltiazol-2-yl)-2,5-difenil tetrazolio bromuro (MTT) por las enzimas
mitocondriales (1,2, 3). La prueba fue realizada en una microplaca para cultivo celular
de 96 pocillos estéril. (8 mm de diámetro; Falcon Plastics, Oxnard, CA).
30
En cada pocillo se cultivó 1x104 células/pocillo MDCK (células de riñón de mono) en
200 µL de medio DMEN suplementado (500 ml Dulbeco suplementado con 50 ml de
suero bovino fetal, 5.5 ml de penicilina/eritromicina). Las muestras fueron incubadas
a 37 ºC en una atmosfera húmeda al 5% de CO2 durante 24 horas. Posteriormente, a
la monocapa celular se le adiciono los irrigantes endodónticos a diferentes
concentraciones (escala 1/1 a 1/1000). Para cada ensayo se utilizó un control positivo
de viabilidad celular (medio de cultivo, pero sin ningún tipo de extracto). El cultivo fue
incubado a 37ºC durante 3 días. La morfología de las células fue inspeccionada
diariamente y observada al microscopio por si se detectase alguna alteración.
Posteriormente se le adiciono 20µL de solución de MTT (3mg/mL en PBS 1X) a cada
pocillo. Las muestras fueron incubadas durante 3 horas a 37 ºC. El medio fue
cuidadosamente removido y se obtuvo los cristales de formazán, los cuales fueron
diluidos con 200µL DMSO (Dimetil Sulfóxido).
Finalmente, la viabilidad celular fue calculada como porcentaje de la absorbancia
obtenida en cada pocillo vs. el control de células no tratadas. Los valores de absorbancia
(570nm) fueron medidos en un lector de ELISA (Biorad). El CC50 fue determinado
utilizando un programa de computadora Pharm/PCS. (27)
Para confirmar los resultados
obtenidos con la prueba de MTT, las monocapas serán evaluadas microscópicamente
para evidenciar cambios morfológicos. Los datos fueron registrados mediante una ficha
de recolección de datos. (Anexo 5 y Anexo 11)
31
VI5. Plan de análisis
Para el análisis univariado se procedió a obtener la media y desviación estándar para
cada uno de los grupos de estudio conformado por los irrigantes de hipoclorito de
sodio al 5%, Clorhexidina al 2% y EDTA al 17%
Además, se determinó si la muestra tenía distribución normal mediante la prueba
de Shapiro – Wilk.
Para el análisis bivariado se procedió realizar la prueba de ANOVA por no presentar
distribución normal, de no presentar esta distribución se procedió a realizar la prueba
de Kruskall Wallis para comparar el efecto antibacteriano de cada grupo de estudios
anteriormente mencionado.
La base de datos se realizó en el programa Microsoft Excel y se analizaron los
resultados mediante el paquete estadísticos Stata® versión 12.0.
VI6. Consideraciones éticas
Este estudio no presenta implicaciones éticas debido a que se procedió a realizar
pruebas in vitro que consiste en comparar el efecto antibacteriano de los irrigantes en
la bacteria del Enterococcus faecalis (ATCC29212).
Se procedió a realizar una solicitud dirigida al comité de ética de la Universidad
Peruana de Ciencias Aplicadas, para que autorizar la ejecución del proyecto de
investigación. Posteriormente se procedió a enviar una solicitud a la Oficina de Grados
y títulos para la aprobación del trabajo de tesis. (Anexo 12)
32
VII. RESULTADOS
El presente estudio tuvo como objetivo comparar in vitro el efecto antibacteriano de los
irrigantes endodónticos (Hipoclorito de sodio al 5%, y Clorhexidina al 2% y EDTA al
17%) sobre cepas del Enterococcus faecalis (ATCC29212) en tres tiempos 24, 48 y 72
horas. Para ello, se realizaron 10 pocillos por cada grupo y como control positivo se utilizó
PBS (solución fosfato salino). Los resultados mostraron promedios similares a las 24
horas, a las 48 horas el EDTA al 17% tuvo mayor efecto, mientras que a las 72 horas la
Clorhexidina al 2% (30.45 mm) y el EDTA al 17% (30.4 mm) tuvieron mayor efecto
antibacteriano que el NaOCl al 5%.
En la tabla 1, se evaluó el efecto antibacteriano de los irrigantes endodónticos (NaOCl
5%, y CHX 2% y EDTA 17%) sobre cepas del Enterococcus Faecalis. Para el grupo de
NaOCl a las 24 horas el promedio fue de 19.18 + 1.45 mm, para el grupo de CHX para
este mismo tiempo se encontró el promedio de 18.7 + 3.94 mm; finalmente para el EDTA
el efecto antibacteriano fue de 19.4 + 3.83 mm. También se evaluó a las 48 horas,
encontrándose para el NaOCl, CHX y EDTA promedios de 19.3 + 1.82, 23.6 + 1.41 y
30.4 + 8.77 mm respectivamente. El último tiempo evaluado fue a las 72 horas
encontrando para el NaOCl un promedio de 19.3 + 1.82 mm, para la CHX se observó un
promedio de 30.45 + 8.54 mm y para el EDTA se encontró un promedio de 30.4 + 8.77
mm. Así mismo se realizó la prueba de Shapiro Wilk y se encontró que la distribución
fue normal para los grupos de CHX24h (p=0.087), EDTA24h (p=0.984), NaOCl48h
(p=0.999), CHX48h (p=0.198), EDTA48h (p=0.207), NaOCl72h (p=0.999) y EDTA72h
(p=0.207); finalmente no se encontró normalidad en los grupos de NaOCl24h (p=0.031)
y CHX72h (p=0.026). (Tabla y Gráfico 1)
33
Se realizó la evaluación de la concentración mínima inhibitoria ( C M I ) de los irrigantes
endodónticos sobre cepas de Enterococcus faecalis. Observándose que para el caso del
NaOCl y EDTA la CMI se obtuvo en la dilución 2 (1:5 µg/ml) con promedios de 9.92
mm y 12.56 mm respectivamente, mientras que para la CHX la CMI se obtuvo en la
dilución 3 (1:25 µg/ml) con un promedio de 9 mm. Por otro lado, a partir de la dilución 4
(1:125 µg/ml) no se encontró efecto antibacteriano de dichos irrigantes endodónticos.
(Tabla y Gráfico 2)
Al evaluar el efecto bactericida (CMB) de los irrigantes endodónticos sobre cepas de
Enterococcus faecalis. Se observó que para el NaOCl y EDTA la CMB se obtuvo hasta
la dilución 3 (1:25 µg/ml), mientras que la CHX es bactericida hasta la dilución 4 (1:125
µg/ml). Por otro lado, a partir de la dilución 5 (1:725 µg/ml) no se encontró efecto
bactericida de los irrigantes endodónticos. (Tabla 3)
Se evaluó la citotoxicidad (CC50) de los irrigantes endodónticos (NaOCl 5%, CHX 2%
y EDTA 17%) sobre la línea celular inmortalizada MDCK. Los resultados indican que el
NaOCl y EDTA son altamente tóxicos a bajas concentraciones, la CC50 se observa a una
concentración del 5%, con una viabilidad celular de 28.78% y 28.09% respectivamente.
También se pudo observar los resultados a una concentración de 50% del NaOCl con un
promedio de 5.34%, CHX al 65.60% y EDTA al 13.07%. (Tabla 4 y Gráfico 3)
Se realizó la comparación del efecto antibacteriano de tres irrigantes endodónticos según
el tiempo de evaluación (24, 48 y 72 horas) contra cepas del Enterococcus Faecalis. Se
realizó la prueba de Kruskall Wallis encontrándose para el NaOCl que no existen
diferencias significativas a las 24, 48 y 72 horas, mostrando un p valor de 0.804, en la
34
CHX se encontró diferencias significativas al comparar el efecto antibacteriano en los
tres tiempos, encontrándose un mayor promedio a las 72 horas (p=0.003). Finalmente,
para el EDTA se realizó la prueba de ANOVA y se encontró diferencias significativas,
observando promedios similares a las 48 y 72 horas con un p valor de 0.032. (Tabla 5)
En la tabla 6 se comparó el efecto antibacteriano de los irrigantes endodónticos a las
24, 48 y 72 horas contra cepas del Enterococcus Faecalis. Se realizó la prueba de
Kruskall Wallis a las 24 horas no encontrándose diferencias significativas para el
NaOCl, CHX y EDTA con un p valor de 0.769, mientras que a las 48 horas se realizó
la prueba de ANOVA y se encontró diferencias significativas con un p valor de 0.000.
Finalmente, para las 72 horas se realizó la prueba de Kruskall Wallis encontrándose
diferencias significativas con un p valor de 0.000. (Tabla 6)
35
TABLA 1
Evaluación del efecto antibacteriano de los irrigantes endodónticos (NaOCl
5%, CHX 2% y EDTA 17%) sobre cepas del Enterococcus Faecalis
(ATCC29212)
Grupo Media
(mm) Mediana D.E Mínimo Máximo Normalidad*
NaOCl24h 19.18 19.75 1.45 17 21 0.031
CHX24h 18.7 19 3.94 14 23 0.087
EDTA24h 19.4 20 3.83 15 23 0.984
NaOCl48h 19.3 19.5 1.82 17 21 0.999
CHX48h 23.6 23.5 1.41 22 26 0.198
EDTA48h 30.4 29 8.77 22 40 0.207
NaOCl72h 19.3 19.5 1.82 17 21 0.999
CHX72h 30.45 30 8.54 22 40 0.026
EDTA72h 30.4 29 8.77 22 40 0.207
*Prueba de Shapiro Wilk
Nivel de significancia estadística, (p>0.05)
36
GRÁFICO 1
Evaluación del efecto antibacteriano de los irrigantes endodónticos (NaOCl
5%, CHX 2% y EDTA 17%) sobre cepas del Enterococcus Faecalis
(ATCC29212)
0
10
20
30
40
NaOCl 5% CHX 2% EDTA 17%
19.18 18.7 19.4
19.323.6
30.419.3
30.45 30.4
Hal
os
de
inhib
icio
n (
mm
)
Irrigantes Endodónticos
24 horas 48 horas 72 horas
37
TABLA 2
Evaluación de la Concentración Mínima Inhibitoria de los irrigantes endodónticos sobre cepas de Enterococcus faecalis
(ATCC29212)
mm: Tamaño de los halos de inhibición
Stock (concentración inicial): NaOCl 5%, CHX 2% y EDTA 17%
Irrigantes Diluciones (ug/ml)
STOCK (1:5) (1:25) (1:125) (1:725) (1:3500) (1:15000) (1:745000)
NaOCl 18.98 9.92 0 0 0 0 0 0
CHX 30.45 20.11 9 0 0 0 0 0
EDTA 30.8 12.56 0 0 0 0 0 0
38
GRÁFICO 2
Evaluación de la Concentración Mínima Inhibitoria de los irrigantes
endodónticos sobre cepas de Enterococcus faecalis (ATCC29212)
mm: Tamaño de los halos de inhibición
Stock (concentración inicial): NaOCl 5%, CHX 2% y EDTA 17%
0
5
10
15
20
25
30
35
Halo
s d
e i
nh
ibic
ión
(m
m)
Diluciones de Irrigantes
NaOCl
CHX
EDTA
39
TABLA 3
Evaluación del efecto bacteriostático y bactericida de los irrigantes endodónticos sobre cepas de Enterococcus faecalis
(ATCC29212)
Microorganismo Irrigantes Concentración (ug/ml)
STOCK 1:5 1:25 1:125 1:725 1:3500 1:15000 1:745000
Enterococcus
faecalis
NaOCl - - CMB - - - - -
CHX - - - CMB - - - -
EDTA - - CMB - - - - -
CMB: Concentración mínima bactericida
Stock (concentración inicial): NaOCl 5%, CHX 2% y EDTA 17%
40
TABLA 4
Evaluación de la citotoxicidad (CC50) de los irrigantes endodónticos (NaOCl 5%, CHX 2% y EDTA 17%)
sobre la línea celular MDCK
CN: Control negativo
Irrigantes Concentraciones V/V (%)
0 5 10 20 30 40 50 CN
NaOCl 5% 100 28.78 14.25 10.96 13.03 9.09 5.34 4.03
CHX 2% 100 99.76 99.73 99.43 96.80 71.93 65.60 2.95
EDTA17% 100 28.09 17.25 13.67 14.79 12.39 13.07 7.17
41
GRÁFICO 3
Evaluación de la citotoxicidad (CC50) de los irrigantes endodónticos (NaOCl
5%, CHX 2% y EDTA 17%) sobre la línea celular MDCK
CN: Control negativo
42
TABLA 5
Comparación del efecto antibacteriano de tres irrigantes endodónticos según el
tiempo de evaluación contra cepas del Enterococcus Faecalis (ATCC29212)
Irrigante Tiempo
(horas) Media D.E p
NaOCL 5%
24 19.18 1.45
0.804* 48 19.3 1.82
72 19.3 1.82
CHX 2%
24 18.7 3.94
0.003* 48 23.6 1.41
72 30.45 8.54
EDTA 17%
24 19.4 3.83
0.032** 48 30.4 8.77
72 30.4 8.77
* Prueba de Kruskall Wallis
** Prueba de ANOVA
Nivel de significancia estadística, (p<0.05)
43
TABLA 6
Comparación del efecto antibacteriano de los irrigantes endodónticos a las 24,
48 y 72 horas contra cepas del Enterococcus Faecalis (ATCC29212)
Tiempo Irrigante Media D.E p
24 horas
NaOCL 5% 19.18 1.45
0.769* CHX 2% 18.7 3.94
EDTA 17% 19.4 3.83
48 horas
NaOCL 5% 19.3 1.82
0.000** CHX 2% 23.6 1.41
EDTA 17% 30.4 8.77
72 horas
NaOCL 5% 19.3 1.82
0.000* CHX 2% 30.45 8.54
EDTA 17% 30.4 8.77
* Prueba de Kruskall Wallis
** Prueba de ANOVA
Nivel de significancia estadística, (p<0.05)
44
V. DISCUSION
En los últimos años, se ha reportado que la bacteria Enterococcus faecalis se encuentra
en un 80-90% en los conductos radiculares. (1,3) Por tal motivo, este estudio tuvo como
finalidad evaluar in vitro el efecto antibacteriano de tres tipos de irrigantes usados en el
área de endodoncia (Hipoclorito de sodio al 5%, Clorhexidina al 2% y EDTA al 17%)
sobre cepas del Enterococcus faecalis (ATCC29212).
Existen diferentes métodos para evaluar el efecto antibacteriano, siendo las más
utilizadas, la difusión de agar en discos y difusión agar en pocillos (28). En este estudio
se eligió el método de difusión de pocillos, similar a lo realizado por Ferraz y col. en el
año 2007. (35) La ventaja de este método es que el irrigante endodóntico está en contacto
directo en los pocillos, lo cual favorece a una mayor sensibilidad del irrigante. Además,
es una técnica simple, fácil de realizar e interpretar los resultados. (36) Mientras que, en
el método de discos, el grosor y el tamaño del poro del papel es muchas veces una
limitante, además de su alto costo. (28) En el presente estudio se utilizó el método de
difusión de agar de pocillos, por las ventajas antes mencionadas para determinar el efecto
antibacteriano de los irrigantes endodónticos.
Se evaluó la concentración mínima inhibitoria (CMI) de los irrigantes endodónticos, en
esta investigación se utilizó la técnica de dilución de caldo BHI (Brain Heart Infussion),
donde se puede obtener cultivos de microorganismos de difícil y rápido crecimiento entre
los que se incluyen a bacterias anaerobias como el Enterococcus faecalis. En el estudio
realizado por Stella y col. (28) realizaron la comparación de técnicas mostrando que la
técnica de dilución en caldo es la más sensible y específica. La primordial ventaja de la
45
dilución en caldo radica en utilizar tubos o microplacas que aumentan la sensibilidad para
el efecto antibacteriano debido a las diluciones pequeñas, lo cual favorece a inhibir a la
bacteria y es de vital importancia al momento de encontrar la concentración mínima
inhibitoria. (16,25,26,28,41)
Asimismo, en el presente estudio se evaluó como otra variable, el potencial citotóxico de
los irrigantes endodónticos. El propósito de determinar esta característica de los irrigantes
endodónticos, se debe porque ellos son usados clínicamente y la citotoxicidad es crucial
para su acción. (24,27) Para el presente estudio se utilizó el ensayo de reducción del MTT
debido a que es un método sencillo, cuantitativo que permite determinar la viabilidad
celular, la cual es determinada por la actividad mitocondrial de las células viables.
Asimismo, Huertas en el año 2015, también realizó la prueba de citotoxicidad y demostró
que el MTT tiene como ventaja que es un método cuantitativo a diferencia de los otros
métodos que son cualitativos. (32,33, 41)
Existen diversos irrigantes para la desinfección de los conductos en los tratamientos de
endodoncia, y los más usados y conocidos son el Hipoclorito de Sodio (NaOCl),
Gluconato de Clorhexidina (CHX) y Ácido etilendiamino tetracético (EDTA). El NaOCl
es el más utilizado en el área de endodoncia por su capacidad antibacteriana, disolvente
de tejido orgánico, pero es un agente irritante y tóxico. (4,35,36,39) Mientras que la
Clorhexidina tiene una amplia gama de actividad contra las bacterias Gram positivas y
negativas, posee efecto bacteriostático y bactericida, y tiene poca o ninguna capacidad
tóxica. (6,35,36,38,39) Finalmente, el EDTA se utiliza como lubricante, ayuda en la
localización de los conductos con difícil acceso, remueve capas de desechos de los
túbulos dentinarios y canales laterales.(3,5,40,48) Cada uno se usa en diferentes
46
concentraciones, según Mohammad y col. en el año 2009, las concentraciones más usadas
son NaOCl al 5%, CHX al 2% y EDTA al 17%; debido a que cuando se usa en
concentraciones idénticas, sus efectos antibacterianos en ex vivo (en la dentina infectada)
e in vivo (en el canal de la raíz sistema) son similares.(35,38)
La bibliografía recientemente menciona que el Enterococcus faecalis sigue siendo el
microorganismo más resistente en los conductos radiculares (3,5,10,14,15,16,17,18,20,36) y
principalmente, se encuentra en infecciones endodónticas. (11) Por este motivo, es
importante evaluar el comportamiento del Enterococcus faecalis frente a los diferentes
irrigantes. Existen estudios como Bulacio y col. en el año 2006, Afzal y col. en el año
2013, y Resmiye y col. en el 2013, entre otros; (16,28,29) que han evaluado el efecto
antibacteriano de irrigantes u otras sustancias contra este microorganismo sin embargo
estos no han evaluado todas las características que debe tener un irrigante endodóntico
(efecto antibacteriano, efecto bactericida y bacteriostática, y la citotoxicidad) en una
misma investigación como el presente estudio desea demostrar.
En el presente estudio se evaluó el efecto antibacteriano de los irrigantes endodónticos
encontrándose promedios similares en el transcurso de las primeras 24 horas, mientras
que el EDTA presentó mayor efecto antibacteriano que el NaOCl y CHX transcurridas
las 48 horas, y finalmente a las 72 horas la CHX y el EDTA presentaron mayor actividad
antibacteriana en comparación con el NaOCl; encontrándose diferencias estadísticamente
significativas. Estos resultados fueron similares con Ferraz y col. en el año 2007, (35)
quienes evaluaron in vitro la eficacia antimicrobiana de la CHX (0,2%, 1% y 2%), CHX
en gel (0,2%, 1% y 2%), y NaOCl (0.5% ,1%, 2.5%, 4% y 5.25%) contra 5 bacterias
anaerobias facultativas y 4 anaerobios Gram-negativos, sus resultados mostraron un
47
mayor efecto antibacteriano en la CHX 2% contra el Enterococcus faecalis. Un resultado
antagónico es el reportado por Bulacio y col. en el año 2006, (16) quienes encontraron que
el NaOCl tuvo mayor efecto antibacteriano frente a la CHX al 0.2% y EDTA al 17%. De
otro modo, en el estudio realizado por Afzal y col. en el año 2013, (29) obtuvieron en el
método de difusión de agar mayores zonas de inhibición en la clorhexidina y el MTAD,
mientras que en el método de contacto directo (dientes extraídos y sumergidos en los
irrigantes) se obtuvo mayor efecto antibacteriano en el NaOCl. La diferencias en los
resultados descritos anteriormente pueden deberse a que la metodología empleada fue
distinta a la de nuestro estudio, y esto puede influenciar en el mecanismo de acción de
cada uno de los irrigantes endodónticos.(29,36)
En el caso del hipoclorito de sodio, el ácido hipocloroso libera gas cloro para romper las
cadenas peptídicas, disuelve las proteínas, degrada los lípidos y ácidos grasos, inactiva
las endotoxinas de los microorganismos Gram negativos. (4) En cambio, la clorhexidina
posee un componente molecular catiónico que se adhiere a áreas de la membrana celular,
destruye la membrana citoplasmática y origina la perdida de los componentes
intracelulares en las bacterias Gram positivas y Gram negativas.(35,38) Mientras el EDTA
es como un inhibidor enzimático, debido a que posee la capacidad de fijar los iones Ca,
Mg, Mo, Fe, Cu y Zn situados en las diferentes enzimas inhabilitando su actividad
catalítica, por lo cual logra debilitar la pared celular ocasionando lisis celular.(39,48)
Entonces, en el método de difusión de agar la propiedad antibacteriana del hipoclorito de
sodio disminuye debido a que el gas cloro se evapora dentro de los pocillos, mientras que
en el método de contacto directo se utiliza los irrigantes inmediatamente y la propiedad
antibacteriana permanece activa. (19,29,40,41) Por ello, en el presente estudio el NaOCl tuvo
el menor efecto antibacteriano por el método de difusión de agar.
48
Por otro lado, se determinó que la concentración mínima inhibitoria (CMI) de la CHX
contra Entorococcus faecalis fue en la dilución de 1:25 μg/ml. Sin embargo, en la
investigación realizada por Bulacio y col. en el año 2011, (16) se evaluó la concentración
mínima inhibitoria de los mismo irrigantes sobre el Enterococcus faecalis,
Staphylococcus aureus, Escherichia coli, y Pseudomonas Aeruginosa mostrando una
concentración mínima inhibitoria para el NaOCl de 0.2%, la CHX de 0.05%, y el EDTA
de 5%. Probablemente la diferencia de éstos resultados se deba a que Bulacio determino
la CMI con el método de contacto directo y dilución, mientras que en este estudio solo se
utilizó el método de dilución. No obstante, ambos estudios coinciden que la CHX posee
mejor efecto bacteriostático.
También se evaluó el efecto bacteriostático que muestra la concentración más baja del
irrigante para inhibir y el efecto bactericida (CMB) la concentración más baja para
eliminar la bacteria, (26) mostrando que la CHX al 2% tiene CMB en la dilución de 1:125
µg/ml, es decir que solo hasta esta cantidad de dilución existe efecto bactericida y
bacteriostático. No existen reportes en la literatura sobre el efecto bacteriostático y
bactericida de los irrigantes endodónticos sobre cepas de Enterococcus faecalis, nuestro
estudio aporta conocimiento sobre la capacidad inhibitoria de los irrigantes sobre esta
bacteria. Mostrando que los tres irrigantes utilizados no solo tiene la capacidad de inhibir
sino también de eliminarla por completo con una determinada concentración.
Al evaluar la citotoxicidad se demostró que las células tratadas con CHX mostraron
mayor viabilidad celular 65,6% (CC50) frente a las células tratadas con el NaOCl y EDTA
a un volumen de irrigante de 50%. Por tal motivo podemos decir que la Clorhexidina es
menos tóxico que el NaOCl y el EDTA. Estos resultados fueron confirmados evaluando
49
la monocapa celular mediante microscopia, donde se observó la disminución del número
de células y el efecto citopático (CPE). Evidenciando que el NaOCl y EDTA destruyen
la monocapa celular a bajas concentraciones, mientras que para el caso de CHX la
monocapa pierde el 50% de viabilidad a una concentración de 50%. Esto nos indica que
NaOCl, CHX y EDTA contienen compuestos activos que producen cambios en la
morfología celular. Existe poca evidencia científica donde se evalúa la citotoxicidad de
compuestos mediante el método de MTT. El estudio de Evren y col. en el año 2015, (37)
compararon la citotoxicidad del extracto de orégano (OES), CHX 2% y NaOCl 5,25%
con el método colorímetro WST-1 en los fibroblastos del ligamento periodontal humano
(PDL). Los resultados fueron que el NaOCl mostró un efecto citotóxico más que el OES
y 2% CHX. Al comparar este estudio con la investigación de Evren y col. encontramos
que diferimos en el uso de células para evaluar la citotoxicidad; mientras que el presente
estudio utilizó células epiteliales, Evren y col. manipuló células del ligamento
periodontal. Sin embargo, ambos estudios comprueban que la CHX es menos citotóxico
de los irrigantes endodónticos.
Si discutimos directamente del efecto antibacteriano cualquiera de los irrigantes podría
ser utilizado para el fin que necesitamos en una preparación biomecánica o una
desinfección del conducto radicular, lo que se busca es justamente tratar de minimizar la
cantidad de flora bacteriana que se genera en los conductos. Sin embargo, hay que tener
en atención que cuando se trabaja clínicamente hay otras características que debemos de
constatar antes de utilizar estos irrigantes en los pacientes como, la concentración mínima
inhibitoria, el efecto bactericida y bacteriostático, teniendo en cuenta, sobre todo la
citotoxicidad que es una de las características fundamentales que hay que tener en cuidado
cuando se va trabajar directamente en los conductos radiculares que es un tejido vivo del
50
paciente. Por ello, en el presente estudio se demuestra que la Clorhexidina al 2% tuvo los
mejores resultados en cada prueba para encontrar el ideal irrigante.
La literatura menciona que el Hipoclorito de Sodio entre los irrigantes endodónticos, es
el que posee una mayor capacidad antibacteriana y es altamente tóxico; pero se puede
observar en esta investigación que el NaOCl no está actuando contra el Enterococcus
faecalis. Este resultado es consecuencia del tipo de método ejecutado, se puede afirmar
que el método de difusión de agar limita los efectos reales del Hipoclorito de sodio. Por
ello, en este estudio se demostró que la Clorhexidina al 2% y el EDTA al 17% tuvieron
mayor efecto antibacteriano que el Hipoclorito de Sodio al 5%. Por ello, se recomienda
cambiar el protocolo de los métodos utilizados para la evaluación in vitro del efecto
antibacteriano de los irrigantes estudiados.
Se demostró en esta investigación que la Clorhexidina al 2% tuvo un mayor efecto
antibacteriano, bacteriostático, bactericida y menor efecto citotóxico que el NaOCl al 5%
y el EDTA al 17%. Sin embargo, toda investigación in vitro presenta limitaciones. En
este tipo de indagaciones hay que tener en consideración, primero que los
microorganismos no están perennes en una placa in vitro, sino que se encuentran dentro
de toda la anatomía radicular; en segundo la flora de los conductos radiculares es mixta,
mientras que en este estudio se utilizó el microorganismo más resistente, y finalmente en
el estudio no existe una interacción entre diversas bacterias, lo cual en clínica si lo
encontramos. También, se debe tener en consideración los tiempos que se emplearon en
este estudio, debido a que en el área clínica el uso de cada uno de estos irrrigantes tiene
intervalos de tiempos muy cortos y no se deja en reposo el irrigante endodóntico dentro
de los canales radiculares, mientras que en esta investigación se colocaron los irrigantes
51
en las placas usando tiempos muy largos como 24, 48 y 72 horas, debido que estos
tiempos son protocolos del método de difusión de agar. Otra de las mayores limitantes,
es el tipo de procedimiento experimental, debido a que el método de difusión de agar es
el inicio de toda investigación para determinar el efecto antibacteriano y brinda un
panorama sobre la efectividad de diferentes sustancias, pero no tiene un efecto real
utilizando el Hipoclorito de Sodio. Se debe realizar más investigaciones con otro tipo de
método como por ejemplo, el método de contacto directo; y con los resultados después
de dicha prueba se podría extrapolarlo a la área clínica. Por esto, debido a las limitaciones
de los estudios in vitro se debe realizar con precaución la decisión final para las
aplicaciones clínicas. Se aconseja realizar más búsquedas de nuevos irrigantes con una
propiedad antimicrobiana similar, pero con menos efectos secundarios.
52
XI. CONCLUSIONES
1. La CHX al 2% y el EDTA al 17% tuvieron mejor efecto antibacteriano que el
NaOCl 5% sobre cepas del Enterococcus faecalis ATCC29212 a las 72 horas.
2. La concentración mínima inhibitoria de la CHX sobre cepas del Enterococcus
faecalis (ATCC29212) fue de 1:25 μg/ml, mientras que para el EDTA y la
NaOCl fue de 1:5 μg/ml para ambos casos.
3. El efecto bactericida y bacteriostático de la CHX sobre cepas del Enterococcus
faecalis (ATCC29212) fue de 1:125 μg/ml, mientras que para el EDTA y la
NaOCl fue de 1:25 μg/ml para ambos casos.
4. La CHX es menos citotóxica que el NaOCl y el EDTA, puesto que su CC50
(viabilidad celular) fue de 65.6%.
5. La comparación del efecto antibacteriano según el tiempo sobre cepas del
Enterococcus faecalis (ATCC29212), para el NaOCl no se encontró diferencias
significativas en los tres tiempos, mientras que para la CHX si se encontró
diferencias significativas, observándose una media de 30.45 mm a las 72 horas
y para el EDTA se encontró diferencias significativas con una media de 30.4
mm a las 48 y 72 horas.
6. La comparación del efecto antibacteriano a las 24, 48 y 72 horas sobre cepas
del Enterococcus faecalis (ATCC29212), el EDTA mostró una media de 19.4
mm a las 24 horas y de 30.4 mm a las 48 horas. Mientras que la CHX mostró
una media de 30.45 mm a las 72 horas.
53
X. REFERENCIAS BIBLOGRÁFICAS
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Enterococcus faecalis después de preparación rotatoria e irrigación con
hipoclorito de sodio al 5% y gluconato de clorhexidina al 2% con/sin EDTA
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60
Anexo 1
Determinación del tamaño de muestra en base a la prueba piloto
Comparación de dos medias
n2 = 8
n1 = 8
Estimated required sample sizes:
n2/n1 = 1.00
sd2 = 3.94
sd1 = 1.45
m2 = 23.6
m1 = 19.18
power = 0.8000
alpha = 0.0500 (two-sided)
Assumptions:
and m2 is the mean in population 2
Test Ho: m1 = m2, where m1 is the mean in population 1
Estimated sample size for two-sample comparison of means
. sampsi 19.18 23.6, sd1(1.45) sd2(3.94) alpha(0.05) power(.80)
61
Anexo 2
Ficha de Recolección de Datos
Efecto antibacteriano de tres irrigantes endodónticos sobre cultivos de cepas de
Enterococcus faecalis (ATCC29212)
Bacteria
Tipos de
irrigantes
Tamaño de halo de inhibición (mm)
Enterococcus
faecalis
(ATCC29212)
NaOCl al
5%
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
CHX al 2%
EDTA al
17%
62
Anexo 3
Ficha de Recolección de Datos
Concentración mínima inhibitoria según tres irrigantes endodónticos sobre
cultivos de cepas de Enterococcus faecalis (ATCC29212)
Bacteria
Tipos de irrigantes
Concentración gr/ ml
Enterococcus
faecalis
(ATCC29212)
NaOCl
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
CHX
EDTA
63
Anexo 4
Ficha de Recolección de Datos
Efecto bacteriostático y/o bactericida de tres irrigantes endodónticos sobre
cultivos de cepas de Enterococcus faecalis (ATCC29212)
Bacteria
Tipos de irrigantes
a la concentración
mínima inhibitoria
Tamaño de halo de inhibición (mm)
Enterococcus
faecalis
(ATCC29212)
NaOCl
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
CHX
EDTA
64
Anexo 5
Ficha de Recolección de Datos
Citotoxicidad de tres irrigantes endodónticos en línea celular MDCK
Bacteria
Tipos de irrigantes
Absorbancia (%)
Enterococcus
faecalis
(ATCC29212)
NaOCl al 5%
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
CHX al 2%
EDTA al 17%
65
Anexo 6
Recolección de irrigantes y bacteria Enterococcus faecalis (ATCC29212)
66
Anexo 7
Cultivo bacteriano
67
Anexo 8
Efecto antibacteriano
68
Anexo 9
Concentración mínima inhibitoria
69
Anexo 10
Efecto bactericida y bacteriostático
70
Anexo 11
Prueba de citotocixidad
71
Anexo 12
Carta de exoneración de ética
CEI/721-11-15
Chorrillos, 17 de noviembre de 2015
Señorita alumna
Yoselyn Díaz Quispe
Estudiante de la Carrera de Odontología
Universidad Peruana de Ciencias Aplicadas
Presente. -
Ref.: Evaluación del efecto antibacteriano de los irrigantes endodónticos contra cepas del
Enterococcus faecalis ATCC29212
Estimada alumna:
En atención a la remisión del Protocolo de la referencia, tengo a bien hacer de su conocimiento que el
Comité de Ética e Investigación (CEI) de la Facultad de Ciencias de la Salud, ha concluido que debido a
que es un estudio in vitro sin participación de seres humanos o animales queda exonerado de revisión.
En tal sentido, se recomienda seguir el trámite regular según lo indica el artículo 5.4 del Reglamento de
Grados y Títulos para Ciencias de la Salud
Sin otro particular, quedo de usted.
Dr. Aldo Vivar Mendoza
Presidente del Comité de Ética
Facultad de Ciencias de la Salud
UPC Universidad Peruana de
Ciencias Aplicadas
Avenida Alameda
San Marcos cuadra 2
Chorrillos
Lima 9 – Perú
T 511 313 3333
www.upc.edu.pe
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