estudos de hemoparasitos por evidencias morfológica, sorológica e

UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE

FACULDADE DE VETERINÁRIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA VETERINÁRIA

(CLÍNICA E REPRODUÇÃO ANIMAL)

MÁRCIA DE SOUZA XAVIER

Estudos de Hemoparasitos por evidências morfológicas, sorológicas e moleculares,

com ênfase na família Anaplasmataceae em Canis familiaris L., na região litorânea

do Estado do Rio de Janeiro.

NITERÓI - RJ

2011





Tese apresentada ao Programa De Pós-

Graduação em Medicina Veterinária

(Clínica e Reprodução Animal)

Universidade Federal Fluminense, como

requisito parcial para a obtenção do

Grau de Doutor. Área de Concentração:

Clínica Veterinária.

ORIENTADORA:Profa Dra NÁDIA REGINA PEREIRA ALMOSNY

CO-ORIENTADOR: Prof Dr ALOYSIO MELO DE FIGUEIREDO CERQUEIRA

NITERÓI - RJ

2011





Tese apresentada ao Programa De Pós-Graduação em Medicina Veterinária (Clínica e Reprodução Animal) Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para a obtenção do Grau de Doutor. Área de Concentração: Clínica Veterinária.

Aprovada em 12 de julho de 2011.

BANCA EXAMINADORA

___________________________________________ Profª Drª Nádia Regina Pereira Almosny - Orientadora

Universidade Federal Fluminense UFF

___________________________________________ Prof. Dr. Aloysio Melo de Figueiredo Cerqueira


___________________________________________ Prof. Dr. Alexsandra Rodrigues de Mendonça Favacho

Fundação Oswaldo Cruz – RJ FIOCRUZ RJ

___________________________________________ Prof. Dr. Nayro Xavier de Alencar


___________________________________________ Prof. Dr. Carlos Massard

Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro UFRRJ

___________________________________________ Prof. Dr. Eduardo Borges Viana

Universidade Federal do Tocantins UFT

___________________________________________ Prof. Dr. Gil Vicente O. da Silva

Universidade Grande Rio - UNIGRANRIO

DEDICATÓRIA

À minha família,

fonte de todo amor e compreensão.

AGRADECIMENTOS

Agradeço a todos que colaboraram e ajudaram na realização desse trabalho,

principalmente aqueles que o fizeram pelo amor e pela amizade.

Agradeço a DEUS que me deu uma família e uma legião de colegas e amigos

maravilhosos que sempre contribuem para o meu desenvolvimento.

Agradeço muito especialmente aos meus professores de Patologia Clínica

Veterinária, professor Marcílio Dias do Nascimento e a professora Nádia Regina

Pereira Almosny que levaram a me apaixonar por essa área da Medicina Veterinária

e, com isso, me sentir muito realizada na profissão. Agradeço mais uma vez a

professora Nádia pelo duplo impulso na minha trajetória profissional desde o

mestrado e agora no doutorado e, mais uma vez ao professor Marcílio, por todos os

ensinamentos que voluntaria ou involuntariamente eu recebi durante maravilhosos

anos de convivência, trabalhando juntos.

Agradeço ao professor Aloysio Mello de Figueiredo Cerqueira pelo acolhimento em

seu laboratório, pela paciência em esclarecer minhas dúvidas de biologia molecular,

solucionar problemas que aparentemente me pareciam “insolúveis” e pela amizade

que desenvolvemos.

A Universidade Federal Fluminense por ter me ensinado Medicina Veterinária e

ainda por ensinar até hoje, e mais, por trabalhar aqui, me fazendo sentir como fosse

continuidade da minha casa.

Aos programas dos governos estadual e federal, FAPERJ e CNPq, de fomento a

pesquisa universitária que permitiram, através da professora Nádia, o financiamento

desse trabalho.

EPÍGRAFE

“Quem não vive para servir não serve para viver.”

“Quem ama cuida”.

Ditados populares

SUMÁRIO

LISTA DE QUADROS, p. 12

LISTA DE TABELAS, p. 13

LISTA DE FIGURAS, p. 21

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS, p. 22

RESUMO, p. 24

ABSTRACT, p. 25

1 INTRODUÇÃO, p. 26

2 REVISÃO DE LITERATURA, p.29

2.1 HISTÓRICO E AGENTES ETIOLÓGICOS, p. 29

2.1.1 Taxonomia, p. 32

2.2 EHRLICHIOSES NOS ANIMAIS, p. 34

2.2.1 Ehrlichiose Monocítica Canina, p.35

2.2.2 Anaplasmose canina, p. 38

2.3 EPIDEMIOLOGIA, p. 42

2.3.1 Fatores de risco, p. 43

2.3.2 Ocorrência de co-infecção, p. 44

2.3.3 Ocorrência no Brasil, p. 46

2.3.4 Ocorrência em populações trombocitopênicas, p. 49

2.3.5 Estudos epidemiológicos de A. platys, p. 49

2.4 FISIOPATOGENIA, p. 50

2.4.1 Estudos biológicos, p. 50

2.4.2 Alterações celulares e na imunidade, p. 51

2.4.3 Fisiopatogenia da trombocitopenia, p. 53

2.5 PATOLOGIA CLÍNICA¸ p. 54

2.5.1 Alterações Hematológicas, p. 55

2..5.1.1 Alterações Plaquetárias, p. 55

2..5.1.2 Alterações Eritrocitárias, p. 57

2..5.1.3 Alterações Leucocitárias, p. 58

2.5.2 Alterações bioquímicas, p. 59

2.6 DIAGNÓSTICO, p. 60

2.6.1 Pesquisa microscópica direta, p.61

8

2.6.2 Testes sorológicos, p. 63

2.6.3 Isolamento microbiano, p. 68

2.6. 4 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), p. 68

2.6. 4.1 O estudo do DNA e diversidade genética, p. 69

2.6. 4.2 Detecção cruzada e análise diferencial na PCR, p. 70

2.6. 4.3 Sensibilidade diagnóstica, p. 72

2.6. 4.4 Análise comparativa entre métodos diagnósticos, p. 74

2.7 TRATAMENTO E PREVENÇÃO, p. 76

3 OBJETIVOS, p. 79

3.1 OBJETIVOS GERAIS, p.79

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS, p. 79

4 MATERIAIS E MÉTODOS, p. 80

4.1 LOCALIZAÇÃO, p. 80

4.2 ANIMAIS, p. 81

4.3 COLETA E PROCESSAMENTO DAS AMOSTRAS DE SANGUE E SORO, p. 82

4.3.1 Realização do hemograma, p. 82

4.3.2 Pesquisa de hemoparasitas, p. 83

4.3.3 Dosagens bioquímicas, p. 83

4.3.4 Detecção imunológica, p. 83

4.4 DIAGNÓSTICO MOLECULAR, p. 84

4.4.1 Extração de DNA, p. 84

4.4.2 Ensaios de PCR para detecção de Ehrlichia sp., Ehrlichia canis e

Anaplasma platys, p. 85

4.4.2.1 Iniciadores (“primers”), p. 85

4.4.2.2 Protocolos de PCR, p. 86

4.4.2.3 Análise dos produtos da PCR, p. 87

4.4.2.4 Sequenciamento de DNA dos produtos amplificados obtidos nos ensaios de

PCR, p. 87

4.4.3 Pesquisa de Babesia sp. nas amostras positivas em protocolos genéricos

para Anaplasmataceae, p. 88

4.4.4 Pesquisa de Hepatozoon sp. por PCR e sorologia para Leishmania sp., p.

88

4.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA, 88

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO, p. 89

9

5.1 ANÁLISES MORFOLÓGICAS DOS ESFREGAÇOS SANGUÍNEOS, p. 89

5.2 REAÇÕES DE PCR, p. 94

5.2.1 Reações de PCR espécie específica, p. 98

5.2.2 Associação dos resultados da PCR com os das amostras positivas na

análise microscópica direta, p. 102

5.2.3 Associação entre as amostras PCR positivas e parasitas de outros

grupos taxonômicos, p.105

5.3 REAÇÕES SOROLÓGICAS POR MÉTODO DE ELISA, p. 110

5.3.1 Reações sorológicas de E. canis, p. 112

5.3.2 Avaliação sorológica de A. phagocytophilum, p. 114

5.3.3 Associação dos resultados das amostras positivas na análise

microscópica direta com os resultados da sorologia, p. 115

5.3.4 Associação dos resultados da PCR com os da sorologia, p. 117

5.3.5 Associação dos resultados da PCR com os morfológicos e os da

sorologia, p. 120

5.3.6 Associação entre as amostras com sorologias positivas e parasitas de

outros grupos taxonômicos, p. 122

5.4 AVALIAÇÃO DA FREQUÊNCIA DE ANAPLASMATACEAE CONSIDERANDO

ANIMAIS POSITIVOS EM PELO MENOS UM MÉTODO DE DIAGNÓSTICO, p. 128

5.4.1 Frequência de E. canis, p. 130

5.4.2 Frequência de A. platys, p. 133

5.5 AVALIAÇÃO DOS EXAMES HEMATOLÓGICOS E BIOQUÍMICOS, p. 134

5.5.1 Cães com resultados PCR positivos com sorologias negativas, p. 135

5.5.1.1 Sem parasitas co-infectantes, p. 135

5.5.1.1.1 Cães PCR positivos apenas em protocolos genéricos, p. 135

5.5.1.1.2 Cães PCR positivos em protocolos específicos, p. 139

5.5.1.2 Cães PCR positivos soronegativos com parasitas co-infectantes, p. 139


5.5.1.2.2 PCR positivos em protocolos específicos, p. 141

5.5.2 Cães com resultados PCR positivos com sorologias positivas, p. 143

5.5.2.1 Cães com resultados PCR positivos com sorologias positivas sem co-

infecção, p. 143


10

5.5.2.1.1.1 Cães PCR positivos apenas em protocolos genéricos sororreativas

para E. canis, p. 143


para A. phagocytophilum, p. 144


para A.phagocytophilum e E. canis, p. 145

5.5.2.1.2 Cães PCR positivos em protocolos específicos, p. 147

5.5.2.1.2.1 Cães PCR positivos para A. platys sororreativas para A.

phlagocytophilum e/ou E. canis, p. 147

5.5.2.1.2.2 Cães PCR positivos E. canis sororreativos para A. phlagocytophilum

e/ou E. canis, p. 149

5.5.2.2. Cães com resultados PCR positivos com sorologias positivas com co-

infecção, p. 152

5.5.2.2.1 Cães PCR positivos apenas em protocolos genéricos sororreativas para E.

canis e/ou A. phagocytophilum, p. 152

5.5.2.2.2 Cães PCR positivos em protocolos específicos sororreativas, p. 161

5.5.2.2.2.1 Cães PCR positivos para A. platys sororreativas para E. canis, p. 161

5.5.2.2.2.2 Cães PCR positivos para E. canis sororreativas para E. canis e A.

phagocytophilum, p. 162

5.5.3 Cães PCR negativos soropositivos, p. 163

5.5.3.1 Cães sem parasitas co-infectantes, p. 164

5.5.3.1.1 Cães sororreativas para E. canis, p. 164

5.5.3.1.2 Cães sororreativas para A. phagocytophilum, p. 165

5.5.3.1.3 Cães sororreativos para E. canis e A. phagocytophilum, p. 166

5.5.3.2 Cães PCR negativos soropositivos com parasitas co-infectantes, p.168

5.5.3.2.1 Cães sororreativas para E. canis, p. 168

5.5.3.2.2 Cães soropositivos para A. phagocytophilum, p. 173

5.5.3.2.3 Cães sororreativas para E. canis e A. phagocytophilum, p. 177

5.5.4 Análise estatística das Alterações Hematológicas e Bioquímicas, p. 183

5.5.5 Comentários finais sobre Alterações Hematológicas e Bioquímicas, p. 191

5.6 ANIMAIS NEGATIVOS, p. 192

6 CONCLUSÕES, p, 195

7 PERSPECTIVAS, p. 196

8 BIBLIOGRAFIA REFERENCIADA, p. 197

11

9 ANEXOS, p. 220

ANEXO 1, p. 220

ANEXO 2, p. 221

ANEXO 3, p. 222

ANEXO 4, p. 223

LISTA DE QUADROS

Quadro 1. Resumo das mudanças taxonômicas nos gêneros Ehrlichia e Anaplasma,

segundo Rymaszewska e Grenda (2008), p. 35

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Resultados das pesquisas de mórulas de hemoparasitas em esfregaços

sanguíneos de cães do município de Maricá/RJ 2007, com os diferentes

tipos de glóbulos sanguíneos em que foram observadas, p. 91

Tabela 2: Resultados das pesquisas de hemoparasitas em esfregaços sanguíneos,

de cães do município de Maricá/RJ, em 2007, p. 92

Tabela 3: Resultados das pesquisas de hemoparasitas em esfregaços sanguíneos

de cães do município de Maricá/RJ, em 2007, distribuídos pelos bairros

pesquisados, mostrando as células em que se encontravam as

inclusões, p. 94

Tabela 4: Resultados de PCR para Anaplasmataceae de amostras sanguíneas de

cães do município de Maricá/RJ em 2007, p. 96

Tabela 5: Resultados da frequência de Anaplasmataceae em cães, de quatro bairros

do município de Maricá/RJ, em 2007, segundo avaliação de PCR, em

protocolos genéricos, p.99

Tabela 6: Resultados de PCR para E. canis e A. platys, em relação às reações de

protocolo genérico, de amostras sanguíneas de cães do município de

Maricá/RJ em 2007, p.99

Tabela 7: Resultados de PCR para E. canis e A. platys de amostras sanguíneas de

cães do município de Maricá/RJ em 2007, distribuídas pelos bairros

estudados, p.101

Tabela 8: Resultados da PCR de amostras sanguíneas de cães do município de

Maricá/RJ, em 2007, associados aos das pesquisas de hemoparasitas

em esfregaços sanguíneos, com suas respectivas células com inclusões.

p.104

Tabela 9: Amostras sanguíneas de cães do município de Maricá/RJ, em 2007,

distribuídas pelos 4 bairros avaliados, positivas para Anaplasmataceae

em PCR, em que outros parasitas foram detectados, por diferentes

métodos, p. 107

Tabela 10: Distribuição pelos bairros avaliados, do número de amostras sanguíneas

de cães do município de Maricá/RJ, em 2007, positivas para

Anaplasmataceae em PCR e os outros parasitas que foram detectados

por diferentes métodos, p. 108

Tabela 11: Número de amostras sanguíneas de cães do município de Maricá/RJ, em

2007, distribuídas pelos bairros estudados, positivas em PCR específico

para Ehrlichia canis/Anaplasma platys, e outros parasitas, que foram

detectados por diferentes métodos, p. 109

Tabela 11a: Número de amostras sanguíneas de cães do município de Maricá/RJ,

em 2007, distribuídas pelos bairros estudados, positivas em PCR para

Anaplasmataceae, e outros parasitas, que foram detectados por

diferentes métodos, 109

Tabela 12: Resultados com sorologia positiva para E. canis e A. phagocytophilum e

negativas, de amostras de cães do município de Maricá/RJ em 2007, p.

112

Tabela 13: Resultados com sorologia positiva para E. canis de amostras de cães do

município de Maricá/RJ em 2007, distribuídas pelos bairros, p. 113

Tabela 14: Resultados de amostras de cães do município de Maricá/RJ em 2007,

com sorologia positiva para A. phagocytophylum, distribuídas pelos

bairros, p. 115

Tabela 15: Resultados de amostras sanguíneas de cães do município de Maricá/RJ,

em 2007, positivos na pesquisas de hemoparasitas em esfregaços

sanguíneos, com suas respectivas células com inclusões associados aos

da sorologia, p. 117

Tabela 16: Resultados da PCR para família Anaplasmataceae e espécies E. canis A.

platys, de amostras sanguíneas de cães do município de Maricá/RJ, em

2007, associados aos da sorologia, p. 119

Tabela 17: Resultados com sorologia negativa em relação aos protocolos de PCR

para gêneros e espécies estudadas da família Anaplasmataceae, de

amostras de cães do município de Maricá/RJ em 2007, p. 121

Tabela 18: Resultados da PCR para família Anaplasmataceae e espécies E. canis A.

platys, de amostras sanguíneas de cães do município de Maricá/RJ, em

2007, associados aos morfológicos, com as respectivas células com

inclusões, e os da sorologia, p. 122

Tabela 18a: Resultados da pesquisa morfológica, com as respectivas células com

inclusões, de amostras sanguíneas de cães do município de Maricá/RJ,

em 2007, associados aos da PCR e aos da sorologia, p. 122

Tabela 19: Amostras de cães do município de Maricá/RJ, em 2007, com sorologia

positiva para Anaplasmataceae (E. canis e/ou A. phagocytophilum) com

parasitos co-infectantes, e os bairros onde foram coletadas, p. 124

Tabela 20: Amostras de cães do município de Maricá/RJ e os bairros onde foram

coletadas, em 2007, com sorologia positiva para Anaplasmataceae (E.

canis e/ou A. phagocytophilum) e os parasitos co-infectantes, p. 125

Tabela 21: Grupo de cães com sorologia positiva para E. canis e/ou A.

phagocytophilum, e os parasitos co-infectantes, de amostras de cães do

município de Maricá/RJ em 2007, e os bairros onde foram coletadas, p.

126

Tabela 22: Resultados de co-infecção da família Anaplasmataceae com outros

parasitas, de amostras de cães do município de Maricá/RJ em 2007,

distribuídos pelos 4 bairros avaliados, p.127

Tabela 23: Resultados de co-infecção da família Anaplasmataceae com outros

parasitas, de amostras de cães do município de Maricá/RJ em 2007,

distribuídos pelos 4 bairros avaliados, com a descrição do número de

cada parasito, p. 128

Tabela 24: Resultados das pesquisas de A. phagocytophilum e E. canis por

sorologia, Anaplasmataceae, E. canis e A. platys por PCR e esfregaços

sanguíneos, em amostras de cães do município de Maricá/RJ, em 2007,

p. 129

Tabela 24a: Resultados da frequência de Anaplasmataceae em cães do município

de Maricá/RJ em 2007, segundo avaliação de PCR, sorologia e pesquisa

em lâmina, p. 130

Tabela 25: Resultados da frequência de Anaplasmataceae em cães, de quatro

bairros do município de Maricá/RJ, em 2007, segundo avaliação de

PCR, sorologia e pesquisa em lâmina, p. 130

Tabela 26: Resultados da frequência de E. canis em cães, de quatro bairros do

município de Maricá/RJ em 2007, segundo avaliação de PCR e

sorologia, p. 132

Tabela 27: Média, desvio padrão, valor mínimo e máximo de valores hematológicos

e bioquímicos de cães, do município de Maricá/RJ em 2007, PCR

positivos/sorologia negativas para Anaplasmataceae, sem co-infecção,

p. 137

Tabela 28: Valores hematológicos e bioquímicos de cães, do município de Maricá/RJ

em 2007, PCR positivos/sorologia negativas para Anaplasmataceae,

com co-infecção, p. 141


em 2007, PCR positivos para E. canis e sorologias negativas, com co-

infecção, p.143



positivos para Anaplasmataceae, com sorologia positiva para E. canis,

sem co-infecção, p.145


em 2007, PCR positivos para Anaplasmataceae, com sorologia positivas

para A. phagocytophilum, sem co-infecção, p. 146

Tabela 32: Valores hematológicos e bioquímicos de cão, do município de Maricá/RJ

em 2007, PCR positivo para Anaplasmataceae, com sorologia positiva

para A. phagocytophilum e E. canis, sem co-infecção, p. 147

Tabela 33a: Valores hematológicos eritrocitários de cães, do município de Maricá/RJ

em 2007, PCR positivos para A. platys ou A. platys e E. canis, com

sorologias positivas para A. phagocytophilum ou E. canis, sem co-

infecção, p. 149

Tabela 33b: Valores hematológicos leucocitários de cães, do município de Maricá/RJ

em 2007, PCR positivos para A. platys ou A. platys e E. canis, com

sorologia positiva para A. phagocytophilum ou E. canis, sem co-infecção,

p.149

Tabela 33c: Valores bioquímicos de cães, do município de Maricá/RJ em 2007, PCR

positivos para A. platys ou A. platys e E. canis, com sorologias positivas

para A. phagocytophilum ou E. canis, sem co-infecção, p. 150


em 2007, PCR positivos para E. canis e sorologias positivas para E.

canis e/ou A. phagocytophilum sem co-infecção, p. 151

Tabela 35a: Média e desvio padrão de valores hematológicos eritrocitários de cães,

do município de Maricá/RJ em 2007, PCR positivos para

Anaplasmataceae, com sorologia positiva para E. canis e/ou A.

phagocytophilum, com co-infecção, p. 154

Tabela 35b: Média e desvio padrão de valores hematológicos leucocitários de cães,




Tabela 35c: Média e desvio padrão de valores bioquímicos de cães, do município de

Maricá/RJ em 2007, PCR positivos para Anaplasmataceae, com

sorologia positiva para E. canis e/ou A. phagocytophilum, com co-

infecção, p. 156


em 2007, PCR positivos para Anaplasmataceae, com sorologia positiva

para E. canis e A. phagocytophilum, com co-infecção, p. 157


em 2007, PCR positivos para Anaplasmataceae, com sorologia positiva

para E. canis e/ou A. phagocytophilum, com co-infecção, p. 158

Tabela 38: Média e desvio padrão e valores hematológicos e bioquímicos de cães,











em 2007, PCR positivo para A. platys, com sorologia positiva para E.

canis, com co-infecção, p. 163


em 2007, PCR positivo para E. canis, com sorologia positiva para E.

canis e A. phagocytophilum com co-infecção, p. 164



negativos para Anaplasmataceae, com sorologia positiva para E. canis,

sem co-infecção, p. 165

Tabela 44 Média e desvio padrão, de valores hematológicos e bioquímicos de cães,

do município de Maricá/RJ em 2007, PCR negativos para

Anaplasmataceae, com sorologia positiva para A. phagocytophilum, sem

co-infecção, p. 168

Tabela 45 Valores hematológicos e bioquímicos de cães, do município de Maricá/RJ

em 2007, PCR negativos para Anaplasmataceae, com sorologia positiva

para E. canis e A. phagocytophilum, sem co-infecção, p. 169

Tabela 46 Média, desvio padrão, valor mínimo e máximo de valores hematológicos e

bioquímicos de cães, do município de Maricá/RJ em 2007, PCR

negativos para Anaplasmataceae, com sorologia positiva para E. canis,

com co-infecção, p. 170

Tabela 47 Média e desvio padrão de valores hematológicos e bioquímicos de cães,


Anaplasmataceae, com sorologia positiva para E. canis, com co-

infecção, p. 171



para E. canis, com co-infecção, p. 172

Tabela 49 Valores hematológicos e bioquímicos de cão, do município de Maricá/RJ








para A. phagocytophilum, com co-infecção, p. 175






Anaplasmataceae, com sorologia positiva para A. phagocytophilum, com

co-infecção, p. 177












Anaplasmataceae, com sorologia positiva para E. canis e A.












e bioquímicos de cães PCR positivos/sorologia negativas sem co-

infecção do município de Maricá/RJ em 2007, p. 185


e bioquímicos de cães PCR positivos/sorologia positivas sem co-

infecção do município de Maricá/RJ em 2007, p. 186


e bioquímicos de cães PCR positivos/sorologia positivas com co-

infecção com Leishmania sp. do município de Maricá/RJ em 2007, p. 187


e bioquímicos de cães PCR negativos/sorologia positivas para

Anaplasmataceae, sem co-infecção do município de Maricá/RJ em 2007,

p. 188


e bioquímicos de cães PCR negativos/sorologia positivas com co-

infecção com Leishmania sp.do município de Maricá/RJ em 2007, p. 189

Tabela 66: Resultados das médias dos grupos estatísticos para análise da

plaquetometria de cães de Maricá/RJ em 2007, p. 190

Tabela 67: Cães negativos para Ehrlichia/Anaplasma sem e com outros parasitas em

cães do município de Maricá/RJ, em 2007, p. 195


e bioquímicos de cães PCR negativos/sorologia negativas para

Anaplasmataceae do município de Maricá/RJ em 2007, p. 195

Tabela 69: Resultados de cães negativos para Ehrlichia/Anaplasma em cães do

município de Maricá/RJ, em 2007, p. 196

LISTA DE FIGURAS

Figura 1

Figura 1 : Mapas de localização do município de Maricá. A – Mapa do Estado do Rio de Janeiro/BR; B e C – Destaques do mapa do Estado,situando Maricá com fronteiras dos municípios de Niterói (N), São Gonçalo (SG), Itaboraí (I), Tanguá (T) e Saquarema (S). Fonte: Google imagens acesso em: 02 de fevereiro de 2011. http://www.maricaense.com.br

81

Figura 2

Figura 2: Destaque do mapa do Estado do RJ/BR, situando Maricá com fronteiras de Niterói (N), São Gonçalo, Itaboraí, Tanguá e Saquarema (S). O mapa mostra também a localização aproximada de Bambuí (B), Espraiado (E), Centro de Maricá (C) e São José do Imbassaí (SJ).

Fonte: Google imagens acesso em: 02 de fevereiro de 2011, http://www.maricaense.com.br

82

http://www.maricaense.com.br/

http://www.maricaense.com.br/

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS

L Microlitro

m Micrometro

AE Aspirado Esplênico

CCZ Centro de Controle de Zoonoses

CL Concentrado Leucocitário

Comb. nov. Combinação (ou compilação) de várias espécies novas

DAI Dias Após Inoculação

EGC Ehrlichiose Granulocítica Canina

EGH Ehrlichiose Granulocítica Humana

EMC Ehrlichiose Monocítica Canina

EMH Ehrlichiose Monocítica Humana

°C Graus Celsius

g/dL Gramas por decilitro

IgG Imunoglobulina G

LG Leucometria Global

mL Mililitros

mmol/L Milimol por litro

n. e No Número

p. Página

PCR Reação em cadeia da polimerase

(do inglês “polymerase chain reaction”)

PLQT Plaquetometria

RNA Ácido ribonucléico

RNAr Ácido ribonucléico ribossomal

SAI Semanas Após Infecção

sp. nov Espécie nova, ainda sem classificação completa

SRD sem raça definida

ST Sangue Total

U/L Unidades por litro

UFF Universidade Federal Fluminense

v. Volume

RESUMO

“Ehrlichiose” é um termo genérico para infecções causadas por bactérias pertencentes à família Anaplasmataceae principalmente dos gêneros Ehrlichia e Anaplasma. Com objetivo de determinar, em cães do município de Maricá/RJ, no litoral do Estado, a ocorrência da família Anaplasmataceae, com ênfase nas espécies Ehrlichia canis e Anaplasma platys e suas alterações em exames laboratoriais hematológicos e bioquímicos, foram obtidas de 155 cães, amostras de sangue com e sem EDTA e confeccionados esfregaços sanguíneos. Foram feitos hemograma com plaquetometria, bioquímica sérica, pesquisa de hemoparasitas por métodos diretos em esfregaço e pesquisa de DNA por PCR e método indireto por sorologia. Foram observadas diferenças nos resultados das frequências, de acordo com o método diagnóstico, sendo que a sorologia foi a que detectou maior quantidade de cães positivos para Anaplasmataceae (60,1%) e Ehrlichia canis (48%). A frequência total da família Anaplasmataceae, considerando o somatório das amostras positivas em pelo menos um dos métodos, foi de 72%, a de E. canis foi 48% e, para Anaplasma platys, de 3,8%. A alteração hematológica mais frequente foi a trombocitopenia que mostrou ser mais acentuada em co-infecções e, a alteração bioquímica sérica mais frequente a hiperglobulinemia. Concluiu-se que a região estudada tem uma frequência elevada de Ehrlichia sp. e casos de co-infecções com essa bactéria.

Palavras-chave: Ehrlichia; Anaplasma; canino; Patologia Clínica

ABSTRACT

"Ehrlichiosis" is a generic term for infections caused by bacteria belonging to the family Anaplasmataceae mainly of the genera Ehrlichia and Anaplasma. In order to determine, in dogs in the city of Marica / RJ, on the coast of the State, the occurrence of the family Anaplasmataceae, with emphasis on species Ehrlichia canis and Anaplasma platys and their changes in hematological and biochemical laboratory tests were obtained 155 dogs, blood samples with and without EDTA, and blood smears prepared. CBC was made with platelet count, serum biochemistry, research hemoparasites by direct methods in blood smears and DNA detection by PCR and serology by the indirect method. There were differences in the results of frequencies according to the method of diagnosis, and serology was found that the greatest amount of positive dogs Anaplasmataceae (60.1%) and Ehrlichia canis (48%). The overall frequency family Anaplasmataceae, considering the sum of the positive samples in at least one of the methods, was 72%, of E. canis was 48% and for Anaplasma platys, 3.8%. The most frequent haematological abnormality was

thrombocytopenia which was more pronounced in co-infections and a biochemical serum hyperglobulinemia more frequent. It was concluded that the studied region has a high frequency of Ehrlichia sp. and cases of co-infections with this bacteria.

Keywords: Ehrlichia; Anaplasma; dogs; Clinical Pathology

1 INTRODUÇÃO

Doenças transmitidas por carrapatos são muito frequentes em todo mundo.

No Brasil, o clima tropical combinado a diversidade biológica, facilita a ocorrência e

disseminação dessas doenças, nas populações animais de diferentes espécies.

Os animais domésticos podem se tornar potenciais reservatórios de diversos

hemoparasitas, facilitando a transmissão e proliferação de zoonoses (MENN, et al.,

2010).

O cão pode servir como sentinela em algumas doenças, como reservatório

em outras ou mesmo como transmissor. O homem acidentalmente pode ser

parasitado por espécies de carrapatos que podem estar contaminados com

microrganismos patogênicos, adquiridos nos animais que fazem parte do seu

convívio natural, como os cães. Em 1989, Goddard relatou que, em regiões do

Mediterrâneo e na América Central ocasionalmente, os carrapatos da espécie

Rhipicephalus sanguineus se alimentavam de sangue humano e que nos EUA isso

ocorre mais raramente. Em 2006 foram descritos os primeiros casos de humanos

parasitados por Rhipicephalus sanguineus no Recife, Brasil (DANTAS-TORRES et

al, 2006). Mais recentemente outros trabalhos têm mostrado que isso pode ocorrer

em todo o mundo (DANTAS-TORRES, 2008).

O estudo da ocorrência de algumas dessas doenças é importante para

avaliação da potencial exposição humana e animal a esses agentes e, se associada

a alterações em exames laboratoriais, podem auxiliar o diagnóstico precoce da

doença, acompanhamento clínico e ajuste do tratamento para recuperação do

paciente. Além disso, a escolha e interpretação correta dos métodos diagnósticos,

diretos ou indiretos, contribuem de forma determinante para alcançar êxito no

resultado da conduta clínica (HARRUS e WANER, 2011).

A ehrlichiose é causada por várias espécies de bactérias que são capazes de

desenvolver doença clínica em diferentes espécies de hospedeiros, além do cão

27

doméstico. Alguns trabalhos demonstram que, além de animais de companhia, como

cães e gatos, espécies silvestres também são suscetíveis à infecção. Isso é

particularmente importante porque alguns desses hospedeiros funcionam como

reservatórios para espécies de Ehrlichia patogênicas para o homem, nos EUA

(BARLOUGH et al., 1997, LEVIN, et al., 2002 e YABSLEY et al., 2005) e, no Brasil

(MACHADO et al., 2006).

Considerada como zoonose, o primeiro caso de ehrlichiose humana foi

descrito no Japão em 1954 (JACOBS e SCHUTZE, 1997), causada por Ehrlichia

(Neorickettsia) sennetsu. Nos EUA, o primeiro caso de ehrlichiose humana foi

descrito em 1986, causada por E. chaffeensis (JACOBS e SCHUTZE, 1997;

DUMLER e WALKER, 2001). No Brasil, os primeiros casos suspeitos foram descritos

em 2004 (CALIC et al., 2004) e, em 2005 (COSTA et al., 2005) e 2006 (COSTA et

al., 2006) mais casos, apenas com sorologia positiva, foram descritos no Brasil,

todos causadas por E. chaffeensis. E, na Venezuela, caso de infecção em humano,

por E. canis, foi descrito em 2006 (PEREZ et al., 2006).

A bactéria Ehrlichia canis foi descrita em 1935 por Donatien e Lestoquard e

denominada primeiramente como Ricketsia canis e é uma das mais patogênicas nos

cães. A ehrlichiose canina tem sido reconhecida como uma das mais importantes

doenças infecciosas transmitida por carrapatos, desde a guerra do Vietnã e, por

isso, tem sido objeto de estudo por pesquisadores no mundo inteiro. Esta doença já

recebeu vários nomes, incluindo: febre hemorrágica canina, síndrome hemorrágica

idiopática, doença do cão rastejador e pancitopenia tropical canina (HUXSOLL,

1976). E, apesar de ter seu gênero mudado para Ehrlichia, permaneceu até o final

da década de 90 na família Rickettsiaceae. Em 2001, Dumler e colaboradores

através de estudos moleculares, propuseram uma nova classificação com a

transferência dos gêneros pertencentes às tribos Ehrlichieae e Wolbachieae para

família Anaplasmataceae. Apesar da aceitação internacional à sugestão taxonômica

de Dumler e colaboradores, em 2004, Uilenberg et al., consideraram justificável que

um novo gênero fosse criado para incluir as espécies E. phagocytophila, E. platys e

E. bovis.

“Ehrlichiose” tornou-se um termo genérico para infecções de cães causadas

por bactérias pertencentes à família Anaplasmataceae. Abrange principalmente

espécies nos gêneros Ehrlichia e Anaplasma que são parasitos intracitoplasmáticos

28

de leucócitos e plaquetas do sangue circulante em várias espécies de mamíferos,

sendo transmitidos biologicamente por vetores artrópodes. Diferentes espécies

podem ser transmitidas aos cães. Outras hemoparasitoses, como hepatozoonose,

babesiose, borreliose entre outras, também apresentam carrapatos como vetores, o

que permite a presença de infecções concomitantes. A precisão do diagnóstico

dessas doenças vem melhorando juntamente com o avanço tecnológico de

metodologias, principalmente aquelas relacionadas com biologia molecular

(RIKIHISA, 2011).

A distribuição geográfica dessas hemoparasitoses está intimamente

relacionada à presença dos carrapatos. O carrapato relacionado à transmissão da E.

canis, é o Rhipicephalus sanguineus, e a bactéria tem sua distribuição geográfica

mundialmente descrita (McBRIDE, 2009). No caso da E. canis a transmissão

experimental com carrapatos da espécie Dermacentor variabilis (JOHNSON et al.,

1998) também mostrou que pode haver variabilidade nesses vetores. No Estado do

Rio de Janeiro, o vetor R. sanguineus é facilmente encontrado, bem como existem

condições naturais para sua proliferação.

Em diferentes estados brasileiros, vários trabalhos sobre aspectos

epidemiológicos, clínicos e laboratoriais como bioquímicos, hematológicos e

relacionados a hemostasia, têm sido desenvolvidos, mostrando que a ehrlichiose

vem se expandindo, inclusive como zoonose. Sendo assim, pesquisar a frequência

desses agentes etiológicos e alterações hematológicas e bioquímicas dos animais

positivos é importante para auxiliar seu diagnóstico, uma vez que estas rickettsioses

podem ter manifestações fisiopatogênicas graves e fatais.

O município de Maricá/RJ, no litoral do estado foi escolhido para estudo, por

chamar atenção pela expansão da urbanização, alteração da paisagem natural e

aumento da população de animais domésticos, principalmente cães, e também, a

circulação de alguns desses animais, retornando continuamente a grandes centros

urbanos, possibilitando a permuta de vetores e agentes etiológicos nessas regiões,

transportados por esses animais. Com o objetivo de contribuir ao estudo da

frequência da família Anaplasmataceae no estado do Rio de Janeiro, bem como o

conhecimento das principais alterações clínico-laboratoriais nos animais positivos,

utilizando-se três métodos diagnósticos, foram coletadas amostras sanguíneas de

155 cães desse município.

24

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1 HISTÓRICO E AGENTES ETIOLÓGICOS

Erlichioses transmitidas por carrapatos têm sido identificadas em medicina

veterinária desde 1910 com a anaplasmose bovina. Em 1925 foi descrita a

pericardite bovina (“cowdriose”) e, em 1935, a ehrlichiose canina, todos

originalmente descobertos na África (DUMLER e WALKER, 2001). No entanto, as

infecções por Ehrlichia foram reconhecidas inicialmente entre os anos de 1920 e

1930, como agentes de importância veterinária, quando Cowdry em 1925 identificou

Rickettsia ruminantium (hoje conhecida como E. ruminantium) como agente

etiológico da pericardite bovina, por ser uma doença fatal de ruminantes (McBRIDE,

2009).

Ehrlichia canis foi descoberto por DONATIEN e LESTOQUARD (1935) em

monócitos de cães na Argélia e recebeu o nome de Rickettsia canis. A rickettsia foi

renomeada como Ehrlichia canis, por Moroshkowsky em 1945 (RISTIC e HUXSOLL,

1984) em homenagem ao pesquisador Paul Ehrlich. As doenças causadas por

Ehrlichia sp. permaneceram em relativa obscuridade até os anos 60 quando a E.

canis foi descrita pela primeira vez nos EUA e mais tarde associada a deflagração

epizoótica da pancitopenia tropical canina na Ásia, pelo patologista David Huxsoll.

Sendo, somente esse agente ehrlichial é considerado de distribuição mundial (Mc

BRIDE, 2009).

Ehrlichioses e anaplasmoses são doenças causadas por bactérias

pleomórficas cocóides Gram negativas e intracelulares obrigatórias, denominadas

corpúsculos elementares e transmitidas por carrapatos (INOKUMA et al., 2001).

De acordo com Ristic e Ruxsoll (1984), os agentes etiológicos da ehrlichiose

canina estavam alocados na tribo Ehrlichiae. Essa classificação foi revista por

Rikihisa (1991), que acrescentou algumas novas espécies, desconhecidas até o final

da década de 1980, sem que fossem feitas mudanças no sistema de classificação.

30

A classificação proposta por Ristic e Huxsoll (1984), se baseava na

comparação de características fenotípicas, envolvendo as interações da Rickettsia

em questão com o meio ambiente (ecologia, dados epidemiológicos e padrões de

infecções experimentais e em humanos). Ademais, os critérios de classificação

incluíam também a antigenicidade dos isolados.

No entanto, estudos genômicos, incluindo o sequenciamento de uma porção

do gene codificador da unidade 16S do RNA ribossomal (16S RNAr), estudos

diversos relacionados ao DNA, perfis de restrição e análises de polimorfismo total do

DNA ou de fragmentos do genoma, somados à análise de plasmídeos, trouxeram

novos horizontes para a taxonomia das Rickettsias. (DRANCOURT e RAOULT,

1994). De acordo com Olsen e Woese (1993), a análise da sequência do gene

codificador da unidade 16S RNAr se concretizou como um poderoso método para

estudos de filogenia bacteriana. Olsen et al. (1994), acrescentaram que esta análise

também seria uma poderosa ferramenta nos estudos sobre a evolução das

bactérias. Outras sequências genéticas têm sido estudadas, como do gene gp36 da

E. canis de diferentes isolados em diferentes regiões do mundo e mostram completa

conservação das repetições de sequências nucleotídicas entre as amostras de

origem geográficas diferentes (HECHEMY et al., 2005). Estudos filogenéticos do 16S

RNAr tem mostrado pouca diversidade genética indicando provável evolução lenta e

homogênea nas diferentes amostras de E. canis (SIARKOU, et al. 2007; VINASCO

et al., 2007; PINYOOWONG, et al., 2008) e Anaplasm. platys (PINYOOWONG et al.,

2008). A diversidade genética e antigênica da principal proteína imunorreativa de E.

canis mostra diferenças entre amostras do Brasil, EUA e Israel, embora não estejam

associadas às características clínicas e hematológicas da doença (ZHANG et al.,

2008). No entanto, apesar dessa homogeneidade genética do 16S rRNA e de outras

regiões genômicas também conservadas (groEL, gltA, família p28, gp140, e virB9),

diferenças entre as manifestações clínicas na erlichiose monocítica canina (EMC),

causada por E. canis, levam a hipótese de que polimorfismos em outras sequências

genéticas possam estar associadas (SIARKOU, et al. 2007). A análise do gene 16S

RNAr de A. platys em cães de Ribeirão Preto, Brasil, mostrou alta similaridade com

outras amostras de regiões geográficas distintas, mas sugere que pelo menos três

linhagens diferentes circulam na América do Sul (CARDOZO, et al. 2007).

31

Assim, com base no sequenciamento de uma porção do gene codificador da

unidade 16S do RNA ribossomal do parasito, tornou-se possível o agrupamento das

espécies da tribo Ehrlichieae em 3 genogrupos distintos (ANDERSON et al., 1991).

Esses grupos podiam ser designados levando-se em consideração as primeiras

espécies identificadas de cada grupo e assim tinha-se os genogrupos da E. canis,

da E. phagocytophila, e da E. sennetsu (DUMLER et al., 1995; WALKER &

DUMLER, 1996; POPOV et al., 1998; RIKIHISA, 2000).

O Gênero Ehrlichia compreendia os parasitos intracitoplasmáticos de leucócitos

e plaquetas do sangue circulante em várias espécies de mamíferos (HUXSOLL et

al., 1969; WOODY e HOSKINS, 1991). As seguintes espécies do gênero Ehrlichia já

foram descritas causando infecções naturais em cães: Ehrlichia canis (DONATIEN &

LESTOQUARD, 1935); Ehrlichia (Anaplasma) platys1 (HARVEY et al., 1978); E.

(Neorickettsia) risticii2 (KAKOMA et al., 1994); E. ewingii (ANDERSON et al., 1992a;

STOCKHAM et al., 1992); E. chaffeensis (DAWSON e EWING, 1992;

BREITSCHWERDT et al., 1998); E. phagocytophila3 (JOHANSSON et al., 1995;

PUSTERLA et al., 1997); E. equi3 (LEWIS et al., 1975; MADEWELL e GRIBBLE,

1982) e o agente da ehrlichiose granulocítica humana3 (HGE) (GREIG et al., 1996).

Várias espécies dos gêneros Ehrlichia e Anaplasma já foram consideradas

como sendo apenas patógenos veterinários, mas têm sido reorganizados

recentemente como emergentes patógenos humanos nos EUA (RIKIHISA, 2003).

A espécie Anaplasma platys até 2001 era considerada como integrante do

gênero Ehrlichia. A partir de análises moleculares de DNA, a classificação proposta

por Dumler e colaboradores passou a incluí-la no gênero Anaplasma. O mesmo

ocorreu com as espécies: Ehrlichia (Anaplasma) phagocitophila e Ehrlichia

(Anaplasma) bovis (MACIEIRA et al., 2005).

A anaplasmose causada por A. phagocytophilum foi descrita em Minessota,

Wisconsin e Califórnia nos Estados Unidos e na Suécia (JOHANSSON et al., 1995;

PUSTERLA et al., 1997). Essa espécie, anteriormente classificada como E.

phagocitophila, é o agente causador da anaplasmose granulocítica humana (PARK

et al., 2003) e anaplasmose granulocítica animal (SCORPIO et al., 2004) . Um dos

1 Reclassificada como Anaplasma platys (DUMLER et al., 2001). 2 Reclassificada como Neorickettsia risticii (DUMLER et al, 2001). 3 Essas 3 espécies foram agrupadas em uma, que foi denominada Anaplasma phagocytophilum (DUMLER et al.,

2001, corrigido por LIST EDITOR: Notification list: Notification that new names and new combinations have

appeared in volume 51, part 6, of the IJSEM. IJSEM, v. 52. p. 5-6, 2002).

32

causadores da ehrlichiose granulocítica canina, a E. ewingii , descrita por Anderson

et al. (1992a) e STOCKHAM et al. (1992) causa uma doença significativa em cães,

experimental e naturalmente infectados. (NEER, 1998). Essas duas espécies ainda

não foram descritas causando doenças no Brasil.

A ehrlichiose monocítica canina é causada pela E. canis (HARRUS et al.

1997b) e é a de maior ocorrencia em cães (ALMOSNY e MASSARD, 2002). E.

chaffeensis , agente da ehrlichiose monocítica humana (RIKIHISA 2003), também

pode causar a ehrlichiose monocítica canina (BREITSCHWERDT, 2000;

SKOTARCZAK, 2003.

2.1.1 Taxonomia

Análises genéticas recentes dos genes codificadores da unidade 16S RNAr, da

síntese de proteínas de superfície e análise genética da proteína de choque térmico

groESL indicaram que as designações taxonômicas apresentavam falhas, dentro

dos gêneros Anaplasma, Ehrlichia, Cowdria, Neorickettsia e Wolbachia. Esses

gêneros compreendem bactérias intracelulares obrigatórias que residem em

vacúolos de células eucarióticas, e que foram previamente colocados em uma classe

taxonômica baseando-se em características morfológicas, ecológicas,

epidemiológicas e clínicas (DUMLER et al., 2001). Vários outros organismos também

tiveram sua taxonomia revisada por análise do DNA (UILENBERG et al., 2004)

Analisando as sequências genéticas obtidas a partir do GenBank4, uma nova

classificação foi proposta: todos os membros das tribos Ehrlichieae e Wolbachieae

deveriam ser transferidos para a família Anaplasmataceae, e a estrutura tribal da

família Rickettsiaceae deveria ser eliminada. O gênero Anaplasma teve de ser

corrigido para incluir a espécie Anaplasma phagocytophilum comb. nov. (englobando

as espécies Ehrlichia phagocytophila, E. equi e o agente da ehrlichiose granulocítica

humana), a espécie Anaplasma platys comb. nov.e a espécie Anaplasma bovis

comb. nov. deveriam ser criadas em substituição às espécies Ehrlichia platys e

Ehrlichia bovis respectivamente. Ademais, o gênero Ehrlichia deveria ser corrigido

para incluir a espécie Ehrlichia ruminantium comb. nov. no lugar de Cowdria

ruminantium, assim como o gênero Neorickettsia, para a inclusão das espécies

Neorickettsia risticii comb. nov. no lugar da Ehrlichia risticii; e Neorickettsia sennetsu

4 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide

33

comb. nov. no lugar de Ehrlichia sennetsu (DUMLER et al., 2001). As mudanças

taxonômicas após 2001 estão sumarizadas no quadro 1, modificado de

Rymaszewska e Grenda (2008).

Taxonomia dos gêneros Ehrlichia e Anaplsma antes e depois de 2001 Taxonomia antes de 2001 Taxonomia depois de 2001

Classe α-proteobacteria

Classe α-proteobacteria

Ordem II Rickettsiales Familia I Rickettsiaceae Genero I Rickettsia Genero II Orientia Genero III Wolbachia – A Familia II Ehrlichiaceae Genero I Ehrlichia – B Especies E. canis – B2 E. chaffeensis – B3 E. equi – B4 E. phagocytophila – B4 czynnik HGE – B4 E. platys – B5 E. risticii – B6 E. sennetsu – B7

Genero III Anaplasma Especies A. marginale

A. centrale

Genero IV Cowdria Especie C. ruminantium – C Genera V Neorickettsia N. helminthoeca

Ordem II Rickettsiales Familia I Rickettsiaceae Genero I Rickettsia Genero II Orientia Famila II. Anaplasmataceae Genero I Anaplasma Especies A. marginale A. centrale A. phagocytophilum – B4 A. platys – B5

Genero IV Ehrlichia – B Especies E. canis – B2 E. chaffeensis – B3 E. ruminantium – C Genero V Neorickettsia Especies N. helminthoeca N. risticii – B6 N. sennetsu – B7 Genero VI Wolbachia – A

Quadro 1: Resumo das mudanças taxonômicas nos gêneros Ehrlichia e Anaplasma, segundo Rymaszewska e Grenda (2008).Letras A, B, B2, B3, B4, B5, B6, B7, C, indicam uma mudança na posição sistemática.

As alterações propostas por DUMLER et al. (2001), foram homologadas e corrigidas

em 20025. A espécie A. phagocytophila teve seu nome corrigido para A.

phagocytophilum. Na mesma lista de notificação, o corpo editorial observou que

tanto a espécie A. bovis quanto A. platys, que foram propostas como novas

combinações, seriam novas espécies, pois seus respectivos basônimos E. bovis e E.

platys não possuíam suporte na nomenclatura, sendo então acrescentado o

complemento sp. nov. O quadro a seguir sumariza a Taxonomia dos gêneros

Ehrlichia e Anaplasma antes e depois de 2001. Letras A, B, B2, B3, B4, B5, B6, B7,

C, indicam uma mudança na posição sistemática, mostrada em tabela nos estudos

de revisão do gênero Anaplasma feito po Rymaszewska e Grenda (2008).

5 LIST EDITOR: Notification list: Notification that new names and new combinations have appeared in volume

51, part 6, of the IJSEM. IJSEM, v. 52. p. 5-6, 2002.

30

34

2.2 EHRLICHIOSES NOS ANIMAIS

Erlichioses e anaplasmoses têm sido identificadas em várias espécies de

animais domésticos, como cães, gatos, equinos e bovinos, além de algumas

espécies selvagens como cervídeos e coiotes. (DAGNONE, et al., 2001). No Brazil,

Oliveira e t al., (2009b) e Lima et al., (2010) fizeram a caracterização molecular de E.

canis em gatos domésticos. Em revisão sobre ehrlichioses e anaplasmoses canina e

felina, Little (2010) destacou informações de vários trabalhos que mostraram que a

ehrlichiose nos cães pode ser causada por três espécies do gênero: E. canis, E.

chaffeensis e E. ewingii ou pela coinfecção dessas bactérias. A E. chaffeensis é

mais conhecida como ehrlichiose monocítica humana, mas em cães, em infecção

experimental, parece determinar doença branda porém, quando em coinfecção com

outras espécies de Ehrlichia spp., pode se tornar mais grave.

E. ewingii foi descrito primeiramente em um cão em 1971 e foi constatado que

produzia doença tanto em cães quanto em seres humanos. No centro sul dos EUA e

em outras áreas com elevada população de carrapatos E. ewingii e E. chaffeensis

parecem ser mais comuns em cães do que E. canis, embora E. canis seja

considerado o agente primário na ehrlichiose canina. Pesquisas mostraram que a

infecção por Ehrlichia spp. também pode ocorrer seguida a inoculação de sangue.

Os organismos sobrevivem e permanecem infecciosos mantidos em sangue total

refrigerado, sugerindo que tanto a exposição a agulhas contaminadas e as

transfusões de sangue, são vias de infecção viáveis, embora raras (LITTLE, 2010).

Co-infecções com bactérias do gênero Ehrlichia e Anaplasma platys e ainda

outros organismo, também transmitidos por carrapatos, tem sido descritas. No

entanto, as consequências da co-infecção não estão bem estabelecidas nas

espécies, em comparação com a infecção com um único organismo. Infecção

simultânea com múltiplos agentes podem ser responsáveis por algumas diferenças,

observadas entre os casos clínicos, daquelas quando apenas um patógeno

transmissível por carrapato é considerado (KORDICK et al., 1999). Suksawat et al.,

(2001a), relataram a existência de três agentes da ehrlichiose: E. canis, E.equi e A.

platys em cães na Tailândia e Venezuela, afirmando que o estado de co-infecção

potencializa as doenças e dificulta o diagnóstico assim como o manejo terapêutico

dos pacientes. Além disso, segundo Little (2010) a clínica da doença pode não se

35

desenvolver até que um cão tenha sido infectado por vários meses ou anos, e os

carrapatos que transmitiram a infecção já há muito podem ter se desprendido do

animal. Por isso, nem a época do ano, nem a ausência de carrapatos durante o

exame clínico, devem eliminar a suspeita de ehrlichiose canina em um indivíduo

específico.

2.2.1 Ehrlichiose Monocítica Canina

A ehrlichiose monocítica canina é causada pela infecção com um organismo

rickettsial, Ehrlichia canis que se replica somente em monócitos e macrófagos

(RIKIHISA, 2011). E. canis, continua sendo um agente erlichial importante no mundo

inteiro causando doença grave que pode levar o animal ao óbito. A variedade de

espécies do gênero Ehrlichia que infectam cães, juntamente com variações

documentadas na patogenicidade de diferentes cepas de E. canis, resultam em um

amplo espectro de doenças que vão desde clinicamente inaparentes a graves, e que

podem ser intensificadas por variações na resposta imune específica de cada cão

e/ou raça, diferenças na dose de patógeno transmitido durante a infecção pelos

carrapatos, presença de agentes coinfectando, e a saúde geral do cão antes da

infecção (LITTLE, 2010).

Vários fatores se relacionam com a disseminação da doença, principalmente

os que favorecem a proliferação do carrapato transmissor (DUMLER, 1995;

HARRUS et al., 1997b). Pesquisas mostram que os cães funcionam como

hospedeiros reservatórios de E. canis e também do vetor primário o Rhipicephalus

sanguiíneus, pois os diferentes estádios de desenvolvimento desse carrapato se

alimentam de sangue nos cães, mantendo transmissão transtadial (LITTLE, 2010). O

carrapato adulto é descrito como capaz de fazer transmissão intrastadial, uma rota

que pode ser importante em situações de surto, como dos carrapatos do sexo

masculino que têm demonstrado se mover facilmente entre cães de maneira

intermitente, para se alimentar e acasalar (BREMER et al., 2005).

Stich et al. (2008), enfatizaram a relação parasito hospedeiro, como a

transmissão e biologia dos hospedeiros invertebrados. Os autores relacionaram

trabalhos que mostraram que não ocorre transmissão transovariana em

Rhipicephalus sanguineus porém, chamam atenção para publicações que

investigam a possibilidade de que outras espécies de carrapatos possam transmitir a

36

bactéria, como Dermacentor variabilis que demonstrou essa capacidade

experimentalmente e a possível relação (não confirmada experimentalmente) de

Otobius megnini com um caso de criança soropositiva para infecção erlichial. Citam,

ainda, estudos com Ixodes scapularis e I. ricinus que podem estar parasitados pela

bactéria, mas sem confirmação experimental da capacidade de infecção em cães,

através desses carrapatos. Os autores citaram, também, artigos de estudos em

outras espécies de hospedeiros mamíferos, como canídeos e felídeos silvestres,

além de cervídeos. No Brasil também existem estudos sobre a ocorrência de

ehrlichiose monocítica em outros mamíferos (MACHADO et al., 2006; ANDRÉ et al.,

2010).

Estudos feitos no Brasil, em região rural do Estado de Minas Gerais (COSTA

Jr et al., 2007), foi suspeitado ser possível que, em áreas rurais, outras espécies de

carrapatos além de R. sanguineus, possam atuar como vetores de E. canis. Com

base nos resultados daquele estudo, os carrapatos da espécie Amblyomma

cajennense deveriam ser incluídos como um potencial vetor de E. canis em áreas

rurais do Brasil.

No estudo de Stich et al., (2008) vários autores mostraram a ocorrência

mundial da doença e que a metodologia usada na seleção da população canina e

para detecção da bactéria ou anticorpos, pode influenciar na porcentagem

encontrada. Revelaram, ainda, que a ocorrência da doença na África pode variar de

32% a 80%, entre estudos moleculares e sorológicos e na Europa de 2,2% a 62,5%.

Nas Américas destacaram a Venezuela com aproximadamente 33% em estudos

moleculares, o México com 44,1% de sororreatividade; 2,2% a 57% nos EUA.

Relataram que existem poucas publicações sobre a ocorrência no Canadá, mas que

uma pesquisa indicou baixa soroprevalência, apesar da proximidade com regiões

dos EUA que tem maior ocorrência da doença. No Brasil, destacaram 19,8% a 23%

de soropositivos, porém, em estudo com pesquisa do DNA ehrlichial, a variação foi

de 1,4% a 3,5% em cães com plaquetometria normal, 20 a 26,1% em população

trombocitopênica e 63,1% em cães cuja plaquetometria se encontrava abaixo de

100mil/μL.

As diferentes espécies do gênero Ehrlichia possuem um tropismo por alguns

tecidos (ALMOSNY e MASSARD, 2002) como, por exemplo, E. canis que tem

preferência por células da microvascularização de alguns órgãos parenquimais como

37

pulmões, rins e meninges de cães, causando hemorragias dos pulmões e da

mucosa nasal conhecida como epistaxe (HARRUS et al., 1997a; HARRUS et al.,

1997b). Os sinais clínicos ocorrem após oito a vinte dias que é o período de

incubação, e podem ser divididos de acordo com as fases da infecção (MOREIRA et

al., 2003).

A doença é dividida na fase aguda, subclínica e crônica. A fase aguda possui

duração de duas a quatro semanas e é nesta fase que ocorre a multiplicação do

organismo dentro das células mononucleadas infectadas. Através dessas células, as

bactérias são levadas para fígado, rins e linfonodos, onde se multiplicam em

macrófagos e linfócitos, causando hiperplasia linforreticular. A infecção é

disseminada para outros locais, interagindo com células endoteliais de vasos de

menor calibre, induzindo vasculite ou resposta inflamatória perivascular, após a

migração para o tecido subendotelial (HARRUS et al., 1997a; ALMOSNY, 1998;

ALMOSNY e MASSARD, 2002). Nesta fase, os sinais clínicos incluem febre,

anorexia, perda de peso, edema de membros, vômitos e linfadenopatia. A gravidade

varia entre os animais (ALMOSNY, 1998) e, em alguns casos mais graves pode

ocorrer epistaxe, anemia, edema de membros e saco escrotal, perda de peso

acentuada, equimoses no abdômen, petéquias em mucosas, melena e hifema

(NEER e HARRUS, 2006).

Alguns estudos experimentais mostram que a doença pode ser mais severa

com algumas cepas de E. canis e que quando co-infectada com outras doenças

transmitidas por carrapatos, também pode exacerbar os sintomas (UNVER et al.,

2009). Castro e colaboradores (2004), mostraram que cães apresentam sinais

clínicos de infecção por E. canis entre 10 e 14 dias após a inoculação experimental.

Mucosas pálidas, linfadenopatia, esplenomegalia, hepatomegalia, emagrecimento e

aumento da perda de pelo foram observados nos animais infectados.

Segundo, Almosny (1998), na fase aguda, pode ocorrer título negativo para a

bactéria. Os cães sobrevivem à fase aguda permanecendo por longos períodos na

fase crônica (ALMOSNY e MASSARD, 2002). Para alguns cães, no entanto, uma

forma grave e potencialmente fatal de ehrlichiose crônica pode se desenvolver

meses ou anos após a infecção inicial com E. canis em que a anorexia, febre e

perda de peso é acompanhada de mialgia, tendências a sangramento, lesões

oculares e alterações neurológicas (STICH et al., 2008; HARRUS e WANNER,

38

2011). Várias formas hemorrágicas podem ocorrer, como epistaxe, petéquias,

equimose, hifema, hemorragia de retina e hematúria, uveíte anterior com alterações

na retina também é descrita. Ataxia, inclinação da cabeça, nistagmo e convulsões

foram relatados, mas estes sinais estão presentes apenas na minoria de cães com

ehrlichiose clínica. A claudicação pode ser observada em cães infectados somente

com E. canis, mas é provável que seja causado por uma dificuldade em se

movimentar devido a mialgia, em vez de artralgia (LITTLE, 2010).

A fase subclínica está associada com a persistência do organismo e aumento

do título de anticorpos séricos, que começam aparecer entre sete e vinte e um dias

após a infecção inicial (WOODY e HOSKINS, 1991). Algumas alterações

hematológicas podem persistir durante esta fase, como anemia arregenerativa,

trombocitopenia e respostas leucocitárias variáveis que podem acompanhar

ausência de sinais clínicos (ALMOSNY e MASSARD, 2002). Alguns animais podem

eliminar a bactéria, sendo imunocompetentes e outros, sem resposta imune

adequada, se tornam crônicos (ANDEREG e PASSOS, 1999). Na fase crônica,

intensa estimulação antigênica leva a hipergamaglobulinemia, devido à resposta

imune celular ineficaz e à persistência da E. canis no interior de células hospedeiras

que leva a uma reação de hipersensibilidade ou uma resposta autoimune, levando a

uma pancitopenia (SWANGO et al., 1989). Nesta fase observam-se todos os sinais

clínicos descritos anteriormente, podendo ocorrer infecções secundárias com

pneumonia, glomerulonefrite, insuficiência renal, artrite, polimiosite e ataxia

(ALMOSNY, 1998).

2.2.2 Anaplasmose canina

Os cães podem ser infectados com Anaplasma phagocytophilum e

Anaplasma platys. Os primeiros relatos de infecção por A. phagocytophilum em cães

foram da Califórnia/EUA, no início dos anos da década de 80. O organismo foi

reconhecido como muito semelhante a Ehrlichia equi dos equinos e, posteriormente,

como assemelhando-se ao que era então chamado de ehrlichiose granulocítica

humana (EGH), um agente descrito pela primeira vez em pessoas de Minnesota e

Wisconsin. Com a mudança taxonômica proposta por Dumler e colaboradores

(2001) E. equi, E. phagocytophila e o agente da EGH passaram a incluirem A.

phagocytophilum. As cepas originais que compunham o genogrupo A

39

phagocytophilum pareciam permanecer em isolados distintos, tanto em termos de

espécies que causavam a doença, como na distribuição geográfica. Isto estava

baseado em estudos realizados na Europa que mostraram que isolados de uma

cepa de A. phagocytophilum da Europa não causavam a doença quando inoculado

em cavalos assim como isolados de seres humanos, nos Estados Unidos, não

provocavam a doença em bovinos. Além disso, têm sido descritas variantes

genéticas do A. phagocytophilum não associadas com a doença. Tanto a infecção

como a doença por A phagocytophilum (cepa HGE) são bem notificadas em cães em

áreas da América do Norte e Europa, onde ocorre densas populações de carrapatos

Ixodes spp (LITTLE, 2010).

Anaplasma platys está relacionada ao aparecimento de inclusões em

plaquetas, entretanto, esta ocorrência pode ser inespecífica, por existirem inclusões

não parasitárias nestes elementos figurados (FERREIRA, 2006).

Infecções por E. canis, em determinada fase da doença, também apresentam

inclusões em outros tipos celulares, inclusive plaquetas (ALMOSNY, 1998;

MYLONAKIS et al., 2003; DAGNONE et al., 2009) e, durante a doença, pode ocorrer

ativação plaquetária com granulações e estas inclusões podem ser confundidas com

mórulas (MYLONAKIS et al., 2003).

Agente da trombocitopenia cíclica, o microorganismo foi primeiramente

descrito nos EUA, na Florida, observado em esfregaço corado por Giemsa como

inclusões basofílicas em plaquetas de um animal trombocitopênico (HARVEY et al.,

1978). Cães sadios inoculados com sangue deste animal desenvolveram estruturas

idênticas em plaquetas e uma síndrome hematológica caracterizada por episódios

de trombocitopenia cíclica, sem sinais evidentes de doença clínica (FRENCH e

HARVEY, 1983). A. platys é um microorganismo intracelular obrigatório, que parasita

plaquetas de cães (WOODY e HOSKINS, 1991, HOSKINS, 1991a; ALMOSNY e

MASSARD, 2002), apresentando características morfológicas e comportamentais

típicas. Essas estruturas, ao serem examinadas ao microscópio eletrônico,

revelaram morfologia similar a Ehrlichia canis, apresentando-se singulares, em pares

ou em grupos, dentro de vacúolos, formando as conhecidas mórulas (FRENCH e

HARVEY, 1983). São pequenas, pleomórficas (cocóides, ou elipsóides) e Gram-

negativas, apesar de não se corarem bem pelo método de Gram. Dentro de

vacúolos vão realizando fissões binárias sucessivas (HIBLER et al., 1986, HARVEY,

40

1990). Medem de 350 a 1250 nm de diâmetro e as plaquetas infectadas podem ter

de um a três vacúolos contendo de um a oito microorganismos (HARVEY et al.,

1978). Entretanto, vacúolos com até quinze destes já foram observados (ARRAGA-

ALVARADO et al., 2003). O mecanismo de penetração e saída do parasito ainda

não é conhecido, mas provavelmente a entrada na plaqueta ocorre por meio de

endocitose, devido à propriedade fagocítica da mesma (HARVEY et al., 1978) e

acredita-se que a membrana do vacúolo é proveniente da parte externa da

membrana dessa célula (HARVEY, 1990).

Anaplasma platys tem como provável vetor o carrapato marrom do cão o

Rhipicephalus sanguineus, (KORDICK et al., 1999; INOKUMA et al., 2000, COHN,

2003). Carrapatos ingurgitados dessa espécie foram examinados no Japão e o DNA

de Anaplasma platys foi amplificado (INOKUMA et al., 2000). Embora A. platys

venha sendo repetidamente identificada em R. sanguineus pela reação em cadeia

da polimerase (PCR), bem como em carrapatos Dermacentor auratus na Tailândia,

até esta data, não foi confirmada, experimentalmente, a transmissão por estes

artrópodes. Além disso, infecção com A. platys tem sido comum em cães em áreas

com alta pressão de R. sanguineus, como o Caribe. Os cães, hospedeiros principais

de R. sanguineus, são considerados os principais reservatório da A. platys e

infecções com esta bactéria em outras espécies, além dos cães, não foram

confirmados (LITTLE, 2010), porém a caracterização molecular confirmou a

ocorrência em gatos (LIMA et al., 2010).

Por esse tipo de transmissão, é extremamente provável a associação com

outros agentes que são transmitidos por este carrapato, como E. canis e Babesia

canis, potencializando as enfermidades (KORDICK et al., 1999; SUKSAWAT et al.,

2001a; INOKUMA et al., 2003). A associação de A. platys com outros

hemoparasitos, como E. canis e/ou B. canis, além de potencializar a doença clínica,

dificulta o diagnóstico e o tratamento dos cães doentes (SUKSAWAT et al., 2001a).

Segundo Harvey (1990) não há transmissão vertical e Hoskins, (1991b) relatou não

haver evidências de transmissão do cão para os humanos diretamente. Estudo de

infecção experimental mostrou que animais infectados somente com A. platys pode

tornar-se PCR negativo antes de serem submetidos a tratamento (GAUNT et al.,

2010).

Embora a trombocitopenia seja um achado comum em infecções por A.

41

platys, este achado não é patognomônico desta ou de qualquer outra doença

(COCKBURN e TROY, 1986). O período de incubação vai de oito a quinze dias.

Durante a infecção aguda há uma alta porcentagem de plaquetas infectadas

circulando. Ocorre um decréscimo das plaquetas circulantes em alguns dias e esse

número pode chegar até 20.000 plaquetas/µL ou menos, sendo neste momento

mínima a probabilidade de visualização do parasita no sangue. Após o

desaparecimento dos microorganismos, a plaquetometria volta ao normal em três ou

quatro dias. Em sete a quatorze dias, ocorre outra parasitemia onde, novamente, o

número de plaquetas decresce. Esta natureza cíclica das trombocitopenias e das

parasitemias diminui com o tempo e com a cronificação da doença, o que resulta em

esporádicas aparições do parasito no sangue e trombocitopenias medianas (HIBLER

et al., 1986; SWANGO et al., 1989; HARVEY, 1990; WOODY e HOSKINS, 1991).

Megacariócitos ou qualquer outra célula precursora na medula óssea não

apresentam inclusões durante a parasitemia (HIBLER et al., 1986; RIKIHISA, 1991).

Os sintomas clínicos da doença variam dependendo de cada cão, mas,

fundamentalmente, A. platys causa o enfraquecimento do animal, letargia, anorexia,

dificuldade respiratória, febre, aumento da secreção de muco, secreção ocular

purulenta, esplenomegalia e hiperceratose do focinho (SAINZ et al., 1999). Cães

infectados naturalmente por A. platys não costumam apresentar doença clínica e a

evidência de hemorragias é rara. No entanto, achados como anorexia, letargia,

depressão, perda de peso, descarga nasal muco purulenta, linfadenomegalia,

mucosas hipocoradas e febre foram descritas (RIKIHISA, 1991; HARRUS et al.,

1997a). Essas bactérias não causam a morte, e o tratamento com antibióticos

adequados é geralmente bem sucedido após quatro semanas (SAINZ et al., 1999).

A infecção também é relatada em cães de experimento e a infecção isolada parece

causar doença branda. Co-infecções com outros agentes, inclusive E. canis,

resultam em sinais clínicos mais graves. Na ausência de co-infecções a

trombocitopenia pode involuir espontaneamente. Em cães dos EUA, a bactéria

parece não acarretar doença clínica, porém tem sido notificados casos com

tendências a sangramentos e uveíte anterior bilateral, talvez relacionados com cepas

variantes em outras regiões geográficas, como Espanha e Chile (LITTLE, 2010).

Um caso de uveíte também foi relatado em um animal com alta titulação de

anticorpos anti A. platys e nenhum título para E. canis (GLAZE e GAUNT, 1986).

42

Em estudo de um caso clínico em Israel, o paciente apresentou anorexia,

apatia, febre e os achados laboratoriais, como anemia, leucopenia e

trombocitopenia, eram semelhantes ao da infecção por E. canis. O diagnóstico foi

definido através da pesquisa em esfregaço sanguíneo, pois foram encontradas

mórulas em plaquetas. O animal apresentava sorologia positiva para A. platys e

negativa para E. canis, mas não se descartou completamente a possibilidade de

coinfecção (WANER, 1993).

Em estudos experimentais, um aumento discreto na temperatura retal foi

notado durante uma parasitemia inicial assim como melenas também foram

observados em pacientes trombocitopênicos (HIBLER et al., 1986; HARVEY, 1990;

WOODY e HOSKINS 1991).

Poucos estudos mostraram a ocorrência específica de A. platys no mundo. Na

Austrália, trabalho desenvolvido entre 1998 a 2006, mostrou ocorrência de 43%

dessa bactéria, numa população canina de 215 animais distribuidos por três regiões

distintas do país. 24% dessa população encontrava-se co-infectada e os autores

analisaram o impacto dessas infecções sobre a contagem plaquetária e concluíram

que os animais infectados apenas com A. platys ou co-infectados, tem potencial para

desenvolverem trombocitopenia e evoluir com quadro clínico de sangramento,

diferente do descrito em outros países que sugerem baixa patogenicidade com

sinais clínicos discretos (BROWN et al., 2006).

2.3 EPIDEMIOLOGIA

A ehrlichiose canina ocorre em muitos países de clima temperado, tropical e

subtropical do mundo, coincidindo com a prevalência do vetor artrópode. Tem sido

relatada em todos os continentes (HOSKINS, 1991b; HARRUS et al, 1997b). No

entanto, apenas E. canis tem sido isolada no mundo inteiro (McBRIDE, 2009) e,

devido a baixa variabilidade genética, apenas uma amostra dessa espécie tem o seu

genoma totalmente sequenciado e, nenhum dado de hibridização genômica

comparativa está disponível para mostrar outras cepas (RIKIISA, 2010). Ehrlichia

canis tem distribuição mundial, mas as manifestações clínicas podem variar

geograficamente (DAGNONE et al., 2003).

No continente americano o primeiro caso de ehrlichiose foi descrito em cães

nas Antilhas Holandesas (BOOL e SUTMÖLLER, 1957 apud EWING, 1969). Nos

43

EUA, a presença da doença foi descrita primeiramente por Ewing, em 1963, que, ao

examinar inclusões em leucócitos de cães parasitados por Babesia canis, visualizou

estruturas características de E. canis. (EWING, 1963 apud EWING, 1969).

Entretanto, a doença começou a despertar um maior interesse durante a guerra do

Vietnã, quando centenas de cães militares norte-americanos morreram devido a

infecções por E. canis (HUXSOLL et al., 1969). RIKIHISA, 1991, afirmou que os

únicos vetores conhecidos das espécies do gênero Ehrlichia são carrapatos

Ixodídeos.

No Brasil, a doença teve seu primeiro relato em Belo Horizonte, MG em 1973

(COSTA et al., 1973) embora os relatos da ocorrência de doença clínica tenham

acontecido no Rio de Janeiro, em 1976, quando dezenas de cães da Polícia Militar

do Estado foram vitimados e vieram a óbito (CARRILLO et al., 1976). No sul do

Brasil foi descrito em 1985 um caso em Santa Maria no estado do Rio Grande do Sul

(SILVA et al., 1985) e em 1988 em Curitiba no Paraná (KAVINSKI et al., 1988).

Atualmente a ehrlichiose canina é prevalente em todas as regiões brasileiras

afetando 20 a 30 % dos cães atendidos em clínicas e hospitais veterinários no Brasil

(DANTAS-TORRES, 2008).

E. canis foi isolado pela primeira vez no Brasil em 2002 (TORRES et al., 2002).

A doença não parece ter predisposição por sexo (BANETH et al., 1996; SAINZ

et al., 1996; INOKUMA et al., 2000; BORBA et al., 2002; DAGNONE et al., 2003;

COCCO et al., 2003) e afeta animais de qualquer idade, embora autores descrevam

predisposição racial (SAINZ et al., 1996; INOKUMA et al., 2000). Embora a raça

pastor alemão tenha sido descrita como a mais suscetível, a doença grave pode ser

vista em qualquer cão que seja infectado com cepa de patogenicidade branda a

acentuada (LITTLE, 2010).

2.3.1 Fatores de risco

A relação entre infecção e doença é frequentemente dinâmica na natureza. O

equilíbrio dessa relação pode ser atingido entre os mecanismos de resistência

hospedeira e a infectividade e virulência do agente. Surtos de doenças são

causados pela introdução de um agente dentro de uma população hospedeira

suscetível que não foi exposta previamente a ele e resultam em doença de

patogenicidade elevada com elevado índice de mortalidade. Tal processo é

44

prejudicial à sobrevivência do agente, uma vez que ao matar a população

hospedeira, afeta negativamente tanto a sua capacidade de se reproduzir como

também suas chances de atingir novos hospedeiros suscetíveis. Um agente pode,

por conseguinte, melhorar as suas chances de sobrevivência, aumentando a sua

infecctividade e diminuindo a sua patogenicidade, e alguns patógenos têm uma

tendência natural de fazer isso em certas circunstâncias (FAO, 2010).

Embora no Brasil não existam estudos que mostrem a mobilidade de animais

domésticos, através de viagens com seus proprietários, os dados de Menn, Lorentz

e Naucke (2010), na Alemanha, mostraram que animais importados ou que tenham

viajado por áreas endêmicas de vários parasitos, são potencialmente responsáveis

por carrearem microrganismos para regiões não endêmicas nesse país. Da mesma

forma, HARRUS e WANER, 2011, consideraram que a suspeita clínica da doença

aumenta quando as manifestações clínicas estão em animais que vivam ou tenham

viajado por regiões endêmicas.

Em Minas Gerais, estudo feito em Nanuque, Belo Horizonte e em Lavras

sugeriram que os cães que viviam nas zonas rurais estavam mais expostos a

carrapatos do que aqueles que vivem em áreas urbanas e poderia estar associada

ao fato de que os cães urbanos eram mais susceptíveis de serem pulverizados com

acaricidas, enquanto cães rurais eram catadores e raramente pulverizados (COSTA

Jr et al., 2007). Também em Minas Gerais, Soares et al., (2006) estudaram

ectoparasitos em cães vivendo em apartamentos e em casas com quintal,

concluindo que o ambiente gramado de quintais favorece o encontro de carrapatos.

Em estudos feitos no Brasil, em região rural do Estado de Minas Gerais,

suspeitaram ser possível que, em áreas rurais, outras espécies de carrapatos além

de R. sanguineus, possam atuar como vetores de E. canis. Com base nos resultados

daquele estudo, os carrapatos da espécie Amblyomma cajennense deveriam ser

incluídos como um potencial vetor de E. canis em áreas rurais do Brasil (COSTA Jr

et al., 2007) e, mostra que em regiões semelhantes os animais teriam maior

probabilidade de se infectarem.

2.3.2 Ocorrência de co-infecção

No Brasil vários estudos mostraram presença de co-infecção entre

Ehrlichia/Anaplasma e/ou outros hemoparasitas. Estudando população canina do

45

Centro de Controle de Zoonozes Paulo Darcoso Filho no município do Rio de

Janeiro/RJ, Santos (2008) avaliou 38 cães escolhidos aleatoriamente e verificou que

36 estavam co-infectados, sendo que 22 eram com E. canis e A. platys.

Na Região dos Lagos/RJ, em estudo que abrangia vários municípios, como

Maricá, Saquarema, Araruama, São Pedro d’Aldeia, Iguaba, Cabo Frio, Arraial do

Cabo e outros, de 3019 amostras sanguíneas de cães, encaminhadas a laboratório

particular, 1% estavam co-infectadas com Ehrlichia spp e Babesia spp. (ACCETTA,

2008). Em Ribeirão Preto/SP, de 221 cães, 34 (15,4%) eram co-infectados de E.

canis com A. platys ou Babesia spp ou ambos (SANTOS et al., 2009). Em

Botucatu/SP, análise de 198 cães mostrou co-infecção em apenas 1% dos animais,

porém, com outros hemoparasitas transmitidos por artrópodes (Bartonella spp e

Leishmania chagasi), mas não encontraram outras espécies da família

Anaplasmataceae (DINIZ, et al., 2007).

Dantas-Torres (2011) relatou em vários estudos sobre a possiblidade da

transmissão de Leishmania através da picada ou ingestão de carrapatos, inclusive

com o Rhipicephalus sanguineus.

Em Belo Horizonte/MG entre 194 animais suspeitos de hemoparasitoses, 145

foram positivos para algum tipo de parasito, sendo 52 (35,9%) para Ehrlichia sp. (E.

canis e/ou A. platys) e 10% desses positivos com co-infecção com Haemobartonella

canis (atualmente denominado Mycoplasma haemocanis) e Babesia canis

(MOREIRA et al., 2003).

Em Cuiabá/MT, Sousa e colaboradores (2009) descreveram dois casos de co-

infecção entre E. canis e A. platys. No nordeste do Brasil, em Teresina/PI, Pires e

colaboradores (2008) analisando aspirado de medula óssea, encontraram 1 cão

entre 65 (1,5%) co-infectado com Ehrlichia sp. e Leishmania sp., mostrando

coexistência dos vetores também nessa região ou a possibilidade de transmissão

pelo mesmo vetor (DANTAS-TORRES et al., 2010 apud DANTAS-TORRES, 2011).

No entanto, no estudo em Teresina/PI, não foram encontrardas inclusões em

plaquetas, para diagnosticarem A. platys. Ainda no nordeste, Souza e colaboradores

(2010) investigaram três espécies de Ehrlichia (não incluíram pesquisa de A. platys)

em 472 animais e 32 carrapatos na capital da Bahia, Salvador, e encontraram

apenas E. canis. Porém, Freire e colaboradores (2009) estudando no mesmo

município mas em regiões diferentes, analisaram 100 casos suspeitos encontrando

46

24% de co-infecção entre E. canis e A. platys. Em Recife/PE, em 100 cães

suspeitos, 32% estavam com A. platys e E. canis (RAMOS et al. 2009). E, também

em Recife, entre 205 cães pesquisados para ocorrência de vários hemoparasitas,

23,9% estavam co-infectados (RAMOS et al., 2010).

2.3.3 Ocorrência no Brasil

De acordo com ALMOSNY (1998) e ALMOSNY e MASSARD (2002), a doença

vem sendo descrita com frequência em vários locais do território brasileiro.

Labarthe et al., (2003) avaliaram, em teste Elisa, 2553 cães em 12 estados

brasileiros e encontraram 19,8% com anticorpos para E. canis, separados pelas

regiões nordestes com 43%, sudeste com 20,9%, centro-oeste com 30,4% e sul com

1,7%. Ao analisarem apenas os dados referentes ao Estado do Rio de Janeiro, foi

encontrada uma prevalência sorológica de 29,6%. Foi sugerido que a baixa

ocorrência encontrada na região sul poderia estar associada com a diferença do

clima entre as regiões, fator importante na proliferação do vetor (LABRUNA e

PEREIRA, 2001; LABARTHE et al., 2003). No entanto foram encontradas incidência

de 23% (TRAPP et al., 2006) e de 21% (DAGNONE et al., 2003) de E. canis em

cães no Paraná, também região sul. Embora Labarthe e colaboradores (2003)

tenham encontrado 15,5% de frequência de soro positividade para este parasito em

São Paulo, SANTOS et al., (2009) encontraram 25,4% utilizando análise molecular

para o DNA de E. canis, na região de Ribeirão Preto/SP enquanto em estudos

moleculares em Botucatu/SP 30,9% (BULLA et al., 2004). Em Campinas/SP, a

análise para pesquisa de erlichiose em 1654 prontuários, do Hospital Veterinário da

Universidade Paulista de Campinas, revelou 87 (5,25%) animais positivos, sendo 54

(3,3%) E. canis e 33 (2%) A.platys (CONDE et al., 2007).

Em estudo realizado em área rural do Rio de Janeiro (região do médio Paraíba)

com 250 cães utilizando esfregaço sanguíneo identificou-se uma ocorrência de 4,8%

de infecção por E. canis (O’DWYER et al., 2001). Santos (2008), estudando

população canina do Centro de Controle de Zoonozes Paulo Darcoso Filho no

município do Rio de Janeiro/RJ avaliou 38 cães escolhidos aleatoriamente e

verificou soropositividade para E. canis em 31 (88,6%) e 23 (60, 5%) com mórulas

intraplaquetárias, sugestivas de A. platys.

47

Na região metropolitana do Rio de janeiro foi encontrada prevalência de 15%

em detecção molecular de E. canis (MACIEIRA et al., 2005). No Município de

Campos dos Goytacazes/RJ, de 1.576 lâminas avaliadas em pesquisa de

hemocitoparasitas, foram evidenciados corpúsculos iniciais, elementares ou mórulas

em 219 (13,89%), de Ehrlichia spp (ALBERNAZ et al., 2007). Também no Rio de

Janeiro, estudo de Accetta (2008) de 3019 esfregaços da Região dos Lagos, 84

(2,8%) foram positivos, sendo 55 (1,8%) para Ehrlichia sp. e 29 (1%) para A. platys.

Outro estudo sobre ocorrência de E. canis feito com 253 amostras de dois

laboratórios particulares no Rio de Janeiro, de clínicas provenientes dos municípios

de Niterói, São Gonçalo, Maricá, São Pedro D’Aldeia, Iguaba, Araruama e

Saquarema, mostrou positividade de 120 amostras (47,4%) através de teste

sorológico (PIMENTEL Jr, 2007).

Em Minas Gerais, de um total de 226 cães, 101 (44,7%) foram diagnosticados

como soropositivos para E. canis. Sendo 65,6% de cães positivos em Nanuque,

37,8% em Belo Horizonte, e 24,7% em Lavras (COSTA Jr et al., 2007). Também em

Belo Horizonte, em estudo da prevalencia de cães soropositivos feito por laboratório

particular, foram analisadas 1640 amostras sendo 901 (54,93%) soropositivas para

E. canis (RISTOW et al., 2009).

No Nordeste, em estudo realizado em 472 cães da cidade de Salvador/BA,

focando os distritos de Itapuã e Cajazeiras, observou-se a prevalência de anticorpos

anti-E. canis, pela imunofluorescência indireta (título ≥ 1:80) em cães, de 35,6%

(168/472). Amostras de sangue dos animais soropositivos foram submetidos a

pesquisa do DNA por uma “nested”-PCR para identificação da espécie de Ehrlichia

responsável pela infecção. Dentre os positivos, 58 (34,5%) cães foram PCR-

positivos para E. canis (SOUZA et al., 2010). Freire e colaboradores (2009) em

estudos realizados no município de Lauro Freitas e entorno, na região metropolitana

de Salvador, avaliaram 100 cães e encontraram 51% de soropositivos, em teste

ELISA, para E. canis e em análise dos esfregaços sanguíneos, 60% apresentavam

inclusões em plaquetas. Ainda em Salvador, Meneses e colaboradores (2008),

estudaram grupo de 75 cães doentes e 98,7% (74/75) foram soropositivos, 33,3%

(25/75) tiveram DNA de E. canis detectados e 5,33% (4/75) tiveram mórulas

observadas em esfregaço.

48

Em estudo realizado no Sul da Bahia, na, Microrregião Ilhéus-Itabuna, a

positividade de anticorpos anti-E. canis encontrada, em teste ELISA, foi de 43% (43)

em Ilhéus e de 29% (29) em Itabuna, perfazendo um total de 36% (72) dos 200 cães

avaliados nos dois municípios (CARLOS et al., 2007). No ano seguinte, em estudos

realizados na mesma região por meio de pesquisa do DNA específico para E. canis,

foi encontrado, de total de 153 cães, sendo 84 de Ilhéus e 69 de Itabuna, 12 animais

(7,8%) positivos. Destes, 9 animais (10,7%) em Ilhéus e três (4,3%) em Itabuna

(CARVALHO et al , 2008).

Ainda no nordeste brasileiro, em Mossoró/RN 198 animais foram pesquisados

por diagnóstico morfológico, sendo encontrados 13 (6,6%) positivos (MEDEIROS e

LIMA, 2004). Em Aracajú/SE a análise de 1565 prontuários do Hospital Veterinário

Dr Vicente Borelli de Aracaju, revelou que 119 (7,6%) indicavam diagnóstico positivo

de ehrlichiose canina (FAIERSTEIN et al., 2008). Em Recife/PE, estudo molecular

com 205 amostras 48,78% estavam positivas para A. platys e 38,08% para E. canis

(RAMOS et al., 2010).

Na região centro-oeste, no município de Dourados/MT o levantamento

retrospectivo de casos de hemoparasitoses no Hospital Veterinário da Faculdade

Anhanguera, 3,8% tinham diagnóstico de E. canis e 2,4% de A. platys (RODRIGUES

et al., 2008). Em Brasília/DF, foram avaliados 2952 históricos de pacientes caninos

do Hospital Veterinário da Universidade de Brasília e 0,81% tinham diagnóstico de

Ehrlichia sp. e 0,69% de A. platys (VASCONCELOS et al., 2008). Em Anápolis/GO

53 animais do Centro de Controle de Zoonoses foram avaliados morfologicamente e

1 (1,9%) foi positivo para Ehrlichia sp. e 9 (17%) positivos para Anaplasma sp.

(MUNDIM, et al., 2008). Na cidade de Cuiabá/MT, 195 cães atendidos no Hospital

Veterinário da UFMT foram avaliados através do esfregaço sanguíneo e 48 (24,6%)

apresentaram mórulas. Uma amostragem de 60 desses 195 cães foi escolhida

aleatoriamente para serem avaliados por PCR e revelaram que 9 (15%) eram

positivos para E. canis e 3 (5%) para Ehrlichia sp. (SOUSA et al., 2010). Também

em Cuiabá/MT, 254 cães domiciliados foram selecionados e testados

sorologicamente e foram detectados 108 (42,5%) positivos (SILVA et al., 2010).

Na Região Norte, estudo realizado pesquisando DNA erlichial em carrapatos,

humanos e cães de Rondônia, foram detectados apenas nos cães, sendo esta a

notificação dos primeiros casos de E. canis na Região Amazônica. Nas outras

49

espécies não foram amplificados DNA erlichial. No mesmo estudo foram analisadas

amostras sanguíneas de capivaras, também todas negativas na pesquisa molecular

(LABRUNA et al., 2007).

2.3.4 Ocorrência em populações trombocitopênicas

Diferenças na prevalência pode refletir a diversidade na patogenicidade do

isolado ou ser um viés de seleção porque cães trombocitopênicos são mais

propensos a serem testados para ehrlichiose (DAGNONE et al., 2003). Em estudo

feito com animais clinicamente suspeitos, na Bahia/BR, foram encontardos

anticorpos anti-Ehrlichia canis em 98,66% (74/75) dos animais. A PCR foi positiva

em 33,3% (25/75) dos cães, enquanto a presença de mórulas foi positiva em 5,33%

(4/75) dos suspeitos. Nesse grupo, contagens de plaquetas com valores inferiores a

200.000/μL foram encontradas em 15 animais (MENESES et al., 2008). Em São

Paulo, na região de Botucatu, estudos moleculares mostraram prevalência de 10,5%

em cães com trombocitopenia, sendo que em animais com trombocitopenia menor

do que 100000/μL essa incidência aumenta para 63,1% (BULLA et al., 2004). No

Rio de Janeiro/RJ estudo molecular com população trombocitopênica determinou

prevalência de E. canis de 32,1%, enquanto em não trombocitopênicos foi de 3,5%

(MACIEIRA et al., 2005). Na Região dos Lagos/RJ entre 1127 trombocitopênicos 84

(7,45%) apresentaram mórulas e, desses, 55 (65,5%) foram classificadas como

Ehrlichia spp. e 29 (34,5%) como A. platys, resultando 1043 trombocitopênicos

negativos para diagnóstico morfológico (ACCETTA, 2008). Em Jaboticabal/SP foi

encontrada incidência de 43% de Ehrlichia spp. em cães trombocitopênicos (UENO

et al., 2009)

2.3.5 Estudos epidemiológicos de A. platys

Estudos epidemiológicos em relação a A. platys são ainda escassos, mas

presume-se que sua distribuição geográfica seja semelhante a outras espécies de

rickettsias (BRADFIELD et al., 1996). Esta bactéria já foi descrita nos EUA, na

Grécia, França, Itália, Israel, China, Japão, Tailândia, Venezuela e Austrália

(BROWN et al., 2001) e tem sido encontrada em todas as regiões brasileiras,

embora poucos casos tenham sido publicados formalmente na literatura (DANTAS-

TORRES, 2008). E é provável que duas cepas diferentes circulem no Brasil

50

(CARDOZO et al., 2007; CARDOZO et al., 2009) e a incidência pode variar de

10,3%, encontrada em Cuiabá/MS (SALES et al., 2007) a 18,8%, no Rio de

Janeiro/RJ (FERREIRA et al., 2007). A infecção por E. (Anaplasma) platys parece ter

como vetor R. Sanguineus (KORDICK et al., 1999). A maioria dos trabalhos

relacionaram a ocorrência em estudos que avaliaram, também, a ocorrência em

infecção associada com outros hemoparasitas, principalmente os de E. canis. No Rio

de Janeiro (SANTOS, 2008; ACCETTA, 2008), em Minas Gerais (MOREIRA et al.,

2003) em São Paulo (DAGNONE et al., 2003; DINIZ et al., 2007; SANTOS et

al.,2009) na Bahia (FREIRE et al., 2009 ), Pernambuco (RAMOS et al., 2009;

RAMOS et al., 2010), Mato Grosso (RODRIGUES et al., 2008; SOUSA et al., 2009),

Goiás (VASCONCELOS et al., 2008, MUNDIM, et al., 2008).

2.4 FISIOPATOGENIA

Em estudo molecular, caracterizando cepas de E. canis com a gravidade da

doença, foi mostrado que há baixa variabilidade genética. O estudo também

forneceu uma evidência mais adicional de que, apesar da distribuição mundial de E.

canis, a parte do perfil genético já investigado é conservado e nenhum isolado é

fator preditivo de características clínicas particulares. Apesar disso, foi sugerido que

novos estudos sobre o polimorfismo genético de regiões genômicas não associadas

com características clínicas, fossem feitos para determinar se essas afetam

substancialmente a virulência e o desfecho clínico da doença (SIARKOU et al.,

2007).

2.4.1 Estudos biológicos

Dependendo da espécie, os membros do gênero Ehrlichia / Anaplasma

infectam mononucleares, granulócitos ou plaquetas. (RIKIHISA, 1991).

Algumas características dos gêneros Anaplasma e Ehrlichia que contribuem

para o entendimento do mecanismo de adesão e sobrevivência na célula hospedeira

tem sido descritos. Quando a bactéria interage com a célula alvo, sinais são

transmitidos entre ambas. Dessa forma, cria-se um ambiente propício à replicação

bacteriana. A entrada nos fagócitos é independente de microfilamentos , indicando

não ocorrer por fagocitose, no entanto depende da atividade da transglutaminase,

pois a endocitose é mediada por receptor (RIKIHISA, 2003).

52

51

2.4.2 Alterações celulares e na imunidade

A compreensão da doença, sua patofisiologia, patogênese e controle são

cruciais, pois dados sugeriram que ocorrem alterações na função de neutrófilos dos

hospedeiros e proteção da imunidade inata e adaptativa e, contribuem para as

manifestações da doença (HECHEMY, et al., 2005). Na erlichiose monocítica do cão

a severidade da doença pode estar relacionada com a natureza da resposta imune

do paciente e o perfil de citocinas induzido após inoculação, onde níveis elevados de

interferon gama (IFN γ) tem sido associados a doença mais branda enquanto

elevados níveis de interleucinas (IL) IL - 1β e IL – 8 estão relacionados a doença

mais grave. (SIARKOU et al., 2007).

Embora a resposta imune celular seja considerada a mais importante para E.

canis, bactéria intracelular, a resposta humoral teve correlação positiva com a

diminuição da quantidade de DNA bacteriano detectado no sangue e baço de

animais infectados experimentalmente por via hematogênica. A infecção

experimental, por ter sido diretamente no sangue, pode ter levado ao aumento da

quantidade de DNA presente no hospedeiro muito mais rápido do que quando

inoculado por via subcutânea, como ocorre naturalmente através da picada do

carrapato. No entando, o acompanhamento de animais infectados naturalmente em

diferentes fases da doença é necessário para confirmar essa comparação (BANETH

et al., 2009). Apesar de poder ocorrer uma gamopatia policlonal ou monoclonal, altos

títulos de anticorpos não protegem contra infecções futuras ou eliminam infecções

existentes. Ao contrário, algumas lesões observadas na erlichiose parecem ser

mediada por complexos imunes, e cães com gamopatia monoclonal podem

desenvolver sequelas tais como glomerulopatia ou hemorragia retiniana (LITTLE,

2010).

Em infecção experimental com E. canis por via subcutânea, a manifestação

clínica da doença variou com a quantidade do inóculo. Quanto menor, mais tardia foi

a manifestação clínica, sendo que com doses muito baixas alguns animais não

apresentaram sintomas, embora tivessem desenvolvido resposta sorológica. A

concentração de imunoglobulina do tipo IgG foi maior em animais cujo inóculo foi

elevado. Nesse estudo a diminuição da contagem plaquetária e a soroconversão

ocorreram mais tardiamente do que em infecção experimental por via hematogênica,

52

mostrando que a via de administração e o tamanho do inóculo podem influenciar no

curso e manifestação clínica da ehrlichiose monocíca canina (GAUNT et al., 1996).

Em linhas gerais, o estudo realizado por Castro e colaboradores em 2004,

com infecção experimental, mostrou um envolvimento intenso de células imunes na

ehrlichiose monocítica canina (EMC), especialmente nos linfonodos e no baço.

Mostrou que a vasculite imunomediada pode desempenhar um papel central na

patogênese da EMC e poderia explicar a maior parte das lesões observadas em

importantes órgãos e tecidos de cães infectados. A gravidade de lesões em animais

infectados e a presença de uma intensa atividade imunológica sugere mecanismos

imunomediados na gênese das lesões. Imunohistoquímica de órgãos linfóides

evidenciou aumento do número de IgM e IgG em células imunologicamente

marcadas em cães com EMC. Linfócitos TCD3+ estavam presentes em maior

número nos sinusóides esplênicos e na região medular dos linfonodos, e em menor

número na região folicular dos linfonodos de todos os cães infectados quando

comparados aos animais controle. O menor número de células T CD3+ na região

folicular dos gânglios linfáticos foi considerado um achado importante pelos

pesquisadores para confirmar participação do sistema imune na formação

histopatológica. Populações de células T CD8 + estavam aumentadas nas regiões

folicular e medular dos linfonodos de animais infectados com E. canis. Essa

descoberta demonstra que as respostas mediadas por células foram pronunciadas

em cães inoculados. Por outro lado, as células CD8+ estavam diminuídas no baço

de cães infectados que poderiam ter ocorrido como um desequilíbrio da resposta

imune neste órgão na EMC. Os pesquisadores sugeriram que as células TCD8+

poderiam representar uma resposta imune protetora contra E. canis persistente, e

que resistiriam a erradicação pelos fagócitos e anticorpos, enquanto elas também

poderiam mediar a lesão tecidual pela eliminação citolítica das células do hospedeiro

parasitado e, assim, contribuiriam para a patogênese da EMC (CASTRO et al.,

2004).

Inclusões em células precursoras na medula óssea sugerem que ocorre

agressão direta no tecido medular para evolução de mielossupressão (MOREIRA et

al., 2005). Porém, segundo Mylonakis et al., (2010) não foi observado mielofibrose

em animais com depressão medular desenvolvida pela infecção por E. canis.

53

O estresse oxidativo parece não ocorrer em infecções isoladas por E. canis,

mas sim com associação a hemólise por babesiose. Estudo avaliando a

concentração de peróxido lipídico eritrocitário (LPO) em cães infectados com E.

canis e coinfectado com Babesia sp. mostrou diferença significativamente maior nos

coinfectados, e assim, danos oxidativos não foram evidenciados pelo aumento de

LPO nos eritrócitos. Não há informação sobre peroxidação de lipídio na erlichiose

monocítica do cão, como na Rickettsia rickettsii, e a E. canis não produz exotoxina e,

seu conteúdo limitado de lipopolissacarídeos, é considerado baixo para o processo

patogênico. Mesmo a morte da bactéria pela célula hospedeira não parece envolver

produção de oxigênio reativo (KUMAR et al., 2006).

2.4.3 Fisiopatogenia da trombocitopenia

A trombocitopenia é uma das características fisiopatogênicas mais comuns na

ehrlichiose canina. Estudo com infecção experimental para avaliar os mecanismos

que levam a redução do número de plaquetas nessa doença mostrou a possível

associação do aumento da destruição pela maior ligação com cromato de sódio, com

a diminuição da vida média plaquetária, através da menor incorporação de

selenomethionina, ambos pelas plaquetas recém formadas liberadas na circulação.

O estudo mostrou, através da avaliação radioativa, que a destruição ocorria

primariamente no baço. Além disso, foi observado através da quantificação de

megacariócitos no sangue e de megatrombócitos (megaloplaquetas), avaliados pelo

diâmetro plaquetário, que existia aceleração da trombopoiese e da liberação de

plaquetas em resposta à redução do número circulante. Foi mostrado que, em

pacientes cuja plaquetometria fosse igual ou inferior a 105/μL, a média do diâmetro

plaquetário tendia ser cada vez maior, bem como a quantidade de megacariócitos

(SMITH et al., 1975). Outro estudo com infecção experimental, conduzido em 1995,

avaliando a presença de anticorpos antiplaquetários na ehrlichiose, mostrou que a

destruição imunomediada era um dos mecanismos que contribuia para a

plaquetopenia e que esta diminuição estava inversamente proporcional ao volume

plaquetário médio (VPM) e que esse começava a se elevar logo na primeira semana

após infecção. A detecção de anticorpos antiplaquetários ocorreu 24 dias após

infecção (DAI) enquanto anticorpos para E. canis (IgG) foram detectados no 15DAI.

(WANER et al., 1995). Também em infecção experimental, estudo que acompanhou

54

cães durante 15 semanas após infecção, mostrou que no 3DAI apareciam

megaloplaquetas e plaquetas ativadas (ALMOSNY, 1998).

A trombocitopenia pode ser causada pela hipoplasia de medula óssea e

também o sequestro e aumento de consumo, assim como pode contribuir para

ocorrência de distúrbios hemorrágicos, principalmente se associada à diminuição da

função plaquetária e secreção de fator de inibição da migração plaquetária por

linfócitos expostos às células infectadas por E. canis. A associação com inibição da

agregação plaquetária pode contribuir para manifetação de diáteses hemorrágicas

(LITTLE, 2010).

Na anaplasmose canina acredita-se que o mecanismo inicial da

trombocitopenia esteja relacionado à proliferação do parasito e, as trombocitopenias

subsequentes, são marcadas por mecanismos de remoção imunomediados

(WOODY e HOSKINS, 1991). O mecanismo da trombocitopenia por A. platys,

entretanto, ainda não está perfeitamente conhecido (RUSSEL e GRIDEM, 2000). Há

um decréscimo da agregação plaquetária, e sua relevância clínica ainda não está

completamente esclarecida. Isso pode estar relacionado à ativação plaquetária

durante a infecção aguda e posterior liberação do parasito, pois estas plaquetas

continuam circulantes, porém hipofuncionais, o que pode justificar o decréscimo

discreto da agregação (GAUNT et al., 1990).

2.5 - PATOLOGIA CLÍNICA

Nas ehrliquioses vários sinais clínicos são inespecíficos (WOODY e

HOSKINS, 1991), pois há muitas outras doenças que apresentam os mesmos sinais

e sintomas que podem estar acometendo os cães infectados por E. canis de forma

isolada, ou em co-infecção (NEITZ e THOMAS, 1938; BREITSCHWERDT et al.,

1998) como com A. platys (BREITSCHWERDT et al., 1998) ou com Babesia

sp.(KUMAR et al., 2006). Por isso o estudo das alterações hematológicas,

bioquímica sanguínea e outros exames laboratoriais podem auxiliar no diagnóstico,

acompanhamento clínico e recuperação do paciente.

Vários estudos têm mostrado que essas bactérias causam alterações em

exames laboratoriais de rotina, como hemograma e bioquímicas séricas (ALMOSNY,

1998).

55

2.5.1 Alterações Hematológicas

Vários trabalhos descrevem alterações hematológicas nas infecções por

Ehrlichia/Anaplasma em cães em infecção natural (ALMOSNY, 1998) ou

experimental (ALMOSNY, 1998; CASTRO et al., 2004; UNVER et al., 2009; GAUNT

et al., 2010;). Cães infectados com E. canis apresentaram ligeira a moderada

alterações hematológicas na infecção experimental aguda por apenas algumas

semanas (30 dias) e houve tendência evidente para os parâmetros hematológicos

voltarem ao normal no final do experimento (CASTRO et al., 2004).

2.5.1.1 Alterações Plaquetárias

Como um dos principais achados de patologia clínica na ehrlichiose canina é a

trombocitopenia (LITTLE, 2010), muitos clínicos tendem a usá-la como uma

indicação para usar o tratamento antimicrobiano (OLIVEIRA et al., 2009a). A

contagem do número de plaquetas tem sido um dos principais parâmetros

laboratoriais, de diagnóstico e acompanhamento clínico, de animais suspeitos ou

confirmadamente positivos para ehrlichiose/anaplasmose em cães (BULLA et al.,

2004; MACIEIRA et al., 2005). Apesar disso, em estudo feito no Rio de Janeiro/BR,

avaliando a correlação da plaquetopenia com a positividade de DNA ehrlichial no

sangue de cães, apenas 32,1% foram positivos, sendo a maioria E. canis (26,8%).

No grupo não trombocitopênico a positividade para DNA ehrlichial foi de 3,5% e

todos E. canis (MACIEIRA et al., 2005). Em Botucatu, estado de São Paulo/BR,

numa população de 146 cães trombocitopênicos, 66 (45,2%) foram positivos para

pesquisa de DNA de E. canis e de 71 cães com plaquetometria normal, apenas 1

(1,4%) foi positivo (BULLA et al., 2004). No entanto, em Ribeirão Preto/SP, estudo

com 107 animais trombocitopênicos 85 (79,4%) foram positivos para E. canis e, no

mesmo estudo, outro grupo de 114 cães não trombocitopênicos, teve incidência

menor, porém significativa, pois 29,8% dos animais foram positivos para DNA de E.

canis. (SANTOS et al., 2009).

A coinfecção parece ser um fator importante na determinação de

trombocitopenia e vários estudos têm mostrado essa ocorrência (MOREIRA et al.,

2003; SANTOS et al., 2009; LITTLE, 2010; GAUNT et al., 2010). No estudo de

Santos e colaboradores (2009), pesquisando DNA de vários hemoparasitas em

Ribeirão Preto/SP, foi encontrado numa população canina de 107 animais

56

trombocitopênicos, 85 positivos para E. canis, e desses, 28 (26,1%) eram co-

infectados com A. platys e/ou Babesia sp. No grupo de 114 animais não

trombocitopênicos, dos 34 positivos para E. canis, 5 estavam co-infectados com um

ou ambos desses hemoparasitas. Segundo revisão conduzida por Little (2010), na

infecção por A. platys a trombocitopenia é a alteração mais frequente, no entanto

aumenta e diminui em um ciclo de 10 a 14 dias, durante a fase aguda. Porém, com

co-infecção com E. canis, a trombocitopenia pode ser mais severa. E, isso tem se

confirmado em infecção experimental (GAUNT et al., 2010).

A plaquetometria tem seus valores apresentando flutuações dia após dia

(TROY e FORRESTER, 1990; XAVIER et al., 2009) e, a resposta medular, como

estímulo positivo a trombocitopenia, justifica essas variações (SMITH et al, 1975). O

Tempo de sangramento prolongado e a fraca retração do coágulo são evidências da

trombocitopenia ou disfunção plaquetária (HIBLER et al, 1986; TROY e

FORRESTER, 1990; HARRUS, et al, 1996). Atualmente a plaquetometria tem sido

considerado um teste sensível, embora pouco específico, na triagem de cães

clinicamente suspeitos de ehrlichiose (BULLA et al, 2004; MACIEIRA et al, 2005) e a

magnitude da trombocitopenia pode aumentar a fidedignidade do diagnóstico

(BULLA et al, 2004).

Na anaplasmose canina, a trombocitopenia é um dos principais achados

laboratoriais (DAGNONE et al., 2003), associado à presença frequente de

macroplaquetas (HARRUS et al., 1997a; ALMOSNY, 1998; KAKOMA et al., 2000).

Cães infectados podem apresentar plaquetometrias próximas ao valor mínimo de

referência ou valores extremamente baixos (WOODY e HOSKINS, 1991; HOSKINS,

1991a; XAVIER et al., 2009).

A trombocitopenia associada a A. platys é classificada como regenerativa,

pois uma hiperplasia megacariocítica é observada na medula óssea de cães

infectados (BAKER et al., 1987). Mudanças cíclicas no número de megacariócitos ou

inclusões citoplasmáticas não foram observadas (GAUNT et al., 1990).

Em estudo com animais infectados naturalmente e diagnosticados pela

pesquisa de DNA bacteriano no sangue, a contagem plaquetária variou de 25 a 222

mil/μL em quatro cães com ehrlichiose e em torno de 150mil/μL em um cão com

anaplasmose (BREITSCHWERDT et al., 1998). Em outro estudo, também com

animais infectados naturalmente, 27 cães foram diagnosticado por sorologia e

57

pesquisa do DNA e a maioria foi positivo para E. canis sendo 11 coinfectados com

outra Ehrlichia ou A. platys e nesses a plaquetometria média foi de 118 x103/μL

(KORDICK et al., 1999).

No Município de Campos dos Goytacazes/RJ, no Brasil, analisando-se 1576

animais suspeitos com 219 confirmados para E. canis pela detecção de mórulas, a

trombocitopenia foi uma das alterações mais frequentes (ALBERNAZ et al., 2007).

Trabalhos com infecção experimental mostraram que ocorre trombocitopenia na

fase aguda da infecção por E. canis (CASTRO et al., 2004; GAUNT et al., 2010;

UNVER et al., 2009; XAVIER et al., 2009) e A.platys (GAUNT et al., 2010). Estudo

feito no EUA mostrou que a diminuição da plaquetometria ocorreu em torno do 28 º

DAI e que foi mais tardia do que aquela cuja infecção tenha sido feita por via

intravenosa (GAUNT et al., 1996). Em estudo no Rio de Janeiro/Brasil, após infecção

experimental por via intravenosa, observou-se diminuição na plaquetometria a partir

da primeira semana após infecção tendo sido a menor contagem na sexta semana,

aproximadamente 48 º DAI (XAVIER et al., 2009). Estudo realizado anteriormente já

relatava que a contagem de plaquetas diminuiu significativamente em cães

infectados a partir da terceira semana até o final do estudo (30 dias após infecção)

(CASTRO et al., 2004). No estudo de Unver e colaboradores (2009), houve

diminuição significativa nos trombócitos com valor de 780/μL, considerando a

inoculação com uma nova cepa de E. canis.

2.5.1.2 Alterações Eritrocitárias

No eritrograma é comum anemia arregenerativa, porém pode ser regenerativa

quando associada a hemólise por infecção concomitante por Babesia canis ou em

decorrência de hemorragia (HOSKINS, 1991a; HOSKINS, 1991b e TROY &

FORRESTER, 1990). Estudos experimentais mostraram o aparecimento de discreta

anemia arregenerativa na fase aguda da ehrlichiose canina, acompanhada até

45DAI (WANER et al., 1995). Em infecção experimental acompanhada durante

quinze semanas, a anemia foi mais intensa entre as quinta e sétima semanas após

infecção e morfologicamente normocítica e normocrômica (ALMOSNY, 1998). Houve

decréscimo significativo nos valores médios da hematimetria (H), hemoglobina (Hb)

e volume globular (VG) dos animais infectados, detectados nas semanas 2 e 3 após

infecção. O CHCM (Concentração de Hb Corpuscular Médio) foi significativamente

58

maior nas semanas 3 e 4 (CASTRO et al., 2004). Hematimetria (3,2 x 106/μL) e VG

(25%) foram diminuidos e Hb (9 g/dL) próximo ao mínimo normal no experimento de

Unver et al (2009).

Estudo com animais infectados naturalmente, no Município de Campos dos

Goytacazes/RJ, mostrou que, dos 219 confirmados para E. canis pela presença de

mórulas, a anemia normocítica normocrômica foi alteração eritrocitária mais

frequente (ALBERNAZ et al., 2007).

Na anaplasmose canina pode ser observada anemia associada,

principalmente, a trombocitopenia (DAGNONE et al., 2003) ou então leve diminuição

do hematócrito, que pode ser raramente inferior o valor de referência (WOODY e

HOSKINS, 1991; HOSKINS, 1991a). A anemia que ocorre durante a doença clínica

é classificada como normocítica/normocrômica e as mudanças no eritrócito e na

concentração de ferro sérico são semelhantes à descrita na anemia da doença

inflamatória. A relação mielóide/eritróide apresentou discreta diminuição (BAKER et

al., 1988). Segundo relatos de Little (2010) na infecção por A. platys pode ocorrer

anemia não regenerativa e, em associação com E. canis, a anemia pode ser mais

acentuada.

Outras doenças também podem causar anemia e trombocitopenia, não sendo

esses achados suficientes para um diagnóstico conclusivo, mas deve-se pensar em

Ehrlichia sp ou A. platys como diagnóstico diferencial para outras doenças

(DAGNONE et al., 2003).

2.5.1.3 Alterações Leucocitárias

O número de leucócitos varia durante a fase aguda da ehrlichiose canina,

porém com a indução do sequestro por mecanismos imunológicos ou utilização

inflamatória, seu número pode ser diminuído, havendo então, um comportamento

cíclico com evolução variada que tende a leucopenia na fase crônica. (CODNER et

al 1985; HARRUS et al, 1997a e ALMOSNY, 1998). Em infecção experimental,

acompanhada durante quinze semanas, a leucometria global (LG) média dos

animais se manteve dentro dos limites normais e apenas um cão, dos nove

inoculados, apresentou leucopenia entre a terceira e sexta semanas após infecção

(ALMOSNY, 1998). Outro estudo com infecção experimental com E. canis mostrou o

aparecimento de discreta leucopenia na fase aguda da ehrlichiose canina,

59

acompanhada até 45DAI (WANER et al., 1995). Os valores de leucócitos foram

significativamente menores nas semanas 2 e 3 após infecção e a contagem de

eosinófilos caiu a partir da segunda semana. Os animais infectados mostraram

aumento significativo nos valores médios de neutrófilos e monócitos na terceira

semana, enquanto o número de linfócitos diminuiu significativamente (CASTRO et

al., 2004). No experimento de Unver e colaboradores (2009) houve diminuição

moderada na contagem de leucócitos (3,1 x 103/μL), neutrófilos (2,4 x 103/μL) e

linfócitos (400/μL).

No estudo de BREITSCHWERDT et al., (1998), feito com cães naturalmente

infectados, a LG variou de 2,9 x103 a 50,9 x103/ μL em cães com ehrlichiose,

enquanto no animal com anaplasmose essa contagem foi de aproximadamente

7x103/μL. No estudo de KORDICK et al., (1999) também com animais naturalmente

infectados, a maioria era coinfectado, e a média da LG foi de 20x103/μL. No estudo

feito em Campos dos Goytacazes/RJ, entre os 219 confirmados para E. canis pela

presença de mórulas em esfregaço sanguíneo, o desvio nuclear de neutrófilos à

esquerda (DNNE) leve, linfocitopenia e eosinopenia absolutas foram as alterações

mais frequentes (ALBERNAZ et al., 2007). Segundo Little (2010) pode ocorrer

linfocitose granular grosseira.

Na anaplasmose canina pode ocorrer monocitose associada a achados

laboratoriais como macroplaquetas (HARRUS et al., 1997a, KAKOMA et al., 2000).

Em alguns casos, uma diminuição transitória da leucometria global também pode ser

encontrada (WOODY e HOSKINS, 1991; HOSKINS, 1991a). Segundo revisão

conduzida por Little (2010) na infecção por A. platys pode ocorrer leucopenia.

2.5.2 Alterações bioquímicas

Vários trabalhos têm descrito alterações bioquímicas em decorrência de

lesões desencadeadas pela infecção por Ehrlichia sp. Esses estudos mostram a

importância de se avaliar órgãos vitais como fígado, através da avaliação dos

valores séricos de proteinas, bilirrubinas e atividades de transaminases e fosfatase

alcalina, assim como as provas de função renal através das dosagens de uréia e

creatinina séricas (CODNER et al, 1985; KUEHN & GAUNT, 1985; CODNER e

FARRIS-SMITH, 1986; KANEKO et al, 1997; TROY & FORRETER, 1990; HOSKINS,

1991a; CODNER et al., 1992; VARELA et al, 1997 e ALMOSNY, 1998).

60

Em trabalho conduzido na cidade de Salvador e região metropolitana,

Bahia/BR, avaliando 75 cães clinicamente suspeitos, não foram observadas

alterações nos animais positivos pela PCR, diferentemente dos relatos na literatura,

que enfatizam a presença de hiperproteinemia em função de uma

hipergamaglobulinemia, alteração comum na fase subclínica da ehrlichiose, quando

a titulação se encontra elevada (MENESES et al., 2008). Em estudo com infecção

experimental a proteína plasmática total (PPT) diminuiu significativamente na

terceira semana (CASTRO et al., 2004). No entanto, no experimento de Unver e

colaboradores (2009), o valor das proteínas do plasma foi de 5,0 g / dL, próximo ao

mínimo normal. Segundo Little (2010) na ehrlichiose canina podem ser achados

hiperglobulinemia, hipoalbuminemia, e aumento de alanina amino transferase (ALT).

Na anaplasmose canina pode ocorrer hipoalbuminemia (HARRUS et al.,

1997a; KAKOMA et al., 2000). Há uma hipoalbuminemia e hipocalcemia que

acontecem em resposta à inflamação e resposta imune ao microorganismo (BAKER

et al., 1988, LITTLE, 2010). Hipergamaglobulinemia também é relatada com

elevações dos valores de IgM e IgA (HIBLER et al., 1986; ALMOSNY e MASSARD,

2002; LITTLE, 2010).

Oliveira e colaboradores (2008) analisaram alterações bioquímicas em cães

de população hospitalar, positivos para hemoparasitas em diagnóstico morfológico, e

verificaram que aumento de atividade sérica de fosfatase alcalina (FA) e de ALT

foram as alterações mais frequentes naqueles positivos para Ehrlichia sp. enquanto

que, para positivos para A. platys aumento de ALT e proteínas, com aumento de

globulinas, foram mais frequentes.

2.6 DIAGNÓSTICO

A erlichiose canina (EMC) é uma doença potencialmente fatal e o diagnóstico

não pode ser feito baseado em sinais clínicos ou resultados sorológicos sozinhos

(VINASCO et al., 2007).

As ehrlichioses apresentam dificuldades para o diagnóstico, pois os vários

sinais clínicos da doença são muito inespecíficos. (WOODY e HOSKINS, 1991). O

diagnóstico clínico é difícil, pois muitas outras doenças apresentam os mesmos

sinais e sintomas que podem estar acometendo os cães infectados por E. canis de

forma isolada, ou em co-infecção (NEITZ e THOMAS, 1938).

61

Harrus e Waner (2011) sumarizaram, em revisão sobre o diagnóstico da

ehrlichiose canina, que este deve ser feito de acordo com a fase da doença ou suas

manifestações clínicas, além de histórico de viver ou ter viajado por regiões

endêmicas ou ter sido exposto a carrapato. Além disso, destacam a importância de

se associar alterações hematológicas e clínicas com características da doença.

Mostraram que a hematologia, sorologia, citologia e isolamento são ferramentas

diagnósticas valiosas, mas que técnicas moleculares são necessárias para o

diagnóstico definitivo. Similarmente, Little (2010) descreveu que os diagnósticos da

ehrlichiose e da anaplasmose caninas geralmente começam com a avaliação clínica,

onde o doente se apresenta febril, com mialgia, histórico de contato com carrapatos

e o hemograma completo com trombocitopenia e outras anormalidades

características, podem aumentar a suspeita. afirmou, ainda, que a confirmação

laboratorial do diagnóstico pode ser feito por sorologia ou pesquisa do DNA pela

Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), embora outros métodos, como os exames

de esfregaços sanguíneos corados para pesquisar mórulas, possam ser

compensadores para alguns agentes, durante a infecção aguda. Conclui que, para

maximizar a probabilidade de se chegar a um diagnóstico, PCR e testes sorológicos

devem ser realizados em conjunto com um exame cuidadoso de esfregaços

sanguíneos em qualquer paciente, na qual ehrlichiose ou anaplasmose seja a

suspeita. O autor complementa, ainda, que o cultivo celular é um auxílio

metodológico diagnóstico dos laboratórios de pesquisa especializada.

Portanto, o diagnóstico laboratorial da infecção é muito importante e além de

ser feito diretamente pela visualização de mórulas, também pode ser feito através da

amplificação de uma porção do genoma do parasito através da PCR, ou

indiretamente pela detecção de anticorpos. (BREITSCHWERDT, 2000).

2.6.1 Pesquisa microscópica direta

A observação morfológica de hemoparasitos nas formas de mórulas ou de

corpúsculos elementares isolados, nos preparados corados por métodos de

Romanowsky vem sendo usada para diagnosticar hemoparasitoses, entretanto,

somente um pequeno número de animais infectados apresentam parasitos

circulantes. O achado em sangue periférico ocorre somente na fase aguda e requer

muito tempo e paciência do profissional que estiver avaliando o esfregaço

62

sanguíneo, e por isso apresenta baixa sensibilidade e frequentes falsos negativos.

(RIKIHISA, 1991; NEER, 1998).

Estudo experimental mostrou que mórulas intracitoplasmáticas de E. canis

foram detectados em monócitos dos esfregaços de sangue em todos os animais

infectados aos 12 dias após a infecção (CASTRO et al., 2004).

Apenas 4% dos casos são diagnosticados com um gasto médio de tempo de 40

a 60 minutos, dependendo da experiência do patologista (HARRUS e WANER,

2011). Um dos métodos muito utilizados na rotina clínico-laboratorial é o do

esfregaço de concentrado leucocitário (BULLA et al., 2004). A otimização aumenta

em torno de 66% observando-se vários esfregaços de concentrado leucocitário e,

em aproximadamente 34%, se for esfregaço de medula óssea. (HARRUS e WANER,

2011).

A probabilidade de obterem-se resultados positivos aumenta quando esse

preparado é um esfregaço de sangue capilar, feito com a primeira gota liberada após

incisão dérmica superficial (OLSEN et al., 1994). Segundo MILONAKIS et al. (2003),

o uso do diagnóstico citológico, através da análise da capa leucocitária e linfonodos,

pode levar a um diagnóstico definitivo na fase aguda da doença e, em cães com

linfadenopatia periférica, a sensibilidade é relativamente alta, sendo que as mórulas

de E. canis, que devem ser diferenciadas das outras estruturas intra-citoplasmáticas,

são mais encontradas dentro de linfócitos do que monócitos.Também Jain (1993)

descreve que esses organismos são achados como inclusões primariamente em

monócitos e linfócitos. Portanto, um dos obstáculos do diagnóstico microscópico é

saber diferenciar as estruturas observadas de outros possíveis parasitos,

precipitados de corantes e artefatos sobre os leucócitos (NEITZ e THOMAS, 1938).

Resultados falsamente positivos no diagnóstico de mórulas no esfregaço sanguíneo

podem ocorrer com plaquetas, linfócitos com grânulos azurófilos, material nuclear

fagocitado, além de outros anaplasmataceos (E. chaffeensis, N. riisticii, E.

ruminantium), que também estão em monócitos daí, a importância de se saber a

ocorrência geográfica dessas espécies e seus vetores, para indicar a necessidade

de PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) para diferenciá-las (HARRUS e

WANER, 2011). O mesmo pode ocorrer no diagnóstico de A platys, onde a pesquisa

do DNA, mostrou maior sensibilidade e especificidade do que a pesquisa

morfológica intraplaquetária em esfregaço sanguíneo (FERREIRA et al., 2007). A

63

análise do esfregaço também é importante para avaliar a ocorrência de co-infecção

com outros patógenos transmitidos por carrapatos e ainda, alterações celulares

como monócitos ativados, eritrofagocitose, trombofagocitose, fagocitose de material

nuclear e megaloplaquetas (HARRUS e WANER, 2011).

2.6.2 Testes sorológicos

Métodos sorológicos são, há muito tempo, os principais apoios no diagnóstico

de ehrlichioses e anaplasmoses, e ainda permanecem úteis na avaliação de

pacientes para esclarecer evidências de infecções com esses agentes (LITTLE,

2010). RIKIHISA (1991) afirmou que todos os agentes do gênero Ehrlichia induzem

uma resposta humoral intensa e esta é a base para o diagnóstico sorológico.

Imunoglobulinas M (IgM) não são consideradas indicadoras fidedignas de

exposição a E. canis devido a inconsistência do desenvolvimento de anticorpos

dessa classe durante o curso da doença. No entanto, títulos de IgG maiores ou igual

a 40 são considerados positivos (HARRUS e WANER, 2011).

A técnica sorológica mais utilizada para o diagnóstico da E. canis é a

imunofluorescência indireta (IFA), onde os anticorpos do tipo IgG são detectados e

indica exposição a bactéria (RISTIC et al., 1972). É uma ferramenta valiosa para o

diagnóstico e triagem, sendo que a IFA é considerada padrão ouro sorológico,

indicando exposição a E. canis (HARRUS e WANER, 2011). No entanto, um título

positivo para anticorpos contra E. canis indica apenas que o animal foi exposto ao

agente, podendo não apresentar infecção, por isso deve-se associar a outros

resultados e aos sinais clínicos do paciente. (RIKIHISA, 1991; WOODY e HOSKINS,

1991; HARRUS et al., 1998b; WANER et al., 2001).

Segundo Preziosi e Cohn (2002) em área endêmica, o resultado sorológico

positivo, não confirma que a doença exista e sim que o animal foi exposto e pode

estar curado ou não . Além desses problemas, ocorrem também reações cruzadas

que, no caso dos testes sorológicos para E. canis, também são detectados

anticorpos para E. ewingii, E. chaffeensis, Neorickettsia helminthoeca e Ehrlichia

(Cowdria) ruminantium (NEER et al., 2002) e ainda N. risticii. Por causa dessa

complicação com reações cruzadas, para o diagnóstico sorológico também deve ser

considerarado a ocorrência geográfica das espécies ou viagem do paciente à área

endêmica de alguma delas e ainda, que a IFA não pode diferenciar entre E. canis, E.

64

ewingii, E. chaffeensis, e Ehrlichia (Cowdria) ruminantium. Não existe reação

cruzada entre E. canis e A. platys e pouca ou nenhuma entre E. canis e R. rickettsii

(HARRUS e WANER, 2011).

As técnicas de IFA para E. canis e A. phagocytophilum são amplamente

disponíveis no diagnóstico laboratorial e, reações cruzadas entre espécies dentro

desses gêneros e, até certo ponto entre essas duas espécies, comumente ocorrem,

embora infecções com agentes relacionados possam gerar títulos de anticorpos

menores do que com o agente isolado (LITTLE, 2010). Reação cruzada entre

anticorpos para E. canis com antígenos de A. phagocytophilum foram bem descritos

por Waner e colaboradores em 1998, onde, em infecção experimental de seis cães,

na fase aguda não houve reação cruzada, mas 55 dias após infecção (DAI) ocorreu

em dois animais, após mais 22 dias em outros dois e, no 150 DAI nos últimos dois

cães, atingindo 100% de ocorrência no experimento.

Na infecção aguda são recomendados dois testes consecutivos de IFA para

diagnóstico e o aumento no título de anticorpos em torno de 2 a 4 vezes, indica

infecção ativa. Anticorpos do tipo IgG, persistem por vários meses a anos após

tratamento e eliminação da rickettsia (HARRUS e WANER, 2011). Na fase crônica,

terminal da doença, os cães podem apresentar diminuição acentuada no título de

anticorpos para E. canis, talvez por causa da resposta imunológica reduzida,

aparentemente causada pela pancitopenia típica da fase final da doença. (RISTIC et

al., 1972; HARRUS et al., 1996).

Na anaplasmose canina esse teste é utilizado para detecção de anticorpos no

soro e é muito usado quando a parasitemia é ausente ou muito baixa (FRENCH e

HARVEY, 1983; ARRAGA-ALVARADO et al., 2003) ou na avaliação pós-tratamento

(WEN et al., 1997). Não há reação cruzada entre A. platys e E. canis e, embora a

imunofluorescência indireta seja altamente específica (FRENCH e HARVEY, 1983;

WANER et al., 2001), não pode ser descartada a possibilidade de uma co-infecção.

Deve-se, ainda, levar em consideração que a presença de anticorpos contra A.

platys não significa infecção clínica e sim exposição ao agente (RIKIHISA, 1991;

WOODY e HOSKINS 1991; WANER et al., 2001; HARRUS e WANER, 2011),

semelhantemente às outras infecções.

A soroconversão (títulos acima de 100) ocorre em cães experimentalmente

infectados no pico da primeira parasitemia, em torno do décimo terceiro ao décimo

65

nono dia pós-inoculação. Os títulos persistem durante quatro meses (FRENCH e

HARVEY, 1983).

Em 2000 Moody e Chiodini em uma revisão dos métodos para detecção de

parasitos sanguíneos em humanos no Reino Unido, apesar do pouco destaque a

erlichiose (EGH e EMH), indicaram a IFA como método preferencial para seu

diagnóstico. Da mesma forma, Dumler e Walker em 2001, afirmaram que, testes

sorológicos eram métodos mais sensíveis para o diagnóstico da erlichiose

granulocítica em humanos, apesar de terem afirmado que até 67% dos pacientes

poderiam apresentar PCR positiva na fase aguda. No entanto, para a erlichiose

monocítica humana esses autores afirmaram que a minoria dos pacientes (em torno

de 29%) desenvolvia anticorpos detectáveis por IFA mesmo assim, concluíram que o

diagnóstico geralmente era confirmado por um aumento de quatro vezes ou mais na

IFA que precisava ser repetida de duas a três semanas. No entanto, com o

conhecimento de que E. canis também pode infectar seres humanos (PEREZ et al.,

1996) maior importância tem sido dada a métodos mais específicos e, isso é

particularmente importante, porque o homem se desloca pelo mundo todo podendo

aumentar a dispersão desse tipo de infecção.

É provável que testes sorológicos não consigam detectar a existência de várias

espécies de Ehrlichia em casos de co-infecção e, por isso, a determinação do DNA

bacteriano é importante, não só pelo tratamento que pode ter especificidade como

também pelo potencial zoonótico (BREITSCHWERDT et al., 1998)

Além da IFA, métodos imunológicos associados a enzimas (ELISA) têm sido

desenvolvidos e considerados úteis no diagnóstico dessas doenças. “Kits” Dot-

ELISA para detecção de IgG para E. canis são disponíveis comercialmente e são

considerados como testes de ponto para o tratamento (“point-of-care tests”)

(HARRUS e WANER, 2011).

Em comparação ao IFA, três diferentes testes ELISA mostraram concordância

qualitativa, ou seja, resultado positivo ou negativo, em 74,6% (50 de 67 amostras).

Dezesseis das 17 amostras em desacordo (com resultados falso negativos), tinham

títulos na IFA menores ou igual a 1: 320. A especificidade de dois deles foi

considerada alta e foi concluído que o dot-ELISA era específico e sensível para

títulos maiores ou iguais a 320. Portanto, foi recomendado repeti-lo duas a três

semanas após o primeiro resultado positivo (HARRUS et al., 2002). Um dos testes

66

ELISA comercial, o SNAP3Dx da IDEXX Laboratories, Westbrook, ME, USA, foi

recomendado para ser usado como teste de triagem anual de relevância clínica mas

não foi considerado adequado para ser interpretado com relevância clínica sozinho e

sim associado aos resultados de plaquetometria e de análise molecular (HEGARTY

et al., 2009). Esses métodos de “point-of-care” como os SNAPs 3Dx/4Dx da IDEXX

Laboratories desenvolvidos para detectar anticorpos para peptídeos específicos da

E. canis e A. phagocytophilum são muito utilizados. Esse teste para E. canis detecta

anticorpos gerados contra algumas cepas de E. chaffeensis e o de A.

phagocytophilum reage com anticorpos gerados contra A. platys. Embora

desenvolvidos para uso em cães, não são espécie específicos. Os testes podem ser

usados para identificar anticorpos para Ehrlichia spp, Anaplasma spp e Borrelia

burgdorferi em outras espécies, como gatos e cavalos (LITTLE, 2010).

Em trabalho, cujo objetivo foi a comparação de dois imunoensaios enzimáticos,

um de base clínica (imunoenzimático IMUNOCOMB ELISA) e outro de campo

(ELISA – DBELIA) com o teste de imunofluorescência direta (IFAT), para o

diagnóstico da ehrlichiose monocítica canina, foram utilizadas 60 amostras de soro

de cães, sendo 52 de infecções naturais e 8 experimentais, de cepa de E. canis

cultivada em células DH82. Um dos ELISA foi positivo em 56 cães (86,7%) e

negativo em 13,3% e o outro detectou 91,7% de positividade enquanto o IFAT

detectou 90%. Os autores concluiram que apesar da correlação positiva entre os três

testes e de não ter havido diferença estatística significativa entre eles, os ELISA

foram mais sensíveis e específicos para o diagnóstico da ehrlichiose monocítica

canina, sendo que o IMUNOCOMB-ELISA seria mais sensível e específico

enquanto o DBELLA indicado por economizar tempo, não requerer equipamento e

pessoal especiais e ter maior prazo de validade, mostrando que na rotina clínica

diária, isso deve ser considerado (OKEWOLE e ADEJINMI, 2009).

Outra técnica sorológica mais específica é o “Western Immunoblot” que é capaz

de caracterizar o agente infeccioso por dar as “impressões digitais” de seus perfis de

proteínas imunogênicas. Normalmente se busca um padrão homogêneo entre

diferentes linhagens de E. canis, embora se suponha existir diversidade antigênica

entre diferentes amostras, em várias regiões do mundo. Essa técnica tem sido usada

para caracterizar e distinguir infecções entre diferentes microrganismos causadores

70

67

de ehrlichioses e anaplasmoses ou ainda neorickettsioses, além de esclarecer

problemas de reações cruzadas (HARRUS e WANER, 2011).

No entanto, estudo conduzido nos EUA em 1998, a partir de avaliação

sequencial de cães naturalmente infectados por várias espécies de Ehrlichia e

Bartonella vinsonii, mostrou que teste sorológico por ensaio de IFA não era capaz de

distinguir, consistentemente, entre a infecção com E. canis e daquela com E.

chaffeensis. Da mesma forma, quando o antígeno E. canis foi utilizado, a análise por

Western Imunoblot de soros dos cães, não resultou no reconhecimento de proteínas

antigênicas que facilitariam diagnósticos diferenciais das espécies infectantes. Pelo

fato de que, naquela época E. ewingii não havia sido cultivada em sistema de cultivo

in vitro, o antígeno deste organismo não estava disponível para testes sorológicos

comparativos. Apesar da co-infecção não ter sido examinada naquele estudo, já era

descrito que a provável co-infecção, com mais de uma espécie de Ehrlichia limitava

ainda mais a utilidade do teste sorológico para a diferenciação das espécies de

Ehrlichia infectantes. Os autores ainda relataram que tinham observado numerosos

exemplos de co-infecção com E. canis, E. chaffeensis, e / ou E. ewingii em um canil

de cães altamente infestados por carrapatos cujos dados não haviam sido

publicados. Como IFA ou Western-immunoblot não pareciam diferenciar facilmente

padrões de soropositividade entre antígenos de E. canis de outras espécies

infectantes, a detecção molecular e especificação do DNA erlichial se faziam

necessárias para determinar se as diferenças previsíveis nos resultados terapêuticos

poderiam estar mais correlacionadas com uma espécie de Ehrlichia infectante (ou

atualmente incluindo Anaplasma). Vários fatores, incluindo a previsão da duração da

infecção, respostas terapêuticas (especialmente aos derivados de tetraciclina) e o

potencial zoonótico, enfatizaram a importância de se determinar quais espécies de

Ehrlichia (ou atualmente incluindo Anaplasma) estavam causando a infecção e se

havia reatividade de anticorpos para antígeno de E. canis (BREITSCHWERDT et al.,

1998).

A fisiopatogenia da doença, reações cruzadas com outras espécies do gênero

Ehrlichia, co-infecções transmitidas por carrapatos e títulos de anticorpos

persistentes nos testes sorológicos após o tratamento, devem ser consideradas

quando se interpreta o resultado de um teste sorológico. Por isso é importante na

71

68

identificação do agente etiológico, o uso de outros métodos, principalmente os

moleculares (WANER et al., 2001).

2.6.3 Isolamento microbiano

O isolamento do agente a partir de cultura de células (NYINDO et al., 1971)

também pode ser realizado para diagnóstico, com o parasito podendo ser isolado do

sangue de cães infectados experimentalmente, a partir de amostras sanguíneas dois

dias após a infecção. Entretanto, o procedimento de cultivo microbiano em células é

pouco prático para uso em laboratórios clínicos, pois o objetivo final é o diagnóstico

da doença e este pode demorar de 14 a 34 dias para ser obtido. Além disso, a

estrutura física para a manutenção da cultura de células, eleva os custos do seu uso

na rotina clínico laboratorial (IQBAL e RIKIHISA 1994a). Assim, este é um

procedimento mais utilizado como uma ferramenta de pesquisa. (NEER et al., 2002;

LITLLE, 2010; HARRUS e WANER, 2011), embora venha sendo utilizado como base

para o desenvolvimento de métodos mais rápidos e simples, principalmente no

diagnóstico da E. canis (TORRES et al. 2002; HARRUS e WANER, 2011).

Macrófagos caninos, derivados de histiocitose maligna, denominada DH82 são

as células mais utilizadas para o crescimento desse microrganismo (HARRUS e

WANER, 2011). Outras linhagens celulares têm sido utilizadas para o

desenvolvimento de culturas celulares para Ehrlichia, como macrófagos peritoneais

caninos (STEPHENSON e OSTERMAN, 1977, apud KEYSARY et al., 2001), células

hibridas humanas com caninas (STEPHENSON e OSTERMAN, 1980, apud

KEYSARY et al., 2001), endoteliais humanas (DAWSON et al., 1993) e uma

linhagem celular contínua de macrófago de rato (KEYSARY et al., 2001).

2.6.4 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)

Em pacientes com ricketsemia o diagnósticio pode ser realizado através da

Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e, o resultado positivo confirma a evidência

da infecção (LITTLE, 2010). Segundo Iqbal e colaboradores (1994) e Iqbal e Rikihisa

(1994b) , a PCR é eficaz na detecção de níveis baixos de parasitemia em tecidos de

cães. A PCR e o sequenciamento são métodos sensíveis para detecção e

caracterização de DNA de E. canis. No entanto, falso positivo pode ocorrer com

baixas temperaturas de anelamento, quando há contaminantes ou quando ocorre

69

amplificação inespecífica. A PCR negativa indica que o DNA não foi detectado, mas

não prova que não esteja presente (HARRUS e WANNER, 2011).

Vários protocolos existem para E. canis e são baseados em diferentes alvos do

genoma, como 16S RNAr, p28, p30, dsb, virB9, mas o 16S RNAr e o p30 são os

mais comumente usados (HARRUS e WANNER, 2011). Para A platys também são

usados gltA (AGUIRRE, et al., 2006), groESL (ABARCA et al., 2007; BEALL et

al.,2008) além do 16S rRNA (AGUIRRE, et al., 2006; ABARCA et al., 2007; BEALL

et al.,2008). Logo, para a realização da PCR, sequências iniciadoras ou primers

devem ser desenhadas para que amplifiquem qualquer espécie do gênero Ehrlichia

cuja porção codificadora da unidade 16S do RNA ribossomal, já tenha sido

sequenciada (NEER et al., 2002), no entanto, a maioria dos estudos mostrou que

primers a partir do 16S rRNA precisam ser capazes de detectar não somente várias

espécies do gênero Ehrlichia (DAWSON et al., 1994) como também da família

Anaplasmataceae (INOKUMA, et al., 2000; UNVER et al., 2003, MARTIN et al.,

2005). Segundo Little (2010), como em qualquer método de diagnóstico, também é

necessária validação externa e, a sensibilidade nem sempre é a mesma observada

em controles clonados em plasmídeos quando comparados a amostras clínicas.

Além disso, amplificações cruzadas inesperadas podem ocorrer, como por exemplo,

com primers baseados na sequencia do 16S RNAr para Ehrlichia sp. e Anaplasma

sp. (família Anaplasmataceae) que nesses casos, também amplifica DNA de

Wolbachia e podem ter resultados positivos em cães microfilarêmicos. Esses não

seriam identificados sem o sequenciamento. No entanto, o autor reforçou que

ensaios de PCR melhoraram muito a capacidade para identificar infecções por

Ehrlichia sp e Anaplasma sp. INOKUMA e colaboradores em 2003 também

afirmaram que o sequenciamento parcial do gene 16S rRNA não pode ser suficiente

para identificar o agente até o nível de espécie, mas que comparado a registros no

GenBank pode auxiliar indentificação de espécie intimamente correlacionada.

2.6.4.1 O estudo do DNA e diversidade genética

O estudo do DNA tem auxiliado não somente o diagnóstico como também o

estudo da diversidade genética das espécies. A análise do gene 16S rRNA de E.

canis e A. platys tem mostrado, em vários estudos, a baixa diversidade de cepas

dessas espécies no mundo todo (UNVER et al., 2001, AGUIRRE et al., 2006;;

70

SIARKOU et al., 2007; VINASCO et al., 2007; PINYOOWONG et al., 2008) ainda

que a caracterização genética de alguns desses estudos defina existência de cepas

diferentes para essas espécies, como no Japão (INOKUMA et al., 2000; INOKUMA

et al., 2001), na América do Sul (UNVER et al., 2001; VINASCO et al., 2007), Grécia

(SIARKOU, et al., 2007),Tailândia (PINYOOWONG et al., 2008), Brasil (DINIZ et al.,

2007; CARDOZO et al.,2007; CARDOZO et al., 2009; OLIVEIRA, et al., 2009a) e

outras regiões. Estudos com outros genes também tem contribuido para mostrar a

variedade dentro dessas espécies, caracterizando quatro novos genotipos para E.

canis (HSIEH, et al., 2010) e variedade genética em cepas diferentes para A. platys

baseados no gene groESL (ABARCA et al., 2007) e no gene gltA (AGUIRRE et al.,

2006). Em 2008, um estudo que objetivava avaliar a diversidade genética e

antigênica das principais proteínas imunorreativas (gp19, gp36, gp140 e gp200) de

algumas cepas de E. canis distribuidas pelo mundo, como dos EUA, Brasil e Israel,

também confirmou pouca variabilidade, mas detectou diferenças genéticas

significativas, embora não tenham sido avaliadas quanto a associação com

diferenças em manifestações clínicas, como severidade ou não da doença (ZHANG

et al., 2008).

Apesar da pouca variabilidade genética relatada, outros estudos são sugeridos

para avaliar a real uniformidade dessas cepas em relação a importância da

influência da diversidade de hospedeiros vertebrados e invertebrados, capazes de

influenciar na biologia dessas bactérias (PINYOOWONG et al., 2008) além de

estudos que mostrem a associação com outros fatores que possam interferir nas

manifestações clínicas da infecção (SIARKOU et al., 2007).

2.6.4.2 Detecção cruzada e análise diferencial na PCR

A análise do gene 16S rRNA de E. canis, A. platys e Wolbachia isolados de

sangues de cães do Japão confirmou a baixa diversidade entre cepas de E. canis e

A. platys de várias regiões geográficas diferentes e essa pesquisa também permitiu

caracterizar pela primeira vez Wolbachia, bactéria endosimbionte de insetos,

aracnídeos, crustáceos e nematódeos, em sangue de cão em que a microfilaremia

não foi confirmada. Pesquisadores sugeriram envolvimento dessa bactéria em

sindromes febris em cães (UNVER et al., 2003). Apesar de Wolbachia não ser tão

conhecido por infectar células de vertebrados, ela pode ser encontrada na corrente

71

sanguínea de vertebrados quando liberadas de vermes filarídeos infestando esses

animais (RIKIHISA, 2003). Wolbachia é importante para a biologia de hospedeiro

filarideo, sendo envolvido na imunopatogênese de infecções de mamíferos por

filarídeos e os efeitos colaterais de terapia adulticida (SIMONCINI et al., 2001 apud

ROSSI et al., 2010). Em estudo para detecção do DNA de Wolbachia em sangues

de cães infectados pelo filarídeo Dirofilaria immitis, a PCR foi desenvolvida a partir

de gene que não o 16S rRNA, a fim de que não houvesse amplificação de outros

membros da família Anaplasmataceae. Com esses “primers” os autores

conseguiram uma sensibilidade de reação para um limite de 80pg de DNA dessa

bactéria. Nesse estudo, em cães com microfilaremia, a menor concentração

observada foi de 150 microfilárias por mililitro de sangue e o DNA de Wolbachia foi

detectado nesses animais com primers não associado ao 16S rRNA (ROSSI et al.,

2010).

A pesquisa do DNA através de PCR usando primers baseados nesse gene,

permite a detecção de várias espécies da família Anaplasmataceae, inclusive

Wolbachia e tem sido usados em pesquisas em diferentes materiais biológicos,

como sangue de animais, humanos e invertebrados (DAWSON, et al., 1994;

INOKUMA et al., 2000; UNVER et al., 2001; HARTELT, et al., 2004, MARTIN et al.,

2005). Em pesquisa para detecção de Anaplasma phagocytophilum (Ehrlichia sp.),

Wolbachia sp., Rickettsia sp. e Babesia sp. em carrapatos, Hartelt e colaboradores

(2004) usaram primers baseados no gene 16S rRNA (ECC e ECB) para detecção de

A. phagocytophilum e depois associaram os positivos a uma técnica com sondas

espécies específicas, verificando que um pouco menos da metade desses positivos

não eram A. phagocytophilum e sim Wolbachia.

Em diagnóstico laboratorial por PCR em cães na Venezuela, Hancock et al.

(2001) usaram primers baseados na sequência de DNA do 16S rRNA bacteriano,

considerados específicos para E. equi (A. phagocytophilum) e encontraram falso

positivo para esta bactéria e, através da realização de clonagem e criação de novos

primers, concluíram tratar-se de infecção por A. platys e ainda, que a semelhança

entre essas espécies poderia interferir no diagnóstico molecular, principalmente pela

concentração do número de organismos na amostra clínica sanguínea. De forma

semelhante, em estudo sobre a coinfecção com três espécies de Ehrlichia em cães

da Tailândia e Venezuela, com ênfase sobre a consideração da estrutura secundária

72

do gene 16S rRNA, os autores identificaram problemas com primers para gerar

sequência parcial desse gene de E. equi (A. phagocytophilum) em amostras com

elevada concentração de DNA de E. platys (A. platys). Afirmaram eles que, se a

concentração de E. platys (A. platys) for baixa ou, se a amostra só tiver E. equi (A.

phagocytophilum), os primers preconizados, baseados no 16S rRNA, detectam esta

bactéria. No entanto, essas conclusões foram publicadas em correções dos autores,

mais de um ano após a publicação original, e os levaram a concluir que a evidência

molecular de E. equi (A. phagocytophilum) em cães nesses países não havia sido

confirmada no estudo, como publicado originalmente (SUKSAWAT, et al., 2001b,

correção dos autores 2002). Da mesma forma, em 2006, estudo da caracterização

molecular de A. platys na Espanha foi realizado com sequenciamento de fragmento

de DNA do gene glt A, além do 16S rRNA, de modo certificar diferença na

amplificação para A. phagocytophilum ( AGUIRRE et al., 2006).

Hechemy et al., (2006), indicaram que a PCR (RT-PCR) foi útil para

diagnosticar rapidamente infecções humanas simples ou em co-infecções através de

multiplex para patógenos dos gêneros Ehrlichia/Anaplasma.

2.6.4.3 Sensibilidade diagnóstica

O resultado positivo da PCR costuma ser obtido a partir do 4º ao 10º dia pós-

infecção (DAI) (IQBAL et al., 1994; NEER et al., 2002) confirmados em experimento

de Gaunt e colaboradores (2010), onde 3 a 5 DAI com A. platys já detectaram DNA

e, no caso de E. canis de 7 a 14 DAI. Também em infecção experimental foi

observado DNA em sangue e baço de cães a partir do 7º DAI além da PCR ter sido

utilizada em estudos de quantificação do DNA extraído de vários tecidos e em

comparação com infecções naturais (BANETH et al., 2009). E, segundo Harrus et

al., (1998a) o DNA ehrlichial pode ser detectado ainda após 34 meses da infecção. E

Iqbal e Rikihisa (1994a) mostraram ser possível reisolamento de E. canis mesmo

após tratamento com doxiciclina.

A pesquisa por PCR com amostras esplênicas é mais sensível para avaliar a

eliminação da bactéria, quando comparada ao sangue ou medula óssea. No soro

pode ser feito quando não se tem o sangue, mas estima-se eficiência menor que

63,1% (HARRUS e WANER, 2011). Em 2009, BANETH e colaboradores sugeriram a

extração de DNA a partir de swab conjuntival como método adicional, pois

73

acompanharam a quantidade de DNA em diferentes intervalos de tempo após

infecção experimental, comparada com alguns animais infectados naturalmente.

Apesar de a conjuntivite ser um sinal clínico comum e do teste ter sido menos

sensível que no sangue e baço, e ainda, o DNA ter sido detectado mais tardiamente

após a infecção, os autores sugerem esse material para obtenção de DNA para PCR

por ser menos invasivo. Destacaram, entretanto, que nos animais infectados

naturalmente a quantidade de DNA no sangue deve ser bem alta para que o teste

seja positivo nas duas conjuntivas.

O “real time PCR” (PCR em tempo real) é mais sensível e menos suscetível a

contaminação e, quando esta ocorre, é mais fácil de ser detectada do que na PCR

convencional, devido ao sistema fechado da reação e quantificação de amplificação

positiva. O desenvolvimento de métodos de detecção simultânea de vários

anaplasmataceos (reação multiplex para E. canis, E. chaffeensis, E. ewingii, e A.

phagocytophilum) pode diminuir a sensibilidade. Além dessas, uma nova técnica de

“real time PCR” de alta resolução (High resolution Melt ou HRM – real time PCR) é

usada para genotipagem e é capaz de detectar polimorfismo em um único

nucleotídeo (HARRUS e WANER, 2011).

Como todos os outros métodos diagnósticos, a PCR também possuí suas

limitações, como um controle de qualidade efetivo e o fato de não existir um padrão

das sequências iniciadoras utilizadas que dificultam a comparação de resultados

entre os laboratórios (KAKOMA et al., 2000; NEER et al., 2002)

No entanto, todas as técnicas de PCR têm várias vantagens sobre a sorologia:

detecção precoce do DNA, antes da soroconversão; maior sensibilidade e detecção

do DNA, ao invés do anticorpo. Isso provavelmente indica infecção ativa e não

apenas exposição ao microrganismo. Essa última característica pode permitir melhor

monitoramento do tratamento pelos clínicos (HARRUS e WANER, 2011).

Também, segundo NEER et al. (2002), o resultado positivo da PCR indica infecção,

ao contrário do mesmo resultado em testes sorológicos, que indica exposição prévia.

Entretanto, segundo os autores, a PCR deve ser utilizada em conjunto com o

método de imunofluorescência indireta para o diagnóstico inicial da doença em

animais não tratados. De acordo com Breitschwerdt et al. (1998), o diagnóstico da

ehrlichiose canina através da detecção do DNA está ganhando aceitação como um

importante adjuvante aos testes sorológicos.

74

Segundo IQBAL et al., 1994, pelo fato dos iniciadores ou primers poderem ser

usados para amplificar diretamente uma porção do DNA alvo, e, comparado com

outras técnicas de diagnóstico, ter se mostrado amplamente vantajoso para o

diagnóstico da infecção causada por E. canis, concluíram que a PCR é um teste

altamente sensível e específico para a detecção de níveis muito baixos de E. canis.

Ademais, os resultados obtidos a partir da PCR de tecidos, inclusive o sangue

(IQBAL e RIKIHISA, 1994a), foram consistentes com os achados em isolados de

culturas celulares, o que comprovou a sensibilidade e especificidade do método. A

PCR requer menos tempo, sendo menos dispendiosa quando comparada com o

método de cultura de células, que além de tudo, pode requerer até 60 dias para a

obtenção de um resultado.

De acordo com McBride e colaboradores (1996), a PCR pode ser uma

alternativa rápida aos outros métodos de diagnóstico existentes. Isto porque os

problemas apresentados nos métodos convencionais, como sensibilidade

inadequada e dificuldade com o diagnóstico diferencial, são superadas pela

tecnologia da PCR. Somado a isso, a extração de ácido nucléico a partir do sangue

total é mais rápida e menos laboriosa do que o isolamento de leucócitos antes da

extração. Ainda segundo esses autores, esse método pode ser mais vantajoso em

atividades de pesquisa e diagnóstico clínico.

2.6.4.4 Análise comparativa entre métodos diagnósticos

Vários trabalhos têm mostrado que existem diferenças na detecção de

ehrlichiose de acordo com a amostra populacional, usando animais suspeitos ou

aleatoriamente selecionados e também pela metodologia usada no diagnostico.

Analisando 75 cães suspeitos em Salvador/BA, a PCR foi mais sensível no

diagnóstico de do que a pesquisa direta em esfregaço. No entanto, anticorpos anti-

Ehrlichia canis foram encontrados em 98,66% (74/75) dos animais. A PCR foi

positiva em 33,3% (25/75) dos cães, enquanto a presença de mórulas foi positiva em

5,33% (4/75) dos suspeitos (MENESES et al., 2008).

Em outro estudo (FARIA et al., 2010), com população de 40 animais suspeitos

de hemoparasitoses, em Jaboticabal/SP, foram utilizados diferentes materiais

biológicos e métodos diagnósticos. Na sorologia a porcentagem foi a mais elevada,

82,5%. Além de sorologia, foram feitas análises diretas em esfregaços de

75

concentrado leucocitário (CL) e em esfregaços de aspirado esplênico (AE) com

agulha fina, e ainda, PCR de DNA extraído de sangue total (ST) e do aspirado

esplênico (AE). Nesse estudo, nas nálises morfológicas diretas, 5,7 % foram

positivas no CL enquanto 48,6% no AE. Na PCR 72,5% positivas no AE e 75% no

ST, diferente do citado por HARRUS e WANER, (2011) que afirmaram haver maior

sensibilidade em amostras esplênicas. Também em Jaboticabal/SP (NAKAGHI et al.,

2008), avaliação feita em 30 animais suspeitos apenas um (3,3%) apresentou

mórula em esfregaço sanguíneo, 21 (70%) soropositivos pelo Dot-ELISA, 19 (63,3%)

soropositivos pelo IFA e 16 (53,3%) positivos na PCR (nested-PCR). Neste trabalho,

os autores discutiram a importância do teste utilizado estar em acordo com a fase

clínica de maior probabilidade de detecção da doença. Afirmaram que a sorologia

seria mais importante nas fases subclínica e crônica e a PCR na fase aguda, sendo

esta a ferramenta essencial para definir a espécie. Em Botucatu/SP (UENO et al.,

2009), a análise em 70 cães suspeitos clínicamente de EMC, cinco (7,1%)

apresentaram mórula em esfregaço sanguíneo, sendo um PCR negativo. A PCR

mostrou que 28 (40%) tinham DNA de Ehrlichia canis. Em Recife/PE (RAMOS et al.,

2009), no nordeste brasileiro, trabalho comparando nested-PCR com diagnóstico

morfológico para detectar E. canis e A. platys em 100 cães, nove apresentaram

mórulas sugestivas de E. canis e 21 sugestivas de A. platys, enquanto a PCR

revelou 57 e 55 positivos, respectivamente para cada bactéria.

Em Belo Horizonte/MG (RISTOW et al., 2009), um laboratório particular utilizou

dois métodos sorológicos para detecção de anticorpos anti-Ehrlichia canis e

encontraram uma correlação positiva elevada entre eles. Os autores concluíram que

os métodos sorológicos ainda são os mais práticos e com melhor relação custo-

benefício para o clínico, enquanto os testes moleculares (PCR) são indicados em

casos de controle de tratamento, porque o animal infectado poderá ser soro positivo

por um período indeterminado após o tratamento. Esse trabalho cita ainda estudos

de Andereg e Passos (1999), que apontam fatores que contribuem para a variação

nos resultados de IFA, como: contaminação de amostras, a experiência do

profissional que executa a técnica, a qualidade dos antígenos e o estágio da

parasitemia. Em relação ao “Western immunoblotting”, esses autores citaram que,

apesar do custo elevado, é uma técnica que mostra sensibilidade semelhante a IFA,

com a vantagem de não estar exposto a influência de quem a realiza, resultando em

76

leitura muita objetiva, além de ser capaz de detectar anticorpos anti-Ehrlichia bem

precocimente. No caso do Dot-Blot-ELISA e outros “kits” comerciais baseados nos

mesmos princípios, além de ter sensibilidade e especificidade semelhante a IFA, tem

a vantagem de ter execução rápida e fácil, observando-se o resultado

imediatamente, pela cor indicada.

2.7 TRATAMENTO E PREVENÇÃO

Doxiciclina é considerado o medicamento de escolha para ehrlichiose e

anaplasmose em cães e também tem sido usado com eficiência em gatos. Para o

tratamento da ehrlichiose é consenso seu uso na dose de 10mg/kg oralmente a cada

24horas, durante 28 dias. Apesar disso, existem casos de infecção persistente após

o tratamento, mostrados através de xenodiagnóstico, PCR em aspirados esplênicos

ou cultura e isolamento. Quando há falha no tratamento ou reincidência da doença,

deve ser feita nova administração de antibióticos juntamente com a avaliação para

verificar a presença de doenças concomitantes. Embora menos comum, o imidocarb

tem sido eficiente contra E. canis e, por ser seu uso intramuscular, tem a vantagem

de permanecer ativo no organismo por mais tempo, porém com a necessidade de

pré-medicação com atropina, para diminuir os efeitos adversos da droga. A rifampina

tem sido usada com eficiência em pessoas para eliminar infecção por A.

phagocytophilum e também em cães com E. canis. Em pacientes que se apresentam

com doença clínica mais grave ou erlichiose crônica, podem levar mais tempo para

responder ao tratamento. Nestes casos, a terapia adjuvante com um pequeno curso

(7 dias ou menos) de prednisona podem ser usado para estimular a melhoria clínica

no início do tratamento, abordando a inflamação diretamente. Essa conduta também

tem utilidade clínica no início do tratamento, quando a confirmação laboratorial da

erlichiose está pendente, e a trombocitopenia imunomediada permanece um

diagnóstico clínico potencial. Outro aspecto importante é o tratamento suporte,

incluindo transfusão, fluidoterapia parenteral e controle de possível quadro de

glomerulonefrite (LITTLE, 2010).

Na Tailândia, um surto de ehrlichiose canina foi controlado com o uso profilático

e terapêutico de tetraciclina e pelo controle de carrapatos (DAVIDSON et al., 1978).

O uso prolongado de doxiciclina, em um modelo experimental com ratos, tem

mostrado ser eficiente na prevenção da transmissão de A. phagocytophilum por

77

picada de carrapatos (HECHEMY et al., 2005). Por isso seu uso também tem sido

indicado como administração profilática para previnir ehrlichiose canina em casos de

surtos. Atenção rigorosa para controle de carrapatos é o único meio disponível de

prevenir a infecção com Ehrlichia sp. ou Anaplasma sp. A aplicação mensal de

acaricidas de uso tópico, incluindo imidacloprida /permetrina e fipronil, deve ser

rotina constante, pois mostraram ser eficiêntes em impedir a infecção com estes

organismos, como evidenciado pela diminuição da soroconversão em cães assim

protegidos, em estudos de transmissão experimental e natural. A rotina deve ser

mais intensa em áreas com pressão populacional maior, pois os diferentes estágios

de desenvolvimento dos carrapatos, além de diferentes espécies desses, são hábeis

em transmitir doenças durante o ano todo. Além disso, animais de companhia

podem viajar, facilitando a transmissão em outros locais. A remoção imediata de

carrapatos, já fixados no animal, com pinças ou dedos enluvados, incluem

recomendações para prevenir a infecção. O uso de acaricidas no ambiente também

é indicado para diminuir a probabilidade de infestação, além de reduzir o acesso dos

animais em locais potencialmente com carrapatos. No entanto, nenhum acaricida é

totalmente eficaz e ocorrem casos de infecção em cães que usam profilaticamente

esses produtos (LITTLE, 2010).

Tal como acontece com animais, a infecção é transmitida às pessoas através

da picada de carrapatos, e não parece que animais aumentem o risco destas

infecções nas pessoas. Os cães teriam, logicamente, maior risco de doenças com

co-infecção transmitidas por carrapatos que os humanos, por causa da maior

probabilidade de serem, simultaneamente, infestados com numerosos carrapatos, e

ainda, de diferentes espécies, tornando os cães potenciais sentinelas para doenças

transmitidas por carrapatos em humanos (KORDICK, et al., 1999).

No entanto, subinoculação de sangue, pode resultar na transmissão de

infecções e, portanto, cuidados devem ser tomados ao manusear sangue ou tecidos

de animais potencialmente infectados, incluindo cães e gatos. As recomendações

para a prevenção da infecção nas pessoas são semelhantes às dos animais de

estimação, com foco no controle do carrapato, e deve incluir esforços para controlar

ectoparasitas nos animais e no ambiente (LITTLE, 2010).

O aparecimento da erlichiose humana na última década e o risco para saúde

pública tem estimulado o interesse no desenvolvimento de uma vacina para a EMH.

78

O uso dessa vacina para prevenção dessa doença pode ser útil principalmente para

militares e profissionais de campo que tem maior risco de contraírem a doença.

Outras erlichioses como a peritonite de ruminantes e a monocítica canina, também

apresentam grande interesse veterinário de desenvolver uma vacina para prevení-

las. Na década de 40, Neitz e Alexander introduziram uma estratégia de infecção e

tratamento em ruminantes, baseada nos casos de animais que sobreviviam à

infecção, desenvolvendo imunidade contra a ehrlichia. O método é incômodo, pois

requer um sistema de entrega refrigerado (em nitrogênio líquido ou gelo seco) que o

torna pouco prático para fazendeiros e médicos. Além disso, alguns animais morrem

devido ao tratamento ou são expostos ao risco de contraírem outras doenças

transmitidas pelo sangue. Também não há normatização e proteção heteróloga,

além de ter custo elevado e ser demorada. Devido a grandes perdas na

agropecuária de alguns países do terceiro mundo, tem-se focado e testado vacinas

para a peritonite de ruminantes, como vacinas vivas, atenuadas ou mortas, de

ácidos nucléicos ou recombinantes. (McBRIDE, 2009). A conservação de

sequências de nucleotídeos entre amostras de E. canis de diferentes regiões

geográficas, tem uma implicação positiva para o desenvolvimento de vacinas

(HECHEMY et al., 2005).

O desenvolvimento de vacinas recombinantes de ácidos nucléicos ou de

subunidade protéica, tem sido restrita ao uso de uma proteína maior ortóloga de

superfície em Ehrlichia spp. (designada MAP 1 em E. ruminantium, p28 em E.

chaffeensis e p28/p30 em E. canis) que é um membro da família multigênica

paráloga não idêntica, de genes de proteínas de membrana externa, em cada

respectiva Ehrlichia spp. Vacinas vivas, atenuadas ou mortas, de ácidos nucléicos

ou recombinantes tem sido desenvolvidas contra Ehrlichia sp. No entanto, para o

desenvolvimento de uma nova geração de vacinas que sejam eficazes e práticas,

tanto para ehrlichioses humanas emergentes, como para as de animais já

conhecidas, são necessários: avaliação do genoma (sequenciamento) de várias

espécies, a caracterização de proteínas imunorreativas e maior entendimento dos

mecanismos patogênicos e imunes nas doenças ehrlichiais (McBRIDE, 2009;

McBRIDE e WALKER, 2010).

79

3. OBJETIVOS

3.1 OBJETIVOS GERAIS

Determinar a frequência de Anaplasmataceae na população canina em quatro

diferentes bairros do município de Maricá, em infecções isoladas e associadas.

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1 - Analisar resultados de frequência por diferentes métodos diagnósticos:

morfológico, moleculares e imunológicos para Ehrlichia sp., Ehrlichia canis e

Anaplasma platys na população canina em quatro bairros diferentes do município de

Maricá.

2- Analisar a frequência e a distribuição de Ehrlichia sp.,Ehrlichia canis e Anaplasma

platys em cães da cidade de Maricá em infecções isoladas e associadas.

3- Comparar padrões hematológicos e bioquímicos dos animais infectados com os

de animais saudáveis, considerando os valores de referência da literatura e definir

alterações mais frequentes.

4- Correlacionar a positividade para Anaplasmataceae em infecções isoladas e

associadas com a presença ou não de trombocitopenia.

80

4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 LOCALIZAÇÃO

Maricá é um município brasileiro, situado no litoral do Estado do Rio de

Janeiro. Localiza-se a 22º55'10" de latitude sul, 42º49'07" de longitude oeste, a 5

metros de altitude. O território municipal estende-se por 362,480 km² e é dividido em

quatro distritos: Maricá (sede), Ponta Negra, Inoã e Itaipuaçu. As figuras a seguir

mostram o mapa do Estado do Rio de Janeiro com suas sub-regiões, destacando o

município de Maricá e os bairros onde foram coletadas as amostras.

Figura 1: Mapas de localização do município de Maricá (seta). Mapa do Estado do Rio de Janeiro/BR; Google acesso em: 05 de abril de 2011. www.macamp.com.br/_CidadesC/_es-rj.htm

http://www.macamp.com.br/_CidadesC/_es-rj.htm

http://www.macamp.com.br/_CidadesC/_es-rj.htm

81

Figura 2: Destaque do mapa do Estado do RJ/BR, situando Maricá com fronteiras de Niterói (N), São Gonçalo, Itaboraí, Tanguá e Saquarema (S). O mapa mostra também a localização aproximada de Bambuí (B), Espraiado (E), Centro de Maricá (C) e São José do Imbassaí (SJ). Fonte: Google imagens acesso em: 02 de fevereiro de 2011, http://www.maricaense.com.br

4.2 ANIMAIS

Foram estudadas, no presente trabalho, 155 amostras, colhidas de cães da

campanha de vacinação, realizada no município de Maricá, do Estado do Rio de

Janeiro/BR, em Setembro de 2007. Desses, 67 animais foram do Bairro de Bambuí,

50 do Espraiado, 24 de São José do Imbassaí e 14 do Centro. Os animais foram

escolhidos por conveniência, não sendo estabelecidos critérios para escolha dos

mesmos como: raça, idade, sexo, condição de higiene, tipo de comportamento ou

moradia. A pesquisa foi autorizada pelo Comitê de Ética em Pesquisa com animais

da UFF (anexo 4). E aprovado sob o número 00164/09.

Foram preenchidas as fichas dos animais e os proprietários foram

esclarecidos sobre o trabalho de pesquisa, assinando um termo de consentimento

autorizando a coleta de material biológico (anexos 2 e 3) e posterior manipulação e

estocagem das amostras de sangue e seus derivados, no laboratório de Patologia

Clínica do Hospital Veterinário Universitário Professor Firmino Mársico Filho, da

Universidade Federal Fluminense – UFF, em Niteró/RJ. O projeto

N S

C SJ

B

E

82

4.3 COLETA E PROCESSAMENTO DAS AMOSTRAS DE SANGUE E SORO

As amostras de sangue venoso periférico foram coletadas com auxilio de

seringas de 5 mL e agulhas 25 x 7mm (BD, São Paulo, Brasil) estéreis, através de

punção da veia cefálica ou da jugular e foram acondicionados em tubos com

anticoagulante EDTA 10% e tubos para bioquímica sérica, sem anticoagulante. Em

seguida foram confeccionados esfregaço de sangue total circulante, para leitura da

leucometria específica do hemograma e outro, de sangue capilar, (ponta-de-orelha)

para pesquisa de hemoparasitas. As amostras de sangue sem anticoagulante foram

mantidas em temperatura ambiente durante alguns minutos para retração do

coágulo. Os tubos de sangue com EDTA e os sem anticoagulante, após retração do

coágulo, foram armazenados em caixa térmica na temperatura de aproximadamente

4 a 8°C, até chegar ao laboratório para serem processadas. Os esfregaços foram

imediatamente identificados após a confecção e colocados em caixas próprias para

serem corados e analisados posteriormente.

No laboratório, alíquotas das amostras de sangue com EDTA foram

transferidas para microtubos de 1,5 mL para serem utilizadas posteriormente em

diagnóstico molecular.

As amostras de sangue sem anticoagulante foram centrifugadas a 2500rpm

por 10minutos (Centribio, São Paulo, Brasil) para recuperação do soro. O soro foi

acondicionado em microtubos de 1,5 mL e mantidos a (-20°C) até sua utilização.

4.3.1 Realização do hemograma

As amostras de sangue total com EDTA foram utilizadas para realizar o

hemograma através do contador automático de células T-890 (Coulter Corp, Hialeah,

Flórida, EUA). Este contador permite a contagem de hemácias, leucócitos e

plaquetas, além de determinar a concentração de hemoglobina e o cálculo dos

Índices Hematimétricos: volume globular médio (VGM), concentração de

hemoglobina globular média (CHGM) e hemoglobina globular média (HGM). Foi

realizada a técnica de microhematócrito para confirmação do volume globular e

determinação da concentração de proteínas plasmáticas totais através de

refratometria.

Os esfregaços foram corados com corante (Merck, Darmstadf, Alemanha)

May Grunwald e Giemsa (MGG) modificado (ROSENFELD, 1947) e, a leucometria

83

específica relativa foi realizada, através da identificação de 100 leucócitos em

esfregaço, analisado em microscópio óptico (Nikon, Tóquio, Japão) com objetivas de

40X, e 100X (aumento de 400 e 1000 vezes) e os devidos cálculos realizados para

obtenção da leucometria específica absoluta.

4.3.2 Pesquisa de hemoparasitas

Todos os esfregaços corados, principalmente todos confeccionados de

sangue capilar, foram observados em aumento de 100 vezes para pesquisa de

microfilárias de Dirofilaria sp. (leitura de toda a lâmina) e 400 vezes para

confirmação da presença do parasita. Todos também foram analisados em objetiva

de imersão (aumento de 1000 vezes) para pesquisa de hemoparasitas como

mórulas de Ehrlichia sp., Anaplasma platys, Babesia sp. e Hepatozoon. Alguns

foram selecionados para fotomicrografia, realizada no Centro de Primatologia, em

Magé/RJ, em microscópio acoplado a um microcomputador, Microscópio NIKON -

Eclipse E200, conjugado com Camera Moticam 2300 - 3,0MegaPixel, USB 2.0 Motic

Images Plus 2.0ML. Seu uso foi gentilmente cedido pelo Médico Veterinário

responsável pelo Centro de primatologia, Dr. Alcides Pissinatti.

4.3.3 Dosagens bioquímicas

As amostras de soro foram utilizadas para a realização de pesquisa

imunológica e dosagens bioquímicas como concentrações de uréia, creatinina,

atividades de alanina aminotrasferase (ALT), aspartato aminotransferase (AST),

fosfatase alcalina (FA), gama-glutamiltransferase (GGT), creatina quinase (CK),

concentração total de proteína e frações (albumina e globulina) com ”kits” de

dosagem da Labtest, Minas Gerais, Brasil. Essas dosagens foram realizadas através

do aparelho Ciba Corning® 550 Express, EUA, no Laboratório Prolab Diagnósticos

(Rio de Janeiro/RJ, Brasil).

4.3.4 Detecção imunológica

A detecção imunológica foi feita utilizando-se o “kit” comercial Canine SNAP®

4Dx® (IDEXX, Westbrook, maine USA) para detecção de anticorpos contra Ehrlichia

canis, Anaplasma phagocytophilum, e que também detecta anticorpos contra

Borrelia burgdorferi e o antígeno de Dirofilaria immitis. A técnica foi realizada de

84

acordo com as especificações do fabricante. O principio do teste baseia-se na

formação de imunocomplexos entre antígeno-anticorpos. A superfície de adsorção

do antígeno ou anticorpo geralmente utilizada é a nitrocelulose. Quando presentes

na amostra de soro os anticorpos ou antígenos específicos, os mesmos são

reconhecidos pelo conjugado e precipitados sobre a superfície de nitrocelulose onde

as ligações específicas permitem o desencadeamento da reação enzima substrato

na presença de um cromógeno precipitante, o que permite a formação de cor e,

consequente, visualização. Em um microtubo a parte foi adicionado três gotas de

amostra de soro e quatro gotas de solução de conjugado. Após homogeneização de

3 a 4 vezes, o conteúdo do tubo da amostra foi colocado no orifício de amostra do

dispositivo “SNAP®”. Ao aparecimento da cor no círculo de ativação o mesmo foi

acionado ficando nivelado com o corpo do dispositivo. O tempo de revelação para

obtenção dos resultados foi de 8 minutos. O resultado fornecido foi de acordo com o

surgimento de cor nos poços de amostra indicando a presença do antígeno da D.

immitis, ou dos anticorpos de E. canis, A. phagocytophilum e B. burgdoferi além do

controle positivo.

4.4 DIAGNÓSTICO MOLECULAR 4.4.1 Extração de DNA

As alíquotas de 1,5mL de sangue total, em microtubos tipo eppendorfs, foram

usadas para a análise molecular no Laboratório de Bactérias Enteropatogênicas e

Microbiologia de Alimentos, no Instituto Biomédico da Universidade Federal

Fluminense, e foram conservadas em freezer (-20ºC) até o momento da extração do

DNA.

As amostras foram utilizadas para extração de DNA utilizando-se o “kit”

comercial da GE Genomic Blood Purifcation Kit (Amersham Biosciences,

Piscataway, EUA), de acordo com as instruções do fabricante.

As amostras de sangue total foram descongeladas e homogeneizadas e

depois, mantidas em cabine de biosegurança classe II tipo A (câmara de fluxo

laminar vertical) VLFS-9 (VECO, Campinas, SP, Brasil) durante o processo de

extração. As amostras de DNA extraído foram armazenadas a -20°C, aguardando

utilização nos ensaios de PCR.

85

Para controle interno da reação, após cada bateria de amostras extraídas foi

realizada extração de ácido nucléico em amostra de água “UltraPureTM

DNase/RNase-Free Distilled Water” (Gibco/Invitrogen, Carlsbad, EUA) com objetivo

de observar eventual contaminação durante a extração do DNA genômico.

4.4.2 Ensaios de PCR para detecção de Anaplasmataceae, Ehrlichia canis e Anaplasma platys 4.4.2.1 Iniciadores (“primers”)

Foram utilizados dois pares de iniciadores ou “primers” para a detecção dos

gêneros de Ehrlichia/Anaplasma. Os pares: ECC (“forward”) (5’ – AGA ACG AAC

GCT GGC GGC AAG C-3’) e ECB (“reverse”) (5’ –CGT ATT ACC GCG GCT GCT

GGC A-3’) (DAWSON et al.,1994; DAWSON et al., 1996) e os pares EHR16SD

“forward” (5' - GGT ACC YAC AGA AGA AGT CC - 3') e EHR16SR “reverse” (5' -

TAG CAC TCA TCG TTT ACA GC - 3') (INOKUMA et al., 2000). Ambos os pares

servem para amplificação de um determinado fragmento em região conservada do

gene 16S do RNA ribossomal das espécies da família Anaplasmataceae (INOKUMA

et al., 2000). O tamanho do fragmento amplificado varia de acordo com a espécie

existente na amostra, podendo variar de 345 a 480 pares de bases.

As amostras positivas, para as reações de amplificações com os iniciadores

citados, foram testadas com sequências iniciadoras específicas para E. canis e A.

platys. Para E. canis foram usados os iniciadores: ECAN5 (“forward”) (5’ –

CAATTATTTATAGCCTCTGGCTATAGGA-3’) (DAWSON et al.,1996; MURPHY et

al., 1998) e HE3 (“reverse”) (5’ –TATAGGTACCGTCATTATCTTCCCTAT-3’)

(ANDERSON et al., 1992b) para um produto de 389 pares de bases do gene 16S

rRNA (Gen Bank M73221 acesso on line http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).

Para A. platys foram usados dois pares de iniciadores. Primeiro os pares:

PLATYS “forward” (5' - GAT TTT TGT CGT AGC TTG CTA TG - 3') combinado com

EHR16SR “reverse” (5' - TAG CAC TCA TCG TTT ACA GC - 3') que amplificam um

fragmento de 678 pb da região 16S do RNA ribossomal. ( BROWN et al. 2001;

MOTOI et al., 2001; MARTIN et al., 2005) (Gen Bank GQ395385.1). As amostras

positivas nessa reação foram testadas com os iniciadores: GroAplatys-35s

(“forward”): 5’_-AGC GTA GTC CGA TTC TCC AGT TTT-3’_ e GroAplatys-550as

(“reverse”): 5’_-TCG CCG TTA GCA GAG ATG GTAG-3’_ (BEALL et al., 2008), para

amplificação de um fragmento de 469 pares de bases do gene groEL. (Gen Bank

http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/265264985?report=genbank&log$=nucltop&blast_rank=1&RID=MRUNN91W01S

86

AY077621).

4.4.2.2 Protocolos de PCR

As reações, em um volume final de 25µL, consistiam de 2,5µL de DNA alvo,

25pmol de cada sequência iniciadora (EHR16SD e EHR16SR ou PLATYS e

EHR16SR), 1,25 U de Taq DNA polimerase, 0,2 mM de cada dNTP (Amersham

Biosciences, Piscataway, EUA) 20mM de Tris-HCl com pH 9, 100 mM KCl e 1,6mM

MgCl2 e o volume de água ultra pura (Mili-Q) a ser acrescentado variava de acordo

com o que faltava para completar o volume final da reação, preparada em câmara

especial para evitar os riscos de contaminação (PCR Chamber, Plas Labs, Lansing,

EUA). Para o protocolo com os iniciadores ECC e ECB também com volume final de

reação de 25µL, consistiam de 5µL de DNA alvo, demais reagentes semelhantes ao

“mix” para EHR 16SR e o volume de água ultra pura (Mili-Q) a ser acrescentado de

acordo com o que faltava para completar o volume de 25µL.

Para cada bateria de reações foi utilizado como controle negativo uma

amostra sem DNA (água) e um controle positivo. Para E. canis o controle positivo foi

gentilmente fornecido pelos médicos veterinários Msc Alexandre Garcia de Sá do

Laboratório Vet análises – Rio de Janeiro/RJ e Msc.Renata Fernandes Ferreira de

sua coleção. O controle de A. platys também foi cedido pela médica veterinária Msc

Renata Fernandes Ferreira. O controle negativo foi usado, também, para verificar

possíveis contaminações durante a manipulação dos reagentes, sendo usado o mix

sem amostra, acrescido do mesmo volume de água mili-Q.

Para os pares de primers ECC e ECB o programa de amplificação consistiu

em um passo inicial para uma desnaturação a 94°C por 3 minutos, seguido de 30

ciclos de desnaturação a 94°C por 60 segundos, anelamento a 65°C por 30

segundos e extensão a 72°C por 30 segundos. Um último passo foi realizado a 72°C

por 5 minutos para uma extensão final.

Para os primers EHR 16S D e EHR 16S R o programa de amplificação

consistiu de desnaturação a 95°C por 2 minutos, seguido de 40 ciclos de

desnaturação a 94°C por 60 segundos, anelamento a 54°C por 30 segundos e

extensão a 72°C por 30 segundos. Uma última etapa foi realizada a 72°C por 5

minutos para extensão final. Para os primers PLATYS e EHR 16S R o programa foi

idêntico a esse.

87

Para os primers GroAplatys-35s e GroAplatys-550as o programa de

amplificação consistiu em um passo inicial para desnaturação a 95°C por 1 minuto,

seguido de 55 ciclos de desnaturação a 94°C por 15 segundos, anelamento a 62°C

por 15 segundos e extensão a 72°C por 15 segundos. Com o último passo a 72°C

por 5 minutos para extensão final.

4.4.2.3 Análise dos produtos da PCR

Foi adicionado aos produtos da PCR 5l de azul de bromofenol a 0,25% +

glicerol a 60% e colocados em gel de agarose a 1% (Amersham Biosciences,

Piscataway, EUA), por aproximadamente 115 V por 1h em fonte EPS-250 (CBS

Scientific Company Inc. Del Mar, EUA) em cuba horizontal especial CBS – MGV 502

T (CBS Scientific Company Inc. Del Mar, EUA). O tampão de corrida utilizado era

composto de solução de Tris a 0,5M - Borato a 0,045M - EDTA a 1mM e pH 8,2

(TBE 1x). A revelação foi realizada através da coloração do gel com solução de

brometo de etídeo 0,01% (Invitrogen, Carlsbad, EUA) por aproximadamente 10

minutos. O gel foi posteriormente visualizado em transluminador ultra-violeta TCX26-

M (Vilber Lourmat, Marne-La-Vallée, França). Para determinação dos produtos

amplificados foi utilizado um marcador de peso molecular (1Kb plus DNA Ladder,

Invitrogen, Carlsbad, EUA).

4.4.2.4 Sequenciamento de DNA dos produtos amplificados obtidos nos ensaios de PCR

As amostras que revelaram resultados positivos aos ensaios de PCR foram

submetidas a novas amplificações com volume final de 100 µL. Os amplificons

obtidos foram purificados através do “kit” PureLinkTM Nucleic Acid Purification Rack

(Invitrogen, São Paulo, Brasil). A quantificação do DNA purificado foi feita com

eletroforese em gel de agarose, por comparação com bandas do Low Mass DNA

Ladder (Invitrogen, São Paulo, Brasil), utilizando-se, para o sequenciamento, uma

quantidade mínima aproximada de 40ng. O sequenciamento foi realizado no Instituto

Biomédico da Universidade Federal Fluminense, usando o protocolo Big Dye

Terminator Cycle Sequencing Standart Version 3.1 com polímero POP7, seguindo as

especificações do fabricante, no sequenciador 3130/3130X/Genetic Analyzer Applied

Biosystems Hitachi USA 850 Lincoln Drive Foster City CA94404USA.

88

As sequências obtidas foram submetidas a alinhamento com aquelas

depositadas no GenBank utilizando-se o programa Blast.

4.4.3 Pesquisa de Babesia sp. nas amostras positivas em protocolos genéricos

para Anaplasmataceae

As amostras que tiveram reação de amplificação nos protocolos de reação

para pesquisa de membros da família Anaplasmataceae foram aliquotadas e

enviadas ao laboratório particular Vet análises em Laranjeiras no município do Rio

de Janeiro/RJ, para que fosse feito PCR para o gênero Babesia sp., usando o

protocolo com os iniciadores “foward” piro A e “reverse” piro B.

4.4.4 Pesquisa de Hepatozoon sp. por PCR e sorologia para Leishmania sp.

Todas as amostras foram testadas por PCR para pesquisa de Hepatozoon sp.

e através de teste sorológico, para pesquisa de anticorpos contra Leishmania sp.

Essas pesquisas foram realizadas pela Médica Veterinária Camila Nunes Fonseca e

representou sua dissertação de mestrado (FONSECA, 2008).

4.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os resultados foram submetidos à análise estatística pelo teste de Kruskal-

Walllis X2, realizados pelo professor Dr. Rodolpho Rodrigues Filho do departamento

de Zootecnia da Faculdade de Veterinária da UFF.

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 ANÁLISES MORFOLÓGICAS DOS ESFREGAÇOS SANGUÍNEOS

Na avaliação morfológica, feita pela pesquisa microscópica direta, 35

amostras dos cães de Maricá foram positivas, com inclusões em diferentes tipos de

glóbulos sanguíneos, como sumarizados nos gráficos um, dois e três e na tabela um.

Gráfico 1: Resultados das pesquisas de mórulas de hemoparasitas em esfregaços sanguíneos de cães do município de Maricá/RJ 2007.

Gráfico 2: Resultados das pesquisas de mórulas de hemoparasitas em esfregaços sanguíneos de cães do município de Maricá/RJ 2007 e os diferentes tipos de glóbulos sanguíneos em que foram observadas.

90

Gráfico 3: Porcentagens dos diferentes tipos de glóbulos sanguíneos em que foram observadas mórulas de hemoparasitas em esfregaços sanguíneos de cães do município de Maricá/RJ 2007.

Tabela 1: Resultados das pesquisas de mórulas de hemoparasitas em esfregaços sanguíneos de cães do município de Maricá/RJ 2007, com os diferentes tipos de glóbulos sanguíneos em que foram observadas.

Legenda: N = Numero de amostras; + = positivas

Pelo tipo de glóbulo sanguíneo onde se encontra a inclusão, a mórula pode

ser associada à possível espécie de Ehrlichia/Anaplasma. Assim, as amostras que

foram observadas inclusões apenas em mononucleados, foram sugestivas de

Ehrlicha canis; as com inclusões em plaquetas, sugestivas de Anaplasma platys; as

com inclusões tanto em segmentados como em mononucleados, foram sugestivas

de Ehrlichia sp. (granulocítica) e de Ehrlicha canis respectivamente, e aquela com

inclusões em mononucleados e plaquetas, sugestivos de E. canis e A. platys,

respectivamente (JAIN, 1993). No entanto Almosny (1998), em estudo com infecção

experimental, sugeriu também a presença de mórulas de E. canis em plaquetas. E

ainda, os estudos de Mylonakis et al., (2003) e Dagnone et al., (2009) mostraram

Células com inclusões

N + % nas +

% total

Mononucleados 29 83 18,7

Plaquetas 3 8,6 1,9

Mononucleados e segmentados

2 5,7 1,3

Mononucleados e plaquetas

1 2,9 0,65

TOTAL 35 100 22,6

91

que essa bactéria pode estar presente em outros tipos globulares. Os resultados dos

hemoparasitas estão sumarizados no gráfico quatro e na tabela dois.

Gráfico 4: Porcentagens dos diferentes tipos de hemoparasitas que foram observados como mórulas em esfregaços sanguíneos de cães do município de Maricá/RJ 2007.

Tabela 2: Resultados das pesquisas de hemoparasitas em esfregaços sanguíneos, de cães do município de Maricá/RJ, em 2007.

Como algumas amostras tiveram inclusões em mais de um glóbulo

sanguíneo, essas porcentagens na tabela dois são diferentes daquelas da tabela

um, porém mostraram melhor a frequência de cada espécie, definida pelo critério da

pesquisa microscópica direta (JAIN, 1993; ALMOSNY, 1998; MYLONAKIS et al.,

2003; DAGNONE et al., 2009).

O achado em esfregaço sanguíneo está relacionado à fase aguda da infecção

(ou recidiva), embora não se possa ter certeza da espécie em questão (RIKIHISA,

1991; NEER, 1998; HARRUS, WANER, 2010). E, esse achado, é de

aproximadamente 4% da população infectada (HARRUS, WANER, 2010). Portanto,

pode ser que pela avaliação morfológica o número de amostras possa ter sido

subestimado. Além disso, em algumas dessas amostras apenas uma célula com

inclusão foi observada, o que pode sugerir baixa bacteremia (HARRUS et al., 1998;

HARRUS et al., 2004).

Espécie sugestiva N0 de amostras % nas + % total

Ehrlicha canis 35 100 22,6

Anaplasma platys 4 11,4 2,6

Ehrlichia sp. granulocítica 2 5,7 1,3

92

Comparado a outros resultados de trabalhos em diferentes regiões no Estado

do Rio de Janeiro, usando análise em esfregaços, as porcentagens encontradas em

Maricá são maiores. Na região do médio Paraíba foram encontrados 4,8% de

infecção por E. canis (O’DWYER et al., 2001), em Campos dos Goytacazes/RJ

13,9%, de Ehrlichia sp. (ALBERNAZ et al., 2007) e na Região dos Lagos, 1,8% para

Ehrlichia sp. e 1% para A. platys (ACCETTA 2008). Isso pode ser justificado, entre

outros fatores, pelo fato de se ter analisado ao menos dois esfregaços de cada

amostra, um de esfregaço do sangue com EDTA para o hemograma e outro, feito

com sangue capilar que aumenta a probabilidade de serem encontradas as mórulas

(OLSEN et al., 1994) ou mesmo, diferenças regionais da frequência desses

parasitas, uma vez que esses estudos também escolheram aleatoriamente a

população estudada.

Porém, a porcentagem para A. platys encontrada em Maricá, foi menor do que

a observada por Santos (2008) de 60,5%, usando a mesma metodologia, justificado,

talvez, pelo tipo de população estudada pelo autor que foram cães não domiciliados,

recolhidos pelo CCZ de Santa Cruz, no município do Rio de Janeiro.

A distribuição dos resultados da avaliação morfológica pelos bairros onde

foram coletadas as amostras e, os respectivos glóbulos sanguíneos onde foram

observadas as mórulas, foram sumarizados na tabela três e nos gráficos cinco, seis

e sete.

Gráfico 5: Resultados das pesquisas de hemoparasitas em esfregaços sanguíneos de cães do município de Maricá/RJ, em 2007, distribuídos pelos bairros pesquisados.

93

Tabela 3: Resultados das pesquisas de hemoparasitas em esfregaços sanguíneos de cães do município de Maricá/RJ, em 2007, distribuídos pelos bairros pesquisados, mostrando as células em que se encontravam as inclusões.

Legenda: Mono. = mononucleados; seg.= segmentados;

Gráfico 6: Resultados das pesquisas de hemoparasitas em esfregaços sanguíneos de cães do município de Maricá/RJ, em 2007, distribuídos pelos bairros pesquisados.

Analisando os resultados morfológicos na tabela 3, observa-se que as

inclusões em mononucleados, sugestivas de E. canis, foram encontradas em todos

os bairros, sugerindo que esta espécie pode circular em toda a região, enquanto as

inclusões intraplaquetárias, sugestivas de A. platys (JAIN, 1993) ou mesmo de E.

canis (ALMOSNY, 1998) foram observadas somente em amostras do Espraiado.

Observa-se também que a frequência variou de 7,1 a 29,2 com média de 20,9%, e

Análise morfológica

Bairro

N0 coletado

Positivos células com inclusões / N0 amostras

Bambuí 67 13 (19,4%) Mononucleados /12

Mono. e Segmentados/1

Espraiado

50

14 (28%) Mononucleados /9

Mono. e Seg. /1

Plaquetas /3

Monon. e Plaquetas /1

São José 24 7 (29,2%) Mononucleados /7

Centro 14 1 (7,1%) Mononucleados /1

Total 155 35 (22,6%)

94

que a maior foi em São José e a menor no Centro. Porém, essas diferenças podem

ser por causa do número de amostras coletadas em cada bairro.

Gráfico 7: Resultados das pesquisas de hemoparasitas em esfregaços sanguíneos de cães d o município de Maricá/RJ, em 2007, distribuídos pelos bairros pesquisados.

5.2 REAÇÕES DE PCR

Na avaliação molecular, feita pelos dois protocolos com pares de iniciadores

genéricos (ECC/ECB e EHR) para detecção de DNA de Anaplasmataceae, 62/155

(40%) amostras dos cães de Maricá, foram positivas, sendo que algumas só em um

dos protocolos, como sumarizados na tabela quatro e nos gráficos oito e nove.

95

Gráfico 8: Resultados PCR negativas e positivas em protocolos genéricos para Anaplasmataceae, avaliados em sangue de cães do município de Maricá/RJ, em 2007

Tabela 4: Resultados de PCR para Anaplasmataceae de amostras sanguíneas de cães do município de Maricá/RJ em 2007.

Protocolo de PCR genérico N0 de amostras positivas

PCR sp negativas

PCR sp positivas

ECC/ECB e EHR 37(23,9%) 26 11

EHR 12 (8,4%) 12 0

ECC/ECB 13 (7,7%) 13 0

TOTAL 62 (40%) 51 (32,9%) 11 (7,1%)

Legenda: ECC/ECB, EHR = iniciadores dos protocolos de PCR genéricos para Anaplasmataceae; PCR sp = PCR de protocolo espécie específico

Poucos estudos têm sido feitos considerando a frequência total de bactérias

da família Anaplasmatacea no Brasil. Comparado a outros resultados de trabalhos

no Estado do Rio de Janeiro, usando análise molecular, as porcentagens

encontradas em Maricá são maiores. Macieira et al., (2005) avaliaram 226 cães da

região metropolitana do Rio de Janeiro através de protocolo de PCR genérico

(ECC/ECB), e detectaram 17,7% de Anaplasmataceae. Ferreira et al., (2008a)

analisaram 101 amostras de cães, também da cidade do Rio de Janeiro, com

protocolo de PCR semelhante para Anaplasmataceae, (EHR), detectando frequência

de 18,8%. Essas diferenças podem ser justificadas pelo tipo de população que em

Maricá foi composta de animais domiciliados em zona rural ou, ainda que urbana,

peri rural, o que pode facilitar o contato com o carrapato vetor, explicando a maior

frequência em Maricá.

96

Gráfico 9: Porcentagens do resultados de PCR em protocolos genéricos para Anaplasmataceae, avaliados em sangue de cães do município de Maricá/RJ, em 2007.

Nessas amostras, quando testadas em protocolos espécie específicos, foi

encontrada uma porcentagem de 32,9% (51/155) de positivas apenas nos protocolos

genéricos e, cinco foram selecionadas para sequenciamento, por causa da presença

de fortes bandas na eletroforese, depois da amplificação do DNA. Após

sequenciamento e comparação com outras sequencias depositadas no GENBANK,

através o programa BLAST, essas amostras mostraram similaridade entre 88% a

100% com Wolbachia sp., também da família Anaplasmataceae. Esses cinco cães

eram microfilarêmicos e, segundo Unver et al., (2003) pesquisando

Anaplasmataceae através de PCR em cães no Japão, foi detectada Wolbachia sp.

através de metodologia semelhante, sendo que não houve evidência de

microfilaremia e os autores discutiram, a possibilidade de que esta bactéria estivesse

associada a quadro fisiopatogênico. Isso também pode explicar a possível presença

de cães da população testada de Maricá, com bactérias dessa família taxonômica,

sem possível microfilaremia ou de outras espécies de Anaplasmataceae. Entre as 51

amostras positivas, apenas em protocolos genérico para Anaplasmataceae, 38 não

eram de cães microfilarêmicos e também foram negativas nas pesquisas de

antígeno de Dirofilaria immitis, diminuindo nessas, a probabilidade de terem

Wolbachia. Sendo que, uma dessas amostras, foi sequenciada indicando

similaridade de 94% com Ehrlichia sp., no programa BLAST.

Esse sequenciamento foi feito a partir do produto amplificado com iniciadores

genéricos que podem amplificar DNA de todos os membros da família

Anaplasmataceae (INOKUMA et al., 2001), o que pode ter contribuído para que o

97

sequenciamento não ficasse suficientemente claro, para definir similaridade

específica, principalmente, se na amostra, existissem mais de uma espécie. Estudos

mostraram que mesmo quando existiam mais de uma bactéria Anaplasmataceae na

amostra clínica, a concentração de DNA que predominava poderia interferir na

positividade, quando utilizados iniciadores baseados no gene 16S rRNA (HANCOCK

et al. 2001; SUKSAWAT, et al., 2001, correção dos autores 2002; HARTELT et al.,

2004). Além disso, não foram testadas, nas amostras positivas nesses protocolos

genéricos, outras espécies além de E. canis e A. platys.

As amostras positivas em apenas um dos protocolos podem ser resultados de

pequenas variações ou interferências no método de cada protocolo ou mesmo

reações inespecíficas, por causa de características intrínsecas dessas amostras,

que poderão ser esclarecidas pelo sequenciamento (LITTLE 2010) já que a

metodologia de PCR usada nesse estudo se assemelhou a de várias publicações

que usaram iniciadores e protocolos idênticos (MACIEIRA et al., 2005; FERREIRA et

al., 2007).

Distribuindo esses resultados positivos para Anaplasmataceae, pelos bairros

onde foram coletadas as amostras, foi confeccionada a Tabela cinco e o gráfico 10.

Gráfico 10: Resultados da frequência de Anaplasmataceae em cães, de quatro bairros do município de Maricá/RJ, em 2007, segundo avaliação de PCR, em protocolos genéricos.

98

Tabela 5: Resultados da frequência de Anaplasmataceae em cães, de quatro bairros do município de Maricá/RJ, em 2007, segundo avaliação de PCR, em protocolos genéricos.

BAIRRO N0 amostras coletadas

N0 amostras PCR positivas (%)

BAMBUÍ 67 30 (44,8%)

ESPRAIADO 50 11 (22%)

SÃO JOSÉ 24 12 (50%)

CENTRO 14 9 (64,3%)

TOTAL 155 62/155 (40%)

A análise da frequência distribuída pelos bairros mostra que esta variou de 22

a 64,3%, tendo 45,3% de média. Por essa análise, o bairro de Espraiado teria a

menor frequência e o Centro a maior, diferente do observado na análise morfológica,

em que o Centro teve a menor frequência. No entanto, essas diferenças podem ser

um reflexo da diferença do número de amostras coletadas em cada bairro.

5.2.1 Reações de PCR espécie específica

Das 37 amostras positivas, nos dois protocolos genéricos, 11 amplificaram em

reações espécie específicas, sumarizadas na tabela seis e nos gráficos 11 e 12.

Entre as amostras positivas em apenas um dos protocolos genéricos, nenhuma foi

positiva para E. canis ou A. platys.

Tabela 6: Resultados de PCR para E. canis e A. platys, em relação às reações de protocolo genérico, de amostras sanguíneas de cães do município de Maricá/RJ em 2007.

Protocolo Genérico PCR sp (+)

E. canis A. platys E. canis e A. platys

N0 de amostras positivas (%)

62 (40)

11/62 (17,7)

5/62 (8,1)

5/62 (8,1)

1/62 (1,6)

Total amostras coletadas/positivas (%)

155/62 (40)

155/11 (7,1)

155/5 (3,2)

155/5 (3,2)

155/1 (0,6)

Legenda: sp (+) = positivas em reações de protocolo espécie específicas

99

Gráfico 11: Resultados da frequência de amostras de sangue de cães do município de Maricá/RJ, em 2007, positivas em PCR usando protocolos específicos e as respectivas espécies.

Embora 40% das amostras estivessem positivas para Anaplasmataceae,

apenas 17,8% dessas amostras foram definidas em nível de espécie, mostrando que

provavelmente outras, não analisadas nesse estudo, pudessem estar presentes

nessa população.

Gráfico 12: Resultados do número de amostras de sangue de cães do município de Maricá/RJ, em 2007, coletadas e positivas em PCR usando protocolos genéricos e específicos e as respectivas espécies.

Poucos estudos, usando detecção molecular, têm sido feitos em áreas

semelhantes, porém, no município do Rio de Janeiro/RJ, Macieira et al., (2005)

evidenciaram frequência para E. canis de 15% e, Ferreira et al., (2008a), de 15,8%

100

para A. platys e, esses trabalhos, foram feitos utilizando metodologia de PCR,

semelhante ao do presente trabalho em Maricá.

Essas diferenças podem estar relacionadas com o tipo de população

selecionada. No caso do estudo de Macieira et al., (2005), foram 226 animais onde

112 desses foram selecionados por serem trombocitopênicos. No estudo de Ferreira

et al., (2008a) a população, de 101 cães, foi selecionada pela presença de inclusões

intraplaquetárias, o que pode ter contribuído para maior frequência do que as

observadas tanto para E. canis quanto para A. platys em Maricá (3,8%), cujos 155

cães foram selecionados aleatoriamente, na população encaminhada para

vacinação anti-rábica. Além disso, diferenças regionais posem ter influenciado, uma

vez que a frequência de Anaplasmataceae foi maior nos cães de Maricá, sugerindo

que outras espécies dessa família taxonômica possam estar presentes.

Tabela 7: Resultados de PCR para E. canis e A. platys de amostras sanguíneas de cães do município de Maricá/RJ em 2007, distribuídas pelos bairros estudados.

BAIRRO N0 amostras testadas

PCR sp (+)(%)

E. canis (%)

A. platys(%)

E. canis e A. platys(%)

BAMBUÍ 67 6 (9) 3 (4,5) 3 (4,5) 0

ESPRAIADO 50 3 (6) 0 2 (4) 1 (2)

CENTRO 14 1 (7,1) 1 (7,1) 0 0

SÃO JOSÉ 24 1 (4,2) 1 (4,2) 0 0

TOTAL 155 11 (7,1) 5 (3,2) 5 (3,2) 1 (0,6)

Legenda: sp (+) = positivas em reações de PCR espécie específicas

A porcentagem de A. platys encontrada em Maricá (3,8%) está abaixo

daquela descrita por Dantas-Torres (2008) para a variação da frequência no Brasil,

de 10,3 a 18,8%, embora o autor se refira a populações hospitalares, diferentes da

analisada no presente estudo. Essa variação da frequência apresentada, inclui o

estudo de Ferreira et al., (2008a) de 15,8% na cidade do Rio de Janeiro e que

avaliaram por PCR, cães com inclusões intraplaquetárias.

A tabela sete e os gráficos 13 e 14 mostram a distribuição desses resultados

pelos bairros, associada ao número de amostras colhidas em cada um. Observa-se

que E. canis foi encontrada em todos os bairros e, talvez, esteja presente em toda a

região, confirmando os achados na pesquisa microscópica direta.

101

A maior frequência de A. platys no bairro do Espraiado também foi mostrada

na análise microscópica direta e confirmada na pesquisa por PCR. Os resultados da

PCR também sugerem menor frequência dessa bactéria nos bairros do Centro e São

José embora isso possa ser um reflexo da diferença do número de amostras

coletadas em cada bairro.

Gráfico 13: Resultados de amostras de sangue de cães do município de Maricá/RJ, em 2007, positivas em PCR usando protocolos genéricos e específicos e as respectivas espécies, comparados ao total de amostras coletadas.

Gráfico 14: Resultados percentuais de amostras de sangue de cães do município de Maricá/RJ, em 2007, positivas em PCR usando protocolos genéricos e específicos e as respectivas espécies.

Como a reação de PCR detecta a presença da bactéria no sangue (LITTLE,

2010; HARRUS E WANER 2010), o resultado positivo está associado mais à fase

aguda da infecção e pode, consequentemente, não detectar outros cães em fase

crônica ou que estavam no início da fase subclínica, quando E. canis se encontra

102

em menor número na circulação sanguínea, e pelo fato da replicação ocorrer no

baço (HARRUS et al., 1998; 2004) ou na medula óssea (SWANGO et al., 1989;

MOREIRA et al., 2005; MYLONAKIS et al., 2010). Além disso, esta bactéria pode se

albergar em outros sistemas que não o sanguíneo (GAUNT et al., 1996; HARRUS et

al., 1998; HARRUS et al., 2004).

Em relação a A. platys que é um microorganismo intracelular obrigatório, que

parasita plaquetas de cães (WOODY e HOSKINS, 1991, HOSKINS, 1991a;

ALMOSNY; MASSARD, 2002) e apresenta parasitemia cíclica, estudo de infecção

experimental mostrou que animais infectados somente com A. platys podem tornar-

se PCR negativos, antes de serem submetidos a tratamento (GAUNT et al., 2010),

mostrando a capacidade do organismo eliminar essa bactéria, mesmo sem o uso de

antimicrobianos. Esses fatores podem contribuir para diminuir o tempo, a partir da

infecção primária, para sua detecção através da PCR, feita no sangue. Assim, o

estudo populacional pode não detectar o número real de cães expostos a A. platys,

quando pesquisados apenas pela pesquisa direta, quer seja pela PCR ou

microscopia.

Comparando as frequências pelos bairros, Bambuí (9%) foi o que teve a

maior em relação às amostras identificadas em espécies, indicando talvez, maior

porcentagem de cães em fase aguda da infecção, quando há maior bacteremia

(HOSKINS, 1991; GAUNT et al., 2010), enquanto em São José (4,2%) foi observado

a menor frequência. No entanto, considerando infecção apenas por E. canis ou A.

platys, o Centro (7,1%) foi o com maior frequência da primeira enquanto o Espraiado

(6%) da segunda. Não foi detectada A. platys nas amostras coletadas de cães de

São José e Centro, como sugerido pelos resultados da pesquisa microscópica direta.

5.2.2 Associação dos resultados da PCR com os das amostras positivas na

análise microscópica direta

Os resultados observados na análise microscópica direta foram comparados

com os da PCR, por serem evidências diretas da bacteremia e, também, porque

outros estudos mostraram que nem sempre as inclusões observadas nos glóbulos

sanguíneos são mórulas de Ehrlichia/Anaplasma, havendo necessidade da

103

realização da PCR para diferenciar as espécies de Anaplasmataceae (HARRUS e

WANER, 2010).

Cada amostra positiva na pesquisa microscópica direta, com o glóbulo

sanguíneo onde foi observada a mórula, foi associada ao seu resultado de PCR em

protocolo genérico e em protocolo espécie específico e foram distribuídas na tabela

8.

Tabela 8: Resultados da PCR de amostras sanguíneas de cães do município de Maricá/RJ, em 2007, associados aos das pesquisas de hemoparasitas em esfregaços sanguíneos, com suas respectivas células com inclusões,.

PCR MORFOLÓGICO

N PROTOCOLOS - + Células com inclusões

genéricos específicos seg/mono mono plqt plqt/mono

- +

37 EHR ECCECB

5c 1 4 1 3 0 0

1cp 0 1 0 1 0 0

5p 5 0 0 0 0 0

26 0 20 6 0 6 0 0

12 EHR 12 0 8 4 0 2 2 0

13 ECCECB 13 0 10 3 0 3 0 0

Total 62 51 11 44 18 1 15 2 0

PCR (-) 93 76 17 1 14 1 1

Total amostras analisadas 155

120 35 2 29 3 1

155 Total positivos Morfológico 35

Legenda: N = número de amostras; ECCECB, EHR = iniciadores dos protocolos de PCR genéricos para Anaplasmataceae; - = negativo; + = positivo; c = E. canis; p = A. platys; seg = neutrófilo segmentado; mono = mononucleado; plqt = plaqueta

Entre as 35 amostras positivas em análise microscópica direta 17 (48,6%) não

foram positivas em nenhuma reação de PCR, podendo representar falso positivo

para Anaplasmataceae, talvez porque não apresentassem concentração de DNA

bacteriano suficiente para amplificação. Entre as 18/35 (51,4%) amostras que

amplificaram em protocolo genérico, 5/18 (27,8%) tiveram a espécie definida nas

reações de PCR espécie específicas, usadas no presente estudo. As outras 13/18

(72,2%) amostras podem ser outras espécies de Anaplasmataceae, não incluídas

nesse trabalho. Entre as cinco amostras positivas para E. canis em PCR, quatro

apresentaram inclusões intraglobulares, sendo que uma delas, com inclusões em

segmentados além de mononucleados, o que pode sugerir que essa espécie

também possa fazer inclusões em granulócitos.

104

Na literatura são descritos vários trabalhos em que o resultado da análise da

pesquisa microscópica direta, foi comparado com os resultados de PCR, e as

diferenças são muito variáveis, de 20% (FERREIRA et al., 2007) a 75% (SOUSA et

al., 2010).

Para A. platys, Ferreira et al., (2007) mostraram que, em comparação com a

análise microscópica direta, de amostras de 101 animais, todos com inclusões

intraplaquetárias, características ou não de mórulas, a PCR amplificou DNA em 16

delas. Nesse estudo, três das 15 consideradas como inclusões características, foram

PCR negativos para A. platys, correspondendo a 20%, consideradas falso positivas.

Porém, um deles foi positivo em PCR genérico (protocolo EHR), indicando a

possibilidade de ser outra espécie de Anaplasmataceae. Ainda nesse estudo, outras

duas amostras foram PCR positivas em protocolo genérico, mostrando que as

inclusões consideradas como não características para A. platys, também podem ser

outra espécie de Anaplasmataceae.

No estudo de MENESES et al., (2008), em que foram analisados 75 cães

suspeitos de ehrlichiose, 4/75 (5,33%) amostras tiveram mórulas observadas em

esfregaço, sendo que dessas quatro amostras, uma não foi PCR positiva para E.

canis, correspondendo a 25% das amostras positivas no esfregaço, como falso

positivos. No total desse estudo, 25/75 (33,3%) amostras tiveram DNA de E. canis

detectados, mostrando que para análise direta, para pesquisar a presença da

bactéria, a PCR foi mais sensível e específica.

Em estudo feito por Ueno et al., (2009) com 70 cães suspeitos de ehrlichiose

canina, cinco apresentaram inclusões características de Ehrlichia sp., sendo apenas

um negativo na PCR que mostrou positividade para E. canis nos outros quatro,

representando 25% de falso positivos pelo diagnóstico morfológico.

Outro estudo, o de Sousa et al., (2010), avaliou sessenta amostras de cães

suspeitos de ehrlichiose e, entre essas, 12 tinham mórulas sugestivas de Ehrlichia

sp., mas apenas três foram PCR positivas (25%) e nove PCR negativas (75%),

representando falso positivos.

Essas diferenças encontradas em todos esses estudos e, também, com os

resultados de Maricá, podem ser justificadas por diferentes fatores, como

características intrínsecas dessas amostras ou pequenas variações ou interferências

no método de cada protocolo e mesmo a experiência de cada patologista ao analisar

as inclusões (LITTLE 2010; HARRUS e WANER, 2010).

105

5.2.3 Associação entre as amostras PCR positivas e parasitas de outros

grupos taxonômicos

Embora não houvesse o objetivo de detectar co-infecções nas amostras

coletadas em Maricá, vários outros hemoparasitas foram observados nos esfregaços

sanguíneos, durante a leitura das lâminas, para pesquisa microscópica direta e para

a realização da leucometria específica relativa. Isso fez com que outras análises

fossem feitas nas mesmas amostras.

Considerando a co-infecção entre E. canis e A. platys, apenas um caso foi

detectado pela PCR, entre todas as amostras testadas, muito abaixo da observada

por Ramos et al., (2009) em Recife/PE que também fizeram avaliação molecular

para diagnóstico desses parasitas e encontraram 32%, mas em população

hospitalar, de cães suspeitos de infecção por hemoparasitas, o que pode justificar

essa diferença. Estudos com diagnóstico molecular para essas espécies não tem

sido desenvolvidos com populações de animais cuja origem não tenha sido o

encaminhamento hospitalar.

Outros casos de co-infecções foram encontrados, com parasitas de diferentes

grupos taxonômicos. Hemoparasitas foram observados durante a pesquisa

microscópica como: Babesia sp., Hepatozoon e microfilárias. Além disso, foi

realizado PCR para Babesia sp. nas amostras cujos protocolos de PCR para

Anaplasmataceae foram positivos e, a metodologia usada para sorologia, também

pode identificar Dirofilaria immitis na população estudada. Todas as amostras foram

testadas em outro trabalho, cujo objetivo foi determinar a frequência de Hepatozoon

sp. através de PCR, e também de Leishmania sp. por sorologia (FONSECA, 2007).

Associando os resultados da PCR, para Anaplasmataceae e

Ehrlichia/Anaplasma, com esses outros hemoparasitas, principalmente os

observados na análise microscópica direta, mas também os da sorologia para D.

immitis, os das amostras positivas em PCR para Babesia sp. e os resultados obtidos

por Fonseca (2007), foram detectados 32/155 (20,6%) casos de co-infecção,

sumarizados nas tabelas 9, 10 e 11 e gráficos 15, 16 e 17.

106

Tabela 9: Amostras sanguíneas de cães do município de Maricá/RJ, em 2007,

distribuídas pelos 4 bairros avaliados, positivas para Anaplasmataceae em

PCR, em que outros parasitas foram detectados, por diferentes métodos.

BAIRRO TOTAL

N

O AMOSTRAS COLETADAS

%

BAMBUÍ 17 67 20,4

ESPRAIADO 4 50 8

S. JOSÉ 5 24 20,8

CENTRO 6 14 42,9

TOTAL 32 155 20,6

Gráfico 15: Amostras sanguíneas de cães do município de Maricá/RJ, em 2007, distribuídas pelos 4 bairros avaliados, positivas para Anaplasmataceae em PCR, em que outros parasitas foram detectados, por diferentes métodos.

Analisando a tabela 9, observa-se que o Centro foi o bairro com maior

frequência de amostras co-infectadas entre cães, com evidência direta de

Anaplasmataceae, enquanto o Espraiado foi o com a menor frequência. Como nesta

avaliação não estão computados os cães que tiveram apenas evidência sorológica

de exposição à Ehrlichia/Anaplasma, esses valores podem ser diferentes, como

discutidos em tópico mais adiante.

107

Tabela 10: Distribuição pelos bairros avaliados, do número de amostras sanguíneas de cães do município de Maricá/RJ, em 2007, positivas para Anaplasmataceae em PCR e os outros parasitas que foram detectados por diferentes métodos.

Gráfico 16: Distribuição pelos bairros avaliados, do número de amostras sanguíneas de cães do município de Maricá/RJ, em 2007, positivas para Anaplasmataceae em PCR e os outros parasitas que foram detectados por diferentes métodos.

Como em cada amostra pode ter aparecido mais de um parasita co-

infectante, como ocorrido em Bambuí, os números totais, por bairros da tabela 9, são

diferentes da tabela 10 e, cada combinação, está descrita na tabela 11 para

amostras positivas em protocolo de PCR específico e tabela 11a para amostras

positivas em PCR com protocolo genérico.

BAIRRO Parasito n0 de amostras

BAMBUÍ

D. immitis 16

Babesia sp. 1

Hepatozoon sp. 3

Leishmania sp. 5

ESPRAIADO Leishmania sp. 4

S. JOSÉ

Hepatozoon sp. 1

Leishmania sp. 4

CENTRO

Hepatozoon sp. 1

Leishmania sp. 4

Babesia sp. 1

108

Tabela 11: Número de amostras sanguíneas de cães do município de Maricá/RJ, em 2007, distribuídas pelos bairros estudados, positivas em PCR específico para Ehrlichia canis/Anaplasma platys, e outros parasitas, que foram detectados por diferentes métodos.

BAIRRO Anaplasmataceae + PARASITO

Número de amostras

Bambuí Hepatozoon sp. e D. immtis (3)

3

D. immtis (5) 5

D. immtis e Leishmania sp.(4)

4

D. immtis , Leishmania sp. e Hepatozoon sp.(1)

1

Espraiado Leishmania sp.(4) 4

S José Hepatozoon sp.(1) 1

Leishmania sp.(3) 3

Centro Babesia sp. (1) 1

Leishmania sp.(4) 4

Hepatozoon sp.(1) 1

Os casos de co-infecção com Ehrlichia/Anaplasma e D. immitis, foram

observados somente no bairro de Bambuí, o que pode estar indicando maior

incidência do vetor desse parasita neste bairro. A ausência de D. immitis nos outros

bairros não significa que não esteja presente, porém pode indicar menor circulação

do vetor ou maior controle de prevenção pelos proprietários nesses bairros, porém,

nas fichas dos animais não há esclarecimento sobre esse procedimento.

Da mesma forma que discutido anteriormente, como nesta avaliação não

estão computados os cães que tiveram apenas evidência sorológica de exposição à

Tipo de protocolo PCR

Anaplasmataceae e Parasito co-infectante (n0 de amostras)

Bairro

Específico

A. platys + D. immtis (1) Bambuí

E. canis + Hepatozoon sp. e D. immtis (1)

E. canis + Babesia sp.(1)

E. canis + D. immtis (1)

E. canis + Leishmania sp.(1) São José

Tabela 11a: Número de amostras sanguíneas de cães do município de Maricá/RJ, em 2007, distribuídas pelos bairros estudados, positivas em PCR para Anaplasmataceae, e outros parasitas, que foram detectados por diferentes métodos.

109

Ehrlichia/Anaplasma, os outros casos de co-infecção mostrados nas tabelas 10 e 11,

podem não refletir a circulação desses parasitas co-infectantes nos bairros

avaliados, como discutido mais adiante. No entanto, para os cães que tiveram

evidência direta dessas bactérias no sangue, a associação com Leishmania sp. foi a

observada em todos os bairros. A associação de E. canis com Leishmania sp. vista

em Maricá, pode reforçar o estudo de Dantas-Torres (2011) em que descreve a

transmissão desses dois parasitas pelo mesmo vetor. Outros estudos mostram que a

co-infecção entre esses parasitas tem ocorrido no Brasil. Em 2008 Sousa e Almeida

descreveram em Cuiabá/MT, cinco casos de cães positivos em teste sorológico para

Leishmania sp. possivelmente co-infectados com Ehrlichia sp., identificadas pela

presença de mórulas intraleucocitárias. Em Teresina/PI, Pires et al.,(2008)

descreveram um caso de co-infecção entre esses parasitas, observados em

aspirados de medula óssea.

Esse tipo de associação foi a única que ocorreu no bairro do Espraiado, onde

não foram encontrados cães com Ehrlichia/Anaplasma associados a Babesia sp.,

Hepatozoon sp. e D. immitis. Embora, como será descrito em tópico mais adiante,

com exceção de D. immitis, essas associações foram observadas nos cães com

evidência apenas sorológica de Ehrlichia/ Anaplasma.

Em São José não foi encontrada associação de amostra positiva em PCR

com Babesia sp. No entanto, aqui também não foram consideradas ainda, as

amostras com evidência somente sorológica de E. canis, para verificar todas

associações com esses co-infectantes, observados no presente estudo, como

mostrado em tópico mais adiante. Por isso esses resultados podem não

corresponder à indicação de que a co-infecção entre esses parasitos seja muito

provável (KORDICK et al., 1999; SUKSAWAT et al., 2001a; INOKUMA et al., 2003).

Avaliando as amostras separadamente, pelos quadros de co-infecção,

descritos na tabela 11, observa-se que E. canis se associou a todos os tipos de

parasitos co-infectantes detectados nesse estudo, confirmando o descrito na

literatura de que é comum a associação de co-infecções em doenças transmitidas

por artrópodes (DINIZ, et al., 2007; MOREIRA et al., 2007; ACCETTA, 2008;

DANTAS- TORRES, 2008; SANTOS 2008; SANTOS et al., 2009).

110

Gráfico 17: Número de amostras sanguíneas de cães do município de Maricá/RJ, em 2007, positivas em PCR para Ehrlichia/Anaplasma, e outros parasitas, que foram detectados por diferentes métodos, nos bairros onde foram encontradas.

Nos cães de Bambuí observou-se que D. immitis esteve associado com todos

os outros tipos de parasitas encontrados no estudo, sendo, portanto, o bairro com

maior variedade de parasitas co-infectantes, sugerindo que esses animais estejam

expostos, simultaneamente, a grande variedade de vetores de diferentes grupos

taxonômicos, proliferando na região. Isso pode ser decorrente de falta de atitudes

que levem ao controle desses vetores e de prevenção da transmissão.

Todos os outros parasitas, encontrados nos quatro bairros avaliados,

mostram a livre circulação dos vetores e podem indicar que possivelmente sejam

encontrados em toda região de Maricá. A maior freqüência da associação de

Ehrlichia/Anaplasma ou Anaplasmataceae com Leishmania sp. pode ser vista como

uma consequência da possível transmissão, deste último, também por carrapatos

(DANTAS-TORRES 2011).

5.3 REAÇÕES SOROLÓGICAS POR MÉTODO DE ELISA

Das 155 amostras coletadas, 7 não foram testadas por causa da qualidade do

soro, 2 de Bambuí, 2 do Espraiado, 2 de São José e 1 do Centro. Entre as 148 que

foram testadas os resultados estão sumarizados nas tabelas 12 e 13 e nos gráficos

18, 18a e 19. Entre todas as amostras analisadas 89/148 (60,1%) foram positivas

para Anaplasmataceae e, mais da metade dessas amostras (71/89, 80%), tiveram

reação sorológica para E. canis.

111

Essas amostras representam cães que foram expostos às bactérias e

desenvolveram resposta imune humoral e podem ou não ter desenvolvido doença

(GAUNT et al, 1996). Para um estudo de frequência na população isso mostra que a

pesquisa de anticorpos é capaz de detectar maior parte de indivíduos positivos por

se tratar de um teste capaz de selecionar todos aqueles que tiveram exposição à

bactéria (RISTIC et al., 1972), podendo ou não ter desenvolvido a doença ou terem

sido curados, como também, os indivíduos que estão simultaneamente com a

bactéria e fazendo resposta humoral (ALMOSNY e MASSARD, 2002). Apesar da

alta sensibilidade do teste sorológico, a reação encontrada, não distingue uma

infecção presente da exposição prévia ao agente, portanto, superestima o número

de cães doentes (WEN et al., 1997; WANER et al., 1995).

Tabela 12: Resultados com sorologia positiva para E. canis e A. phagocytophilum e negativas, de amostras de cães do município de Maricá/RJ em 2007.

Positivas - NT

Espécie avaliada

E. canis A. phagocytophilum

E. canis e A. phagocytophilum

59 (39,9)

7 (4,7)

N (%) 48(32,4) 18 (12,2) 23 (15,5)

Total (%) 71 (48) 41 (27,7)

Legenda: N = número de amostras; - = negativas; NT = não testadas.

Gráfico 18: Resultados de amostras com sorologia positiva para E. canis e/ou A. phagocytophilum de cães do município de Maricá/RJ em 2007 comparados ao número de amostras testadas.

112

Gráfico 18a: Resultados de amostras com sorologia positiva para E. canis e A. phagocytophilum de cães do município de Maricá/RJ em 2007.

5.3.1 Reações sorológicas de E. canis

A tabela 13 mostra a distribuição das amostras soropositivas para E. canis

pelos bairros onde foram coletadas. Observa-se nessa tabela que no Centro foi

encontrada maior frequência, semelhantemente às reações de PCR. Enquanto na

avaliação microscópica direta este bairro teve a menor frequência. Na sorologia as

frequências variaram de 61,5 a 40% com 52% de média, embora isso possa ser

apenas resultante da diferença do número de amostras coletadas.

Tabela 13: Resultados com sorologia positiva para E. canis de amostras de cães do município de Maricá/RJ em 2007, distribuídas pelos bairros.

N0 (%) AMOSTRAS COM SOROLOGIA POSITIVA NOS BAIRROS

BAIRRO N0 amostras testadas E. canis

BAMBUÍ 65 26 (40)

ESPRAIADO 48 25 (52,1)

CENTRO 13 8 (61,5)

SÃO JOSÉ 22 12 (54,5)

TOTAL (%) 148 71 (48)

113

Os estudos de Labarthe et al., (2003) e Pimentel Jr (2007) feitos no estado

do Rio de Janeiro e que se basearam em detecção sorológica de E. canis, também

usando teste ELISA da Idexx®, obtiveram frequências de 29,6 e 47,4%

respectivamente. Comparadas a frequência encontrada em Maricá de 48%,esta foi

maior que a de Labarthe et al., (2003) e muito idêntica a de Pimentel Jr (2007).

Nesses dois estudos também foram usadas populações diferentes, no de Labarthe

et al., (2003) foi uma população selecionada de forma semelhante à de Maricá, entre

animais de campanha de vacinação, enquanto Pimentel Jr selecionou amostras

encaminhadas a laboratório clínico particular e, portanto, de origem hospitalar, que

no entanto, teve um valor bem semelhante ao encontrado, sugerindo que em Maricá

tenha maior circulação dessa bactéria. Santos (2008) também avaliou

sorologicamente uma população de cães não domiciliados, recolhidos pelo CCZ de

Santa Cruz na cidade do Rio de Janeiro, encontrando 88,6% de positivos,

mostrando que o tipo de população pode influenciar na frequência do parasita. E,

considerando o estudo de Labarthe et al., (2003), com população semelhante no

estado do Rio de Janeiro, verifica-se que Maricá tem uma frequência maior de E.

canis talvez por um aumento na disseminação dessa bactéria nesse estado, nesse

intervalo de tempo. No entanto, para essa hipótese ser confirmada, estudo mais

amplo no estado deve ser realizado. Em Maricá essa frequência também pode ser

mais elevada pela maior proliferação de vetores, embora isso não tenha sido

avaliado.

114

Gráfico 19: Resultados de amostras de cães do município de Maricá/RJ em 2007, com sorologia positiva para A. phagocytophylum e E. canis, distribuídas pelos bairros estudados.

5.3.2 Avaliação sorológica de A. phagocytophilum

A tabela 14 e o gráfico 19 mostram a distribuição das amostras soropositivas

para A. phagocytophilum pelos bairros onde foram coletadas. Observa-se nessa

tabela que no Centro foi encontrada menor frequência, que variou de 23,1 a 31,8

com 27,5% de média e, a maior, em São José, embora isso possa ser apenas

resultante da diferença do número de amostras coletadas.

Tabela 14: Resultados de amostras de cães do município de Maricá/RJ em 2007, com sorologia positiva para A. phagocytophylum, distribuídas pelos bairros.

N0 (%) AMOSTRAS COM SOROLOGIA POSITIVA NOS BAIRROS

BAIRRO N0 amostras testadas A. phagocytophilum

BAMBUÍ 65 17 (26,1)

ESPRAIADO 48 14 (29,2)

CENTRO 13 3 (23,1)

SÃO JOSÉ 22 7 (31,8)

TOTAL (%) 148 41 (27,7)

Embora o fabricante do “kit” sorológico Canine SNAP® 4Dx® (IDEXX,

Westbrook, Maine USA) que detecta anticorpos contra A. phagocytophilum,

descreva a possibilidade de reação cruzada com anticorpos para A. platys, não se

115

considerou as amostras com reações positivas, para cálculo da freqüência de A.

platys, na população de cães de Maricá. Ferreira et al., (2008b) avaliaram amostras

com PCR positivo para A. platys com esse mesmo “kit” sorológico e não detectou

nenhuma reação. No entanto esses animais poderiam estar em fase aguda do

contato com a bactéria e ainda não terem anticorpos e, nenhum teste para detecção

de anticorpos específicos para A. platys, foi utilizado naquele estudo.

Outra observação feita foi que no Centro não houve detecção, pela PCR, de

cães com A. platys. Porém houve reação sorológica para alguns indivíduos desse

bairro, para A. phagocytophilum, o que não descarta a possibilidade de serem

reações cruzadas entre essas bactérias. E, uma vez que são potencialmente

transmitidos pelo mesmo carrapato transmissor da E. canis (KORDICK et al., 1999;

INOKUMA et al., 2000, COHN, 2003) e esta foi detectada em todos bairros

estudados, é provável que A. platys também esteja igualmente disseminada.

Em 2011, foi descrito pela primeira vez a evidência molecular a A.

phagocytophilum no Brasil, no município de Seropédica, estado do Rio de Janeiro

(SANTOS et al., 2011), o que pode indicar a possibilidade de que essa bactéria

esteja presente também no município de Maricá. As amostras coletadas nesse

município não foram testadas para essa espécie, embora entre as seis amostras

positivas em PCR para A. platys, quatro (66,7%) tenham apresentado reação

sorológica para A. phagocytophilum.

5.3.3 Associação dos resultados das amostras positivas na análise

microscópica direta com os resultados da sorologia

As amostras positivas na análise morfológica foram comparadas com seus

respectivos resultados de sorologia. Entre as 35 positivas com inclusões globulares,

25 tiveram resultado sorológico positivo para E. canis ou A. phagocytophilum ou para

ambas, como descrito na tabela 15 e no gráfico 20.

116

Tabela 15: Resultados de amostras sanguíneas de cães do município de Maricá/RJ, em 2007, positivos na pesquisas de hemoparasitas em esfregaços sanguíneos, com suas respectivas células com inclusões associados aos da sorologia.

N0

Células com inclusões

sorologia

espécies -

E A E/A

29 mononucleados 10 3 7 9

2 Mononucleados/Segmentados 0 1 0 1

1 Mononucleados/plaquetas 0 1 0 0

3 plaquetas 2 0 1 0

Total 35 12 5 8 10

Legenda: N0 = Amostras positivas na análise morfológica; E = E. canis; A = A. phagocytophilum; E/A = E. canis e A. phagocytophilum; - = negativo

Apenas o estudo de Meneses et al., (2008) associou a sorologia com

diagnóstico morfológico e a PCR, no entanto, não esclareceu as células em que

foram observadas as inclusões e se as amostras positivas no esfregaço foram ou

não soropositivas. Porém, como dos 75 cães estudados por esses autores, 74

(98,7%) foram soropositivos, pelo menos três entre os quatro positivos pelo achado

em esfregaços, foram positivos na sorologia. Desses quatro, três também foram

PCR positivos, embora os autores não esclareçam se eram os mesmos três animais.

117

Gráfico 20: Resultados de amostras sanguíneas de cães do município de Maricá/RJ, em 2007, positivos na pesquisas de hemoparasitas em esfregaços sanguíneos, com suas respectivas células com inclusões associados aos da sorologia.

5.3.4 Associação dos resultados da PCR com os da sorologia

Entre as 62 amostras PCR positivas, em protocolo genérico para

Anaplasmataceae, 42 tiveram reações sorológicas positivas, e, das 93 PCR

negativas 47 foram positivas na sorologia, descritas na tabela 16 e no gráfico 21. E,

das 59 negativas em reações sorológicas, 19 foram PCR positivas, sendo que duas

destas em protocolo espécie específico, mostrados na tabela 17.

Entre as seis amostras PCR positivas para E. canis, duas (33,3%) mostraram

presença de anticorpos, indicando infecção com resposta humoral, enquanto as

outras quatro (66,7%), sem reação sorológica, indicaram infecção aguda, onde ainda

podem não ter anticorpos (ALMOSNY, 1998).

Naquelas em que a PCR foi positiva apenas em protocolos genéricos, 33/51

(64,7%) tiveram sorologia positiva, sendo 19/33 (57,6%) só para E. canis, 4/33

(12,1%) só para A. phagocytophilum e 10/33 (30,3%) para as duas bactérias.

118

Tabela 16: Resultados da PCR, de amostras sanguíneas de cães do município de Maricá/RJ, em 2007, associados aos da sorologia.

PCR SOROLÓGICO

N PROTOCOLOS espécies -

Genéricos específicos E A E/A

- +

37 EHR ECCECB

5c 1 0 2 2

1cp 0 1 0 0

5p 2 3 0 0

26 0 6 3 6 11

12 EHR 12* 0 5 0 2 4

13 ECCECB 13 0 8 1 2 2

51* 11 22 8 12 19

TOTAL 62* 42

PCR (-) 93** 26 10 11 40

TOTAL** 47

Total amostras analisadas 48 18 23 59

TOTAL 155 TOTAL 148 Legenda: N = número de amostras; EHR, ECCECB = iniciadores dos protocolos de PCR genéricos para Anaplasmataceae; - = negativo; + = positivo; * = uma amostra sem sorologia; ** = seis amostras sem sorologia; c = E. canis; p = A. platys; E = E. canis; A = A. phagocytophilum

As 29/51 (56,9%) amostras com anticorpos para E. canis tem DNA bacteriano

de Anaplasmataceae, embora não tenham amplificado em reações específicas para

essa bactéria, o que significa que esses cães tiveram contato prévio com essa

espécie, mas ainda têm DNA de outro membro da família taxonômica (MACIEIRA et

al., 2005). No entanto, embora 20/51 (39,2%) amostras tenham anticorpos contra A.

phagocytophilum, não se pode definir que esses animais tenham sido infectados por

essa espécie, uma vez que não foram testadas por PCR específico para esta e

também, o fabricante do “kit” sorológico afirmar que possa ocorrer reação cruzada

com anticorpos para A. platys.

119

Gráfico 21: Resultados da PCR, de amostras sanguíneas de cães do município de Maricá/RJ, em 2007, associados aos da sorologia.

Analisando as amostras que foram sorologicamente negativas, verifica-se que

duas dessas foram PCR positivas para E. canis, evidenciando que esses animais

ainda não tem resposta humoral, uma vez que a concentração de DNA pode ser

inversamente proporcional à de anticorpos (BANETH et al., 2009), ou por estarem

em fase aguda (ALMOSNY, 1998) ou por não serem imunocompetentes (ANDEREG

e PASSOS, 1999). As outras 17 amostras soronegativas que foram PCR positivas

apenas em protocolos genéricos, não foram testadas para pesquisa de anticorpos

contra outras espécies de Anaplasmataceae. No entanto indicam que tem DNA

ehrlichial, uma vez que amplificaram DNA com iniciadores baseados no gene

16SrRNA dessa família taxonômica (MACIEIRA et al., 2005).

No estudo de MENESES et al., (2008), foram feitas análises dos títulos de

anticorpos nos cães positivos na PCR e não houve relação entre aqueles com títulos

elevados e a PCR, uma vez que os títulos mais baixos foram os mais frequentes.

Segundo Harrus et al., (1998; 2004), isso pode ser explicado pelo número de cães

na fase aguda que ainda não produziram altos títulos de anticorpos específicos ou

que estavam no início da fase subclínica, quando E. canis se encontra em menor

número na circulação sanguínea, e pelo fato de o baço ser o local de replicação.

120

Tabela 17: Resultados com sorologia negativa em relação aos protocolos de PCR para gêneros e espécies estudadas da família Anaplasmataceae, de amostras de cães do município de Maricá/RJ em 2007.

AMOSTRAS COM SOROLOGIA NEGATIVA

TOTAL

Tipo de PCR

ECCECB

EHR

EHR ECCECB

Espécie

PCR(+) 19 2 4 13 2 (E. canis)

PCR (-) 40 0 0 0 0

TOTAL 59 2 4 13 2

Amostras não testadas 7 - - - -

TOTAL 66 - - - -

5.3.5 Associação dos resultados da PCR com os morfológicos e os da sorologia

As tabelas 18 e 18a mostram as relações entre as amostras analisadas na

PCR com os seus resultados na pesquisa morfológica e no teste sorológico. As

diferenças observadas se referem principalmente a apresentação da fisiopatogenia

da infecção ehrlichial, onde o achado morfológico e a PCR foram evidências diretas

da bactéria no sangue, enquanto o teste sorológico mostrou a resposta imune à

presença desta no organismo (LITTLE, 2010; HARRUS e WANNER, 2010) que

ainda poderia, ou não, albergar o microrganismo (GAUNT et al., 1996; HARRUS et

al., 1998; HARRUS et al., 2004).

Na tabela 18 são detalhados os comportamentos das amostras PCR positivas

e negativas com relação aos resultados da pesquisa morfológica e sorológica. Entre

as 62 positivas 18 também o foram na pesquisa morfológica e 42 na pesquisa

sorológica.

121

Tabela 18: Resultados da PCR, de amostras sanguíneas de cães do município de Maricá/RJ, em 2007, associados aos morfológicos, com as respectivas células com inclusões, e os da sorologia.

PCR MORFOLÓGICO SOROLÓGICO

N PROTOCOLOS - + Células com inclusões espécies -

Genéricos específicos seg/mono mono plaqt Mono/plaqt E

A E/A

- +

37 EHR ECCECB

5c 1 4 1 3 0 0 1 0 2 2

1cp 0 1 0 1 0 0 0 1 0 0

5p 5 0 0 0 0 0 2 3 0 0

26 0 20 6 0 6 0 0 6 3 6 11

12 EHR 12*

0 8 4 0 2 2 0 5 0 2 4

13 ECCECB 13 0 10 3 0 3 0 0 8 1 2 2

51* 11 44 18 1 15 2 0 22 8 12 19

PCR Negativos 93** 76 17 1 14 1 1 26 10 11 40

Total 120 35 2 29 3 1 48 18 23 59

Total amostras analisadas 155 155 35 148

Legenda: N = número de amostras; EHR, ECCECB = iniciadores dos protocolos de PCR genéricos para Anaplasmataceae; - = negativo; + = positivo; * = uma amostra sem sorologia; ** = seis amostras sem sorologia; c = E. canis; p = A. platys;seg = neutrófilo segmentado; mono = mononucleado; plqt = plaqueta; E = E. canis; A = A. phagocytophilum;

Na tabela 18a são detalhados os comportamentos das amostras positivas em

pesquisa morfológica, com as respectivas células em que foram achadas as

mórulas, com relação aos resultados da PCR e dos testes sorológicos. As 35

amostras, positivas com mórulas, tiveram 18 positivas em PCR e 25 na sorologia,

sendo que apenas três foram simultaneamente negativas em PCR e sorologia.

Tabela 18a: Resultados da pesquisa morfológica, com as respectivas células com inclusões, de amostras sanguíneas de cães do município de Maricá/RJ, em 2007, associados aos da PCR e aos da sorologia.

N0

Morfologia

PCR sorologia

PROTOCOLOS espécies -

Células com inclusões genéricos específicos E A E/A

- + - +

29 mononucleados 14 15 11 4 10 3 7 9

2 Mononucleados/Segmentados 1 1 0 1 0 1 0 1

1 Mononucleados/plaquetas 1 0 0 0 0 1 0 0

3 Plaquetas 1 2 2 0 2 0 1 0

Total 35 - 17 18 12 5 8 10

Resultado morfológico positivo

Total PCR-/Soro+ 14 8 3 3 0

Total PCR-/Soro- 3 3

E = E. canis; A = A. phagocytophilum;

122

5.3.6 Associação entre as amostras com sorologias positivas e parasitas de

outros grupos taxonômicos

Associando os resultados positivos dos testes sorológicos, tanto para E. canis

como para A. phagocytophylum, com os outros parasitas detectados durante esse

estudo, ou seja: Hepatozoon sp., Babesia sp., D. immitis e Leishmania sp.,

observou-se que a porcentagem total de co-infecções, de (29/148) 19,6%, foi menor

do que aquela observada entre as amostras positivas na PCR para

Anaplasmataceae e esses outros parasitas, de (32/155) 20,6%, como mostrado na

tabela 19 e no gráfico 22. Não há uma justificativa evidente para essa diferença. O

número de animais com resposta sorológica para Anaplasmatacea (E. canis e A.

phagocytophilum) foi maior (89) do que o total de animais positivos na PCR (62),

porém, o número de casos combinados com outros parasitas foi maior naqueles com

evidência da bacteremia do que naqueles em que havia somente a resposta imune

humoral evidente. Talvez essa diferença fisiopatogênica estivesse envolvida na

explicação para essa diferença. Uma vez que a transmissão pelo mesmo carrapato

pode ocorrer com alguns desses parasitas, como Babesia sp., Hepatozoon sp.

(UNVER et al., 2009) e Leishmania sp. (DANTAS-TORRES, 2010), o estado de

bacteremia evidente e algum(uns) dos co-infectante(s), pode ter sido detectada,

ainda que já existisse resposta sorológica, como detalhado na tabela 22, onde foi

separada a quantidade de amostras com positividade em ambas condições. E, com

o desenvolvimento de resposta imune e provável eliminação da bacteremia

(HARRUS et al., 2004; GAUNT et al., 2010) pode ser sugerido que talvez o

organismo também tenha eliminado o(s) co-infectante(s) do sangue.

Observando a distribuição nos bairros, diferentemente da relação com as

amostras positivas na PCR, o Centro foi o que teve menor porcentagem de co-

infecção e o Espraiado o que teve maior.

123

Tabela 19: Amostras de cães do município de Maricá/RJ, em 2007, com

sorologia positiva para Anaplasmataceae (E. canis e/ou A. phagocytophilum)

com parasitos co-infectantes, e os bairros onde foram coletadas.

Um achado comum às duas relações de co-infecções, foi que tanto nas

amostras positivas na PCR como nas com sorologia positiva, a co-infecção com

Leishmania sp. foi a mais frequente, como mostrado no gráfico 24.

Gráfico 22: Amostras de cães com sorologia positiva para Anaplasmataceae (E. canis e/ou A. phagocytophilum) e os parasitos co-infectantes, de amostras de cães do município de Maricá/RJ em 2007, e os bairros onde foram coletadas.

Sorologia positiva (PCR -) com co-infecção

BAIRRO NO AMOSTRAS POSITIVAS

N


%

BAMBUÍ 10 65 15,4

ESPRAIADO 13 48 27

S. JOSÉ 5 22 22,7

CENTRO 1 13 7,7

TOTAL 29 148 19,6

124

A tabela 20 mostra os diferentes parasitas co-infectantes e o número de

amostras por bairro em que esses parasitas foram encontrado. Semelhantemente às

amostras co-infectadas positivas na PCR, D. immitis só foi detectada no bairro de

Bambuí, reforçando a indicação de maior incidência do vetor nessa região do

município.

No bairro do Espraiado foi evidenciado outros casos de co-infecções, além da

associação com Leishmania sp., que já havia sido observado com mostras positivas

na PCR. Neste bairro foram evidenciadas também co-infecções de

Anaplasmataceae, E. canis/A. phagocytophilum (sorologia) com Babesia sp. e

Hepatozoon sp.

Tabela 20: Amostras de cães do município de Maricá/RJ e os bairros onde foram coletadas, em 2007, com sorologia positiva para Anaplasmataceae (E. canis e/ou A. phagocytophilum) e os parasitos co-infectantes.

Na tabela 21 e no gráfico 23 são mostradas as combinações entre os

diferentes parasitas co-infectantes, seus resultados nas reações sorológicas e os

bairros onde foram detectadas. Também se observa que a associação com

Leishmania sp. foi a mais frequente, reforçando a idéia de que o vetor pode ser o

mesmo (DANTAS-TORRES, 2010). E, embora a co-infecção com Babesia sp. seja

indicada como muito provável com Ehrlichia sp. (KORDICK et al., 1999; SUKSAWAT

et al., 2001a; INOKUMA et al., 2003) esta correspondeu a 17% ( 5/29) dos casos de

co-infecção, semelhante aqueles com Hepatozoon sp. No entanto, associado aos

resultados de co-infecção das amostras positivas na PCR, observa-se que a co-

Resultados Sorologia positiva para Anaplasmataceae e Parasito co-infectante

BAIRRO (NO AMOSTRAS) sorologia S+ (P-) Parasito n0

E A EA

BAMBUÍ (12)

4 1 3 D. immtis 8

1 1 0 Babesia sp. 2

1 0 1 Hepatozoon sp.2

1 0 1 Leishmania sp.2

ESPRAIADO (15)

1 0 0 Babesia sp. 1

1 1 1 Hepatozoon sp.3

6 2 2 Leishmania sp. 10

S. JOSÉ (5)

0 1 1 Babesia sp. 2


CENTRO (1)


125

infecção entre esses parasitas foi observada em todos os bairros avaliados,

indicando provável circulação em todo município.

Analisando a frequência geral de co-infecções, mostradas na tabela 23, o

bairro do Centro foi o que apresentou maior porcentagem de casos e o Espraiado a

menor, como já se observara na relação de amostras positivas na PCR.

No entanto, o Bairro do Espraiado foi o que apresentou maior número de

casos de co-infecção com Leishmania sp., o que reforça a idéia de que nesta região

a população animal e humana esteja mais exposta a vetores infectados com esse

parasita que foi detectado em todos os bairros estudados.

Tabela 21: Grupo de cães com sorologia positiva para E. canis e/ou A. phagocytophilum, e os parasitos co-infectantes, de amostras de cães do município de Maricá/RJ em 2007, e os bairros onde foram coletadas.

Legenda: A. p = A. phagocytophilum; E.c = E. canis;

Embora nas amostras positivas em PCR e co-infectadas não tenha sido

evidenciada relação de E. canis com Leishmania sp., maior do que aquela

observada com os outros parasitas, nas amostras com sorologia positiva, foi

observado que a relação entre esses parasitas foi a mais frequente, em 13 (44,8%)

das 29 amostras co-infectadas.

A existência dessas relações de co-infecções com Anaplasmataceae com diferentes

estados fisiopatogênicos, ou seja, PCR positivo e/ou sorologicamente positivo,

Parasitas co-infectantes (N0Amostras)

Sorologia positiva BAIRRO

E. canis A. p E.c e A. p

D. immtis (5) 3 1 1

Bambuí

D. immtis e Babesia sp.(1) 1 0 0 D. immtis e Leishmania sp.(1) 0 0 1

D. immtis , Babesia sp. e Leishmania sp.(1) 0 0 1 Hepatozoon sp.(2) 1 0 1

Babesia sp., Leishmania sp.e Hepatozoon sp.(1) 1 0 0 Espraiado Hepatozoon sp.(3) 1 1 1

Leishmania sp.(9) 5 2 2

Babesia sp.(2) 0 1 1 S José

Leishmania sp.(3) 2 0 1

Leishmania sp.(1) 7 3 3 Centro

126

reforça a hipótese de que neste município os cães estejam sendo constantemente

reinfectados e por diferentes vetores artrópodes hematófagos.

Tabela 22: Resultados de co-infecção da família Anaplasmataceae com outros parasitas, de amostras de cães do município de Maricá/RJ em 2007, distribuídos pelos 4 bairros avaliados,

Amostras com co-infecção nos bairros avaliados Proporção

BAIRRO Resultados* Sorologia PCR TOTAL

N


% S+P- S-P+ S+P+

BAMBUÍ 10 7 10 27 67 40,3

ESPRAIADO 13 0 4 17 50 34

S. JOSÉ 5 0 5 10 24 41,7

CENTRO 1 1 5 7 14 50

TOTAL 29 8 24 61 155 39,3

Legenda: * = para Anaplasmataceae; S+ = sorologia positiva; S - = sorologia negativa; P+ = PCR positiva; P- = PCR negativa.

Gráfico 23: Amostras de cães com sorologia positiva para Anaplasmataceae (E. canis e/ou A. phagocytophilum) e os parasitos co-infectantes, de amostras de cães do município de Maricá/RJ em 2007, e os bairros onde foram coletadas. E.c = E. canis; A. p = A. phagocytophilum

O parasita co-infectante mais frequente entre todas as 62 amostras positivas

em PCR e nas 89 positivas em sorologia, foi Leishmania sp, com 53,2% das

amostras, como mostrado no gráfico 24. No entanto, além deste, sabidamente um

127

agente de doença humana, outros também podem ser transmitidos aos seres

humanos (ALMOSNY e MASSARD, 2002), o que faz com que se alerte para o fato

da necessidade de se controlar esses vetores nesse município.

Tabela 23: Resultados de co-infecção da família Anaplasmataceae com outros parasitas, de amostras de cães do município de Maricá/RJ em 2007, distribuídos pelos 4 bairros avaliados, com a descrição do número de cada parasito. Amostras com co-infecção nos bairros avaliados

BAIRRO Resultados PCR Sorologia para Anaplasmataceae e Parasito co-infectante

S+P- Parasito n0 S-P+Parasito n

0 S+P+Parasito n

0

BAMBUÍ

D. immtis 8

D. immtis 6

D. immtis 10

Babesia sp. 2 Babesia sp. 1

Hepatozoon sp.1 Hepatozoon sp. 1 Hepatozoon sp. 2

Leishmania sp.1 Leishmania sp. 5 ESPRAIADO

Babesia sp. 1 0

Leishmania sp. 4 Hepatozoon sp.4

Leishmania sp. 10 S. JOSÉ

Babesia sp. 2 0

Hepatozoon sp. 1

Leishmania sp. 3 Leishmania sp. 4

CENTRO

Leishmania sp. 1

Babesia sp. 1 Hepatozoon sp. 1

Leishmania sp. 4

Legenda: S+ = sorologia positiva; S - = sorologia negativa; P+ = PCR positiva; P- = PCR negativa.

Gráfico 24: Porcentagens de amostras positivas para Anaplasmataceae (positivas em PCR e/ou sorologia) com cada parasito co-infectante, em cães do município de Maricá/RJ, em 2007.

128

5.4 AVALIAÇÃO DA FREQUÊNCIA DE ANAPLASMATACEAE CONSIDERANDO

ANIMAIS POSITIVOS EM PELO MENOS UM MÉTODO DE DIAGNÓSTICO

Vários autores têm mostrado a ocorrência mundial de erlichiose monocítica

canina e que a metodologia usada na seleção da população e para detecção da

bactéria ou anticorpos, pode influenciar na porcentagem encontrada (STICH et al.,

2008), por isso, no presente estudo, foram usadas metodologias que se

complementam no diagnóstico da doença. No entanto, para o diagnóstico da

anaplasmose canina, poucos estudos sobre a frequência na população têm sido

feitos, tanto no Brasil, quanto no mundo. Talvez por ser considerada menos

patogênica tanto com infecção natural (RIKIHISA, 1991; HARRUS et al., 1997a)

como em infecções experimentais (FRENCH e HARVEY, 1983; GAUNT et al., 2010).

A Tabela 24 mostra a comparação entre a frequência observada entre os

métodos usados nesse estudo, para Anaplasmataceae, E. canis e A. platys. Sendo

que, para esse último, apenas um método foi considerado.

Tabela 24: Resultados das pesquisas de A. phagocytophilum e E. canis por sorologia, Anaplasmataceae, E. canis e A. platys por PCR e esfregaços sanguíneos, em amostras de cães do município de Maricá/RJ, em 2007.

METODOLOGIA SOROLOGIA PCR P M

ESPÉCIES PESQUISADAS

TOTAL AMOSTRAS N0

A A. p E.canis A E.canis A. platys

89 41 71 62 6 6 35

% 60,1 27,7 48 40 3,9 3,9 22,6%

Legenda: A = Anaplasmataceae; A. p = A. phagocytophilum; P M = Pesquisa (morfológica) em Lâmina

Para obtenção do valor de frequência total de Anaplasmataceae na população

avaliada, foram consideradas todas as amostras que indicaram exposição (contato

com a bactéria) ou evidência direta da bactéria. Portanto, todas as amostras

positivas nas reações de PCR, todas as amostras positivas nas reações sorológicas

para E. canis e A. phagocytophilum e todas as amostras positivas na pesquisa

morfológica em lâmina, porém, descontadas as amostras que foram

simultaneamente positivas em mais de um teste. Esses resultados estão

sumarizados na tabela 24a e, na tabela 25, distribuídos pelos bairros.

129

Tabela 24a: Resultados da frequência de Anaplasmataceae em cães do município de Maricá/RJ em 2007, segundo avaliação de PCR, sorologia e pesquisa em lâmina.

Total de amostras

P(+) S(+) PS(+) L(+) LP(+) LS(+) LPS(+) Frequência total de

Anaplasmataceae

155 62 89 42 35 18 25 11 112

% 40 60,1 27,1 22,6 11,6 16,1 7,1 72

Legenda: P= PCR; S = Sorologia; L = Pesquisa em lâmina; (+) = reação ou pesquisa positiva.

Tabela 25: Resultados da frequência de Anaplasmataceae em cães, de quatro bairros do município de Maricá/RJ, em 2007, segundo avaliação de PCR, sorologia e pesquisa em lâmina.

BAIRRO N

0 amostras

coletadas

Total/sorologia

TESTES REALIZADOS TOTAL LÂMINAS*

(+) PCR (+) SOROLOGIA

(+)

PCR (+)

Sorologia

(+)

BAMBUÍ 67/65 13 (19,4%) 30

(44,8%)

33 (50,8%) 19/65

(29,2%)

44/67

(65,7%)

ESPRAIADO 50/48 14 (28%) 11

(22%)

33 (68,7%) 8/48

(16,7%)

38**/50

(76%)

SÃO JOSÉ 24/22 7 (29,2%) 12

(50%))

14 (63,6%) 8/22

(36,4%)

19**/24

(79%)

CENTRO 14/13 1 (7,1%) 9 (64,3%)

9 (69,3%) 7/13

(53,8%)

11/14

(78,6%)

TOTAL 155/148 35/155

(22,6%)

62/155

(40%)

89/148

(60,1%)

42/148

(28,4%)

112*/155

(72%)

* Descontados do total pois foram PCR ou sorologia positivas. **Acrescidas das 3 amostras com inclusões que tiveram amostras negativas em PCR e sorologia.

Essas diferenças não refletem maior ou menor eficiência, e sim, a fase em

que se encontra a infecção dos animais testados. No caso da avaliação morfológica,

entretanto, a baixa especificidade pode levar a falso positivo, uma vez que outras

estruturas podem ser confundidas com mórulas, mesmo pelos patologistas mais

experientes (HARRUS e WANER, 2011; LITLLE, 2010). Além de não ser possível

diferenciar a espécie pela morfologia ou mesmo pela célula com inclusão

(ALMOSNY, 1998).

A análise da frequência distribuída pelos bairros mostra que esta variou de

65,7 a 79%, tendo 74,8% de média. Por essa análise, o bairro de Bambuí teria a

130

menor freqüência e São José a maior. No entanto, isso pode ser um reflexo da

diferença de amostras coletadas em cada bairro.

O objetivo de somar os valores, obtidos na análise de PCR com a sorológica,

foi ampliar a possibilidade de detecção de todos os cães que possam ter sido

apenas expostos à bactéria, produzindo anticorpos, e também aqueles que têm o

microrganismo no sangue, sem ter ainda, desenvolvido anticorpos, e também

aqueles com as duas situações: com a bactéria e com anticorpos.

Esses resultados mostram que 112/155 (72%) da população de cães

analisada tiveram contato ou ainda tem uma bactéria da família Anaplasmataceae

no sangue. Poucos estudos têm sido feitos considerando a freqüência total de

bactérias da família Anaplasmataceae no Brasil.

Macieira et al., (2005) e Ferreira et al., (2008a) avaliaram cães da região

metropolitana do Rio de Janeiro através de protocolo de PCR e encontraram assim

uma frequência entre 18 e 19%, menor do que a observada no estudo em Maricá.

A análise sorológica detectou a maior porcentagem de indivíduos positivos

para Anaplasmataceae. No entanto, isso não quer dizer que estes animais

estivessem doentes, como demonstrado em estudo experimental (GAUNT et al,

1996). Para um estudo de freqüência na população isso mostra que a pesquisa de

anticorpos é capaz de detectar maior parte de indivíduos positivos por se tratar de

um teste capaz de detectar todos os indivíduos que tiveram exposição à bactéria

(RISTIC et al., 1972). Já a PCR detectou apenas aqueles cães que ainda estavam

com a bacteremia (LITTLE, 2010; HARRUS e WANNER, 2010). Sendo que esses

animais poderiam ou não ter produzido anticorpos. Como descrito por Almosny

(1998), na fase aguda pode ocorrer título negativo para a bactéria.

Por isso, para o estudo da freqüência, a soma da população soropositiva com

a positiva em pesquisa de DNA bacteriano, mostra mais precisamente quanto da

população está exposta à bactéria (MENESES et al., 2008).

5.4.1 Frequência de E. canis

Para obtenção do valor de frequência de E. canis na população avaliada,

foram consideradas todas as amostras positivas nas reações de PCR com

iniciadores espécie específicos ECAN5 e HE3, confirmadas por sequenciamento e,

também todas as amostras positivas nas reações sorológicas para essa espécie,

131

determinando uma frequência de 47,7% na população avaliada. Não foram

consideradas as amostras com inclusões de mórulas observadas em esfregaço, por

essas não poderem definir a espécie, apenas por características morfológicas

(HARRUS e WANNER, 2010). Esses resultados estão sumarizados na Tabela 26.

O objetivo de somar os valores obtidos na análise de PCR com a sorológica,

também foi ampliar a possibilidade de detecção de todos os cães, como explicado

para a frequência geral de Anaplasmataceae.

Apesar da frequência encontrada para Anaplasmataceae ser muito superior a

dos estudos de Macieira et al., 2005 e de Ferreira et al., 2008a, na região

metropolitana do Rio de Janeiro, a frequência de detecção das bactérias E. canis e

A. platys foi menor, considerando que usaram a mesma metodologia de PCR. Essas

diferenças podem estar relacionadas com o tipo de população selecionada. No

entanto, para E. canis o somatório da população com bacteremia, detectada por

PCR, com aquela somente com reação sorológica, mostra uma porcentagem maior,

de positivos, no município de Maricá.

A análise da frequência distribuída pelos bairros mostra uma variação de 41,8

a 57,1%, tendo 50,2% de média. Por essa análise, o bairro de Bambuí teria a menor

freqüência e o Centro a maior. No entanto, isso também pode ser um reflexo da

diferença de amostras coletadas em cada bairro.

Tabela 26: Resultados da frequência de E. canis em cães, de quatro bairros do município de Maricá/RJ em 2007, segundo avaliação de PCR e sorologia.

TESTES REALIZADOS BAIRRO N

0 amostras

coletadas

total/sorologia

PCR

(+) E.

canis

PCR (+) E.

canis e A.

platys

SOROLOGIA

(+) E. canis

PCR (+)

Sorologia (+)

E. canis

Total

E. canis

(%)

BAMBUÍ 67/65 3 0 26 1 28/67

(41,8%) ESPRAIADO 50/48 0 1 25 0 26/50

(52%) SÃO JOSÉ 24/22 1 0 12 1 12/24

(50%) CENTRO 14/13 1 0 8 1 8/14

(57,1%)

TOTAL 155/148 5 1 71 3 74/155

(47,7%)

Na frequência de E. canis a análise sorológica também detectou a maior

porcentagem de indivíduos positivos (71/155). No entanto, como discutido

132

anteriormente, isso não quer dizer que estes animais estivessem doentes (GAUNT

et al, 1996). Apesar da alta sensibilidade do teste sorológico, a reação encontrada,

não distingue uma infecção presente da exposição prévia ao agente, portanto,

superestima o número de cães doentes (WANER et al., 1995; WEN et al., 1997).

Portanto, para o estudo da freqüência, a soma da população soropositiva com a

positiva em pesquisa de DNA bacteriano, mostra, de forma mais precisa, quanto

essa população está exposta à bactéria, como o trabalho de Meneses et al., (2008),

em que foram analisados 75 cães suspeitos e 98,7% (74/75) foram soropositivos,

33,3% (25/75) tiveram DNA de E. canis detectados e 5,33% (4/75) tiveram mórulas

observadas em esfregaço. Sendo que os da identificação morfológica poderiam não

ser dessa espécie de Anaplasmataceae. No trabalho desses autores dois animais

diagnosticados morfologicamente não foram PCR positivo.

Ainda no estudo de Meneses et al., (2008), foram feitas análises dos títulos de

anticorpos nos cães positivos na PCR e não houve relação entre aqueles com títulos

elevados e a PCR, uma vez que os títulos mais baixos foram os mais frequentes.

Segundo Harrus et al., (1998; 2004), isso pode ser explicado pelo número de cães

na fase aguda que ainda não produziram altos títulos de anticorpos específicos ou

que estavam no início da fase subclínica, quando E. canis se encontra em menor

número na circulação sanguínea, e pelo fato de o baço ser o local de replicação.

Portanto, essa variação de freqüência não se relaciona com a eficiência do

método diagnóstico e sim com a fisiopatogenia da doença, onde aqueles animais

que já não apresentavam a bactéria no sangue, não foram identificados pela PCR

(LITTLE, 2010; HARRUS e WANNER, 2010), mas poderiam ou não ter desenvolvido

anticorpos se tivessem contato com a bactéria (GAUNT et al, 1996). O fato de terem

sido PCR negativo, também não elimina a possibilidade de que tivessem a bactéria

no organismo, já que esta pode se albergar em outros sistemas que não o

sanguíneo (GAUNT et al., 1996; HARRUS et al., 1998; HARRUS et al., 2004).

Também os estudos de Carlos et al., (2007) e Carvalho et al., (2008), feitos

na mesma região do sul da Bahia/BR, pesquisando E. canis, chegaram a

freqüências muito diferentes (36 e 7,8%, respectivamente) pelo fato de terem usado

testes sorológicos e moleculares respectivamente, mostrando a importância de se

usar os dois métodos para abranger animais nos dois estados fisiopatogênicos da

infecção: com anticorpos e com a bactéria.

133

A maioria dos estudos conduzidos em regiões semelhantes, no Estado do Rio

de Janeiro, baseou-se apenas no diagnóstico morfológico, justificando as diferenças,

como O’Odwyer et al., (2001) que encontraram 4,8%; Albernaz et al., (2007) 13,9% e

Accetta (2008) 1,8%. O diagnóstico morfológico não permite identificar a espécie da

bactéria, além de que apenas uma pequena porcentagem dos cães infectados pode

ser diagnosticada por esse método, ainda que o animal tenha a bactéria no sangue

(HARRUS e WANNER, 2010).

Os estudos de Labarthe et al., (2003) e Pimentel Jr (2007) que se basearam

em detecção sorológica de E. canis, obtiveram frequências de 29,6 e 47,4%

respectivamente, se aproximando da freqüência encontrada nesse estudo, em

Maricá de 47,7%. Nesses dois estudos também foram usadas populações

diferentes, no de Labarthe et al., (2003) foi uma população selecionada de forma

semelhante, entre animais de campanha de vacinação, enquanto Pimentel Jr

selecionou amostras encaminhadas a laboratório clínico particular e, no entanto,

com um valor bem semelhante ao encontrado. Santos (2008) também avaliou

sorologicamente uma população de cães recolhidos pelo CCZ de Santa Cruz na

cidade do Rio de Janeiro, encontrando 88,6% de positivos, mostrando mais uma vez

que o tipo de população pode ter maior ou menor frequência da bactéria. Da mesma

forma Macieira et al., (2005), comparou, através da PCR, a frequência de E. canis

entre populações caninas trombocitopênicas e não trombocitopênicas, evidenciando

26,8% e 3,5% respectivamente, confirmando o discutido por Dagnone et al., (2003)

que essas diferenças podem refletir um viés de seleção, porque cães

trombocitopênicos são mais propensos a serem testados para ehrlichiose.

5.4.2 Frequência de A. platys

Para obtenção do valor de frequência de A. platys na população avaliada,

foram consideradas todas as amostras positivas nas reações de PCR com

iniciadores espécie específicos, com os pares PLATYS/EHR16SR e com os pares

GroAplatys-35s/GroAplatys-550as. Embora o fabricante do “kit” sorológico Canine

SNAP® 4Dx® (IDEXX, Westbrook, maine USA) que detecta anticorpos contra

A.phagocytophilum, descreva a possibilidade de reação cruzada com anticorpos

para A. platys não se considerou as amostras com reações positivas, para cálculo da

freqüência de A.platys, na população de cães de Maricá.

134

Como já descrito no tópico de resultados da PCR, seis amostras (6/155;

3,9%) foram positivas para as reações de PCR específicas para A.platys e

confirmadas por sequenciamento. No entanto, esse resultado, não reflete a real

quantidade de cães que poderiam estar em contato com a bactéria, uma vez que

testes sorológicos específico, para detectar aqueles que tinham anticorpos como

resultado de uma exposição prévia, com ou sem a permanência da bactéria no

organismo, não foram avaliados. Essa porcentagem está abaixo daquela descrita

por Datnta-Torres (2008) para a variação da freqüência no Brasil, de 10,3 a 18,8%

embora o autor se refira a populações hospitalares, diferentes da analisada no

presente estudo. Essa variação da freqüência apresentada, inclui o estudo de

Ferreira e tal., (2008a) de 15,8% na cidade do Rio de Janeiro e que avaliaram por

PCR, cães com inclusões intraplaquetárias.

Os resultados obtidos com a análise morfológica dos esfregaços, não foram

incluídos nessa frequência pelo fato de não poder se definir a espécie apenas pelas

características morfológicas, ainda que as inclusões estejam em plaquetas, uma vez

que estudos comprovam que outras espécies também podem parasitar esse glóbulo,

como o experimento conduzido por Almosny (1998) e os estudos de (MYLONAKIS et

al., 2003; DAGNONE et al., 2009). Mesmo no estudo de Ferreira et al., (2007),

algumas das inclusões consideradas pelos autores como características para A.

platys, foram PCR negativas.

No entanto, se considerarmos que os animais soropositivos para A.

phagocytophilum podem ser resultado de uma reação cruzada com A. platys, pode

ser observado um aumento de 41 amostras na população positiva, totalizando

47/155 (30,3%).

5.5 AVALIAÇÃO DOS EXAMES HEMATOLÓGICOS E BIOQUÍMICOS

Na descrição desses resultados os animais foram agrupados de acordo com a

condição diagnóstica, primeiro da PCR, genérico ou específico, depois a sorologia,

de E. canis e/ou A . phagocytophilum. Além desse primeiro critério, foram separados

de acordo com a condição co-infectado ou não. Nesses resultados foram destacadas

e discutidas as alterações mais comuns, sendo que, no caso da CK (Creatino

quinase), devido a variações nos valores de referência, a discussão não foi

considerada.

135

5.5.1 Cães com resultados PCR positivos com sorologias negativas

5.5.1.1 Sem parasitas co-infectantes

5.5.1.1.1 Cães PCR positivos apenas em protocolos genéricos

Foram observados 12 cães positivos apenas em protocolos de PCR para

Anaplasmataceae (genéricos), sem co-infecções e, os resultados desse grupo, estão

descritos na tabela 27.

A tabela 27 mostra que nos resultados hematológicos, em relação à média, a

maioria dos 20 parâmetros analisados ficou nos intervalos de referência. Apenas os

valores de plaquetometria (plaquetas), eosinófilo absoluto (EOS2) e neutrófilo

segmentado relativo (Se1) foram alterados, definindo respectivamente:

plaquetopenia (trombocitopenia), eosinofilia absoluta e neutropenia relativa,

associados a diferentes fases de ehrlichiose nos cães (ALMOSNY e MASSARD,

2002). Esses parâmetros tiveram seus valores mínimos abaixo do normal e, com

exceção da plaquetometria, os valores máximos a cima do normal, possíveis de

serem encontrados nas infecções ehrlichiais em cães, principalmente por A. platys

(ALMOSNY e MASSARD, 2002; GAUNT et al., 2010).

136

Tabela 27: Média, desvio padrão, valor mínimo e máximo de valores hematológicos e bioquímicos de cães, do município de Maricá/RJ em 2007, PCR positivos/sorologia negativas para Anaplasmataceae, sem co-infecção.

(PCR positivos/sorologia negativas sem co-infecção)

VALORES HEMATOLÓGICOS Variavel N Média Desv Pad Minimum Maximum Unidade

Hemacias 12 5.7683333 1.0567603 3.4600000 7.09000 x103/μL

Hemoglobina 12 13.9666667 4.3920038 6.9000000 19.70000 /g/dL

VG 12 40.2833333 8.9030979 22.8000000 50.60000 %

VCM 12 69.4416667 4.5265798 58.7000000 73.50000 fL

HCM 12 23.6250000 4.4290621 12.1000000 26.90000 pg

CHCM 12 33.8250000 5.0436504 18.9000000 36.80000 %

plaquetas 12 184333.33 162502.21 21000.00 493000. /μL

LG 12 14916.67 4710.88 7400.00 22400. /μL

BAS1 12 0.9166667 1.2401124 0 3.00000 %

BAS2 12 156.5000000 218.1882007 0 516.00000/μL

EOS1 12 9.9166667 6.4731380 1.0000000 22.00000 %

EOS2 12 1420.50 965.4916317 74.0000000 3784. /μL

Ba1 12 0.5000000 0.7977240 0 2.00000 %

Ba2 12 65.3333333 131.1171117 0 448.00000/μL

Se1 12 58.4166667 11.9427295 39.0000000 78.00000 %

Se2 12 8950.58 4274.42 3774.00 16926. /μL

Li1 12 21.1666667 12.7052840 3.0000000 45.00000 %

Li2 12 3005.25 2091.26 672.0000000 6795. /μL

MO1 12 9.0833333 5.4348762 3.0000000 23.00000 %

MO2 12 1318.50 807.7061234 447.0000000 3038. /μL

VALORES BIOQUÍMICOS Variavel N Média Desv Pad Minimum Maximum

PPT 12 6.8666667 0.9354953 5.2000000 8.40000 g/dL

ALT 11 46.8181818 19.4875251 21.0000000 81.00000 U/L

AST 11 35.8181818 12.0980840 25.0000000 60.00000 U/L

CREATININA 11 0.8272727 0.2866737 0.4000000 1.30000 mg/dL

UREIA 11 32.8181818 10.2549323 17.0000000 54.00000 mg/dL

PT 12 6.6 0.920637 5.2000000 7.90000 g/dL

ALBUMINA 11 2.8272727 0.5217105 1.9000000 3.60000 g/dL

GLOBULINA 11 3.7909091 1.0024515 2.4000000 5.30000 g/dL

GGT 11 3.090909 2.151 0.0000 8.00000 U/L

FA 11 75.000000 74.69404 13.00000 262.00000 U/L

CK 09 149.66677 96.25097 41.00000 312.00000 U/L

Legenda: N = número de cães; Desv Pad = Desvio Padrão; Hemácia x103/µL VG = Volume Globular %; VCM =

Volume Globular Médio fL; HCM = Hemoglobina Globular Média pg; CHCM = Concentração de Hemoglobina

Globular Média %; plaquetas = plaquetometria/µL; LG = Leucometria Global/µL; BAS = Basófilo; EOS =

Eosinófilo; Ba = Bastão; Se = Segmantado; Li= Linfócito; Mo= monócito; 1 = valores relativos %; 2 = Valores absolutos /µL; PPT = Proteínas Plasmáticas Totais; ALT = Alaninaminotransferase; AST =

Aspartatoaminotransferase; PT = Proteínas Séricas Totais; GGT = Gamaglutamil transferase; FA = Fosfatase

Alcalina; CK = Creatinoquinase. ALT, AST, GGT, FA, CK em U/L; Hemoglobina, PPT, PT, Albumina e Globulina

em g/dL. Creatinina, Uréia em mg/dL

Analisando os valores mínimos e máximos dos outros parâmetros cujas

médias foram normais, verifica-se que hematimetria (hemácias), hemoglobinometria

(hemoglobina), volume globular (VG), índices hematimétricos (VGM, CHGM e HGM)

eosinófilos e linfócitos tiveram seus valores mínimos abaixo do normal, definindo

anemia, microcítica/hipocrômica, associada a deficiência de síntese de hemoglobina,

eosinopenia e linfopenia, associadas a imunossupressão, enquanto os valores

máximos apresentaram acima do normal para hemoglobinometria, HGM, CHGM,

sugerindo provável processo hemolítico (JAIN, 1993; THRALL, 2003), leucocitose,

DNNE, eosinofilia, basocitofilia, linfocitose e monocitose, compatíveis com processo

137

inflamatório e/ou infeccioso crônico (JAIN, 1993) que na ehrlichiose canina pode ser

frequente (THRALL, 2004) ou estar associada à fase subclínica que pode ter

respostas leucocitárias variáveis e sem sintomas clínicos. Os valores médios dos

índices hematimétricos dentro do intervalo de normalidade, sugeriram que os

quadros de anemia, em sua maioria, eram normocíticos e normocrômicos, portanto,

de anemias arregenerativas, também comum na fase subclínica (ALMOSNY e

MASSARD, 2002) ou mesmo aguda (WANER et al., 1995) provavelmente

associadas a inflamação.

Nos resultados bioquímicos observou-se que quanto aos valores médios, dos

11 parâmetros analisados, apenas o da uréia ficou acima do máximo normal para

espécie, indicando diminuição da filtração glomerular que pode ser de origem pré-

renal ou possível lesão renal que pode ocorrer nas infecções ehrlichiais, uma vez

que essas bactérias são levadas para vários órgãos como rins, fígado e linfonodos,

onde se multiplicam em macrófagos e são disseminadas para outros locais,

interagindo com células endoteliais de vasos de menor calibre induzindo vasculite ou

resposta inflamatória perivascular (HARRUS et al., 1997a; ALMOSNY, 1998;

ALMOSNY e MASSARD, 2002) podendo desenvolver glomerulonefrite e

insuficiência renal na fase crônica (ALMOSNY, 1998). Embora tenha havido

elevação nos valores séricos médios de uréia, os valores da creatinina foram todos

normais nos indivíduos desse grupo, indicando que, ainda que alguns indivíduos

pudessem apresentar lesão renal, esta pode não ser acentuada (KANEKO, et al.,

1997; LATIMER et al., 2003; STOCKHAM e SCOTT, 2011). Estes dois, índices,

entretanto,são considerados de baixa sensibilidade e especificidade diagnósticas

para disfunção renal (STOCKHAM e SCOTT, 2011).

Analisando os intervalos mínimos e máximos dos outros parâmetros

bioquímicos cujas médias ficaram dentro dos valores de referência, observou-se que

apenas o perfil protéico apresentou valores mínimos abaixo no normal, indicando

que possivelmente existam casos de hipoproteinemia associados a causas variadas,

como perda protéica, decorrente de vasculite sistêmica (HARRUS et al., 1997a;

ALMOSNY, 1998; ALMOSNY e MASSARD, 2002), ou deficiência de síntese,

decorrente de lesão hepática (CASTRO et al., 2004), responsáveis por sintomas nas

infecções ehrlichiais como edema de membros (ALMOSNY, 1998; NEER e

HARRUS, 2006), edema de saco escrotal e perda de peso acentuada (NEER e

HARRUS, 2006). Em estudo com infecção experimental, foi verificado que a proteína

138

plasmática total (PPT) diminuiu significativamente na terceira semana (CASTRO et

al., 2004). E, segundo Little (2010) na ehrlichiose canina pode ser achado

hipoalbuminemia. Na anaplasmose canina pode ocorrer hipoalbuminemia (HARRUS

et al., 1997a; BAKER et al., 1988; KAKOMA et al., 2000; LITTLE, 2010), em resposta

à inflamação e resposta imune ao microorganismo (BAKER et al., 1988, LITTLE,

2010).

Com relação aos valores máximos, além da uréia, em que já foi observado a

média acima dos valores de referência, o perfil protéico, GGT e FA também

apresentaram valores máximos acima dos normais para espécie. Segundo Little

(2010) na ehrlichiose canina pode ser achado hiperglobulinemia com gamopatia

policlonal ou monoclonal. Uma expansão monoclonal de linfócitos T foi encontrada

em cães infectados por E. canis que tinham uma gamopatia concomitante com picos

eletroforéticos estreitos (STOCKHAM e SCOTT, 2011). Na anaplasmose canina

pode ocorrer aumento de proteínas, com aumento de globulinas,

hipergamaglobulinemia, associada com elevações dos valores de IgM e IgA

(HIBLER et al., 1986; ALMOSNY; MASSARD, 2002; OLIVEIRA et al., 2008; LITTLE,

2010).

Embora não se tenha definido a(s) espécie(s) nesse grupo de

Anaplasmataceae, pode ser afirmado que embora os valores médios protéicos

encontrados neste grupo, estejam dentro do normal, a presença de animais com

hiperglobulinemia foi de 36%, mostrando que existem cães com resposta imune que

levou ao aumento do título de anticorpos séricos (SWANGO et al., 1989; HOSKINS,

1991), podendo caracterizar intensa estimulação antigênica, levando a uma reação

de hipersensibilidade ou resposta autoimune que pode aparecer na fase crônica de

infecções por essas bactérias (SWANGO et al., 1989) e, esse aumento de globulinas

também pode ser uma das causas para a diminuição de albumina (STOCKHAM e

SCOTT, 2011). Alguns animais tiveram alteração da função hepática, que também

pode ser uma das causas de hipoalbuminemia (KANEKO, et al., 1997; LATIMER et

al., 2003; STOCKHAM e SCOTT, 2011), porém, como foi indicada pela associação

com o aumento da atividade sérica de FA, achado frequente em cães positivos para

Ehrlichia sp. em população hospitalar (OLIVEIRA et al., 2008) e de GGT,

provavelmente não interferiu na síntese de albumina. O aumento de ambas sugeriu

colestase ou hiperplasia biliar (KANEKO, et al., 1997; LATIMER et al., 2003;

STOCKHAM e SCOTT, 2011) mas a sensibilidade destas enzimas ao cortisol

139

(STOCKHAM e SCOTT, 2011)também poderão relacionar esta elevação ao estresse

sistêmico causado por doenças..

Embora estudos tenham revelado que a atividade sérica de ALT pode estar

elevada em infecções por Ehrlichia sp. em cães (OLIVEIRA et al., 2008; LITTLE,

2010), nesse grupo, todos animais tiveram valores dentro da normalidade. Mas, as

elevações das atividades séricas de FA e GGT, sugeriram colestase ou estresse

sistêmico. (STOCKHAM e SCOTT, 2011).

5.5.1.1.2 Cães PCR positivos em protocolos específicos

Não tiveram amostras positivas para E. canis ou A. platys em PCR com

sorologias negativas e sem co-infecção.

5.5.1.2 Cães PCR positivos soronegativos com parasitas co-infectantes


As amostras que foram positivas em protocolos de PCR para

Anaplasmataceae (genéricos), com sorologias negativas, mas tiveram co-infecção

com os outros parasitas que foram detectados, de diferentes grupos taxonômicos,

totalizaram apenas seis, cujos resultados hematológicos e bioquímicos estão

descritos na tabela 28.

A alteração comum a todo grupo foi a trombocitopenia. Vários são os fatores

desencadeantes de consumo plaquetário em doenças infecciosas, principalmente

aquelas que afetam diretamente a circulação sanguínea (JAIN, 19973; KANEKO,

1997; THRALL, 2003; STOCKHAM e SCOTT, 2011). Não sendo, portanto,

patognomônico de nenhuma doença específica (COCKBURN e TROY, 1986; JAIN,

1993; STOCKHAM e SCOTT, 2011). Porém, no caso de co-infecções entre

hemoparasitas essa trombocitopenia pode ser mais acentuada (GAUNT et al., 2010),

como observada nos animais desse grupo e, em pelo menos um que teve a

plaquetometria abaixo de 100000/µL, limite considerado clinicamente mais grave

(JAIN, 1993).

140

Tabela 28: Valores hematológicos e bioquímicos de cães, do município de Maricá/RJ em 2007, PCR positivos/sorologia negativas para Anaplasmataceae, com co-infecção.

ERITROGRAMA E PLAQUETOMETRIA

Co-infectado com Babesia sp.

Parâmetro plaquetas Hemáciasx103

Hemoglobina VG VCM HCM CHCM

N = 1 128.000 5,97 14,9 42 69,9 24,9 35,7

Co-infectados com D. immitis

Parâmetro N = 3

plaquetas Hemácias x10

3


168.000 6,45 16,9 48 74,5 26,2 35,1

82.000 5,42 13,9 39 71,9 25,6 35,6

190.000 7,20 17,3 48 66,1 24,1 36,4

média 146.667 6,36 16,0 45 70,8 25,3 35,7

Co-infectados com Hepatozoon sp. e D. immitis

Parâmetro N = 2


3


146.000 6,11 17,1 46 76,0 27,9 36,7

188.000 4,25 11,0 32 75,6 26,0 34,4

média 167.000 5,18 14,1 39 75,8 27,0 35,6

LEUCOGRAMA


Parâmetro LG BAS BAS EOS EOS Ba Ba Se Se Li Li MO MO

N = 1 17300 7 1211 10 1730 0 0 55 9515 19 3287 9 1557


Parâmetro N = 3

LG BAS BAS EOS EOS Ba Ba Se Se Li Li MO MO

23400 0 0 12 2808 0 0 51 11934 32 7488 5 1170

9200 1 92 4 368 0 0 76 6992 13 1196 6 552

14100 4 564 34 4794 0 0 36 5076 19 2679 7 987

média 15566 2 219 17 2657 54 8001 21 3788 6 903


Parâmetro N = 2


14300 1 143 8 1144 0 0 71 10153 8 1144 12 1716

39100 2 782 2 782 1 391 84 32844 3 1173 8 3128

média 26700 1 462 5 963 0,5 195 77 21498 5 1158 10 2422

Legenda: Hemácias= hematimetria/µL; VG = Volume Globular %; VCM = Volume Globular Médio fl; HCM = Hemoglobina Globular

Média pg; CHCM = Concentração de Hemoglobina Globular Média %; plaquetas = plaquetometria /µL; LG = Leucometria Global /µL; BAS

= Basófilo; EOS = Eosinófilo; Ba = Bastão; Se = Segmantado; Li= Linfócito; Mo= monócito; 10 = valores relativos %; 2

0 = Valores

absolutos /µL; PPT = Proteínas Plasmáticas Totais; ALT = Alaninaminotransferase; AST = Aspartatoaminotransferase; PT = Proteínas

Séricas Totais; GGT = Gamaglutamil transferase; FA = Fosfatase Alcalina; CK = Creatinoquinase. ALT, AST, GGT, FA, CK em

U/L; Hemoglobina, PPT, PT, Albumina e Globulina em g/dL. Creatinina, Uréia em mg/dL

BIOQUÍMICA SÉRICA


Parâmetro PPT ALT AST Creatinina Uréia PT Albumina Globulina GGT FA CK

N = 1 6,8 38 74 0,9 43 7,6 3,7 3,9 11 97 309


Parâmetro N = 3

PPT ALT AST Creatinina Uréia PT Albumina Globulina GGT FA CK

6,8 40 31 1,3 36 7,2 3,1 4,1 1 95 69

8,4 348 42 1 39 8,7 3,5 5,2 5 1136 53

7,6 63 36 1,6 21 7,8 2,6 5,2 2 41 62

média 7,6 150 36 1,3 32 7,9 3,1 4,8 2,7 424 61


Parâmetro N = 2


8,2 27 9 1 72 7,7 3,1 4,6 23 39

8,8 8 20 0,5 13 4,9 0,9 4 1 44 93

média 8,5 17,5 14,5 0,75 42,5 6,3 2 4,3 12 41,5

141

Entre esses animais, apenas um apresentou anemia discreta e estava

indicando co-infecção com dois outros parasitas além de Anaplasmataceae.

Provavelmente anemia da inflamação (JAIN, 1993; THRALL, 2003; STOCKHAM e

SCOTT, 2011), uma vez que esse animal também foi o que apresentou leucocitose

mais acentuada, acompanhado de alterações específicas de processo inflamatório

crônico.

Outro cão também apresentou leucocitose, embora pouco menos intensa.

Neste animal, indicando co-infecção com D. immitis, destaca-se a eosinofilia com

linfocitose, típicas de processos parasitários intensos por nematódeos, com contato

íntimo no tecido (JAIN, 1993: THRALL, 2003). A eosinofilia também foi observada

em outros cães com D. immitis, embora não tenha sido um achado comum, bem

como a monocitose, porém, foram os mais frequentes, alterando os valores médios

de eosinófilos em um grupo e de monócitos no outro grupo, com D. immitis. Esses

dois achados também foram observados no animal com babesiose, associado a

basocitofilia, e é comum a processos inflamatórios crônicos onde há intensa

liberação de histamina e resposta imune celular (JAIN, 1993).

Em relação às alterações bioquímicas a mais frequente foi no proteinograma,

indicando hiperproteinemia por aumento de globulinas, embora em alguns animais

tenha sido observado hipoalbuminemia. Essas alterações são compatíveis a

resposta inflamatória intensa, com produção não só de imunoglobulinas como de

outras globulinas da inflamação como alfa e betas globulinas (JAIN, 1993; KANEKO,

1997). Alguns animais apresentaram a uréia aumentada, porém com ceatinina

dentro da normalidade, indicando lesão renal menos evidenciável ou de causa pré-

renal (KANEKO, et al., 1997; LATIMER et al., 2003; STOCKHAM e SCOTT, 2011).

5.5.1.2.2 PCR positivos em protocolos específicos

Duas amostras foram positivas para E. canis em PCR e soronegativas,

porém, com co-infecção: uma com Babesia sp. e outra simultaneamente com

Hepatozoon sp. e D. immitis. Os resultados hematológicos e bioquímicos estão

descritos na tabela 29. Nenhuma amostra foi encontrada com A. platys positiva em

PCR e soronegativa.

142

Tabela 29: Valores hematológicos e bioquímicos de cães, do município de Maricá/RJ em 2007, PCR positivos para E. canis e sorologias negativas, com co-infecção.


Co-infectado E. canis e Babesia sp.

Parâmetro plaquetas Hemácias x103 Hemoglobina VG VCM HCM CHCM

N = 1 27000 1,69 4,0 13 75,0 23,9 31,8

Co-infectados com E. canis, Hepatozoon sp. e D. immitis


N = 1 244.000 6,80 16,0 45 65,9 23,5 35,6

Legenda: Hemácias= hematimetria/µL; VG = Volume Globular %; VCM = Volume Globular Médio fl; HCM =

Hemoglobina Globular Média pg; CHCM = Concentração de Hemoglobina Globular Média %; plaquetas =

plaquetometria /µL; LG = Leucometria Global /µL; BAS = Basófilo; EOS = Eosinófilo; Ba = Bastão; Se =

Segmantado; Li= Linfócito; Mo= monócito; 10 = valores relativos %; 20 = Valores absolutos /µL; PPT =

Proteínas Plasmáticas Totais; ALT = Alaninaminotransferase; AST = Aspartatoaminotransferase; PT = Proteínas Séricas Totais; GGT = Gamaglutamil transferase; FA = Fosfatase Alcalina; CK = Creatinoquinase. ALT, AST,

GGT, FA, CK em U/L; Hemoglobina, PPT, PT, Albumina e Globulina em g/dL. Creatinina, Uréia em mg/dL

Embora o grupo seja estatisticamente não representativo, as alterações

observadas foram expressivas das infecções presentes nesses dois animais. Na co-

infecção com Babesia sp. a anemia e trombocitopenia intensas são consequências

da hemólise (JAIN, 1993, THRALL, 2003; STOCKHAM e SCOTT, 2011), como

também o aumento da AST, FA e CK (KANEKO, 1997). Embora a hiperproteinemia

seja esperada nesse quadro, a hemólise também pode ser responsável pelo

aumento da PT, concomitante a diminuição de outras frações protéicas, refletidas na

diminuição da PT, por causa da diminuição de Albunima e Globulina (KANEKO,

1997; KUMAR et al., 2006). No outro animal não foi observado anemia nem

LEUCOGRAMA


Parâmetro LG Ba Ba Se Se Li Li MO MO N = 1 8600 1 86 89 7654 4 344 6 516

Co-infectados E. canis, Hepatozoon sp. e D. immitis

Parâmetro LG BAS BAS EOS EOS Se Se Li Li MO MO N = 1 26900 5 1345 9 2421 48 12912 35 9415 3 807

BIOQUÍMICA SÉRICA


Parâmetro PPT ALT AST Creatinina Uréia PT Albumina Globulina GGT FA CK N = 1 8,2 3 92 0,8 66 3,7 1,1 2,6 5 284 580

Co-infectados E. canis, Hepatozoon sp. e D. immitis

Parâmetro PPT ALT AST Creatinina Uréia PT Albumina Globulina GGT FA CK N = 1 9,0 38 74 1,6 21 10,5 2,9 7,6 3 105 120

143

trombocitopenia e, o leucograma, associado ao perfil protéico de hiperglobulinemia é

compatível de processo inflamatório/infeccioso intenso (JAIN, 1993).

5.5.2 Cães com resultados PCR positivos com sorologias positivas

5.5.2.1 Cães com resultados PCR positivos com sorologias positivas sem co-infecção

O conjunto de amostras positivas simultaneamente na PCR e nas sorologias,

foi dividido entre aquelas que foram positivas nos protocolos genéricos sem

definição da(s) espécie(s) e aquelas que foram E. canis ou A. platys. Cada um

desses grupos também foi dividido de acordo com o tipo de reação sorológica

positiva: E. canis ou A. phagocytophilum. E, além disso, também foram divididos de

acordo com a condição de co-infecção com os outros grupos taxonômicos. Assim, o

primeiro grupo, semelhantemente a divisão anterior foi daqueles cães positivos em

PCR genérico para Anaplasmataceae, a seguir.


Os cães desse grupo foram divididos de acordo com a sorologia para E. canis

ou A. phagocytophilum. E, esses subgrupos estão descritos a seguir.


para E. canis

Nove cães foram sororreativos para E. canis nessas condições de

positividade em PCR e sem co-infecções com os outros grupos taxonômicos

encontrados e, suas alterações hematológicas e bioquímicas, estão descritas na

tabela 30.

144

Tabela 30: Média, desvio padrão, valor mínimo e máximo de valores hematológicos e bioquímicos de cães, do município de Maricá/RJ em 2007, PCR positivos para Anaplasmataceae, com sorologia positiva para E. canis, sem co-infecção.


PCR genérico positivos e sororreativos E. canis

Parâmetro N = 9

plaquetas Hemácias x103 Hemoglobina VG VCM HCM CHCM

média 169.778 5,52 14,2 40 71,4 25,5 35,6

Desv Pad 69763 1,3 3,8 10 3,7 2 1

MIN 93.000 2,87 6,6 19 64,8 22,4 33,9

MAX 325.000 6,86 17,8 49 77,8 28,6 36,8

LEUCOGRAMA


Parâmetro N = 9


Média 17211 1 119 8 1222 1 97 59 10511 24 3807 9 1648

Desv Pad 6676 1,3 183 6 863 0,7 123 11 6154 12 2224 5 1427 MIN 9200 1 125 0 0 0 0 41 5612 4 1288 2 254

MAX 32200 4 548 18 2466 2 322 80 25760 47 8366 16 4830

Legenda: Desv Pad = Desvio Padrão; Hemácias= hematimetria/µL; VG = Volume Globular %; VGM = Volume

Clobular Médio fl; HCM = Hemoglobina Globular Média pg; CHCM = Concentração de Hemoglobina Globular

Média %; plaquetas = plaquetometria /µL; LG = Leucometria Global /µL; BAS = Basófilo; EOS = Eosinófilo;

Ba = Bastão; Se = Segmantado; Li= Linfócito; Mo= monócito; 10 = valores relativos %; 20 = Valores absolutos

/µL; PPT = Proteínas Plasmáticas Totais; ALT = Alaninaminotransferase; AST = Aspartatoaminotransferase; PT

= Proteínas Séricas Totais; GGT = Gamaglutamil transferase; FA = Fosfatase Alcalina; CK = Creatinoquinase.

ALT, AST, GGT, FA, CK em U/L; Hemoglobina, PPT, PT, Albumina e Globulina em g/dL. Creatinina, Uréia em mg/dL


para A. phagocytophilum

Apenas duas amostras foram encontradas nessa descrição, e suas alterações

hematológicas e bioquímicas estão na tabela 31.

BIOQUÍMICA SÉRICA


Parâmetro N = 9


Média 7,6 29 34 1 37 7,2 2,7 4,6 16,5 79 102

Desv Pad 0,7 18,6 12 0,3 11 1,2 0,7 1,2 1,8 28 27 MIN 6,4 12 20 0,5 21 5,8 0,9 3 1 35 46

MAX 9,0 74 57 1,6 59 10 3,5 7,1 5 128 114

145

Tabela 31: Valores hematológicos e bioquímicos de cães, do município de Maricá/RJ em 2007, PCR positivos para Anaplasmataceae, com sorologia positivas para A. phagocytophilum, sem co-infecção.


PCR genérico positivos e sororreativos A. phagocytophilum

Parâmetro N = 2

plaquetas Hemácias x103 Hemoglobina VG VCM HCM CHCM

72.000 5,50 13,6 38 69,1 24,7 35,7

117.000 5,11 12,6 35 68,8 24,6 35,8

LEUCOGRAMA


Parâmetro N = 2 LG BAS BAS EOS EOS Se Se Li Li MO MO

20200 6 1212 20 4040 45 9090 21 4242 8 1616 20200 2 404 26 5252 47 9494 22 4444 3 606

Legenda: Hemácias= hematimetria/µL; VG = Volume Globular %; VGM = Volume Clobular Médio fl; HCM =




Proteínas Plasmáticas Totais; ALT = Alaninaminotransferase; AST = Aspartatoaminotransferase; PT = Proteínas

Séricas Totais; GGT = Gamaglutamil transferase; FA = Fosfatase Alcalina; CK = Creatinoquinase. ALT, AST,



para A.phagocytophilum e E. canis

Apenas uma amostra sem co-infecção foi PCR positiva em protocolo genérico

para Anaplasmataceae com sorologia positiva simultaneamente para A.

phagocytophilum e E. canis, e suas alterações hematológicas e bioquímicas estão

descritas na tabela 32. Nesse animal não foram obtidos o eritrograma, a PPT e a

plaquetometria.

BIOQUÍMICA SÉRICA


Parâmetro N = 2


8,0 36 35 1,2 45 7,7 2,4 5,3 2 87 117 8,4 60 24 0,8 31 6,8 1,4 5,4 3 41 52

146

Tabela 32: Valores hematológicos e bioquímicos de cão, do município de Maricá/RJ em 2007, PCR positivo para Anaplasmataceae, com sorologia positiva para A. phagocytophilum e E. canis, sem co-infecção.

LEUCOGRAMA

PCR genérico positivos e sororreativos A. phagocytophilum e E. canis

Parâmetro LG BAS BAS EOS EOS Se Se Li Li MO MO

N = 1 7000 0 0 13 910 67 4690 13 910 7 490

Legenda: LG = Leucometria Global /µL; BAS = Basófilo; EOS = Eosinófilo; Ba = Bastão; Se = Segmantado;

Li= Linfócito; Mo= monócito; 10 = valores relativos %; 20 = Valores absolutos /µL; ALT =

Alaninaminotransferase; AST = Aspartatoaminotransferase; PT = Proteínas Séricas Totais; GGT =

Gamaglutamil transferase; FA = Fosfatase Alcalina; CK = Creatinoquinase. ALT, AST, GGT, FA, CK em U/L; Hemoglobina, PPT, PT, Albumina e Globulina em g/dL. Creatinina, Uréia em mg/dL

A análise das tabelas 30, 31 e 32 foi feita em conjunto, embora

apresentassem algumas diferenças e o animal da tabela 32 não tivesse alguns

resultados hematológicos. Nesse grupo de animais a trombocitopenia foi a alteração

mais frequente, embora no grupo sororreativo para E. canis o valor máximo tenha

mostrado que existiram amostras cujas contagens plaquetárias foram normais.

Esses achados foram compatíveis com quase todos trabalhos que estudaram a

infecção por E. canis, onde a resposta imune humoral poderia ser um dos fatores

que contribuiriam para diminuição do número de plaquetas (CASTRO et al., 2004),

mas que essa característica poderia ou não estar presente, principalmente em

animais sem evidência de bacteremia (LITTLE, 2010).

A anemia não foi um resultado frequente, embora valores mínimos na série

eritrocítica do grupo positivo para E. canis tenha mostradso que alguns cães

desenvolveram essa alteração. Não observou-se, no presente estudo, alterações

nos valores da leucometria global na maioria desses cães, embora no grupo com

sorologia positiva para A. phagocytophilum a leucocitose tenha sido comum aos dois

animais, por causa de basocitofilia e eosinofilia, prováveis de inflamação persistente

(JAIN, 1993), embora apenas um deles tivesse outras alterações hematológicas

concordantes, como monocitose.

As alterações bioquímicas mais frequentes foram as do proteinograma,

compatíveis com processo inflamatório intenso, com resposta imune humoral, com

aumento de globulinas, justificando soro positividade desses animais para

BIOQUÍMICA SÉRICA

PCR genérico positivos e sororreativos A. phagocytophilum e E. canis

Parâmetro ALT AST Creatinina Uréia PT Albumina Globulina GGT FA CK

N = 1 41 47 1,4 31 7,7 2,9 4,8 0 39 74

147

Anaplasmataceae, como descrito em estudos anteriores que descrevem esse tipo de

infecção como causa de alterações no perfil protéico (JAIN, 1993; KANEKO, 1997;

THRALL, 2003), inclusive na eletroforese, com picos monoclonais (STOCKHAM e

SCOTT, 2011) e Hipergamaglobulinemia relatada com elevações dos valores de IgM

e IgA (HIBLER et al., 1986; ALMOSNY; MASSARD, 2002; OLIVEIRA et al., 2008;

LITTLE, 2010).

Alguns animais apresentaram alterações na uréia, com elevação desta,

indicando possível alteração pré-renal ou renal (KANEKO, 1997), como discutido

anteriormente.

5.5.2.1.2 Cães PCR positivos em protocolos específicos

5.5.2.1.2.1 Cães PCR positivos para A. platys sororreativas para A.

phlagocytophilum e/ou E. canis

As amostras PCR positivos para A. platys ou simultaneamente para A. platys

e E. canis com sorologia positiva para A. phagocytophilum ou E. canis e suas

alterações hematológicas e bioquímicas, totalizaram cinco amostras que estão

descritas na tabela 33a, 33b e 33c.

Tabela 33a: Valores hematológicos eritrocitários de cães, do município de Maricá/RJ em 2007, PCR positivos para A. platys ou A. platys e E. canis, com sorologias positivas para A. phagocytophilum ou E. canis, sem co-infecção.


PCR A. platys e sororreativos A. phagocytophilum

Parâmetro N = 3 plaquetas Hemácias x103 Hemoglobina VG VCM HCM CHCM

63.000 3,96 9,7 28 70,3 24,4 34,7

20.000 4,99 12,8 36 71,3 25,6 35,9

114.000 4,96 12,8 35 70,7 25,8 36,5

média 65.667 4,64 11,8 33 70,8 25,3 35,7

PCR A. platys e sororreativos E. canis


27.000 6,80 16,1 45 66,9 23,7 35,4

Média considerando todos como um grupo

média G 56.000 5,18 12,9 36 69,8 24,9 35,6

PCR A. platys e E. canis e sororreativo A. phagocytophilum

N = 1 34.000 4,28 10,3 30 68,5 24,1 35,2

média Gg 51.600 5 12,3 35 69,5 24,7 35,5 Desv Pad 38527 1,1 2,5 6,9 1,8 1 0,7

Legenda: Hemácias= hematimetria/µL; VG = Volume Globular %; VGM = Volume Clobular Médio fl; HCM =


plaquetometria /µL.

148

Tabela 33b: Valores hematológicos leucocitários de cães, do município de Maricá/RJ em 2007, PCR positivos para A. platys ou A. platys e E. canis, com sorologia positiva para A. phagocytophilum ou E. canis, sem co-infecção.


Li= Linfócito; Mo= monócito; 10 = valores relativos %; 20 = Valores absolutos /µL;

Tabela 33c: Valores bioquímicos de cães, do município de Maricá/RJ em 2007, PCR positivos para A. platys ou A. platys e E. canis, com sorologias positivas para A. phagocytophilum ou E. canis, sem co-infecção.

Legenda: PPT = Proteínas Plasmáticas Totais; ALT = Alaninaminotransferase; AST = Aspartatoaminotransferase; PT = Proteínas Séricas

Totais; GGT = Gamaglutamil transferase; FA = Fosfatase Alcalina; CK = Creatinoquinase. ALT, AST, GGT, FA, CK em U/L;

Hemoglobina, PPT, PT, Albumina e Globulina em g/dL. Creatinina, Uréia em mg/dL

LEUCOGRAMA

PCR A. platys e sororreativos A. phagocytophilum Parâmetro

N = 3 LG BAS BAS EOS EOS Se Se Li Li MO

MO

9800 0 0 9 882 64 6272 18 1764 9 882

11600 0 0 5 580 50 5800 34 3944 11 1276

15800 2 316 22 3476 51 8058 24 3792 1 158

Média 12400 1 105 12 1646 55 6710 25 3167 7 772

PCR A. platys e sororreativos E. canis Parâmetro LG BAS BAS EOS EOS Se Se Li Li MO MO

N = 1 17500 0 0 14 2450 36 6300 39 6825 11 1925

Média Geral considerando todos como um grupo Parâmetro LG BAS BAS EOS EOS Ba Ba Se Se Li Li MO MO

Média G 13675 0,5 79 12,5 1847 0 0 50 6607 29 4081 8 1060


N = 1 14400 0 0 4 576 2 288 47 6768 31 4464 16 2304

Média Geral de todos acima: PCR A. platys ou A. platys e E. canis; sororreativo A. phagocytophilum ou E. canis

média Gg 13820 0,4 63 10 1592 0,4 58 50 6640 29 4158 10 1309

Desv Pad 3118 1 141 7 1308 0 129 10 864 8 1811 5 848

BIOQUÍMICA SÉRICA

PCR A. platys e sororreativos A. phagocytophilum

Parâmetro N = 3


7,0 20 44 1,7 39 6,2 3,2 3 6 255 187

8,0 52 68 1,5 42 6,7 3,6 3,1 1 180 61

7,4 57 50 0,9 31 7,9 3 4,9 6 67 169

Média 7,5 43 54 1,4 37 6,9 3,3 3,7 4 167 139

PCR A. platys e sororreativos E. canis


N = 1 7,0 38 48 1 18 6,9 3,2 3,7 4 104 160



média geral 7,4 48 52 1,3 32 6,9 3,2 3,7 4,25 151 144

N = 1347 5,8 34 48 0,6 18 5,7 2,9 2,8 5 211 308

Média Geral de todos acima PCR A. platys e/ou E. canis sororreativo A. phagocytophilum ou E. canis

média Gg 7,0 40 51 1 29 6,7 3,2 3,5 4,4 163 177

Desv Pad 0,8 15 9 0,4 11 1 0,3 1 2 77 88

149

5.5.2.1.2.2 Cães PCR positivos E. canis sororreativos para A. phlagocytophilum

e/ou E. canis

Três amostras foram observadas com essas características, sendo que um

desses também foi colocado na tabela 33 para que fosse feita comparação, uma vez

que foi PCR positivo tanto para E. canis como para A. platys. Todos esses

resultados hematológicos e bioquímicos estão na tabela 34.

Tabela 34: Valores hematológicos e bioquímicos de cães, do município de Maricá/RJ em 2007, PCR positivos para E. canis e sorologias positivas para E. canis e/ou A. phagocytophilum sem co-infecção.


PCR E. canis e sororreativo E. canis


N = 1 82.000 3,44 8,8 25 72,6 25,5 35,1

PCR E. canis e sororreativo A. phagocytophilum e E. canis N = 1 36.000 4,78 11,4 32 67,6 23,7 35,1


N = 1 34.000 4,28 10,3 29 68,5 24,1 35,2

Média Geral de todos acima

média Gg 50.667 4,17 10,2 29 69,6 24,4 35,1

Desv Pad 27154 0,7 1,3 3,7 2,7 0,9 0,1

Legenda: Hemácias= hematimetria/µL; VG = Volume Globular %; VCM = Volume Globular Médio fl; HCM = Hemoglobina Globular Média pg; CHCM = Concentração de Hemoglobina Globular Média %; plaquetas = plaquetometria /µL; LG = Leucometria Global /µL; BAS = Basófilo; EOS = Eosinófilo; Ba = Bastão; Se = Segmantado; Li= Linfócito; Mo= monócito; 10 = valores relativos %; 20 = Valores absolutos /µL; PPT = Proteínas Plasmáticas Totais; ALT = Alaninaminotransferase; AST = Aspartatoaminotransferase; PT = Proteínas Séricas Totais; GGT = Gamaglutamil transferase;

FA = Fosfatase Alcalina; CK = Creatinoquinase. ALT, AST, GGT, FA, CK em U/L; Hemoglobina, PPT, PT, Albumina e Globulina em g/dL. Creatinina, Uréia em mg/dL

LEUCOGRAMA

PCR E. canis e sororreativo E. canis

Parâmetro LG BAS BAS EOS EOS Ba Ba Se Se Li Li MO MO N = 1 11000 2 220 10 1100 0 0 77 8470 3 330 8 880

PCR E. canis e sororreativo A. phagocytophilum e E. canis

N = 1 8300 2 166 8 664 2 166 65 5395 17 1411 6 498

PCR A. platys e E. canis e SORORREATIVO A. phagocytophilum

N = 1 14400 0 0 4 576 2 288 47 6768 31 4464 16 2304


média Gg 11233 1 129 7 780 1 151 63 6878 17 2068 10 1227

Desv Pad 3057 1 115 3 281 1 144 15 1540 14 2144 5 952

BIOQUÍMICA SÉRICA

PCR E. canis e SORORREATIVO E. canis


N = 1 7,0 19 20 1,6 87 5,9 1,8 4,1 1 30 58

PCR E. canis e sororreativo A. phagocytophilum e E. canis

N = 1 8,8 18 18 0,9 20 7,8 1,4 6,4 1 39 71

PCR A. platys e E. canis e SORORREATIVO A. phagocytophilum

N = 1 5,8 34 48 0,6 18 5,7 2,9 2,8 5 211 308


média Gg 7,2 24 29 1 42 6,5 2 4,4 2,3 93,3 146

Desv Pad 1 9 17 0,5 39 1,2 0,8 1,8 2,3 102 141

150

Os animais das tabelas 33 e 34 tiveram seus resultados discutidos juntos,

pelas semelhanças observadas. A trombocitopenia foi a alteração mais frequente e,

com exceção de um cão positivo para A. platys com 114000/µL, todos os animais

apresentaram trombocitopenia inferior a 100000/µL, considerado de importância

clínica, pelo fato de estarem mais vulneráveis a distúrbios hemostáticos (JAIN,

1993). É considerada por todos os estudos de infecções por Ehrlichia sp. e A. platys

como a alteração mais comum, embora estudos recentes reforcem que não seja um

achado patognomônico (BULLA et al., 2004; MACIEIRA et al., 2005; LITTLE, 2010;

GAUNT et al., 2010). Como não foram encontrados cães PCR positivos para essas

espécies com sorologia negativa para ambas as bactérias desse grupo taxonômico e

sem co-infecção, não foi possível discutir se a condição sorologia positiva, que indica

resposta imune humoral, se relaciona com maior ou menor trombocitopenia.

Com relação a outras alterações hematológicas a anemia também foi

frequente, embora nem todos animais a tivessem apresentado. Porém, todos os que

foram PCR positivos para E. canis desses grupos, inclusive o que foi

simultaneamente positivo para A. platys e E. canis, foram anêmicos, normocíticos e

normocrômicos arregenerativos, mostrando que essa infecção pode comprometer os

eritrócitos na produção ou na sobrevida (JAIN, 1993), embora estudos experimentais

não esclareçam o mecanismo (KUMAR et al., 2006). A leucometria global foi normal

em todos esses animais, mostrando que pode não ter características típicas de

infecção bacteriana ou de depressão medular, embora essas sejam descritas, mas

podem estar mais associadas a fase subclínica (ALMOSNY, 1998; CASTRO et al.,

2004). Dois cães positivos para A. platys na PCR apresentaram eosinofilia e, embora

apenas um desses tenha apresentado monocitose concomitante, essa alteração

pode estar relacionada à cronicidade do processo patogênico (JAIN, 1993). Apenas

um cão com E. canis na PCR e, também soro positivo para esta bactéria, apresentou

linfopenia mas, simultaneamente, esse animal teve aumento de uréia, mais de três

vezes maior o valor de referência, o que pode comprometer a sobrevida desses

leucócitos na circulação (JAIN, 1993; THRALL, 2003; STOCKHAM e SCOTT, 2011).

Esse animal também foi o único com hipoalbuminemia que pode ser decorrente de

alterações na filtração glomerular (KANEKO, 1997). A elevação da uréia também foi

comum nos cães positivos para A. platys e soropositivos para A.phagocytophilum

indicando alterações pré-renais ou renais, sem cronicidade, combinadas com

151

creatinina normal nesses animais (KANEKO, 1997; THRALL, 2003; STOCKHAM e

SCOTT, 2011).

Outras alterações no perfil bioquímico foram mais relacionadas ao

proteinograma. Apenas dois tiveram PT elevadas em consequência de

hiperglobulinemia. Um dos animais positivos para A. platys e também apenas um

dos positivos para E. canis, o que poderia estar correlacionada a resposta imune

humoral indicada pela sorologia positiva (ALMOSNY, 1998; CASTRO et al., 2004;

HARRUS e WANER, 2010) e, outro cão com discreta hiperalbuminemia. Neste

último, também foi observado aumento discreto da uréia, sugerindo alterações pré-

renais com desidratação (JAIN, 1993; KANEKO, 1997; THRALL, 2003; STOCKHAM

e SCOTT, 2011). Nos demais animais o proteinograma foi normal.

O cão positivo em PCR para A. platys e E. canis, além de intensamente

trombocitopênico, anêmico e com monocitose, característicos de infecções por

essas bactérias (JAIN, 1993; ALMOSNY, 1998; CASTRO et al., 2004; LITTLE, 2010)

foi o único deste grupo com aumento de FA, sugestivo de colestase (KANEKO,

1997; THRALL, 2003; STOCKHAM e SCOTT, 2011).

5.5.2.2 Cães com resultados PCR positivos com sorologias positivas com co-

infecção

5.5.2.2.1 Cães PCR positivos apenas em protocolos genéricos sororreativas

para E. canis e/ou A. phagocytophilum

Esse grupo de amostras foi dividido de acordo com o tipo(s) de parasita(s) co-

infectantes e associados aos resultados da sorologia.

Entre as amostras analisadas, 11 tinham co-infecção com Leishmania sp. e

foram encontradas com essas características, PCR positivos, apenas em protocolos

genéricos e soropositivas, mostradas nas tabelas 35a, 35b e 35c e assim divididas

em três subgrupos: sete com sorologia positiva apenas para E. canis, uma para A.

phagocytophilum e três com sorologias positivas para ambas espécies.

152

Tabela 35a: Média e desvio padrão de valores hematológicos eritrocitários de cães, do município de Maricá/RJ em 2007, PCR positivos para Anaplasmataceae, com sorologia positiva para E. canis e/ou A. phagocytophilum, com co-infecção.


PCR genérico e sororreativos E.canis co-infectado Leishmania sp.

Parâmetro N = 7


3


média 46.571 4,92 12,1 34 69,2 24,7 35,6

Desv Pad 21854 0,9 2,4 6 3 1,3 0,9

PCR genérico e sororreativos A. phagocytophilum co-infectado Leishmania sp.

Parâmetro plaquetas Hemácias x10

3


N= 1 19.000 5,42 14,5 40 73,5 26,8 36,5

PCR genérico e sororreativos E.canis e A. phagocytophilum co-infectado Leishmania sp.

N=3 média 52.333 5,07 12,4 35 68,7 24,5 35,7

Desv Pad 25968 1 3 8 3 1 1


média Gg 45.637 5,01 12,4 35 69,4 24,8 35,7

Desv Pad 22504 1 2 6 3 1 1


Hemoglobina Globular Média pg; CHCM = Concentração de Hemoglobina Globular Média %; plaquetas = plaquetometria /µL; Hemoglobina g/dL.

A trombocitopenia foi o resultado mais homogêneo desses animais, refletido

na média geral, considerada entre todos três subgrupos: com soropositividade só

para E. canis, só para A. phagocytophilum ou soropositivo para ambos.

Característica descrita em todos os estudos com infecções por Ehrlichia sp. e que

pode ser mais intensificada com co-infecção (MOREIRA et al., 2003; SANTOS et al.,

2009; LITTLE, 2010; GAUNT et al., 2010).

Embora alguns animais tenham apresentado anemia, essa foi discreta, mas

arregenerativa, indicando diminuição na produção (JAIN, 1993; THRALL, 2003;

STOCKHAM e SCOTT, 2011), provavelmente associada à inflamação.

153

Tabela 35b: Média e desvio padrão de valores hematológicos leucocitários de cães, do município de Maricá/RJ em 2007, PCR positivos para Anaplasmataceae, com sorologia positiva para E. canis e/ou A. phagocytophilum, com co-infecção.

LEUCOGRAMA


Parâmetro N = 7


Média 12686 0,6 63 9 1011 1 188 55 6589 27 3868 7 966

Desv Pad 6498 0,8 85 7 789 1 268 16 2858 18 5000 3 566

PCR genérico e sororreativos A. phagocytophilum co-infectado Leishmania sp.


N=1 14200 0 0 9 1278 1 142 65 9230 19 2698 6 852



N=3 média 10000 2 224 22 2052

0 0 49 4976 21 2316 6 432

Desv Pad 5671 1 216 7 1170

0 0 8 3204 6 1538 4 125


média Gg 12091 1 101 13 1319 1 132 55 6390 24 3338 7 810

Desv Pad 5811 1 142 9 936 1 225 14 2897 14 4002 3 506


Li= Linfócito; Mo= monócito; 10 = valores relativos %; 20 = Valores absolutos /µL;

A LG foi normal sem alterações específicas, o que pode caracterizar fase

subclínica de infecção (ALMOSNY, 1998; ALMOSNY e MASSARD, 2002; CASTRO

et al., 2004). Alguns apresentaram eosinofilia, mas estas não alteraram o valor

médio para todo grupo. Essa característica pode estar associada a possíveis lesões

teciduais profundas, causadas por parasitas (JAIN, 1993), como pode ocorrer na

leishmaniose.

Com relação às alterações bioquímicas a hiperglobulinemia foi a mais

frequente, porém não foi refletida na média geral dos grupos, que ficou dentro do

intervalo de normalidade para espécie. Alguns animais apresentaram

hipoalbuminemia que se refletiu na média geral dos grupos.

154

Tabela 35c: Média e desvio padrão de valores bioquímicos de cães, do município de Maricá/RJ em 2007, PCR positivos para Anaplasmataceae, com sorologia positiva para E. canis e/ou A. phagocytophilum, com co-infecção.

Legenda: PPT = Proteínas Plasmáticas Totais; ALT = Alaninaminotransferase; AST =


Alcalina; CK = Creatinoquinase. ALT, AST, GGT, FA, CK em U/L; Hemoglobina, PPT, PT, Albumina e Globulina

em g/dL. Creatinina, Uréia em mg/dL

As alterações observadas no proteinograma são compatíveis com processos

infecciosos, com intensa produção de anticorpos, o que pode levar a diminuição de

albumina (STOCKHAM e SCOTT, 2011).

Alguns animais também apresentaram elevação da uréia, indicada na média

geral dos grupos e em cada subgrupo. Como esse aumento não foi acompanhado

de elevação da creatinina, pode estar associado alterações pré-renais ou renais sem

cronicidade (KANEKO, 1997; THRALL, 2003; STOCKHAM e SCOTT, 2011).

No grupo com soro positividade apenas para E. canis houve aumento de ALT,

sugestivo de colestase com ou sem lesão de hepatócitos (KANEKO, 1997).

Duas amostras foram detectadas com co-infecção com D immitis e também

tinham, PCR positivos, apenas em protocolos genéricos e soropositivas, mostradas

nas tabelas 36.

BIOQUÍMICA SÉRICA


Parâmetro N = 7


média 7,8 110 41 1,1 33 8,4 2,6 5,8 4,7 84 92

Desv Pad 1 126 14 0,2 16 1,2 0,4 1,2 3,0 45 42

PCR genérico e sororreativos A. phagocytophilum co-infectado Leishmania sp. Parâmetro PPT ALT AST Creatinina Uréia PT Albumina Globulina GGT FA CK

N = 1 8,0 39 36 1,2 37 6,6 3 3,6 2 87 81



média 8,4 21 25 1 50 7,7 2,1 5,7 1,3 46 44

Desv Pad 3 6 10 0 23 1 0,5 1,1 1,5 8 5,7


média Gg 8,0 80 36 1 38 8 2,5 5,5 3,4 74 82

Desv Pad 1,6 106 14 0,2 18 1 0,5 1,2 2,9 39 39

155

Tabela 36: Valores hematológicos e bioquímicos de cães, do município de Maricá/RJ em 2007, PCR positivos para Anaplasmataceae, com sorologia positiva para E. canis e A. phagocytophilum, com co-infecção.


PCR genérico e sororreativo E. canis e A. phagocytophilum co-infectado D. immitis


213 19.000 4,82 12,1 34 70,9 25,0 35,3

235 103.000 3,17 7,6 22 69,0 23,9 34,6








Outros dois cães foram detectados com co-infecção com Hepatozoon sp.

também com PCR positivos, apenas em protocolos genéricos e soropositivas,

mostradas nas tabelas 37, subdivididos de acordo com a sorologia. Quatro cães co-

infectados simultaneamente com D. immitis e Leishmania sp., descritos na tabela 38,

também subdivididos, de acordo com a sorologia. Um cão com co-infecção de D.

immitis e Hepatozoon sp., descrito na tabela 39 e um cão com co-infecção de D.

immitis, Leishmania sp. e Hepatozoon sp., descrito na tabela 40.

Os animais das tabelas 36, 37, 38, 39 e 40 foram discutidos juntos e

comparativamente entre eles e os da tabela 35, pelas condições semelhantes de

positividade na PCR, diferindo na sorologia e parasita(s) co-infectante(s).

LEUCOGRAMA

PCR genérico e sororreativo E. canis e A. phagocytophilum co-infectado D. immitis

Parâmetro N = 2 LG BAS BAS EOS EOS Ba Ba Se Se Li Li MO MO

213 2500 1 25 7 175 66 1650 14 350 12 300

235 10100 0 0 8 808 69 6969 15 1515 8 808

BIOQUÍMICA SÉRICA

PCR genérico e sororreativo E. canis e A. phagocytophilum

Parâmetro N = 2


213 7,6 51 38 1,3 39 8,2 2,5 5,7 0 43 50

235 7,4 116 81 0,8 79 8,2 2,4 5,8 2 43 83

156

Tabela 37: Valores hematológicos e bioquímicos de cães, do município de Maricá/RJ em 2007, PCR positivos para Anaplasmataceae, com sorologia positiva para E. canis e/ou A. phagocytophilum, com co-infecção.


PCR genérico e sororreativo E. canis co-infectado Hepatozoon


N = 1 381 75.000 4,06 9,1 26 64,9 22,5 34,6

PCR genérico e sororreativo E. canis e A. phagocytophilum co-infectado Hepatozoon

N = 1 629 165.000 4,94 12,4 35 70,6 25,0 35,4





Proteínas Plasmáticas Totais; ALT = Alaninaminotransferase; AST = Aspartatoaminotransferase; PT = Proteínas Séricas Totais; GGT = Gamaglutamil transferase; FA = Fosfatase Alcalina; CK = Creatinoquinase. ALT, AST,


Todos esses animais apresentaram trombocitopenia, sendo que os que

tinham co-infecção com Leishmania sp. observou-se tendência a desenvolver

trombocitopenia mais intensa, em torno de 50000/µL, semelhante a co-infecção por

Babesia sp., mesmo quando nesta não havia sorologia positiva. Entre os cães

distribuídos nessas cinco tabelas, apenas um teve plaquetometria próximo ao valor

mínimo normal, que foi de 199000/µL.

LEUCOGRAMA



N = 1 381 16500 0 0 5 825 1 165 69 11385 4 660 21 3465

PCR genérico e SORORREATIVO E. canis e A. phagocytophilum co-infectado Hepatozoon

N = 1 629 33800 3 1014 15 5070 6 2028 34 11492 33 11154 9 3042

BIOQUÍMICA SÉRICA



N = 1 6,8 24 30 0,6 38 8,9 4,1 4,8 3 145 -

PCR genérico e sororreativo E. canis e A. phagocytophilum co-infectado Hepatozoon

N = 1 9,0 12 25 1,1 38 8,5 2,5 6 5 43 78

157

Tabela 38: Média e desvio padrão e valores hematológicos e bioquímicos de cães, do município de Maricá/RJ em 2007, PCR positivos para Anaplasmataceae, com sorologia positiva para E. canis e/ou A. phagocytophilum, com co-infecção.


PCR genérico e sororreativo E. canis co-infectado D. immitis e Leishmania


232 103.000 6,43 13,5 39 60,7 21,1 34,7

238 45.000 3,95 11,4 32 80,4 29,0 36,0

PCR genérico e sororreativo A. phagocytophilum co-infectado D. immitis e Leishmania

N = 1 203 19.000 6,65 17,3 48 72,9 26,1 35,8 PCR genérico e sororreativo A. phagocytophilum e E. canis co-infectado D. immitis e Leishmania

N = 1 554 38.000 4,58 10,6 30 66,3 23,1 34,9

média Gg 51.250 5,4 13,2 37 70,1 24,8 35,4

Desv Pad 36206 1,3 3 8 8 4 1






Séricas Totais; GGT = Gamaglutamil transferase; FA = Fosfatase Alcalina; CK = Creatinoquinase. ALT, AST, GGT, FA, CK em U/L; Hemoglobina, PPT, PT, Albumina e Globulina em g/dL. Creatinina, Uréia em mg/dL

LEUCOGRAMA



16600 0 0 26 4316 0 0 24 3984 38 6308 12 1992


N = 1 14300 0 0 14 2002 1 143 44 6292 34 4862 7 1001

PCR genérico e sororreativo E. canis e A. phagocytophilum co-infectado D. immitis e Leishmania

N = 1 14200 0 0 6 852 3 426 48 6816 38 5396 5 710

média Gg 15000 0 0 13 2053 1 142 47 6880 32 4812 7 1112

Desv Pad 1110 0 0 9 1590 1 201 19 2667 9 1540 3 601

BIOQUÍMICA SÉRICA



N = 2 7,8 75 68 1,3 35 8,5 3,6 4,9 2 39 164

8,6 50 41 1,6 51 8,5 2,7 5,8 5 37 80


N = 1 8,0 21 46 1,3 22 8,6 3,7 4,9 3 43

PCR genérico e sororreativo E. canis e A. phagocytophilum co-infectado D. immitis e Leishmania N = 1 8,8 29 28 0,7 33 7,8 1,9 5,9 3 45 130

média Gg 8,3 44 46 1 35 8,3 3 5,4 3,2 41 125

Desv Pad 0,5 24 17 0,4 12 0,4 0,8 0,5 1,2 3,6 42

158

Embora esses animais não tenham a espécie de Anaplasmataceae definida, o

comportamento fisiopatogênico parece ser semelhante aos de infecções por

Ehrlichia sp., em que a diminuição do número de plaquetas, principalmente

associado à co-infecção, é a principal característica hematológica. Além disso, esses

animais foram sorologicamente positivos para E. canis e/ou A. phagocytophilum, o

que mostrou que tiveram contato com essas bactérias.

Tabela 39: Valores hematológicos e bioquímicos de cão, do município de Maricá/RJ em 2007, PCR positivo para Anaplasmataceae, com sorologia positiva para E. canis e A. phagocytophilum, com co-infecção.

ERITROGRAMA E PLAQUETOMETRIA PCR genérico positivos e sororreativos E. canis e A. phagocytophilum co-infectado D. immitis e

Hepatozoon sp.


N = 1 199.000 5,16 12,0 34 66,7 23,3 35,0






Séricas Totais; GGT = Gamaglutamil transferase; FA = Fosfatase Alcalina; CK = Creatinoquinase. ALT, AST, GGT, FA, CK em U/L; Hemoglobina, PPT, PT, Albumina e Globulina em g/dL. Creatinina, Uréia em mg/dL

Nos valores relacionados aos eritrócitos esses animais apresentaram

variação entre valores mínimos normais e anemia discreta, normocítica e

normocrômica arregenerativa, provavelmente decorrente de inflamação. Apenas um

animal, da tabela 38, apresentou macrocitose, mas sem indicação de regeneração

na hematoscopia, podendo estar relacionado à carência nutricional de elementos

para síntese de ácidos nucléicos, como ácido fólico e vitamina B12 (JAIN, 1993;

KANEKO, 1997).

No leucograma, dos 10 animais distribuídos nas tabelas 36, 37, 38, 39 e 40,

apenas um foi leucopênico e outro teve leucocitose. Os demais tiveram a

LEUCOGRAMA



BIOQUÍMICA SÉRICA PCR genérico positivos e sororreativos E. canis e A. phagocytophilum co-infectado D. immitis e Hepatozoon sp.


N = 1 8,2 13 12 0,5 19 7,1 1,3 5,8 3 79 -

159

leucometria global normal. O animal leucopênico teve neutropenia, linfopenia e

monocitose relativa, combinados a anemia discreta e trombocitopenia muito

acentuada, podendo indicar possível depressão medular leucocitária e também com

diminuição da produção de plaquetas e, em menor grau, a de eritrócitos, todos

compatíveis com fisiopatogenia das infecções da ehrlichiose canina, principalmente

na fase cônica (JAIN, 1993; ALMOSNY, 1998; ALMOSNY e MASSARD, 2002;

CASTRO et al., 2004; LITTLE, 2010). O cão que apresentou leucocitose, da tabela

37, apresentou perfil de infecção bacteriana crônico, trombocitopenia discreta sem

anemia, mas com valores eritrocitários mínimos normais, talvez iniciando a

cronicidade observada na ehrlichiose canina.

Tabela 40: Valores hematológicos e bioquímicos de cão, do município de Maricá/RJ em 2007, PCR positivo para Anaplasmataceae, com sorologia positiva para E. canis e A. phagocytophilum, com co-infecção.


PCR genérico positivos e sororreativos E. canis e A. phagocytophilum co-infectado 1, 2 e3

Parâmetrto plaquetas Hemácias x103 Hemoglobina VG VCM HCM CHCM

N = 1 231 86.000 3,70 9,5 27 72,8 25,7 35,3







GGT, FA, CK em U/L; Hemoglobina, PPT, PT, Albumina e Globulina em g/dL. Creatinina, Uréia em mg/dL. co-infectado 1, 2 e 3 = co-infectado D. immitis, Leishmania sp. Hepatozoon sp.

Esses dois animais apresentaram uréia elevada podendo ser de origem pré-

renal ou renal, mas sem cronicidade por causa da associação com creatinina normal

(KANEKO, 1997; THRALL, 2003; STOCKHAM e SCOTT, 2011) e tiveram perfil

protéico elevado, em consequência de hiperglobulinemia, mas com

LEUCOGRAMA



BIOQUÍMICA SÉRICA



N = 1 11,8 32 51 1,1 29 13,2 2,3 10,9 4 35 86

160

hipoalbuminemia, ambos em decorrência da resposta imune humoral (JAIN, 1993;

KANEKO, 1997).

Os outros animais (tabelas 36 a 40) que tiveram a leucometria global normal

combinaram alterações da leucometria específica compatíveis com processo

infeccioso crônico, uréia aumentada e perfil protéico com hiperglobulinemia, sendo

que, alguns com hipoalbuminemia. Todas essas alterações eram semelhantes aos

dos animais anteriores, sugerindo processo em cronificação (JAIN, 1993), sendo

que, no caso do aumento dos valores séricos de uréia, indicaram origem pré-renal

ou renal, mas sem cronicidade.

5.5.2.2.2 Cães PCR positivos em protocolos específicos sororreativas

Semelhantemente aos grupos anteriores, esses foram divididos de acordo

com o(s) parasita(s) co-infectantes.

5.5.2.2.2.1 Cães PCR positivos para A. platys sororreativos para E. canis

Apenas um animal foi PCR positivo para A. platys, soropositivo e co-infectado

e, seus resultados hematológicos e bioquímicos estão descritos na tabela 41.

Semelhantemente às alterações dos outros grupos, prevalece a

trombocitopenia moderada, anemia moderada e normocítica normocrômica

arregenerativa, leucometria global com perfil de cronicidade (eosinofilia e discreta

linfocitose) e bioquímica sérica com elevação de uréia e hiperproteinemia com

hiperglobulinemia e hipoalbuminemia, também resultantes de resposta inflamatória

em cronificação (JAIN, 1993; KANEKO, 1997; THRALL, 2003; STOCKHAM e

SCOTT, 2011).

Como estatisticamente o resultado não foi representativo, não se pode

considerar essas características como comuns nesse tipo de infecção. Porém como

se assemelha a outros quadros de positividade sorológica e com co-infecção, mas

com PCR de Anaplasmataceae, sugeriu-se que em outros indivíduos seja provável a

trombocitopenia com anemia e quadro leucocitário e bioquímico sérico secundário a

inflamação/infecção crônica.

161

Tabela 41: Valores hematológicos e bioquímicos de cão, do município de Maricá/RJ em 2007, PCR positivo para A. platys, com sorologia positiva para E. canis, com co-infecção.


PCR A. platys e sororreativos E. canis co-infectado D. immitis


N = 1 86.000 3,16 7,7 21 67,2 24,3 36,2








5.5.2.2.2.2 Cães PCR positivos para E. canis sororreativos para E. canis e A.

phagocytophilum

Apenas um animal foi PCR positivo para E. canis, soropositivo e co-infectado

e, seus resultados hematológicos e bioquímicos estão descritos na tabela 42.

Embora não tenha quantidade de indivíduos para ser um grupo

estatisticamente representativo, como os outros grupos sorologicamente positivos

para E. canis e co-infectado de Leishmania sp. esse animal apresentou

trombocitopenia moderada a acentuada, confirmando mais uma vez que o estado de

co-infecção intensifica a trombocitopenia.

LEUCOGRAMA



BIOQUÍMICA SÉRICA



N = 1 10,0 49 43 0,9 53 9,8 2 7,8 3 48 50

162

Tabela 42: Valores hematológicos e bioquímicos de cão, do município de Maricá/RJ em 2007, PCR positivo para E. canis, com sorologia positiva para E. canis e A. phagocytophilum com co-infecção.


PCR E. canis e sororreativos E. canis e A. phagocytophilum co-infectado Leishmania


N = 1 72.000 4,04 9,9 29 71,2 24,7 34,6








Anemia discreta normocítica e normocrômica arregenerativa com leucometria

global normal e sem alterações específicas, sugerindo fase subclínica da infecção

ehrlichial (ALMOSNY, 1998; ALMOSNY e MASSARD, 2002; CASTRO et al., 2004),

associadas a uréia discretamente aumentada, indicando diminuição de filtração

glomerular de origem pré-renal ou renal, mas sem cronicidade e perfil protéico sérico

com hiperproteinemia com hiperglobulinemia, provavelmente pela resposta imune

humoral, tanto para E. canis e A. phagocytophilum como para Leishmania sp.

5.5.3 Cães PCR negativos soropositivos

Esses foram divididos de acordo com o quadro de co-infecção e separados

pelo tipo de reação sorológica positiva para E. canis e/ou A. phagocytophilum.

LEUCOGRAMA



BIOQUÍMICA SÉRICA



N = 1 6,4 29 23 0,7 43 7,9 2,7 5,2 3 81 112

163

5.5.3.1 Cães sem parasitas co-infectantes

Com essas características foram encontrados 17 animais, separados de

acordo com a positividade sorológica como descrito a seguir.

5.5.3.1.1 Cães sororreativas para E. canis

Doze cães foram PCR negativos com sorologia positiva apenas para E. canis

e sem parasitos co-infectantes, descritos na tabela 43.

Tabela 43: Média, desvio padrão, valor mínimo e máximo de valores hematológicos e bioquímicos de cães, do município de Maricá/RJ em 2007, PCR negativos para Anaplasmataceae, com sorologia positiva para E. canis, sem co-infecção.


PCR negativo e SORORREATIVOS E. canis

Parâmetro N = 12

plaquetas Hemácias Hemoglobina VG VCM HCM CHCM

média 117.333 6,06 15,5 43 69,1 25,7 36,1

Desv Pad 57308 0,7 2 4 8 2 1

MIN 23.000 5,26 12,6 36 45,2 22,5 34,8

MAX 242.000 7,37 17,4 49 79,1 29,1 36,8

LEUCOGRAMA


Parâmetro N = 12


Média 15533 0,4 73 10 1513 1 74 54 7795 30 5185 6 893

Desv Pad 5394 1 163 5 924 1 113 16 1938 18 4587 3 516

MIN 8400 0 0 5 576 0 0 26 5252 10 1330 1 202

MAX 27700 3 549 17 3366 3 360 73 10803 68 13736 10 1939


Hemoglobina Globular Média pg; CHCM = Concentração de Hemoglobina Globular Média %; plaquetas = plaquetometria /µL; LG = Leucometria Global /µL; BAS = Basófilo; EOS = Eosinófilo; Ba = Bastão; Se =





BIOQUÍMICA SÉRICA


Parâmetro N = 12


Média 8,4 47 45 1,2 41 9 3,2 5,9 5,6 55 163

Desv Pad 1,5 20 16 0,3 16 1,4 0,8 1,5 3,6 36 171

MIN 6,0 18 22 0,6 19 6,4 1,8 3,4 0 12 57

MAX 10,8 84 72 1,8 72 11,1 4,7 8,9 12 114 523

164

Embora a média desses animais tenha demonstrado trombocitopenia discreta

a moderada, o intervalo entre valor mínimo e máximo mostrou que havia indivíduos

com trombocitopenia muito acentuada e indivíduos com contagem normal de

plaquetas. Esse estado flutuante da contagem plaquetária, se considerarmos que

esses animais poderiam estar em diferentes fases da infecção ehrlichial, embora não

estivessem com a bactéria detectada no sangue, pôde ser observado e mostrado em

vários estudos de infecção experimental ou natural com diferentes espécies e cepas

de Ehrlichia sp. (TROY e FORRESTER, 1990; CASTRO et al,. 2004; STICH et al.,

2008; XAVIER et al., 2009).

A média do eritrograma indicou normalidade, no entanto, o valor mínimo do

VGM apresentou microcitose, característica que poderia estar associada à intensa

deficiência de síntese de hemoglobina (JAIN, 1993; THRALL, 2003; STOCKHAM e

SCOTT, 2011), que seria mostrada por presença de hipocromia, porém, isso não foi

observado nos resultados de CHGM. Essa microcitose também poderia estar

associada à esferocitose por fragmentação eritrocitária imunomediada (JAIN, 1993),

mas essas alterações também não foram observadas na hematoscopia.

No leucograma médio a LG foi normal, mas apresentando eosinofilia e

linfocitose, compatíveis com cronicidade inflamatória. Nos valores máximos normais

também foi observado monocitose que reforça característica de cronicidade (JAIN,

1993; THRALL, 2003; STOCKHAM e SCOTT, 2011).

Na bioquímica sérica desse grupo destacou-se nos valores médios,

novamente a uréia elevada, semelhante aos demais casos discutidos e,

hiperproteinemia com hiperglobulinemia, também semelhantes aos demais já

discutidos, além da hipoalbuminemia que pode ser compensatória, observada no

seu valor mínimo.

5.5.3.1.2 Cães sororreativas para A. phagocytophilum

Quatro animais foram observados com essas características e seus

resultados hematológicos e bioquímicos descritos na tabela 44.

165

Tabela 44 Média e desvio padrão, de valores hematológicos e bioquímicos de cães, do município de Maricá/RJ em 2007, PCR negativos para Anaplasmataceae, com sorologia positiva para A. phagocytophilum, sem co-infecção.


PCR negativo e sororreativos A. phagocytophilum

Parâmetro N = 4 plaquetas Hemácias Hemoglobina VG VCM HCM CHCM

Média 121.000 4,94 12,2 34 69,2 24,5 35,4

Desv Pad 59727 0,8 3 8 4,5 2 0,9

LEUCOGRAMA


Parâmetro N = 4


Média 15075 2 297 6 961 1 139 50 7633 31 4568 10 1474

Desv Pad 4528 1,4 192 3,6 593 1 206 5 2691 2 1025 3 433








Nesses animais os valores médios indicaram que também houve

trombocitopenia moderada, anemia discreta normocítica e normocrômica

arregenerativa, leucograma com LG normal e linfocitose muito discreta e monocitose

discreta, compatíveis com fase subclínica a crônica de infecção ehrlichial. A

bioquímica sérica com uréia elevada, semelhante aos casos discutidos

anteriormente e os outros parâmetros dentro da normalidade.

BIOQUÍMICA SÉRICA


Parâmetro N = 4


Média 6,8 39 48 1 34 7 2,8 4,3 4,5 104 167

Desv Pad 0,3 18 5 0,6 15 0,8 0,7 1,4 4,4 40 113

166

5.5.3.1.3 Cães sororreativos para E. canis e A. phagocytophilum

Apenas dois cães apresentaram essas características e seus resultados

hematológicos e bioquímicos estão descritos na tabela 45.

Tabela 45 Valores hematológicos e bioquímicos de cães, do município de Maricá/RJ em 2007, PCR negativos para Anaplasmataceae, com sorologia positiva para E. canis e A. phagocytophilum, sem co-infecção.


PCR negativo e sororreativos E. canis e A. phagocytophilum

Parâmetro N = 2

plaquetas Hemácias Hemoglobina VG VCM HCM CHCM

306.000 4,00 9,2 27 66,4 23,0 34,6

89.000 5,23 12,3 34 65,5 23,5 35,9

LEUCOGRAMA


Parâmetro N = 2


13800 2 276 11 1518 55 7590 22 3036 10 1380

14400 6 864 11 1584 43 6192 34 4896 6 864






Séricas Totais; GGT = Gamaglutamil transferase; FA = Fosfatase Alcalina; CK = Creatinoquinase ALT, AST,


Embora um desses animais estivesse com plaquetometria normal, o outro

apresentou trombocitopenia moderada à acentuada o que faria uma média de

trombocitopenia discreta. Porém, como não há representatividade estatística não se

pode afirmar que esse tipo de alteração seja significante ou não. Mas, como se

assemelha a alteração constantemente observada nos animais positivos para

Anaplasmataceae, esse achado pode ser considerado frequente, embora não

patognomônico (COCKBURN e TROY, 1986).

BIOQUÍMICA SÉRICA


Parâmetro N = 2


7,0 21 18 0,6 16 6,9 1,8 5,1 5 73 155

8,4 139 27 0,9 42 9,7 2,2 7,5 12 69 90

167

No leucograma foi observado LG normal com perfil específico com eosinofilia

discreta acompanhada de linfócitos e monócitos normais ou aumentados,

compatíveis de fase subclínica a crônica (JAIN, 1993; THRALL, 2003).

A bioquímica séria com um dos cães com uréia elevada, semelhante a grupos

já discutidos anteriormente e ALT e GGT aumentados, indicando colestase

(KANEKO, 1997). Ambos tiveram alterações na proteinemia com hiperglobulinemia

e hipoalbuminemia, semelhante a outros grupos, também já discutidos, que

poderiam estar com alterações compensatórias no proteinograma.

5.5.3.2 Cães PCR negativos soropositivos com parasitas co-infectantes

Nesse grupo foram observados 29 cães que foram subdivididos de acordo

com a reação sorológica. A fim de simplificar a discussão desses animais, nos quais

foram observadassemelhanças em suas alterações, todos foram agrupados no

grupo com sorologia para E. canis e/ou A. phagocytophilum, independente do(s)

parasita(s) co-infectante, embora estivessem descritos em tabelas separadas.

5.5.3.2.1 Cães sororreativas para E. canis

O total de cães desse grupo foi de 14, descritos nas tabelas 46, 47, 48, 49 e

50, onde foi comum a trombocitopenia abaixo de 100000/µL, considerada de

moderada a acentuada. Porém, raros animais tiveram contagem pouco acima desse

valor, mas ainda trombocitopênicos moderados, reforçando que essa é uma das

características mais comuns dos cães positivos.

Embora esses cães não tenham formado grupos de co-infectados com

representatividade estatística, aqueles com Leishmania sp. e/ou Babesia sp.

apresentaram tendência às trombocitopenias mais intensas.

168

Tabela 46 Média, desvio padrão, valor mínimo e máximo de valores hematológicos e bioquímicos de cães, do município de Maricá/RJ em 2007, PCR negativos para Anaplasmataceae, com sorologia positiva para E. canis, com co-infecção


PCR negativo e sororreativos E. canis co-infectado Leishmania

Parâmetro N = 7

plaquetas HemáciasX103


média 49.143 5,53 13,5 38 68 24,3 35,9

Desv Pad 37800 0,8 2,3 6,7 3,8 1 0,5

MIN 14.000 4,6 11 31 62 22,3 35,2

MAX 119.000 6,6 16,8 48 74 26,1 36,4

LEUCOGRAMA



Média 12557 1 80 9 1232 1 69 41 4858 43 5680 6 638

Desv Pad 4343 1 104 3 629 0,5 77 13 1884 14 2747 3 402

MIN 3200 0 0 4 128 0 0 23 2048 22 704 2 256

MAX 16000 2 278 14 1989 1 160 64 7200 65 9490 12 1452




Segmantado; Li= Linfócito; Mo= monócito; 10 = valores relativos %; 2

0 = Valores absolutos /µL; PPT =




BIOQUÍMICA SÉRICA


Parâmetro N = 7


Média 9,1 22 29 2 29 9,1 2,3 6,3 3 46 49

Desv Pad 1,3 10 8 2 14 1,4 0,5 2 2 8,7 10

MIN 7,2 10 17 0,9 12 7,2 1,5 3,1 1 29 34

MAX 10,6 41 38 7 53 10,9 3,1 8,9 6 57 62

169

Tabela 47 Média e desvio padrão de valores hematológicos e bioquímicos de cães, do município de Maricá/RJ em 2007, PCR negativos para Anaplasmataceae, com sorologia positiva para E. canis, com co-infecção.


PCR negativo e sororreativos E. canis co-infectado D. immitis

Parâmetro N = 3

plaquetas Hemácias X103 Hemoglobina VG VCM HCM CHCM

média 56.333 5,07 13,6 37,6 74,1 26,7 36

Desv Pad 30664 1 3,5 9 2,4 1 0,5

LEUCOGRAMA



Média 12133 1 99 11 1287 61 7060 18 2712 9 976 61 7060

Desv Pad 7342 1 91 3 946 8 3887 12 2428 3 409 8,4 3887








No eritrograma foi observado variação entre valores normais e anemia

acentuada sendo que, um animal da tabela 48 (co-infectado com Hepatozoon sp.),

apresentou hipocromia, indicativo de diminuição de síntese de hemoglobina (JAIN,

1993; THRALL, 2003). A maioria, no entanto, apresentou valores normais nesses

parâmetros.

No leucograma foi observada maior variação de resultados entre os animais,

porém, a maioria apresentou LG normal. Apenas um apresentou leucocitose,

acompanhada de linfocitose e monocitose, perfil mais típico da cronicidade na

ehrlichiose canina (JAIN, 1993; ALMOSNY, 1998; ALMOSNY e MASSARD, 2002;

CASTRO et al., 2004; GAUNT et al., 2010). Nos co-infectados com Leishmania sp.

foram observados valores mínimos nos resultados. Este animais apresentaram

leucopenia, neutropenia ou linfopenia,. Os demais que tiveram LG normais tiveram

seus perfis específicos bem variáveis, com características de processo inflamatório

BIOQUÍMICA SÉRICA


Parâmetro N = 3


Média 8,0 42 41 2,2 92 7,8 2,7 5,1 4 58 114

Desv Pad 1,1 27 18 1,8 106 0,4 0,9 1,2 1 37 22

170

agudo, subclínico ou crônico, não podendo ser traçado um perfil mais comum a

todos. Alguns apresentaram eosinofilia que também pode ser uma característica de

inflamação crônica ou mesmo de agressão parasitária tecidual, como discutido em

grupos anteriores.

Tabela 48 Valores hematológicos e bioquímicos de cães, do município de Maricá/RJ em 2007, PCR negativos para Anaplasmataceae, com sorologia positiva para E. canis, com co-infecção.


PCR negativo e sororreativos E. canis co-infectado Hepatozoon sp.

Parâmetro N = 2

plaquetas Hemácias X103 Hemoglobina VG VCM HCM CHCM

81.000 2,85 4,9 20 69,9 17,0 24,4

33.000 5,18 11,4 33 63,0 21,9 34,8

LEUCOGRAMA



23800 0 0 3 714 1 238 46 10948 41 9758 9 2142

11400 0 0 15 1710 2 228 54 6156 13 1482 16 1824








No perfil bioquímico as alterações mais comuns foram no proteinograma,

onde todos das tabelas 46, 47, 48, 49 e 50 mostraram animais com hiperproteinemia

com hiperglobulinemia, semelhante aos grupos anteriormente discutidos, sendo que

também alguns apresentaram hipoalbuminemia que pode ser compensatória à

hiperglobulinemia, como comentado.

BIOQUÍMICA SÉRICA


Parâmetro N = 2


6,6 19 24 0,6 24 13,3 1,4 11,9 4 15 113

8,0 23 57 1,1 47 8,7 2,6 6,1 7 49 141

171

Tabela 49 Valores hematológicos e bioquímicos de cão, do município de

Maricá/RJ em 2007, PCR negativos para Anaplasmataceae, com sorologia

positiva para E. canis, com co-infecção.


PCR negativo e sororreativos E. canis co-infectado D. immitis e Babesia sp.

Parâmetro plaquetas Hemáciasx103 Hemoglobina VG VCM HCM CHCM

N = 1 39.000 5,17 14,5 39,8 77,0 28,1 36,5

LEUCOGRAMA



N = 1 7700 0 0 10 770 1 77 53 4081 29 2233 7 539








Nos animais com co-infecção com Leishmania sp. e naqueles com D. immitis,

foram observados cães com valores de uréia elevada acompanhada de elevação

dos de creatinina, indicando lesão renal mais grave, quer seja aguda ou crônica, que

pode estar associada a infecção ehrlichial (KANEKO et al, 1997; TROY &

FORRETER, 1990; HOSKINS, 1991a; CODNER et al., 1992; VARELA et al, 1997;

ALMOSNY, 1998). Na maioria, no entanto, os níveis de uréia esteve aumentada

sem elevação da creatinina, podendo ser de causas pré-renais ou renais mais

brandas.

BIOQUÍMICA SÉRICA



N = 1 8,2 30 36 1,2 26 7,8 3 4,8 2 87 62

172

Tabela 50 Valores hematológicos e bioquímicos de cão, do município de Maricá/RJ em 2007, PCR negativos para Anaplasmataceae, com sorologia positiva para E. canis, com co-infecção.


PCR negativo e sororreativos E. canis co-infectado Leishmanis sp., Hepatozoon sp. e Babesia sp.


N = 1 31.000 4,14 9,2 26 63,0 22,1 35,1

LEUCOGRAMA



N = 1 6600 0 0 13 858 5 330 56 3696 15 990 11 726


Hemoglobina Globular Média pg; CHCM = Concentração de Hemoglobina Globular Média %; plaquetas = plaquetometria /µL; LG = Leucometria Global /µL; BAS = Basófilo; EOS = Eosinófilo; Ba = Bastão; Se =





5.5.3.2.2 Cães soropositivos para A. phagocytophilum

Da mesma forma que foi discutido com os cães soropositivos para E. canis,

esses também foram agrupados durante a discussão. Apenas seis cães formaram

esse grupo, subdividido nas tabelas 51, 52, 53 e 54.

Embora também todos tivessem apresentado trombocitopenia de moderada a

acentuada, não houve representatividade estatística para comparar entre os casos

de co-infecção, apesar da semelhança com outros grupos já descritos, sugerindo

que a co-infecção com Leishmania sp. e/ou Babesia sp. tenham tendência a causar

trombocitopenia mais frequente e mais acentuada.

BIOQUÍMICA SÉRICA



N = 1 7,6 40 53 0,8 35 8 2,7 5,3 8 102 162

173

Tabela 51 Valores hematológicos e bioquímicos de cão, do município de Maricá/RJ em 2007, PCR negativos para Anaplasmataceae, com sorologia positiva para A. phagocytophilum, com co-infecção.


PCR negativo e sororreativos A. phagocytophilum co-infectado D. immitis

Parâmetro plaquetas Hemácias Hemoglobina VG VCM HCM CHCM N = 1 56.000 5,87 15,2 42 71,8 25,9 36,0

LEUCOGRAMA



N = 1 10800 0 0 15 1620 0 0 41 4428 40 4320 4 432



plaquetometria /µL; LG = Leucometria Global /µL; BAS = Basófilo; EOS = Eosinófilo; Ba = Bastão; Se = Segmantado; Li= Linfócito; Mo= monócito; 10 = valores relativos %; 20 = Valores absolutos /µL; PPT =




O eritrograma foi normal na maioria desses animais, porém um cão da tabela

52, co-infectado com Babesia sp., foi intensamente anêmico, com microcitose e

hipocromia, associados a intensa diminuição de síntese de hemoglobina (JAIN,

1993). Neste animal foram observados também leucopenia com neutropenia e

linfopenia, mas eosinofilia relativa que, associadas à trombocitopenia, já comentada,

indica diminuição de atividade medular somada a possível falta de elementos para

síntese de hemoglobina que, no caso da babesiose, pode ser decorrente da

hemólise intravascular com hemoglobinúria que leva a perda de elementos como o

ferro. Esse animal também combina perfil bioquímico de uréia elevada,

hipoproteinemia com hipoalbuminemia e hipoglobulinemia que podem estar

associadas a perda renal e diminuição de síntese (JAIN, 1993; KANEKO, 1997;

THRALL, 2003; STOCKHAM e SCOTT, 2011).

BIOQUÍMICA SÉRICA



N = 1 8,2 21 57 1,2 35 9,4 4,2 5,2 1 31 65

174



PCR negativo e sororreativos A. phagocytophilum co-infectado Babesia sp.

Parâmetro Plaquetas Hemáciasx103

Hemoglobina VG VCM HCM CHCM N = 1 83.000 387 3,26 7,4 21,5 65,9 22,9

LEUCOGRAMA



N = 1 4900 1 49 25 1225 4 196 44 2156 17 833 9 441







Nos demais animais com eritrogramas normais, os leucogramas

apresentaram LG normais, mas com eosinofilia, provavelmente associada a lesão

parasitária tecidual.

Os perfis bioquímicos apresentaram uréia aumentada em todos,

semelhantemente a outros grupos já comentados. E, com exceção do cão co-

infectado com Hepatozoon sp., descrito na tabela 54 e do com co-infecção com

Babesia sp., os demais apresentaram hiperproteinemia com hiperglobulinemia.

BIOQUÍMICA SÉRICA



N = 1 7,4 21 37 0,6 35 4,7 1,9 2,8 3 159 454

175

Tabela 53 Média e desvio padrão de valores hematológicos e bioquímicos de cães, do município de Maricá/RJ em 2007, PCR negativos para Anaplasmataceae, com sorologia positiva para A. phagocytophilum, com co-infecção.


PCR negativo e sororreativos A. phagocytophilum co-infectado Leishmanis sp.

Parâmetro N = 3

plaquetas Hemáciasx103


média 93.667 6,08 15,7 44 72,3 25,9 35,7

Desv Pad 67471 0,4 1,8 3,8 2,4 1,6 0,9

LEUCOGRAMA



Média 12167 2 318 13 1810 1 99 61 7135 14 1883 8 922

Desv Pad 4475 1 260 9 1489 1 171 11 1693 6 1239 3 355








BIOQUÍMICA SÉRICA


Parâmetro N = 3


Média 8,1 77 44 1 56 8,1 3,5 4,6 5 76 60

Desv Pad 0,6 27 11 0,1 24 0,6 0,9 1,2 2,6 55 3,5

176



PCR negativo e sororreativos A. phagocytophilum co-infectado Hepatozoon sp.



N = 1 133.000 6,20 15,5 43 69,2 25,0 36,2

LEUCOGRAMA



N = 1 13700 0 0 12 1644 0 0 57 7809 25 3425 6 822








5.5.3.2.3 Cães sororreativas para E. canis e A. phagocytophilum

Nas tabelas 55, 56, 57, 58, 59 e 60 foram apresentados os resultados dos

nove cães com reações sorológicas simultâneas para E. canis e A. phagocytophilum,

separados de acordo com o(s) parasita(s) co-infectante(s), discutidos juntos, como

nos casos anteriores.

Nesses animais a trombocitopenia foi o resultado mais comum a todos os

cães e, apenas os co-infectados com D. immitis e simultaneamente com D. immitis e

Leishmania sp. apresentaram trombocitopenia com valores acima de 100000/µL,

porém sem alguma representatividade estatística, não descaracterizando esse

achado como o de maior importância hematológica em cães positivos para

Ehrlichia/Anaplasma. Sendo que, mais uma vez a associação com Babesia sp.

mostrou acentuar a trombocitopenia.

BIOQUÍMICA SÉRICA



N = 1 8,0 25 25 1 45 7,1 3,3 3,8 3 49 56

177

Tabela 55 Valores hematológicos e bioquímicos de cão, do município de Maricá/RJ em 2007, PCR negativos para Anaplasmataceae, com sorologia positiva para E. canis e A. phagocytophilum, com co-infecção.


PCR negativo e sororreativos E. canis e A. phagocytophilum co-infectado D. immitis


Hemoglobina VG VCM HCM CHCM N = 1 143.000 4,15 10,5 30 71,7 25,4 35,4

LEUCOGRAMA



N = 1 12600 1 126 15 1890 0 0 61 7686 16 2016 7 882







O eritrograma apresentou valores normais na maioria desses animais e

anemia discreta a moderada em dois deles, um co-infectado com D. immitis , na

tabela 55 e outro com co-infecção com Hepatozoon sp., na tabela 58. Ambas

normocítica e normocrômicas arregenerativas, provavelmente decorrentes de

inflamação.

O leucograma apresentou valores de LG normais na maioria desses cães,

menos nos co-infectados com Hepatozoon sp., na tabela 58. Na maioria, a

leucometria específica também teve poucas alterações. Dois cães com linfocitose,

nas tabelas 57(co-infectados com Leishmania sp.) e 58 (co-infectados com

Hepatozoon sp.). Essa alteração pode caracterizar resposta imune humoral intensa

(JAIN, 1993), por estar associada à hiperglobulinemia, nos dois casos.

BIOQUÍMICA SÉRICA



N = 1 7,0 22 15 1,9 127 9,5 1,9 7,6 1 53 35

178



PCR negativo e sororreativos E. canis e A. phagocytophilum co-infectado Babesia sp.



LEUCOGRAMA



N = 1 7200 0 0 1 72 0 0 73 5256 24 1728 2 144







No leucograma de outros dois cães desse grupo foi observado linfopenia, um

co-infectados com D. immitis e Leishmania sp., na tabela 59 e outro co-infectado

com esses dois parasitas e mais Babesia sp., na tabela 60. E, embora ambos

estivessem também com hiperglobulinemia, mostrando que, apesar da diminuição

linfocitária, esses animais permaneceram com resposta inflamatória protéica que

pode estar associadas a alfa e beta globulinas (KANEKO, 1997).

Apenas um animal apresentou eosinofilia discreta, co-infectado com D.

immitis, na tabela 55 e, provavelmente, decorrente de contato íntimo do parasita com

tecidos vasculares.

BIOQUÍMICA SÉRICA



N = 1 7,0 19 19 0,8 31 8,4 3,1 5,3 3 33 37

179

Tabela 57 Média e desvio padrão de valores hematológicos e bioquímicos de cães, do município de Maricá/RJ em 2007, PCR negativos para Anaplasmataceae, com sorologia positiva para E. canis e A. phagocytophilum, com co-infecção.


PCR negativo e sororreativos A. phagocytophilum e E. canis co-infectado Leishmania sp.

Parâmetro N = 3



média 78.000 5,16 12,5 35 67,9 24,2 35,6

Desv Pad 36428 0,4 1,5 4,3 3 1 0,4

LEUCOGRAMA



Média 11533 0 0 6 726 1 81 44 4643 41 5228 8 855

Desv Pad 6296 0 0 2 522 2 140 11 1236 14 4453 4 409








Nesses animais, o perfil bioquímico na maioria, apresentou elevação da uréia,

caracterizando alterações pré-renais ou renais, sendo que, em um deles, co-

infectado com D. immitis, o valor desse parâmetro ultrapassou mais do triplo do valor

máximo normal, sugerindo lesão renal (KANEKO, 1997).

BIOQUÍMICA SÉRICA


Parâmetro N = 3


Média 9,0 21 40 1 24 9,9 2,1 7,9 6,3 42 52

Desv Pad 2,1 13 23 0,3 4 1,5 0,4 1,4 4,2 15 18

180

Tabela 58 Valores hematológicos e bioquímicos de cães, do município de Maricá/RJ em 2007, PCR negativos para Anaplasmataceae, com sorologia positiva para E. canis e A. phagocytophilum, com co-infecção.


PCR negativo e sororreativos E. canis e A. phagocytophilum co-infectado Hepatozoon sp.

Parâmetro N = 2



54.000 3,64 8,1 23 63,5 22,4 35,2

90.000 6,72 17,1 47 69,5 25,4 36,5

LEUCOGRAMA


Parâmetro N = 2


19000 0 0 1 190 1 190 39 7410 53 10070 6 1140

17400 0 0 7 1218 0 0 68 11832 19 3306 6 1044








Ainda no perfil bioquímico, a característica mais comum a todos esses cães

foi a hiperproteinemia com hiperglobulinemia, em alguns acompanhado de

hipoalbuminemia, provavelmente compensatória a hiperglobulinemia.

BIOQUÍMICA SÉRICA


Parâmetro N = 2


12,0 20 18 0,8 31 12,5 1,3 11,2 2 93 95

7,2 57 53 1,2 27 9,6 3,3 6,3 4 44 67

181



PCR negativo e sororreativos E. canis e A. phagocytophilum co-infectado D. immitis e Leishmania sp.

Parâmetro plaquetas Hemácias103


LEUCOGRAMA



N = 1 7400 0 0 12 888 1 74 74 5476 12 888 1 74








BIOQUÍMICA SÉRICA



N = 1 8,6 32 44 1,6 48 8,3 1,9 6,4 3 69 126

182



PCR negativo e sororreativos E. canis e A. phagocytophilum co-infectado D. immitis, Babesia sp. e Leishmania sp.


Hemoglobina VG VCM HCM CHCM N = 1 23.000 5,49 14,3 38,6 70,3 26,1 37,0

LEUCOGRAMA



N = 1 11600 0 0 3 348 0 0 87 10092 6 696 4 464








5.5.4 Análise estatística das alterações hematológicas e Bioquímicas

Foram feitas análises estatísticas para avaliar se as variáveis hematológicas e

bioquímicas estudadas eram significativamente diferentes de um grupo para outro.

Porém, foram submetidos à estatística, apenas os grupos com representatividade

suficiente para ter análise. Assim, apesar de terem sido feitas 34 tabelas,

descrevendo os resultados bioquímicos e hematológicos dos animais estudados, de

acordo com os resultados da PCR, sorologia e estado de co-infecção, apenas cinco

grupos apresentaram representatividade, com mais de 10 animais.

Os grupos foram assim classificados: grupo um, cães PCR positivos com

sorologia negativas sem co-infecção; grupo dois, cães PCR positivos com sorologia

positivas (tanto para E. canis como para A. phagocytophilum) sem co-infecção;

grupo três, cães PCR positivos com sorologia positivas (idem ao anterior) com co-

infecção com Leishmania sp.; grupo quatro, cães PCR negativos com sorologia

BIOQUÍMICA SÉRICA



N = 1 10,2 50 33 0,7 20 7 2,5 4,5 4 58 43

183

positivas (idem) sem co-infecção; grupo cinco, cães PCR negativos com sorologia

positivas (idem) com co-infecção com Leishmania sp. Os valores de média, desvio

padrão, valor mínimo e máximo para as variáveis hematológicas e bioquímicas

nesses grupos estão nas tabelas 61, 62, 63, 64 e 65. Além desses, o grupo de

animais negativos (Tabela 68) foi usado para comparação nas análises estatísticas.

Tabela 61: Média, desvio padrão, valor mínimo e máximo de valores hematológicos e bioquímicos de cães PCR positivos/sorologia negativas sem co-infecção do município de Maricá/RJ em 2007.

Grupo um (PCR positivos/sorologia negativas sem co-infecção)

VALORES HEMATOLÓGICOS Variavel N Média Desv Pad Minimum Maximum unidade

Hemacias 12 5.7683333 1.0567603 3.4600000 7.09000 x103/μL

Hemoglobina 12 13.9666667 4.3920038 6.9000000 19.70000 g/dL

VG 12 40.2833333 8.9030979 22.8000000 50.60000 %

VCM 12 69.4416667 4.5265798 58.7000000 73.50000 fL

HCM 12 23.6250000 4.4290621 12.1000000 26.90000 pg

CHCM 12 33.8250000 5.0436504 18.9000000 36.80000 %

plaquetas 12 184333.33 162502.21 21000.00 493000. /μL

LG 12 14916.67 4710.88 7400.00 22400. /μL

BAS1 12 0.9166667 1.2401124 0 3.00000 %

BAS2 12 156.5000000 218.1882007 0 516.00000/μL

EOS1 12 9.9166667 6.4731380 1.0000000 22.00000 %

EOS2 12 1420.50 965.4916317 74.0000000 3784. /μL

Ba1 12 0.5000000 0.7977240 0 2.00000 %

Ba2 12 65.3333333 131.1171117 0 448.00000/μL

Se1 12 58.4166667 11.9427295 39.0000000 78.00000 %

Se2 12 8950.58 4274.42 3774.00 16926. /μL

Li1 12 21.1666667 12.7052840 3.0000000 45.00000 %

Li2 12 3005.25 2091.26 672.0000000 6795. /μL

MO1 12 9.0833333 5.4348762 3.0000000 23.00000 %

MO2 12 1318.50 807.7061234 447.0000000 3038. /μL


PPT 12 6.8666667 0.9354953 5.2000000 8.40000 g/dL

ALT 11 46.8181818 19.4875251 21.0000000 81.00000 U/L

AST 11 35.8181818 12.0980840 25.0000000 60.000000 U/L

CREATININA 11 0.8272727 0.2866737 0.4000000 1.30000 mg/dL

UREIA 11 32.8181818 10.2549323 17.0000000 54.00000 mg/dL

PT 12 6.0666667 2.1025237 0 7.90000 g/dL

ALBUMINA 11 2.8272727 0.5217105 1.9000000 3.60000 g/dL

GLOBULINA 11 3.7909091 1.0024515 2.4000000 5.30000 g/dL




Eosinófilo; Ba = Bastão; Se = Segmantado; Li= Linfócito; Mo= monócito; 1 = valores relativos %; 2 = Valores

absolutos /µL; PPT = Proteínas Plasmáticas Totais; ALT = Alaninaminotransferase; AST =


Alcalina; CK = Creatinoquinase. ALT, AST, GGT, FA, CK em U/L; Hemoglobina, PPT, Creatinina, Uréia, PT,

Albumina e Globulina em g/dL.

184

Tabela 62: Média, desvio padrão, valor mínimo e máximo de valores hematológicos e bioquímicos de cães PCR positivos/sorologia positivas sem co-infecção do município de Maricá/RJ em 2007.

Grupo dois (PCR positivos/sorologia positivas sem co-infecção)


Hemacias 11 5.4845455 1.1367793 2.8700000 6.86000 x103/μL

Hemoglobina 11 14.0090909 3.4820840 6.6000000 17.80000 g/dL

VG 11 39.1181818 9.0280472 19.4000000 49.30000 %

VCM 11 70.9727273 3.4698965 64.8000000 77.80000 fL

HCM 11 25.3090909 1.8195904 22.4000000 28.60000 pg

CHCM 11 35.6454545 1.0122881 33.9000000 36.80000 %

plaquetas 11 156090.91 70157.61 72000.00 325000. /μL

LG 12 16858.33 6586.55 7000.00 32200. /μL

BAS1 12 1.2500000 1.9128750 0 6.00000 %

BAS2 12 223.5833333 360.0304175 0 1212. /μL

EOS1 12 11.0000000 7.8624539 0 26.00000 %

EOS2 12 1766.92 1557.40 0 5252. /μL

Ba1 12 0.4166667 0.6685579 0 2.00000 %

Ba2 12 72.9166667 113.6337485 0 322.00000 /μL

Se1 12 57.5000000 10.8334499 41.0000000 80.00000 %

Se2 12 9823.00 5512.45 4690.00 25760. /μL

Li1 12 22.6666667 10.9820791 4.0000000 47.00000 %

Li2 12 3654.92 2094.87 910.0000000 8366. /μL

MO1 12 8.0000000 4.4517617 2.0000000 16.00000 %

MO2 12 1462.00 1290.03 254.0000000 4830. /μL

VALORES BIOQUÍMICOS Variavel N Média Desv Pad Minimum Maximum Unidade

PPT 11 7.6909091 0.6774283 6.4000000 9.00000 g/dL

ALT 12 33.3333333 18.3616861 12.0000000 74.00000 U/L

AST 12 34.0833333 11.2286835 20.0000000 57.00000 U/L

CREATININA 12 1.0250000 0.3306330 0.5000000 1.60000 mg/dL

UREIA 12 36.8333333 10.3995921 21.0000000 59.00000 mg/dL

PT 12 7.2833333 1.0399592 5.8000000 10.00000 g/dL

ALBUMINA 12 2.5583333 0.7415688 0.9000000 3.50000 g/dL

GLOBULINA 12 4.7250000 1.0746035 3.0000000 7.10000 g/dL

GGT 10 2.6000000 1.5776213 1.0000000 5.00000 U/L

FA 12 73.0833333 28.6719956 35.0000000 128.00000 U/L

CK 11 96.0000000 47.9437170 46.0000000 185.00000 U/L



Globular Média %; plaquetas = plaquetometria/µL; LG = Leucometria Global/µL; BAS = Basófilo; EOS = Eosinófilo; Ba = Bastão; Se = Segmantado; Li= Linfócito; Mo= monócito; 1 = valores relativos %; 2 = Valores

absolutos /µL; PPT = Proteínas Plasmáticas Totais; ALT = Alaninaminotransferase; AST =




185

Tabela 63: Média, desvio padrão, valor mínimo e máximo de valores hematológicos e bioquímicos de cães PCR positivos/sorologia positivas com co-infecção com Leishmania sp. do município de Maricá/RJ em 2007.

Grupo três (PCR positivos/sorologia positivas com co-infecção com Leishmania sp.)


Hemacias 11 5.0081818 0.8976393 3.6900000 6.31000 x103/μL

Hemoglobina 11 12.4363636 2.4229209 8.9000000 16.00000 g/dL

VG 11 34.7363636 6.2501636 25.5000000 43.50000 g/dL

VCM 11 69.4272727 3.0964789 63.3000000 73.50000 fL

HCM 11 24.8090909 1.2621050 22.0000000 26.80000 pg

CHCM 11 35.7363636 0.8065640 34.5000000 36.70000 %

plaquetas 11 45636.36 22504.54 11000.00 77000. /μL

LG 11 12090.91 5811.27 3100.00 24600. /μL

BAS1 11 0.8181818 1.0787198 0 3.00000 %

BAS2 11 101.3636364 142.3940116 0 432.00000 /μL

EOS1 11 12.6363636 8.9137279 2.0000000 27.00000 %

EOS2 11 1319.45 935.6537141 248.0000000 3240. /μL

Ba1 11 0.8181818 1.1677484 0 3.00000 %

Ba2 11 132.2727273 225.1062375 0 738.00000/μL

Se1 11 54.6363636 13.7932790 24.0000000 72.00000 %

Se2 11 6389.36 2896.63 1581.00 10140. /μL

Li1 11 24.4545455 14.2854026 11.0000000 61.00000 %

Li2 11 3338.45 4002.75 540.0000000 15006. /μL

MO1 11 6.6363636 2.8380531 3.0000000 12.00000 %

MO2 11 810.0000000 505.7238377 93.0000000 1722. /μL


PPT 10 8.0200000 1.6342174 6.4000000 12.00000 g/dL

ALT 11 79.6363636 106.5150438 11.0000000 345.00000 U/L

AST 11 35.9090909 14.1453494 17.0000000 67.00000 U/L

CREATININA 11 1.0545455 0.2161649 0.7000000 1.50000 mg/dL

UREIA 11 38.0000000 17.9276323 14.0000000 76.00000 mg/dL

PT 11 8.0363636 1.1526255 6.6000000 10.50000 g/dL

ALBUMINA 11 2.4909091 0.5107926 1.5000000 3.30000 g/dL

GLOBULINA 11 5.5454545 1.2266733 3.6000000 8.00000 g/dL

GGT 9 3.7777778 2.7738862 1.0000000 9.00000 U/L

FA 11 73.7272727 39.4261104 33.0000000 140.00000 U/L

CK 10 81.6000000 39.6041524 40.0000000 147.00000 U/L




Eosinófilo; Ba = Bastão; Se = Segmantado; Li= Linfócito; Mo= monócito; 1 = valores relativos %; 2 = Valores absolutos /µL; PPT = Proteínas Plasmáticas Totais; ALT = Alaninaminotransferase; AST =




186

Tabela 64: Média, desvio padrão, valor mínimo e máximo de valores hematológicos e bioquímicos de cães PCR negativos/sorologia positivas para Anaplasmataceae, sem co-infecção do município de Maricá/RJ em 2007.

Grupo quatro (PCR negativos/sorologia positivas sem co-infecção)

VALORES HEMATOLÓGICOS Variável N Média Desv Pad Minimum Maximum Unidade

Hemacias 18 5.64 0.90 3.88 7.37 x106/μL

Hemoglobina 18 14.27 2.67 8.40 17.40 g/dL

VG 18 39.76 7.02 24.60 48.90 %

VCM 18 68.77 7.17 45.20 79.10 fL

HCM 18 25.18 1.92 21.60 29.10 pg

CHCM 18 35.84 0.77 34.10 36.80 %

plaquetas 18 127055 69273 23000 306000 /μL

LG 18 15272 4761 8400 27700 /μL

BAS1 18 1.16 1.69 0 6.00 %

BAS2 18 178 251 0 864 /μL

EOS1 18 9.05 4.34 1.00 17.00 %

EOS2 18 1394 819 126 3366 /μL

Ba1 18 0.55 0.85 0 3.00 %

Ba2 18 80 131 0 436 /μL

Se1 18 52.55 13.43 26.00 73.00 %

Se2 18 7659 1961 5252 11554 /μL

Li1 18 29.67 15.02 10.00 68.00 %

Li2 18 4912 3753 1330 13736 /μL

MO1 18 7.00 3.10 1.00 14.00 %

MO2 18 1047 523 202 1939 /μL

VALORES BIOQUÍMICOS Variável N Média Desv Pad Minimum Maximum Unidade

PPT 18 7.92 1.39 6.00 10.80 g/dL

ALT 18 48.72 29.57 18.00 139.00 U/L

AST 18 43.11 15.15 18.00 72.00 U/L

CREATININA 18 1.13 0.42 0.60 1.90 mg/dL

UREIA 18 38.39 15.52 16.00 72.00 mg/dL

PT 18 8.55 1.53 6.20 11.10 g/dL

ALBUMINA 18 2.98 0.80 1.80 4.70 g/dL

GLOBULINA 18 5.58 1.59 2.80 8.90 g/dL

GGT 17 6.00 3.64 1.00 12.00 U/L

FA 18 68.05 39.55 12.00 140.00 U/L

CK 17 152.05 135.13 35.00 523.00 U/L

Legenda: N= número de cães; VG=Volume Globular; VGM= Volume Globular Médio; HGM= Hemoglobina

Globular Média; CHGM= Concentração de Hemoglobina Globular Média; plaquetas = plaquetometria; LG=

Leucometria Global; Bas=Basófilo; Eos= Eosinófilo; Se= Segmantado; Li=Linfócito; Mo=monócito; 1= valores

relativos; 2=Valores absolutos; PPT=Proteínas Plasmáticas Totais; ALT=Alaninaminotransferase;AST=Aspartatoaminotransferase; PT=Proteínas Séricas Totais; GGT=

Gamaglutamil transferase; FA=Fosfatase Alcalina; CK=Creatinoquinase.

187

Tabela 65: Média, desvio padrão, valor mínimo e máximo de valores hematológicos e bioquímicos de cães PCR negativos/sorologia positivas com co-infecção com Leishmania sp.do município de Maricá/RJ em 2007.

Grupo cinco (PCR negativos/sorologia positivas com co-infecção com Leishmania sp.)


Hemacias 13 5.5730769 0.7161865 4.5600000 6.6100000x10

6/μL

Hemoglobina 13 13.7769231 2.2446803 10.8000000 17.7000000 g/dL

VG 13 38.5153846 6.2237243 30.2000000 48.1000000 %

VCM 13 68.9230769 3.6731353 62.0000000 74.6000000 fL

HCM 13 24.6615385 1.3961485 22.3000000 27.5000000 pg

CHCM 13 35.7923077 0.5407734 35.0000000 36.8000000 %

plaquetas 13 66076.92 45688.19 14000.00 144000.00 /μL

LG 13 12230.77 4422.74 3200.00 18800.00 /μL

BAS1 13 0.9230769 1.1875422 0 4.0000000 %

BAS2 13 116.3846154 175.9505321 0 588.0000000 /μL

EOS1 13 9.3846154 5.0750774 4.0000000 23.0000000 %

EOS2 13 1248.62 871.5080358 128.0000000 3381.00 /μL

Ba1 13 0.6923077 0.9473309 0 3.0000000 %

Ba2 13 78.6923077 106.2688294 0 296.0000000 /μL

Se1 13 46.6153846 14.0862726 23.0000000 74.0000000 %

Se2 13 5334.08 1889.59 2048.00 8140.00 /μL

Li1 13 35.6923077 16.9331264 9.0000000 65.0000000 %

Li2 13 4699.23 3154.16 630.0000000 10340.00 /μL

MO1 13 6.6923077 3.4006033 2.0000000 13.0000000 %

MO2 13 753.7692308 383.7853467 256.0000000 1452.00 /μL


PPT 13 8.8153846 1.3378130 6.6000000 10.6000000 g/dL

ALT 13 34.7692308 28.0539773 9.0000000 105.0000000 U/L

AST 13 34.7692308 13.6146603 17.0000000 66.0000000 U/L

CREATININA 13 1.4846154 1.6797054 0.6000000 7.0000000 mg/dL

UREIA 13 33.9230769 19.2676825 12.0000000 81.0000000 mg/dL

PT 13 8.3461538 2.8256608 0 11.2000000 g/dL

ALBUMINA 13 2.5461538 0.7848730 1.5000000 4.3000000 g/dL

GLOBULINA 12 6.5416667 1.8352401 3.2000000 9.3000000 g/dL

GGT 12 4.3333333 2.8709623 1.0000000 11.0000000 U/L

FA 13 52.3076923 27.7620383 26.0000000 140.0000000 U/L

CK 10 53.0000000 10.2956301 34.0000000 65.0000000 U/L

Legenda: N = número de cães; VG = Volume Globular; VGM = Volume Globular Médio; HGM = Hemoglobina Globular Média; CHGM = Concentração de Hemoglobina Globular Média; plaquetas = plaquetometria; LG =

Leucometria Global; Bas = Basófilo; Eos = Eosinófilo; Se = Segmantado; L i= Linfócito; Mo = monócito; 1 =

valores relativos; 2 = Valores absolutos; PPT = Proteínas Plasmáticas Totais;

ALT=Alaninaminotransferase;AST=Aspartatoaminotransferase; PT = Proteínas Séricas Totais; GGT =

Gamaglutamil transferase; FA = Fosfatase Alcalina; CK = Creatinoquinase.

188

O resultado da análise estatística pelo teste de Kruskal-Walllis X2, revelou

diferença significativa entre os grupos para as seguintes variáveis: plaquetometria

(p< 0,0001), segmentados em valores absolutos (p< 0,0008), proteínas séricas totais

(p< 0,0008), proteínas plasmáticas totais (p< 0,0310), AST (p< 0,0216) e globulina

(p< 0, 0002).

No caso da plaquetometria, essa foi a que mais variou. E, analisando as

médias de cada grupo, o teste estatístico mostrou que os grupos cinco e três foram

mais semelhantes entre si, enquanto o mesmo ocorreu com os demais grupos: um,

dois, quatro e seis. Na tabela 66 foram destacados os valores das médias da

plaquetometria de cada grupo. Embora todos estejam abaixo do mínimo normal para

espécie (200000/μL), os grupos três e cinco estão abaixo de 100000/ μL,

considerados com risco clínico hemorrágico (JAIN, 1993; KANEKO et al., 1997).

Tabela 66: Resultados das médias dos grupos estatísticos para análise da plaquetometria de cães de Maricá/RJ em 2007.

Variável Média G1 Média G2 Média G3 Média G4 Média G5 Média G6

Plaquetometria/μL 184333 156091 45636 127056 66077 177571

Os grupos três e cinco eram co-infectados com Leishmania sp. enquanto os

grupos um, dois e quatro eram positivos ou em PCR ou sorologia ou ambos, para

Anaplasmataceae, mas sem co-infecção. A coinfecção parece ser um fator

importante na determinação de trombocitopenia e vários estudos têm mostrado essa

ocorrência (MOREIRA et al., 2003; SANTOS et al., 2009; LITTLE, 2010; GAUNT et

al., 2010). Além disso, estudos como o de Pires et al., (2008) analisando aspirado de

medula óssea, encontraram 1 cão entre 65 (1,5%) co-infectado com Ehrlichia sp. e

Leishmania sp., indicando que podem se associar no tecido hematopoiético

contribuindo para a diminuição do número de plaquetas, uma vez que a

trombocitopenia pode ser causada pela hipoplasia de medula óssea e também pelo

sequestro e aumento de consumo (LITTLE, 2010). O grupo seis, embora de animais

negativos para Anaplasmataceae, foi composto por um grupo de cães que poderiam

apresentar outras alterações fisiopatogênicas, não avaliadas nesse estudo,

mostrando que a trombocitopenia pode estar presente em qualquer

inflamação/infecção que afete o animal sistemicamente, não sendo patognomônico

de infecções por Anaplasma platys (COCKBURN e TROY, 1986) ou outra bactéria

do mesmo grupo taxonômico.

189

Embora o número de segmentados tenha variado significativamente entre os

grupos, todos os valores médios se mantiveram dentro do intervalo de referência

para espécie e, esses valores podem oscilar entre a diminuição, normalidade e o

aumento, de acordo com a fase da ehrlichiose/anaplasmose (ALMOSNY, 1998;

BREITSCHWERDT et al., 1998; LITTLE, 2010).

Na avaliação bioquímica as globulinas e as proteínas séricas totais

apresentaram maior variação em relação aos valores de referência, tendendo a

valores elevados. No grupamento estatístico das globulinas os grupos quatro e cinco

foram mais próximos entre si, bem como o dois e três, todos com valores médios

acima do normal. Esses valores podem estar relacionados ao aumento do título de

anticorpos (HOSKINS, 1991), hipergamaglobulinemia devido à reação de

hipersensibilidade ou resposta autoimune (SWANGO et al., 1989). Os grupos um e

seis foram mais semelhantes entre si e apresentaram valores médios dentro dos

normais para espécie, sendo que no grupo seis são cães negativos para

Anaplasmataceae e outros parasitos e o grupo um, cães soronegativos para

Ehrlichia/Anaplasma, o que pode justificar a não elevação do título de anticorpos

acima do normal.

As proteínas séricas totais apresentaram no grupamento estatístico maior

semelhança entre os grupos quatro e cinco, seis e três e, dois com o seis, todos

esses com valores acima da referência. Uma vez que o grupo seis são cães

negativos, essa hiperproteinemia pode estar relacionada à presença de alterações

não avaliadas nesse estudo. O grupo um se assemelhou mais ao dois, sendo que o

grupo um apresentou valores médios dentro da normalidade. Essas variações

podem estar relacionadas com as alterações das globulinas, descritas

anteriormente, uma vez que essas fazem parte da concentração das proteínas totais

séricas. No entanto, o grupo dos cães negativos (seis) não apresentou aumento

médio de globulinas e apresentou aumento médio das proteínas séricas totais,

reforçando a idéia de que outras alterações não relacionadas a esse estudo podem

estar presentes nesses cães.

Na avaliação das proteínas plasmáticas totais também foi observado um

comportamento semelhante ao das proteínas séricas totais. No entanto, o

grupamento estatístico mostrou maior semelhança entre os grupos três e cinco, dois

e quatro, seis e dois, todos esses com valores médios acima do normal, e do grupo

um com o seis, sendo o um com valores médios normais. A maior semelhança entre

190

os grupos três e cinco, diferente do observado nas proteínas séricas totais, pode

estar relacionada ao fato desses dois grupos serem de Anaplasmataceae co-

infectados com Leishmania sp. e que, talvez, o fibrinogênio tenha um papel mais

acentuado na fisiopatogenia da infecção com Leishmania sp., já que esta proteína é

o principal elemento que difere as proteínas plasmáticas das séricas totais. Além

disso é uma proteína de importância na resposta inflamatória tecidual (KANEKO et

al., 1997).

Embora as enzimas hepáticas AST e GGT tenham apresentado diferenças

significativas entre os grupos analisados, seus valores médios foram todos dentro

dos intervalos de normalidade para cães. Essas variações podem estar associadas a

possíveis quadros de lesão hepática que podem ser observados nos animais com

ehrlichiose canina, uma vez que a bactéria pode se albergar no fígado (HARRUS et

al., 1997a; ALMOSNY, 1998; ALMOSNY e MASSARD, 2002), podendo causar

hepatomegalia (UNVER et al., 2009).

5.5.5 Comentários finais sobre Alterações Hematológicas e Bioquímicas

Analisando os resultados gerais, mesmos dos grupos sem representatividade

estatística, descritos separadamente, observa-se que mesmo a trombocitopenia e a

hiperglobulinemia que foram os mais frequentes, não houve um resultado

suficientemente frequente entre os animais positivos, quer seja em diagnóstico por

PCR ou sorológico, que possa ser considerado como característica exclusiva de

cães com Ehrlichia sp., Ehrlichia canis e/ou Anaplasma platys ou soropositivos para

Ehrlichia canis e/ou Anaplasmaphagocytophilum. Estudo transversal feito com

população hospitalar, sugeriu que a elevação da creatinina indicasse cronicidade na

ehrlichiose canina e que as atividades séricas de ALT e FA elevadas, estariam

associadas à fase aguda (SANTARÉM et al., 2008), no entanto esses autores

correlacionaram com o estado de pancitopenia ou não nos animais doentes, além de

sinais clínicos, para sugerirem fase da doença e, no estudo feito em Maricá, os

animais tiveram outros parâmetros analisados, além do diagnóstico molecular e

morfológico, a condição sorológica e estados de co-infecções, que contribuíram para

diferenças nessas conclusões. No entanto, semelhantemente a esses autores, a

trombocitopenia e hiperglobulinemia foram os resultados mais frequentes nos

animais positivos.

191

Estudo longitudinal em cães de abrigo particular na Itália, infectados naturalmente

com Ehrlichia canis ou Anaplasma platys co-infectados ou não com outros

patógenos transmitidos por vetores artrópodes, sugeriu intensa gravidade da

associação infecciosa de E. canis e Babesia canis, onde todos cães com esse

diagnóstico vieram a óbito (CAPRARIIS et al., 2011). Isso pode indicar que muitos

cães não sobrevivam a essa co-infecção e talvez possa justificar a baixa frequência

encontrada na população de cães de Maricá, em que se selecionou tipo de

população semelhante, uma vez que vários estudos indicam como muito provável

essas associação (KORDICK et al., 1999; SUKSAWAT et al., 2001a; INOKUMA et

al., 2003). Também no estudo de Caprariis et al., (2011) a trombocitopenia foi o

achado mais frequente e mais intensa em co-infecções. Entretanto, esses autores

encontraram também uma correlação significativa de hipoalbuminemia em cães com

A. platys. Isso não pode ser avaliado nos cães de Maricá devido a baixa

representatividade estatística encontrada.

5.6 ANIMAIS NEGATIVOS

O grupo dos negativos foi representado pelos cães PCR e sorologia negativas

e que não foram encontrados outros parasitos não Anaplasmataceae. Este grupo foi

o número seis da análise estatística e os resultados hematológicos e bioquímicos

estão sumarizados na tabela 68.

Dos 155 animais avaliados, 22/155 (14,2%) foram negativos em todos os

testes usados para detecção de Anaplasmataceae, Ehrlichia e Anaplasma caninas:

avaliação morfológica em esfregaço sanguíneo, sorologia e PCR, e também não

estavam infectados com outros parasitas, encontrados na população, durante a

avaliação.

Além dos 22 animais negativos para Anaplasmataceae e outros parasitos

encontrados durante o estudo, mais 16 cães também negativos, porém positivos

para esses outros parasitos que foram identificados e estão sumarizados na tabela

67.

192

Tabela 67: Cães negativos para Ehrlichia/Anaplasma sem e com outros parasitas em cães do município de Maricá/RJ, em 2007.

Condição PCR/Soro

Parasitos não Anaplasmataceae

N0

de amostras

Parasito co-infectante (n

0)

G

PCR (-) SORO (-)

SEM 22 amostras

G6

COM

16

D. immtis (11)

Leishmania sp. (3)

Hepatozoon sp. (2)

Legenda: G = Grupo estatístico

Apenas os 22 cães negativos para Anaplasmataceae e sem outros parasitos

encontrados durante o estudo foram analisados estatisticamente e usados para

comparação com os dos grupos um, dois, três, quatro e cinco. Na tabela 68 estão

sumarizados os valores de média, desvio padrão, valor mínimo e máximo para as

variáveis hematológicas e bioquímicas desses animais.

Tabela 68: Média, desvio padrão, valor mínimo e máximo de valores hematológicos e bioquímicos de cães PCR negativos/sorologia negativas para Anaplasmataceae do município de Maricá/RJ em 2007.


Hemacias 21 5.8400000 1.3065259 3.2100000 8.2700000 x103/μL

Hemoglobina 21 14.6000000 3.7567273 6.2000000 22.200000 g/dL

VG 21 40.8761905 10.0653318 18.3000000 61.800000 %

VCM 21 69.6428571 4.5633947 57.0000000 79.5000000 fL

HCM 21 24.8238095 1.9255921 19.3000000 28.2000000 pg

CHCM 21 35.6095238 0.8467023 33.2000000 36.9000000 %

plaquetas 21 177571.43 67568.17 49000.00 261000.00 /μL

LG 22 17559.09 5952.08 11200.00 34400.00 /μL

BAS1 22 0.5000000 0.9636241 0 4.0000000 %

BAS2 22 90.0909091 175.3944966 0 656.0000000 /μL

EOS1 22 11.9545455 7.7917983 2.0000000 30.0000000 %

EOS2 22 2042.18 1471.94 366.0000000 5240.00 /μL

Ba1 22 0.8636364 1.1252705 0 4.00000 %

Ba2 22 150.9545455 199.9660631 0 750.000 /μL

Se1 22 59.1363636 11.2727884 39.0000000 78.0000 %

Se2 22 10509.32 4570.34 5520.00 23736.00 /μL

Li1 22 20.8181818 9.7669821 6.0000000 48.00000 %

Li2 22 3624.32 2134.35 840.0000000 10608.00 /μL

MO1 22 6.7272727 4.0494775 1.0000000 19.0000 %

MO2 22 1142.23 747.0936023 262.0000000 3108.00 /μL


PPT 22 7.6000000 1.4579830 4.6000000 10.00000 g/dL

ALT 22 50.0454545 30.7717825 9.0000000 141.00000 U/L

AST 22 52.8181818 27.7156245 22.0000000 157.00000 U/L

CREATININA 22 1.1863636 0.3931502 0.5000000 2.2000 mg/dL

UREIA 22 34.5909091 15.9303815 10.0000000 70.00000 mg/dL

PT 22 7.3500000 1.6927717 3.8000000 10.00000 g/dL

ALBUMINA 22 3.0863636 0.8724871 1.0000000 4.40000 g/dL

GLOBULINA 22 4.2636364 1.3421892 2.4000000 7.20000 g/dl

GGT 22 6.8181818 5.5689305 1.0000000 20.00000 U/L

FA 22 96.3636364 73.3326053 10.0000000 314.00000 U/L

CK 22 212.7272727 113.7634060 66.0000000 472.00000 U/L

Legenda: VG=Volume Globular; VGM= Volume Globular Médio; HGM= Hemoglobina Globular Média; CHGM= Concentração de Hemoglobina Globular Média; LG= Leucometria Global; Bas=Basófilo; Eos=

Eosinófilo; Se= Segmantado; Li=Linfócito; Mo=monócito; 1= valores relativos; 2=Valores absolutos;

PPT=Proteínas Plasmáticas Totais; ALT=Alaninaminotransferase;AST=Aspartatoaminotransferase;

PT=Proteínas Séricas Totais; GGT= Gamaglutamil transferase; FA=Fosfatase Alcalina; CK=Creatinoquinase.

193

Desses 22 negativos, 11 (50%) de Bambuí, 8 (36,4%) foram do bairro do

Espraiado, 1 (4,5%) de São José do Imbassaí e 2 (9,1%) do Centro.

Esses resultados negativos, quando comparados a população que foi

coletada para o estudo em cada bairro, têm-se as porcentagens variando da mais

baixa em São José e a mais elevada em Bambuí. Esses resultados estão

sumarizados na tabela 69.

Com exceção do bairro de São José, todos os demais apresentaram valores

semelhantes à média geral no município. Isso pode sugerir que esse bairro tenha

maior possibilidade de transmissão de doença por carrapatos, como as observadas

nesse estudo.

Tabela 69: Resultados de cães negativos para Ehrlichia/Anaplasma em cães do município de Maricá/RJ, em 2007.

BAIRROS N0 COLETADOS N0 NEGATIVOS %

BAMBUÍ 67 11 16,4

ESPRAIADO 50 8 16

SÃO JOSÉ 24 1 4,2

CENTRO 14 2 14,3

TOTAL 155 22 14,2

6 CONCLUSÕES

Analisando os resultados descritos e a discussão com outros trabalhos, pode-se

concluir:

- A frequência de Anaplasmataceae na população canina em quatro diferentes

bairros do município de Maricá é elevada (72%), onde a maior foi no bairro de

São José do Imbassaí, seguida pelas respectivas frequências nos bairros do

Centro, Espraiado e Bambuí, ocorrendo em infecções isoladas e associadas.

- É possível identificar, através de evidência morfológica, sorológica e molecular a

presença de co-infecções de Anaplasmataceae, E. canis e A. platys com outros

parasitas como D. immitis, Babesia sp., Hepatozoon sp. e Leishmania sp. e,

existe predomínio de animais sorologicamente positivos em relação aqueles com

evidência de E. canis no sangue.

- O Bairro de Bambuí é mais exposto que os demais bairros estudados à co-infecção

por Ehrlichia sp. e D. immitis e, por isso, à maior variedade de casos de co-

infecção.

- Trombocitopenia é a alteração hematológica mais frequente em cães infectados

com E. canis e naqueles sorologicamente positivos, bem como nos cães

infectados com A. platys e nos co-infectados com E. canis e A. platys.

- Em cães com evidência morfológica, sorológica e molecular de Anaplasmataceae

associados outros parasitas que não são dessa família, a trombocitopenia é mais

acentuada.

- Não é possível traçar um perfil de alterações bioquímicas típico das infecções

observadas, por causa da grande variedade de quadros de associação

parasitária, no município de Maricá. No entanto, é possível concluir que:

- o proteinograma é o que mais se altera.

- a hiperglobulinemia é a alteração mais comum em animais sorologicamente

positivos para Ehrlichia/Anaplasma, co-infectados ou não.

7 PERSPECTIVAS

Os resultados de frequência das infecções e co-infecções reforçam o conceito

do cão como animal sentinela para a circulação destes agentes e de que existe uma

variedade de vetores para diferentes doenças transmitidas por artrópodes nos

bairros estudados. A frequência de cães infectados, encontrada nas regiões

estudadas, mostra que seus habitantes estão expostos a vetores contaminados,

representando risco de infecção. Decorrente dessas observações, sugere-se como

perspectivas:

- Estimulo a implantação de programas de controles de vetores artrópodes no

município de Maricá.

- Como essas bactérias também têm sido caracterizadas em felinos deve-se

sugerir ao grupo de pesquisa Hemoparasitas, que a avaliação realizada em cães,

também ocorra na população felina, para aprofundamento do conhecimento do risco

real, da exposição da população, a esses agentes.

- sugerir à Secretaria Municipal de Saúde o desenvolvimento de um estudo

semelhante na população humana dessa região, principalmente naqueles que

estejam em condições consideradas de maior risco de exposição a essas doenças

transmitidas por carrapatos.

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9 ANEXOS

ANEXO 1 VALORES DE REFERÊNCIA HEMATOLÓGICOS PARA CÃES SEGUNDO JAIN, 1993.

EXAMES (unidade) CANINO

Hemácias (x 106/mm

3) 5,5 – 8,5

Volume Globular (VG) ou Hematócrito (%)

37 – 55

Hemoglobina (g/dl)

12,0 – 18,0

VGM (fl) 60 – 77

CHGM (%) 32 – 36

Leucom glob. (x 103/mm

3)

6,0 – 17,0

Leucometria específica Relativa (%) Absoluta (/mm3)

Basófilos Raros Raros

Eosinófilos

2 - 10 100 - 1250

Mielócitos 0 0

Metamielócitos

0 0

Bastões

0 - 3 0 - 300

Neutrófilos segmentados

60 - 77 3000 - 11500

Linfócitos

12 - 30 1000 - 4800

Monócitos

3 - 10 150 - 1350

Reticulócitos (%)

0 – 1,5

Plaquetometria (x 103/mm

3)

200 - 500

Proteínas plasmáticas (g/dl) 6,0 – 8,0

Fibrinogênio (g/dl) 0,2 – 0,4

VALORES DE REFEÊNCIA BIOQUÍMICOS para cães SEGUNDO KANEKO et al, 1997

Exame (unidade) Valores

PPT g/dL

ALT U/L

AST U/L

CREATININA mg/dL

UREIA mg/dL

PT g/dL 5,4 – 7,1

ALBUMINA g/dL 2,6 – 3,3

GLOBULINA g/dL 2,7 – 4,4

GGT U/L

FA U/L

CK U/L 1,15 – 28,4 10 – 100U/L (thrall); 52 – 368 U/L

(Duncan/Prasse)

PPT=Proteínas Plasmáticas Totais; ALT=Alaninaminotransferase;AST=Aspartatoaminotransferase;

PT=Proteínas Séricas Totais; GGT= Gamaglutamil transferase; FA=Fosfatase Alcalina; CK=Creatinoquinase.

220

ANEXO 2. Ficha do animal

FICHA DO ANIMAL Nº ______

Proprietário:

End:

CEP: Tel:

Nome do animal:

Can Fel Outros

Idade: Sexo: M F

Castrado: Sim Não

Raça: Porte: Pequeno Médio Grande

Vacinado: Veterinário Campanha Não vacinado

Vermifugado: Não Sim Quando?

Pulgas: Sim Não

Carrapatos: Sim Não

Tem alguma doença? Não Sim Qual?

Toma remédio? Não Sim Qual?

Acesso à rua: Nunca Às vezes Sempre

Material coletado: sangue total soro carrapato ponta de orelha

OBS:

221

ANEXO 3. Termo de consentimento

TERMO DE AUTORIZAÇÃO Eu,_____________________________________________________________________________________________ autorizo por meio deste documento a coleta de sangue, do(s) animal(ais)___________________________________________________ de minha propriedade, para fins de pesquisa na Universidade Federal Fluminense, bem como informo estar ciente do anonimato das informações referentes à minha identidade na divulgação dos resultados do presente estudo.

Maricá,_____/______/_________.

_____________________________________________________ Assinatura do(a) proprietário(a) do(s) animal(is)

222

ANEXO 4. Aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa Animal

estudos de hemoparasitos por evidencias morfológica, sorológica e

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