estudo mutacional em pacientes com o complexo da esclerose

I

Luiz Gustavo Dufner de Almeida

Estudo mutacional em pacientes com o

complexo da esclerose tuberosa

SÃO PAULO

2014

II

Luiz Gustavo Dufner de Almeida

Estudo mutacional em pacientes com o

complexo da esclerose tuberosa

Dissertação apresentada ao Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo como

requisito parcial para obtenção do título de Mestre na área de Biologia/Genética

ORIENTADORA: PROFA. DRA. LUCIANA AMARAL HADDAD

SÃO PAULO

2014

Dissertação de Mestrado 2014 Luiz Gustavo D. de Almeida

III

_____________________________________ _____________________________________

Prof(a) Dr(a) Prof(a) Dr(a)

___________________________________

Prof(a) Dr(a) Luciana Amaral Haddad

Orientador(a)

Dufner-Almeida, Luiz Gustavo Estudo mutacional em pacientes com o complexo da esclerose tuberosa 70 páginas Dissertação (Mestrado) - Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo. Departamento de Genética e Biologia Evolutiva. (1) Complexo da esclerose tuberosa, (2) gene TSC1 (3) gene supressor tumoral, (4) mutação nonsense, (5) mutação frameshift Universidade de São Paulo, Instituto de Biociências, Departamento de Genética e Biologia Evolutiva.


IV

Ao meu pai e minha mãe, Luiz Sergio de Almeida e Rosely Christina Dufner de Almeida;

meu irmão, Rafael Augusto Dufner de Almeida; e,

minha querida noiva, Karina Campos Tisovec.


V

“Eu não tenho ídolos. Tenho admiração por trabalho, dedicação e

competência”

Ayrton Senna da Silva


VI

Este trabalho foi realizado com auxílios financeiros da Fundação de

Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo à orientadora (FAPESP Proc.

2011/14329-9) e do Conselho de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível

Superior - Programa de Excelência Acadêmica (CAPES-Proex) ao aluno.


VII

Agradecimentos

À Profa Dra. Luciana Amaral Haddad, agradeço pela paciência, orientação, incentivo e

por suportar minha ansiedade e gênio forte durante esses dois anos de convívio e

aprendizado.

Ao Prof. Sérgio Rosemberg, Dra. Juliana Paula e equipe, agradeço por receberem os

pacientes com TSC, assim com pela coleta das amostras de sangue e por estarem sempre

disponíveis para discussão sobre os pacientes. Agradeço também ao Prof. Sérgio Antoniuk, por

no enviar as amostras de sangue de pacientes atendidos no Hospital Universitário da

Universidade Federal do Paraná.

Agradeço também à Profa. Dra. Regina Migroni Netto, por permitir a utilização das

dependências de seu laboratório, reagentes e termocicladores, sem os quais não seria possível

realizar este projeto. Agradeço à Profa. Dra. Ângela Maria Viana Morgante, por disponibilizar

as dependências de seu laboratório, assim como a inestimável ajuda da Fátima Kely ao

acompanhar-me durante minha adaptação no departamento. Ao Prof. Dr. Paulo Otto agradeço

por todas as suas piadas e histórias que me divertiram por diversas vezes.

Ao Centro de Estudos do Genoma Humano IB-USP, em especial à técnica Meire

Aguena, por disponibilizarem reagentes e máquinas necessárias para as etapas de

sequenciamento.Assim como à Maria Teresa Auricchio e à Dra. Lilian Kimura, as quais eram as

primeiras pessoas que eu recorria quando algo de errado acontecia.

Agradeço à Juliana Corrêa, Fernando Velloso, Marcelo Valpeteris e Ana Batissoco por

me acolherem no laboratório. À Isabella Yacar, agradeço pelas discussões de nossos projetos.

Ao Leandro Ucela Alves, agradeço pelas conversas sobre protocolos e PCRs que teimavam em

não amplificar. Ao Adriano Bonaldi, pelos brain storms corriqueiros nas horas do “lanchinho”

da tarde os quais podíamos divagar sobre nossos projetos. Ao Renan Barbosa Leme, “meu

melhor amigo da salinha”, por tornar a sala 341 um pouco mais acolhedora e menos gélida e

por sempre compartilhar comigo seus gráfico que só ele e o Prof. Dr. Paulo Otto


VIII

compreendem. À sua namorada, Juliana Emilia Carnavalli, pelo seu bolinho de limão a os chás

pontuais às 16 horas.

Em especial, agradeço ao meu pai, mãe, irmão e noiva, os quais aguentaram meus

nervos à flor da pele, por fingirem entender os assuntos sobre o meu projeto durante a janta,

mas principalmente por me incentivarem e me apoiarem em todos os momentos durante

esses dois anos.

À minha falecida tia Monika, dedico essa minha dissertação, pela garra e alegria

durante toda sua vida e que ficarão sempre marcados em minha memória.


IX

Lista de Acrônimos

4E-BP1: 4E proteína ligante 1

Akt: proteína cinase B

AML: angiomiolipomas

AMPK: proteína cinase da subunidade

catalítica α 1, AMP-ativada

ANVISA: Agência Nacional de Vigilância

Sanitária

ENCODE: enciclopédia de elementos

regulatórios do DNA

eIF4E: fator de iniciação de transcrição 4E

HSC-SP: Hopital Santa Casas - SP

HU-UFPR: Hospital Universitário - UFPR

FOX: forkhead box

Kb: kilobases

GAP3: proteína ativadora da rap1 GTPase

LAM: linfangioleiomiomatose pulmonar

MLPA: amplificação multiplex de sondas

dependente de ligação

MMPH: hiperplasia multifocal

micronodular de pneumócito do tipo II

mTOR: álvo de rapamicina em mamíferos

mTOR-raptor: complexo mTORC1

mTOR–rictor: complexo mTORC2

NMI: mutações não identificadas

ORF: código aberto de leitura

p27kip1: inibidor de cinase dependente de

ciclina 1B

pb: pares de bases

PCR: reação em cadeia da polimerase

PDK1: cinase piruvato desidrogenase,

isozima 1

PECs: células epitelioides perivasculares

PEComas: neoplasias de células

epitelioides perivasculares

PI3K: cinase fosfatidilinosito-4,5-bisfosfato

3

PKD1: gene 1 da doença renal policística

PKD: doença de policistos renais

Rheb: homólogo de Ras enriquecido no

cérebro

S6K: proteína cinase ribosomal S6

SEGA: astrocitomas subependimários de

células gigantes

SEN: nódulos subependimários

S-LAM: LAM esporádico

SC35: fator de splicing rico em

serina/arginina 2

SF2/ASF: fator de splicing SF2/fator

alternative de splicing

SRp40: fator de splicing rico em

serina/arginina 5

TBC1D7: membro 7 da família dos

domínios TBC1

TSC1: gene 1 da esclerose tuberosa

TSC2: gene 2 da esclerose tuberosa

TSC: complexo da esclerose tuberosa

TSC-LAM: LAM associados à TSC


X

Índice de Figuras

Figura 1: Representação esquemática do gene TSC1.. ................................................................. 6

Figura 2: Mapa de elementos em cis reguladores. ....................................................................... 7

Figura 3: Representação esquemática do gene TSC2 ................................................................... 8

Figura 4: Ilustração da hipótese de Knudson para genes supressores de tumor. ........................ 9

Figura 5: Cascata de sinalização da via do mTOR Complexo TSC1/TSC2 (hamartina/tuberina). 23

Figura 6: Cromatogramas referentes às mutações do tipo nonsense. ....................................... 37

Figura 7: Mutações identificadas na sequência do gene TSC1 que causam deslocamento de

fase de leitura .............................................................................................................. 38

Figura 8: Predição de estrutura coiled-coil segundo a ferramenta COIL-ExPASy. ...................... 40

Figura 9: Representação gráfica do resultado da análise in silico realizada com a ferramenta

Acescan2/Rescue ......................................................................................................... 46


Human Splicing Finder. ................................................................................................ 47


ESEFinder. .................................................................................................................... 48


SpliceAid....................................................................................................................... 49

Figura 13: Representação gráfica dos resultados das análises in silico realizadas com a

ferramenta ESR Search. ............................................................................................... 50

Figura 14: As variantes de DNA do gene TSC1 identificadas a 5’ do promotor basal. ................ 51

Figura 15: Distribuição das sete mutações patogênicas identificadas no gene TSC1. ................ 59


XI

Índice de Tabelas

Tabela 1: Primeiros casos clínicos relatados com sinais do TSC nas décadas de 1860 a 1880. .. 11

Tabela 2: Critérios revistos para o diagnóstico de TSC de acordo com a Conferência

Internacional para Consenso do Complexo da Esclerose Tuberosa (Modificado de

Northrup et al., 2013). ................................................................................................. 21

Tabela 3: Lista de sequências de oligonucleotídeos* utilizados nas reações de PCR do gene

TSC1. ............................................................................................................................ 29

Tabela 4: Lista de sequências de oligonucleotídeos* adicionais utilizados nas reações de

sequenciamento do gene TSC1. ................................................................................... 32

Tabela 5: Extensão de sequências exônicas e intrônicas sequenciadas para cada paciente* ... 33

Tabela 6: Dados clínicos e genotípicos disponíveis sobre os 28 pacientes analisados. .............. 41

Tabela 7: Variantes missense identificadas nos éxons 10, 14 e 15 do gene TSC1. ..................... 42

Tabela 8: Variantes sinônimas, identificadas nos éxons 14, 22 e 23 do gene TSC1. .................. 43

Tabela 9: Variantes intrônicas correspondentes a polimorfismos de DNA no gene TSC1. ........ 44

Tabela 10: Variantes de DNA inconclusivas, identificadas a 5’ do promotor basal e no éxon 2 do

gene TSC1. .................................................................................................................... 45

Tabela 11: Variantes de DNA depositadas no banco de dados LOVD até maio/2014,

consideradas patogênicas ou não. .............................................................................. 58


XII

Sumário

I. Resumo ............................................................................................................................... 1 II. Abstract ............................................................................................................................... 3 III. Introdução ........................................................................................................................... 5

A. Aspectos genéticos do TSC .......................................................................................... 5 B. Aspectos clínicos sobre o TSC ................................................................................... 10

1. Transtorno do desenvolvimento neuronal .......................................................... 11 2. PEComas ............................................................................................................... 15 3. Lesões de Pele ...................................................................................................... 17 4. Rabdomiomas cardíacos ...................................................................................... 18 5. Hiperplasias de células epiteliais ......................................................................... 18 6. Diagnóstico de TSC ............................................................................................... 19

C. Produtos da expressão dos genes TSC1 e TSC2 ........................................................ 21 IV. Objetivos ........................................................................................................................... 26 V. Pacientes e Métodos ......................................................................................................... 27

A. Pacientes ................................................................................................................... 27 B. Métodos .................................................................................................................... 28

1. Extração de DNA .................................................................................................. 28 2. Quantificação de DNA genômico ......................................................................... 28 3. Oligodesoxirribonucleotídeos .............................................................................. 29 4. Reação em cadeia da polimerase......................................................................... 30 5. Eletroforese em gel de agarose a 1% ................................................................... 31 6. Purificação com Exonuclease I (Exo) e Shrimp Alkaline Phosphatase (Sap) ........ 31 7. Sequenciamento Sanger de DNA ......................................................................... 31 8. Nomenclatura das variantes no gene TSC1 ......................................................... 33 9. Análise in silico de patogenicidade e frequência das variantes ........................... 34

VI. Resultados ......................................................................................................................... 36 A. Mutações patogênicas .............................................................................................. 36

1. Mutações patogênicas do tipo nonsense ............................................................. 36 2. Mutações patogênicas do tipo frameshift ........................................................... 37

B. Polimorfismos de DNA no gene TSC1 ........................................................................ 40 1. Variantes exônicas ............................................................................................... 40

a) Variantes exônicas do tipo missense. ...............................................................40 b) Variantes exônicas do tipo nonsense. ...............................................................43

2. Variantes intrônicas ............................................................................................. 43 C. Variantes de DNA inconclusivas ................................................................................ 45

1. Variante exônica inconclusiva .............................................................................. 46 2. Variantes inconclusivas a 5’ do promotor basal do gene TSC1 ............................ 50

D. Segmento gênico em homozigose ............................................................................ 51 VII. Discussão ........................................................................................................................... 53 VIII. Conclusões ........................................................................................................................ 62 IX. Referências Bibliográficas ................................................................................................. 63


1

I. Resumo

O complexo da esclerose tuberosa (TSC) é um transtorno genético, sistêmico, com

expressividade variável e herança autossômica dominante. Clinicamente manifesta-se devido

ao desenvolvimento de hamartomas e hamártias em diferentes tecidos, principalmente no

cérebro, rins, coração, pele e pulmões, podendo causar disfunção do órgão. Mutação em um

de dois genes supressores tumorais, TSC1 ou TSC2, são responsáveis pelo TSC. Os genes TSC1 e

TSC2 codificam para hamartina e tuberina, respectivamente. Ambas as proteínas interagem

fisicamente formando um complexo citosólico que inibe mTOR (mammalian target of

rapamycin). Testes moleculares para TSC1 e TSC2 são úteis para auxiliar no diagnóstico de

casos clínicos difíceis, em aconselhamento genético e estudos de associação genótipo-

fenotípica, além de permitirem a caracterização molecular de mecanismos patogenéticos da

formação dos hamartomas e análises funcionais de seus produtos gênicos. Apesar de o

diagnóstico de TSC ser basicamente clínico, a partir da revisão de seus critérios em 2012 por

um grupo de especialistas, o achado de uma mutação em TSC1 ou TSC2 passou a ser

considerado suficiente para o diagnóstico definitivo da doença.

O estudo apresentado aqui é parte de um projeto em andamento para estabelecer

condições ao desenvolvimento de análise de mutações causadoras de TSC nos genes TSC1 e

TSC2. Nosso objetivo neste trabalho foi avaliar por sequenciamento de Sanger o DNA

genômico de 28 pacientes brasileiros com diagnóstico definitivo de TSC, procedentes dos

estados de São Paulo ou Paraná, tendo como alvo a sequência codificadora do gene TSC1,

parte de seus segmentos intrônicos, o promotor basal, bem como o segmento imediatamente

a 5’ deste. Sete pacientes (25%) apresentaram mutações de sentido trocado (nonsense) ou

com deslocamento da leitura à tradução (frameshift) no gene TSC1. Entre 31 outras variantes

de DNA encontradas, 23 são polimorfismos conhecidos e oito apresentaram frequência

inferior a 1%, como verificado in silico entre mais de mil sequências de genomas humanos.


2

Entre essas oito variantes de DNA novas ou raras, quatro foram detectadas em pacientes para

os quais uma mutação patogênica havia sido identificada e, por isso, foram reclassificadas

como polimorfismos. Duas e uma variantes de DNA do mesmo paciente flanqueavam um sítio

de ligação em potencial para um fator de transcrição específico, a 5’ do promotor basal de

TSC1. Por fim, uma nova variante de DNA na região não codificadora do éxon 2 do gene TSC1

foi predita com potencial para alterar um elemento candidato a acentuador de splicing. Em

resumo, como observado em estudos anteriores, descrevemos aqui 25% dos pacientes com

TSC apresentando mutações patogênicas na sequência codificadora do gene TSC1. Nossos

dados mostraram quatro novas variantes de DNA em regiões potencialmente reguladoras da

expressão do gene TSC1, que podem revelar-se como mutações patogênicas e, portanto,

necessitam ser testadas experimentalmente.


3

II. Abstract

Tuberous sclerosis complex (TSC) is a multisystem disorder, with variable expression

and autosomal dominant inheritance. Clinically it is due to hamartia and hamartoma

development in different tissues, notably in the brain, kidneys, heart, skin and lungs, causing

organ dysfunction. Mutations in either tumor suppressor gene, TSC1 or TSC2, are responsible

for TSC. TSC1 and TSC2 genes code for hamartin and tuberin, respectively. Both proteins

physically interact forming a cytosolic complex that inhibits the mammalian target of

rapamycin (mTOR). TSC1 and TSC2 molecular testing has been useful in diagnosing clinically

challenging cases, in genetic counseling and genotype/phenotype association studies, besides

evaluation of the molecular basis of hamartoma formation and functional analyses of both

gene products. Although TSC diagnosis is basically clinical, since the 2012 specialist panel

review the finding of a TSC1 or TSC2 mutation has been considered sufficient for the definite

diagnosis of the disease. The results presented here are part of an ongoing project to establish

conditions for TSC1 and TSC2 mutation studies. Our first aim is to evaluate by Sanger

sequencing TSC1 coding sequence, and an average of 132 base pairs of intronic regions next to

exon boundaries from TSC patients, in addition to the gene core promoter. We present

preliminary results of a sample of 28 patients with definite TSC diagnosis, from São Paulo and

Paraná states. Seven patients (25%) displayed TSC1 nonsense or frameshift mutations. Among

31 other DNA variants identified, 23 were known polymorphisms, and eight had frequencies

below 1% as verified in silico among more than a thousand human genomes. Out of eight novel

or rare DNA variants, four were detected in patients for whom a pathogenic mutation had

been found. Two and one additional DNA point variants from the same patient flanked a

putative transcription factor binding site. Finally, a novel DNA variant residing in the TSC1

noncoding exon 2 was predicted to change the sequence potential to behave as a splicing

enhancer. In summary, similar to previous studies, we describe 25% of TSC patients with

mutations in the TSC1 coding sequence. Differently from other reports, our data disclose four


4

novel DNA variants in TSC1 potentially regulatory regions that are likely to unravel novel

pathogenic mutations, and thus need to be experimentally tested.


5

III. Introdução

O complexo da esclerose tuberosa (TSC, do inglês, tuberous sclerosis complex) é um

transtorno clínico, sistêmico, podendo afetar qualquer órgão, embora mais comumente o

cérebro, coração, rins, pulmões, retinas e pele. Tem incidência estimada entre 1:6.000 e

1:10.000 nascidos vivos, sem viés de ocorrência étnica (Sampson et al., 1989; O'Callaghan et

al., 1998; Au et al., 2007).

O TSC é caracterizado pelo desenvolvimento de lesões tumorais, benignas, de forma

geral classificadas em dois tipos. Os hamartomas são o principal tipo de lesão, consistindo de

tumores benignos de crescimento lento, contendo células que normalmente ocorrem no

tecido de origem, mas que se dispõe de modo desorganizado e sem nenhum elemento

predominante. Comumente, as células do hamartoma têm características pouco diferenciadas

e apresentam-se maiores do que o esperado, sugerindo que as lesões sejam oriundas de

células progenitoras ou multipotentes e que exista descontrole do crescimento celular. O

outro tipo de lesão são as hamártias, as quais são caracterizadas por lesões circunscritas de

células displásicas, desalinhadas e sem proliferação (Kit-Sing et al., 1998; Young et al., 1998).

O desenvolvimento de neoplasias e metástases é incomum, embora possam ocorrer

em órgãos específicos (van Slegtenhorst et al., 1997; Telfeian et al., 2004). Em geral, cada tipo

de lesão parece afetar especificamente um órgão e tende a se manifestar em janelas

específicas do período do desenvolvimento pré ou pós-natal.

As manifestações clínicas ocorrem, em geral, em virtude da disfunção do órgão por

ruptura da microarquitetura do tecido ou por fenômenos compressivos ou vasculares.

A. Aspectos genéticos do TSC

O TSC é uma doença genética, com herança autossômica dominante, penetrância

elevada e expressividade variável (Hunt & Lindenbaum, 1984; Gomez, 1988; Northrup et al.,


6

1993). É causado por mutações em um de dois genes supressores tumorais, TSC1 ou TSC2 (van

Slegtenhorst et al., 1997; Grajkowska et al., 2010).

O gene TSC1 humano, localizado em 9q34.1, apresenta aproximadamente 55 kilobases

(kb). Contendo 23 éxons, somente os últimos 21 são codificadores para a proteína hamartina,

com massa esperada de 130 kDa (Figura 1). Logo, o códon de início da tradução localiza-se no

éxon 3 (van Slegtenhorst et al., 1997). A região 5’ não traduzida (5’-UTR), contendo 181 pb no

RNAm, é expressa pelos éxons 1, 2 e parte do 3. O último éxon (23) é longo (5407 Kb),

apresenta 520 pb da parte 3’ da sequência codificadora e 4887 pb de região 3’ não traduzida

(3’-UTR) para o RNAm. O gene é expresso em um transcrito maduro de 8,6 kb e sequência

codificadora com 3,4 kb (van Slegtenhorst et al., 1997).

Figura 1: Representação esquemática do gene TSC1. O comprimento dos éxons (barras verticais alaranjadas), assim como dos íntrons (barras horizontais pretas), encontra-se em escala. Os números abaixo de cada barra correspondem ao número de cada éxon. As regiões codificadas dos éxons 9 a 14 codificam para um domínio da hamartina que interage com a tuberina, produto da expressão do gene TSC2. Uma região coiled-coil é traduzida pela sequência codificadora entre os éxons 17 a 23.

TSC1 é um gene com disposição antissenso (fita-código na fita minus) no mapa de

referência do cromossomo 9 humano. O promotor basal, por definição, compreende cerca de

50 pb a 5’ (-50) do sítio de início da transcrição (+1) até aproximadamente 50 pb a 3’ deste

(+50), já parte do éxon 1. De acordo com o banco de dados SwissRegulon estabelecido na

Universidade de Basel, na Suíça (http://www.swissregulon.unibas.ch), que apresenta sítios

regulatórios para a versão hg19 do genoma humano, observam-se dois segmentos

enriquecidos em elementos em cis com potencial para serem reconhecidos por fatores

transcricionais específicos, um a 5’ e outro a 3’ (éxon 1) do promotor basal (Figura 2).


7

Figura 2: Mapa de elementos em cis reguladores transcricionais em potencial na porção 5’ do gene TSC1 e segmento 5’ a este, no cromossomo 9 humano. Informações são de acordo com o disponível para o genoma humano (hg19) no SwissRegulon estabelecido na Universidade de Basel, na Suíça (http://swissregulon.unibas.ch). É apresentado segmento de 2kb, compreendendo a porção 5’ do gene TSC1 (cerca de 1 kb, sequência não mostrada) e segmento a 5’, disposto na parte direita da Figura, uma vez que a fita-código do gene fica antissenso (fita -) no mapa de referência do cromossomo 9 humano. A numeração do segmento genômico (superior) refere-se à sua posição no cromossomo 9. Seta indica sentido da transcrição do gene a partir do sítio de início (círculo escuro). O diagrama em lilás apresenta o primeiro éxon do TSC1 (éxon 1) em caixa, seguido do íntron 1 transcrito, em linha. Pequenas caixas vermelhas ou róseas indicam sítios em potencial para reconhecimento por fatores transcricionais específicos indicados por acrônimos, embora não tenham sido testados experimentalmente. Intensidade da cor indica proporcionalmente maior similaridade à sequência-consenso para o dado fator de transcrição. Dados desse banco foram obtidos por uma combinação de informações a partir de demonstração experimental de motivos para fatores transcricionais na literatura científica, especificidades bem estabelecidas para fatores transcricionais conhecidos, dados de imunoprecipitação de cromatina e alinhamentos de segmentos não codificadores entre genes ortólogos.

O gene TSC2 humano, localizado em 16p13.3, tem cerca de 40kb ao longo de 41 éxons

e 41 íntrons (Figura 3). O gene TSC2 é expresso em um RNAm de 5,5 kb, o qual, embora longo,

apresenta uma organização econômica, com 5,4 kb compondo a sequência codificadora para a

proteína tuberina, com 180 kDa. O códon de início da tradução encontra-se no éxon 1 e o

códon de parada da tradução está no éxon 41 (Consortium, 1993; van Slegtenhorst et al.,

1997; Jones et al., 1999; Dabora et al., 2001; Sancak et al., 2005; Au et al., 2007)


8

Figura 3: Representação esquemática do gene TSC2. O comprimento dos éxons (barras verticais alaranjadas), assim como dos íntrons (barras horizontais pretas), encontra-se em escala. Os números abaixo de cada barra correspondem ao número de cada éxon. As regiões codificadas pelos éxons 1 a 11 traduzem para o domínio da tuberina de interação com a hamartina, produto da expressão do gene TSC1; os éxons 9 e 10 codificam para uma curta região coiled-coil. O domínio de ativação GTPásica (GAP) é traduzido pelas regiões codificadas pelos éxons 34 a 39, como indicado.

Dois terços dos indivíduos com diagnóstico clínico de TSC apresentam mutação de

novo, ou seja, representam casos esporádicos, enquanto 1/3 dos casos é familial (Niida et al.,

1999; Dabora et al., 2001; Sancak et al., 2005; Au et al., 2007). Casos esporádicos têm mais

mutações em TSC2 do que em TSC1, em uma razão de 3:1 a 4:1 (Jones et al., 1997). De modo

geral, em casos esporádicos, mutações em TSC2 podem associar-se a um fenótipo mais grave

do que mutações em TSC1 (Young et al., 1998; Crino, 2013). Não se observa diferença de

frequência de mutações em TSC1 versus em TSC2 em casos familiais de TSC. Nestes, não se

encontraram diferenças de gravidade relacionadas aos genes (Jones et al., 1999; Dabora et al.,

2001; Sancak et al., 2005).

Entre 10% e 15% dos pacientes diagnosticados com TSC não apresenta mutações

identificadas nos genes TSC1 ou TSC2, constituindo o grupo NMI (do inglês, no-mutation

identified) (Camposano et al., 2009; Qin et al., 2010). Qin et al., 2010 utilizaram

sequenciamento massivo, em paralelo de DNA de 33 pacientes NMI e relataram somente 6%

(2/33) de mosaicismo. Outro estudo recente, utilizando técnicas similares para

sequenciamento de todos os éxons e a grande maioria intrônica de ambos os genes, não

identificou mutações em 18% dos pacientes (Tyburczy et al., 2013). Desse modo, estudos


9

indicam que pelo menos 10% dos pacientes com TSC permanecem sem mutação identificada

por diferentes abordagens de sequenciamento de DNA.

Classificados como genes supressores de tumor, espera-se inativação bialélica dos

genes TSC1 ou TSC2 para o desenvolvimento de hamartomas e hamártias e manifestação do

TSC. Desta forma, um segundo evento mutacional deve ocorrer, causando inativação bialélica

de um ou outro gene. Assim, além da mutação germinativa, a qual pode ser detectada em DNA

de leucócitos dos pacientes, o segundo evento mutacional deve ser somático e necessário ao

desenvolvimento clonal dos tumores, de acordo com a hipótese desenvolvida por Knudson

para genes supressores tumorais (Figura 4, Knudson, 1971).

Figura 4: Ilustração da hipótese de Knudson para genes supressores de tumor. À esquerda da figura, estão ilustradas duas células com taxas de proliferação e crescimento normais. A célula da extrema esquerda apresenta um par de cromossomos homólogos (barras verticais alaranjadas), cada um com um alelo tipo-selvagem (retângulos azulados) de um gene hipotético. A célula logo à direita da primeira representa uma célula com um cromossomo contendo um alelo mutado (retângulo branco), embora seu fenótipo seja o mesmo que o da primeira. Esta célula pode representar qualquer célula somática de indivíduo que herdou a mutação em um caso familial ou ser de indivíduo que representa o primeiro caso na família, porque foi gerado por gameta que apresentava uma mutação nova ou, ainda, esta ocorreu bem no início do desenvolvimento pós-zigótico. Diante de um segundo evento mutacional, que deve ocorrer em células somáticas, a célula passará a ter inativação bialélica, constituindo um clone celular e ocasionando um fenótipo celular alterado, que dependerá da função do gene supressor de tumor inativado. Esse fenótipo pode incluir alteração de índices de proliferação celular, autossuficiência de crescimento com insensibilidade aos sinais de controle do crescimento celular, perda de capacidade de adesão ao substrato, com potencial para invasão tissular, angiogênese sustentada, etc. No caso de inativação bialélica dos genes TSC1 ou TSC2, alterações discretas do índice de proliferação celular, da adesão e do crescimento celular são observados (Au et al., 2004).

A observação no tecido tumoral de perda de heterozigose de marcadores polimórficos

ligados aos genes TSC1 ou TSC2 infere que o segundo evento mutacional causando hamartoma

em paciente com TSC seja deleção ou rearranjo genômico, respectivamente em 9q34.1 ou


10

16p13.3 (Jones et al., 1997; Choy et al., 1999; Jones et al., 1999; van den Ouweland et al.,

2011). Perda de heterozigose foi demonstrada mais frequentemente para hamartomas do que

hamártias de TSC (Au et al., 2004; Crino et al., 2010; Campos et al., 2013). Outros estudos

relatam mutações de ponto como a mutação somática em hamartomas de pele desses

pacientes (Tyburczy et al., 2013), o que não seria observado por métodos indiretos como

perda de heterozigose. A limitação de demonstração da mutação somática em hamártia

cerebral de pacientes com TSC, seja por método direto ou indireto, sugere haploinsuficiência

da mutação germinativa (Niida et al., 2001; Wei et al., 2010). Contudo, neste cenário, outros

fatores, desconhecidos devem ser necessários à patogênese da hamártia, uma vez que se

observa grande variabilidade fenotípica, morfológica e funcional (Curatolo, 2003).

B. Aspectos clínicos sobre o TSC

O TSC foi descrito há aproximadamente 150 anos por Friedrick D. von Recklinghausen

(1862) em um paciente recém-nascido, que apresentava tumores cardíacos e malformações da

superfície cerebral. Em 1864, Rudolph Virchow relatou um caso clínico semelhante em um

menino. Foi somente no ano de 1880 que o médico francês, Désiré Magloire Bourneville,

cunhou o nome da doença a partir da autópsia de um paciente com malformações cerebrais,

corticais, com morfologia semelhante a tubérculos e de consistência mais firme que o

parênquima adjacente, denominando esclerose das circunvoluções cerebrais. Este paciente

apresentava epilepsia, além de lesões faciais de pele e renais (Bourneville, 1880; Gomez et al.,

1999; Jansen et al., 2004) (Tabela 1).

Se analisarmos estes e outros quatro casos clínicos descritos até 1890 (Tabela 1),

podemos observar que (i) o TSC é um transtorno sistêmico pois pode afetar cérebro, pele,

coração e rins; (ii) é um complexo porque pode apresentar-se como combinação variável de

sinais, nem sempre presentes em todos os pacientes; e (iii) as tuberosidades corticais são a

lesão mais comumente presente nos pacientes com TSC. Uma vez que o sistema nervoso e a


11

pele são geralmente afetados por essas lesões, o TSC é também classificado como síndrome

neuro-cutânea ou facomatose (do grego, phakos, mancha) (McCall et al., 2006).

Tabela 1: Primeiros casos clínicos relatados com sinais do TSC nas décadas de 1860 a 1880.

Tu

mo

res c

ard

íaco

s

Tu

be

rosid

ad

es

co

rtic

ais

Nó

du

los

pe

riven

tric

ula

res

An

gio

fib

rom

a

Pla

cas f

ibró

ticas

Le

sõ

es r

en

ais

Friedrick D. von Recklinghausen 1862 √ √

Rudolph Virchow 1864 √ √

Désiré Magloire Bourneville 1880 √ √ √

Hartdegen 1881 √ √

Bourneville e Brissaud 1881 √ √ √ √

François H. Hallopeau e Émile Leredde 1885 √ √

John J. Pringle 1890 √ √ √

: Sinal observado

Apesar de serem vários e diferentes os tipos de lesões histológicas que podem ocorrer

no TSC, podemos classificá-los em cinco grandes grupos de acordo com a patogênese e célula

de origem da lesão: (1) lesões que levam a transtorno do desenvolvimento neuronal; (2)

neoplasias de células epitelioides perivasculares; (3) lesões de pele; (4) rabdomioma cardíaco;

e (5) as hiperplasias de células epiteliais.

1. Transtorno do desenvolvimento neuronal

No sistema nervoso central, o TSC manifesta-se como um transtorno do

desenvolvimento neuronal, devido a quatro tipos de lesões: (i) os nódulos subependimários

(SEN), (ii) os astrocitomas subependimários de células gigantes (SEGA), (iii) as tuberosidades

corticais e (iv) as heterotopias neuronais. Estas lesões são avaliadas no paciente

principalmente por ressonância nuclear magnética do crânio e análises anatomo-patológicas

de peças cirúrgicas ou estudos postmortem (revisto por Ouyang et al., 2014).

SENs são hamartomas geralmente assintomáticos, observados em cerca de 80% dos

pacientes com TSC (Houser & Gomez, 1992). Apresentam-se como lesão com até 5 mm de


12

diâmetro, arredondada ou ovoide, na camada subependimária dos ventrículos laterais

cerebrais projetando-se à sua cavidade, com superfície lisa, firme e endurecida, devido à

calcificação frequente. São revestidos pelo epitélio do epêndima, de forma relativamente

intacta e não são infiltrativos. Células gigantes, com núcleos numerosos, convolutos e grandes

tendem a ser observadas no interior do nódulo. São lesões muito vascularizadas, cujos vasos

apresentam tendência à hialinização (Trombley & Mirra, 1981; Scheithauer & Reagan, 1999).

Hemorragia e necrose internas ao SEN são eventos raros e próprios de nódulos maiores. Em

5% a 15% dos pacientes com TSC, SENs podem evoluir a SEGAs, sobretudo nas duas primeiras

década de vida, uma hipótese sustentada pelo acompanhamento dos exames de imagem,

semelhanças histológicas entre esses hamartomas e sua localização encefálica (Roach &

Sparagana, 2004; Grajkowska et al., 2010).

A maioria de SEGAs apresenta-se como uma massa solitária, discreta, maior que 5 mm

de diâmetro e localização próxima ao forame de Monro. SENs e SEGAs são hamartomas

formados por astrócitos displásicos e células neuronais (Gomez et al., 1999; Jozwiak et al.,

2005). Apesar de muitas discussões sobre suas origens (Davidson et al., 1991; Johnson et al.,

1991) e embora classificados como astrocitomas, hoje se sabe que devido à composição

neuro-glial de SEGAs devem ser classificados como tumores de origem mista (Buccoliero et al.,

2009). Esta composição sugere que SEN e SEGA devem originar de progenitores neurogliais da

zona subventricular do cérebro (Crino, 2013). Apesar de SEGA ser um tumor classificado como

grau I (Organização Mundial da Saúde), ele mantém um ritmo de crescimento lento, em torno

de 2 mm ao ano. Este crescimento e sua localização podem contribuir à hidrocefalia e um

quadro agudo de hipertensão intracraniana, por fenômenos obstrutivos. A calcificação e

hialinização vasculares contribuem à ocorrência rara de hemorragia intramural. A calcificação

do estroma é mais comum em SEN do que em SEGA (Huttenlocher & Wollmann, 1991;

Shepherd et al., 1991; Stefansson, 1991; Scheithauer & Reagan, 1999).


13

As tuberosidades corticais, também denominadas túberes corticais, são lesões

presentes ao nascimento na maioria de pacientes com TSC. Entretanto, a sua observação pela

técnica de ressonância nuclear magnética pode ser prejudicada nos primeiros dois anos de

vida, período necessário à mielinização, que aumenta o contraste para identificação dessas

lesões (Houser & Gomez, 1992; Shepherd et al., 1995). Consistem do alargamento dos giros da

superfície cerebral, de forma circunscrita no parênquima cerebral, cortical ou subcortical,

sendo mais firmes do que o parênquima adjacente; por isso, o termo esclerose denominando a

doença. Sua leve protrusão no parênquima cerebral cria aspecto semelhante a tubérculos

(tuberosidade). São displasias e, uma vez que são compostas por células não proliferativas, as

tuberosidades corticais são classificadas como hamártias (Huttenlocher & Wollmann, 1991;

Scheithauer & Reagan, 1999).

As heterotopias neuronais são hamártias resultantes de um dissincronismo na

migração neuronal ao longo das fibras da glia radial (Roach & Sparagana, 2004). Apresentam-

se na forma de linhas de migração radial da substância branca, possivelmente formadas por

grupos de corpos de neurônios pós-mitóticos que não concluíram o processo migratório radial

(Northrup et al., 2013; van Eeghen et al., 2013).

As tuberosidades corticais e as heterotopias neuronais estão associadas à epilepsia,

com crises convulsivas de variados tipos e refratárias à medicação anti-convulsivante. A elas,

podem associar-se deficiência intelectual, autismo e outros tipos de transtornos do

comportamento. Em parte dos pacientes com idade inferior a dois anos, as crises convulsivas

manifestam-se sob a forma de espasmos infantis que não apresentam resultados plenamente

satisfatórios em resposta à terapia medicamentosa (Chiron et al., 1997; Hancock & Osborne,

1998; Curatolo et al., 2001; Thiele, 2004; Adriaensen et al., 2009). A maior parte dos pacientes

com espasmos infantis evoluirá com crises convulsivas de outros tipos (Chu-Shore et al., 2010).

Muitos desses pacientes são submetidos à ressecção cirúrgica da tuberosidade em foco de

atividade eletroencefalográfica, o que pode ou não levar a algum sucesso terapêutico (Parain


14

et al., 2001; Weiner et al., 2004). Por outro lado, a falta de controle terapêutico da epilepsia

nos primeiros cinco anos de vida (60–90% do pacientes com TSC - Orlova & Crino, 2010) parece

relacionar-se posteriormente com a gravidade da deficiência intelectual (Joinson et al., 2003;

Humphrey et al., 2004). Embora não se tenha estabelecido de maneira convincente uma

correspondência entre o número e localização de tuberosidades corticais e a gravidade clínica,

aqueles pacientes com distribuição temporal dessas lesões parecem associar-se

frequentemente aos quadros mais graves de epilepsia e autismo (Goodman et al., 1997;

Hosoyaa et al., 1999; Holmes et al., 2007). A ausência de manifestações clínicas decorrentes

das tuberosidades corticais nos primeiros cinco anos de vida está relacionada à melhor função

cognitiva e social nesta e nas fases sucessivas do desenvolvimento (Joinson et al., 2003;

Humphrey et al., 2004).

A localização dessas quatro lesões encefálicas, as quais são comumente observadas em

um mesmo paciente com TSC, sugere que tenham uma origem comum. SEN e SEGA

apresentam características de proliferação e crescimento celulares deficientes, originando-se

potencialmente de células progenitoras da zona subventricular, após o período de

corticogênese, a partir de quando se espera a segunda mutação em TSC1 ou TSC2, somática.

Nesta fase do desenvolvimento embrionário (final do primeiro e segundo terços da gestação),

neurônios pós-mitóticos, gerados de progenitores neuro-gliais – as células que permanecem

até o adulto como tal e provavelmente darão origem a SENs e SEGAs – iniciam sua migração

para a formação das seis camadas cortico-cerebrais. Aqueles neurônios possivelmente com

disfunções em processos de adesão celular (Lamb et al., 2000; Goncharova et al., 2004),

necessário à migração, poderão se acumular, formando heterotopias neuronais. Neurônios

que atingirão as camadas corticais poderão não ter dendritos apropriadamente arborizados,

sendo deficientes em sinaptogênese, formando as tuberosidades corticais (Johnson et al.,

1991; Mizuguchi & Takashima, 2001; Nishio et al., 2001; Crino, 2013).


15

2. PEComas

A Organização Mundial da Saúde define as neoplasias de células epitelioides (PECs)

perivasculares (PEComas, do inglês perivascular epithelioid cell neoplasms) como tumores

mesenquimais compostos histologica e imunoistoquimicamente de células epitelióides,

perivasculares, distintas. A família dos tumores do tipo PEComa é diversa. Em pacientes com

TSC, PEComas ocorrem na forma de angiomiolipomas (AML) e linfangioleiomiomatose

pulmonar (LAM) (Martignoni et al., 2008; Folpe & Kwiatkowski, 2010).

PECs são caracterizadas pela sua localização perivascular, sendo frequentemente

arranjadas de forma radial ao redor do lúmen vascular. Análises cuidadosas dos PEComas

revelam vasos sanguíneos comprimidos pela parede do tumor. Apresentam citoplasma

eosinófilo claro a transparente, diferente das células musculares lisas que são intensamente

eosinófilas. PECs podem acumular grande quantidade de lipídeos, mimetizando adipócitos ou

lipoblastos, células normalmente encontradas distantes da parede vascular (Folpe &

Kwiatkowski, 2010).

AMLs são hamartomas altamente vascularizados, de composição mista, cujas células

têm características de adipócitos e músculo liso, apresentando também vasos sanguíneos

dismórficos. Acredita-se hoje que AMLs sejam derivados de PECs (Weeks et al., 1991; Ashfaq et

al., 1993), embora a natureza dessas células ainda seja desconhecida, sugestiva de pericitos ou

outra célula originária da crista neural (Fernandez-Flores, 2011).

Os AMLs normalmente apresentam-se como massas expansivas, não infiltrativas, que

podem sofrer complicações vasculares, como microtrombos, embolia e sangramento a

hemorragia. Esses tumores são observados mais frequentemente em rins, podendo ocorrer

em outros órgãos, como por exemplo, fígado, glândula adrenal, pâncreas e pelve (Crundwell,

2004; Orlova & Crino, 2010; Yang et al., 2012; Northrup et al., 2013). Embora grande parte dos

pacientes com AML seja assintomática (Folpe & Kwiatkowski, 2010), há risco de sangramento

local, causando dor devido ao rompimento de aneurismas do tumor ou compressão e/ou


16

invasão do parênquima renal. É também elevada a probabilidade de evolução para

insuficiência renal crônica, se o AML não for tratado.

AML é o PEComa mais comum, com uma prevalência de 0,13% em adultos, sendo mais

frequentemente encontrado em mulheres do que em homens. AMLs renais são observados

entre 60% a 80% dos pacientes adultos com TSC. Mais elevada em adultos, sua frequência

dependente da idade (Rakowski et al., 2006). Apesar da alta frequência entre pacientes com

TSC, cerca de 80% dos pacientes com AML não têm TSC, i.e., sua ocorrência de forma isolada é

mais comum do que associada ao TSC (Eble, 1998).

LAM pulmonar é uma doença progressiva e frequentemente fatal causada por

proliferação de PECs, em ambos os pulmões, como fibras musculares, distribuídas ao redor de

vasos linfáticos, brônquios, septos interlobares e pleura (Smolarek et al., 1998; Folpe &

Kwiatkowski, 2010). A distribuição difusa e bilateral de LAM nos pulmões, a co-ocorrência de

AML e LAM isolada, a demonstração de uma mutação somática em TSC2 em ambas as lesões

do mesmo paciente, além da identificação de células circulantes com o mesmo aspecto de

PECs encontradas nesses hamartomas sugeriram que LAM seja resultado de metástase de AML

de localização renal ou não (Carsillo et al., 2000). Desta forma, esses dois tipos de PEComa são

relacionados.

Pacientes com LAM, em sua grande maioria do sexo feminino, apresentam dispneia

progressiva ao esforço e pneumotórax recorrente, tipicamente nas terceira e quarta décadas

de vida (Northrup et al., 2013).

LAM ocorre principalmente de forma isolada e cerca de 30% dos casos são associados

a TSC (Smolarek et al., 1998; Carsillo et al., 2000; Franz et al., 2010). Os primeiros estudos

apontavam que 1% a 5% de pacientes com TSC apresentavam LAM (Castro et al., 1995). Após a

ampliação do uso de tomografia computadorizada de tórax, revelou-se que entre 25% e 40%

de pacientes do sexo feminino com TSC apresentam LAM (Moss et al., 2001). Estudos mais

recentes indicam que a frequência de LAM em pacientes com TSC aumenta com a idade e


17

pode atingir 80% dos pacientes do sexo feminino, ao final da quarta década de vida (Northrup

et al., 2013).

3. Lesões de Pele

Os tipos de lesões de pele mais comumente encontrados em pacientes com TSC são: (i)

as máculas hipomelanóticas; (ii) os angiofibromas faciais; (iii) os fibromas ungueais e intraorais;

e (iv) as placas fibróticas (Roach & Sparagana, 2004; Orlova & Crino, 2010; Northrup et al.,

2013).

Máculas hipomelanóticas são características significativas em pacientes com TSC, pois

ocorrem em 90% dos pacientes, muitas vezes ao nascimento, sendo úteis ao diagnóstico. Para

tal, os pacientes devem apresentar três ou mais manchas de cor esbranquiçada com pelo

menos 5 mm de diâmetro (Northrup et al., 2013). Angiofibromas faciais, caracterizados por

três ou mais pápulas eritematosas, dolorosas, comumente no processo malar, ocorrem em

aproximadamente 75% dos pacientes com TSC. Geralmente essas lesões surgem por volta de 2

a 5 anos de idade, sendo bem evidentes na fase puberal (Northrup et al., 2013). Com o tempo,

essas lesões se tornam maiores, sem significativo aumento no número total, podendo se

estender para as pregas nasolabiais e mento (Roach & Sparagana, 2004).

Os fibromas ungueais apresentam-se como nódulos no leito ungueal, em geral

dolorosa, que podem ou não surgir após pequenos traumas e causar dor. Apresentam uma

frequência de 20% em jovens e superior a 80% em adultos com TSC (Roach & Sparagana, 2004;

Northrup et al., 2013). As placas fibróticas normalmente ocorrem no couro cabeludo ou na

face em 25% dos pacientes TSC, ou na forma de placas de Shagreen em 50% dos pacientes.

Essas apresentam-se como placas na região lombar com uma superfície irregular com aspecto

de couro ou casca de laranja, sendo esta apresentação clínica quase sempre relacionada ao

TSC (Northrup et al., 2013).


18

4. Rabdomiomas cardíacos

Dois terços dos fetos e recém-nascidos com TSC têm um ou mais rabdomiomas

cardíacos. Apesar desses tumores normalmente regredirem no período pós natal, há novo pico

de frequência na adolescência. Embora esses hamartomas possam causar arritimia cardíaca,

em geral, não apresentam complicações clínicas graves, e sua identificação é altamente

sugestiva de TSC (Roach & Sparagana, 2004; Northrup et al., 2013).

5. Hiperplasias de células epiteliais

Hiperplasia é definida como proliferação de células, em índice superior à média

esperada para o tecido. Em pacientes com TSC, elas ocorrem mais comumente nos pulmões e

rins, embora possam acometer outros órgãos, como o fígado.

A hiperplasia multifocal, micronodular de pneumócito do tipo II (MMPH, do inglês,

multifocal micronodular pneumocyte hyperplasia,) é uma manifestação pulmonar em TSC.

MMPH caracteriza-se por pequenos nódulos (1 mm a 10 mm), com margens claras, na parede

do alvéolo, em ambos os pulmões, podendo acometer pacientes dos sexos feminino ou

masculino, em uma frequência entre 2% e 3% no TSC. MMPH pode ocorrer de forma

independente da LAM pulmonar (Muir et al., 1998; Maruyama et al., 2001; Hayashi et al.,

2010).

Embora a hiperplasia de células epiteliais, renais, na forma de cistos simples, uni ou

bilaterais possa ocorrer em pacientes com TSC, sua apresentação de forma isolada é, em geral,

muito comum na população geral. Por outro lado, 5% dos pacientes com TSC apresentam

deleção genômica no cromossomo 16, envolvendo as porções 3’ dos genes contíguos, TSC2 e

PKD1 (gene 1 da Doença Renal Policística de herança autossômica dominante, ADPKD). Nestes

pacientes, com a síndrome da deleção contígua TSC-ADPKD, há coexistência de TSC com

ADPKD, uma patologia também causada por disfunção de gene supressor de tumor,

caracterizada por desenvolvimento bilateral de múltiplos cistos renais, podendo afetar outros


19

órgãos, e evoluindo a partir da quarta década de vida para insuficiência renal crônica, terminal

(Bastos & Onuchic, 2011).

6. Diagnóstico de TSC

Embora a apresentação clínica do TSC possa ser muito variável (Gomez et al., 1999;

Curatolo, 2003; Krueger et al., 2013), a tríade de Vogt (1908), consistindo em adenoma

sebáceo (angiofibroma), deficiência intelectual e epilepsia, foi inicialmente utilizada como

critério para seu diagnóstico. Com a melhor caracterização fenotípica da doença e o

desenvolvimento dos exames de imagem, critérios diagnósticos, clínicos, classificados em

principais ou secundários, foram compostos e revistos (Roach et al., 1998). Um painel de

especialistas reviu os critérios diagnósticos para TSC em 2012 e, por isso, a tabela referência

desde a revisão de 1998 foi reeditada. Não há sinal clínico patognomônico para o TSC, uma vez

que cada lesão pode ocorrer de forma isolada (Roach & Sparagana, 2004). Após a revisão de

2012, há onze critérios principais e seis secundários que devem ser levados em consideração

para o diagnóstico definitivo ou possível de TSC, que é essencialmente clínico. Desde a revisão

de 2012, a detecção de uma mutação patogênica em um dos genes TSC1 ou TSC2 é suficiente

para o diagnóstico definitivo de TSC. Variantes genéticas de TSC1 ou TSC2 não confirmadas

como patogênicas não são consideradas como critério principal para o diagnóstico (Tabela 2,

Northrup et al., 2013).

Hoje, para que um paciente receba o diagnóstico definitivo de TSC, três situações são

possíveis: a detecção de uma mutação patogênica em TSC1 ou TSC2; a presença de dois

critérios principais; ou a descrição de um critério principal e pelo menos dois critérios

secundários. O diagnóstico possível de TSC pode ser considerado diante de um critério

principal ou pelo menos dois critérios secundários (Tabela 2).

O diagnóstico molecular de TSC vem sendo feito por sequenciamento de Sanger de

produtos de PCR de diferentes éxons de cada gene, TSC1 ou TSC2. As mutações distribuem-se

ao longo de toda as sequências codificadoras de TSC1 ou TSC2. Dada a mais elevada frequência


20

de mutações em TSC2, inicia-se o sequenciamento pelo gene TSC2, seguido do gene TSC1. Se

mutação de ponto não for encontrada em nenhum dos dois genes, técnicas como MLPA (do

inglês, multiplex ligation-dependent probe amplification) ou hibridação comparativa do

genoma em microarranjo (array-CGH) são utilizadas na busca por deleções de segmentos

genômicos contendo pelo menos parte de um dos dois genes, responsáveis por 7% das

mutações conhecidas causadoras de TSC, conhecidas (Kozlowski et al., 2007). Como visto,

análises recentes têm permitido avaliar os benefícios e custos do sequenciamento massivo, em

paralelo de DNA para a detecção de mutações em TSC1 ou TSC2, seja tendo os éxons como

alvo ou o gene inteiro, a partir de moldes obtidos de long-range PCR (Qin et al., 2010; Tyburczy

et al., 2013).


21

Tabela 2: Critérios revistos para o diagnóstico de TSC de acordo com a Conferência Internacional para Consenso do Complexo da Esclerose Tuberosa (Modificado de Northrup et al., 2013).

A. Critérios diagnósticos genéticos

A Identificação de uma mutação patogênica no gene TSC1 ou TSC2 em tecido normal é suficiente para o diagnóstico definitivo de TSC*.

B. Critérios diagnósticos clínicos

Critérios principais

Máculas hipomelanóticas (>3, pelo menos 5 mm em diâmetro)

Angiofibromas (>3) ou placa fibrótica cefálica (face ou couro cabeludo)

Fibromas ungueais (>2)

Shagreen patch

Hamartomas retinianos múltiplos

Displasias corticais**

Nódulos subependimários

Astrocitoma subependimário de células gigantes

Rabdomioma cardiac

Linfangioleiomiomatose (LAM)***

Angiomiolipomas (>2)*** Critérios secundários

Lesões de pele em confete

Crateras no esmalte do dente (>3)

Fibromas intraorais (>2)

Acromia retiniana localizada

Cistos renais múltiplos

Hamartomas não-renais

Diagnóstico definitivo: Dois critérios principais; ou Um critério principal e pelo menos dois critérios secundários.

Diagnóstico possível: Um critério principal; ou Pelo menos dois critérios secundários.

*Uma mutação patogênica é definida como uma mutação que inative a função das proteínas expressas pelos genes TSC1 ou TSC2, previna a síntese proteica, ou seja uma mutação de sentido trocado (missense) cujo efeito sobre a função da proteína tenha sido comprovada por um ensaio funcional (www.lovd.nl/TSC1, www.lovd.nl/TSC2). **Displasia cortical inclui tuberosidades corticais ou linhas de migração radial na substância branca cerebral.

***Uma combinação dos dois critérios principais - LAM e angiomiolipomas - na ausência de outro critério não se

encaixa no diagnóstico definitivo de TSC, sendo considerado como um único critério principal, devido à co-ocorrência das duas lesões em pelo menos 30% dos pacientes com a forma isolada de LAM

1.

C. Produtos da expressão dos genes TSC1 e TSC2

A hamartina, produto da expressão do gene TSC1, é uma proteína hidrofílica, porém

apresenta um domínio transmembrânico em potencial, predito entre os aminoácidos 127 e

144. Possui uma região coiled-coil C-terminal, longa, com 266 aminoácidos, a partir do resíduo

730. As regiões transmembrânica e coiled-coil preditas estão conservadas entre humano,


22

camundongo, rato e drosófila (Cheadle et al., 2000). Em sua região N-terminal, existe um

domínio de interação com a proteína tuberina, codificada pelo gene TSC2 (Figura 1).

Tuberina, produto da expressão do gene TSC2, apresenta um domínio C-terminal de

homologia à GAP (do inglês, GTPase activating protein) para pequena GTPase rap1, com

aproximadamente 160 aminoácidos codificados pelos éxons 34 a 38 do gene. O domínio GAP

de tuberina estimula a hidrólise da forma ativa da proteína rheb-GTP à forma inativa, rheb-

GDP. A proteína Rheb (do inglês, Ras homolog enriched in brain) pertence à família das

pequenas GTPases. Outro domínio importante da tuberina localiza-se na região N-terminal

(aminoácidos 81 a 102) e envolve resíduos de leucina em α-hélice, em um domínio zíper de

leucina. Os zíperes de leucina são importantes mediadores de interação proteína-proteína,

incluindo dimerização. Esse domínio realiza a interação com a proteína hamartina (Plank et al.,

1998; van Slegtenhorst et al., 1998; Nellist, 1999).

Uma vez que mutações em TSC1 ou TSC2 podem causar o mesmo fenótipo (TSC), é

natural supor que as proteínas expressas por esses genes interajam fisicamente. O complexo

heterodimérico hamartina-tuberina, ou TSC1/TSC2, reprime indiretamente a atividade da

proteína mTOR (do inglês, mammalian target of rapamycin), mantendo baixos níveis de

proliferação e crescimento celular.

Fatores de crescimento agem em receptores da membrana recrutando a proteína PI3K

(do inglês, phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase) para a membrana plasmática, que

ativa PDK1. PDK1, assim como mTOR–rictor (complexo mTORC2), fosforilam Akt (do inglês,

protein kinase B), ativando-a. Essa proteína fosforila a proteína tuberina, inativando o

complexo hamartina-tuberina. Uma vez o complexo inativo, Rheb é mantido conjugado ao

GTP, forma que ativa a proteína mTOR em associação a raptor (complexo mTORC1). A

atividade cinásica de mTORC1 é significativa sobre a cinase de S6 (S6K) e a repressora

traducional que se liga ao fator 4E de iniciação da tradução (proteína 4E-BP1), aumentando a

biogênese ribossomal e a síntese proteica, respectivamente.


23

Figura 5: Cascata de sinalização da via do mTOR Complexo TSC1/TSC2 (hamartina/tuberina) funcionam como mediadores de níveis de nutrientes intracelulares via respectivamente AMPK e IRS/PI3K, regulando a atividade de mTORC1 via Rheb sobre a síntese proteica e crescimento celular ou sobre p27

kip1 e a proliferação celular (Crino,

2013).

Na célula, o complexo hamartina-tuberina funciona como sensor intermediário da

razão ATP/ADP, através da cinase ativada por AMP (AMPK). Em condições de baixa

concentração de ATP, AMPK fosforila a tuberina ativando-a, a qual reduz a atividade de Rheb,

de mTOR, a síntese protéica e o crescimento celular. Por outro lado, a associação de tuberina

com a proteína p27kip1 (inibidor de cinase dependente de ciclina 1B) inibe o ciclo celular (Figura

5).

Dado o conhecimento da inibição de mTORC1 pela tuberina, agentes inibidores do

mTORC1 (rapamicina) ou sintéticos (análogos da rapamicina) vêm sendo estudados para tratar

pacientes com TSC. No Brasil, um dos análogos da rapamicina recebeu aprovação da ANVISA

(Agência Nacional de Vigilância Sanitária) para o tratamento clínico de SEGA em pacientes com

TSC. Percebe-se, diante disso, que desde as clonagens dos genes TSC2 e TSC1, respectivamente


24

em 1993 e 1997, o rápido avanço no conhecimento molecular da patogênese de TSC tem

permitido vislumbrar novas alternativas terapêuticas para esses pacientes. Com este objetivo,

diversos estudos pré-clínicos e clínicos têm sido conduzidos (Kenerson et al., 2005; Krueger et

al., 2010; McCormack et al., 2011). Neste cenário, estudos clínicos e moleculares deixaram de

ter um papel somente no aconselhamento genético e diagnóstico pré-natal, passando a

ocupar uma posição importante em ensaios clínicos com possibilidade de associações entre o

genótipo e a resposta terapêutica.

No presente trabalho, padronizamos condições para o estudo da sequência do gene

TSC1 visando à identificação de mutações causadoras de TSC, o conhecimento de custos e

benefícios, e a descoberta de novas variantes de DNA que possam trazer informações sobre a

função do gene. Em paralelo, dois grupos de neurologistas caracterizam clinicamente os

pacientes. Esperamos que a continuação deste trabalho permita avaliar o gene TSC2 nesses

pacientes, expandir a amostra, avaliar deleções genômicas de ambos os genes e realizar

estudos de associação fenótipo-genotípica, em médio prazo.

Espera-se também que este estudo e a futura padronização de análises de mutações

em TSC2 tragam: (i) a possibilidade de aconselhamento genético com conhecimento molecular

e diagnóstico pré-natal de mutações causadoras de TSC; (ii) a análise molecular para pesquisa

em tecidos tumorais removidos cirurgicamente, com possibilidade de inferir mecanismos

patogenéticos; (iii) os estudos funcionais de variantes novas de DNA em TSC1 ou TSC2; (iv) a

comparação de benefícios e custo entre as metodologias de sequenciamento de DNA de

Sanger e massivo, em paralelo; e (v) a alternativa de se associar futuramente melhor resposta

terapêutica de pacientes a genótipos relacionados ao gene TSC1 ou TSC2, prevendo estudos

colaborativos.

Em nossas análises, apresentadas aqui, sobre o gene TSC1 em DNA de 28 pacientes

brasileiros com diagnóstico definitivo de TSC, identificamos 25% deles com mutações

patogênicas e quatro novas variantes de DNA com potencial para regular a expressão do gene.


25

Desta forma, estabelecemos a base para que diversas análises genéticas e funcionais sejam

realizadas a partir daqui.


26

IV. Objetivos

O objetivo deste estudo foi caracterizar mutações de ponto, nas sequências

codificadora, de segmentos intrônicos, promotora basal e a 5’ desta do gene TSC1 em

pacientes com diagnóstico clínico, definitivo de TSC.

Para cumprir o objetivo geral, tivemos os seguintes objetivos específicos:

1. Inclusão de pacientes com diagnóstico definitivo de TSC e extração de DNA de leucócitos;

2. Padronização da PCR para os éxons e vizinhanças intrônicas do gene TSC1 bem como

promotor basal e região a 5’ deste, a partir de amostra de DNA genômico humano;

3. Triagem pela PCR seguida de sequenciamento de Sanger do DNA de amplicoms do gene

TSC1 de 28 pacientes que fizeram parte deste estudo;

4. Análise dos resultados do sequenciamento de DNA, anotação de variantes de DNA e sua

interpretação com base em bancos de dados de sequências ou de mutações e

ferramentas in silico para análise de sequências de DNA.


27

V. Pacientes e Métodos

A. Pacientes

O protocolo para trabalho com amostras de sangue de seres humanos foi aprovado

pelo Comitê de Ética de pesquisa em seres humanos do IB-USP (N° do parecer: 242.698). O

termo de consentimento livre e esclarecido entregue ao paciente ou responsável informava

que (i) o TSC é uma doença que pode afetar os indivíduos de várias maneiras; (ii) em uma

mesma família, as pessoas podem ter a doença de forma grave ou benigna; (iii) há dois genes

conhecidos, TSC1 e TSC2, que podem causar a doença; (iv) a maioria das mutações incide no

gene TSC2; e (v) estudos sobre as mutações que causam a doença podem ajudar os cientistas a

entenderem como ela se manifesta. O(a) paciente foi esclarecido(a) de que, na pesquisa, ele(a)

será avaliado pelo(a) neurologista em entrevista e exame físico; exames de imagem poderão

ser solicitados; e será coletado sangue por venopuntura. Ao final do estudo, ele(a) poderá ser

esclarecido(a) sobre o tipo de mutação identificada e poderá ser realizado aconselhamento

genético.

A participação do(a) paciente no estudo foi voluntária. Ele(a) teve a alternativa de

entrar em contato com os coordenadores do projeto, antes de comparecer à consulta. Durante

todo o projeto e em todos os momentos da comunicação entre a equipe e a

família/responsável pelo(a) paciente, foi mantida a confidencialidade e o direito de retirada

do(a) paciente do estudo. Em nenhum momento foram negados o acesso e os direitos do(a)

paciente ao tratamento clínico.

Os 28 pacientes que foram incluídos no estudo tinham até 19 anos de idade, eram

procedentes dos estados de São Paulo ou Paraná e tiveram o diagnóstico definitivo de TSC

realizado por neurologista de acordo com critérios revistos por Northrup et al.,2013 (Northrup

et al., 2013). Dezenove e nove pacientes foram atendidos nos serviços de neuropediatria,

respectivamente, da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo (HSCM-SP, sob responsabilidade


28

do Prof. Sérgio Rosemberg) e do Hospital das Clínicas da Universidade Federal do Paraná (HU-

UFPR, sob responsabilidade do Prof. Sérgio Antoniuk). Os pacientes foram numerados de 1 a

30, ausentando-se os de número 15 e 21, que eram externos e não entraram em nossa lista A

equipe do neurologista realizou anamnese e exame físico do paciente e analisou exames de

imagem, de acordo com protocolos de pesquisa de dois projetos de mestrado, um de cada

serviço. Os dados da caracterização fenotípica dos pacientes não fizeram parte do presente

trabalho e constituirão dissertações dos respectivos programas de pós-graduação. Após o

atendimento, o neurologista coletou as amostras de sangue por venopuntura (2 X 4 mL) para

extração de DNA de leucócitos.

B. Métodos

1. Extração de DNA

Cerca de quatro mililitros de sangue periférico de cada paciente foram submetidos à

extração de DNA de leucócitos com o kit Puregene chemistry (QIAGEN, Valencia, CA) e o

aparelho Autopure LS (Gentra Systems, Minneapolis, MN), no Centro de Estudos do Genoma

Humano (CEGH-IBUSP), seguindo recomendações dos fabricantes. A segunda amostra, com

volume semelhante de sangue foi submetida à extração de DNA com QIAamp DNA Blood Midi

e Maxi Kits (QIAGEN, Valencia, CA), seguindo as indicações do fabricante. A eluição final do

DNA era em 300 µL de água destilada estéril ou tampão fornecido pela empresa.

2. Quantificação de DNA genômico

A quantificação da concentração e verificação da qualidade do DNA foram feitas

usando o espectrofotômetro de microplaca EPOCH (BioTek, Winooski VT), no laboratório da

Prof. Dra. Regina Migroni Netto (IBUSP). Dois microlitros de cada amostra de DNA foram

submetidos à leitura espectrofotométrica à absorbância ultravioleta a 260 nm e 280 nm. A

razão 260nm/280nm do DNA das amostras submetidas a PCR variou de 1,67 a 2,59

(Média=1,98), sendo a ideal a partir de 1,8.


29

3. Oligodesoxirribonucleotídeos

Os pares de oligonucleotídeos para amplificar cada éxon e a região promotora do gene

TSC1 foram desenhados utilizando-se o programa Primer3 input (v. 0.4.0 -

http://primer3.wi.mit.edu/), desenvolvido por Steve Rozen e Helen Skaletsky e disponível

gratuitamente na internet (Rozen & Skaletsky, 2000). Os parâmetros utilizados para a

obtenção de sequências de oligonucleotídeos para PCR do gene TSC1 (Tabela 3) foram: (i)

tamanho do produto entre 350-450 ou 950-1350 pares de bases (pb), sendo que os menores

produtos compreendiam apenas um éxon e os maiores produtos continham dois éxons e um

íntron curto; (ii) oligonucleotídeos variando de 20 a 22 nucleotídeos, sendo 21 nucleotídeos o

ideal; (iii) temperatura de hibridação entre 59°C e 61°C, tendo como ótima 60°C e, no máximo,

1°C de diferença entre os pares; e (iv) porcentagem de guanina e citosina (GC) entre 40 e 60%,

sendo ótima em 50%.

A especificidade de cada oligonucleotídeo foi verificada através de seu alinhamento

contra o genoma humano usando programa Blat (UCSC Genome Browser,

http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start). As sequências que apresentaram

especificidade somente à sequencia-alvo de TSC1 foram selecionadas.

Tabela 3: Lista de sequências de oligonucleotídeos* utilizados nas reações de PCR do gene TSC1.

Segmentos amplificados

Nome Oligonucleotídeos Número de bases

5´+ Promotor + éxon 1

gTSC1_1S 5´ Aaatgtttagcccaggaagga 3´ 21

gTSC1_1A 5´ gccggagatagcgtgtaataa 3´ 21

Éxon 2 gTSC1_3S 5´ Ttggattttaacccggaactc 3´ 21

gTSC1_3A 5´ tcaggcactgaatacaagcaa 3´ 21

Éxon 3 gTSC1_4A 5´ ggggttcactgcatgattct 3´ 20

gTSC1_4S 5´ Cctcttcataaactcgccaaag 3´ 22

Éxon 4 gTSC1_5S 5´ Cagaactgtaatgctgcacaaa 3´ 22

gTSC1_5A 5´ ttcaagaatcatgggtcctaca 3´ 22

Éxon 5 gTSC1_6S 5´ Ttttatctgcatgacccttgc 3´ 21

gTSC1_6A 5´ ccatacttgcatggacaaggt 3´ 21

Éxon 6 gTSC1_7S 5´ Cagtagagttggggctcagtg 3´ 21

gTSC1_7A 5´ gcacccaagatattccctca 3´ 20

Éxons 7+8 gTSC1_8S 5´ Ctgaagaggagggcagaagtt 3´ 21

gTSC1_8A 5´ attagtcctccgcctgtgaa 3´ 20

Éxon 9 gTSC1_10S 5´ Tttccattttgaggctacacc 3´ 21

gTSC1_10A 5´ ttccagagacaaagttgcaaaa 3´ 22

Éxon 10 gTSC1_28S 5´ Acctaaaaccacacactaaccc 3´ 22

gTSC1_11A 5´ ggaatgctaagtcatccacga 3´ 21

Éxons 11+12 gTSC1_12S 5´ Gggaaaatttcacactgctca 3´ 21

gTSC1_12A 5´ cacaccttgagagcagcttgt 3´ 21

Éxon 13+14 gTSC1_14S 5´ Catcccaacaatttgagaatca 3´ 22

gTSC1_14A 5´ ggcatcactttacctggcata 3´ 21


30

Éxon 15 gTSC1_16S 5´ Ggatgccactttttctcctct 3´ 21

gTSC1_16A 5´ tcccaatttaggtgcacagag 3´ 21

Éxons 16+17 gTSC1_18S 5´ ttatgccattgcagattttgac 3´ 22

gTSC1_18A 5´ ggaaggactgggaactctgac 3´ 21

Éxon 18 gTSC1_20S 5´ gcaaactgatccctgagaaga 3´ 21

gTSC1_20A 5´ agttggggaacctctgtccta 3´ 21

Éxon 19 gTSC1_21S 5´ cagaatctttctgcagcatcc 3´ 21

gTSC1_21A 5´ cagcaccaaaaacatgaacct 3´ 21

Éxon 20 gTSC1_22S 5´ ccattatgtcagggactgtgaa 3´ 22

gTSC1_22A 5´ tagctggaccacggagtagtg 3´ 21

Éxons 21+22 gTSC1_23S 5´ gcttggggatagatttcaagg 3´ 21

gTSC1_23A 5´ acacggagtgagctgagtgtt 3´ 21

Éxon 23 gTSC1_25S 5´ catatggccacaggaagtgtt 3´ 21

gTSC1_28A 5´ ccgtcccatttccacacatg 3´ 21

*Sequência de oligonucleotídeos senso (terminadas em S) ou antissenso (terminadas em A).

4. Reação em cadeia da polimerase

As reações em cadeia da polimerase (PCR) foram realizadas em volume final de 25 L,

com um décimo do volume de tampão PCR buffer (200 mM Tris-HCl, pH 8,4, 500 mM KCl)

concentrado 10X, 1 L de MgCl2 a 50 mM, dimetilsufóxido (DMSO) a 5%, cada

desoxirribonucleotídeo dATP, dCTP, dGTP e dTTP a 0,2 mM, cada iniciador senso (S) ou

antissenso (A) a 0,2 µM, 80 ng de DNA genômico humano e 0,2 U de polimerase Taq do DNA

(Invitrogen, Carlsbad, CA). As condições ao termociclador para PCR foram: 5 minutos de

desnaturação inicial a 95°C, seguido por 30 ciclos de desnaturação a 95°C por um minuto,

hibridação a 60°C por um minuto e extensão a 72°C por um minuto. O último estágio consistiu

de oito minutos a 72°C seguido por resfriamento até 4°C.

Para o amplicom que compreende o promotor, segmento a 5´ deste e o éxon 1 do

gene TSC1, o análogo de desoxirribonucleotídeo dGTP, 7-deaza-2´-desoxiguanosina (dc7GTP),

foi usado para substituir o dGTP na mistura para PCR, em uma razão de 3(dc7GTP):1(GTP).

Para esse amplicom, outro protocolo de ciclagem foi utilizado ao termociclador. Neste,

slowdown PCR (Frey et al., 2008), amplificação ocorreu com o primeiro ciclo composto por 30

segundos de desnaturação a 95°C, 30 segundos de hibridação a 70°C e uma extensão de 40

segundos a 72°C. Os 47 ciclos subcequentes tiveram uma redução de 1°C a cada 3 ciclos na

temperatura de hibridação dos iniciadores até chegar a 53°C. Quinze ciclos adicionais se

seguiram a uma temperatura de hibridação de 58°C. De modo geral, cada rampa (mudança de


31

temperatura no ciclo) teve uma taxa de variação de temperatura de 2,5°C por segundo, em

especial um resfriamento de 1,5°C por segundo para atingir a temperatura de hibridação, em

um total de 48 ciclos.

5. Eletroforese em gel de agarose a 1%

Os produtos da PCR foram submetidos à eletroforese, a qual foi realizada em gel de

agarose a 1% em tampão TBE 1X (tris base a 0,9 M, ácido bórico a 0,9 M e EDTA a 0,5 M),

contendo 1 L de SYBR™ Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Carlsbad, CA) para cada 10 mL de gel.

As imagens do gel foram analisadas no fotodocumentador Gel Doc™EZ System (BioRad,

Hercules, CA), onde a imagem foi capturada e analisada com o software Image Lab™ (BioRad,

Hercules, CA).

6. Purificação com Exonuclease I (Exo) e Shrimp Alkaline

Phosphatase (Sap)

Oito microlitros do produto da PCR foram incubados com 1,5 µL de Exonuclease

I:Shrimp Alkaline Phosphatase (ExoSap) na proporção de 5U:1U, durante 60 minutos a 37°C,

seguida de uma desnaturação a 60°C por 15 minutos.

7. Sequenciamento Sanger de DNA

As reações de sequenciamento de Sanger de cada fita de DNA foram feitas segundo o

protocolo ABI BigDye Terminator (Applied Biosystems, Carlsbad, CA), usando um dos

oligonucleotídeos utilizados na PCR,ou um dos outros listados na Tabela 4, nas seguintes

condições: 4 µL de DNA após purificação com ExoSap, 0,3 mM de oligonucleotídeo, 2 µL de

BigDye terminator v3.1, 1,5 µL de tampão 10X (BigDyeno kit® - Applied Biosystems, Carlsbad,

CA) e 6,5 µl de água ultrapura para completar o volume de reação para 15 µL. A mistura é

colocada no termociclador com um ciclo de desnaturação a 96°C, 25 ciclos com as etapas de

desnaturação a 96°C por 10 segundos (1°C/segundo), hibridação a 50°C por 5 segundos e

extensão a 60°C por 4 minutos. Os produtos foram purificados em coluna com Sephadex

(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ).


32

Os produtos da reação de sequenciamento foram secados a 95°C por 20 minutos e

submetidos a eletroforese capilar no equipamento ABI 3730xl DNA Analyzer (Amersham

Biosciences, Piscataway, NJ), no CEGH-IBUSP. As análises dos resultados eram feitas usando o

programa Sequencher 5.2.4 (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI).

A partir dos resultados dos primeiros sequenciamentos de DNA, determinamos o

segmento de sequência com boa leitura de bases para cada oligonucleotídeo e verificamos a

sequência complementar lida por outro oligonucleotídeo, definindo uma região de fita dupla

que deveria ter as duas fitas analisadas para cada amplicom de PCR e cada paciente. As

sequências que não se enquadraram nesses parâmetros não foram consideradas e a reação de

sequenciamento foi repetida. A Tabela 5 indica a extensão em pares de bases (pb) dos

segmentos 5’ e 3’ de cada íntron, avaliada após as reações de sequenciamento. A Tabela 5

apresenta também a extensão de cada éxon do gene TSC1, que foi inteiramente sequenciada.

Além disso, o promotor basal e 517 pares de bases a 5´ deste foram sequenciados nos

pacientes 1 a 13, 18 e 19. O promotor basal foi definido como as 50 bases a 5´da primeira base

transcrita até a base 50 do éxon 1 (Gerstein et al., 2007). Esta estratégia permitiu analisar

100% da sequência exônica e 18% das sequências intrônicas, totalizando 11% da sequência

genômica do gene TSC1.

Tabela 4: Lista de sequências de oligonucleotídeos* adicionais utilizados nas reações de sequenciamento do gene TSC1.

Segmentos amplificados

Nome Oligonucleotídeos Número de bases

Promotor gTSC1_2A 5´ catcttggacgtacagcacct 3´ 21

Éxon 1 gTSC1_2S 5´ Ccgtctatccttcctttcgag 3´ 21

Éxon 7 gTSC1_9A 5´ Aatttccctgtctgccgtta 3´ 20

Éxon 8 gTSC1_29S 5´ Caatccctaggcagccacta 3´ 20

Éxon 11 gTSC1_13A 5´ cccagggatttgcaataagt 3´ 20

Éxon 12 gTSC1_13S 5´ Cggcagtttttctaatagttgg 3´ 22

Éxon 13 gTSC1_15A 5´ Tcccagaatttccttgtttcc 3´ 21

Éxon 14 gTSC1_15S 5´ Ccatgtccagccttctctgt 3´ 20

Éxon 15 (5´) gTSC1_17A 5´ gatgacaaaatgatgggctgt 3´ 21

Éxon 15 (3´) gTSC1_17S 5´ cacaccaaagcaagcctttac 3´ 21

Éxon 16 gTSC1_19A 5´ acttggcaacacttgagatcct 3´ 22

Éxon 17 gTSC1_19S 5´ aagctaacaacacatgggaagg 3´ 22

Éxon 21 gTSC1_24A 5´ tgcagctgtcctctgaaagat 3´ 21

Éxon 22 gTSC1_24S 5´ gtcaaactccaggcaaggtaa 3´ 21

Éxon 23 (5´) gTSC1_26A 5´ cagaaaggctactggtcatgc 3´ 21

Éxon 23 (3`) gTSC1_26S 5´ gggagacgactatgggagaag 3´ 21

*Sequência de oligonucleotídeos senso (terminadas em S) ou antissenso (terminadas em A).


33

Tabela 5: Extensão de sequências exônicas e intrônicas sequenciadas para cada paciente*

8. Nomenclatura das variantes no gene TSC1

A designação das variantes encontradas para o gene TSC1 foram determinadas usando

a sequência-referência NG_012386.1, que cobre o transcrito do gene TSC1 NM_000368.4 de

acordo com o banco de dados LOVD (Leiden Open Variation Database em

http://chromium.liacs.nl/LOVD2/TSC/refseq/TSC1_codingDNA.html). Utilizou-se a sequência

codificadora como referência para determinar a localização da variante detectada, de acordo

com as recomendações da HGVS (Human Genome Variation Society).

Número do éxon ou íntron Extensão do éxon (pb) Extensão do segmento intrônico analisado

A 5’ (pb) A 3’ (pb)

1 91** 80** 253

2 63 68 141

3 186 100 77

4 104 103 69

5 153 166 88

6 145 88 210

7 155 191 191

8 74 122 206

9 176 0 2

10 116 228 194

11 112 154 155

12 122 100 70

13 70 232 233

14 105 86 61

15 559 91 12

16 44 296 297

17 167 32 168

18 183 142 220

19 111 138 40

20 123 38 20

21 188 47 47

22 167 69 168

23 520

* Íntrons em sombreado foram inteiramente sequenciados. ** Segmentos sequenciados somente para os pacientes 1 a 13, 18 e 19.


34

9. Análise in silico de patogenicidade e frequência das variantes

Para se determinar a possível patogenicidade de cada variante de DNA identificada

neste estudo, cinco bancos de sequências ou mutações e ferramentas disponíveis na web

foram consultadas para análise: LOVD

(http://chromium.liacs.nl/LOVD2/TSC/home.php?select_db=TSC1), 1000 Genomes

(http://www.1000genomes.org/), PolyPhen-2 (Adzhubei et al., 2010,

http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/), SIFT (Ng & Henikoff, 2006, Kumar et al., 2009,

http://sift.jcvi.org/), Mutation Taster (Schwarz et al., 2010, http://www.mutationtaster.org/) e

COILS-ExPASy (Lupas et al., 1991, http://embnet.vital-it.ch/software/COILS_form.html).

Análise in silico das variantes inconclusivas do gene TSC1, localizadas no éxon 2 do

gene TSC1 foram realizadas na busca por segmentos candidatos a regulação do splicing do pré-

RNAm. Utilizaram-se ferramentas bioinformáticas Acescan2 (http://genes.mit.edu/acescan2/),

SpliceAid2 (Piva et al., 2012, http://193.206.120.249/splicing_tissue.html), ESE Finder (Cartegni

et al., 2003, Smith et al., 2006, http://rulai.cshl.edu/tools/ESE2/), ESR search (Zhang & Chasin,

2004, Goren et al., 2006, http://esrsearch.tau.ac.il/) e Human Splicing Finder Version 2.4.1

(Desmet et al., 2009, http://www.umd.be/HSF/) cujos algoritmos buscam por elementos nas

sequências de DNA com possibilidade de atuar como reguladores em cis do splicing de acordo

com banco de dados de elementos previamente testados experimentalmente.

A busca por sítios de ligação a fatores de transcrição, específicos – diferentes dos

fatores gerais da transcrição que identificam o promotor basal – foi realizada inicialmente no

Eukaryotic Promoter Database (http://epd.vital-it.ch) que nos direcionou ao site do Swiss

Regulon (Pachkov et al., 2007), baseado na Unversidade de Basel (Suíça,

http://www.swissregulon.unibas.ch/gbrowse2) no qual, de forma semelhante ao ENCODE (do

inglês, Encyclopedia of DNA Regulatory Elements), fornece informações relacionadas à

sequência gênica, seus transcritos e seu mapeamento cromossômico, mas de forma mais

http://epd.vital-it.ch/

http://www.swissregulon.unibas.ch/gbrowse2


35

diretas e concentrada em elementos em cis potencialmente reconhecidos como acentuadores

ou silenciadores transcricionais por fatores específicos.


36

VI. Resultados

Do total de 28 pacientes com diagnóstico definitivo TSC, encaminhados dos serviços de

Neurologia da Santa Casa de São Paulo (HSCM-SP, 19 pacientes) e do Hospital das Clínicas da

Universidade Federal do Paraná (UFPR, nove pacientes), 13 eram do sexo masculino e 15 do

sexo feminino. A idade dos pacientes variou entre 5 meses e 19 anos (média de 10 anos e 3

meses, mediana de 11 anos). Entre os 28 pacientes, 26 apresentaram epilepsia, 17

apresentavam deficiência intelectual (DI), dez pacientes tiveram diagnóstico de SEGA e nove

tinham alguma forma de acometimento renal.

A. Mutações patogênicas

Os éxons 2 a 23 do gene TSC1 tiveram ambas as fitas de DNA dos 28 pacientes

inteiramente sequenciadas. O DNA dos pacientes 1 a 13, 18 e 19 teve o amplicom de PCR do

éxon 1 do TSC1 sequenciado, o qual compreendia também o promotor basal, 467 pares de

base a 5´ deste e 80 pares de base do segmento 5´ do íntron 1.

Foram encontradas mutações patogênicas no gene TSC1 em sete pacientes (25%,

7/28) com diagnóstico definitivo de TSC, sendo três mutações de sentido trocado (nonsense) e

quatro inserções ou deleções causando deslocamento da fase de leitura para a tradução

(frameshift) gerando códons de parada prematura.

1. Mutações patogênicas do tipo nonsense

O paciente 5 apresentou a mutação c.1525C>T (p.509R>X) no éxon 15 do gene TSC1

(Figura 6A). Isso condiz com uma redução do tamanho da proteína hamartina de 1164

aminoácidos (aa) para 509 aa, sem tradução do segmento para a região coiled-coil, C-terminal.


(Figura 6B), prevendo 500 aa para a proteína hamartina, que não deverá apresentar a região

coiled-coil, C-terminal.


37


(Figura 6C), causando potencialmente a redução do tamanho da hamartina para 786 aa, tendo

somente parte inicial do domínio coiled-coil, C-terminal.

Figura 6: Cromatogramas referentes às mutações do tipo nonsense nos pacientes 5, 8 e 16. São apresentadas seções dos cromatogramas referentes ao sequenciamento de Sanger com substituições de bases indicadas por setas em vermelho. (A) Mutação c.1525C>T no éxon 15 do paciente 5; (B) mutação c.1498C>T no éxon 15 do paciente 8; (C) mutação c.2356C>T no éxon 18 do paciente 16.

2. Mutações patogênicas do tipo frameshift

O paciente 19 apresentou a mutação c.988inT no éxon 10 do gene TSC1 (Figura 7A e

B). Esta mutação causa um deslocamento da fase de leitura a partir do nucleotídeo de número


38

c.989, cria um códon de parada prematura logo após o códon para o resíduo 340, no éxon 10,

ocasionando numa hamartina sem a região coiled-coil, C-terminal.

À análise do DNA do paciente 13, observamos uma deleção c.1431_1434delAGAA no

éxon 14 do gene TSC1 (Figura 7C e D). Esta mutação causa um deslocamento da fase de leitura

a partir do nucleotídeo de número c.1435, levando à formação de um códon de parada em

c.1590, no éxon 15, e potencial para uma proteína truncada com 530 aa.

O paciente 17 apresentou a mutação c.1518_1519inCC no éxon 15 do gene TSC1

(Figura 7E e F), deslocando a fase de leitura e prevendo uma proteína com 532 aa devido a um

códon de parada prematura em c.1596, no éxon 15.

O paciente 10 apresentou a mutação c.2745delC no éxon 21 do gene TSC1 (Figura 7G e

H), o que levou a um códon de parada em c.2790, no éxon 21 e a tradução de uma proteína

com 930 aa, contendo aproximadamente 75% da região coiled-coil, C-terminal da hamartina,

como previsto pela ferramenta COIL-ExPASy (Figura 8).

Figura 7: Mutações identificadas na sequência do gene TSC1 que causam deslocamento de fase de leitura: c.988inT no éxon 10 do paciente 19, c.1431_1434delAGAA no éxon 14 do paciente 13, c.1518_1519inCC no éxon 15 do paciente 17 e c.2745delC no éxon 21 do paciente 10. (A, C, E e G) Seções de cromatogramas referentes ao sequenciamento de Sanger do DNA de parte do gene TSC1 dos pacientes 19, 13, 17 e 10, sendo o início de ambiguidade à leitura de bases indicado por setas em vermelho. (B, D, F e H) As sequências de DNA do gene TSC1 de referência e do alelo mutado são mostradas em maiúsculas nas linhas com sua identificação. Agrupamento de três letras define um códon. A sequência a 3’ da mutação aparece em azul. A tradução de cada sequência encontra-se na linha abaixo da respectiva sequência de DNA, em terminologia de uma letra maiúscula para cada aminoácido. Os códons de parada são representados pela letra X maiúscula. (B) O T maiúsculo, em vermelho, representa a base timina inserida na sequência do paciente 19 (mutação c.988inT). (D) As letras AGAA maiúsculas na sequência de referência, em vermelho, representam as quatro bases deletadas da sequência do paciente 13 (mutação c.1431_1434delAGAA). (F) As letras CC maiúsculas, em vermelho, representam as duas bases citosina inseridas na sequência do paciente 17 (mutação c.1518_1519inCC). (H) O C maiúsculo na sequência de referência, em vermelho, representa a base citosina deletada da sequência do paciente 10 (mutação c.2745delC). (Continua na próxima página)


39


40

Figura 8: Predição de estrutura coiled-coil segundo a ferramenta COIL-ExPASy. Cada pico na figura representa uma predição de estrutura coiled-coils segundo uma janela de 14 aa (verde), 21 aa (azul) e 28 aa (vermelho); (A) Predição de estrutura coiled-coil para a hamartina expressa pelo gene TSC1 de referência; (B) Predição de estrutura coiled-coil para o paciente 10 que apresentou a mutação c.2745delC (p.930E>X) com códon de parada prematuro no éxon 21 do gene TSC1.

As sete mutações descritas encontram-se na Tabela 6 junto aos dados disponíveis de

cada um dos 28 pacientes.

B. Polimorfismos de DNA no gene TSC1

Vinte e três diferentes polimorfismos de DNA foram identificados, no total dos 28

pacientes: três variantes exônicas do tipo missense, quatro variantes exônicas sinônimas e 16

intrônicas.

1. Variantes exônicas

a) Variantes exônicas do tipo missense

Três variantes do tipo missense (sentido trocado) foram encontradas: c.965T>C

(p.322M>T), c.1342C>T (p.448P>S) e c.1760A>G (p.587K>R), respectivamente nos éxons 10, 14

e 15 (Tabela 7).


41

Tabela 6: Dados clínicos e genotípicos disponíveis sobre os 28 pacientes analisados.

Paciente Serviço Sexo Idade

(anos)* História

Familiar** DI Epilepsia SEGA

Rins ***

Mutações patogênicas em

TSC1

1 HSCM M 16 - + + - CisBil

2 HSCM M 11 + + + + -

3 HSCM M 11 - + + + Tumor

4 HSCM F 14 + + + - Tumor

5 HSCM M 18 + + + + Calcif c.1525C>T (p.509R>X)

6 HSCM F 13 - + + + Tumor

7 HSCM F 03 - ND + - ND

8 HSCM M 10 - + + + - c.1498C>T (p.500R>X)

9 HSCM F 12 - + + + -

10 HSCM F 10 - - + - - c.2745delC

11 HSCM F 16 - + + - +****

12 HSCM M 01 - ND + + -

13 HSCM M 19 + + + - - c.1431_1434delAGA

A

14 HSCM F 01 + ND + - -

16 HSCM F 11 - NC + - - c.2356C>T (p.786R>X)

17 HSCM F 08 - + + + - c.1518_1519inCC

18 HSCM F 11 - NC - + -

19 HSCM M 5 m + ND + - - c.988inT

20 UFPR F 14 - + + + Tumor

22 HSCM F 14 - + + - -

23 UFPR F 2 - - + - Tumor D

CisBil

24 UFPR M 12 + + + - -

25 UFPR F 13 - + + - -

26 UFPR M 12 + + + - Tumor

27 UFPR M 15 - - + - NC

28 UFPR F 5 - + + NC -

29 UFPR M 5 - - - - -

30 UFPR M 11 - - + - Tumor D

CisBil

M: sexo masculino; F: sexo feminino; +: presença; -: ausência; NC: propedêutica não concluída; ND: não determinado; DI: deficiência intelectual; CisBil: cistos bilaterais; Calcif: calcificação isolada; D: à direita. * Idade em dezembro de 2013. Se (m): idade em meses ** Relato ou não de história de TSC na família quando questionado ao responsável *** Os tumores renais de dois pacientes (4 e 6) tinham aspecto sugestivo de angiomiolipoma à tomografia computadorizada e ultrassonografia renal. Os pacientes 3, 20, 23, 26 e 30 tinham resultados também sugestivos de angiomiolipoma, embora somente à ultrassonografia renal. **** Rins com dimensões reduzidas e textura cortical alterada.


42

Tabela 7: Variantes missense identificadas nos éxons 10, 14 e 15 do gene TSC1.

Éxon Variante

(Paciente*) LOVD

1000 Genomas** SIFT PolyPhen

Total (n=1092) AFR (n=246) AMR (n=181) ASN (n=286) EUR (n=379)

10

c.965 T>C (p.322M>T)

(Pacientes 1, 11, 13, 14 e 24)

SEM CONHECIMENTO DA PATOGENICIDADE. Encontrada

em paciente com mutação patogênica em TSC1 c.1717C>T

(p.573Gln>X) (Dabora et al., 1998 ).

T C T C T C T C T C Substituição p.322M>T é

TOLERANTE, score=1,00. Região com pouca

tolerância a alteração.

BENIGNA, score= 0,000 (Sensibilidade: 1,00; especificidade: 0,00) 86% 14% 76% 24% 89% 11% 94% 6% 96% 4%

14 c.1342 C>T (p.448P>S)

(Paciente 18)

PROVAVELMENTE NÃO PATOGÊNICA. Encontrada em

paciente com mutação patogênica em TSC2 c.4515C>G (p.1505T>X) (Hoogeveen-Westerveld et al, 2012

(Hoogeveen-Westerveld et al., 2012)).

C T C T C T C T C T

Substituição p.448P>S AFETANDO A FUNÇÃO

PROTÉICA†,

score=0,00.

BENIGNA, score=0,001 (Sensibilidadde: 0,99; especificidade: 0,15) 100% 0% 99% 1% 100% 0% 100% 0% 100% 0%

15

c.1760 A>G (p.587K>R)

(Pacientes 7, 19, 22, 25 e 30)

SEM CONHECIMENTO DA PATOGENICIDADE

A G A G A G A G A G Substituição p.587K>R AFETANDO A FUNÇÃO

PROTÉICA†,

score=0,00.

BENIGNA, score=0,010 (Sensibilidade: 0,96; especificidade: 0,77) 98% 2% 100% 0% 87% 13% 100% 0% 100% 0%

Estão representados os dados resumidos , obtidos no banco de dados de sequências LOVD ou 1000 Genomes, ou pelas ferramentas SIFT e PolyPhen. Para o projeto 1000 Genomas, os dados foram obtidos em maio de 2014 e são referentes à fase 1 do projeto * Identificação dos pacientes em que se observou a variante. ** Total: frequência de cada variante observada na amostra do banco de dados; AFR: população africana; AMR: população americana; ASN: população asiática; EUR: população europeia. A: adenina; C: citosina; G: guanina; T: timina †= Segundo a ferramenta SIFT estes dados são de baixa confiança de predição.


43

b) Variantes exônicas do tipo sinônima

Quatro variantes exônicas, sinônimas foram identificadas no gene TSC1 em 11

pacientes: uma no éxon 14, outra no éxon 22 e duas no éxon 23 (Tabela 8). Estas variantes são

consideradas sinônimas porque não causam substituição de aminoácidos. Todas eram

substituições de terceira base de códon.

Tabela 8: Variantes sinônimas, identificadas nos éxons 14, 22 e 23 do gene TSC1.

Éxon Variante

(Paciente*) LOVD

(**)

1000 Genomas***

Total (n=1092)

AFR (n=246)

AMR (n=181)

ASN (n=286)

EUR (n=379)

14 c.1335 A>G

(Pacientes 1, 10, 11, 13, 14 e 24)

15 A G A G A G A G A G

86% 14% 77% 23% 89% 11% 94% 6% 85% 15%

22 c.2829 C>T

(Pacientes 1, 6, 8 e 19) ND

C T C T C T C T C T

93% 7% 89% 11% 90% 10% 98% 2% 94% 6%

23

c.3282 G>A (Paciente 7)

3 G A G A G A G A G A

100% 0% 98% 2% 100% 0% 100% 0% 100% 0%

c.3324 C>T (Paciente 26)

7 C T C T C T C T C T

99% 1% 99% 1% 94% 6% 99% 1% 100% 0%

Estão representados os dados resumidos, obtidos no banco de dados de sequências LOVD e 1000 Genomes. Para o projeto 1000 Genomas, os dados foram obtidos em maio de 2014 e são referentes à fase 1 do projeto . *Identificação dos pacientes em que se observou a variante. **Número de vezes descrita no banco de dados LOVD. ***Total: frequência de cada variante observada na amostra do banco de dados; AFR: população africana; AMR: população americana; ASN: população asiática; EUR: população europeia. A: adenina; C: citosina; G: guanina; T: timina

2. Variantes intrônicas

Cinco dos 22 íntrons do gene TSC1 (íntrons 7, 11, 13, 16 e 21) foram inteiramente

sequenciados, dadas suas curtas extensões (94 a 593 pb). Três íntrons (8, 10 e 18) tiveram pelo

menos 122 pb de cada extremidade 5’ ou 3’ sequenciados. Nove íntrons (1 a 6, 12, 14 e 22)

tiveram pelo menos 61 pb de cada extremidade 5’ ou 3’ sequenciados. Quatro íntrons (15, 17,

19 e 20) tiveram pelo menos 12 pb de cada extremidade sequenciados. O íntron 9 só teve 2 pb

sequenciados (Tabela 5).

Vinte polimorfismos intrônicos foram encontrados no gene TSC1 (Tabela 9). Dezesseis

destes não foram identificados como patogênicos ou possivelmente patogênicos nos bancos

de dados consultados (Projeto 1000 Genomes, LOVD). Quatro outras variantes de DNA em


44

íntrons do gene TSC1 foram inicialmente consideradas como potencialmente patogênicas, uma

vez que tiveram frequência abaixo de 1% observada no banco de sequências do Projeto 1000

Genomes. Entretanto, essas foram reclassificadas como polimorfismos raros de DNA, não

patogênicos em TSC1, pois foram detectadas em DNA de pacientes para os quais uma mutação

patogênica havia sido identificada neste gene. São elas: c.-80-71T>A (íntron 2), c.1334-174T>C

(íntron 13), c.2041+268 A>G (íntron 16) e c.2391+59G>C (íntron 18).

Tabela 9: Variantes intrônicas correspondentes a polimorfismos de DNA no gene TSC1.

Íntron Variante

(Pacientes*)

1000 Genomas **


2 c.-80-71T>A

(Pacientes 13 e 29)

T A T A T A T A T A

100% 0% 100% 0% 99% 1% 100% 0% 100% 0%

8 c.737+142 T>G (Paciente 11)

T G T G T G T G T G

97% 3% 98% 2% 97% 3% 100% 0% 94% 6%

11

c.1141+63 G>A (Paciente 6)

G A G A G A G A G A

99% 1% 97% 3% 100% 0% 100% 0% 100% 0%

c.1142-33 A>G (Pacientes 11, 13, 14 e

24)

A G A G A G A G A G

86% 14% 77% 23% 89% 11% 94% 6% 86% 14%

13

c.1333+209 C>T (Pacientes 1, 10, 11,

13, 14 e 24)

C T C T C T C T C T

86% 14% 76% 24% 89% 11% 94% 6% 85% 15%

c.1334-174T>C (Pacientes 10 e 14)

T C T C T C T C T C

ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND

c.1334-55 C>G (Pacientes 1 e 24)

C G C G C G C G C G

91% 9% 89% 11% 93% 7% 94% 6% 91% 9%

14

c.1438+92 G>T (Pacientes 1, 11, 14 e

24)

G T G T G T G T G T

86% 14% 76% 23% 89% 11% 94% 6% 85% 15%

c.1439-37 C>T (Pacientes 1, 10, 11,

13, 14 e 24)

C T C T C T C T C T

86% 14% 76% 24% 89% 11% 94% 6% 85% 5%

16 c.2041+268 A>G

(Pacientes 1, 10, 11, 13, 14, 24 e 28)

A G A G A G A G A G


18

c.2392-222 C>T (Pacientes 27 e 30)

C T C T C T C T C T

99% 1% 100% 0% 99% 1% 100% 0% 99% 1%

c.2392-35 T>C (Pacientes 1, 11, 11,

13, 14, 25 e 28)

T C T C T C T C T C

83% 17% 64% 36% 88% 12% 94% 6% 85% 15%

c.2391+59G>C (Pacientes 10)

G C G C G C G C G C

100% 0% 100% 0% 99% 1% 100% 0% 99% 1%

19

c.2502+51 A>G (Pacientes 3, 4 e 5)

A G A G A G A G A G

92% 8% 100% 0% 97% 3% 81% 19% 93% 7%

c.2502+131 C>T (Pacientes 1, 13,24)

C T C T C T C T C T

91% 9% 88% 12% 93% 7% 94% 6% 91% 9%


45

c.2503-117 G>T (Pacientes 1, 10, 11,

1324 e 28)

G T G T G T G T G T

83% 17% 64% 36% 88% 12% 94% 6% 85% 15%

20

c.2625+68 G>A (Todos, exceto

1, 2, 6, 10, 17, 21, 22, 26 e 29)

G A G A G A G A G A

59% 41% 94% 6% 54% 56% 45% 55% 58% 42%

22

c.2975+101 A>G (Pacientes 2, 3, 6 e 18)

A G A G A G A G A G

98% 2% 92% 8% 99% 1% 100% 0% 100% 0%

c.2976-54 G>A (Pacientes 2 e 3)

G A G A G A G A G A

99% 1% 98% 2% 99% 1% 100% 0% 100% 0%

c.2976-43 G>C (Pacientes 18)

G C G C G C G C G C

98% 2% 92% 8% 98% 2% 100% 0% 100% 0%

Estão representados os dados resumidos, obtidos no banco de dados de sequências LOVD e 1000 Genomes. Para o projeto 1000 Genomas, os dados foram obtidos em maio de 2014 e são referentes à fase 1 do projeto . * Identificação dos pacientes em que se observou a variante. ** Número de vezes descrita no banco de dados LOVD. *** Total: frequência de cada variante observada na amostra do banco de dados; ND: Não descrito. AFR: população africana; AMR: população americana; ASN: população asiática; EUR: população europeia. A: adenina; C: citosina; G: guanina; T: timina

C. Variantes de DNA inconclusivas

Quatro novas variantes de DNA foram identificadas em três pacientes, sendo uma

variação em sequência exônica e três outras a 5’ do promotor basal de TSC1. Nenhuma delas

foi localizada no banco de mutações LOVD (Tabela 10) e a referente ao éxon 2 apresentou

frequência abaixo de 1% entre os genomas do Projeto 1000 Genomes.

Tabela 10: Variantes de DNA inconclusivas, identificadas a 5’ do promotor basal e no éxon 2 do gene TSC1.

Segmento gênico

Variante (Paciente*)

1000 Genomas**


5’ ao promotor

basal

c.-606 G>T (Paciente 6)

G T G T G T G T G T


c.-605 C>G (Pacientes 6 e 18)

C G C G C G C G C G


c.-597 G>A (Paciente 6)

G A G A G A G A G A


Éxon 2 c.-99C>T

(Paciente 18)

C T C T C T C T C T

100% 0% 99% 1% 100% 0% 100% 0% 100% 0%

Estão representados os dados resumidos, obtidos no banco de dados de sequências LOVD e 1000 Genomes. Para o projeto 1000 Genomas, os dados foram obtidos em maio de 2014 e são referentes à fase 1 do projeto . *Identificação dos pacientes em que se observou a variante. **Número de vezes descrita no banco de dados LOVD. ***Total: frequência de cada variante observada na amostra do banco de dados ND: Não descrito. AFR: população africana; AMR: população americana; ASN: população asiática; EUR: população europeia. A: adenina; C: citosina; G: guanina; T: timina


46

1. Variante exônica inconclusiva

Como observado na Tabela 10, uma variante nova (c.-99C>T) foi detectada no éxon 2

do paciente 18, segmento que corresponde a parte da região 5’ não-traduzida (5’-UTR) no

RNAm do TSC1. Avaliamos a sequência dos dois alelos (c.-99C ou c.-99T) com ferramentas que

detectam elementos localizados em éxons (E), potencialmente acentuadores (do inglês,

enhancer, E) ou silenciadores (do inglês, silencer, S) de splicing do pré-RNAm (S), compondo

ESE ou ESS, respectivamente. Nenhum dos dois alelos, c.-99C ou c.-99T, foi reconhecido como

parte de acentuador ou silenciador de splicing do pré-RNAm pelas ferramentas

Acescan2/Rescue (Figura 9), Human Splicing Finder (Figura 10), ESE Finder (Figura 11) ou

SpliceAid (Figura 12).

Figura 9: Representação gráfica do resultado da análise in silico realizada com a ferramenta Acescan2/Rescue para busca de ESE, ESS, ISE ou ISS no éxon 2 do gene TSC1. A sequência genômica escrita em preto (5’-3’) refere-se à fita-código do gene TSC1, tem o segmento do éxon 2 em maiúsculas, o qual se mostra flaqueado por parte dos íntrons adjacentes (1 e 2, respectivamente) em minúsculas. Os elementos candidatos a acentuador exônico (ESE, em azul) ou intrônico (ISE, em rosa) de splicing do éxon 2 do TSC1 estão localizados acima da sequência genômica. Abaixo desta, encontram-se identificados elementos candidatos a inibidor exônico (ESS) ou intrônico (ISS) do splicing desse éxon (em verde). Na parte inferior da figura, é apresentada a localização da sequência analisada em relação aos cinco primeiros éxons do gene TSC1. São apresentados os resultados para a sequência do alelo c.-99C (posição indicada por seta em vermelho) que foram iguais aos observados para o alelo c.-99T (não mostrado).


47

Posição Tipo de Proteína Ligada Motif Valor 0-100 (variação)

c.-81+2 hnRNP A1 taagct 71.91 (+18.62 %)

c.-81+13 hnRNP A1 caggcc 72.86 (+21.38 %)

Figura 10: Representação gráfica do resultado da análise in silico realizada com a ferramenta Human Splicing Finder para busca de ESE, ESS, ISE ou ISS no éxon 2 do gene TSC1. A sequência genômica escrita em preto (5’-3’) refere-se à fita-código do gene TSC1, tem o segmento do éxon 2 em maiúsculas, o qual se mostra flaqueado por parte dos íntrons adjacentes (1 e 2, respectivamente) em minúsculas. Não foram identificados elementos exônicos candidatos a acentuador ou silenciador do splicing (ESE ou ESS) desse éxon, mas intrônicos candidatos a acentuador do splicing (ISE, em azul e em verde), mostrados acima da sequência do íntron 2. Na parte inferior da figura, é apresentada a localização da sequência analisada em relação aos cinco primeiros éxons do gene TSC1. Encontram-se representados apenas ISS cujas probabilidades de ação repressora estão acima de 10%. São apresentados os resultados para o alelo c.-99C (posição indicada por seta em vermelho) que foram iguais aos observados para o alelo c.-99T (não mostrado).


48

SF2/ASF Threshold: 1,956

SC35 Threshold: 2,383

SRp40 Threshold: 2,67

Pos. Motif Score Pos. Motif Score Pos. Motif Score

c.-132 GACACCA 2,434 c.-125 GGTTGACA 2,383 c.-133 AGACACC 3,304

c.-130 CACCAGG 2,345 c.-94 TGTCGCTA 2,485 c.-131 ACACCAG 2,969

c.-116 CACTGG 3,534

c.-122 TGACAGC 4,660

c.-107 CTGAAGT 2,343

c.-117 GCACTGG 3,574

c.-85 AACAGgt 3,126

c.-92 TCGCTAG 2,902

Figura 11: Representação gráfica do resultado da análise in silico realizada com a ferramenta ESEFinder para busca de ESE ou ESS no éxon 2 do gene TSC1. No eixo horizontal do gráfico, a sequência genômica escrita em preto (5’-3’) refere-se à fita-código do gene TSC1, tem o segmento do éxon 2 em maiúsculas, o qual se mostra flaqueado por parte dos íntrons adjacentes (1 e 2, respectivamente) em minúsculas. A cor de cada barra do gráfico representa um membro protótipo da família RS de proteínas ativadoras de splicing que apresentam domínios ricos em serina (S) e arginina (R). Esses membros da família (SF2/ASF, do inglês, splicing factor SF2/alternative splicing factor 1; SC35, do inglês, serin/arginine-rich splicing factor 2; e SRp40, do inglês, serin/arginine-rich splicing factor 5) estão identificados na Tabela de acordo com a cor que o representa no gráfico (tabela na parte inferior da figura). No gráfico, a altura de cada barra é determinada pelo valor no eixo vertical e refere-se à probabilidade relativa de cada elemento em cis identificado (acentuador exônico de splicing – ESE - do éxon 2 do TSC1 apresentados na Tabela) participar na regulação do splicing do éxon pela respectiva proteína ativadora. Na Tabela, pos é a posição da base na sequência do TSC1, motif é o candidato a ESE, score é a sua pontuação de acordo com o limite (threshold). Na parte intermediária da figura, é apresentada a localização da sequência analisada em relação aos cinco primeiros éxons do gene TSC1. São apresentados os resultados para a sequência do alelo c.-99C (posição indicada por seta em vermelho) que foram iguais aos observados para o alelo c.-99T (não mostrado).


49

Figura 12: Representação gráfica do resultado da análise in silico realizada com a ferramenta SpliceAid para busca de ESE ou ESS no éxon 2 do gene TSC1. A sequência genômica escrita em preto (5’-3’) refere-se à fita-código do gene TSC1, tem o segmento do éxon 2 em maiúsculas, o qual se mostra flaqueado por parte dos íntrons adjacentes (1 e 2, respectivamente) em minúsculas. As barras, posicionadas sobre a sequência exônica e também a sequência do íntron 1 indicam acrônimos de proteínas potencialmente regulatórias alinhadas ao elementos em cis candidatos a acentuadores (acima da sequência) ou silenciadores (abaixo da sequência) do éxon 2 do TSC1. Na parte intermediária da figura, é apresentada a localização da sequência analisada em relação aos cinco primeiros éxons do gene TSC1. São apresentados os resultados para a sequência do alelo c.-99C (posição indicada por seta em vermelho) que foram iguais aos observados para o alelo c.-99T (não mostrado).

Ao utilizarmos a ferramenta ESR Search, as ESE e ESS GAAGTACC, TGAAGTAC e

TACCAG foram identificadas para o alelo c.-99C, mas não para o alelo c.-99T (Figura 13).


50

Figura 13: Representação gráfica dos resultados das análises in silico realizadas com a ferramenta ESR Search para busca de ESE ou ESS no éxon 2 do gene TSC1. A sequência genômica escrita em preto (5’-3’) refere-se à fita-código do gene TSC1, tem o segmento do éxon 2 em maiúsculas, o qual se mostra flaqueado por parte dos íntrons adjacentes (1 e 2, respectivamente) em minúsculas. Em marrom encontram-se as ESE e ESS preditas por Goren et al., 2006 e em verde (ESE) e azul (ESS) preditas por Zhang & Chasin, 2004. Asteriscos em (A) indicam ESE e ESS não preditas quando se emprega a sequência do alelo mutado, c.-99T (B). Na parte inferior da figura, é apresentada a localização da sequência analisada em relação aos cinco primeiros éxons do gene TSC1.

2. Variantes inconclusivas a 5’ do promotor basal do gene TSC1

Três variantes a 5´ do promotor basal do gene TSC1 foram encontradas em dois

pacientes. O paciente 6 apresentou as três variantes c.-606G>T, c.-605C>G e c.-597G>A,

enquanto o paciente 18 somente a c.-605C>G (Tabela 3). Não é possível dizer se as três

variantes de DNA a 5’ do promotor de TSC1 segregam juntas no paciente 6. Uma busca in silico

por elementos em cis em sequência de 500 pb a 5’ do sítio de início da transcrição do gene

TSC1, que inclui o segmento entre c.-605 e c.-597, identificou um motivo para o fator de

transcrição da família forkhead (FOX) dos tipos F1, F2 ou J1, cujo consenso é 5’ (G/A)TAAACAA

3’. Embora esta sequência esteja presente entre as bases c.-597 e c.-605 (Figura 14), neste

segmento do gene TSC1, o consenso para FOXF1, F2 ou J1 apresenta-se na fita-molde. Nesta,

as bases variantes da sequência do TSC1 do paciente 6 flanqueiam o motivo para esse fator


51

transcricional (Figura 14). Assim como para as proteínas FOX F1, F2 e J1, o elemento também é

consensual para elementos reconhecidos por fatores de transcrição FOX dos tipos D1 e D2

(Figura 14).

Figura 14: As variantes de DNA do gene TSC1 identificadas a 5’ do promotor basal desse gene flanqueiam sequência conservada para sítio de ligação a fator transcricional FOX dos tipos D1 ou D2 e F1, F2 ou J1. A sequência de 500 pb a 5’ do sítio de iniciação da transcrição do gene TSC1 analisada e disponível pelo site do Swiss Regulon concentra dados de diferentes projetos sobre elementos de controle da transcrição gênica. Em (A) é apresentado segmento de 100 pb do TSC1 (sequência não mostrada) que se dispõe entre 350 a 450 pb a 5’ do sítio de início da transcrição do gene. A numeração do segmento do gene refere-se à sua posição no cromossomo 9. É mostrada a localização de motivos conservados já identificados em outros genes como sítios de reconhecimento de fatores de transcrição específicos, aqui denominados por acrônimos. A identificação de cada um como disponível no Swiss Regulon foi por similaridade. As pontas de seta indicam a orientação de cada consenso em relação ao cromossomo 9. Elementos identificados na cor vermelha têm probabilidade mais alta de similaridade ao consenso. Em (B) são mostrados dois pictogramas de sequências-consenso de motivos em geral reconhecidos por um grupo de proteínas FOX (D1 e D2 ou F1, F2 e J1). As sequências-consenso são conservadas nas bases c.-604 a c.-598 da fita molde do TSC1 (em cores e sublinhado). As bases c.-606G, c.-605C e c.-597G flanqueiam as bases do elemento consenso para essas proteínas FOX e são apresentadas em minúsculas em ambas as fitas e em negrito na fita-código.

D. Segmento gênico em homozigose

O paciente 10, no qual a mutação c.2745delC foi identificada no éxon 21 do gene TSC1,

apresentou outras oito variantes de DNA. Assim como a mutação patogênica, a variante


52

c.2391+59G>C, localizada no íntron 18, apresentou-se em heterozigose. As sete outras

variantes de DNA, c.1333+209C>T (íntron 13), c.1334-174T>C (íntron13), c.1335A>G (p.445E>E,

éxon 14), c.1439-37C>T (íntron 14), c.2041-268A>G (íntron 16), c.2392-35T>C (íntron 18) e

c.2503-117G>T (íntron 19), ocorreram em homozigose. A frequência de homozigose esperada

para o alelo menos frequente (0,13 a 0,14), que nos cinco locos informativos foi apresentado

pelo paciente, é próxima a 2% (Tabela 8 eTabela 9). Não há histórico familiar da doença na

família desse paciente (Tabela 6) nem relato de consaguinidade.


53

VII. Discussão

A epilepsia é o sinal mais frequente entre pacientes com TSC (Chu-Shore et al., 2010) e

está presente em 26 dos 28 pacientes (93%) que vêm sendo analisados nos Serviços de

Neurologia da SCSP e UFPR. SEGAs podem agravar a epilepsia desses pacientes (Krueger et al.,

2013). Dez de 28 pacientes apresentaram SEGA (35,7%), uma taxa superior à esperada (10% a

15%, Northrup et al., 2013). Essa e a frequência de epilepsia entre esses pacientes podem

dever-se à natureza dos serviços onde são acompanhados. Em especial, observou-se alto

índice de SEGA entre os pacientes da HSCM-SP (9/19, 47,4%) quando comparado ao dos

pacientes da HU-UFPR (1/9, 11,1%). A deficiência intelectual é um conjunto de sinais que se

associa em elevada frequência à epilepsia nos pacientes com TSC, uma vez que esta se deve,

sobretudo, às hamártias - tuberosidades corticais e heterotopias neuronais – lesões que

surgem durante o desenvolvimento cortico-cerebral do embrião e que podem estar presentes

na grande maioria dos pacientes (Crino, 2013). Por ser uma condição própria do

desenvolvimento, a avaliação por testes neuropsicológicos não é geralmente realizada antes

dos sete anos de idade (Houser & Gomez, 1992; Shepherd et al., 1995). Por isso, seu

diagnóstico permanece não determinado ou não concluído em alguns casos (Tabela 6).

Mutações nos genes TSC1 ou TSC2 podem causar TSC (Northrup et al., 1993

(atualizado 2011); Jones et al., 1997; Cheadle et al., 2000). As metodologias mais modernas

para sequenciamento de DNA mostraram-se úteis e mais efetivas em identificar mosaicismo

somático em TSC1 ou TSC2, embora tenham mantido semelhantes os percentuais de pacientes

sem mutação identificada (NMI) aos avaliados por sequenciamento de Sanger (Qin et al., 2010;

van Veghel-Plandsoen et al., 2011). É possível a existência de um terceiro gene, ainda não

identificado, cujas mutações possam causar TSC (TSC3, Kwiatkowski, 2005). Em outro cenário,

pacientes sem mutação identificada em leucócitos poderiam apresentar mosaicismo somático

do primeiro evento mutacional, podendo este ser detectável em tecido afetado por

hamartoma. Entretanto, análises recentes com sequenciamento massivo, em paralelo de DNA


54

de angiofibromas de 4 pacientes com TSC não detectou mutações em 18% deles (Tyburczy et

al., 2013). Ainda, a combinação de polimorfismos de DNA em genes codificadores para

proteínas da via do mTOR poderia, em outra hipótese, causar TSC em pacientes NMI. São

aceitas as observações reprodutíveis de que pacientes NMI tenham, em conjunto, um fenótipo

mais leve, caracterizado por baixa incidência de lesões no cérebro, lesões renais e crises

convulsivas (Camposano et al., 2009; Boronat et al., 2013).

Por outro lado, observou-se que pacientes com mutações novas em TSC2 quando

comparados aos portadores de mutações em TSC1 são acometidos por um quadro clínico mais

grave, em que é frequentemente mais alto o índice de crises convulsivas e deficiência

intelectual (Jones et al., 1999; Dabora et al., 2001; Au et al., 2007). Mesmo assim, pacientes

com mutações novas ou herdadas em TSC1 ou casos familiais de TSC com mutações em TSC2

podem também apresentar quadros clínicos, graves (Young et al., 1998; Crino, 2013; Niida et

al., 2013). Assim, a gravidade do quadro clínico não pode guiar na busca do gene, alvo da

mutação que causou o TSC.

Entre pacientes com mutações identificadas em TSC1 ou TSC2, cerca de 30%

representam casos familiais e o restante (70%) é esporádico (Niida et al., 1999; Dabora et al.,

2001; Sancak et al., 2005; Au et al., 2007). Nos casos esporádicos, aproximadamente 50% têm

mutações em TSC2 (Dabora et al., 2001; Au et al., 2007), podendo sugerir que este gene seja

mais vulnerável à mutagênese, o que pode ser justificado por sua maior extensão se

comparado ao TSC1. Uma alternativa para explicar essa diferença seria a falta de diagnóstico

clínico ou o diagnóstico possível, não definitivo, dos casos mais leves de TSC em decorrência de

mutação em TSC1.

Cinco em cada 100 pacientes com TSC devem ter também a doença renal policística

(PKD) devido à deleção de pelo menos as porções 3’ dos genes contíguos, TSC2 e PKD1, cujos

sentidos são opostos no cromossomo 16 (Harris et al., 1995). Com um curto segmento de DNA

(aproximadamente 60 pb) entre seus sítios de poliadenilação, supõe-se que deleções


55

genômicas compreendendo essa região interfiram na estabilidade dos RNAm produzidos pela

expressão de cada gene, PKD1 ou TSC2 (Brook-Carter et al., 1994; Longa et al., 1997). Assim,

para a detecção de mutações causadoras de TSC em DNA de pacientes que sabidamente

apresentam PKD, indica-se utilizar metodologias como MLPA (Kozlowski et al., 2008; Oyazato

et al., 2011), uma vez que o sequenciamento de Sanger será negativo.

Os critérios diagnósticos para identificação de cistos renais à ultrassonografia são

baseados no princípio que cistos renais simples (< 3 cm em diâmetro, uni ou bilaterais, ovais

ou circulares, corticais, contornos bem definidos, com parede fina e lisa) não ocorrem

comumente em crianças e adolescentes, mas aparecem com maior frequência à medida que a

idade avança (Eknoyan, 2009). Três pacientes (2, 11 e 16 anos de idade) apresentaram cistos

renais bilaterais. Nenhum deles teve mutação de ponto identificada no gene TSC1. Embora não

tenhamos tido acesso às descrições dos cistos à ultrassonografia ou tomografia

computadorizada, a ocorrência de cistos renais, bilaterais, nessas idades, em pacientes com

TSC sugere ADPKD indica acompanhamento com exames por imagem, monitorar pressão

arterial, e avaliar ritmo de filtração glomerular (Krueger et al., 2013). Projetos de pesquisa, em

andamento na HSC-SP e HU-UFPR, deverão abordar o aspecto e a evolução dessas lesões e a

possibilidade de diagnóstico de PKD de acordo com o preenchimento de critérios apropriados,

em seguimento longitudinal (Gabow et al., 1997; Sweeney & Avner, 2011). Esses pacientes

serão candidatos a terem o DNA analisado por MLPA.

Considerando-se a estimativa de 5% e 15% de pacientes com TSC respectivamente

com PKD e NMI, e 25% dos pacientes avaliados no presente estudo com mutações patogênicas

em TSC1, faz-se a projeção de que 55% dos pacientes (15-16/28) deverão ter mutações

patogênicas em TSC2, um a dois pacientes com deleção contígua de TSC2 e PKD1 e quatro

pacientes NMI. Assim, se esta amostra seguir a tendência de outros relatos, entre os 28

pacientes deste estudo, 24 deverão ter mutação identificada em TSC1 ou TSC2 e 29,2% (7/24)

têm mutações em TSC1. Como dito, entre os pacientes com mutações identificadas em TSC1


56

ou TSC2, cerca de 70% e 30% correspondem aos casos esporádicos e familiais,

respectivamente. Se 30% e 50% respectivamente de casos esporádicos e familiais devem ter

mutações em TSC1, estima-se que 36% [(0,3 X 70) + (0,5 X 30)] de todos os pacientes com TSC

e mutações identificadas tenham alterações patogênicas em TSC1. Embora nossos dados

(29,2%) estejam abaixo do observado (36%), variações são esperadas e relacionadas

principalmente à composição da amostra. Uma vez padronizada, há pouca variação na técnica

de sequenciamento de Sanger. Nossos amplicoms foram definidos com iniciadores intrônicos

para a PCR, muitas vezes mais afastados da borda exônica do que geralmente empregado

(Jones et al., 1997). Houve uniformização para o conteúdo de bases avaliado para todo

paciente.

As informações das frequências de mutações em TSC1 ou TSC2 permitem determinar

um fluxo de trabalho no laboratório para a detecção de mutações causadoras de TSC para

todo paciente que não apresentar PKD. Sugere-se que seja realizado o sequenciamento de

DNA em primeiro lugar para o gene TSC2. Se nenhuma mutação patogênica for encontrada,

segue-se com o sequenciamento de DNA do gene TSC1. Na falta de detecção de mutação de

ponto em TSC1 ou TSC2 deve-se empregar metodologia para detecção de deleção genômica,

entre as quais o MLPA seguido de confirmação por RTqPCR tem sido mais frequentemente

utilizado (Rendtorff et al., 2005; Kozlowski et al., 2007; Kozlowski et al., 2008).

Considerando-se que este é um trabalho de mestrado, com um tempo limitado,

decidimos estudar somente um dos dois genes, TSC1 ou TSC2. Como não dispúnhamos ainda

da amostra de DNA de pacientes, eles ainda não haviam sido convocados para o estudo e por

ser o gene TSC1 mais curto do que o TSC2 (18 Vs. 41 amplicoms de PCR e 46 Vs. 82 reações de

sequenciamento, respectivamente), optamos por trabalhar com o gene TSC1, embora número

mais baixo de mutações fosse previsto do que para TSC2. Contudo, com a continuação da

análise desta amostra no curso de doutoramento, prevemos empregar o sequenciamento de


57

Sanger de TSC2, MLPA e qPCR no DNA destes e de novos pacientes que deverão expandir a

amostra.

Na última década, com o avanço tecnológico para sequenciamento de DNA de forma

massiva e em paralelo (Margulies et al., 2005), é natural esperar que novas abordagens

diagnósticas, moleculares sejam atualizadas e transferidas para novas plataformas. A ausência

de hot spots para as mutações de pacientes com TSC, sua distribuição entre pelo menos dois

genes e uma vasta maioria de mutações exônicas entre todas identificadas são fatores que

fazem das metodologias de última geração uma alternativa razoável a se considerar para a

detecção molecular de mutações em TSC1 ou TSC2. Com o objetivo de desenvolver estudos

funcionais com mutações nesses genes, ao longo prazo, estabelecemos como prioridades (i) o

estabelecimento de uma amostra fenotipicamente bem caracterizada, como vem sendo

realizado pelos neurologistas colaboradores; (ii) a padronização de metodologias de Sanger,

MLPA e RTqPCR para os genes TSC1 e TSC2, com conhecimento de custos, cobertura e

eficiência; (iii) o estudo da distribuição e frequência de mutações em cada gene e seus

segmentos (sequência exônica, codificadora ou não; íntrons; promotores ou outros segmentos

reguladores); e, finalmente, ao longo prazo, (iv) um estudo de associações fenótipo-

genotípicas de uma amostra expandida de pacientes. De acordo com essas prioridades, a

avaliação por sequenciamento massivo, em paralelo do DNA de pacientes com TSC deve vir de

forma comparativa à tecnologia padrão-ouro, o sequenciamento de Sanger. Mesmo se, no

futuro, metodologias mais recentes se estabelecerem como o padrão-ouro, o sequenciamento

de Sanger deverá se manter essencial para confirmação de variantes de DNA detectadas por

metodologia mais robusta e para verificar a presença de mutação em familiares de probando

cuja mutação já tenha sido identificada.

A maioria das mutações patogênicas descritas no gene TSC1 está localizada em sua

região codificadora, sendo mais de 90% delas do tipo sem sentido (nonsense) ou inserções ou

deleções que causam deslocamento da leitura à tradução (frameshift, Tabela 11). Do mesmo


58

modo, entre as sete mutações em TSC1 consideradas patogênicas no nosso estudo, três foram

do tipo nonsense e quatro do tipo frameshift, sendo duas destas ainda não descritas. Todas

essas mutações causaram um códon de parada prematura, em seis delas é anterior à região

coiled-coil, C-terminal (Figura 6A, B, C e Figura 7A, C e E), exceto na mutação c.2745delC onde

75% desta região deve ainda ser traduzida (Figura 7G). A redução de 25% da região coiled-coil

C-terminal de hamartina na mutação c.2745delC não prevê efeito sobre a estabilidade da

tuberina, mas da própria hamartina pela falta de expressão do éxon 23 (Santiago Lima et al.,

2014). Em nenhuma das deleções ou duplicações de ponto nos éxons 21, 22 ou 23 já

depositadas no LOVD, que levaram a uma redução no tamanho da região coiled-coil, o efeito

sobre tuberina foi analisado. Por outro lado, um estudo recente demonstrou que os

aminoácidos 939 a 977 da hamartina humana são necessários e suficientes para a interação

com a proteína TBC1D7 (do inglês, TBC1 domain family member 7, Santiago Lima et al., 2014).

Embora mutações em TBC1D7 não causem TSC, o produto proteico da expressão desse gene

foi relatado como parte do complexo hamartina-tuberina e necessário à sua estabilidade

(Dibble et al., 2012). Desta forma, a mutação c.2745delC no éxon 21 de TSC1 foi considerada

patogênica.

Tabela 11: Variantes de DNA depositadas no banco de dados LOVD até maio/2014, consideradas patogênicas ou não.

Tipo de Variante Total observado Região Porcentagem

(%) 5' Codificadora Intrônica 3'UTR

Substituição 1288 9 1004 234 41 72,12

Deleção 365 5 314 43 3 20,44

Duplicação 103 1 98 4 0 5,77

Inserção 14 0 13 1 0 0,78

Inserção/deleção 6 0 5 1 0 0,34

Inversão 6 0 0 6 0 0,34

Desconhecido 4 0 0 0 0 0,22

Total 1786 15 1434 289 44 100

Fonte: http://chromium.liacs.nl/LOVD2/TSC/variants_statistics.php * Nenhuma descrição de variante a 5` do éxon 1.


59

O mesmo paciente apresentou todo o segmento gênico de TSC1 até o éxon 18 em

homozigose, incluindo cinco variantes de DNA, cuja frequência em homozigose é menor que

2%, cada. Variantes em heterozigose foram observadas no íntron 18 e éxon 21, no qual

corresponde à mutação patogênica citada acima (Figura 7G). Embora esta mutação deva ser a

causa de TSC neste paciente (veja acima), seu DNA deverá ser avaliado também por MLPA para

se afastar a possibilidade de deleção intragênica em TSC1. Há possibilidade de convocar os pais

para análise do DNA.

As sete mutações patogências identificadas distribuíram-se aos éxons 10, 14, 15, 18 e

21 (Figura 15). A aparente elevada frequência de mutações no éxon 15 do TSC1 pode dever-se

ao seu maior tamanho, sendo o segundo maior éxon do gene.

Figura 15: Distribuição das sete mutações patogênicas identificadas no gene TSC1. No eixo vertical os números representam a quantidade de mutações patogênica; no eixo horizontal, estão representados cada éxon do gene TSC1.

É incomum a identificação de mutações que alterem a inclusão de éxon no transcrito

do TSC1. Baseando-nos em uma triagem inicial da frequência do alelo de 20 variantes

intrônicas identificadas ou exclusão pela presença destas em DNA de paciente com mutação

detectada, todas foram descartadas com frequência maior que 1% em mais de mil genomas

analisados in silico (Tabela 9). A única variante de DNA com baixa frequência e identificada em

0

1

2

3

4

Éxo

n 1

Éxo

n 2

Éxo

n 3

Éxo

n 4

Éxo

n 5

Éxo

n 6

Éxo

n 7

Éxo

n 8

Éxo

n 9

Éxo

n 1

0

Éxo

n 1

1

Éxo

n 1

2

Éxo

n 1

3

Éxo

n 1

4

Éxo

n 1

5

Éxo

n 1

6

Éxo

n 1

7

Éxo

n 1

8

Éxo

n 1

9

Éxo

n 2

0

Éxo

n 2

1

Éxo

n 2

2

Éxo

n 2

3


60

paciente sem mutação detectada foi c.-99C>T no éxon 2 do paciente 18 (Tabela 10). Busca por

elementos acentuadores ou silenciadores exônicos de splicing de pré-RNAm, com a

ferramenta ESR Search, identificou três elementos em potencial para o alelo c.-99C, não

reconhecidos para o alelo c.-99T (Figura 13). Este paciente é do sexo feminino, tem 11 anos e

não apresenta epilepsia ou deficiência intelectual, embora teste neuropsicológico esteja em

andamento, nem acometimento renal (Tabela 6). Embora os dados fenotípicos ainda não

tenham sido analisados, esses preliminares sugerem se tratar de um caso mais leve sob o

ponto de vista neurológico, uma vez que nessa idade, o quadro de epilepsia e deficiência

intelectual já deveriam ter se manifestado. A variante c.-99C>T reside no éxon 2, não

codificador para hamartina. Embora a região 5’ não traduzida desempenhe, em geral,

importante papel regulador da tradução e possa controlar também a estabilidade de RNAm,

não se conhecem ainda os aspectos moleculares da regulação do RNAm do TSC1. Assim,

apesar de não podermos inferir de forma consistente o papel funcional de tal variante exônica

nem conseguirmos informações sobre fatores de splicing que possam se associar a ela, há a

hipótese de que os elementos identificados in silico possam funcionar como acentuadores

exônicos do splicing do éxon 2 de TSC1. Para começar a testar tal hipótese, precisaremos

verificar se no RNAm de fibrolastos de pele da paciente, há splicing alternativo com exclusão

do éxon 2 e se este padrão difere de controles. Contudo, tal hipótese só deverá ser testada se

nenhuma mutação patogênica for encontrada em TSC2 para a paciente 18.

A identificação de variante de DNA fora de região codificadora para proteínas nem

sempre tem interpretação fácil. Por um lado, o segmento de DNA não codificador para

proteínas é menos estudado e, por isso, mesmo na análise in silico em bancos de dados como

o 1000 Genomes, a frequência da variante pode não estar registrada (Tabela 10). Por outro

lado, a inferência de papeis regulatórios in silico permanecem ainda pouco convincente, dada

a relativa parcimômia de dados para alimentar tais bancos de dados. Um terceiro ponto

relevante é a natureza de elementos em cis, com papéis potencialmente reguladores da


61

expressão gênica. São, em geral, sequências curtas e com caráter degenerado (Blencowe,

2012). Este foi o caso das três variantes de DNA detectadas no segmento a 5’ do promotor de

TSC1 (Figura 14). Embora não tenhamos identificado similaridade dessas três bases com

elementos em cis genômicos reconhecidos por fatores transcricionais, percebemos que esses

nucleotídeos flaqueiam um motivo reconhecido por membros da família FOX (D1, D2, F1, F2

ou J1). Neste tipo de motivo, a porção central é mais conservada e a periferia não o é, embora

seja muitas vezes necessária (Marsman & Horsfield, 2012). As sequências-consenso

encontram-se em fitas opostas e não são palindrômicas (Figura 14). Mesmo assim, há a

possibilidade de formação de loops de cromatina entre o segmento reconhecido pelo fator de

transcrição FOX e o mediador ou promotor basal (Marsman & Horsfield, 2012).

FOXD1 é um fator transcricional que se mostrou importante na promoção da

diferenciação de progenitores celulares do néfron do rim embrionário (Fetting et al., 2014); na

expansão de pericitos na patogênese da fibrose pulmonar (Boronat et al., 2013) e na

reprogramação de células com pluripotência induzida (Koga et al., 2014). Uma vez que os

hamartomas de pacientes com TSC parecem derivar de células pluripotentes do encéfalo e

perivasculares como PECs ou pericitos, FOXD1 pode ser um fator candidato a regular a

expressão de TSC1. Entretanto, como explicado anteriormente, deveremos conhecer se há

mutação patogênica no DNA do paciente que apresenta as três variantes de DNA e,

essencialmente, verificar se elas segregam juntas no mesmo cromossomo, através da

clonagem do amplicom específico e seu sequenciamento.

Em resumo, além de sete mutações patogênicas identificadas, variantes de DNA novas,

como as quatro descritas, constituem uma fonte importante para estudos funcionais, cujos

resultados podem contribuir não somente ao entendimento da função do gene, mas também

à identificação de novas mutações patogênicas.


62

VIII. Conclusões

1. Mutações de sentido trocado (nonsense) ou com deslocamento da leitura à tradução

(frameshift) no gene TSC1 foram identificadas no DNA de sete pacientes com diagnóstico

definitivo de TSC, procedentes do estado de São Paulo.

2. Quatro novas variantes de DNA foram detectadas em regiões potencialmente reguladoras

da expressão do gene TSC1, éxon 2 e segmento a 5’ do promotor do gene, podendo

revelar-se como mutações patogênicas e, portanto, necessitam ser testadas

experimentalmente.


63

IX. Referências Bibliográficas

Adriaensen, M. E., Schaefer-Prokop, C. M., Stijnen, T., Duyndam, D. A., Zonnenberg, B. A., e Prokop, M. (2009). Prevalence of Subependymal Giant Cell Tumors in Patients with Tuberous Sclerosis and a Review of the Literature. European journal of neurology : the official journal of the European Federation of Neurological Societies 16, 691-696.

Adzhubei, I. A., Schmidt, S., Peshkin, L., Ramensky, V. E., Gerasimova, A., Bork, P., Kondrashov, A. S., e Sunyaev, S. R. (2010). A Method and Server for Predicting Damaging Missense Mutations. Nat Methods 7, 248-249.

Ashfaq, R., Weinberg, A. G., e Albores-Saavedra, J. (1993). Renal Angiomyolipomas and Hmb-45 Reactivity. Cancer 71, 3091-3097.

Au, K. S., Williams, A. T., Gambello, M. J., e Northrup, H. (2004). Molecular Genetic Basis of Tuberous Sclerosis Complex: From Bench to Bedside. Journal of child neurology 19, 699-709.

Au, K. S., Williams, A. T., Roach, E. S., Batchelor, L., Sparagana, S. P., Delgado, M. R., Wheless, J. W., Baumgartner, J. E., Roa, B. B., Wilson, C. M., et al. (2007). Genotype/Phenotype Correlation in 325 Individuals Referred for a Diagnosis of Tuberous Sclerosis Complex in the United States. Genet Med 9, 88-100.

Bastos, A. P., e Onuchic, L. F. (2011). Molecular and Cellular Pathogenesis of Autosomal Dominant Polycystic Kidney Disease. Braz J Med Biol Res 44, 606-617.

Blencowe, B. J. (2012). An Exon-Centric Perspective. Biochemistry and cell biology = Biochimie et biologie cellulaire 90, 603-612.

Boronat, S., Shaaya, E., Doherty, C., Caruso, P., e Thiele, E. (2013). Tuberous Sclerosis Complex without Tubers and Subependymal Nodules: A Phenotype-Genotype Study. Clinical genetics.

Bourneville, D. M. (1880). Sclérose Tubéreuse Des Circonvolutions Cérébrales. Arch Neurol 1, 11.

Brook-Carter, P. T., Peral, B., Ward, C. J., Thompson, P., Hughes, J., Maheshwar, M. M., Nellist, M., Gamble, V., Harris, P. C., e Sampson, J. R. (1994). Deletion of the Tsc2 and Pkd1 Genes Associated with Severe Infantile Polycystic Kidney Disease--a Contiguous Gene Syndrome. Nature genetics 8, 328-332.

Buccoliero, A. M., Franchi, A., Castiglione, F., Gheri, C. F., Mussa, F., Giordano, F., Genitori, L., e Taddei, G. L. (2009). Subependymal Giant Cell Astrocytoma (Sega): Is It an Astrocytoma? Morphological, Immunohistochemical and Ultrastructural Study. Neuropathology : official journal of the Japanese Society of Neuropathology 29, 25-30.

Campos, F. P. F. d., Ferreira, C. R., Simões, A. B., Alcântara, P. S. M. d., Matines, B. M., Silva, A. F. d., Azzi-Nogueira, D., Britto, L. R. G. d., Dufner-Almeida, L. G., e Haddad, L. A. (2013). Unilateral Giant Renal Angiomyolipoma and Pulmonar Lymphangioleiomyomatosis. Autopsy and Case Reports 3, 53-62.

Camposano, S. E., Greenberg, E., Kwiatkowski, D. J., e Thiele, E. A. (2009). Distinct Clinical Characteristics of Tuberous Sclerosis Complex Patients with No Mutation Identified. Ann Hum Genet 73, 141-146.

Carsillo, T., Astrinidis, A., e Henske, E. P. (2000). Mutations in the Tuberous Sclerosis Complex Gene Tsc2 Are a Cause of Sporadic Pulmonary Lymphangioleiomyomatosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 97, 6085-6090.

Cartegni, L., Wang, J., Zhu, Z., Zhang, M. Q., e Krainer, A. R. (2003). Esefinder: A Web Resource to Identify Exonic Splicing Enhancers. Nucleic acids research 31, 3568-3571.

Castro, M., Shepherd, C. W., Gomez, M. R., Lie, J. T., e Ryu, J. H. (1995). Pulmonary Tuberous Sclerosis. Chest 107, 189-195.

Cheadle, J., Reeve, M., Sampson, J., e Kwiatkowski, D. (2000). Molecular Genetic Advances in Tuberous Sclerosis. Human genetics 107, 97-114.


64

Chiron, C., Dumas, C., Jambaqué, I., Mumford, J., e Dulac, O. (1997). Randomized Trial Comparing Vigabatrin and Hydrocortisone in Infantile Spasms Due to Tuberous Sclerosis. Epilepsy Res 26, 389-395.

Choy, Y. S., Dabora, S. L., Hall, F., Ramesh, V., Niida, Y., Franz, D., Kasprzyk-Obara, J., Reeve, M. P., e Kwiatkowski, D. J. (1999). Superiority of Denaturing High Performance Liquid Chromatography over Single-Stranded Conformation and Conformation-Sensitive Gel Electrophoresis for Mutation Detection in Tsc2. Ann Hum Genet 63, 383-391.

Chu-Shore, C. J., Major, P., Camposano, S., Muzykewicz, D., e Thiele, E. A. (2010). The Natural History of Epilepsy in Tuberous Sclerosis Complex. Epilepsia 51, 1236-1241.

Consortium, T. E. C. T. S. (1993). Identification and Characterization of the Tuberous Sclerosis Gene on Chromosome 16. Cell 75, 11.

Crino, P. B. (2013). Evolving Neurobiology of Tuberous Sclerosis Complex. Acta neuropathologica 125, 317-332.

Crino, P. B., Aronica, E., Baltuch, G., e Nathanson, K. L. (2010). Biallelic Tsc Gene Inactivation in Tuberous Sclerosis Complex. Neurology 74, 1716-1723.

Crundwell, M. (2004). Pathology and Genetics of Tumours of the Urinary System and Male Genital Organs. BJU International 94, 675-675.

Curatolo, P. (2003). Tuberous Sclerosis Complex: From Basic Science to Clinical Phenotypes. Mac Keith Press, Cambridge.

Curatolo, P., Seri, S., Verdecchia, M., e Bombardieri, R. (2001). Infantile Spasms in Tuberous Sclerosis Complex. Brain & development 23, 502-507.

Dabora, S. L., Jozwiak, S., Franz, D. N., Roberts, P. S., Nieto, A., Chung, J., Choy, Y. S., Reeve, M. P., Thiele, E., Egelhoff, J. C., et al. (2001). Mutational Analysis in a Cohort of 224 Tuberous Sclerosis Patients Indicates Increased Severity of Tsc2, Compared with Tsc1, Disease in Multiple Organs. American journal of human genetics 68, 64-80.

Davidson, M., Yoshidome, H., Stenroos, E., e Johnson, W. G. (1991). Neuron-Like Cells in Culture of Tuberous Sclerosis Tissue. Annals of the New York Academy of Sciences 615, 196-210.

Desmet, F. O., Hamroun, D., Lalande, M., Collod-Beroud, G., Claustres, M., e Beroud, C. (2009). Human Splicing Finder: An Online Bioinformatics Tool to Predict Splicing Signals. Nucleic acids research 37, e67.

Dibble, C. C., Elis, W., Menon, S., Qin, W., Klekota, J., Asara, J. M., Finan, P. M., Kwiatkowski, D. J., Murphy, L. O., e Manning, B. D. (2012). Tbc1d7 Is a Third Subunit of the Tsc1-Tsc2 Complex Upstream of Mtorc1. Molecular cell 47, 535-546.

Eble, J. N. (1998). Angiomyolipoma of Kidney. Seminars in diagnostic pathology 15, 21-40.

Eknoyan, G. (2009). A Clinical View of Simple and Complex Renal Cysts. Journal of the American Society of Nephrology : JASN 20, 1874-1876.

Fernandez-Flores, A. (2011). Perivascular Migration: A Clue to the Histogenesis of Pecomas? The American Journal of dermatopathology 33, 528-529.

Fetting, J. L., Guay, J. A., Karolak, M. J., Iozzo, R. V., Adams, D. C., Maridas, D. E., Brown, A. C., e Oxburgh, L. (2014). Foxd1 Promotes Nephron Progenitor Differentiation by Repressing Decorin in the Embryonic Kidney. Development 141, 17-27.

Folpe, A. L., e Kwiatkowski, D. J. (2010). Perivascular Epithelioid Cell Neoplasms: Pathology and Pathogenesis. Human Pathology 41, 1-15.

Franz, D. N., Bissler, J. J., e McCormack, F. X. (2010). Tuberous Sclerosis Complex: Neurological, Renal and Pulmonary Manifestations. Neuropediatrics 41, 199-208.


65

Frey, U. H., Bachmann, H. S., Peters, J., e Siffert, W. (2008). Pcr-Amplification of Gc-Rich Regions: 'Slowdown Pcr'. Nature protocols 3, 1312-1317.

Gabow, P. A., Kimberling, W. J., Strain, J. D., Manco-Johnson, M. L., e Johnson, A. M. (1997). Utility of Ultrasonography in the Diagnosis of Autosomal Dominant Polycystic Kidney Disease in Children. Journal of the American Society of Nephrology : JASN 8, 105-110.

Gerstein, M. B., Bruce, C., Rozowsky, J. S., Zheng, D., Du, J., Korbel, J. O., Emanuelsson, O., Zhang, Z. D., Weissman, S., e Snyder, M. (2007). What Is a Gene, Post-Encode? History and Updated Definition. Genome Res 17, 669-681.

Gomez, M., Sampson, J., e Holtes-Whittemore, V. (1999). Tuberous Sclerosis Complex. Oxford University Press 3rd edition.

Gomez, M. R. (1988). Varieties of Expression of Tuberous Sclerosis. Neurofibromatosis 1, 330-338.

Goncharova, E., Goncharov, D., Noonan, D., e Krymskaya, V. P. (2004). Tsc2 Modulates Actin Cytoskeleton and Focal Adhesion through Tsc1-Binding Domain and the Rac1 Gtpase. The Journal of cell biology 167, 1171-1182.

Goodman, M., Lamm, S. H., Engel, A., Shepherd, C. W., Houser, O. W., e Gomez, M. R. (1997). Cortical Tuber Count: A Biomarker Indicating Neurologic Severity of Tuberous Sclerosis Complex. Journal of child neurology 12, 85-90.

Goren, A., Ram, O., Amit, M., Keren, H., Lev-Maor, G., Vig, I., Pupko, T., e Ast, G. (2006). Comparative Analysis Identifies Exonic Splicing Regulatory Sequences--the Complex Definition of Enhancers and Silencers. Molecular cell 22, 769-781.

Grajkowska, W., Kotulska, K., Jurkiewicz, E., e Matyja, E. (2010). Brain Lesions in Tuberous Sclerosis Complex. Review. Folia neuropathologica / Association of Polish Neuropathologists and Medical Research Centre, Polish Academy of Sciences 48, 139-149.

Hancock, E., e Osborne, J. (1998). Treatment of Infantile Spasms with High-Dose Oral Prednisolone. Developmental medicine and child neurology 40, 500.

Harris, P. C., Ward, C. J., Peral, B., e Hughes, J. (1995). Autosomal Dominant Polycystic Kidney Disease: Molecular Analysis. Hum Mol Genet 4 Spec No, 1745-1749.

Hayashi, T., Kumasaka, T., Mitani, K., Yao, T., Suda, K., e Seyama, K. (2010). Loss of Heterozygosity on Tuberous Sclerosis Complex Genes in Multifocal Micronodular Pneumocyte Hyperplasia. Modern pathology : an official journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc 23, 1251-1260.

Holmes, G. L., Stafstrom, C. E., e Tuberous Sclerosis Study, G. (2007). Tuberous Sclerosis Complex and Epilepsy: Recent Developments and Future Challenges. Epilepsia 48, 617-630.

Hoogeveen-Westerveld, M., Ekong, R., Povey, S., Karbassi, I., Batish, S. D., den Dunnen, J. T., van Eeghen, A., Thiele, E., Mayer, K., Dies, K., et al. (2012). Functional Assessment of Tsc1 Missense Variants Identified in Individuals with Tuberous Sclerosis Complex. Hum Mutat 33, 476-479.

Hosoyaa, M., Naitoa, H., e Nihei, K. (1999). Neurological Prognosis Correlated with Variations over Time in the Number of Subependymal Nodules in Tuberous Sclerosis. Brain & development 21, 4.

Houser, O. W., e Gomez, M. R. (1992). Ct and Mr Imaging of Intracranial Tuberous Sclerosis. The Journal of dermatology 19, 904-908.

Humphrey, A., Williams, J., Pinto, E., e Bolton, P. F. (2004). A Prospective Longitudinal Study of Early Cognitive Development in Tuberous Sclerosis - a Clinic Based Study. European child & adolescent psychiatry 13, 159-165.

Hunt, A., e Lindenbaum, R. H. (1984). Tuberous Sclerosis - a New Estimate of Prevalence within the Oxford Region. Journal of Medical Genetics 21, 272-277.


66

Huttenlocher, P. R., e Wollmann, R. L. (1991). Cellular Neuropathology of Tuberous Sclerosis. Annals of the New York Academy of Sciences 615, 140-148.

Jansen, F. E., van Nieuwenhuizen, O., e van Huffelen, A. C. (2004). Tuberous Sclerosis Complex and Its Founders. Journal of neurology, neurosurgery, and psychiatry 75, 770.

Johnson, W. G., Yoshidome, H., Stenroos, E. S., e Davidson, M. M. (1991). Origin of the Neuron-Like Cells in Tuberous Sclerosis Tissues. Annals of the New York Academy of Sciences 615, 211-219.

Joinson, C., O'Callaghan, F. J., Osborne, J. P., Martyn, C., Harris, T., e Bolton, P. F. (2003). Learning Disability and Epilepsy in an Epidemiological Sample of Individuals with Tuberous Sclerosis Complex. Psychological medicine 33, 335-344.

Jones, A. C., Daniells, C. E., Snell, R. G., Tachataki, M., Idziaszczyk, S. A., Krawczak, M., Sampson, J. R., e Cheadle, J. P. (1997). Molecular Genetic and Phenotypic Analysis Reveals Differences between Tsc1 and Tsc2 Associated Familial and Sporadic Tuberous Sclerosis. Hum Mol Genet 6, 2155-2161.

Jones, A. C., Shyamsundar, M. M., Thomas, M. W., Maynard, J., Idziaszczyk, S., Tomkins, S., Sampson, J. R., e Cheadle, J. P. (1999). Comprehensive Mutation Analysis of Tsc1 and Tsc2-and Phenotypic Correlations in 150 Families with Tuberous Sclerosis. American journal of human genetics 64, 1305-1315.

Jozwiak, J., Jozwiak, S., e Skopinski, P. (2005). Immunohistochemical and Microscopic Studies on Giant Cells in Tuberous Sclerosis. Histology and histopathology 20, 1321-1326.

Kenerson, H., Dundon, T. A., e Yeung, R. S. (2005). Effects of Rapamycin in the Eker Rat Model of Tuberous Sclerosis Complex. Pediatr Res 57, 67-75.

Kit-Sing, A., Joseph, A. R., Jennifer, L. F., Kelly, A. V., Roach, E. S., Mauricio, R. D., Estanislado, R., e Hope, N. (1998). Germ-Line Mutational Analysis of the Tsc2 Gene in 90 Tuberous-Sclerosis Patients. The American Journal of Human Genetics 62.

Knudson, A. G., Jr. (1971). Mutation and Cancer: Statistical Study of Retinoblastoma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 68, 820-823.

Koga, M., Matsuda, M., Kawamura, T., Sogo, T., Shigeno, A., Nishida, E., e Ebisuya, M. (2014). Foxd1 Is a Mediator and Indicator of the Cell Reprogramming Process. Nature communications 5, 3197.

Kozlowski, P., Bissler, J., Pei, Y., e Kwiatkowski, D. J. (2008). Analysis of Pkd1 for Genomic Deletion by Multiplex Ligation-Dependent Probe Assay: Absence of Hot Spots. Genomics 91, 203-208.

Kozlowski, P., Roberts, P., Dabora, S., Franz, D., Bissler, J., Northrup, H., Au, K. S., Lazarus, R., Domanska-Pakiela, D., Kotulska, K., et al. (2007). Identification of 54 Large Deletions/Duplications in Tsc1 and Tsc2 Using Mlpa, and Genotype-Phenotype Correlations. Human genetics 121, 389-400.

Krueger, D. A., Care, M. M., Holland, K., Agricola, K., Tudor, C., Mangeshkar, P., Wilson, K. A., Byars, A., Sahmoud, T., e Franz, D. N. (2010). Everolimus for Subependymal Giant-Cell Astrocytomas in Tuberous Sclerosis. N Engl J Med 363, 1801-1811.

Krueger, D. A., Northrup, H., e International Tuberous Sclerosis Complex Consensus, G. (2013). Tuberous Sclerosis Complex Surveillance and Management: Recommendations of the 2012 International Tuberous Sclerosis Complex Consensus Conference. Pediatric neurology 49, 255-265.

Kumar, P., Henikoff, S., e Ng, P. C. (2009). Predicting the Effects of Coding Non-Synonymous Variants on Protein Function Using the Sift Algorithm. Nat Protoc 4, 1073-1082.

Kwiatkowski, D. (2005). Tsc1, Tsc2, Tsc3? Or Mosaicism? European journal of human genetics : EJHG 13, 695-696.

Lamb, R. F., Roy, C., Diefenbach, T. J., Vinters, H. V., Johnson, M. W., Jay, D. G., e Hall, A. (2000). The Tsc1 Tumour Suppressor Hamartin Regulates Cell Adhesion through Erm Proteins and the Gtpase Rho. Nature cell biology 2, 281-287.


67

Longa, L., Scolari, F., Brusco, A., Carbonara, C., Polidoro, S., Valzorio, B., Riegler, P., Migone, N., e Maiorca, R. (1997). A Large Tsc2 and Pkd1 Gene Deletion Is Associated with Renal and Extrarenal Signs of Autosomal Dominant Polycystic Kidney Disease. Nephrol Dial Transpl 12, 1900-1907.

Lupas, A., Van Dyke, M., e Stock, J. (1991). Predicting Coiled Coils from Protein Sequences. Science 252, 1162-1164.

Margulies, M., Egholm, M., Altman, W. E., Attiya, S., Bader, J. S., Bemben, L. A., Berka, J., Braverman, M. S., Chen, Y. J., Chen, Z., et al. (2005). Genome Sequencing in Microfabricated High-Density Picolitre Reactors. Nature 437, 376-380.

Marsman, J., e Horsfield, J. A. (2012). Long Distance Relationships: Enhancer-Promoter Communication and Dynamic Gene Transcription. Biochimica et biophysica acta 1819, 1217-1227.

Martignoni, G., Pea, M., Reghellin, D., Zamboni, G., e Bonetti, F. (2008). Pecomas: The Past, the Present and the Future. Virchows Arch 452, 119-132.

Maruyama, H., Seyama, K., Sobajima, J., Kitamura, K., Sobajima, T., Fukuda, T., Hamada, K., Tsutsumi, M., Hino, O., e Konishi, Y. (2001). Multifocal Micronodular Pneumocyte Hyperplasia and Lymphangioleiomyomatosis in Tuberous Sclerosis with a Tsc2 Gene. Modern pathology : an official journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc 14, 609-614.

McCall, T., Chin, S. S., Salzman, K. L., e Fults, D. W. (2006). Tuberous Sclerosis: A Syndrome of Incomplete Tumor Suppression. Neurosurgical focus 20, E3.

McCormack, F. X., Inoue, Y., Moss, J., Singer, L. G., Strange, C., Nakata, K., Barker, A. F., Chapman, J. T., Brantly, M. L., Stocks, J. M., et al. (2011). Efficacy and Safety of Sirolimus in Lymphangioleiomyomatosis. N Engl J Med 364, 1595-1606.

Mizuguchi, M., e Takashima, S. (2001). Neuropathology of Tuberous Sclerosis. Brain & development 23, 508-515.

Moss, J., Avila, N. A., Barnes, P. M., Litzenberger, R. A., Bechtle, J., Brooks, P. G., Hedin, C. J., Hunsberger, S., e Kristof, A. S. (2001). Prevalence and Clinical Characteristics of Lymphangioleiomyomatosis (Lam) in Patients with Tuberous Sclerosis Complex. Am J Respir Crit Care Med 164, 669-671.

Muir, T. E., Leslie, K. O., Popper, H., Kitaichi, M., Gagné, E., Emelin, J. K., Vinters, H. V., e Colby, T. V. (1998). Micronodular Pneumocyte Hyperplasia. Am J Surg Pathol 22, 8.

Nellist, M. (1999). Characterization of the Cytosolic Tuberin-Hamartin Complex. Tuberin Is a Cytosolic Chaperone for Hamartin. Journal of Biological Chemistry 274, 35647-35652.

Ng, P. C., e Henikoff, S. (2006). Predicting the Effects of Amino Acid Substitutions on Protein Function. Annu Rev Genomics Hum Genet 7, 61-80.

Niida, Y., Lawrence-Smith, N., Banwell, A., Hammer, E., Lewis, J., Beauchamp, R. L., Sims, K., Ramesh, V., e Ozelius, L. (1999). Analysis of Bothtsc1 Andtsc2 for Germline Mutations in 126 Unrelated Patients with Tuberous Sclerosis. Human Mutation 14, 412-422.

Niida, Y., Stemmer-Rachamimov, A. O., Logrip, M., Tapon, D., Perez, R., Kwiatkowski, D. J., Sims, K., MacCollin, M., Louis, D. N., e Ramesh, V. (2001). Survey of Somatic Mutations in Tuberous Sclerosis Complex (Tsc) Hamartomas Suggests Different Genetic Mechanisms for Pathogenesis of Tsc Lesions. American journal of human genetics 69, 493-503.

Niida, Y., Wakisaka, A., Tsuji, T., Yamada, H., Kuroda, M., Mitani, Y., Okumura, A., e Yokoi, A. (2013). Mutational Analysis of Tsc1 and Tsc2 in Japanese Patients with Tuberous Sclerosis Complex Revealed Higher Incidence of Tsc1 Patients Than Previously Reported. Journal of human genetics 58, 216-225.

Nishio, S., Morioka, T., Suzuki, S., Kira, R., Mihara, F., e Fukui, M. (2001). Subependymal Giant Cell Astrocytoma: Clinical and Neuroimaging Features of Four Cases. Journal of clinical neuroscience : official journal of the Neurosurgical Society of Australasia 8, 31-34.

Northrup, H., Koenig, M. K., e Au, K.-S. (1993 (atualizado 2011)). Tuberous Sclerosis Complex. GeneReviews™ [Internet].


68

Northrup, H., Krueger, D. A., e International Tuberous Sclerosis Complex Consensus, G. (2013). Tuberous Sclerosis Complex Diagnostic Criteria Update: Recommendations of the 2012 International Tuberous Sclerosis Complex Consensus Conference. Pediatric neurology 49, 243-254.

Northrup, H., Wheless, J., Bertin, T., e Lewis, R. (1993). Variability of Expression in Tuberous Sclerosis. Journal of medical genetics 30, 41-43.

O'Callaghan, F. J., Shiell, A. W., Osborne, J. P., e Martyn, C. N. (1998). Prevalence of Tuberous Sclerosis Estimated by Capture-Recapture Analysis. Lancet 351, 1490.

Orlova, K. A., e Crino, P. B. (2010). The Tuberous Sclerosis Complex. Annals of the New York Academy of Sciences 1184, 87-105.

Ouyang, T., Zhang, N., Benjamin, T., Wang, L., Jiao, J., Zhao, Y., e Chen, J. (2014). Subependymal Giant Cell Astrocytoma: Current Concepts, Management, and Future Directions. Child's nervous system : ChNS : official journal of the International Society for Pediatric Neurosurgery 30, 561-570.

Oyazato, Y., Iijima, K., Emi, M., Sekine, T., Kamei, K., Takanashi, J., Nakao, H., Namai, Y., Nozu, K., e Matsuo, M. (2011). Molecular Analysis of Tsc2/Pkd1 Contiguous Gene Deletion Syndrome. The Kobe journal of medical sciences 57, E1-10.

Pachkov, M., Erb, I., Molina, N., e van Nimwegen, E. (2007). Swissregulon: A Database of Genome-Wide Annotations of Regulatory Sites. Nucleic acids research 35, D127-131.

Parain, D., Penniello, M. J., Berquen, P., Delangre, T., Billard, C., e Murphy, J. V. (2001). Vagal Nerve Stimulation in Tuberous Sclerosis Complex Patients. Pediatric neurology 25, 213-216.

Piva, F., Giulietti, M., Burini, A. B., e Principato, G. (2012). Spliceaid 2: A Database of Human Splicing Factors Expression Data and Rna Target Motifs. Human mutation 33, 81-85.

Plank, T. L., Yeung, R. S., e Henske, E. P. (1998). Hamartin, the Product of the Tuberous Sclerosis 1 (Tsc1) Gene, Interacts with Tuberin and Appears to Be Localized to Cytoplasmic Vesicles. Cancer Res 58, 4766-4770.

Qin, W., Kozlowski, P., Taillon, B. E., Bouffard, P., Holmes, A. J., Janne, P., Camposano, S., Thiele, E., Franz, D., e Kwiatkowski, D. J. (2010). Ultra Deep Sequencing Detects a Low Rate of Mosaic Mutations in Tuberous Sclerosis Complex. Human genetics 127, 573-582.

Rakowski, S. K., Winterkorn, E. B., Paul, E., Steele, D. J., Halpern, E. F., e Thiele, E. A. (2006). Renal Manifestations of Tuberous Sclerosis Complex: Incidence, Prognosis, and Predictive Factors. Kidney international 70, 1777-1782.

Rendtorff, N. D., Bjerregaard, B., Frodin, M., Kjaergaard, S., Hove, H., Skovby, F., Brondum-Nielsen, K., Schwartz, M., e Danish Tuberous Sclerosis, G. (2005). Analysis of 65 Tuberous Sclerosis Complex (Tsc) Patients by Tsc2 Dgge, Tsc1/Tsc2 Mlpa, and Tsc1 Long-Range Pcr Sequencing, and Report of 28 Novel Mutations. Hum Mutat 26, 374-383.

Roach, E. S., Gomez, M. R., e Northrup, H. (1998). Tuberous Sclerosis Complex Consensus Conference: Revised Clinical Diagnostic Criteria. Journal of child neurology 13, 624-628.

Roach, E. S., e Sparagana, S. P. (2004). Diagnosis of Tuberous Sclerosis Complex. Journal of child neurology 19, 643-649.

Rozen, S., e Skaletsky, H. J. (2000). Primer3 on the Www for General Users and for Biologist Programmers. In: Krawetz S, Misener S (Eds) Bioinformatics Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology. Humana Press, 2.

Sampson, J. R., Scahill, S. J., Stephenson, J. B., Mann, L., e Connor, J. M. (1989). Genetic Aspects of Tuberous Sclerosis in the West of Scotland. J Med Genet 26, 28-31.

Sancak, O., Nellist, M., Goedbloed, M., Elfferich, P., Wouters, C., Maat-Kievit, A., Zonnenberg, B., Verhoef, S., Halley, D., e van den Ouweland, A. (2005). Mutational Analysis of the Tsc1 and Tsc2 Genes in a Diagnostic Setting: Genotype--Phenotype Correlations and Comparison of Diagnostic DNA Techniques in Tuberous Sclerosis Complex. European journal of human genetics : EJHG 13, 731-741.


69

Santiago Lima, A. J., Hoogeveen-Westerveld, M., Nakashima, A., Maat-Kievit, A., van den Ouweland, A., Halley, D., Kikkawa, U., e Nellist, M. (2014). Identification of Regions Critical for the Integrity of the Tsc1-Tsc2-Tbc1d7 Complex. PloS one 9, e93940.

Scheithauer, B. J., e Reagan, T. J. (1999). In: Gomez, M. R. E Whittemore, V. H. 3a Ed. Tuberous Sclerois Complex. Neurophatology, 44.

Schwarz, J. M., Rodelsperger, C., Schuelke, M., e Seelow, D. (2010). Mutationtaster Evaluates Disease-Causing Potential of Sequence Alterations. Nat Methods 7, 575-576.

Shepherd, C. W., Houser, O. W., e Gomez, M. R. (1995). Mr Findings in Tuberous Sclerosis Complex and Correlation with Seizure Development and Mental Impairment. AJNR American journal of neuroradiology 16, 149-155.

Shepherd, C. W., Scheithauer, B. W., Gomez, M. R., Altermatt, H. J., e Katzmann, J. A. (1991). Subependymal Giant Cell Astrocytoma: A Clinical, Pathological, and Flow Cytometric Study. Neurosurgery 28, 864-868.

Smith, P. J., Zhang, C., Wang, J., Chew, S. L., Zhang, M. Q., e Krainer, A. R. (2006). An Increased Specificity Score Matrix for the Prediction of Sf2/Asf-Specific Exonic Splicing Enhancers. Hum Mol Genet 15, 2490-2508.

Smolarek, T. A., Wessner, L. L., McCormack, F. X., Mylet, J. C., Menon, A. G., e Henske, E. P. (1998). Evidence That Lymphangiomyomatosis Is Caused by Tsc2 Mutations: Chromosome 16p13 Loss of Heterozygosity in Angiomyolipomas and Lymph Nodes from Women with Lymphangiomyomatosis. American journal of human genetics 62, 810-815.

Stefansson, K. (1991). Tuberous Sclerosis. Mayo Clinic proceedings Mayo Clinic 66, 868-872.

Sweeney, W. E., Jr., e Avner, E. D. (2011). Diagnosis and Management of Childhood Polycystic Kidney Disease. Pediatric nephrology 26, 675-692.

Telfeian, A. E., Judkins, A., Younkin, D., Pollock, A. N., e Crino, P. (2004). Subependymal Giant Cell Astrocytoma with Cranial and Spinal Metastases in a Patient with Tuberous Sclerosis. Case Report. Journal of neurosurgery 100, 498-500.

Thiele, E. A. (2004). Managing Epilepsy in Tuberous Sclerosis Complex. Journal of child neurology 19, 680-686.

Trombley, I. K., e Mirra, S. S. (1981). Ultrastructure of Tuberous Sclerosis: Cortical Tuber and Subependymal Tumor. Annals of neurology 9, 174-181.

Tyburczy, M. E., Wang, J. A., Li, S., Thangapazham, R., Chekaluk, Y., Moss, J., Kwiatkowski, D. J., e Darling, T. N. (2013). Sun Exposure Causes Somatic Second-Hit Mutations and Angiofibroma Development in Tuberous Sclerosis Complex. Hum Mol Genet 23, 20232029.

van den Ouweland, A. M., Elfferich, P., Zonnenberg, B. A., Arts, W. F., Kleefstra, T., Nellist, M. D., Millan, J. M., Withagen-Hermans, C., Maat-Kievit, A. J., e Halley, D. J. (2011). Characterisation of Tsc1 Promoter Deletions in Tuberous Sclerosis Complex Patients. European journal of human genetics : EJHG 19, 157-163.

van Eeghen, A. M., Ortiz-Teran, L., Johnson, J., Pulsifer, M. B., Thiele, E. A., e Caruso, P. (2013). The Neuroanatomical Phenotype of Tuberous Sclerosis Complex: Focus on Radial Migration Lines. Neuroradiology 55, 1007-1014.

van Slegtenhorst, M., de Hoogt, R., Hermans, C., Nellist, M., Janssen, B., Verhoef, S., Lindhout, D., van den Ouweland, A., Halley, D., Young, J., et al. (1997). Identification of the Tuberous Sclerosis Gene Tsc1 on Chromosome 9q34. Science 277, 805-808.

van Slegtenhorst, M., Nellist, M., Nagelkerken, B., Cheadle, J., Snell, R., van den Ouweland, A., Reuser, A., Sampson, J., Halley, D., e van der Sluijs, P. (1998). Interaction between Hamartin and Tuberin, the Tsc1 and Tsc2 Gene Products. Hum Mol Genet 7, 1053-1057.


70

van Veghel-Plandsoen, M. M., Wouters, C. H., Kromosoeto, J. N., den Ridder-Klunnen, M. C., Halley, D. J., e van den Ouweland, A. M. (2011). Multiplex Ligation-Depending Probe Amplification Is Not Suitable for Detection of Low-Grade Mosaicism. European journal of human genetics : EJHG 19, 1009-1012.

Weeks, D. A., Malott, R. L., Arnesen, M., Zuppan, C., Aitken, D., e Mierau, G. (1991). Hepatic Angiomyolipoma with Striated Granules and Positivity with Melanoma--Specific Antibody (Hmb-45): A Report of Two Cases. Ultrastructural pathology 15, 563-571.

Wei, Q., Jennifer, A. C., Harry, V. V., Gary, W. M., David, N. F., Bruce, E. T., Pascal, B., e David, J. K. (2010). Analysis of Tsc Cortical Tubers by Deep Sequencing of Tsc1, Tsc2 and Kras Demonstrates That Small Second-Hit Mutations in These Genes Are Rare Events. Brain pathology 20, 1096-1105.

Weiner, H. L., Ferraris, N., LaJoie, J., Miles, D., e Devinsky, O. (2004). Epilepsy Surgery for Children with Tuberous Sclerosis Complex. Journal of child neurology 19, 687-689.

Yang, L., Feng, X. L., Shen, S., Shan, L., Zhang, H. F., Liu, X. Y., e Lv, N. (2012). Clinicopathological Analysis of 156 Patients with Angiomyolipoma Originating from Different Organs. Oncology letters 3, 586-590.

Young, J. M., Burley, M. W., Jeremiah, S. J., Jeganathan, D., Ekong, R., Osborne, J. P., e Povey, S. (1998). A Mutation Screen of the Tsc1 Gene Reveals 26 Protein Truncating Mutations and 1 Splice Site Mutation in a Panel of 79 Tuberous Sclerosis Patients. Ann Hum Genet 62, 203-213.

Zhang, X. H., e Chasin, L. A. (2004). Computational Definition of Sequence Motifs Governing Constitutive Exon Splicing. Genes & development 18, 1241-1250.

estudo mutacional em pacientes com o complexo da esclerose

Documents