estudo fitoquÍmico de ocotea duckei vattimo … · 2018-09-06 · universidade federal da paraÍba...

UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS

E SINTÉTICOS BIOATIVOS

MARIA MADALENA ROCHA SILVA TELES

ESTUDO FITOQUÍMICO DE OCOTEA DUCKEI VATTIMO

(LAURACEAE)

João Pessoa – PB

2012



(LAURACEAE)

Dissertação apresentada ao Programa

de Pós-Graduação em Produtos

Naturais e Sintéticos Bioativos do Centro

de Ciências da Saúde da Universidade

Federal da Paraíba, em cumprimento às

exigências para obtenção do título de

Mestre em Farmacoquímica de Produtos

Naturais e Sintéticos Bioativos.

ORIENTADOR: Prof. Dr. José Maria Barbosa Filho

João Pessoa – PB

2012



(LAURACEAE)

COMISSÃO EXAMINADORA

____________________________________________

Prof. Dr. José Maria Barbosa Filho Doutor em Química Orgânica

Universidade Federal da Paraíba

(Orientador)

____________________________________________

Prof. Dr. Josean Fechine Tavares Doutor em Farmacoquímica de Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos

Universidade Federal da Paraíba – Campus I

(Examinador interno)

____________________________________________

Prof. Dr. Petrônio Filgueiras de Athayde Filho Doutor em Química

Universidade Federal da Paraíba

(Examinador externo)

Com amor, aos meus pais

Maria Bernardo Rocha

Nunes e Silvino Teles da

Silva( in memorian), dedico.

AGRADECIMENTOS

Este trabalho é o resultado visível de um processo de construção em

meio a uma conjuração de afetos e amizades. Em tempos em que quase

ninguém se olha nos olhos, em que a maioria das pessoas pouco se interessa

pelo que não lhe diz respeito, só mesmo agradecendo àqueles que percebem

nossas descrenças, indecisões, medos, tudo o que nos paralisa, e gastam um

pouco da sua energia conosco, insistindo. Dessa forma, dando continuidade à

história, dedico algumas palavras àqueles que já o percorrem nas entrelinhas e

dela fazem parte.

A Deus, mais do que me criar, deu propósito à minha vida. Vem dEle

tudo o que sou, o que tenho e o que espero. Meu amparo e refúgio, alegria da

minha alma, onde encontro esperança e conforto. As mãos que me guiam e

acolhem.

Aos meus amados pais, Silvino (in memorian) e Maria, pelo amor

incondicional, dedicação e preocupação. Pelos sacrifícios suportados em

silêncio para a qualidade da minha educação. Agradeço o exemplo de caráter,

coragem e dignidade. Por sempre me guiarem para o caminho do bem, por

acreditarem em mim, por muito me amarem.

.

Às minhas irmãs, Helena, Silvana e Wanderlea, pelo amor que

sempre nos uniu. A lembrança afetuosa de vocês e o abraço amoroso a cada

reencontro me fizeram mais forte. Agradeço pelas vezes que viram seus

sonhos adiados para que os meus fossem realizados.

Ao meu esposo, Kayo, por todo amor, proteção e cumplicidade. O

abraço espontâneo e tão necessário. Obrigada pelo apoio, paciência e

compreensão nos momentos que precisei estar ausente.

A minha avó Júlia (in memorian), cujos ensinamentos me guiaram

para além das teorias, da química e das técnicas... me deram a consciência do

verdadeiro valor da vida.

Ao Prof. José Maria Barbosa Filho, pela oportunidade de crescimento

e aprendizado, pela confiança em mim depositada ao ter aceitado me orientar.

Espelho de humildade e generosidade e pela gentileza a mim sempre

dispensada.

Ao prof. Davi Antas e Silva, pela inestimável ajuda e contribuição para

finalização deste projeto de forma gratuita. Sua serenidade, sensibilidade e

humildade sempre tão receptivas o tornam singular. Agradeço pelo novo amigo

que fiz.

Ao prof. Josean Fechine Tavares, sempre disposto a ajudar sem

distinções. Profissional admirável, exemplo de dedicação e competência à

pesquisa. Um espelho a ser seguido pela nova geração.

À prof. Celidarque da Silva Dias, pelo estímulo nos momentos difíceis,

pela preocupação e pela amizade que foi conquistada.

Ao prof. Jnanabrata Bhattacharya, pelo interesse no meu trabalho,

pelas sábias palavras, as quais admiro. Por sua consciência costurada pela

experiência e pelo amor à ciência.

À prof. Bagnólia Araújo da silva, pela postura ética, por ensinar a

seguir adiante, sem perder o que pulsa, o que vibra, agradeço imensamente.

Aos professores da banca examinadora, por aceitarem colaborar com

meu trabalho, proporcionando discussões e sugestões que servirão para

crescimento, aprendizado e incentivo à pesquisa.

Aos amigos de bancada e da vida, que me acolheram generosamente:

Analúcia, Ana Sílvia, Daysianne, Fabiana, Gabriela, Jacqueline, Jéssica,

Narlize e Thaísa. Preferi dispor seus nomes por ordem alfabética, pela

impossibilidade de distinguí-las. Pessoas ímpares que Deus colocou em minha

vida, agradeço por toda alegria que me proporcionaram, excelente convivência,

ensinamentos valiosos, pelas sugestões, pela ajuda desprendida e

incondicional.

A Fábio, um ser genial, pela amizade, por se disponibilizar a ajudar

sempre, por dividir seus conhecimentos, pela companhia, pelas conversas

espirituosas e fortuitas e pelos valiosos conselhos.

À melhor contribuição da Ocotea duckei, Sandro e Fábia (equipe

Ocotea). Sandro sempre prestativo, amigo de todas as horas, peça chave na

elaboração desse trabalho com sua paciência e inteligência, muitíssimo

obrigada. Fábia, amiga companheira, conselheira, em quem confio muito. À

“fofinha” Cinthia, sua bondade e meiguice me conquistaram. São especiais

para mim.

Ao amigo Vicente Carlos, pelo apoio irrestrito. A dedicação ao trabalho

se estende aos amigos. Agradeço a atenção, os conselhos, sua presteza e

preocupação voluntárias.

Aos meus amigos de mestrado da farmacoquímica, Manuela,

Otemberg, Jeane, Rafaela, Sara, Hellane, Carol e Roni, pela excelente

convivência e conhecimentos partilhados, me permitindo aprender muito com

todos vocês.

À minha turma de mestrado pelo companheirismo e carinho. Em

especial Aos amigos Ricardo, pela sua disponibilidade em ajudar, por não

medir esforços, pelas dificuldades partilhadas e por sua torcida e amizade.

Monalisa, pelas longas conversas partilhando idéias, confidências,

descontração. Por dividir seus conhecimentos e por me presentear com sua

amizade. Juliana (destino), pelos momentos de diversão sempre concluídos

com boas risadas e apoio constante. Ronaldo, por ser um grande amigo. Por

sua generosidade e simplicidade. Nossas longas conversas e desabafos

aliviaram as dificuldades.

Aos amigos da graduação, em especial Polyana e Philipe, fieis

escudeiros, cujas presenças, palavras e silêncios escreveram seus nomes em

minha vida.

A todos os colegas do laboratório, em especial, Marcelo, Marianne,

Danielli, Denise, Helóisa, Camila, Severino, Vivianne, Ìsis, Paula, Tiago,

pela excelente convivência, pela troca de conhecimentos e ajuda.

A Raimundo Nonato pelo auxílio constante na bancada, pela paciência

e fonte de consulta indidpensável.

Aos alunos de iniciação científica, Roseana, Lázaro, Yuri, Laiane,

Denise, Karlienne, Mariana, Thamyres e Ana Letícia pelo convívio e apoio

que sempre me deram.

Às secretárias, Tânia e Carol, pela disponibilidade sempre que precisei

e pela receptividade sempre acolhedora.

A todos os funcionários do Programa de pós-graduação em Produtos

Naturais e, em especial a Atayde, Sócrates, Alexsandro, Dinho e Glória e a

todos os seguranças e funcionários da limpeza e da manutenção, por darem

suporte para que nosso trabalho fosse possível.

À Universidade Federal da Paraíba e a Coordenação de

Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo apoio financeiro

concedido.

" ... se um dia, já homem feito e respeitado, sentires que a terra cede a teus

pés, que tuas obras se desmoronam, que não há ninguém à tua volta para te

estender a mão, esquece a tua maturidade, passa pela tua mocidade, volta à

tua infância e balbucia, entre lágrimas e esperanças, as últimas palavras que

sempre te restarão na alma: " Meu pai, minha mãe..."

Rui Barbosa

RESUMO

TELES, Maria Madalena Rocha Silva. Estudo fitoquímico de Ocotea duckei

Vattimo (LAURACEAE) 140 p. Dissertação (Mestrado em Produtos Naturais e

Sintéticos Bioativos) – Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal da

Paraíba, João Pessoa, 2012.

A família Lauraceae é constituída por aproximadamente 50 gêneros e 3000

espécies com distribuição pantropical, sendo bem representada na América,

Ásia Tropical, Austrália e Madagascar. No Brasil, a família Lauraceae

compreende 24 gêneros, dentre esses, encontramos o gênero Ocotea,

possuindo cerca de 170 espécies distribuídas nas florestas fluviais, restingas e

áreas de cerrado. O presente trabalho descreve os resultados do estudo

fitoquímico das cascas do caule e folhas de Ocotea duckei Vattimo. O material

botânico foi submetido a processos de extração, partição e cromatografia para

isolamento dos constituintes químicos. A estrutura química dos mesmos foi

determinada por métodos espectroscópicos de Ressonância Magnética

Nuclear de 1H e 13C uni e bidimensionais e comparações com modelos da

literatura. O fracionamento cromatográfico do resíduo da marcha de lignoides

resultou no isolamento de um sesquiterpeno, 9-oxo-nerolidol, sendo descrito

pela primeira vez no gênero Ocotea. Da fase hexânica, obteve-se o β-sitosterol,

Sitosterol-3-O-β-D-glicopiranosídeo, nerolidol e α-tocoferol quinona, sendo esta

descrita pela primeira vez no gênero Ocotea.

Palavras-chave: Lauraceae, estudo fitoquímico, Ocotea duckei Vattimo.

ABSTRACT

TELES, Maria Madalena Rocha Silva. Phytochemical study of Ocotea duckei

Vattimo (LAURACEAE) 140 p. Dissertação (Mestrado em Produtos Naturais e

Sintéticos Bioativos) – Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal da

Paraíba, João Pessoa, 2012.

The Lauraceae family consists of approximately 50 genera and 3000 species

with pantropical distribuction, being well represented in America, Tropical Asia,

Australia and Madagascar. In Brazil, the Lauraceae family includes 24 genera,

in which there is the Ocotea genus, with about 170 species occurring

in pluvial forests, salt marshes and savanna areas. This work describes the

results of the phytochemical study from the stem bark and leaves of

Ocotea duckei Vattimo. The plant material was subjected to extraction, partition

and chromatographic processes to isolation of the chemical constituents. Their

chemical structures were determined by spectroscopic methods such as 1H e

13C NMR, uni and bidimensional, and comparisons to literature data. The

chromatographic partition of the lignoids extraction residue resulted in the

isolation of a sesquiterpene, 9-oxo-nerolidol, being described for the first time

on Ocotea genus. From the hexane extract was obtained β-sitosterol,

sitosterol -3- β-D-glycopiranoside, nerolidol and α-tocopherol quinone, this one

being reported for the first time in Ocotea genus.

Keywords: Lauraceae, phytochemical study, Ocotea duckei Vattimo.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Mapa de distribuição da família Lauraceae no mundo, representada

nas áreas em verde. .................................................................................. 30

Figura 2 - Espécies de Lauraceae: Persea americana (abacate), Aniba

rosaeodora (pau-rosa) e Laurus nobilis (louro), respectivamente. ............. 31

Figura 3 - Mapa de distribuição do gênero Ocotea Aubl., representado em

verde. ......................................................................................................... 32

Figura 4 - Distribuição das espécies de Ocotea no Brasil por região ............... 33

Figura 5 - Imagens do caule, folhas e inflorescências da Ocotea duckei Vattimo

................................................................................................................... 37

Figura 6 - Espectro de RMN de 13C - APT de Od-1 (CDCl3, 125 MHz) ............ 63

Figura 7 - Expansão do espectro de RMN de 13C - APT de Od-1, na região de

15 a 75 ppm) (CDCl3, 125 MHz) ................................................................ 64

Figura 8 - Espectro de RMN de 1H de Od-1 (CDCl3, 500 MHz) ....................... 65

Figura 9 - Expansão do espectro de RMN de 1H de Od-1 na região de (6,2 a

5,3) ppm (CDCl3, 500 MHz) ....................................................................... 66


1,0) ppm (CDCl3, 500 MHz) ....................................................................... 67

Figura 11 - Espectro de correlação homonuclear COSY de Od-1 (CDCl3, 500

MHz) .......................................................................................................... 68

Figura 12 - Expansão do espectro de correlação homonuclear COSY de Od-1

na região de (6,5 a 0,5) x (6,5 a 0,5) ppm (CDCl3, 500 MHz) ................... 69


na região de (4,5 a 0,5) x (3,5 a 0,5) ppm (CDCl3, 500 MHz) ................... 70

Figura 14 - Espectro de correlações 1H x 13C – JCH - HMQC de Od-1 (CDCl3,

500 e 125 MHz) ......................................................................................... 71

Figura 15 - Expansão do espectro de correlações 1H x 13C – JCH - HMQC de

Od-1 na região de 145 a 110 ppm (CDCl3, 500 e 125 MHz) ...................... 72


Od-1 na região de (4,5 a 1,0) x (35 a 15 ppm) (CDCl3, 500 e 125 MHz) ... 73

Figura 17 -Expansão do espectro de correlação 1H x 13C – JCH- HMQC de Od-1

na região de (2,4 a 0,4) x (36 a 15) ppm (CDCl3, 500 e 125 MHz) ............ 74

Figura 18 - Espectro de correlações 1H x 13C-nJCH (n=2 e 3) - HMBC de Od-1

(CDCl3, 500 e 125 MHz) ............................................................................ 75

Figura 19 - Expansão do espectro de correlações 1H x 13C-nJCH (n=2 e 3) -

HMBC de Od-1 na região de (7,0 A 0,5) x (80 a 15 ppm) (CDCl3, 500 e 125

MHz) .......................................................................................................... 76


HMBC de Od-1 na região de (3,4 a 0,6 ppm) x (180 a 120 ppm) (CDCl3,500

e 125 MHz) ................................................................................................ 77


HMBC de Od-1 na região de (3,4 a 6,0 ppm) x (60 a 15 ppm) (CDCl3, 500 e

125 MHz) ................................................................................................... 78

Figura 22 - Espectro de correlação homonuclear NOESY de Od-1 (CDCl3,500

MHz) .......................................................................................................... 79

Figura 23 - Expansão do espectro de correlação homonuclear NOESY de Od-1

na região de (6,5 a 0,5 ppm) x (6,5 a 0,5) (CDCl3, 500 MHz) .................... 80


na região de (3,2 a 0,6 ppm) x (3,2 a 0,6 ppm) (CDCl3, 500 MHz) ............ 81

Figura 25 - Espectro de RMN de 13C - APT de Od-2 (CDCl3, 125 MHz) .......... 86

Figura 26 - Expansão do espectro de RMN de 13C de Od-2 na região de 150 a

70 ppm (CDCl3, 125 MHz) ......................................................................... 87


17 ppm (CDCl3, 125 MHz) ........................................................................ 88

Figura 28 - Espectro de RMN de 1H de Od-2 (CDCl3, 500 MHz)...................... 89

Figura 29 - Expansão do espectro de RMN de 1H de Od-2 na região de 6,0 a

5,0 ppm (CDCl3, 500 MHz) ........................................................................ 90


0,8 ppm (CDCl3, 500 MHz) ........................................................................ 91

Figura 31 - Espectro de RMN de 1H de Od-3 (CDCl3, 500 MHz)...................... 94


3,8 ppm (CDCl3, 500MHz) ......................................................................... 95

Figura 33 - Expansão do espectro de RMN de 1H de Od-3 na região de 1,5 A

0,60 ppm (CDCl3, 125 MHz) ...................................................................... 96

Figura 34 - Espectro de RMN de 13C- APT de Od-3 (CDCl3, 125 MHz) ........... 97

Figura 35 - Expansão do espectro de RMN de 13C- APT de Od-3 na região de

144 a 44 ppm (CDCl3, 125 MHz) ............................................................... 98

Figura 36 - Expansão do espectro de RMN de 13C APT de Od-3 na região de

45 a 15 ppm (CDCl3, 125 MHz) ................................................................. 99

Figura 37 - Espectro de RMN de 1H de Od-4 (C5D5N, 500 MHz) ................... 102


3,8 ppm (C5D5N), 500 MHz) .................................................................... 103

Figura 39 - Espectro de RMN de 13C – APT de Od-4 ((C5D5N), 125 MHz) .... 104


101 ppm (CDCl3, 125 MHz) ..................................................................... 105


45 ppm (CDCl3, 125 MHz) ....................................................................... 106


10 ppm (CDCl3, 125 MHz) ....................................................................... 107

Figura 43 - Espectro de RMN de 1H de Od-5 (CDCl3, 500 MHz).................... 113


1,95 ppm (CDCl3, 500MHz) ..................................................................... 114


0,75 ppm (CDCl3, 500MHz) ..................................................................... 115

Figura 46 - Espectro de RMN de 13C - APT de Od-5 (CDCl3, 125 MHz) ........ 116


195 a 70 ppm (CDCl3, 125 MHz) ............................................................. 117


50 a 10 ppm (CDCl3, 125 MHz) ............................................................... 118


500 e 125 MHz) ....................................................................................... 119


Od-5, na região de (2,5 a 0,4) x (42 a 12 ppm) (CDCl3, 500 e 125 MHz) 120


(CDCl3, 500 e 125 MHz) .......................................................................... 121


HMBC de Od-5, na região de (2,6 a 0,5) x (80 a 10) ppm (CDCl3, 500 e 125

MHz) ........................................................................................................ 122


HMBC de Od-5, na região de (3,0 a 1,7) x (190 a 140) ppm (CDCl3, 500 e

125 MHz) ................................................................................................. 123

LISTA DE ESQUEMAS E QUADROS

Esquema 1 - Obtenção e particionamento do extrato etanólico bruto de Ocotea

duckei Vattimo ........................................................................................... 49

Esquema 2 - Marcha para extração de lignoides ............................................. 50

Esquema 3 - Fracionamento cromatográfico do resíduo da marcha de extração

de lignoides de Ocotea duckei. .................................................................. 51

Esquema 4 - Fracionamento cromatográfico da fase hexânica do extrato

etanólico bruto de Ocotea duckei Vattimo ................................................. 56

Quadro 1 - Alguns constituintes químicos de plantas do gênero Ocotea. ........ 36

Quadro 2 – Estrutura química de algumas substâncias isoladas de Ocotea

duckei. ....................................................................................................... 41

Quadro 3 - Sistemas de eluições utilizados no fracionamento cromatográfico do

resíduo da extração de lignoides de Ocotea duckei .................................. 52

Quadro 4 - Sistemas de eluições utilizados no fracionamento cromatográfico da

fase hexânica do extrato etanólico bruto de Ocotea duckei Vattimo ......... 54

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Deslocamentos químicos, tipos de sinal e correlações para Od-1,

verificados nos espectros de RMN 1H e 13C (500 e 125 MHz,

respectivamente) uni e bidimensionais em CDCl3. .................................... 61

Tabela 2 - Dados de RMN de 1H (500 MHz) e 13C (125 MHz) para Od-1 em

CDCl3 e comparação com os dados da literatura [(CDCl3) (Iida et al., 1981)]

(δ em ppm e J em Hz). .............................................................................. 62


CDCl3 e comparação com os dados da literatura [(CDCl3) (Miyazawa et al.,

1996)] (δ em ppm e J em Hz). ................................................................... 84

Tabela 4 - Dados de RMN de 1H (500 MHz) e 13C (125 MHz) de Od-2 e de Od-

1 ................................................................................................................. 85

Tabela 5 - Deslocamentos químicos e tipos de sinais para os átomos de

carbono e hidrogênio de Od-3, verificados nos espectros de RMN 1H e 13C

(500 e 125 MHz, respectivamente) em CDCl3, bem como, os

deslocamentos químicos dos carbonos (δC*) apresentados por Tomaz

(2008) para a mesma substância .............................................................. 93

Tabela 6 - Dados de RMN de 1H (500 MHz) e 13C (500 MHz) para Od-4

(C5D5N) e comparação com os dados de RMN de 13C da literatura (δC*)

[(C5D5N) (KOJIMA et al., 1990)] (δ em ppm e J em Hz). ......................... 101

Tabela 7 – Deslocamentos químicos, tipos de sinal e correlações para Od-5,

verificados nos espectros de RMN 1H e 13C (500 e 125 MHz,

respectivamente) uni e bidimensionais (CDCl3) ....................................... 111

Tabela 8 - Deslocamentos químicos e tipos de sinais para os átomos d carbono

e hidrogênio de Od-5, verificados nos espectros de RMN 1H e 13C (500 e

125 MHz, respectivamente) em CDCl3, bem como, os deslocamentos

químicos dos carbonos (δC*) apresentados por Tereza (1986) para a

mesma substância ................................................................................... 112

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E FÓRMULAS

AcOEt Acetato de Etila

ACN Acetonitrila

APT Attached Proton Test

ATQ α-tocoferol quinona

CC Cromatografia em coluna

CCDA Cromatografia em Camada Delgada Analítica

CCDP Cromatografia em Camada Delgada Preparativa

CDCl3 Clorofórmio deuterado

CHCl3 Clorofórmio

C5D5N Piridina deuterada

CH2O2 Ácido fórmico

CH2Cl2 Diclorometano

CLMP Cromatografia Líquida de Média Pressão

COSY Correlation Spectroscopy

d Dubleto

dd Duplo dubleto

ddd Duplo duplo dubleto

EEB Extrato Etanólico Bruto

EtOH Etanol

Fig Figura

g Grama

HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation

HMQC Heteronuclear Multiple Quantum Correlation

Hz Hertz

H2O Água

J Constante de acoplamento

kg Quilograma

LTF Laboratório de Tecnologia Farmacêutica

LMCA Laboratório Multiusuário de Caracterização e Análise

MeOH Metanol

m Multipleto

mg Miligrama

MHz Megahertz

mL Mililitro

nm Nanômetro

mm Milímetro

Na2SO4 Sulfato de sódio

NOESY Nuclear Overhauser Enhancement Spectroscopy

PAF Fator de agregação plaquetária

pág. Página

ppm Partes por milhão

Rf Fator de Retenção

RMN 13C Ressonância Magnética Nuclear de Carbono 13

RMN 1H Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio

s Singleto

Tab Tabela

UFPB Universidade Federal da Paraíba

δ Deslocamento químico em ppm

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO .............................................................................................. 22

1.1 Plantas medicinais: fonte de novos fármacos ............................................ 22

2 OBJETIVOS .................................................................................................. 27

2.1 OBJETIVO GERAL ................................................................................. 27

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................... 27

3 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ..................................................................... 29

3.1 Considerações sobre a família Lauraceae: aspectos botânicos, químicos e

farmacológicos ................................................................................................. 29

3.2 Considerações sobre o gênero Ocotea Aubl. ............................................. 32

3.3 Considerações sobre a espécie Ocotea duckei Vattimo ............................ 37

4 METODOLOGIA ............................................................................................ 44

4.1 Estudo fitoquímico ...................................................................................... 44

4.1.1 Coleta e identificação do material botânico ............................................. 44

4.1.2 Métodos de análise ................................................................................. 44

4.1.2.1 Métodos cromatográficos ..................................................................... 44

4.1.2.2 Impregnação de Sílica Gel com Nitrato de Prata ................................. 45

4.1.2.3 Métodos espectrométricos ................................................................... 46

4.1.2.3.1 Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear ........................ 46

4.1.2.3.2 Ponto de Fusão ................................................................................. 47

4.1.3 Processamento das cascas do caule de Ocotea duckei Vattimo ............ 47

4.1.4 Obtenção do extrato etanólico bruto (EEB) das cascas do caule e folhas

de Ocotea duckei Vattimo ................................................................................ 47

4.1.5 Particionamento do extrato etanólico bruto (EEB) de Ocotea duckei

Vattimo ............................................................................................................. 48

4.1.6 Fracionamento do EEB – Marcha para lignoides .................................... 50

4.1.7 Fracionamento cromatográfico do resíduo da marcha de extração de

lignoides ........................................................................................................... 50

4.1.8 Fracionamento cromatográfico da fase hexânica do EEB das cascas do

caule e folhas de Ocotea duckei Vattimo ......................................................... 53

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ..................................................................... 58

5.1 Determinação estrutural de Od-1 ............................................................... 58



5.4 Determinação estrutural de Od-4 ............................................................. 100

5.5 Determinação estrutural de Od-5 ............................................................. 108

6 CONCLUSÃO E PERSPECTIVAS .............................................................. 125

REFERÊNCIAS .............................................................................................. 127

INTRODUÇÃO

Estudo Fitoquímico de Ocotea duckei Vattimo (Lauraceae) 22

TELES, M. M. R. S

1 INTRODUÇÃO

1.1 Plantas medicinais: fonte de novos fármacos

Por milhares de anos as pessoas recorreram às plantas para tratar

doenças e amenizar dores e incômodos. As mesmas ervas, árvores e arbustos

empregados pelos povos antigos continuaram a ser valorizados através dos

tempos. Mas embora as pessoas soubessem que certas plantas tinham

indiscutível poder curativo, elas não podiam explicar como as plantas

medicinais atuavam e, dessa forma, frequentemente atribuíam a elas forças

sobrenaturais (MARTINS et al., 1998). Evidências arqueológicas mostram que

o uso de drogas era amplo em culturas antigas. Nozes de bétele, uma planta

aromática que contém substâncias psicoativas, eram mascadas há 13 mil anos

no Timor; e artefatos descobertos no Equador estendem o uso das folhas de

coca há 5000 anos (PINTO et al., 2002).

Em todas as épocas e em todas as culturas, o homem aprendeu a tirar

proveito dos recursos naturais locais. Ao longo dos anos, sutis observadores

perceberam que uma erva capaz de induzir sonolência seria também capaz de

acalmar, se usada em dosagens menores. Plantas cujos frutos usualmente

tinham efeito laxante poderiam ser usadas para regular o intestino

“preguiçoso”. Todo esse conhecimento foi passado ao longo das gerações, que

juntamente com mitos e rituais, formavam parte importante das culturas locais

(LORENZI; MATOS, 2008).

O acúmulo destas informações pelos homens primitivos propiciou o

nascimento de uma cultura da arte de curar, que se tornou a base para o

nascimento da medicina (CORRÊA, 2001).

De acordo com a Organização Mundial de Saúde, a pobreza e a falta de

acesso à medicina moderna conduzem 65% a 80% da população do mundo,

nos países em desenvolvimento, a depender essencialmente das plantas para

cuidado primário da saúde (PARKER et al., 2007).

No Brasil, a utilização das plantas como medicamento foi influenciada

pelas culturas indígena, africana e européia, deixando um acervo cultural que


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constitui a base da medicina popular, atualmente resgatada pela medicina

natural que procura aproveitar suas práticas, porém, fornecendo-lhe um caráter

científico (MATTEI et al., 1998).

O uso de plantas medicinais, conhecido hoje como fitoterapia, tem

ressurgido como uma opção medicamentosa bem aceita e acessível aos

povos, e no caso do Brasil é adequada para as necessidades locais de

centenas de municípios brasileiros no atendimento primário à saúde. A

expansão da fitoterapia pode ser atribuída a diversos fatores tais como: os

efeitos adversos de fármacos sintéticos, a preferência dos consumidores por

tratamentos “naturais”, a validação científica das propriedades farmacológicas

de espécies vegetais, o desenvolvimento de novos métodos analíticos

colocados à disposição do controle de qualidade, o desenvolvimento de novas

formas de preparações e administrações de produtos fitoterápicos, um melhor

conhecimento químico, farmacológico e clínico das drogas vegetais e seus

derivados, além, também, do menor custo se comparado com os fármacos

sintéticos (BRAZ FILHO, 2010).

No processo de embasamento científico de uma medicina alternativa, a

Química de Produtos Naturais se destaca ao permitir o conhecimento estrutural

dos metabólitos secundários responsáveis pelos efeitos farmacológicos das

plantas medicinais. Em suas inúmeras atribuições, engloba o isolamento e a

identificação dos constituintes químicos bioativos, atuando como fonte de

novos fármacos, e realiza pesquisas para validação de medicamentos de

origem vegetal, sendo assim, a base essencial para o direcionamento de

estudos farmacológicos (SOUZA; SILVA, 2006).

Na medicina moderna os compostos de origem natural desempenham

quatros papeis importantes. Em primeiro lugar, fornecem alguns medicamentos

úteis, cuja produção e comercialização na forma sintética é economicamente

inviáve. Defontes naturais também são retirados compostos básicos que

podem ser ligeiramentemodificados para tornarem-se mais eficazes ou menos

tóxicos; exemplo disso são as numerosas variações da molécula da morfina.

Entre eles estão grupos tão diversificados de substâncias como os alcaloides

da papoula produtora de ópio, do esporão do centeio, antibióticos, os soros,


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vacinas e produtos afins. O terceiro papel desempenhado pelos produtos

naturais é a sua utilidade como protótipo ou modelo para medicamentos

sintéticos que tenham atividades fisiológicas semelhantes às dos originais; a

procaína e os anestésicos locais costumam ser citados como representantes

desta categoria.

Há um quarto papel desempenhado pelos produtos naturais, bem

diferente dos acima citados, mas não menos importante. Alguns produtos

naturais contêm compostos que apresentam atividade pequena ou nula, mas

que podem ser modificados por métodos químicos ou biológicos para produzir

drogas potentes, não obtidas facilmente por outros métodos. Por exemplo, o

tratamento químico e biológico do estigmasterol, que ocorre em abundância no

óleo de soja, permite a produção em larga escala da hidrocortisona ou de

corticosteroides afins, compostos estes que ocorrem pequenas quantidades na

natureza (ROBBERS; SPEEDIE; TYLER, 1997).

Fazendo uma revisão do desenvolvimento de fármacos, a importância

dos produtos naturais é inquestionável. Já no século XIX muitas plantas

tiveram seus primeiros estudos com base científica, o que resultou na

descoberta da morfina, glicosídeos cardiotônicos, quinina, entre outras

substâncias, isoladas de plantas medicinais e, utilizadas ate hoje como

medicamentos. No século passado, o domínio da química de produtos naturais

no desenvolvimento de medicamentos teve um declínio significativo,

especialmente apos a II Guerra Mundial, devido, em parte, ao desenvolvimento

da síntese orgânica. Utilizando-se da síntese, a indústria farmacoquímica

produziu uma quantidade expressiva de substâncias que foram testadas

aleatoriamente, ficando os produtos naturais relegados a um segundo plano,

por quase meio século (McCHESNEY et al., 2007).

Apesar dos muitos desafios enfrentados nas últimas décadas, a Química

de Produtos Naturais tem tido avanços importantes com a intersecção com

outras áreas afins como Bioquímica, Biologia Molecular, Etnofarmacologia,

Imunologia, e de tecnologias inovadoras de análise e elucidação estrutural

como a Ressonância Magnética Nuclear e Espectroscopia de Massas

(FERREIRA; PINTO, 2010).


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Analisando os medicamentos disponibilizados no mercado entre 1981 e

2002, observa-se que 28% destes possuem princípios ativos isolados de

produtos naturais ou semi-sintéticos, ao passo que 24% são sintéticos com

grupos farmacofóricos baseados em estruturas de produtos naturais. Portanto,

mais da metade dos novos medicamentos lançados no referido período são

derivados de produtos naturais, revelando a grande importância dessa fonte

nos estudos de desenvolvimento de novos medicamentos (BRANDÃO et al.,

2010).

As pesquisas com plantas medicinais envolvem investigações da

medicina tradicional e popular (etnobotânica); isolamento, purificação e

caracterização de princípios ativos (química orgânica: fitoquímica); investigação

farmacológica de extratos e dos constituintes químicos isolados (farmacologia);

transformações químicas de princípios ativos (química orgânica sintética);

estudo da relação estrutura/ atividade e dos mecanismos de ação dos

princípios ativos (química medicinal e farmacologia) e, finalmente a operação

de formulações para a produção de fitoterápicos. A integração destas áreas na

pesquisa de plantas medicinais conduz a um caminho promissor e eficaz para

descobertas de novos medicamentos (MACIEL; PINTO; VEIGA-JR, 2002).

Assim, o isolamento e a determinação estrutural de substâncias

orgânicas produzidas pelo metabolismo secundário das plantas apresentam

importância fundamental para a fitoterapia e para o desenvolvimento científico

da própria Química de Produtos Naturais, contribuindo para o avanço de outras

atividades científicas e tecnológicas no país (LEMOS et al., 2007).

Diante destas justificativas, evidenciamos a importância do estudo das

plantas medicinais para a obtenção de novas moléculas bioativas, obtendo-se,

portanto, protótipos para a síntese de novas moléculas ou para adaptar as

moléculas já existentes, tornando-as mais potentes ou ativas.

Contribuindo com os estudos de plantas do Nordeste brasileiro para a

descoberta de novas substâncias químicas, tomou-se como objeto de estudo a

espécie Ocotea duckei Vattimo, planta pertencente à família Lauraceae, cujos

estudos surgiram no Laboratório de Tecnologia Farmacêutica (LTF), no início

da década de 90.

OBJETIVOS


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2 OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

Ampliar o conhecimento do gênero Ocotea através do estudo fitoquímico

de Ocotea duckei Vattimo.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Analisar fitoquimicamente as cascas do caule e folhas de Ocotea duckei

através de métodos de extração, isolamento e purificação dos

constituintes químicos;

Identificar e/ou elucidar a estrutura dos constituintes químicos isolados

através de técnicas de espectroscopia de infravermelho, espectrometria

de massas e ressonância magnética nuclear de 1H e 13C (uni e

bidimensionais);

Integrar estudos biológicos ao estudo químico de Ocotea duckei

Vattimo, através da disponibilização de seus extratos e/ou substâncias

isoladas para a realização de testes farmacológicos.

FUNDAMENTAÇÃO

TEÓRICA


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3 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

3.1 Considerações sobre a família Lauraceae: aspectos

botânicos, químicos e farmacológicos

A família Lauraceae, pertencente à ordem Laurales, é considerada uma

das famílias mais primitivas da divisão Magnoliphyta (STEVENS, 2011).

Foi estabelecida por Antoine Laurent de Jussieu em 1789 e o

conhecimento de suas espécies data de 2800 a.C., quando as folhas de louro

(Laurus nobilis) eram usadas como grinaldas pelos antigos gregos e romanos

para coroar guerreiros e atletas (GOTTLIEB, 1972). Através de documentos da

China de 2800 a.C., temos relatos do uso do óleo de Cinnamomum camphora

(L.) J.Presl e de outras espécies do gênero na medicina (SANGIRARDI, 1984).

Algumas de suas espécies receberam seu nome como referência àquela

época; Laurus L. vem do celta “lauer” que significa verde e “laus” que significa

louvor; o gênero Phoebe tem o seu nome relacionado ao deus Apolo. Outras

espécies utilizadas desde a Grécia antiga são as pertencentes ao gênero

Cinnamomum Schaeffer, que significa “caneleira” em grego (BARROSO et al.,

1978; COE-TEIXEIRA, 1980). Alguns termos usados fazem alusão àquela

época, como “poeta laureado” e “Prêmio Nobel”.

Lauraceae é um dos grupos de Angiospermas de maior dificuldade para

a caracterização de suas espécies, principalmente pela significativa

uniformidade morfológica existente entre os táxons (CASTIGLIONI, 1951).

Esta família possui distribuição pantropical (Fig. 1, pág. 30), sendo bem

representada na América, Ásia tropical, Austrália e Madagascar, com pouca

expressividade no sul da África, possuindo cerca de 3000 espécies

subordinadas a 50 gêneros (ROHWER, 1993). No Continente Americano

encontram-se 29 gêneros e 900 espécies com grande diversidade em terras

baixas da Amazônia e da América Central (GOTTLIEB, 1972). No Brasil

ocorrem aproximadamente 435 espécies, distribuídas em 24 gêneros

(QUINETet al., 2012). Suas espécies habitam em sua maior parte as Florestas

Pluviais, Restingas e áreas de Cerrados (BARROSO, 2002). Segundo Souza e


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Lorenzi (2005), é uma das famílias de maior destaque na composição florística

de grande parte dos ecossistemas florestais do país, em especial da Mata

Atlântica e em florestas da Região Sul.

Figura 1 - Mapa de distribuição da família Lauraceae no mundo, representada

nas áreas em verde.

Adaptado de: http://www.tropicos.org/Name/420000016?tab=maps, Acesso em: 18/10/2011

Suas espécies compreendem árvores e arbustos, com exceção do

gênero Cassyta, cuja única espécie (C. filiformis) se apresenta como uma

trepadeira parasita. Apresentam folhas alternas, raramente sub-opostas,

inteiras, peninérveas ou de três a cinco nérveas, podendo apresentar pêlos ou

não. Apresentam inflorescência paniculiforme. As flores são andróginas ou

unissexuadas, monóicas ou dióicas, monoclamídeas, com cálice

infundibuliforme ou urceolado. Androceu em geral constituído de 9-6-3 estames

férteis, acompanhados ou não por estaminóides. Ovário livre, mediano,

unicarpelar, uniovulado, com estilete simples, terminal. Os seus frutos são tipo

baga. Sementes sem endosperma, com embrião bem desenvolvido, com

rostelo curto e cotilédones amplos e carnosos (HEYWOOD, 1993).

Lauraceae destaca-se entre as demais famílias pela sua importância

econômica. Dentre as espécies utilizadas em larga escala, tem-se o fruto de


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Persea americana (abacateiro), a casca de Cinnamomum verum (canela) e as

folhas de Laurus nobilis (louro). Outras são empregadas nas suas regiões de

origem, como condimento (Dicypellium caryophyllaceum) ou para fazer chá

(Licaria puchury-major e Aniba canelilla). Essências aromáticas, empregadas

na indústria de perfumes, são obtidas de algumas espécies como canela-

sassafrás (Ocotea odorifera) e pau-rosa (Aniba rosaeodora). Algumas têm uso

medicinal como cânfora (Cinnamomum canfora). Além dessas utilizações, tem-

se explorado a madeira de espécies de Lauraceae, para construção civil e de

embarcações (RALPH, 1978). A pressão extrativista sobre espécies

madeiráveis resultou na diminuição de populações de Lauraceae, e as

espécies Ocotea catharinensis Mez, Ocotea odorífera (Vell.) Rohwer e O

porosa (Nees) Barroso, que ocorrem no Paraná, estão incluídas na lista oficial

das espécies da flora brasileira ameaçadas de extinção (Brasil, 2008). No

Brasil, destacam-se especialmente as espécies Dos gêneros Ocotea e de

Nectandra, conhecidas popularmente como canelas, loureiros ou embuias, que

remontam ao começo da colonização, quando foram exploradas para o

emprego na construção naval e movelaria de luxo (CANTE, 1988).

Figura 2 - Espécies de Lauraceae: Persea americana (abacate), Aniba

rosaeodora (pau-rosa) e Laurus nobilis (louro), respectivamente.

Adaptado de: http://www.missouribotanicalgarden.org/gardens-gardening/your-garden/. aspx,

Acesso em: 05 de Janeiro de 2012.

Diversas espécies da família Lauraceae são empregadas na medicina

popular. O uso de plantas aromáticas é bastante difundido, em especial no


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tratamento de infecções microbianas, inflamações, dores, eczemas e na

regulação da fertilidade (ONAYADE-SONTAN,1991).

Diversos estudos químicos têm demonstrado a presença de diferentes

metabólitos, destacando-se os alcaloides, principalmente isoquinolínicos,

aporfínicos e indólicos (BARBOSA-FILHO; YOSHIDA; GOTTLIEB, 1989),

lignanas e neolignanas, seus principais marcadores químicos (GOTTLIEB;

YOSHIDA,1989), e os óleos essenciais, formados em geral por monoterpenos,

sesquiterpenos e fenilprapranoides (PINO et al., 2005).

3.2 Considerações sobre o gênero Ocotea Aubl.

O gênero Ocotea foi estabelecido por Aublet em 1775 com a espécie

Ocotea guianensis, sendo considerado o maior gênero da família Lauraceae.

Apresenta cerca de 350 espécies, a maioria nas Américas tropical e subtropical

(BAITELLO, 2001), desde o México até a Argentina, com poucas espécies na

África e em Madagascar e ausentes na Ásia (ROHWER, 1993). No Brasil, o

gênero é bem representado com cerca de 170 espécies (QUINETet al., 2012).

Figura 3 - Mapa de distribuição do gênero Ocotea Aubl., representado em

verde.

Adaptado de: http: //tropicos.org/Name/40030080?tab=maps, Acesso em: 18/10/ 2011.


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Regiões Geográficas

Nordeste Norte Centro-Oeste Sudeste Sul

É um gênero muito variável, servindo como depósito de espécies

(WERFF, 1991). Segundo ROHWER (1993) é o gênero menos definido da

família. Suas espécies não possuem constância na frutificação, fato que

dificulta sua propagação (ZANIN; LORDELLO, 2007).

Figura 4 - Distribuição das espécies de Ocotea no Brasil por região

Fonte: Adaptado de: (http://floradobrasil.jbrj.gov.br/2012/FB008440), Acesso em

19/01/2012

Ocotea compreende árvores ou arbustos, com flores monoclinas ou

diclinas, com 6 tépalas, as flores estaminadas, androceu com 9 estames

férteis, anteras quadrilocelares, locelos dispostos em pares superpostos;

estames das séries I e II com 3 estames cada, anteras introrsas; estames da

série III com 3 estames, par de glândulas na base dos filetes, reduzidos,

anteras extrorsas; série IV estaminodial ausente ou quando presente com 3

estaminódios, em geral reduzidos, filiformes, ou raramente estaminódios bem

desenvolvidos, cordados ou sagitados; pistiloide presente ou ausente. Flores

pistiladas com estaminódios reduzidos, de morfologia semelhante aos estames

das flores estaminadas, com vestígio de locelos dispostos em dois pares

superpostos. Fruto bacáceo, sobre ou parcialmente envolvido pela cúpula, em

geral com margem simples e tépalas decíduas (QUINET; ANDREATA, 2002).


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Espécies do gênero Ocotea são utilizadas na medicina popular para o

tratamento de infecções, picada de cobra, úlceras (Ocotea caparrapi), dor de

cabeça (Ocotea bullata), febre, tosse (Ocotea species), cólicas menstruais

(Ocotea nicaraguensis), diarréia (Ocotea quixos), dentre outras (NAPRALERT,

2009). No Norte e Nordeste brasileiro, várias espécies do gênero são utilizadas

na medicina popular para o tratamento da dor, neuralgia, dispepsia e anorexia

(MORAIS et al., 1998b).

Ocotea Aubl. merece um especial destaque devido ao grande número de

espécies que são utilizadas para diferentes fins. Ocotea puberula Nees, por

exemplo, possui características próprias para caixotaria, sendo utilizada

também para a fabricação de papel. Possui um odor bem característico, muito

semelhante ao anis. Ocotea diospyrifolia (Mez) é uma espécie encontrada nas

regiões sul e sudeste do Brasil, sendo comum ainda na Argentina e no

Paraguai. Sua madeira é considerada boa para postes e tábuas de assoalho, já

a casca contém tanino. Ocotea guianensis Aubl. fornece madeira branca, leve,

fácil de trabalhar, podendo-se obter pasta para papel. Ocotea aciphylla (Nees)

Mez, possui madeira amarela, aromática, resistente aos insetos, principalmente

aos cupins, própria para a construção civil e taboados de assoalho. A espécie

Ocotea canaliculata (Rich.) Mez é uma árvore cuja madeira de cor pardo-

escura é usada em marcenaria. Outras espécies, como Ocotea spectabilis

(Meiss.) Mez, Ocotea divaricata (Nees) Mez, Ocotea porosa (Nees) L. Barroso

e Ocotea elegans Nees também são empregadas em marcenaria e

construções em geral (MARQUES, 2001).

Dentre as atividades farmacológicas já encontradas em algumas

espécies de Ocotea, destacam-se como antioxidante (BRUNI et al., 2004),

antibacteriana e antifúngica (SOUZA et al., 2004), antiinflamatória (ZSCHOCKE

et al., 2000), relaxante muscular (RIBEIRO et al., 2003) e antimalárica

(NAPRALERT, 2009). Estudos relatam ainda que do óleo essencial extraído

dos frutos de Ocotea quixos foram identificados 40 compostos, onde o principal

é o trans-cinamaldeído. Este óleo demonstrou atividade antioxidante, bem

como ação antibacteriana contra Enterococcus foecalis, Staphylococcus

aureus, Escherichia coli e Pseudomona aeruginosa. Observou-se, ainda, ação


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antifúngica contra Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae, Pythium

ultimum e Trichophyton mentagrophyte (BRUNI et al., 2004). Souza et al.

(2004) avaliaram a atividade antimicrobiana de extratos metanólicos de 18

plantas medicinais usadas no Rio Grande do Sul. Dentre as espécies

estudadas, Ocotea odorifera demonstrou ação contra Saccharomyces

cerevisiae, embora tenha sido inativa, frente a S. aureus, Staphylococcus

epidermidis, E. coli, Bacillus subtilis, Micrococcus luteus e Candida albicans.

Vários alcaloides aporfínicos comumente encontrados no gênero Ocotea

apresentam pronunciada bioatividade, como a nantenina (bloqueador de

contração muscular, translocação de Ca2+), coclaurina (anti-HIV), dicentrina

(inibição da topoisomerase II, atividade antineoplásica (ZANIN; LORDELLO,

2007); a dicentriona, isolada de O. leucoxyn apresentou atividade inibitória para

topoisomarase I (ZHOU et al., 2000).

Diversas pesquisas têm sido conduzidas com diferentes espécies de

Ocotea, visando o isolamento e a caracterização de compostos químicos.

Dentre os metabólitos vegetais identificados, destacam-se os alcaloides

benzilisoquinolínicos e aporfínicos (VILEGAS et al., 1989, DIAS et al., 2003),

lignanas e neolignanas (SILVA et al., 1989) e óleos essenciais, constituídos por

monoterpenos, sesquiterpenos e fenilpropanóides (BRUNI et al., 2004;

LACERDA, 2004). O quadro 1 (pág.36) mostra alguns constituintes químicos

isolados de diversas espécies do gênero Ocotea.


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Quadro 1 - Alguns constituintes químicos de plantas do gênero Ocotea.

Classe do composto Substância isolada Espécie vegetal Referência

Alcaloides

Reticulina O. duckei MORAIS et al., 1998b

O. caparrapi SUAREZ, 1980

Coclaurina O. duckei SILVA et al., 2002

O. lancifolia FOURNET et al., 2007

Laureliptina Ocotea pretiosa MOLLAN, 1961

N-acetilnorjuzifina O. duckei DIAS et al., 2003

Benzenoides Piperonal O. pretiosa

AIBA, GOTTLIEB e

MAGALHAES, 1976

Benzaldeído O. pretiosa HICKEY, 1948

Esteroides β-sitosterol

O. argyrophylla ALVARENGA et al., 1978

O. corymbosa CHAVEZ, GOTTLIEB e

YOSHIDA, 1995

Flavonoides Epicatequina O. porosa

DAVID, YOSHIDA e

GOTTLIEB, 1994

Catequina O. holdrigiana CASTRO; RUIZ, 1994

Lignoides

Iangambina O. duckei MORAIS et al., 1996

Eudesmina O. duckei MORAIS et al., 1996

Sesartemina O. duckei MORAIS et al., 1996

Sesamina O. usambarensis SEHLAPELO, DREWES

e SANDOR, 1993

Monoterpeno

α- Pineno

O. opifera LORENZO et al., 2001

O. pretiosa HICKEY, 1948

O. pentalanthera GOTTLIEB et al., 1981

Carvacrol O. corymbosa CHAVEZ et al., 1995

Cânfora O. pretiosa MOLLAN, 1961

α- Terpineol O. opifera LORENZO et al., 2001

Caraleno O. duckei LACERDA, 2004

Sesquiterpeno

β- Eudesmol O. duckei LACERDA, 2004

δ-Cadineno O. opifera LORENZO et al., 2001

Spatulenol O. catharinensis LORDELLO; YOSHIDA,

1997

Nerolidol O. caparrapi BROOKS; CAMPBELL ,

1969

β- Farneseno O. duckei LACERDA, 2004


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3.3 Considerações sobre a espécie Ocotea duckei Vattimo

Ocotea duckei Vattimo é uma espécie popularmente conhecida como

“louro-de-cheiro”, “louro-pimenta” e “louro-canela”, encontrada nos estados da

Paraíba, Pernambuco, Ceará, Sergipe e Bahia e em áreas remanescentes da

Floresta Atlântica (BARRETO, 1990).

Compreende uma árvore de grande porte, com cerca de 10 m de altura,

de copa arredondada, caule e ramos cilíndricos, verdes quando jovens

tornando-se marrons na planta adulta. As folhas são simples, alternas, com

lâmina foliar de contorno elíptico a oval, com ápice agudo acuminado, base

aguda, simétrica, margem inteira, superfície adaxial lisa, verde escuro e

brilhante, superfície abaxial verde pálido e opaca. Seu pecíolo é marginal,

glabro. Suas inflorescências são em panícula axilares laterais ou apicais.

Flores monóclinas com tépalas lanceoladas, de cor creme, pubérulas.

Androceu com estames em filamentos, mais estreitos que as anteras, que são

glabras, anteras férteis com quatro válvulas de liberação para grãos de pólen,

no exterior 6 estames, tem uma glândula rodada (estaminoide), na base de

cada filamento, que são unidas á base das tépalas; no interior outros três

estames cercam o pistilo. O pistilo é glabro, verde-claro; ovário globoso, estilete

quase lateral e estigma discóide. O fruto é oblongo e a cúpula evidente

(BARRETO, 1990; COUTINHO et al., 2006).

Figura 5 - Imagens do caule, folhas e inflorescências da Ocotea duckei Vattimo

Fotos: Sandro Leal, 2011


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Os primeiros trabalhos com Ocotea duckei Vattimo surgiram no

Laboratório de Tecnologia Farmacêutica (LTF), no início da década de 90. Não

há registros na literatura do uso popular desta planta (ALMEIDA et al., 1995),

no entanto o grupo de pesquisa coordenado pelo Prof. José Maria Barbosa

Filho e o estudo com esta espécie, do ponto de vista fitoquímico e

farmacológico relatam resultados promissores.

Estudos químicos realizados com a referida espécie relataram a

presença de três alcaloides benzilisoquinolínicos: reticulina (MORAIS et al.,

1998b), coclaurina (SILVA et al., 2002) e N-acetilnorjuzifina (DIAS et al., 2003).

Também foi isolado um alcaloide aporfínico, a laureliptina (DIAS et al., 2003).

Em relação às atividades farmacológicas, estudos realizados com a

reticulina demonstraram que a substância produziu alteração de

comportamento nos animais testados, além de aumentar o tempo de sono

induzido pelo pentobarbital; reduziu a coordenação motora e a hipermotilidade

induzida por D-anfetamina, indicando com estes resultados que a reticulina tem

atividade depressora do sistema nervoso central (MORAIS et al.,1998b). Dias

et al., (2004), através de ensaios in vitro e in vivo demonstraram que a

reticulina apresenta atividade hipotensora, provavelmente por diminuição da

resistência vascular periférica.

Para essa espécie são relatadas várias lignanas como: iangambina,

epiiangambina, sesartemina, episesartemina, siringaresinol, 4’- O-

demetilepimagnolin A e (+) - 4’’- O- demetilepimagnolin A (MORAIS et al., 1996;

MORAIS et al., 1998a).

A Iangambina, uma lignana furofurânica, representa o maior constituinte

da fração total de lignóides isolado dessa espécie (MORAIS et al., 1999).

Estudos farmacológicos atribuíram várias atividades para a iangambina.

Almeida et al., (1995) e Pachú et al., (1993) relataram aumento do tempo de

sono induzido por pentobarbital, sugerindo sua atividade como depressor do

sistema nervoso central, anticonvulsivante e sedativo-hipnótico; possível

atividade analgésica (ALMEIDA et al., 1995); um eficaz agente farmacológico

contra colapso cardiovascular e mortalidade causada por choque induzido por

endotoxina (ARAÚJO et al., 2001); atividade antitumoral em células coloretais


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induzindo apoptose (HAUSSOT et al., 2003). efeito antialérgico (SERRA et al.,

1997); atividade ansiolítica (LIMA et al, 2010).

Evidências indicam que a liberação endógena do PAF, por células

ativadas em situações patológicas tais como choque anafilático e séptico, está

provavelmente envolvida no colapso cardiovascular e morte súbita

frequentemente observados nestas doenças (LEVI et al.,1984; TERASHITA et

al., 1992). Castro Faria-Neto e colaboradores (1995a e 1995b) evidenciaram

que a iangambina inibe a agregação plaquetária induzida pelo PAF em

modelos experimentais in vitro e in vivo, respectivamente. Estudos

farmacológicos feitos por Herbert e colaboradores (1997) observaram que

existem dois subtipos diferentes de receptores de PAF em plaquetas e

leucócitos, estudos esses realizados com a iangambina. O trabalho mostra que

a iangambina é um antagonista seletivo para o receptor de PAF em plaquetas,

e esta lignana falhou em inibir o PAF em leucócitos humanos.

O conceito de que o PAF parece contribuir na fase precoce do dano

tecidual em algumas reações alérgicas (DOEBBER et al., 1986) levou Serra et

al., (1997) a examinarem o potencial da iangambina como uma droga anti-

anafilática. Esses estudos forneceram evidências que a iangambina exibe

propriedade antagonista sobre os receptores do PAF e também sobre outros

receptores, podendo ser uma importante ferramenta na conduta de algumas

doenças alérgicas (SERRA et al., 1997).

Trabalhos recentes realizados in vitro por Monte-Neto e colaboradores

(2007) com parasitas das espécies de Leishmania chagasi e L. amazonensis

mostraram que a iangambina apresenta uma significativa atividade

antipromastigota e antiamastigota em macrófagos murinos infectados com L.

chagasi. Penha, (2010), demonstrou que a iangambina apresentou um efeito

antileishmania in vivo, em camundongos suiços infectados com L.

amazonensis, traduzido pela diminuição da carga parasitária nos animais

tratados via oral com esta lignana.

Em relação ao aspecto toxicológico, estudos preliminares verificaram

que a iangambina administrada em camundongos pela via oral e intraperitonial

em doses de até 1 g/Kg não apresentou efeitos tóxicos (BARBOSA-FILHO,


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1997). Estudos de citotoxicidade realizados in vitro (macrófagos) demonstraram

baixa citotoxicidade para este composto nos modelos estudados (MONTE-

NETO et al., 2007). Estudo com a finalidade de avaliar seu potencial

mutagênico foi feito através do teste de Ames. Resultados negativos foram

obtidos com o tratamento das linhagens TA97a, TA100 e TA102 de Salmonella

typhimurium, indicando que a iangambina não foi mutagênica para as linhagens

testadas mesmo na presença de ativação metabólica (MARQUES et al., 2003).

A análise dos óleos essenciais extraídos de diversas partes de O. duckei

mostraram que são formados por misturas complexas de monoterpenos e

sesquiterpenos. O teor das folhas tem como componente majoritário, o trans-

cariofileno. Os sesquiterpenos, α-humuleno e δ-selineno, também

representaram um teor significativo. O fruto apresenta d-limoneno em

concentrações elevadas. No caule, há predominância de β-eudesmol, enquanto

na raiz o principal constituinte foi o elemol (LACERDA, 2004).


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Reticulina Acetilnorjuzifina

(MORAIS et. al., 1998b) (DIAS et al., 2003)

Iangambina β-Eudesmol

(MORAIS et al., 1996) (LACERDA, 2004)

Siringaresinol Epiiangambina

(MORAIS et al., 1996) (MORAIS et al., 1999

Quadro 2 – Estrutura química de algumas substâncias isoladas de Ocotea

duckei.


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Continuação do Quadro 2 - Estrutura química de algumas substâncias isoladas de Ocotea duckei.

(+)- 4’’-O-dimetilepimagnolin A 4’-O- Dimetilepiiangambina

(MORAIS et al.,1998a) (MORAIS et al., 1996)

Bisaboleno α- Cadineno

(LACERDA, 2004) (LACERDA, 2004)

Episesartemina Sesartemina

(MORAIS et al., 1999) (MORAIS et al., 1996)

METODOLOGIA


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4 METODOLOGIA

4.1 Estudo fitoquímico

4.1.1 Coleta e identificação do material botânico

As cascas do caule e folhas da espécie vegetal Ocotea duckei foram

coletadas no mês de fevereiro de 2010, no município de Santa Rita, estado da

Paraíba. A identificação botânica do material vegetal foi realizada pela Profª.

Dra. Maria de Fátima Agra, do Centro de Biotecnologia(CBiotec/UFPB). Uma

exsicata desta espécie encontra-se depositada no Herbário Prof. Lauro Pires

Xavier (JPB), do Centro de Ciências Exatas e da Natureza (CCEN / UFPB) sob

o código AGRA 4309.

4.1.2 Métodos de análise

4.1.2.1 Métodos cromatográficos

Para a Cromatografia em Coluna (CC) foi utilizada sílica gel 60, ART

7734 da MERCK, com granulometria entre 0,063 – 0,200 mm e 0,04 – 0,063

mm, e para cromatografia flash, sílca gel 60(230-400 mesh-ASTM, Merck). O

comprimento e o diâmetro das colunas variaram de acordo com a quantidade

das amostras e as quantidades de fases estacionárias a serem

cromatografadas.

Para análise e purificação das frações obtidas por CC, foram

empregadas Cromatografia em Camada Delgada Analítica (CCDA) e

Cromatografia em Camada Delgada Preparativa (CCDP), que foram feitas

utilizando-se sílica gel 60 PF254 ART 7749 da MERCK, nas espessuras de

0,25 e 1,0 mm, respectivamente, suspensa em água destilada (1:2),

distribuídas sobre placas de vidro com ajuda de um espalhador mecânico tipo


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quick fit, seguindo técnica descrita por Matos (1997). As cromatoplacas obtidas

foram secas ao ar livre e ativadas em estufa a 110°C, durante duas horas.

Como fases móveis foram usados os solventes hexano (Hex),

clorofórmio (CHCl3), diclorometano (CH2Cl2), acetato de etila (AcOEt) e metanol

(MeOH), isoladamente ou em misturas binárias em gradiente crescente de

polaridade. Os solventes empregados foram destilados no CBiotec/UFPB.

As revelações das substâncias nas CCDA foram executadas pela

exposição das placas à lâmpada de irradiação ultravioleta com dois

comprimentos de onda (254 e 366 nm) por meio de aparelho MINERALIGHT,

modelo UVGL-58 e/ou pela pulverização com o ácido sulfúrico (H2SO4).

Também foi utilizado como revelador câmara saturada com vapores de iodo. O

grau de pureza das substâncias foi evidenciado por CCDA, determinando-se a

pureza quando observada uma única mancha após revelação, em pelo menos

três tipos de sistemas de eluição diferentes; como também pela variação do

ponto de fusão das substâncias.

4.1.2.2 Impregnação de Sílica Gel com Nitrato de Prata

Para impregnação da sílica gel com nitrato de prata (AgNO3) foi

utilizada a metodologia descrita por Andreão et al., 2010. Foram utilizadas 6,0

g de sílica gel 60 (70-230 mesh-ASTM, Merck) em um béquer de forma baixa, e

separadamente em ambiente protegido da luz, pesou-se 600 mg de AgNO3. O

AgNO3 foi então diluído em 5,0 mL de água destilada, sendo em seguida

vertido no recipiente que continha a sílica gel. Este recipiente foi protegido da

luz com folhas de papel alumínio, deixando em sua parte superior, pequenos

orifícios para a saída do vapor de água. O material foi mantido em uma estufa

por 3 dias a 75 ºC para ativação. Em ambiente sem iluminação direta, uma

coluna foi empacotada com a sílica gel impregnada com AgNO3 através da

suspensão da fase estacionária em hexano. Após compactação a mistura a ser

separada foi adicionada na forma de farofa em sílica gel sem AgNO3. A coluna

foi eluída inicialmente com hexano, aumentando a polaridade com misturas de

HEX: AcOEt


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4.1.2.3 Métodos espectrométricos

4.1.2.3.1 Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear

Os espectros de Ressonância Magnética Nuclear (RMN)de 1H e 13C, uni

e bidimensionais, foram obtidos em espectrômetro da marca VARIAN-NMR-

SYSTEM 500 MHz , do Laboratório Multiusuário de Caracterização e Análise –

LMCA, Central Analítica da UFPB. As amostras para análise foram preparadas

dissolvendo-se as mesmas em solventes deuterados da marca Cambridge

Isotope Laboratories: Clorofórmio deuterado (CDCl3) e Piridina deuterada

(C5D5N).

Os deslocamentos químicos (δ) foram expressos em partes por milhão

(ppm) e as constantes de acoplamento (J) em Hz, referenciados para RMN de

1H pelos picos característicos dos hidrogênios pertencentes às frações não

deuteradas do clorofórmio (7,24 ppm).

Para os espectros de RMN de 13C, os deslocamentos químicos foram

referenciados pelos sinais dos carbonos do solvente deuterado: CDCl3 (77,0

ppm).

As multiplicidades no espectro de RMN 1H foram indicadas segundo as

convenções: s (simpleto), d (dupleto), dd (duplo dupleto), ddd (duplo duplo

dupleto), m (multipleto) e t (tripleto). Os espectros de RMN foram otimizados

para as técnicas bidimensionais: HMQC, espectro de correlação heteronuclear,

que permite fazer uma correlação entre hidrogênios e seus respectivos

carbonos; HMBC que permite fazer uma correlação entre hidrogênios e

carbonos a duas (J2) e três (J3) ligações; COSY estabelece as correlações

entre hidrogênios que são responsáveis, entre si, pelo desdobramento do sinal,

e assim discernir a multiplicidade dos sinais observados no espectro de RMN

1H; e NOESY, técnica homonuclear que mostra correlações espaciais dos

hidrogênios da molécula (KAISER, 2000).


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4.1.2.3.2 Ponto de Fusão

O ponto de fusão foi determinado em aparelho digital para ponto de

fusão, marca Microquímica, modelo MQAPF-302, com microscópio óptico tipo

“Kofler”, marca REICHERT, modelo R3279, com temperatura que varia de 0-

350 ºC.

4.1.3 Processamento das cascas do caule de Ocotea duckei Vattimo

As cascas do caule e folhas de Ocotea duckei foram secas em estufa

com ar circulante à temperatura média de 45 °C durante quatro dias. Após a

secagem, o material vegetal foi submetido a um processo de pulverização em

moinho mecânico tipo Harley, obtendo-se 10000g de pó seco.

4.1.4 Obtenção do extrato etanólico bruto (EEB) das cascas do caule e

folhas de Ocotea duckei Vattimo

O material vegetal seco e pulverizado (10000 g) foi submetido à

maceração com etanol (EtOH) a 95% em um recipiente de aço inoxidável,

durante 72 horas. Este processo foi repetido por três vezes, obtendo-se a

solução extrativa contendo os constituintes químicos da planta.

A solução extrativa resultante da maceração foi concentrada em

rotaevaporador sob pressão reduzida, a uma temperatura média de 45 ° C,

sendo obtidos 1628,83 g de Extrato Etanólico Bruto (EEB), 16,28% em relação

ao peso seco da planta.


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4.1.5 Particionamento do extrato etanólico bruto (EEB) de Ocotea duckei

Vattimo

Uma parte do EEB (300,0 g) foi suspenso em uma solução de

Metanol/Água (7:3 v/v) e homogeneizado sob agitação mecânica durante

aproximadamente 60 minutos. Desse processo resultou uma solução

hidroalcoólica que foi submetida a uma partição líquido/líquido, em uma ampola

de separação, sob agitação manual utilizando consecutivamente solventes de

polaridades crescentes, obtendo-se as fases: hexânica, diclorometano e

acetato de etila. As soluções obtidas no processo de partição foram tratadas

com Sulfato de Sódio (Na2SO4) anidro, para retirada da umidade, e submetidas

à filtração sob pressão reduzida. Após esse processo, os solventes foram

evaporados em rotaevaporador a uma temperatura média de 50 °C, obtendo-

se: 71,0 g de fase hexânica, 23,0 g da fase diclorometano e 7,19 g da fase

acetato de etila (Esquema 1, pág.49) .


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Esquema 1 - Obtenção e particionamento do extrato etanólico bruto de Ocotea

duckei Vattimo

* Descartada

** Reservada para estudos posteriores

- Secagem com Na2SO4 anidro; - Filtração sob pressão reduzida; - Concentração em evaporador rotativo.

Fase Hexânica (71g)

Fase Diclorometano (23g)

Fase Acetato de Etila (7,19)**

- Maceração com EtOH 95 % (três vezes); - Concentração em evaporador rotativo.

Extrato Etanólico Bruto (300g)

Solução Hidroalcoólica

- Dissolução em MeOH:H2O (7:3 v/v); - Agitação mecânica por 60minutos

- Partição em ampola de separação com hexano

Solução Hidroalcoólica I

IiiII - Partição em ampola

de separação com CH2Cl2

- Secagem com Na2SO4 anidro;

- Filtração sob pressão reduzida; - Concentração em evaporador rotativo.

- Secagem com Na2SO4 anidro;

- Filtração sob pressão reduzida; - Concentração em evaporador rotativo.

Solução Hidroalcoólica II

II

- Partição em ampola de separação com AcOEt

Solução Hidroalcoólica III*

III

Material botânico seco e pulverizado (10000g)


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4.1.6 Fracionamento Cromatogáfico do resíduo da marcha de lignoides –

Marcha para lignoides

A marcha para lignoides foi realizada de acordo com a metodologia

descrita por Barbosa-Filho et al. (1999), para obtenção do resíduo que

teoricamente estaria isento de lignoides e encontra-se esquematizada abaixo.

Esquema 2 - Marcha para extração de lignoides

* Reservada para estudos posteriores

4.1.7 Fracionamento cromatográfico do resíduo da marcha de extração de

lignoides

- Ácido acético a 10%

- Agitação mecânica por 1h

- Filtração em celite®

Extrato aquoso acético

- Extração com CH₂Cl₂ (1:1, 3x)

- Secagem com Na₂SO₄ anidro

- Concentração em rotaevaporador

Fração de lignoides *

Extrato etanólico Bruto (200g)

Resíduo (122,67g)

Extrato acético

desengordurado


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Uma alíquota de 3g do resíduo foi submetido a uma colona

cromatográfica (CC) usando-se como fase estacionária sílica gel 60 (Artigo

7734 MERCK - 0,063 – 0,200 mm), e como eluentes hexano, diclorometano e

metanol, puros ou em misturas binárias, em gradiente crescente de polaridade.

Foram obtidas 79 frações de 125 mL, que foram concentradas em

rotaevaporador e reunidas por CCDA, de acordo com seus fatores de retenção

(Rfs) em 7 grupos (Quadro 3, pág. 52).

A reunião das frações 8-13 apresentou-se como um óleo amarelo, e

após análise em CCDA, apresentou-se pura e, foi codificada como Od-1 e

submetida à análise espectral (Esquema 3).

Esquema 3 - Fracionamento cromatográfico do resíduo da marcha de

extração de lignoides de Ocotea duckei.

Resíduo (3,0g)

79 frações

- CC (sílica gel 60);

- Hex / Hex: CH2Cl2 / CH2Cl2:MeOH

(em gradiente crescente de polaridade)

7 grupos

- CCDA

- CCDA

1-7 8-13 14-46 47-49 50-55 56-61 62-79

Od-1 (34mg)

60mg


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Quadro 3 - Sistemas de eluições utilizados no fracionamento cromatográfico

do resíduo da extração de lignoides de Ocotea duckei

Frações Solvente Proporção

1-3 Hexano: Diclorometano 95: 5 v/v










33-36 Diclorometano 100 v/v

37-39 Diclorometano: Metanol 99: 1 v/v










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4.1.8 Fracionamento cromatográfico da fase hexânica do EEB das cascas

do caule e folhas de Ocotea duckei Vattimo

A fase hexânica (7,0 g) foi submetida a uma coluna cromatográfica CC,

utilizando-se como fase estacionária sílica gel 60 (Art 7734 MERCK - 0,063 –

0,200 mm), e como eluentes hexano, acetato e metanol, puros ou em misturas

binárias, obedecendo um grau crescente de polaridade. Foram coletadas 220

frações de 125 mL, que foram concentradas individualmente em

rotaevaporador.

As frações foram analisadas através de CCDA, utilizando diferentes

sistemas de eluição e reunidas, quando semelhantes e de acordo com seus

fatores de retenção (Rfs), após visualização na luz ultravioleta e impregnação

com vapores de iodo em 22 grupos (Quadro 4, pág. 54; Esquema 4, pág. 56).


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Quadro 4 - Sistemas de eluições utilizados no fracionamento cromatográfico

da fase hexânica do extrato etanólico bruto de Ocotea duckei Vattimo

Sistema de eluição Frações Reunião das frações

Hexano 100% 01-09 01-07; 08-10

11-15 Hex: AcOEt (99: 1,0) 10-20

Hex: AcOEt (95:5,0) 21-35 16-22; 23;

24-36; 37-46 Hex: AcOEt (90: 10) 36-46

Hex: AcOEt (80: 20) 47-60 47-58

Hex: AcOEt (75: 25) 61-75 59-77

Hex: AcOEt (1,0: 1,0) 76-86 78-85

86-100

101-114

Hex: AcOEt (30: 70) 87-108

Hex: AcOEt (20: 80) 109-115

Hex: AcOEt (10: 90) 116-128 115-120

121-130

131-145

Acetato 100 % 129-145

AcOEt: MeOH (99,5: 0,5) 146-150

AcOEt: MeOH (99: 1,0) 151-160 146-155

AcOEt: MeOH (98,5: 1,5) 161-175 156-161

AcOEt: MeO (98: 2,0) 176-186 162-178

AcOEt: MeO (97: 3,0) 187-193 179-190

AcOEt: MeOH (96: 4,0) 193-199 191-199

AcOEt: MeOH (95: 5,0) 200-206

200-210

211-220

AcOEt: MeO ( 90: 10) 207-215

AcOEt: MeOH (80: 20) 216-220


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A fração 11-15 foi submetida à cromatografia líquida de média pressão

(CLMP), utilizando Aparelho de Sistema binário de separação flash da Bushi,

equipado com dois módulos de bombas (C-601 e C-605), módulo controlador

(C- 615) e coluna (45 x 3,5 cm) empacotada com sílica gel 60 (Artigo 7734

Merck - 0,04 – 0,063 mm), com um fluxo de 10 mL/min. Foram coletadas 20

frações, que foram concentradas em rotaevaporador e reunidas por CCDA, de

acordo com seus Rfs em 6 grupos. A subfração 16 (S.16) foi submetida à

cromatografia em coluna preenchida com sílica gel 60 e eluída com hexano,

acetato de etila, puros ou em misturas binárias, obedecendo a um gradiente de

concentração, obtendo-se 16 subfrações que foram reunidas em 4 grupos após

monitoramento por CCDA. A subfração (S.10) revelou uma única mancha

sendo então codificada como Od-2 (Esquema 4, pág.56)

A fração 23 apresentou-se na forma de cristais brancos, e após análise

por CCDA revelou uma única mancha, sendo então codificada como Od-3 e

encaminhada para análise espectral (Esquema 4, pág.56).

A fração 47-58 foi submetida a uma cromatografia flash em coluna com

sílica gel 60 (230-400 mesh-ASTM, Merck), utilizando como eluentes Hex/

AcOEt em gradiente crescente de polaridade, resultando em 134 subfrações de

10,0 mL cada. Estas subfrações, após análise por CCDA, foram reunidas em

23 grupos. A subfração 45-56 (S.45-56) foi submetida á cromatografia em

coluna preenchica com sílica gel 60 (Art 7734 Merck) impregnada com nitrato

de prata (AgNO3) e eluída com hexano e acetato, puros ou em misturas

binárias, obedecendo um gradiente de concentração. A cromatografia com a

subfração (S.45-56) resultou em 190 frações de 10,0 mL cada, que foram

reunidas em 13 grupos após análise por CCDA. A reunião das frações (144-

157) por CCDA, após evaporação do solvente, resultou num óleo amarelo que

foi submetido à análise espectral com o código Od-5 (Esquema 4, pág 56).

A fração 86-100 apresentou-se na forma de um sólido branco após

evaporação do solvente. Após análise por CCDA revelou uma única mancha,

sendo então codificada como Od-4 e encaminhada para análise espectral

(Esquema 4, pág 56).


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Esquema 4 - Fracionamento cromatográfico da fase hexânica do extrato

etanólico bruto de Ocotea duckei Vattimo

-CCDA

-CCDA

-CCDA

Fase Hexânica (7,0g)

220 frações


- Hex / Hex: AcOEt / AcOEt:MeOH

(em gradiente crescente de polaridade)

-CCDA

22 grupos

-CCDA

11-15

(222mg)

23 47-58

369mg

86-100

- CLMP (sílica gel 60);

- Hex / Hex: AcOEt

-CCDA

Od- 3 (18mg)

-CCDA

Od-4 (14mg)

20 subfrações

S.16

Od-2

(8mg)


- Hex / Hex: AcOEt

-CCDA

- CC Flash (sílica gel 60)

- Hex / Hex: AcOEt

134 subfrações

-CCDA

S.45-56 (196 mg)

- CC (sílica gel 60/AgNO3);

- Hex / Hex: AcOEt

-CCDA

190 frações

grupos

144-157

Od-5

(10mg)

RESULTADOS E

DISCUSSÃO


TELES, M. M. R. S

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

O estudo fitoquímico das cascas do caule e folhas de Ocotea duckei

resultou no isolamento de cinco substâncias. Na caracterização dessas

substâncias foram utilizadas técnicas espectroscópicas de RMN de 1H e 13C,

uni e bidimensionais, ponto de fusão e comparação com dados da literatura.

5.1 Determinação estrutural de Od-1

O composto codificado como Od-1 foi isolado como um óleo amarelo,

com peso de 34 mg.

Os dados espectrais de RMN 13C (125 MHz, CDCl3), Tabela 1 (pág.

61), e as expansões (Fig 6 e 7, pág. 63, 64), apresentaram 15 sinais, atribuídos

a três carbonos metínicos (δC 122,7, 129.2, 144,8,), quatro carbonos

metilênicos (δC 22,9, 55,1, 41,7, 111,6, ), quatro carbonos metílicos (δC 27.6,

27.7, 16.3, 20.6) e quatro carbonos não hidrogenados (δ 73,2, 129,7, 155,7,

199,2,). Foi observada uma absorção em δC 199,2, característico de carbonila

de cetona (PAVIA et al., 2010). O espectro mostrou também δC 73,2, sugestivo

de álcool alifático. Absorções em δC 111,6 e 144,8 foram observadas,

indicativas de um grupo vinil terminal, outras absorções para carbonos

insaturados foram observadas δC 122,8 e 129,7, e δC 129,2 e 155,7 estas são

sugestivas de absorções de unidades isoprênicas.

Os dados espectrais de RMN 1H (500 MHz, CDCl3), (Tab.1, pág.61) e

as expansões (Fig.8-10, pág. 65-67) apresentaram um envelope de absorções

para hidrogênios alifáticos entre 1,0 e 2,06, característico de terpenóides, onde

se encontram singletos referentes a quatro metilas em δ 1.80 (s, 3H), δ 1.21 (s,

3H), δ 1,53 (s, 3H) e δ 2,06 (s, 3H). A presença das metilas associada ao fato

de existirem 15 sinais de carbono sugeriu tratar-se de um sesquiterpeno. Um

duplo dubleto δH 5,17 (J = 1,5 e 17,5 Hz, 1H), que acopla trans com o H-2 (δH

5,85) e com hidrogênio geminal H-1b (δH 4,98). Um duplo dubleto δH 4,98 (J =

1,5 e 11,0 Hz, 1H), que acopla cis com H-2 (δH 5,85) e com o hidrogênio


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geminal H-1a (δH 5,16) e outro duplo dubleto δH 5,85 (J = 11,0 e 15,0 Hz, 1H),

que acopla cis com H-1b (δH 4,98)) e trans com H-1a (δH 5,16). Dois multipletos

em δH 1,55 (2H) e δH 2,06 (2H) e um singleto em 2,96 (2H), referentes a

hidrogênios alifáticos. Observou-se um tripleto em δH 5,19 (1H), desblindado,

por ser um de hidrogênio ligado a carbono sp2. Outra absorção para hidrogênio

de carbono sp2 foi observada em 6,03 (1H) mostrando-se como um singleto

largo.

A compilação dos dados de RMN de 1H e 13C obtidos para o composto

Od-1 e comparação com valores da literatura (Iida et al., 1982), permitiram

identificá-lo como 9-oxo-nerolidol (Tabela 2, pág. 62), sendo descrito pela

primeira vez no gênero Ocotea.

O espectro de correlação homonuclear COSY e as expansões (Fig.11-

13, pág. 68-70) confirmaram o acoplamento cis e trans observado pelas

correlações de δH 5,85 (H-2) com δH 5,16 (H-1a (trans)) e δH 4,98 (H-1b(cis)),

caracterizando um grupo vinila terminal. Foi observada outra correlação entre o

multipleto δH 2,06 (H-5) com o multipleto δH 1,55 (H-4) e com o tripleto δH 5,19

(H-6). Adicionalmente, observou-se um fraco acoplamento entre o singleto

largo δH 6,03 (H-10) com as absorções dos hidrogênios metílicos de (C-12 e C-

13) em δH 1,80 e δH 2,06 respectivamente,

O espectro bidimensional de HMQC e suas expansões permitiram

confirmar as correlações diretas de carbono e hidrogênio (Figuras 14-17, pág.

71-74)

A análise dos dados espectrais de correlação heteronuclear 1H X 13C

HMBC (tabela 1, pág.61) e suas expansões (Fig. 18-21, pág. 75-78) puderam

OOH

1

2

4

53

6

7

8

11

10

12

9

13

14

15


TELES, M. M. R. S

assinalar várias unidades do esqueleto estrutural do sesquiterpeno, por análise

da correlação a duas (J2) e três ligações (J3). As correlações do hidrogênio δH

5,16 (H-1a) com o carbono δC 144,8 (C-2) a J2 e com δC 73,2 (C-3) a J3 e entre

o hidrogênio δH 5,85 (H-2) e o carbono δC 73,2 (C-3) a J3 permitiram sugerir que

o grupo vinila terminal está ligado ao carbono C-3. Também foram observadas

correlações dos hidrogênios metílicos δH 1,21 com δC 73,2 (C-3) a J2, como

também com δC 144,8 (C-2) e δC 41,4 (C-4) a J3, que permitiram confirmar a

conectividade da metila ao C-3. As correlações do δH 2,96 (H-8) com δC 199,2

(C-9) a J2, e entre δH 6,03 (H-10) e δC 199,2 (C-9) a J2 definiram a posição da

carbonila. Uma correlação a J3 entre os hidrogênios δH 2,96 (H-8) e δC 16,3 (C-

14) e δC 129,7 (C-7) a J2, bem como as correlações entre os hidrogênios de C-

14 (δH 1,53) e o δC 129,7 (C-7) a j2 e com δC 55,1 (C-8) a J3, permitiu sugerir a

posição da metila.

Os espectros de HMBC também apresentaram dados que confirmaram

a posição das metilas dos carbonos C-12 e C-13 através das correlações entre

o hidrogênio δH 6,03 (H-10) com δC 27,6 (C-12) e δC 20,6 (C-13); entre os

hidrogênios de C-13 (δH 2,06) com δC 122,7(C-10) e δC 27,6 (C-12), bem como

do hidrogênios metílicos de C-12 (δH 1,80) com os carbonos δC 122,7(C-10) e

δC 20,6 (C-13). Também foi observada a correlação entre os hidrogênios δH

2,06 (H-5) e δC 129,2 (C-6) a duas ligações. Essas correlações nos permitiram

confirmar os valores de deslocamento para os carbonos C-6 e C-10, corrigindo

os valores da literatura, que apresentavam valores trocados para esses

carbonos (Tabela 1, pág. 61)

A análise dos espectros de correlação homonuclear NOESY (tabela 1,

pág. 61) e as expansões (Fig. 22-24 pág. 79-81) corroboraram com as

informações dos espectros anteriores.


TELES, M. M. R. S

Tabela 1 - Deslocamentos químicos, tipos de sinal e correlações para Od-1,

verificados nos espectros de RMN 1H e 13C (500 e 125 MHz, respectivamente)

uni e bidimensionais em CDCl3.

C HMQC HMBC

COSY NOESY δC δH

2J

3J

1 111,6

H1a 5,17 (dd, J = 1,5 e 17,5

Hz, 1H)

C-2 C-3 H-1b, H-2

H1b 4,98 (dd, J = 1,5 e 11,0

Hz, 1H) H-1a, H-2 H-6

2 144,8 5,85 (dd, J = 11,0 e 15,0 Hz,

1H) C-3 H-1a, H-1b

3 73,2 -

4 41,7 1,55 (m, 2H) H-5

5 22,9 2,06 (m, 2H) C-6, C-4 H-4, H-6

6 129,2 5,19 (t, J = 5,0 Hz, 1H) H-5 H-8, H1b

7 129,7 -

8 55,1 2,96 (s, 2H) C-9, C-7 C-14 H-6

9 199,2 -

10 122,7 6,03 (sl, 1H) C-9 H-13, H-12 H-12

11 155,7 -

12 27,6 1,80 (s, 3H) C-11 C-10, C-13 H-10 H-10

13 20,6 2,06 (s, 3H) C-11 C-10, C-12

14 16,3 1,53 (s, 3H) C-7 C-8

15 27,7 1,21 (s, 3H) C-3 C-2, C-4

OOH

1

2

4

53

6

7

8

11

10

12

9

13

14

15


TELES, M. M. R. S


CDCl3 e comparação com os dados da literatura [(CDCl3) (Iida et al., 1982)] (δ

em ppm e J em Hz).

C

Od-1 (125 e 500 MHz) Iida et al., 1982 (25 e 100 MHz)

δC δH δC δH

1 111,6

H1a 5,16 (dd, J = 1,5 e 17,5 Hz, 1H)

111,4 4,90-6,00 (m, J = 3, 10 e

17 Hz, 3H) H1b 4,98 (dd, J = 1,5 e

11,0 Hz, 1H)

2 144,8 5,85 (dd, J = 10,0 e 15,0

Hz, 1H)

144,7

3 73,2 - 73,1 -

4 41,7 1,55 (m, 2H) 41,8 Não assinalados

5 22,9 2,06 (m, 2H) 23,0 Não assinalados

6 129,2 5,19 (t, J = 5,0 Hz, 1H) 122,6 5,12 (m, 1H)

7 129,7 - 129,4 -

8 55,1 2,96 (s, 2H) 55,1 3,00 (s, 2H)

9 199,2 - 198,8 -

10 122,7 6,03 (sl, 1H) 129,1 6,04 (sl, 1H)

11 155,7 - 155,3 -

12 27,6 1,80 (s, 3H) 27,6 1,88 (s, 3H)

13 20,6 2,06 (s, 3H) 20,7 2,12 (s, 3H)

14 16,3 1,53 (s, 3H) 16,7 1,60 (s, 3H)

15 27,7 1,21 (s, 3H) 27,8 1,28 (s, 3H)

OOH

1

2

4

53

6

7

8

11

10

12

9

13

14

15


TELES, M. M. R. S

Figura 6 - Espectro de RMN de 13C - APT de Od-1 (CDCl3, 125 MHz)

OO

H

1

2

4

53

6

7

8

11

10

129

13

14

15


TELES, M. M. R. S


15 a 75 ppm) (CDCl3, 125 MHz)

OO

H

1

2

4

53

6

7

8

11

10

129

13

14

15


TELES, M. M. R. S

Figura 8 - Espectro de RMN de 1H de Od-1 (CDCl3, 500 MHz)

OO

H

1

2

4

53

6

7

8

11

10

129

13

14

15


TELES, M. M. R. S


5,3) ppm (CDCl3, 500 MHz)

OO

H

1

2

4

53

6

7

8

11

10

129

13

14

15


TELES, M. M. R. S


1,0) ppm (CDCl3, 500 MHz)

OO

H

1

2

4

53

6

7

8

11

10

129

13

14

15


TELES, M. M. R. S

Figura 11 - Espectro de correlação homonuclear COSY de Od-1 (CDCl3, 500

MHz)

OOH

1

2

4

53

6

7

8

11

10

12

9

13

14

15


TELES, M. M. R. S


na região de (6,5 a 0,5) x (6,5 a 0,5) ppm (CDCl3, 500 MHz)

O

OH

1

2

4

53

6

7

8

11

10

12

9

13

14

15


TELES, M. M. R. S


na região de (4,5 a 0,5) x (3,5 a 0,5) ppm (CDCl3, 500 MHz)

OOH

1

2

4

53

6

7

8

11

10

12

9

13

14

15


TELES, M. M. R. S


500 e 125 MHz)

OO

H

1

2

4

53

6

7

8

11

10

129

13

14

15


TELES, M. M. R. S


Od-1 na região de 145 a 110 ppm (CDCl3, 500 e 125 MHz)

OO

H

1

2

4

53

6

7

8

11

10

129

13

14

15


TELES, M. M. R. S


Od-1 na região de (4,5 a 1,0) x (35 a 15 ppm) (CDCl3, 500 e 125 MHz)

OO

H

1

2

4

53

6

7

8

11

10

129

13

14

15

OO

H

1

2

4

53

6

7

8

11

10

129

13

14

15


TELES, M. M. R. S

Figura 17 -Expansão do espectro de correlação 1H x 13C – JCH- HMQC de Od-1

na região de (2,4 a 0,4) x (36 a 15) ppm (CDCl3, 500 e 125 MHz)


TELES, M. M. R. S


(CDCl3, 500 e 125 MHz)

OO

H

1

2

4

53

6

7

8

11

10

129

13

14

15


TELES, M. M. R. S


HMBC de Od-1 na região de (7,0 A 0,5) x (80 a 15 ppm) (CDCl3, 500 e 125

MHz)

OO

H

1

2

4

53

6

7

8

11

10

129

13

14

15


TELES, M. M. R. S


HMBC de Od-1 na região de (3,4 a 0,6 ppm) x (180 a 120 ppm) (CDCl3,500 e

125 MHz)

OO

H

1

2

4

53

6

7

8

11

10

129

13

14

15


TELES, M. M. R. S


HMBC de Od-1 na região de (3,4 a 6,0 ppm) x (60 a 15 ppm) (CDCl3, 500 e 125

MHz)

Figura 18 Expansão do espectro de correlações 1H x 13C-nJCH (n=2 e 3) -

HMBC de Od-1 na região de (0,6 a 3,4 ppm) x (60 a 15 ppm) (CDCl3 , 500 e

125 MHz)

OO

H

1

2

4

53

6

7

8

11

10

129

13

14

15


TELES, M. M. R. S

Figura 22 - Espectro de correlação homonuclear NOESY de Od-1 (CDCl3,500

MHz)

OOH

1

2

4

53

6

7

8

11

10

12

9

13

14

15


TELES, M. M. R. S


na região de (6,5 a 0,5 ppm) x (6,5 a 0,5) (CDCl3, 500 MHz)

OOH

1

2

4

53

6

7

8

11

10

12

9

13

14

15


TELES, M. M. R. S


na região de (3,2 a 0,6 ppm) x (3,2 a 0,6 ppm) (CDCl3, 500 MHz)

OOH

1

2

4

53

6

7

8

11

10

12

9

13

14

15


TELES, M. M. R. S


A substância codificada como Od-2 foi obtida como um óleo amarelo,

solúvel em CDCl3, com peso 8mg. A mesma foi identificada através de análise

espectral dos dados de RMN 1H e 13C uni e bidimensionais e comparação com

os dados obtidos na literatura (Miyazawa et al., 1996).

Os dados espectrais de RMN 13C (125 MHz, CDCl3), Tabela 3 (pág.

83), e as expansões (Fig. 25-27, pág.85-87), apresentaram 15 sinais, atribuídos

a três carbonos metínicos (δC 124,2, 124,2 e 145,1), cinco carbonos

metilênicos (δC 22,7, 26,6, 39,7, 42,1 e 111,6 ), quatro carbonos metílicos (δC

16,0, 17,6, 25,6, e 27,8) e três carbonos não hidrogenados (δC 73,4, 131,3 e

135,5). Absorções em δC 111,6 e 145,1 sugestivas de um grupo vinil terminal e

outras absorções para carbonos insaturados foram observadas δC 124,2 e

135,5, e δC 124,2 e 131,3, sugestivas de absorções de unidades isoprênicas. O

espectro mostrou também δC 73,4, sugestiva de álcool alifático.

Os dados espectrais de RMN 1H (500 MHz, CDCl3), (Tab.3, pág. 83) e

as expansões (Fig. 28-30, pág. 88-90) apresentaram um envelope de

absorções para hidrogênios alifáticos entre 0,9 e 2,05, característico de

terpenoides, onde se encontram singletos referentes a quatro metilas em 1,59

(s, 3H), δ 1,58 (s, 3H), δ 1,26 (s, 3H) e um singleto largo δ 1,66 (sl, 3H). A

presença das metilas associada ao fato de existirem 15 sinais de carbono

sugeriu tratar-se de um sesquiterpeno. Um duplo dubleto δH 5,20 (J = 1,0 e 17

Hz, 1H) e outro duplo dupleto δH 5,04 (J = 1,0 e 11,0 Hz, 1H), referente a um

grupo vinílico terminal. Foi observado um multipleto (δH 1,95 – 2,04 Hz, m, 2H).

As absorções de 1H e 13C de Od-2 mostraram-se semelhantes a Od-1.

A diferença significativa consiste na ausência de um grupo carbonila em C-9

em Od-2, que apresentou um deslocamento em δC 26,6, e Od-1 mostrou uma

absorção em δC 199,2, que caracteriza uma carbonila de cetona. A compilação

dos dados de RMN de 1H e 13C obtidos para o composto Od-2 e comparação

com valores da literatura (Miyazawa et al., 1996), permitiram identificá-lo como

o nerolidol (Tabela 3, pág. 83). Esses dados também foram comparados com o

Od-1, e estão apresentados na (Tab. 4, pág. 84).


TELES, M. M. R. S

O nerolidol é usado para realçar o sabor e aroma, e tem sido estudado

como promotor de penetração tópica na pele (LAPCZYNSKI et al., 2008;.

William; Barry, 2004). Além disso, tem atividade inibitória sobre S. aureus e E.

coli por alterar a permeabilidade celular bacterian (BREHM-STECHER;

JOHNSON, 2003; INOUE et al, 2004), efeito antifúngico contra

Microsporum gypseum (LEE et al., 2007), atividade antimalárica (LOPES et al.,

1999) antileishmanicia e antiulcerosa (ARRUDA et al, 2005.;

Klopell et al., 2007


TELES, M. M. R. S


CDCl3 e comparação com os dados da literatura [(CDCl3) (Miyazawa et al.,

1996)] (δ em ppm e J em Hz).

C

Od-2

(125 e 500 MHz) Miyazawa et al., 1996 (125 e 500 MHz)

δC δH δC δH

1 111,6

5,20 (dd, J = 1,0 e 17 Hz,

1H)

5,03 (dd, J = 1,0 e 11,0 Hz,

1H)

111,6

5,21 (dd, J = 1,5 e 17,5 Hz)

5,06 (dd, J = 1,5 e 11 Hz)

2 145,1 5,90 (dd, J = 11,0 e 17,5 Hz,

1H)

145,0 5,92 (dd, J = 11,0 e 17,5 Hz)

3 73,4 - 73,4 -

4 42,1 1,55 (m, 2H) 42,0 1,58 (m)

5 22,7 1,95 – 2,04 (m, 2H) 22,7 1,96 – 2,10 (m)

6 124,2 5,12 (m, 1H) 124,2 5,14 (tq, J = 1,0 e 7,0 Hz)

7 135,5 - 135,5 -

8 39,7 1,95 – 2,04 (m, 2H) 39,6 1,96-2,10(m)

9 26,6 1,95 – 2,04 (m, 2H) 26,6 1,96-2,10(m)

10 124,2 5,07 (m, 1H) 124,2 5,08 (m)

11 131,3 - 131,3 -

12 25,6 1,66 (sl, 3H) 25,6 1,68 d (J=1,0 Hz)

13 17,6 1,59 (s, 3H) 17,6 1,60 (s)

14 16,0 1,58 (s, 3H) 15,9 1,60 (s)

15 27,8 1,26 (s, 3H) 27,8 1,28 (s)

OH

1

2

4

53

6

7

8

11

10

12

9

13

14

15


TELES, M. M. R. S

Tabela 4 - Dados de RMN de 1H (500 MHz) e 13C (125 MHz) de Od-2 e de Od-

1

C

Od-2 (125 e 500 MHz) Od-1 (125 e 500 MHz)

δC δH δC δH

1 111,6

5,19 (dd, J = 1,0 e 17 Hz, 1H)

5,03 (dd, J = 1,0 e 11,0 Hz, 1H)

111,6

5,21 (dd, J = 1,5 e 17,5 Hz 1H)

5,06 (dd, J = 1,5 e 11 Hz 1H)

2 145,1 5,90 (dd, J = 11,0 e 17,5 Hz, 1H) 144,8 5,85 (dd, J = 10,0 e 15,0 Hz, 1H)

3 73,4 - 73,2 -

4 42,1 1,55 (m, 2H) 41,7 1,55 (m, 2H)

5 22,7 1,95 – 2,04 (m, 2H) 22,9 2,06 (m, 2H)

6 124,2 5,12 (m, 1H) 129,2 5,19 (t, J = 5,0 Hz, 1H)

7 135,5 - 129,7 -

8 39,7 1,95 – 2,04 (m, 2H) 55,1 2,96 (s, 2H)

9 26,6 1,95 – 2,04 (m, 2H) 199,2 -

10 124,2 5,07 (m, 1H) 122,7 6,03 (sl, 1H)

11 131,3 - 155,7 -

12 25,6 1,66 (sl, 3H) 27,6 1,80 (s, 3H)

13 17,6 1,59 (s, 3H) 20,6 1,21 (s, 3H)

14 16,0 1,58 (s, 3H) 16,3 1,53 (s, 3H)

15 27,8 1,26 (s, 3H) 27,7 2,06 (s, 3H)

OH

1

2

4

53

6

7

8

11

10

12

9

13

14

15

OOH

1

2

4

53

6

7

8

11

10

12

9

13

14

15


TELES, M. M. R. S


OH

1

2

4

53

6

7

8

11

10

129

13

14

15


TELES, M. M. R. S


70 ppm (CDCl3, 125 MHz)

OH

1

2

4

53

6

7

8

11

10

129

13

14

15


TELES, M. M. R. S



OH

1

2

4

53

6

7

8

11

10

129

13

14

15


TELES, M. M. R. S


OH

1

2

4

53

6

7

8

11

10

129

13

14

15


TELES, M. M. R. S


5,0 ppm (CDCl3, 500 MHz)

OH

1

2

4

53

6

7

8

11

10

129

13

14

15


TELES, M. M. R. S




TELES, M. M. R. S


A substância codificada como Od-3 foi isolada na forma de cristais em

agulha, brancos, com ponto de fusão 139-142ºC não apresentando

fluorescência à luz ultravioleta.

O espectro de RMN 1H (500 MHz, CDCl3) e as expansões (Fig. 31-33,

pág. 93-95) apresentaram um conjunto de deslocamentos químicos simples e

de alta multiplicidade na região compreendida entre δH 0,66 - 2,2

característicos de hidrogênios metínicos, metilênicos e metílicos, sugerindo que

Od-3 possui estrutura triterpênica ou esteroidal. A presença de um multipleto

em δH 3,49 pôde-se verificar a presença de um hidrogênio oximetínico atribuído

ao hidrogênio do carbono 3 (H-3) de núcleo esteroidal (KOJIMA, 1990). O

espectro ainda mostrou um dubleto em δ 5,32 (J = 5,0 Hz) característico de

hidrogênio olefínico na posição 6 de fitoesteróides (AHMED et al., 1992)

No espectro de RMN 13C - APT (125 MHz, CDCl3) e nas expansões

(Figura 34-36, pág. 96-98) observa-se um sinal em δC 71,8 referente ao

carbono oximetínico (C-3); sinais para carbono sp2 metínicos em δC 121,7 e

carbono não hidrogenado em δC 140,8 compatíveis com a dupla ligação

localizada em C-5 e C-6; outros em δC δC 34,0 e 26,2 para carbonos

metilênicos, referentes a C-22 e C-23. Estes dados espectrais, feições do

espectro e comparações com dados da literatura possibilitaram sugerir que Od-

3 trata-se do β- sitosterol (Tab.5, pág. 92)

β-Sitosterol é relatado em todo o Reino Vegetal. No gênero Ocotea há

relato para algumas espécies. O β-sitosterol é conhecido por apresentar

atividades antiúlcera (LING; JONES, 1995), gastroprotetora (NAVARRETE et

al., 2002), anticancerígena (AWAD et al., 2005), antiofídica (GALOTTA;

BOAVENTURA, 2005) e hipoglicemiante (LINDO, 1999 citado por MCANUFF

et al., 2005).


TELES, M. M. R. S

Tabela 5 - Deslocamentos químicos e tipos de sinais para os átomos de

carbono e hidrogênio de Od-3, verificados nos espectros de RMN 1H e 13C (500

e 125 MHz, respectivamente) em CDCl3, bem como, os deslocamentos

químicos dos carbonos (δC) apresentados por Tomaz (2008) para a mesma

substância

C

β-sitosterol

δC δC δH

1 37,2 37,2 -

2 31,7 31,4 -

3 71,8 71,7 3,49 (m, 1H)

4 42,3 42,1 -

5 140,8 140,7 -

6 121,7 121,6 5,32 (d, J = 5,0 Hz, 1H)

7 31,9 31,9 -

8 31,9 31,8 -

9 50,1 50,1 -

10 36,5 36,4 -

11 21,1 21,0 -

12 39,8 39,7 -

13 42,3 42,2 -

14 56,8 56,7 -

15 24,3 24,3 -

16 28,2 28,2 -

17 56,1 56,0 -

18 11,8 11,8 0,66 (s, 3H)

19 19,4 19,3 0,98 (s, 3H)

20 36,1 36,1 -

21 18,8 18,7 -

22 34,0 34,0 -

23 26,2 26,0 -

24 45,8 45,7 -

25 29,2 29,0 -

26 19,8 19,8 0,89 (d, J = 6,4 Hz, 3H)

27 19,0 19,0 0,79 (d, J = 5,6 Hz, 3H)

28 23,1 23,0 -

29 12,0 12,0 -


TELES, M. M. R. S



TELES, M. M. R. S


3,8 ppm (CDCl3, 500MHz)


TELES, M. M. R. S




TELES, M. M. R. S

Figura 34 - Espectro de RMN de 13C- APT de Od-3 (CDCl3, 125 MHz)


TELES, M. M. R. S

Figura 35 - Expansão do espectro de RMN de 13C- APT de Od-3 na região de

144 a 44 ppm (CDCl3, 125 MHz)


TELES, M. M. R. S

Figura 36 - Expansão do espectro de RMN de 13C APT de Od-3 na região de

45 a 15 ppm (CDCl3, 125 MHz)


TELES, M. M. R. S


A substância codificada como Od-4 foi obtida na forma de um sólido

branco, com ponto de fusão 271-274ºC.

Assim como Od-3, os espectros de RMN 1H e 13C (500 e 125 MHz,

C5D5N) de Od-4 (Fig. 37-38, pág. 101 e 102) apresentaram um envelope de

absorções em δH 0,64 e δH 2,7 característico de núcleo esteroidal ou

triterpênico. A presença de unidade osídica foi sugerida por um conjunto de

absorções entre δH 4,0 e δH 4,5 típicos de hidrogênios oximetínicos da referida

unidade (KASAI et al., 1987). Um multipleto em δH 3,94 referente ao hidrogênio

carbinólico, permitiu propor presença de unidade osídica no C-3, tendo em

vista seu deslocamento para campo baixo em Od-4 quando comparado com o

mesmo hidrogênio (H-3) em Od-3, que absorve em δH 3,49.

O espectro de RMN 13C e suas expansões, obtidos utilizando a técnica

APT (Fig. 39-42, pág. 103-106) corroboram com a proposta anterior da

presença da unidade osídica, ao mostrar um sinal em δC 102,55 referente ao

carbono anomérico (C-1`) (AQUINO et al., 1988), bem como absorções na

região entre δC 71,68 e δC 78,54 condizentes com absorções de carbonos

carbinólicos. Uma absorção em δC 62,80 referente a carbono metilênico

oxigenado, confirma que a unidade osídica trata-se da glicose. Observaram-se

também sinais entre δC 11,93 e δC 19,93, característicos de carbonos metílicos

de esteroides (BREITMAIER; VOELTER, 1990). Absorções em δC 140,90 e δC

123,75 correspondem, respectivamente, aos carbonos 5 e 6 do esqueleto de

esteroides como o sitosterol.

A compilação dos dados de RMN de 1H e 13C obtidos para o composto

Od-4 e comparação com valores da literatura (KOJIMA et al., 1990), permitiram

identificá-lo como Sitosterol-3-O-β-D-glicopiranosídeo (Tab.6, pág 100).

Estudos in vivo em animais demostraram que o β-sitosterol glicosilado

apresenta atividades antiinflamatória, antineoplásica, antipirética e

imunomodulatória e inibidor da DNA polimerase (MIZUSHINA et al., 2006).


TELES, M. M. R. S

Tabela 6 - Dados de RMN de 1H (500 MHz) e 13C (500 MHz) para Od-4

(C5D5N) e comparação com os dados de RMN de 13C da literatura (δC)

[(C5D5N) (KOJIMA et al., 1990)] (δ em ppm e J em Hz).

C

Sitosterol-3-O-β-D-glicopiranosídeo

δC δC δH

1 37,60 37,45 -

2 30,30 30,21 -

3 78,30 78,39 3,94 (m, 1H)

4 39,40 39,31 -

5 140,9 140,89 -

6 121,86 121,86 -

7 32,20 32,14 -

8 32,10 32,03 -

9 50,40 50,33 -

10 37,00 36,89 -

11 21,40 21,13 -

12 40,00 39,92 -

13 42,40 42,45 -

14 56,30 56,23 -

15 24,60 24,47 -

16 28,70 28,50 -

17 56,50 56,81 -

18 12,00 11,94 -

19 19,30 19,19 -

20 36,50 36,35 -

21 19,10 18,98 -

22 34,30 34,19 -

23 26,40 26,40 -

24 46,10 46,03 -

25 29,50 29,46 -

26 20,10 19,93 -

27 19,50 19, 38 -

28 23,40 23,37 -

29 12,20 11,85 -

1’ 102,55 102,60

2’ 75,30 75,40

3’ 78,54 78,70

4’ 71,70 71,70

5’ 78,13 77,50

6’ 62,80 62,90


TELES, M. M. R. S

Figura 37 - Espectro de RMN de 1H de Od-4 (C5D5N, 500 MHz)


TELES, M. M. R. S


3,8 ppm (C5D5N), 500 MHz)


TELES, M. M. R. S

Figura 39 - Espectro de RMN de 13C – APT de Od-4 (C5D5N), 125 MHz)


TELES, M. M. R. S




TELES, M. M. R. S


A substância codificada como Od-5 foi isolada como óleo amarelo e a

análise dos dados espectrais de RMN de 1H e suas expansões (Fig. 43-45,

pág. 111-113) mostraram absorções para hidrogênios alifáticos,

compreendidas entre δH 0,82-2,52, característicos de hidrogênios metilênicos e

metínicos, com destaque para absorções de cinco metilas em δH: 0,82 (3H),

0,83 (6H), 0,84 (3H) e 1,21 (3H). Observou-se ainda absorções em δH 1,98

(6H) e 2,01 (3H), sugerindo tratar-se de metilas ligadas a carbonos insaturados.

A absorção em δH 2,52 referente a hidrogênios metilênicos, por apresentar um

valor desblindado, é sugestiva de hidrogênios próximos a carbono sp2.

O espectro de RMN de 13C e suas expansões (Fig. 46-48, pág. 114-116)

mostraram absorções referentes a 29 sinais, sendo 3 para carbonos metínicos,

11 para carbonos metilênicos, 8 para carbonos metílicos e 7 carbonos não

hidrogenados. Destacam-se absorções para duas carbonilas em 187,20 e

187,65, bem como absorções para carbonos insaturados (sp2) em 144,45,

140,52, 140,42 e 140,16, de onde podemos inferir que Od-5 trata-se de uma

benzoquinona.

Continuando a análise de RMN de 13C observou-se sinais para carbonos

alifáticos foram observadas entre δC 11,94 e 72,66, corroborando com o

espectro de RMN 1H que mostrou valores referentes a hidrogênios alifáticos.

Destaca-se a absorção em δC 72,66, sugestiva de carbono carbinólico. Tais

absorções juntamente com os dados de RMN 1H sugerem a presença de um

derivado do fitol para substância Od-5.

A princípio, indagou-se a possibilidade de Od-5 tratar-se de uma mistura

de fitol com benzoquinona, porém a análise do espectro de HMBC mostrou

correlações que indicaram a ligação entre eles.

A conexão da cadeia alílica com o anel benzoquinona pôde ser

estabelecida através do espectro de HMBC e suas expansões (Fig. 51-53, pág.

119-121) que mostraram correlações a duas ligações dos hidrogênios do

carbono 1’(δH 2,52) com o carbono 6 (δC 144,45), e deste a três ligações com

os hidrogênios da metila 5 [(Me-5), (δH 2,01)], permitindo assim afirmar que o


TELES, M. M. R. S

fitol estaria localizado no carbono 6 (C-6). Essa conexão foi sugerida

anteriormente pelo espectro de RMN 1H ao mostrar um valor de absorção para

os hidrogênios (2H) do carbono 1’ (δH em 2,52), desprotegidos devido à

proximidade com o carbono insaturado.

Esse espectro também ajudou a determinar os deslocamentos químicos

dos outros carbonos e hidrogênios do anel benzoquinona, mostrando as

seguintes correlações: a três ligações (J3) do carbono C-1(δC 187,20) com os

hidrogênios (δH 2,52) de C-1’ e com os hidrogênios da metila 2 [(Me-2), (δH

1,98)]; a três ligações (J3) do C-5 com os hidrogênios (2H) do C-1’ (δH 2,52); a

três ligações (J3) do C-4 com os hidrogênios da metila 5 [(Me-5), (δH 2,01)]; a

três ligações (J3) do C-3 com os hidrogênios da metila 2 [(Me-2),(δH 1,98)]; Os

carbonos C-3’, C-2 e C-3 mostraram ainda correlações a duas ligações (J2)

com os hidrogênios das metilas que estes sustentam, Me-3’, Me-2 e Me-3,

respectivamente.

Algumas interações adicionais no espectro de HMBC permitiram

confirmar absorções das posições de carbonos e hidrogênios do fitol: O

carbono C-11’ mostrou correlação a duas ligações (J2) com os hidrogênios da

metila 11’[(Me-11’), (δH 0,84)], respectivamente. Os carbonos C-6’ e C-8’

mostraram correlações a três ligações (J3) com os hidrogênios da metila 7’

(Me-7’). O carbono C-15’ mostrou correlações também a duas ligações (J2)

com os hidrogênios das metilas 15’a e 15’b (Me-15’a, Me-15’b), que também

mostraram correlações a três ligações (J3) com o carbono C-14’, permitindo

assim assinalar as posições e absorções dos referidos carbonos e hidrogênios.

A metila 3’ teve sua posição confirmada pelas correlações a três ligações dos

seus hidrogênios com os carbonos C-2’ e C-4’.

O espectro de HMQC (Fig. 49-50, pág. 117-118) mostrou as correlações

diretas entre carbonos e seus respectivos hidrogênios (Tab. 7, pág. 109).

Os dados espectrais estão condizentes com a literatura, permitindo

identificar Od-5 como α - tocoferol quinona, relatada pela primeira vez no

gênero Ocotea (Tab. 8, pág. 110).

A α-tocoferol quinona (ATQ) é um importante derivado da vitamina E.

Pode ser sintetizado em muitas plantas, animais e microrganismos e é


TELES, M. M. R. S

detectado em uma grande variedade de organelas e tecidos como membrana

mitocondrial, retículo endoplasmático e plasma (GILLE et al., 2001; MOTTIER

et al., 2002). Estudos mostram que a ATQ é um potente anticoagulate que

pode ser responsável pelos efeitos benéficos da vitamina E na prevenção de

ataques cardíacos e derrames ( DOWD; ZHENG, 1995)


TELES, M. M. R. S

O

O

OH

12

3

45

6

1'

2'

3'

4'

5'

6'

7'

8' 10'

11'

12'

9' 13'

14'

15'

Me-3' Me-7' Me-11'

Me-5

Me-3

Me-2

15'a

15'b

Tabela 7 – Deslocamentos químicos, tipos de sinal e correlações para Od-5,

verificados nos espectros de RMN 1H e 13C (500 e 125 MHz, respectivamente)

uni e bidimensionais (CDCl3)

HMQC HMBC

C δC δH J2 J

3

1 187,20 - -

2 140,42 - -

3 140,52 - -

4 187,65 - -

5 140,16 - -

6 144,45 - -

1’ 21,41 2,52 (m, 2H) C-2’; C-6; C-5; C-1

2’ 40,26 1,50 (m, 2H) C-3’

3’ 72,66 -

4’ 42,30 1,45 (m, 1H) C-3’

5’ 21,37 1,30 (m, 2H)

6’ 37,62 1,30-1,05

7’ 32,80 1,40 (m, 1H)

8’ 37,44 1,30-1,05

9’ 24,49 1,25 (m, 2H)

10’ 37,29 1,30-1,05

11’ 32,80 1,40 (m, 2H)

12’ 37,44 1,30-1,05

13’ 24,79 1,25 (m, 2H)

14’ 39,37 1,10 (m, 2H)

15’ 27,97

Me-2 12,34 1,98 (s, 3H) C-2 C-3

Me-3 12,27 1,98 (s, 3H) C-3 C-2

Me-5 11,94 2,01 (s, 3H) C-4; C-6

Me-3’ 26,58 1,21 (s, 3H) C-3’ C-2’; C-4’

Me-7’ 19,68 0,82 (d, J = 6,5 Hz 3H) C-6’; C-8’

Me-11’ 19,68 0,84 (d, J = 7,0 Hz 3H) C-11’

Me-15’a 22,64 0,83 (d, J = 6,5 Hz 3H) C-15’ C-15’b, C-14’

Me-15’b 22,64 0,83(d, J = 6,5 Hz 3H) C-15’ C-15’a, C-14’


TELES, M. M. R. S

O

O

OH

12

3

45

6

1'

2'

3'

4'

5'

6'

7'

8' 10'

11'

12'

9' 13'

14'

15'

Me-3' Me-7' Me-11'

Me-5

Me-3

Me-2

15'a

15'b

Tabela 8 - Deslocamentos químicos e tipos de sinais para os átomos d carbono

e hidrogênio de Od-5, verificados nos espectros de RMN 1H e 13C (500 e 125

MHz, respectivamente) em CDCl3, bem como, os deslocamentos químicos dos

carbonos (δC) apresentados por Tereza (1986) para a mesma substância

C

Od-5 Tereza, 1986

δC δH δC δH

1 187,20 - 187, 24

2 140,42 - 140,49

3 140,52 - 140,23

4 187,65 - 187,68

5 140,16 - 140,58

6 144,45 - 144,55

1’ 21,41 2,52 (m, 2H) 21,46 2,52 (m, 2H)

2’ 40,26 1,50 (m, 2H) 40,35 1,50 (m)

3’ 72,66 - 72,69 -

4’ 42,30 1,45 (m, 1H) 42,39 1,50 (m)

5’ 21,37 1,30 (m, 2H) 21,39 -

6’ 37,62 1,30-1,05 37,50 -

7’ 32,80 1,40 (m, 1H) - -

8’ 37,44 1,30-1,05 - -

9’ 24,49 1,25 (m, 2H) 24,54 -

10’ 37,29 1,30-1,05 37,50 -

11’ 32,80 1,40 (m, 2H) 32,84 1,41 (m)

12’ 37,44 1,30-1,05 37,35 -

13’ 24,79 1,25 (m, 2H) 24,83 -

14’ 39,37 1,10 (m, 2H) 39,44 1,18 (m)

15’ 27,97 28,01 -

Me-2 12,34 1,98 (s, 3H) 12,35 1,99 (s, 3H)

Me-3 12,27 1,98 (s, 3H) 12,27 1,99 (s, 3H)

Me-5 11,94 2,01 (s, 3H) 11,95 2,02 (s, 3H)

Me-3’ 26,58 1,21 (s, 3H) 26,64 1,21 (s, 3H)

Me-7’ 19,68 0,82 (d, J = 6,5 Hz 3H) 19,74 0,82 (d, J = 6,5 Hz, 3H)

Me-11’ 19,68 0,84 (d, J = 7,0 Hz 3H) 19,79 0,85 (d, J = 6,5 Hz, 3H)

Me-15’a 22,64 0,83 (d, J = 6,5 Hz 3H) 22,73 0,84 (d, J = 6,5 Hz, 3H)

Me-15’b 22,64 0,83(d, J = 6,5 Hz 3H) 22,64 0,84 (d, J = 6,5 Hz, 3H)


TELES, M. M. R. S

O O

OH

12

3

456

1'

2'

3'

4'

5'

6'

7'

8'

10'

11'

12

'

9'

13'

14

'15

'

Me-3

'M

e-7

'M

e-1

1'

Me-5

Me-3

Me-2

15'a

15'b



TELES, M. M. R. S

O O

OH

12

3

456

1'

2'

3'

4'

5'

6'

7'

8'

10'

11'

12

'

9'

13'

14

'15

'

Me-

3'

Me-

7'

Me-

11

'

Me-

5

Me-

3

Me-

2

15'a

15'b

Figura 47 - Expansão do espectro de RMN de 13C - APT de Od-5, na região de 195 a 70 ppm (CDCl3, 125 MHz)


TELES, M. M. R. S

O O

OH

12

3

456

1'

2'

3'

4'

5'

6'

7'

8'

10'

11'

12

'

9'

13'

14

'15

'

Me-3

'M

e-7

'M

e-1

1'

Me-5

Me-3

Me-2

15'a

15'b


50 a 10 ppm (CDCl3, 125 MHz)


TELES, M. M. R. S

O O

OH

12

3

456

1'

2'

3'

4'

5'

6'

7'

8'

10'

11'

12

'

9'

13'

14

'15

'

Me-3

'M

e-7

'M

e-1

1'

Me-5

Me-3

Me-2

15'a

15'b


500 e 125 MHz)


TELES, M. M. R. S


Od-5, na região de (2,5 a 0,4) x (42 a 12 ppm) (CDCl3, 500 e 125 MHz)


TELES, M. M. R. S

O O

OH

12

3

456

1'

2'

3'

4'

5'

6'

7'

8'

10'

11'

12

'

9'

13'

14

'15

'

Me-3

'M

e-7

'M

e-1

1'

Me-5

Me-3

Me-2

15'a

15'b


(CDCl3, 500 e 125 MHz)


TELES, M. M. R. S

O O

OH

12

3

456

1'

2'

3'

4'

5'

6'

7'

8'

10'

11'

12

'

9'

13'

14

'15

'

Me-3

'M

e-7

'M

e-1

1'

Me-5

Me-3

Me-2

15'a

15'b



MHz)

CONCLUSÃO E

PERSPECTIVAS


TELES, M. M. R. S

6 CONCLUSÃO E PERSPECTIVAS

O presente trabalho cumpriu o objetivo principal que se fundamentou na

ampliação do conhecimento quimiotaxonômico do gênero Ocotea através do

estudo fitoquímico das cascas do caule e folhas de ocotea duckei Vattimo.

O estudo fitoquímico de Ocotea duckei Vattimo resultou no isolamento

de dois sesquiterpenos: 9-oxo-nerolidol e nerolidol; dois esteroides; os

esteroides β- sitosterol e Sitosterol-3-O-β-D-glicopiranosídeo e a quinona α-

tocoferol quinona. O 9-oxo-nerolidol e a quinona estão sendo descritos pela

primeira vez no gênero Ocotea.

A existência de grande variedade de metabólitos secundários no gênero

Ocotea, levou-nos ao interesse em dar continuidade ao estuda da mesma, na

busca de novas substâncias para essa espécie.

Considerando o potencial farmacêutico do gênero, as substâncias

isoladas da espécie em estudo estão sendo encaminhados para testes

farmacológicos. Espera-se dessa forma descobrir novas atividades

farmacológicas, além daquelas já relatadas na literatura.

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