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  • UNIVERSIDADE FEDERAL DO PAR

    INSTITUTO DE CINCIAS DA SADE

    PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM CINCIAS

    FARMACUTICAS

    ESTUDO FITOQUMICO, AVALIAO DA TOXICIDADE ORAL AGUDA E DA ATIVIDADE ANTIMALRICA IN VITRO

    E IN VIVO DAS CASCAS DE PARAHANCORNIA FASCICULATA (POIR.) BENOIST (APOCYNACEAE)

    Adreanne Oliveira da Silva

    Belm-PA 2013

  • UNIVERSIDADE FEDERAL DO PAR INSTITUTO DE CIENCIAS DA SADE

    PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM CINCIAS

    FARMACUTICAS

    ESTUDO FITOQUMICO, AVALIAO DA TOXICIDADE

    ORAL AGUDA E DA ATIVIDADE ANTIMALRICA IN VITRO

    E IN VIVO DAS CASCAS DE PARAHANCORNIA

    FASCICULATA (POIR.) BENOIST (APOCYNACEAE)

    Autor: Adreanne Oliveira da Silva

    Orientadora: Prof. Dr. Maria Fani Dolabela

    Co-Orientadora: Prof. Dr.a Alade Braga de Oliveira

    Dissertao apresentada ao Programa de Ps-graduao em Cincias Farmacuticas, rea de concentrao Frmacos e Medicamentos, do Instituto de Cincias da Sade da Universidade Federal do Par como requisito para obteno de Ttulo de Mestre em Cincias Farmacuticas.

    Belm-PA 2013

  • FOLHA DE APROVAO

    Adreanne Oliveira da Silva

    ESTUDO FITOQUMICO, AVALIAO DA TOXICIDADE ORAL

    AGUDA E DA ATIVIDADE ANTIMALRICA IN VITRO E IN VIVO DAS

    CASCAS DE PARAHANCORNIA FASCICULATA (POIR.) BENOIST

    (APOCYNACEAE)

    Dissertao apresentada Faculdade de Farmcia da Universidade Federal do Par para obteno do ttulo de mestre do PPGCF. rea de concentrao: Frmacos e Medicamentos.

    Aprovado em:

    Banca Examinadora

    Profa. Dra. Maria Fni Dolabela Instituio: Faculdade de Farmcia, Universidade Federal do Par.

    Orientadora Ass:_______________________

    Profa. Dra Alade Braga de Oliveira

    Instituio: Faculdade de Farmcia, Universidade Federal de Minas Gerais. Ass:_______________________

    Prof. Dr. Sandro Percrio Instituio: Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Par.

    Ass:_______________________

    Prof. Dr. Flvio de Vasconcelos (suplente) Instituio: Faculdade de Farmcia, Universidade Federal do Par.

    Ass:_______________________

    Belm- PA 2013

  • DEDICATRIA

    Aos meus pais Ludilcio Serro da Silva e Carmem do Socorro Oliveira da

    Silva, minhas irms Andra Oliveira da Silva e Amanda Oliveira da Silva e ao meu

    namorado e amigo Jorge Valentim Monteiro Abdelnor, com amor, admirao e

    gratido por seu apoio, pacincia, carinho, incentivo e amor incondicional. Muito

    obrigada por tudo, sem vocs no seria nada.

    No existem palavras que expressem a gratido e o amor que sinto por todos

    vocs. Espero ser sempre motivo de orgulho e alegria para vocs. Dedico-lhes esta

    conquista com muita gratido e amor.

  • AGRADECIMENTOS

    Em primeiro lugar e acima de tudo agradeo a Deus por tudo de bom que me concede na vida, pela companhia, sabedoria e fora constante em todos os momentos deste mestrado e da minha vida. Sem Ele, nada existiria. No haveria razo e nem motivo. Obrigado meu Deus por estar sempre comigo no s neste trabalho, mas em todas as situaes que acontecem em minha vida, me aconselhando e ensinando.

    minha orientadora Profa. Dra. Maria Fni Dolabela pela sua orientao, fora, sabedoria, ajuda, confiana e pacincia durante a trajetria deste trabalho. Alm das sugestes durante a realizao e redao do mesmo. minha co-orientadora Profa. Dra Alade Braga de Oliveira pela sua orientao, sabedoria, fora, incentivo, apoio, confiana, carinho e pacincia pelos trs meses em que fiquei realizando a parte experimental deste trabalho em Belo Horizonte, alm das sugestes durante a realizao e redao deste trabalho. aluna de Doutorado Renata Cristina de Paula e Mestra Maria Fernanda do Nascimento, Faculdade de Farmcia/UFMG, pela ajuda, pacincia e competncia no ensinamento da parte experimental dos ensaios de atividade antimalrica in vitro e in vivo. Aos meus queridos colegas Doutores Clio Brando, Guilherme Pereira e Rodrigo de Pdua, Faculdade de Farmcia/UFMG, pela ajuda, apoio, compreenso, pacincia e carinho nos testes fitoqumicos. Aos colegas do Laboratrio de Fitoqumica da UFMG, Marina Barbosa, Raquel Isidorio, Juliana de Oliveira, Keylla Ribeiro, Sarah Assis, Karla Evangelista, Bruna Malagoli, Ana Brbara Dias, Tatiane Borgati e Marina Schiavo pela ajuda, apoio, parceria, carinho e maravilhoso acolhimento que todos tiveram comigo no perodo em que estive em Belo Horizonte. Aos meus queridos amigos do Laboratrio de Famacologia da UFPA, Dayse Brando, Michel Martins, Andreza Veiga, Edinilza Borges, Cynthia Quaresma, Amanda Almeida, Diele Magno, Natasha Costa, Raimundo Miranda, Guilherme Carvalho, Rosana Volpato, Camila Santos que sempre estiveram ao meu lado nos momentos bons ou ruins, por toda ajuda, apoio, carinho, compreenso, dedicao e ateno. Obrigada queridos por tudo. Ao Laboratrio de Toxicologia da UFPA na pessoa do professor Flvio Vasconcelos por nos liberar o laboratrio para a realizao de alguns experimentos e aos meus colegas Thyago Vilhena, Thiago Leite e Adriana Veiga pelo carinho, ajuda e apoio na realizao dos ensaios. Ao Laboratrio de Fitoqumica da UFPA na pessoa do Prof. Dr. Wagner Barbosa por nos liberar o laboratrio para a realizao de alguns experimentos e aos seus colaboradores Jailton Nascimento, Jos Gomes, Amiraldo Perez e Myrth Soares pelo carinho, ajuda e apoio na realizao dos ensaios.

  • A Central de Extrao da UFPA por permitir que realizasse a o processo de moagem das cascas de Parahancornia fasciculata. Aos meus pais Ludilcio Serro da Silva e Carmem do Socorro Oliveira da Silva, irms Amanda Oliveira da Silva e Andra Oliveira da Silva e ao meu namorado e amigo Jorge Valentim Monteiro Abdelnor, pela compreenso, pacincia, carinho, dedicao, amor, respeito e apoio incondicional em toda a minha vida. A Coordenao de Aperfeioamento de Pessoal de Nvel Superior CAPES pela bolsa concedida. Ao Ministrio da Cincia e Tecnologia (MCT), Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico (CNPq), Ministrio da Sade (MS), Secretaria de Cincia, Tecnologia e Insusmos Estratgicos (SCTIE), Departamento de Cincia e Tecnologia (DECIT), Fundao de Amparo Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG), Fundao de Amparo Pesquisa do Estado do Par (FAPESPA) pelo apoio financeiro para realizao do trabalho. A Universidade Federal do Par pela Ps-graduao em Cincias Farmacuticas. Aos professores do Programa de Ps-Graduao em Cincias Farmacuticas da Faculdade de Farmcia da Universidade Federal do Par pelos ensinamentos de tantos anos. As minhas queridas amigas Karla Fabiana Barroso e Mayara Sousa pelo apoio, carinho e amizade durante esse perodo de curso. Aos funcionrios da Ps-graduao em Cincias Farmacuticas pela ajuda sempre dispensada. E a todos aqueles que contriburam de modo direto ou indireto, na realizao desta dissertao.

  • A presente dissertao faz parte do PRONEX- Rede malria. Processo no 555655/2009-1-Rede de produtos naturais para a quimioterapia antimalrica, coordenado pela Profa. Alade Braga de Oliveira, Faculdade de Farmcia/UFMG e com apoio das seguintes agncias na UFPA: Ministrio da Cincia e Tecnologia (MCT), Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico (CNPq), Ministrio da Sade (MS), Secretaria de Cincia, Tecnologia e Insumos Estratgicos (SCTIE), Departamento de Cincia e Tecnologia (DECIT), Fundao de Amparo Pesquisa do Estado do Amazonas (FAPEAM), Fundao de Amparo Pesquisa do Estado do Maranho (FAPEMA), Fundao de Amparo Pesquisa do Estado de Mato Grosso (FAPEMAT), Fundao de Amparo Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG), Fundao de Amparo Pesquisa do Estado do Par (FAPESPA), Fundao de Amparo Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) e Fundao de Amparo Pesquisa do Estado de So Paulo (FAPESP). Parte do trabalho de Fitoqumica e a avaliao da atividade antimalrica in vitro e in vivo foram desenvolvidos na forma de Mestrado Sanduche no laboratrio de Fitoqumica, Faculdade de Farmcia, Universidade Federal de Minas Gerais, sob a orientao da Profa. Dra. Alade Braga de Oliveira, com a colaborao do Dr. Geraldo Clio Brando, da Doutoranda Renata Cristina de Paula, e da Bolsista CNPq/DTI2 MSc Maria Fernanda Alves do Nascimento. O perodo de realizao do estgio do mestrado sanduche foi de Setembro a Dezembro de 2011.

  • RESUMO

    SILVA, A. O. Estudo fitoqumico, avaliao da toxicidade oral aguda e da atividade antimalrica in vitro e in vivo das cascas de Parahancornia fasciculata (Poir.) Benoist (Apocynaceae). 2013. 137f. Dissertao de Mestrado, Faculdade de Farmcia, Universidade Federal do Par, Belm-PA, 2013. Parahancornia fasciculata (Poir.) Benoist (Apocynaceae), tambm conhecida como Parahancornia amapa (Hub.) Ducke, uma espcie vegetal empregada popularmente no tratamento da malria, infeces no tero, gastrite, anemia, problemas respiratrios, entre outros. Os objetivos do presente trabalho foram realizar o estudo fitoqumico, avaliar a toxicidade oral aguda e a atividade antimalrica in vitro e in vivo de extratos, fraes e substncia isolada obtidas a partir de cascas do caule de P. fasciculata. Foram realizados dois tipos de extraes com o p das cascas de P. fasciculata, por macerao / percolao, com etanol 96GL e diclorometano, esta ltima tendo sido realizada a com o p das cascas alcalinizado com hidrxido de amnio, obtendo-se os extratos secos EEPF e EDAPF, respectivamente. Uma terceira extrao foi realizada a partir do EEPF por aquecimento sob refluxo, sucessivamente, com Hex:DCM (1:1), AcOEt:DCM (1:1) e AcOEt. EEPF foi, tambm, submetido a fracionamento por extraes cido-base resultando nas fraes de neutros (EEPFN) e de alcalides (EEPFA). A prospeco fitoqumica realizada com o EEPF foi desenvolvida por CCD em cromatoplacas de slica gel tendo sido detectada a presena de triterpenos, esterides, heterosdeos flavnicos, saponinas, polifenis, taninos, heterosdeos antracnicos e heterosdeos cardiotnicos. EDAPF foi submetido cromatografia em coluna de slica gel. Foram recolhidas 30 fraes sendo que as fraes Fr1-3, Fr4, Fr5-7 e Fr11 concentraram a maior parte da massa do extrato cromatografado. Da Fr5-7 foi isolada uma mistura de steres do lupeol que representam os componentes majoritrios do EDAPF. Esta frao passou por um processo de hidrlise alcalina e o produto obtido (Fr5-7Hid) foi analisado por espectrometrias no IV, RMN de 1H e 13C e foi identificado como o triterpeno lupeol. A frao insolvel em AcOEt obtida a partir do EEPF, por aquecimento sob refluxo, apresentou resultado positivo para o teste de proantocianidinas e foi submetido a doseamento desta classe de metablitos. Os resultados foram expressos em porcentagem dos teores para a amostra no diluida (10,460,3419%), amostra diluda a 1:10 (9,94 0,1598%) e amostra diluda a 1:100 (10,55 0,9299%). A avaliao da atividade antiplasmdica in vitro em culturas de cepas W2 de Plasmodium falciparum foi realizada pelo teste da Protena II Rica em Histidina (HRP-II) tendo sido testados EEPF, EEPFN, EEPFA, Fr1-3, Fr4, Fr5-7(steres do lupeol), Fr11 e o Fr5-7Hid (lupeol). Os melhores resultados obtidos foram para EEPF, EEPFA E EEPFN (CI50= ~ 50 g/mL) sendo considerados moderadamente ativos. As demais amostras apresentaram CI50 > 50 g/mL e foram consideradas inativas. Realizou-se tambm a avaliao da atividade antimalrica in vivo em camundongos fmeas suos infectados com cepas ANKA de P. berghei com o EEPF e o EEPF-HEX:DCM (1:1) em concentraes de 500, 250 e 125mg/kg de peso. EEPF foi parcialmente ativo, somente no 8 dia, em todas as concentraes. J EEPF-HEX:DCM (1:1) foi parcialmente ativo na dose de 500mg/kg de peso e nas demais doses foi inativo. O teste de toxicidade oral aguda foi realizado em camundongos fmeas suos, pelo mtodo da dose fixa (5.000mg/kg), com EEPF e no apresentou nenhum sinal de toxicidade evidente, o

  • que foi confirmado pela ausncia de alteraes nos exames antomo-histopatolgicos realizados. Palavras-chave: Apocynaceae, Parahancornia fasciculata, Fitoqumica, steres do lupeol, Lupeol, Plasmodium falciparum, Plasmodium berghei, Atividade antiplasmdica in vitro, Atividade antimalrica in vivo, Toxicidade oral aguda.

  • ABSTRACT

    SILVA, A. O. Phytochemistry, acute oral toxicity, in vitro and in vivo antimalarial activity from the trunk bark of Parahancornia fasciculata (Poir.) Benoist (Apocynaceae). 2013. 137f. Dissertao de Mestrado, Faculdade de Farmcia, Universidade Federal do Par, Belm-PA, 2013. Parahancornia fasciculata (Poir.) Benoist (Apocynaceae), also known as Parahancornia amapa (Hub.) Ducke is a species used in the treatment of malaria, uterus infections, gastritis, anemia, respiratory problems, among other ailments. The objectives of this study were to carry out the phytochemical study of the trunk bark from P. fasciculata, to evaluate the in vitro and in vivo antimalarial activity as well as the acute oral toxicity of extracts and fractions from this plant species. The powder bark of P. fasciculata was submitted to extractions by maceration/percolation with ethanol 96% and with dichloromethane after alkalinization of the bark powder affording the dry extracts EEPF and EDAPF, respectively. EEPF underwent two different re-extractions: 1)acid-base extractions affording the neutral (EEPFN) and alkaloidal fractions (EEPFA) and 2)heating under reflux with different solvents, leading to the fractions EEPF-DCM:HEX (1:1), EEPF-DCM: AcOEt (1:1) and EEPF-insoluble in AcOEt. Phytochemical screening of EEPF by TLC revealed the presence of triterpenes and steroids, flavonoid heterosides, saponins, polyphenols, tannins, anthracene heterosides and cardiotonic heterosides. EDAPF was submitted to chromatography through a silica gel column to give 30 fractions of which Fr1-3, Fr4, Fr5-7 and Fr11 represented most of the extract that was chromatographed. Fr5-7 led to the isolation of a mixture of esters of lupeol which are the major components of this extract. Saponification of this fraction afforded Fr5-7Hid that was analyzed by IV, 1H and 13CNMR and was identified as the triterpene lupeol. The insoluble AcOEt fraction derived from re-extraction of EEPF gave a positive test for proanthocyanidins which were quantitatively determined and the results were expressed in percentage for the content of these metabolites in an undiluted sample (10,46 0,3419 %), a 1:10 diluted sample (9,94 0,1598 %) and a 1:100 diluted sample (10,55 0,9299 %). The evaluation of the antiplasmodial activity in vitro was carried out against W2 strains of Plasmodium falciparum by the assay of the Histidine-Rich Protein II (HRPII) with EEPF, EEPFN, EEPFA, Fr1-3, Fr4, Fr5-7 (lupeol esters), Fr11 and Fr5-7Hid (lupeol). The best result was obtained for EEPF, EEPFA, EEPFN (CI50 = ~ 50 g / mL) that can be considered as moderately active. The remaining samples showed CI50 > 50 g / mL and were considered inactive. The in vivo antimalarial activity was performed in Swiss female mice infected with ANKA strains of Plasmodium berghei with EEPF and EEPF-DCM:HEX (1:1) at concentrations of 500, 250 and 125mg/kg body weight. EEPF was partially active only on the 8th day in all concentrations tested while EEPF-DCM:HEX (1:1) was partially active at a dosis of 500mg/kg and was inactive in the remaining doses....

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